KR20060074928A - 풍미가 개선된 단백질 또는 단백질 함유 식품의 제조 방법 - Google Patents
풍미가 개선된 단백질 또는 단백질 함유 식품의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
원료를 충분한 양의 디글리코시다제를 사용하여, 원료내에 함유된 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질이 아글리콘 유형의 생리 활성 물질로 변환되는데 충분한 시간, 온도 및 pH에서 처리함으로써 산/알칼리 처리나 발효 공정에 의존하지 않고, 소재의 물리적 성질을 실질적으로 변경하지 않으면서, 아글리콘 유형의 생리 활성 물질, 특히 아글리콘 이소플라본을 효과적으로 제조할 수 있고, 또한 디글리코시다제 및/또는 특정의 효소 제제를 사용함으로써 단백질 또는 단백질 함유 식품의 아글리콘 함량을 증가시키고, 이의 풍미를 개선시킬 수 있다.
디글리코시다제, 아글리콘, 글리코사이드, 이소플라본, 후라보노이드, 다이드진, 게니스틴, 글리시틴, 페니실리움 멀티칼라 ＩＡＭ 7153
Description
도 1은 실시예 7의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 8의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 14의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 15의 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은, 아글리콘의 제조 방법, 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법, 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법 및 생체내에서 이소플라본을 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 가공 식품, 건강 식품, 영양 보조 식품 및 의약품의 제조 등에 이용할 수 있다.
글리코사이드는 아글리콘이라고 호칭되는 비당질 부분에 당이 결합한 화학 물질이고, 자연계에 널리 존재하고 있다.
글리코사이드에는, 항산화 작용 등을 갖는 폴리페놀 및 약한 에스트로겐 작용을 갖는 파이토에스트로겐 등의 파이토케미칼(식물성의 기능 성분)과 같이, 글리코사이드 그 자신은 장관 흡수가 나빠서 생리 활성을 나타내지 않지만, 장내 세균이 생산하는 글루코시다제 등의 글리코시다제에 의해 분해되어 생기는 아글리콘에 의해 생리 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있고, 암, 동맥경화증, 골다공증, 갱년기 장애 등의 생활 습관병, 고령화에 따르는 질환의 예방이나 증상을 경감시키는 효과가 있다는 점에서, 대두 단백 농축물, 대두 가공 소재 및 당해 대두 단백질 농축물 등을 함유하는 식품에 관심이 집중되고 있다.
이러한 파이토케미칼 중에서, 하기의 일반식으로 나타내는 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글루코사이드(이하, 이소플라본 글루코사이드라고도 한다)에는, 다이드제인, 게니스테인, 글리시테인 등의 아글리콘이 포함되고, 유방암이나 전립선암 세포 증식의 억제, 동맥경화증, 골다공증 등의 경감, 및 여성 호르몬인 에스트로겐 유형의 작용을 나타내는 것에 의한 갱년기 장애를 경감하는 것이, 세포 수준에서의 조사 및 역학적인 조사 등에서 밝혀졌다.
(여기서, R1 및 R2는 각각 H, OH 및 OCH3로 이루어지는 그룹으로부터 독립적 으로 선택되고, R3는 H, COCH3, COCH2COOH 및 COCH2CH2COOH로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다).
그러나, 고령자, 병자, 항생 물질의 투여를 받고 있는 환자 등에서는 장내 세균에 의해 충분한 양의 글리코시다제가 생산되지 않을 가능성이 있으며 글리코시다제는 아세틸 또는 말로닐 그룹 등에 의해 변형된 글리코사이드나 이당 또는 삼당 글리코사이드를 분해하기가 곤란한 점 등으로부터, 대두 단백질의 농축물 등에 포함되는 파이토케미칼의 충분한 흡수를 기대할 수 없다.
또한, 대두 단백질의 농축물 등의 대두 가공 소재는 그 독특한 냄새와 쓴 맛 때문에, 특히 구미(歐美)에서는 당해 대두 가공 소재 등을 함유하는 식품의 섭취를 꺼리고 있어, 아글리콘 이소플라본의 공급원으로서 한계가 있었다.
따라서, 파이토케미칼을 생체내에서 효과적으로 생성하는 방법 및 보다 흡수 효율이 높고 보다 소량으로 충분한 양의 이소플라본을 섭취할 수 있는 아글리콘 이소플라본이 풍부하고 또한 보다 대두의 독특한 냄새와 쓴 맛이 적은 대두 가공 소재 또는 당해 대두 가공 소재를 함유하는 식품 등의 풍미 개선이 요구되고 있다.
한편, 이소플라본 글루코사이드를 아글리콘 이소플라본으로 변환하는 방법에 관해서는, 문헌[일본 공개특허공보 제(평)10-117792호]에 기재되어 있는 것같이 공지되어 있다. 이 방법은, 식물성 단백질 추출물을 알칼리 처리하여 변형된 글루코사이드 이소플라본을 글루코사이드 이소플라본으로 변환시켜, 글리코시다제 처리를 하고 있다. 기존의 글리코시다제는 변형 글루코사이드 이소플라본에 직접 작용할 수 없기 때문에 상기 처리가 수행된다. 이와 같이, 상기 방법은 2 단계의 공정을 요하고, 또한 알칼리 처리에 따른 쓴 맛의 증강, 물성이나 성분의 변화, 부산물의 생성, 알칼리 처리 후의 폐액의 문제 등을 수반한다. 또한, 작용의 주요한 부분을 이루는 글루코시다제는 유리된 글루코스의 영향을 받기 쉽기 때문에, 제조에 사용하는 소재의 종류나 농도가 제한될 수 있다.
또한, 문헌[일본 공개특허공보 제(평)8-214787호]에는, 미생물을 사용한 발효에 의해 글루코사이드 이소플라본으로부터 아글리콘 이소플라본으로의 전환 방법이 기재되어 있다. 그러나, 생성된 아글리콘 이소플라본이 미생물에 의해서 분해되어, 예상외의 부산물이 생성되는 등의 가능성이 있어, 실제의 제조에 사용하기 위해서는 많은 문제점이 야기될 수 있다.
또한, 염산과 같은 산에 의한 가수분해에 의한 방법도 생각되지만, 가혹한 조건으로 인해, 단백질, 인지질, 중성 지질 및 기타 성분의 분해 및 부산물이 생성된다. 특히, 이의 발암성이 보고되어 있는 MCP(모노클로로프로판올) 및 DCP(디클로로프로판올) 같은 염소 화합물의 생성을 피할 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 산/알칼리 처리나 발효 공정없이, 소재의 물성을 실질적으로 변경하는 일이 없고, 또한 효과적으로 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 디글리코시다제 및/또는 특정한 효소 제제를 사용함으로써 단백질 또는 단백질 함유 식품의 아글리콘 함량을 높이고, 또한 이의 풍미를 개선하는 것을 목적으로 한다. 이러한 목적 및 기타의 목적은 이하에 나타내는 상세한 설명에서 더욱 분명하게 된다.
본 발명자들은 여러가지의 미생물을 기원으로 발견된 디글리코시다제가 기존의 글리코시다제로 분해가 곤란한 글리코사이드를 효율적으로 분해하고, 또한, 체내에서도 작용하는 것을 예의 연구한 결과 밝혀내어, 본 발명을 완성하였다. 또한, 공급원에 관계 없이 모든 디글리코시다제를 사용하여, 본 발명을 실시할 수 있음을 밝혀내었다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 디글리코시다제를 아글리콘으로서 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤 및 리그난으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 글리코사이드에 처리하여 아글리콘을 생성시키는 것을 특징으로 하는 아글리콘의 제조 방법.
(2) 아글리콘이 이소플라본인 상기 항목(1)의 아글리콘의 제조 방법.
(3) 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드가 다이드진, 게니스틴 또는 글리시틴, 및 이들의 아세틸 유도체, 석시닐 유도체 또는 말로닐 유도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 아글리콘의 제조 방법.
(4) 디글리코시다제가 글루코스 내성을 갖는 것인 상기 아글리콘의 제조 방법.
(5) 디글리코시다제가 페니실리움 멀티칼라(Penicillium multicolor) IAM 7153이 생산하는 디글리코시다제인 상기의 아글리콘의 제조 방법.
(6) 단백질 또는 단백질 함유 식품에 디글리코시다제를 처리하는 공정을 포 함하는 것을 특징으로 하는 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(7) 단백질 또는 단백질 함유 식품이 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드를 함유하는 상기 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(8) 제조되는 단백질 또는 단백질 함유 식품이 또한 풍미가 개선된 것인 상기 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(9) 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드가 다이드진, 게니스틴 또는 글리시틴, 및 이들의 아세틸 유도체, 석시닐 유도체 또는 말로닐 유도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 상기 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(10) 또한 아밀라제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 주로 함유하는 효소 제제를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(11) 풍미의 개선이 쓴 맛 및/또는 떫은 맛의 감소인 상기 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(12) 단백질 또는 단백질 함유 식품에, 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제, α-갈락토시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 주로 함유하는 효소 제제를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(13) 단백질 또는 단백질 함유 식품이 아글리콘으로서 후라보노이드를 함유하는 글리코사이드를 함유하는 상기 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(14) 단백질 또는 단백질 함유 식품이 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드를 함유하는 상기 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
(15) 디글리코시다제를 경구 투여하여 생체내에서 글리코사이드로부터 아글리콘을 생성시키는 방법.
(16) 디글리코시다제를 경구 투여하여 생체내에서 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드로부터 이소플라본을 생성시키는 방법.
또한, 본 발명은 이하를 제공할 수 있다.
(17) 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질에 디글리코시다제를 처리하는 것을 특징으로 하는 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질을 아글리콘 유형의 생리 활성 물질로 변환하는 방법.
(18) 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 함유하는 식물 재료에 디글리코시다제를 처리하는 것을 특징으로 하는 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질이 풍부한 조성물의 제조 방법.
(19) 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질을 함유하는 음식물의 섭취전, 섭 취중 및/또는 섭취후에, 디글리코시다제를 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 생리 활성 물질의 생체 흡수의 촉진 방법.
(20) 적어도 디글리코시다제를 함유하는 것을 특징으로 하는 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질의 아글리콘 유형의 생리 활성 물질로의 변환제.
본 발명의 이들의 태양 및 기타의 태양은, 이하에 나타내는 상세한 설명에서 더욱 분명하게 된다.
본 발명에 기재한 디글리코시다제는, 아글리콘으로서 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤 및 리그난으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 글리코사이드(이하, 아글리콘 글리코사이드라고도 한다)에 대하여 효과적으로 작용하는데, 특히 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드(이하, 이소플라본 글리코사이드라고도 한다)에 대하여 대단히 효과적으로 작용할 수 있고, 또한 유리 글루코스의 영향을 거의 받지 않는다. 따라서, 이소플라본 글리코사이드가 다이드진, 게니스틴 또는 글리시틴, 및 이들의 아세틸 유도체, 석시닐 유도체 또는 말로닐 유도체 등의 경우에 유리하게 수행할 수 있다. 또한, 이소플라본 글리코사이드로부터 생성되는 이소플라본을 아글리콘 이소플라본이라고도 한다.
또한, 디글리코시다제를 투여함으로써, 경구 섭취된 아글리콘 글리코사이드 내지 이를 포함하는 식품으로부터 이소플라본을 생성시킴으로써 각종 질병의 예방 효과를 높일 수 있다. 디글리코시다제는 페니실리움 멀티칼라(Penicillium multico1or) IAM 7153이 생산하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 페니실리움 멀티칼라 유래의 β-갈락토시다제는 식품 첨가물 리스트에 게재되어 있는 안전성이 확인되어 있는 효소이고, 이러한 안정성이 높은 균으로부터 생산되는 디글리코시다제에 관해서도 높은 안전성이 추정된다.
또한, 대두를 원료로 한 경우, 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재의 건강상의 이점이 보고되어 있지만, 이의 독특한 냄새와 쓴 맛 때문에, 특히 구미에서는 섭취를 꺼리고 있다. 상기한 아세틸글루코사이드 이소플라본이나 말로닐글루코사이드 이소플라본은 쓴 맛이 강하고, 아글리콘 이소플라본은 쓴 맛이 적다. 따라서, 디글리코시다제에 의한 아글리콘 이소플라본으로의 변환에 의해, 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재의 쓴 맛을 효과적으로 감소시킨 식품을 제공하는 것도 가능하다.
이러한 이소플라본이 보다 흡수 효율이 높은 아글리콘으로서 농축된 보다 쓴 맛이 적은 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재를 사용하면, 보다 소량으로 충분한 양의 이소플라본을 섭취할 수 있고, 대두의 독특한 냄새와 이미(異味)를 꺼리는 사람들에게 있어서도 섭취하기 쉬운 형태로 변경할 수 있다.
또한, 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재의 냄새 및 이미 때문에, 식품 원료로서 사용하는 경우에는 이의 사용량이 제한되고, 이로 인해, 식품용 이소플라본의 공급원으로서는 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재에는 한계가 있었다. 본 발명에 의해, 이소플라본 글리코사이드를 디글리코시다제로 소화하고, 보다 흡수 효율이 높은 아글리콘인 이소플라본으로서 농축되어 보다 쓴 맛이 적은 대두 단백 농축물이나 대두 가공 소재를 사용하면, 보다 소량의 사용으로 식품용 이소플라본의 공급이 가능해지고, 이소플라본 공급원으로서 보다 많은 종류의 식품에 이용 가능하다.
본 발명에서 사용되는 디글리코시다제는, 기존의 글루코시다제가 기질로서 이용하기 어려운 이당 글리코사이드에 작용하여 당해 이당 글리코사이드로부터 두 개의 단당 단위로 당을 유리시키고 또한 아글리콘을 생성시키는 활성을 갖는 것으로 특징지워 진다. 본 명세서에서는, 상기의 활성을 갖는 효소를 「디글리코시다제」라고 부른다.
본 발명에서의 디글리코시다제란, 당쇄 가수분해 효소로 분류되는데 기존의 각종 α- 및 β-글리코시다제와는 다른 성질을 가지는 효소이다. 이러한 디글리코시다제는, 단일 또는 복수의 종류의 당류로부터 구성된 직쇄 및 분기당쇄와 당류 이외의 화합물이 당쇄의 하이드록실 그룹을 통하여 결합한 소위 글리코사이드를 기질로 할 수 있고, 이당 단위로 기질을 인식하여 절단하고, 상당하는 이당 그리고 두 개의 단당을 갖는 보다 적은 쇄 길이의 당쇄를 갖는 아글리콘을 순차 생성하고, 최종적으로 아글리콘을 생성한다. 또한, 기존의 글루코시다제에서는 분해하기 어려운 아세틸 유도체, 석시닐 유도체 또는 말로닐 유도체 등의 변형 글루코사이드를 당과 아글리콘으로 분해한다. 자연계에 존재하는 당쇄의 대표예로서, 전분, 셀룰로스, 세포벽을 구성하는 다당류 등을 들 수 있다. 이당 글리코사이드의 당쇄는 여러 종류가 적합할 수 있는데, 예를 들면, 자연계에는, 6-O-β-D-크실로피라노실-β-D- 글루코피라노시드(β-프리메베로사이드), 6-O-α-L-아라비노피라노실-β-D-글루코피라노시드(비시아노시드), 6-O-α-L-아라비노푸라노실-β-D-글루코피라노시드, 6-O-α-L-람노피라노실-β-D-글루코피라노시드(루티노시드), 6-O-β-D-아피오푸라노실-β-D-글루코피라노시드, 6-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노시드(겐티오비시드), 4-O-α-글루코피라노실-β-D-글루코피라노시드(말토스), 2-O-α-L-람노피라노실-β-D-갈락토피라노시드(람니노스), 6-O-α-L-람노피라노실-β-D-갈락토피라노시드(로비노비노시드), 2-O-β-D-크실로피라노실-β-D-글루코피라노시드(크실로실글루코스), 4-O-β-D-글루코피라노실-β-D-글루코피라노시드(셀로비오시드), 크실로비오시드 등이 있다. 상기 언급된 화합물 이외에, 이당 구조이면 어떠한 당의 조합이라도 반응의 기질로서 인식하는 것이 가능하다. 아글리콘이란, 글리코사이드를 구성하고 있는 당 이외의 화합물을 나타내는 것이다. 자연계에서, 글리코사이드의 아글리콘은 널리 존재하고, 이의 대표예로서, 식물의 휘발성 화합물로서의 리날룰, 게라니올, 시트로넬랄, 펜에틸알콜, 시트로넬롤, 자스민류, 리모넨, 테르피넨, 시트랄, 네롤, 피넨, 보르네올, 테르피네올, 메틸쟈스모네이트, 헥사놀, 헥세놀, 헥사날, 헥세날, 바닐린, 벤즈알데히드, 유게놀, 살리실산메틸, 리날룰옥사이드, 벤질알콜, 보미포미톨 등이 있고, 식물의 색소 화합물인 알리자린, 푸르푸린, 안토시아니딘으로서 펠라고니딘, 시아니딘, 델피니딘, 페오니딘, 페튜니딘, 및 말비딘; 및 후라보노이드류로서 나릴틴, 나린게닌, 헤스페레틴, 네오헤스페레틴, 디오스메틴, 켈세틴, 캄페롤, 미리세틴, 이소람네틴, 및 시린게닌 등이 있다. 본원에 언급된 화합물 이외에도, 다양한 화합물이 글리코사이드의 아글리콘으로서 존재 하고, 또는 글리코사이드의 아글리콘이 될 수 있다.
또한, 디글리코시다제는 위에 기재한 이당 유리 활성 이외에, 1분자의 당과 아글리콘이 결합한 소위 단당 글리코사이드도 기질로 할 수 있고, 상당하는 단당과 아글리콘을 생성할 수 있다. 특히, 기존의 β-글루코시다제로 가수분해하기 어려운 단당 글리코사이드에도 작용할 수 있는 점을 특징으로서 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 디글리코시다제는, 당업자에 과도한 실험을 요구하지 않고, 당해 디글리코시다제 생산능을 갖는 미생물로부터 얻을 수 있다[예를 들면, WO 제00/18931호 참조].
본 발명의 디글리코시다제를 생산하는 미생물은, 예를 들면 아래와 같이 스크리닝하여 얻을 수 있다. 즉, 토양의 현탁액을 유게닐 프리메베로사이드 등을 유일한 탄소원으로서 함유하는 분리용 액체 배지에 접종함으로써 집적 배양을 수행하고, 이의 배양액을 같은 분리용 평판 한천 배지에 도포하고, 생육한 콜로니를 선택하여 얻는다. 이들의 균주를 적당한 액체 배지에서 배양하고, pNP-프리메베로사이드 등으로부터 이당을 절단하여 pNP 유리 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다.
이렇게 하여 선택된 균주에 관해서, 또한 pNP-프리메베로사이드 등을 기질로서 이당 유리를 지표로서 디글리코시다제 생산 미생물을 스크리닝할 수 있다.
이미, 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger) IFO4407(입수처: 재단법인 발효연구소 오사카시 죠가와구 쥬산본마치 2-17-85), 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger) IAM 2020, 아스퍼길러스 후미가투스(Aspergillus fumigatus) IAM 2046, 페니실리움 멀티칼라(Penicillium multicolor) IAM 7153(입 수처: 도쿄대학부 분자세포생물학연구소 도쿄도 분쿄구 야요이 1-1-1) 등에서 이의 생산능이 확인되어 있다.
또한, 기타의 다양한 미생물에 있어서도, 아스퍼길러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 리조무코르(Rhizomucor)속, 탈라로마이세스(Talaromyces)속, 모르티에렐라(Mortierella)속, 크립토코커스(Cryptococcus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 악티노플라네스(Actinoplanes)속 등의 다양한 미생물에서 디글리코시다제 활성이 확인되어 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 균종은, 디글리코시다제 생산능을 갖는 균종이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 상기한 균종에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에서 이용할 수 있는 디글리코시다제의 생산 방법으로서는, 디글리코시다제 생산능을 갖는 균종의 돌연 변이주, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 디글리코시다제를 생산할 수 있도록 변형된 각종 미생물, 또는 각종 세포(예를 들면, 효모 세포, 세균 세포, 고등 식물 세포, 동물 세포 등)도 포함되며, 특히, 디글리코시다제를 고생산할 수 있도록 변형된 것이 바람직하다. 디글리코시다제 유전자를 도입함으로써 디글리코시다제 생산능을 부여하는 경우에는, 숙주로 사용되는 미생물에는 디글리코시다제 생산능이 없어도 좋다.
상기한 각종 미생물 등을 사용하여 디글리코시다제를 제조하기 위해서는, 당해 미생물의 배양에 적합한 방법이나 조건을 설정할 수 있고, 이들의 방법이나 조건은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기한 각종 균종의 배양법으로서는 액 체 배양 및 고체 배양의 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 액체 배양이 이용된다. 액체 배양으로서는 예를 들면, 아래와 같이 하여 수행할 수 있다.
사용할 수 있는 배지로서는, 디글리코시다제를 생산하는 미생물이 생육 가능한 배지인 경우에는 어떠한 것이라도 좋다. 예를 들면, 글루코스, 슈크로스, 겐티오비오스, 가용성 전분, 글리세린, 덱스트린, 당밀, 유기산 등의 탄소원, 또한 황산암모늄, 탄산암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 또는, 펩톤, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 밀기울, 고기 추출물 등의 질소원, 또한 칼륨염, 마그네슘염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 철염, 아연염 등의 무기염을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 또한, 디글리코시다제를 생산 축적시키도록 하기 위해서 배지에 각종의 유도 물질을 첨가할 수 있다. 유도 물질로서는 예를 들면 당류를 사용할 수 있고, 바람직하게는 겐토스(예를 들면, 겐토스 #80, 니혼쇼쿠힝가고(주)), 겐티오비오스, 겐티올리고당(예를 들면, 겐티올리고 등, 와코준야쿠고교(주)), 갈락토만난 등을 이용할 수 있다. 이들 유도 물질의 첨가량은 목적으로 하는 디글리코시다제의 생산능이 증대되는 양이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.01 내지 10%가 첨가된다.
배지의 pH는 예를 들면 약 3 내지 8, 바람직하게는 약 5 내지 6 정도로 조제하고, 배양 온도는 통상 약 10 내지 50℃, 바람직하게는 약 25 내지 30℃ 정도로, 1 내지 15일간, 바람직하게는 4 내지 7일간 정도 호기적 조건하에서 배양한다. 배양법으로서는 예를 들면 진탕배양법, 소형 발효기에 의한 호기적 심부 배양법을 이용할 수 있다. 그렇지만, 상기한 각종의 배양 조건 등은 물론, 배양하는 대상인 미 생물이나 세포에 따라 적절하게 변경될 수 있으며, 본 발명의 디글리코시다제가 생산되는 조건인 경우 이의 조건 등은 한정되지 않는다.
수득된 배양액으로부터 디글리코시다제를 분리 정제하기 위해서는, 디글리코시다제 활성을 지표로 하여, 원심분리, UF 농축, 염석, 이온교환 수지 등의 각종 크로마토그래피를 조합시켜 일반적인 방법에 의해 처리하여 정제한 디글리코시다제를 얻을 수 있다[참고 문헌: 단백질 및 효소의 기초실험법, 호리오 다케카즈저, 난고도].
본 발명의 효소 조성물은 상기한 미생물을 배양한 배양액 그대로도 이용할 수 있다. 물론 본 배양액은 본 발명의 사용 목적에 따라서 이의 정제 정도를 적절히 변경할 수 있다.
본 발명은, 디글리코시다제를 아글리콘으로서 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤 및 리그난으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 글리코사이드에 처리하여 아글리콘을 생성시키는 아글리콘의 제조 방법을 제공한다. 이러한 제조 방법은, 아글리콘으로서 상기 화합물을 함유하는 글리코사이드를 포함하는 식물 재료를 바람직하게는 약산성 조건하에서 충분한 양의 디글리코시다제 효소와, 원료 중의 적어도 대부분의 글리코사이드가 아글리콘을 생성하는데 충분한 시간, 온도 및 pH에서 반응시켜, 이로써 아글리콘을 제조하는 것을 포함한다. 본 발명은 디글리코시다제가 아글리콘이 풍부한 식물 추출물을 제조하기 위하여, 식물 추출물 중에 첨가되는 것과 같은 제조 방법을 제공한다.
이러한 신규의 방법은 이당 글리코사이드 가수분해 효소, 즉 디글리코시다제를 포함하는 효소 제제에 의한 아글리콘 글리코사이드의 대부분을 유리 아글리콘으로 전환하는 1 단계 공정의 방법이다. 아글리콘 글리코사이드는 식물 재료 중, 바람직하게는 단백질 또는 단백질 식품에 존재하는 것이 효과적이다. 이 방법은, 변형 글루코사이드 이소플라본 및 글루코사이드 이소플라본의 아글리콘 이소플라본으로의 실질적으로 완전한 전환을 가능하게 하는 것이 밝혀지고 있기 때문에, 변형 글루코사이드 이소플라본 및 글루코사이드 이소플라본의 아글리콘 이소플라본으로의 전환을 포함한다. 어떤 식물성 단백질 재료, 특히 단백질 재료에서는, 식물성 단백질 재료 중의 전체 이소플라본 내용물의 상당한 부분이 이소플라본 글리코사이드의 형태로 존재한다. 그러므로, 글루코사이드 이소플라본을 아글리콘 이소플라본으로 전환할 뿐만 아니라, 변형 글루코사이드 이소플라본을 아글리콘 이소플라본으로 전환하는 것은 식물성 단백질 재료로부터 얻을 수 있는 아글리콘 이소플라본의 양을 최대한으로 증가시키기 위해서 필요하다.
바람직한 태양의 방법에서의 출발 재료는, 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질을 포함하는 모든 단백질 또는 단백질 함유 식품(더욱 바람직하게는 식물 재료, 식물성 단백질, 식물성 단백질 함유 식품)이다. 이하의 설명 중의 어느 방법은, 대두의 생성물을 예로서 기재되지만, 본 발명의 방법은 대두나 대두의 생성물 이외의 단백질 또는 단백질 함유 식품에 광범위하게 일반적으로 적용할 수 있다.
본 발명에서 「단백질 또는 단백질 함유 식품」이란, 글리코사이드 유형의 생리 활성 물질을 포함하는 것이 바람직하지만 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 「식물 재료」란, 가식성 또는 약용으로 사용하는 식물체의 전체 또는 잎, 꽃, 열매, 줄기, 뿌리 등의 일부분과 이들의 가공물을 의미하고, 이의 예로서는 채취된 식물체의 전체 또는 잎, 꽃, 열매, 줄기, 뿌리 등의 일부분이나, 식물 추출물, 이들의 가공물을 들 수 있다. 식물 재료의 구체예로서는 이하와 같은 재료가 포함된다: 대두 단백질 등의 식물성 단백질이나, 두유, 과즙(오렌지 과즙, 포도 과즙, 사과 과즙, 석류 과즙), 허브 차, 허브 추출물 등의 식물 추출물, 및 과즙 음료, 와인, 차, 홍차, 코코아 등의 상기 재료의 가공물.
「식물성 단백질」이란, 상기「식물 재료」로부터 얻어지는 단백질을 의미하고, 식물 재료 유래의 다른 성분을 혼합하고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, 「파이토케미칼, 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤, 리그난으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물」은, 이들의 개념에 포함되는 화합물인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 생체내에서(바람직하게는 온혈동물, 더욱 바람직하게는 사람) 생리 활성을 나타내거나, 생리 활성을 증강하는 화합물이 바람직하다. 바람직하게는 후라보노이드이고, 또한 바람직하게는 이소플라본이고, 가장 바람직하게는 상기 구조식으로 나타내는 이소플라본이다.
본 발명에서 「생리 활성 물질」이란, 바람직하게는 식물내에서 이의 대부분이 글리코사이드로서 존재하고, 아글리콘 유형으로 변환되는 경우 생체내에서 생리 활성을 나타내거나, 생리 활성을 증강하는 물질을 의미한다. 구체적으로는, 생리 활성 물질로서는, 상기한 바와 같은 파이토케미칼, 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤, 리그난 등이 포함되고, 바람직하게는, 이소플라본이다.
「글리코사이드 유형의 생리 활성 물질」이란, 상기 글리코사이드의 아글리콘이 생리 활성 물질인 것을 의미하고, 당쇄로서는 1당 이상, 바람직하게는 이당 이상인 것이다. 이당쇄로서는 상기 언급된 것 등을 들 수 있다.
본 발명에서 「아밀라제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 주로 함유하는 효소 제제」란, 이들의 효소를 주체로 하여 포함하는 한 특별히 한정되지 않고, 시판 효소 제제를 이용하는 것이 가능하다. 이하, 아마노 엔자임(주)제의 것을 예시한다. 아밀라제의 예로서는, 아밀라제 AD「아마노」1(최적 pH: 6.0, 최적 온도: 70℃), 글루코자임 NL4.2(최적 pH: 4.5, 최적 온도: 65℃), 트랜스글루코시다제 L「아마노」(최적 pH: 5.0, 최적 온도: 60℃) 등을 들 수 있고, 셀룰라제로서는, 셀룰라제 A「아마노」3(최적 pH: 4.5, 최적 온도: 55℃), 셀룰라제 T「아마노」4, 헤미셀룰라제「아마노」90G(최적 pH: 4.5, 최적 온도: 50℃), 헤미셀룰라제 GM「아마노」 등을 들 수 있고, 펙티나제로서는, 펙티나제 PL「아마노」(최적 pH: 4.55 내지 0, 최적 온도: 60 내지 55℃) 등을 들 수 있고, 프로테아제로서는, 우마미자임, 뉴라제 F3G, 파파인 W-40, 판크레아틴 F, 프로테아제 B, 프로테아제 A「아마노」G 등을 들 수 있고, 리파제로서는, 리파제 A「아마노」6(최적 pH: 6.5, 최적 온도: 45℃) 등을 들 수 있고, 효모 용해성 효소로서는 효모 용해성 효소 제제 YL-15(최적 pH: 7.0, 최적 온도: 50 내지 55℃)를 들 수 있으며, α-갈락토시다제로서는, ADG- S-DS(최적 pH: 4.5 내지 5, 최적 온도: 50 내지 60℃) 등을 들 수 있다.
상기 각 효소 내지 효소 제제는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 특정한 효소를 생산하는 미생물을 디글리코시다제의 제조와 같이 스크리닝을 수행하고, 수득된 효소 생산균을 적당한 배지에서 배양하여 효소를 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 생산균으로서는, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtillis), 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.) 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 단백질 또는 단백질 함유 식품에 디글리코시다제를 처리하는 공정을 포함하는 아글리콘 함량을 높인 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법에 관해서, 식물 재료 유래의 식물성 생리 활성 성분(특히 이소플라본 글리코사이드)을 예로 하여, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 식물 재료 유래의 식물성 생리 활성 성분 이외의 상기 화합물에 관해서도 동일하게 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 대두 재료라는 용어는, 대두 또는 대두의 변종의 모든 유형의 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 실시 방법의 몇개의 다른 태양이 가능하다.
제1의 태양에서는, 식물성 생리 활성 물질을 식물성 재료 중에 남긴 채로, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로 전환한다. 따라서, 생성된 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질은 식물성 재료 중에 남은 채라도 좋고, 적절히 제거하여도 좋다. 식물성 생리 활성 물질 의 아글리콘 형태는 일반적으로 용매, 소수성의 침출 또는 추출 방법에 의해 제거할 수 있다고 생각된다. 이러한 조작에 알맞은 용매에는, 아세톤, 에탄올 및 이의 다른 유사한 유기 용매가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
제2의 태양에서는, 식물성 재료 중에서 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질(예를 들면, 이소플라본 변형 글리코사이드 및 이소플라본 글루코사이드)를 식물성 재료 중에서, 수성 침출 또는 추출 방법에 의해 제거한다. 수성 침출은 식물 재료를 침적하거나, 식물성 재료를 물 또는 예를 들면 에탄올 또는 기타의 알콜 등의 친수성 용매의 혼합물 중에 노출시키거나 침지시킴으로써 비교적 가용성의 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 침출시켜 수행된다. 수득된 수계의 pH는 약 pH 2 내지 약 pH 5이고, 바람직하게는, 약 pH 4이다. 제거한 후, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로 전환시킨다.
제3의 태양에서는, 모든 전환 조작을 하기 전에, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 식물성 재료 중에서 제거한다.
글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 포함하는 식물 재료의 유형에 따라서는, 어떤 경우에 있어서는, 식물 재료를 미세하게 파쇄한 형태로 가공하는 것이 바람직하다. 이것은 식물 재료 중에 포함되는 식물성 생리 활성 물질을 이하에 상세하게 기술하는 공정에서 이용하는 시약(디글리코시다제)에 접촉시키기 위하여 바람직하다. 재료를 당해 기술분야에서 기지의 통상의 방법에 의해 으깨고, 파쇄하거나 기타의 가공을 시행할 수 있다. 혹시 식물 재료가 식물 재료 중의 이소플 라본 화합물이 외부의 시약 또는 반응물에 용이하게 접촉하는 상태에 있는, 예를 들면 임의의 식물에서의 작은 잎의 부분 등인 경우, 식물 재료에 대해 상기의 가공을 시행할 필요는 없다.
글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질의 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로의 전환의 일부는 사용하는 식물 재료에 따라서는, 혼합물 중에 존재하는 효소에 의해서 수행되는 경우가 있다. 이들 효소는 식물성 단백질 재료 중에 천연에 존재하는 것이라도 좋고, 재료속에서 증식한 미생물 유래의 것이라도 좋다. 이러한 효소를 잔류성 효소라고 부른다. 그렇지만, 식물성 단백질 재료 중의 잔류성 효소의 성질 및 농도에서는, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질로부터 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로의 전환을 충분히 수행할 수 없을 가능성이 있다. 외래의 효소, 즉 디글리코시다제를 포함하는 효소 제제를 첨가함으로써, 최대의 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질 전환 효율을 달성하는 것이 가능해진다.
본 발명에 있어서, 첨가하는 효소량은 존재하는 효소의 유형, 효소 농도의 분포, 반응계의 pH, 존재하는 효소의 활성 및 온도를 포함하는 여러가지의 인자에 의존한다. 효소를 첨가하는 경우에는, 존재하는 효소의 전체 농도가 건조 질량 기준으로 식물성 재료 100g에 대하여 통상, 10 내지 10000 AU, 바람직하게는 28 내지 2800 AU가 되는 양이 전형적으로 바람직한 효소량이다. 잔류성 효소, 추가의 효소 또는 둘 모두를 포함하여, 충분한 농도의 효소가 상기 계 중에 존재하면, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 혼합물 중의 글리코사이드 유형의 식물성 생 리 활성 물질의 실질적으로 전부를 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로 전환하는 데 충분한 온도, pH 및 시간으로 접촉시킨다.
전환-제조 공정은 pH 약 2 내지 약 6으로 수행하는 것이 바람직하다. 전환-제조 공정에 바람직한 pH 범위는 약 3 내지 약 5이다. 사용하는 식물성 소재에 따라서, 염산, 인산, 아세트산, 황산 등의 산성 시약, 또는 수산화나트륨과 같은 알칼리성 시약에 의해 pH를 조정할 수 있다. 많은 경우에서는, 식품 등급의 산성 또는 알칼리성 시약을 사용하는 것이 상정된다. 전환-제조 공정에 사용할 수 있는 온도는 약 25℃ 내지 약 65℃가 바람직하다. 보다 바람직한 온도는 약 30℃ 내지 약 55℃이다. 반응을 통하여, 온도는 통상 일정하지만, 이용하는 소재, 그 후의 공정이나 최종적인 사용 목적에 따라서 온도를 상승시키거나 강하시킬 수 있다. 즉, 온도는 다양한 상황에 따라서 비교적 자유롭게 변경시키는 것이 가능해진다.
전환-제조에 필요한 시간은, 반응에 제공하는 소재의 종류, 농도, 물리적 특성, 그리고 첨가한 효소 농도, 또한 반응계의 온도 및 pH 등의 여러가지의 인자가 복잡하게 관계함으로써 결정된다. 대부분의 경우, 6 내지 12시간 이내에 실질적으로 완전한 전환-제조를 달성할 수가 있다. 전환-제조를 하기 위하여 필요한 시간은, 첨가하는 디글리코시다제의 농도에 의존하여 단축할 수 있다. 전환-제조 공정에서는, 반응 혼합물 중의 이소플라본 글리코사이드의 대부분을 아글리콘 이소플라본으로 전환-제조할 수 있다. 전환의 효율은 통상 적어도 약 50% 이상으로, 바람직하게는 약 70% 이상이다. 상기의 바람직한 반응 조건을 채택함으로써, 거의 완전한 전환을 달성할 수 있다.
본 발명의 디글리코시다제를 아글리콘으로서 파이토에스트로겐, 폴리페놀, 이소플라본, 비오카닌 A, 포름오노네틴, 쿠메스트롤 및 리그난으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 글리코사이드에 처리하여 아글리콘을 생성시키는 것을 특징으로 하는 아글리콘의 제조 방법에 관해서도, 상기와 같은 조건을 채택하는 것으로 실시 가능하다.
상기의 공정에 추가하여, 본 발명에 있어서는, 상기 방법은 아밀라제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 주로 함유하는 효소 제제를 처리하는 공정을 또한 포함하여도 좋다. 이 공정은 디글리코시다제를 처리하는 공정의 전이나 후에 수행하여도 좋고, 디글리코시다제와 효소 제제를 동시에 처리할 수 있다. 이 경우, 효소 제제를 디글리코시다제와 동시 사용하는 경우의 처리 조건은, 상기 디글리코시다제 단독의 경우에 준하여 수행할 수 있다. 또한, 효소 제제의 처리를 디글리코시다제 처리의 전단계 또는 후단계로 수행하는 경우에는 상기 각 효소 제제의 최적 pH 및 최적 온도를 감안하여 적절한 pH, 온도, 처리 시간 등을 선택할 수 있다. 이 방법은 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 아글리콘 함량을 높일 수 있고, 또한 쓴 맛 및/또는 떫은 맛을 감소하고, 풍미를 개선하는 효과도 있다.
또한, 본 발명은 상기 디글리코시다제와의 병용 효과를 밝혀내는 과정에서, 특정한 효소 제제, 즉 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제, α-갈락토시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 적어도 1종의 효소를 주로 함유하는 효소 제제를 단독으로 단백질 또는 단백 질 함유 식품에 작용시키면 풍미가 개선되는 것을 밝혀내었다. 이 경우의 처리 조건은, pH는 바람직하게는 3 내지 8, 보다 바람직하게는 5 내지 7.5이고, 처리 온도 및 처리 시간은 디글리코시다제 병용의 경우와 같다. 또한, 처리된 생성물을 적절히 목적하는 pH로 임의로 조정할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 단백질 또는 단백질 함유 식품을 처리함으로써, 단백질이나 단백질 함유 식품의 풍미를 개선할 수 있고, 특히 쓴 맛 및/또는 떫은 맛을 감소시킬 수 있다.
또한, 상기한 바와 같이 제조된 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질이나 아글리콘 유형 식물성 생리 활성 물질이 풍부한 조성물을 그대로 또는, 음식물이나 음료에 혼합하여 투여함으로써, 식물성 생리 활성 물질에 의한 효과 등을 얻을 수 있다. 식물성 생리 활성 물질에 의한 효과로서는, 각종 질병(암, 생활 습관병, 골다공증, 갱년기 장애에서의 발열 등)의 예방 효과, 정장 작용, 면역 부활 작용, 생체 방어 증강 작용이 있으며, 또한, 아글리콘 유형으로 미리 변환된 식물성 생리 활성 물질을 투여하는 이외에도, 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질 및/또는 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 함유하는 식물 재료를 디글리코시다제와 동시에 경구 투여함으로써, 위나 장내 등의 생체내에서 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질로부터 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질의 변환을 수행하고, 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질의 흡수와 혈중 이행을 촉진하고, 식물성 생리 활성 물질에 의한 각종 질병의 예방 효과를 높일 수 있다.
본 발명에 의한 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 함유하는 음 식물의 섭취전, 섭취중, 및/또는 섭취후에, 디글리코시다제를 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 식물성 생리 활성 물질의 생체 흡수의 촉진 방법(바람직하게는 생체내에서의 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드로부터 이소플라본을 생성하는 방법)은 아래와 같이 실시된다.
대상은 온혈동물이고, 바람직하게는 사람이나 가축이다.
위장내에서 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질과 디글리코시다제가 접촉하는 한, 디글리코시다제는 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질을 함유하는 음식물의 섭취전, 섭취중, 섭취후의 어느 시점에서도 투여할 수 있다. 바람직하게는, 식사직후에서 1시간내이다.
디글리코시다제의 투여량은 글리코사이드 유형의 식물성 생리 활성 물질로부터 아글리콘 유형의 식물성 생리 활성 물질로의 변환이 체내에서 일어나면 특별히 한정되지 않지만, 통상 10㎎/일에서 500㎎/일, 바람직하게는 30㎎/일 내지 300㎎/일, 더욱 바람직하게는 100㎎/일 내지 200㎎/일의 범위에서 경구 투여된다. 투여 회수는 특별히 한정되지 않지만, 수일에 1회 내지 하루 수회가 바람직하고, 특히 바람직하게는, 매식후(하루 3회)이다.
또한, 생리 활성 물질의 섭취량은 그 효과가 얻어지면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 10㎎/일 이상, 더욱 바람직하게는, 50㎎/일 이상, 더욱 바람직하게는, 50㎎/일에서 100㎎/일의 범위에서 섭취된다.
또한, 디글리코시다제는 효소 제제로서 단독으로 및/또는 기존의 글리코시다제 (예를 들면, 글루코시다제, 갈락토시다제 등)와 혼합하여 투여할 수 있다.
디글리코시다제는 효소 제제로서 사용할 수 있다. 이 경우, 효소 제제는 필수 성분으로서 디글리코시다제를 함유하고, 또한, 바람직하게는 식품으로서 허용되는 여러가지의 효소, 안정화제 등을 포함하여도 좋다.
또한, 기존의 글리코시다제와 혼합한 효소 제제로서 투여하는 경우, 기존의 글리코시다제의 예로서는, 글루코시다제, 갈락토시다제, 크실로시다제, 람노시다제를 포함하며 또한, 디글리코시다제의 투여량으로서는 10㎎/일 내지 50㎎/일이 바람직하다.
실시예
식물 재료로서 대두 소재를 사용한 실시예를 이하에 나타내는 것에 의해, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 실시예는 어디까지나 설명을 목적으로 한 것이고, 이것이 본 발명의 범위를 제한 및 한정하는 일은 결코 없는 것으로 이해되어야 한다.
식물 재료, 예를 들면, 탈지 대두, 두유, 농축 대두 단백질 및 각종 대두 제품은 12종류의 이소플라본 화합물을 포함한다. 구체적으로는, 이들은 아글리콘인 글리시테인, 다이드제인 및 게니스테인, 글루코사이드 글리코사이드인 글리시틴, 다이드진 및 게니스틴, 글루코스 잔기의 6위치에 O-아세틸 그룹을 가지는 아세틸글리시틴, 아세틸다이드진 및 아세틸게니스틴, 글루코스 잔기의 6위치에 O-말로닐 그룹을 가지는 말로닐글리시틴, 말로닐다이드진 및 말로닐게니스틴을 포함한다. 이들 화합물의 존재비는 대두의 품종의 차이 및 제조 공정에서의 처리의 차이에 의해서 각각특징적이다.
특별한 언급이 없는 한, 본원 명세서에서 비율, 부, 퍼센트 등은 질량 기준이다.
또한, 본원 명세서에서 각종 효소 활성 측정은 특별히 기재하지 않는 한, 이하에 기재하는 방법에 의해 수행한 값으로 표시한다.
디글리코시다제 활성
활성의 측정은 자동 화학 분석 장치(도시바사제, TBA-30R)를 사용하여 수행하였다. 효소 샘플 30㎕와 이당 글리코사이드 기질로서 아세트산 완충액(pH 5.5)에 용해시킨 파라니트로페닐(pNP)프리메베로사이드 2mM 용액 200㎕와 혼합하고, 40℃, 사이클 타임 22.5초에서 9.75분간 반응시킨 후, 탄산나트륨 250㎕를 가하여 412nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플 유래의 블랭크의 측정은 기질 용액의 대신에 20mM 아세트산 완충액(pH 5.5)을 사용하여 동일하게 측정하였다.
이 조건하에서 흡광도를 1 정도 상승시키는 효소량을 1 AU로 하였다.
여기서 사용한 pNP-프리메베로사이드는, 예를 들면 pNP-글루코사이드(머크사제)와 크실로올리고당(와코준야쿠사제)을 효소 크실로시다제(시그마사제)를 사용하여 반응시켜, pNP-글루코사이드에 크실로스를 β-1,6 결합으로 1 잔기 전이시킴으로써 합성할 수 있다.
실시예 1
페니실리움
멀티칼라
(
Penicillium
multicolor)
IAM
7153에 의한
디글리코시다제의
제조
디글리코시다제의
배양
2.0%의 탈지 대두, 3.0% 포도당, 0.5% 인산2수소칼륨, 0.4% 황산암모늄, 0.3% 건조 효모를 포함하는 생육 배지(pH 5.6)를 121℃에서 20분간 살균하였다. 살균한 배지 100㎖에 대하여 페니실리움 멀티칼라(Penicillium multicolor) IAM 7153을 1백금이로 접종하고, 27℃, 140min-1의 진탕 속도로 전배양을 하였다. 5일 후, 1.0% 선파이버 R, 2.0% 인산2수소칼륨, 1.0% 황산암모늄, 3.13% 미스트 P1G를 포함하는 pH 4.9의 본 배지 20L를 30L 용량의 소형 발효기에서, 150min-1로 교반하면서 121℃에서 20분간 살균하였다. 전배지를 1.5% 비율로 접종하고, 교반수 250min-1, 통기량 0.75vvm(15 L/min), 내압 0.5 Kg/㎠(48 kPa), 27±1℃에서 8일간 배양하였다.
디글리코시다제의
정제
배양 브로스에 여과 조재로서 젬라이트수퍼(Zemlite Super) 56 M과 파인플로(Fineflow) A를 전체 액량의 2 중량%를 첨가하고, 규조토 여과를 하였다. 한외여과막 UF AIP-2020(MW 6,000)에서 20배 농축을 함과 동시에, pH 4.7의 20mM 아세트산 완충액으로 대체하였다. 상기 한외여과 농축액에 황산암모늄을 첨가하고, 50% 황산암모늄 염석을 하였다. 수득된 침전을 제거하고, 상청액에 또한 황산암모늄을 첨가하여 80% 황산암모늄 염석을 하였다. 침전물을 회수하고, pH 4.7의 20mM 아세트산 완충액에 용해하였다. 용해액을 10-DG 컬럼(BioRad Co.)에 통과시켜, 완충액을 30% 포화 황산암모늄을 포함하는 pH 4.7의 20mM 아세트산 완충액으로 대체하였다(이 용액을 이하「조 디글루코시다제」라고도 한다). 이 용액을 소수성 크로마토그래피(HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose High Performance(Pharmacia))에 적용하고, 디글리코시다제 활성을 나타내는 분획을 β-글루코시다제 및 β-크실로시다제 활성의 분획으로 분리시켰다. 실온에서, 2㎖/min의 유속으로 30% 포화 황산암모늄을 포함하는 20mM 아세트산 완충액으로 용출을 개시하고, 30 내지 0%의 직선 구배로 용출하였다. 10 내지 12.5% 포화 황산암모늄 농도로 디글리코시다제 활성을 나타내는 분획이 용출되었다. 회수한 디글리코시다제 분획을 농축하고, 원심분리한 상청액을 10-DG 컬럼에 적용하고 용해액을 pH 7.1의 25 mM 트리스-염산 완충액으로 대체하였다. 이러한 액체를 등전점 크로마토그래피(Mono-P HR5/20(Pharmacia))에 적용하고, pH 5.0의 폴리버퍼 74로 1㎖/min, 실온에서 용출을 개시하였다. 목적하는 디글리코시다제 활성은 pH 6.2 내지 pH 6.3에서 용출하였다. 이 분획의 SDS 전기영동으로 단일 밴드가 얻어졌기 때문에, 디글리코시다제(이하 「정제 디글리코시다제」라고도 한다.)를 정제할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 2
각종 이소플라본 글리코사이드에 대한
디글리코시다제의
반응성
디글리코시다제를 pH 4.0의 아세트산 완충액으로 희석하고 0.75 AU/㎖의 효 소액을 조제하였다. 비교로서, 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 β-글루코시다제(Fluka사제) 또는 아몬드 유래의 β-글루코시다제(시그마사제), 펙티나제 G(아마노 엔자임 가부시키가이샤제)로부터 정제한 β-크실로시다제도 동일하게 수행하였다. 이소플라본 글리코사이드의 정제품(글리시틴, 아세틸글리시틴, 말로닐글리시틴, 다이드진, 아세틸다이드진, 말로닐다이드진, 게니스틴, 아세틸게니스틴, 말로닐게니스틴, 모두 나카라인덱스 가부시키가이샤제)을 메탄올에 용해하여 2mM의 각 기질 용액을 조제하였다. 기질 용액 10㎕, 20mM 아세트산 완충액(pH 4.0) 200㎕, 각 정제 효소액 40㎕을 혼합하고, 전체 액량 250㎕에서 반응시켰다. 55℃에서 반응시켜, 반응 0, 1, 3, 6시간의 반응액 중의 이소플라본 글리코사이드로부터의 유리된 아글리콘 이소플라본을 HPLC에 의해 검출하였다.
HPLC
분석
반응액에 에탄올을 700㎕ 첨가하고, 교반, 초음파 처리를 시행하고, 15,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 후, 상청액을 필터 여과하여 HPLC에 적용하였다.
당해 여액에 포함되는 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본을, TOSOH TSK 겔 ODS-80 TM 컬럼(도소 가부시키가이샤제)을 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC, Shimadzu CLASS LC-10시스템)에 의해, 분리 및 검출하였다. 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본을 포함하는 당해 여액을 오토인젝터(Shimadzu, SIL-10 AXL)에 의해 컬럼에 주입하고, 용리액 A(아세토니트릴)과 용 리액 B(10% 아세트산 용액)를 각각 2% 및 98% 포함하는 용액으로 개시하고, 5분 후, 용리액 A 50%, 용리액 B 50%의 용액으로 종료하는 선형 농도 구배를 사용하여 용리하였다. 전체 유속은 0.8㎖/min이고, 12종류의 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본, 즉, 글리시틴, 다이드진, 게니스틴, 6"-O-아세틸글리시틴, 6"-O-아세틸다이드진, 6"-O-아세틸게니스틴, 6"-O-말로닐글리시틴, 6"-O-말로닐다이드진, 6"-O-말로닐게니스틴, 글리시테인, 다이드제인, 게니스테인이 분리 가능하다. 260nm에서의 흡광도를 UV 검출기(Shimadzu, SPD-10 AV)에 의해 검출하였다. 표준 화합물로서, 상기 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본의 정제품(나카라인덱스 가부시키가이샤제)을 사용하여 검량선법(calibration curve method)에 의해 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본을 정량하였다. 또한, 특별히 단정하지 않는 한, 본원 명세서의 HPLC의 측정 조건은 당해 실시예에 기재한 것을 의미한다.
그 결과, 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 β-글루코시다제는 글리시틴, 다이드진, 게니스틴의 3종의 글루코사이드 이소플라본에 대하여 잘 작용할 수 있지만, 변형 글리코사이드에 대한 반응성은 대단히 낮았다. 식물 유래의 β-글루코시다제는 글루코사이드 이소플라본을 분해하지만 효율이 낮고, 변형 글루코사이드 이소플라본에 대하여는 전혀 작용할 수 없었다. 한편, 디글리코시다제는 모든 이소플라본 글리코사이드를 대단히 높은 효율로 절단할 수 있었다. 이 중에서도, 아세틸글루코사이드 이소플라본에 대한 분해 효율이 높았다. 이상의 결과로부터, 디글리코시다제는 이소플라본 글리코사이드로부터 아글리콘 이소플라본 을 대단히 효과적으로 절단하는 것으로 확인되었다(표 1).
또한, 본 효소에 부가하여 β-글루코시다제를 병용함으로써, 이소플라본 글루코사이드, 특히 게니스틴의 분해 효율을 더욱 높이는 것이 가능해지는 것도 확인되었다.
실시예 3
디글리코시다제
활성에 대한 유리
글루코스의
영향
정제 디글리코시다제를 pH 4.0의 20mM 아세트산 완충액으로 희석하고 0.75 AU/㎖의 효소액을 조제하였다.
실시예 2에 기재된 각 2mM 기질 용액 10㎕와 글루코스 용액을 혼합하고, pH 4.0의 20mM 아세트산 완충액을 첨가하여 액량을 210㎕로 하였다. 또한 효소액 40㎕를 첨가하고, 최종 액량 250㎕에서 반응을 수행하였다. 첨가하는 글루코스 용액을 조절하여, 반응액 중에 글루코스를 0 내지 20%의 범위에서 존재하도록 하였다. 55℃에서 반응을 하고, 반응 0, 0.5, 1 및 3 시간에서의 이소플라본 글리코사이드와 아글리콘 이소플라본의 존재를 HPLC로 분석하였다.
글루코스 농도 0%시, 반응 0.5 시간에서의 각 이소플라본 글리코사이드를 기질로 하였을 때에 유리된 아글리콘 함량을 100%로서 비교하면, 디글리코시다제의 아글리콘 이소플라본 전환 효율은 유리 글루코스 농도의 상승에 의해서 거의 저해를 받지 않는다는 것을 확인하였다. 반대로 8% 글루코스 농도까지는 전환 효율의 상승이 관찰되었다. 따라서, 디글리코시다제의 아글리콘 이소플라본 전환 반응에서는 20%까지의 농도의 글루코스에 의한 저해는 관찰되지 않았다(표 2).
또한, 종래의 아글리콘 이소플라본 전환법에 사용하는 β-글루코시다제는 글루코스에 의한 저해를 받아, 반응 효율의 대폭적인 저하가 관찰되는데 반하여, 본 발명의 디글리코시다제에 대하여는 글루코스에 의한 저해가 거의 없는 것을 확인하였다. 따라서, 기존의 글리코시다제로서는 아글리콘 이소플라본으로의 전환의 원료인 식물성 소재의 사용량, 종류 및 사용법이 제한되지만, 본 발명의 디글리코시다제에서는 이러한 제한이 없고, 이소플라본 아글리콘으로의 전환의 효율이 현저히 향상된다.
| 글루코스 | 이소플라본 글리코사이드 | |||||||
| 농도(%) | 글리시틴 | 다이드진 | 아세틸-글리시틴 | 아세틸-게니스틴 | 아세틸-다이드진 | 말로닐-글리시틴 | 말로닐-게니스틴 | 말로닐-다이드진 |
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 2 | 96 | 128.1 | 100.9 | 104.1 | 108.1 | 121.4 | 152 | 125.3 |
| 4 | 99.7 | 126 | 100.9 | 104.1 | 112.2 | 127.6 | 164.7 | 132.1 |
| 8 | 100.1 | 129.1 | 100.9 | 104.1 | 115.8 | 128.6 | 163.5 | 125.4 |
| 20 | 92.8 | 111.9 | 100.9 | 104.1 | 114.5 | 116.4 | 139.5 | 98.1 |
실시예 4
대두 소재를 사용한
디글리코시다제에
의한 이소플라본 아글리콘으로의 전환에서 온도 시험
각종 대두 소재(콩가루(후지쇼쿠료 가부시키가이샤제), 두유(기토 쇼쿠힝 가부시키가이샤제), 탈지 대두(후지세이유 가부시키가이샤제), 농축 대두 단백질(후지세이유 가부시키가이샤제)) 50㎎을 pH 4.0의 20mM 아세트산 완충액 400㎕에 현탁하고, 기질 용액을 조제하였다. 조 디글리코시다제를 pH 4.0의 20mM 아세트산 완충액으로 희석하고 디글리코시다제 활성을 1.88 AU/㎖로 하였다. 이 효소액 50㎕와 기질 용액을 혼합하고, 전량 500㎕에서 80, 65, 55, 45, 37 또는 30℃에서 반응시켰다. 반응 0, 1, 3 및 6시간 후의 반응액에 에탄올을 700㎕ 첨가하였다. 교반 및 초음파 처리를 시행하고, 15,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 필터 여과하여 반응액 중에 포함된 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본의 존재를 HPLC에 의해 검출하였다.
4종류의 소재(콩가루, 두유, 농축 대두 단백질, 탈지 대두)에 효소를 처리시키는 동안 디글리코시다제 활성을 포함하는 효소 제제에 의한 이소플라본 글리코사이드의 아글리콘 이소플라본으로의 분해 효율을 이소플라본 화합물을 3개의 그룹으로 나눠 조사하였다. 즉, 글리시틴 패밀리(글리시틴, 말로닐글리시틴, 아세틸글리시틴, 글리시테인), 게니스틴 패밀리(게니스틴, 말로닐게니스틴, 아세틸게니스틴, 게니스테인), 및 다이드진 패밀리(다이드진, 말로닐다이드진, 아세틸다이드진, 다이드제인)의 3 개 그룹에 관해서 전환 효율을 분석하였다(표 3 내지 14).
이소플라본 글루코사이드의 3개 그룹 모두는 검토한 모든 온도 범위에서 분해가 일어나, 37 내지 65℃, 특히 55℃에서 빠르게 일어난다. 또한, 탈지 대두에서는, 내재성의 β-글루코시다제도 분해에 관여한다. 분해의 대부분이 디글리코시다제에 의한 것으로 생각되는 변형 글루코사이드 글리코사이드의 분해는 37 내지 55℃에서 분해되기 쉬운 것으로 나타났다. 3개 그룹의 아글리콘 이소플라본에 공통적으로, 55℃, 6시간의 반응에서 아글리콘의 유리가 최대로 관찰되었다. 콩가루에서는, 글리시테인은 약 94%, 게니스테인은 약 74%, 다이드제인은 약 73%로 분해되었다. 두유에서는, 글리시테인은 약 84%, 게니스테인은 약 80%, 다이드제인은 약 70%로 분해되었다. 농축 대두 단백질에서는 글리시테인은 약 73%, 게니스테인은 약 61%, 다이드제인은 약 62%로 분해되었다. 탈지 대두에서는 글리시테인은 약 57%, 게니스테인은 약 57%, 다이드제인은 약 60%로 분해되었다.
이들의 결과로부터, 디글리코시다제에 의한 변형 글루코사이드 글리코사이드의 분해는 37 내지 65℃, 특히 55℃ 부근에서 효과적으로 일어나는 것으로 나타났다.
실시예 5
대두 소재를 사용한
디글리코시다제에
의한 이소플라본 아글리콘으로의 전환에서 pH 시험
각 대두 소재(콩가루(후지쇼쿠료 가부시키가이샤제), 두유(기토 쇼쿠힝 가부시키가이샤제), 탈지 대두(후지세이유 가부시키가이샤제), 농축 대두 단백질(후지세이유 가부시키가이샤제)) 50㎎을 정제수에 현탁하면서, 염산 또는 수산화나트륨으로 pH를 2 내지 11로 조정하여, 450㎕의 기질 용액을 조제하였다. 조 디글리코시다제의 디글리코시다제 활성을 1.88 AU/㎖로 조정한 pH 2 내지 11의 당해 효소액 50㎕를 첨가하고, 전량 500㎕, 55℃에서 반응시켰다. 반응 0, 1, 3 및 6시간 후의 반응액에 메탄올을 700㎕ 첨가하였다. 교반 및 초음파 처리를 시행하고, 15,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 필터 여과하여 반응액 중에 포함되는 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본의 존재를 HPLC에 의해 검출하였다(표 15 내지 26).
이들 결과로부터, 최적 pH는 3.5 내지 5의 범위에 있는 것을 확인하였다. 구체적으로는, 콩가루에서는, pH 4, 반응 6시간으로 각 이소플라본 패밀리의 아글리콘의 존재율은 글리시테인 100%, 게니스테인 87%, 다이드제인 89%이었다. 두유에서는, pH 3.5, 6시간의 반응으로 이소플라본 글리코사이드의 거의 완전한 분해가 일어나고, 글리시테인 100%, 게니스테인 97%, 다이드제인 93%이었다. 농축 대두 단백질에서는, pH 3.7, 반응 6시간으로 글리시테인 78%, 게니스테인 69%, 다이드제인 75%이었다. 탈지 대두에서는, pH 3.4, 반응 6시간으로 아글리콘이 최대로 유리되었고, 글리시테인 68%, 게니스테인 69%, 다이드제인 71%이었다.
실시예 6
대두 소재를 사용한
디글리코시다제에
의한 이소플라본 아글리콘으로의 전환에서 기질 농도 시험
각 대두 소재(콩가루(후지쇼쿠료 가부시키가이샤제), 두유(기토 쇼쿠힝 가부시키가이샤제), 탈지 대두(후지세이유 가부시키가이샤제), 농축 대두 단백질(후지세이유 가부시키가이샤제)) 0.1g, 0.25g, 0.5g, 1.0g 또는 1.5g을 pH 4.0의 20mM 아세트산 완충액에 현탁하였다. 현탁액의 pH를 측정하고, 1N 염산 용액으로 pH를 4.0으로 조정하면서 액량을 4.5㎖로 조정하였다. 조 디글리코시다제의 디글리코시다제 활성을 1.88 AU/㎖로 조정한 효소 제제를 0.5㎖ 첨가하고, 최종 액량을 5.0㎖로 하였다. 즉, 반응액 중에 차지하는 소재의 비율은, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%(w/v)로 된다. 55℃에서 진탕하면서 반응시켰다. 반응 후 0, 1, 3 및 6시간 후 반응액 5㎖에 대하여 에탄올을 7㎖ 첨가하고, 초음파 처리를 시행한 후 잘 혼합하였다. 2,000rpm, 실온에서 5분간 원심분리하고, 또한 이의 상청액 1㎖를 1.5㎖ 용량의 마이크로튜브로 옮겨, 15,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리를 하였다. 상청액을 필터여과하고, 각 샘플의 기질 농도에 따라서 1 내지 6배로 적절히 희석하였다. 희석액의 50㎕을 HPLC로 분석하였다(표 27 내지 38).
최적 반응 온도 및 pH를 조합시킴으로써, 검토한 모든 소재에 있어서, 10% 이하의 소재 농도인 경우 각 이소플라본 글리코사이드의 아글리콘의 유리는 70% 이상이었다. 특히 소재 농도가 2% 내지 5%인 때에는, 거의 100%의 이소플라본 글리코사이드로부터 아글리콘으로의 전환이 일어나는 것으로 나타났다.
실시예 7
디글리코시다제에
의한 아글리콘 이소플라본으로의 전환 반응을
촉진시키는
시판 효소 제제의 영향
소야플라본(Soyaflavone, 후지세이유 가부시키가이샤제)을 pH 3.0의 0.1M 아세트산나트륨 완충액에 현탁하고, 당해 기질 농도를 30%(w/v), 용액 pH를 5.0이 되도록 조제하였다. 50℃에서 1시간 예비 항온처리하고, 현탁액의 온도를 50℃로 상승시켰다. 이 현탁액에 각 시판 효소 제제(아밀라제 AD「아마노」1, YL-15, 글루코자임 NL4.2, 트랜스글루코시다제 L「아마노」, 모두 아마노 엔자임 가부시키가이샤제)를 단독 또는 디글리코시다제(0.3 AU)와 조합시켜 0.1%(w/v)가 되도록 첨가하였다. 50℃에서 6시간 반응시켜, 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본 조성의 변화를 HPLC로 분석하였다. 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본을 정량하고, 이 중의 아글리콘 이소플라본 이상치를 100%로 한 경우의 상대치를 도 1에 나타냈다.
각 아글리콘 이소플라본의 이상치는, 효소 무첨가의 이소플라본 글리코사이드 및 아글리콘 이소플라본의 함량으로부터 각 아글리콘 이소플라본마다 아래와 같이 산출하였다.
아글리콘 이소플라본의 이상치
= AG + G1 x MAG/MG1 + G2 x MAG/MG2 + ......
(AG; 아글리콘 이소플라본량, G1; 이소플라본 글리코사이드량, MAG; 아글리콘 이소플라본의 분자량, MAG; 이소플라본 글리코사이드의 분자량).
각 시판 효소 제제는, 그 자체에서는 글리코사이드를 대부분 가수분해할 수 없지만, 디글리코시다제와 조합시킴으로써, 유리 아글리콘 이소플라본량을 명백히 증가시켰다. 예를 들면, 디글리코시다제와 아밀라제 AD「아마노」1을 조합시킴으로써, 디글리코시다제 단독의 작용에 비교하여, 글리시테인은 2.1배 및 게니스테인은 1.3배의 증가가 확인되었다. 그렇지만, 다이드제인은 1.1배 정도 증가하였다. 디글리코시다제와 YL-15를 조합시킴으로써, 글리시테인은 1.8배, 게니스테인은 1.2배 및 다이드제인은 1.1배 증가하였고, 디글리코시다제와 글루코자임NL-4.2를 조합시킴으로써, 글리시테인은 0.8배, 게니스테인은 1.1배 및 다이드제인은 1.0배 증가하였으며, 디글리코시다제와 트랜스글루코시다제 L「아마노」를 조합시킴으로써, 글리시테인은 1.6배, 게니스테인은 1.0배 및 다이드제인은 1.0배의 증가를 보였다.
실시예 8
디글리코시다제에
의한 아글리콘 이소플라본으로의 전환 반응을
촉진시키는
아밀라제 AD「
아마노
」1의 유효량 시험
콩가루(후지 쇼쿠힝 가부시키가이샤제)를 pH 3.15로 조제한 0.1M 아세트산나트륨 완충액에 현탁하고, 당해 기질 농도를 30%(w/v), 용액 pH를 5.0이 되도록 조제하였다. 50℃에서 1시간 예비 항온처리하고, 현탁액의 온도를 50℃로 상승시켰다. 이 현탁액에 디글리코시다제를 최종 농도로 0.1%(w/v)(0.3 AU) 및 아밀라제 AD「아마노」1(아마노엔자임 가부시키가이샤제)을 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 및 0.0001%(w/v)로 되도록 첨가하여 50℃에서 3시간 반응시켜, 이소플라본 조성의 변화를 HPLC로 분석하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 0.1%(w/v) 보다도 낮은 농도에서 오히려 아글리콘의 유리량이 증가하는 것을 확인하였다. 0.0001%(w/v)라는 소량에서도 효과를 나타냈다. 0.005%(w/v)에서, 글리시테인과 게니스테인이 각각 1.23 및 1.20배 증가하였다. 다이드제인에서는 1.2배 증가하였다. 또한, 0%는 디글리코시다제 단독의 경우의 결과를 의미한다.
실시예 9
디글리코시다제
또는 각 시판 효소 제제에 의한 대두 단백질의 풍미 개선
후지프로(Fujipro; 분리 대두 단백질, 후지세이유 가부시키가이샤제) 10g에 90㎖의 물을 가하고, 충분히 혼합시켜 대두 단백질 용액을 얻었다. 이에 디글리코시다제 또는 각 시판 효소 제제(아밀라제 AD「아마노」1, ADG-S-DS, 리파제 A「아마노」6, 락타제F-DS, 락타제F, 셀룰라제 A「아마노」3, 헤미셀룰라제「아마노」90G, 프로테아제 B, YL-15, 펙티나제 PL「아마노」, 트랜스글루코시다제 L「아마노」, 글루코자임 NL4.2, 모두 아마노 엔자임 가부시키가이샤제)를 첨가하고, 대두 단백질 용액 중에 디글리코시다제(0.5 AU) 또는 당해 각 효소 제제가 각각 25%(w/v)가 되도록 하였다. 50℃에서 5시간 처리를 하였다. 또한, 반응 pH는 7.1이었다. 관능 시험을 위해 완충액에 의한 영향을 고려하여 pH 조정은 수행하지 않았다(실시예 10 내지 12에서 동일).
관능 시험(
디글리코시다제
또는 각 시판 효소 제제에 의해 처리된 분리 대두 단백질의 풍미 개선)
관능 시험을 하기 위해서, 디글리코시다제 또는 각 시판 효소 제제로 처리된 대두 단백질을 1500xg, 4℃에서 20분간 원심분리를 하였다. 침전물을 제거하고, 염산을 사용하여 상청액의 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액을 2배 희석시켜 수득한 용액을 사용하여, 시험을 실시하였다. 평가는 숙련된 5명의 패널리스트에 의해 수행되며, 좋은 맛, 쓴 맛·떫은 맛, 뒷맛을 효소 비처리된 대조군과 비교하여 수행하였다(표 39).
그 결과, 디글리코시다제, 아밀라제 AD「아마노」1, ADG-S-DS, 리파제 A「아마노」6, 셀룰라제 A「아마노」3, 또는 헤미셀룰라제「아마노」90G에 의해서 쓴 맛·떫은 맛이 감소 또는 소실되었다.
또한, 뒷맛의 개선에는 디글리코시다제, 아밀라제 AD「아마노」1, ADG-S-DS, 리파제 A「아마노」6, 셀룰라제 A「아마노」3, 헤미셀룰라제「아마노」90G, YL-15, 펙티나제 PL「아마노」에 의한 처리로 효과가 있는 것으로 나타났다. 검토 항목 이외에도, 이들의 효소 제제에 의해서 단맛이 나오는 것이나 풋내감이 감소되는 것 등의 전체적인 풍미가 개선되는 것으로 나타났다.
실시예
10
디글리코시다제
및 각 시판 효소 제제에 의한 대두 단백질의 풍미 개선
후지프로(분리 대두 단백질, 후지세이유 가부시키가이샤제) 10g에 90㎖의 물을 가하고, 충분히 혼합시켜 대두 단백질 용액을 얻었다. 이에 디글리코시다제 및 각 시판 효소 제제(아밀라제 AD「아마노」1, ADG-S-DS, 리파제 A「아마노」6, 락타제F-DS, 락타제F, 셀룰라제 A「아마노」3, 헤미셀룰라제「아마노」90G, 프로테아제 B, YL-15, 펙티나제 PL「아마노」, 트랜스글루코시다제 L「아마노」, 글루코자임 NL4.2, 모두 아마노 엔자임 가부시키가이샤제)를 첨가하고, 대두 단백질 용액 중에 디글리코시다제가 6.5 AU 및 당해 각 효소 제제가 각각 0.25%(w/v)로 되도록 하였다. 50℃에서 5시간 처리를 하고, 효소 처리된 대두 단백질을 얻었다. 또한, 반응 pH는 7.1이었다.
관능 시험(
디글리코시다제
및 각 시판 효소 제제에 의해 처리된 분리 대두 단백질의 풍미 개선)
관능 시험을 하기 위해서, 효소 처리된 대두 단백질을 1500xg, 4℃에서 20분간 원심분리를 하였다. 침전물을 제거하고, 염산을 사용하여 상청액의 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액을 2배 희석시켜 수득한 용액을 사용하여, 시험을 실시하였다. 평가는 숙련된 5명의 패널리스트에 의해 수행되며, 좋은 맛, 쓴 맛·떫은 맛, 뒷맛을 효소 비처리된 대조군과 비교하여 수행하였다(표 40).
그 결과, 표에 나타낸 디글리코시다제와 각 시판 효소 제제의 모든 조합(디글리코시다제와 아밀라제 AD「아마노」1, 디글리코시다제와 ADG-S-DS, 디글리코시다제와 리파제 A「아마노」6, 디글리코시다제와 락타제F-DS, 디글리코시다제와 락타제F「아마노」, 디글리코시다제와 셀룰라제 A「아마노」3, 디글리코시다제와 헤미셀룰라제「아마노」90G, 디글리코시다제와 프로테아제 B, 디글리코시다제와 YL-15, 디글리코시다제와 펙티나제 PL「아마노」, 디글리코시다제와 트랜스글루코시다제 L, 디글리코시다제와 글루코자임)에 있어서, 좋은 맛이 느껴지고, 쓴 맛·떫은 맛의 감소, 또는 뒷맛이 개선된다고 하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이들 사실로부터, 디글리코시다제 단독 보다도, 디글리코시다제와 각 시판 효소 제제의 조합에서, 풍미 개선의 효과가 보다 높아지는 것이 분명해졌다.
실시예 11
디글리코시다제
또는 각 시판 효소 제제에 의한 두유의 풍미 개선
성분 무조제의 두유(기토 쇼쿠힝 가부시키가이샤) 20㎖에 대하여, 디글리코시다제 또는 각 시판 효소 제제(ADG-S-DS, 아밀라제 AD「아마노」1, 셀룰라제 A「아마노」3, 헤미셀룰라제「아마노」90G, 모두 아마노 엔자임 가부시키가이샤제)를 첨가하고, 두유 중에 디글리코시다제가 6.5 AU 또는 각 효소 제제가 0.25%(w/v)가 되도록 첨가하였다. 55℃에서 1.5시간 처리 후, 70℃에서 1시간의 가열 처리에 의해 효소를 실활시켰다. 또한, 반응 pH는 6.6이었다.
관능 시험(
디글리코시다제
또는 각 시판 효소 제제에 의해 처리된 두유의 풍미 개선)
이렇게 하여 수득된 효소 처리액을 물로 3배 정도 희석하고, 관능 시험에 제공하였다. 평가는 숙련된 5명의 패널리스트에 의해 좋은 맛, 쓴 맛·떫은 맛, 뒷맛을 효소 비처리된 대조군과 비교하여 수행하였다(표 41)
여기에 나타낸 디글리코시다제 또는 시판 효소 제제에 의해서, 단맛이 생기고, 그리고 쓴 맛·떫은 맛이 감소되며 뒷맛이 개선되는 것으로 나타났다.
실시예 12
디글리코시다제
및 각 시판 효소 제제에 의한 두유의 풍미 개선
성분 무조제의 두유(기토 쇼쿠힝 가부시키가이샤) 20㎖에 대하여, 디글리코시다제와 각 시판 효소 제제(ADG-S-DS, 아밀라제 AD「아마노」1, 셀룰라제 A「아마노」3 또는 헤미셀룰라제「아마노」90G, 모두 아마노 엔자임 가부시키가이샤제)를 첨가하고, 두유 중에 디글리코시다제가 6.5 AU 및 당해 각 시판 효소 제제가 0.25 %(w/v)가 되도록 첨가하였다. 55℃에서 1.5시간 처리 후, 70℃에서 1시간의 가열 처리에 의해 효소를 실활시켰다. 또한, 반응 pH는 6.6이었다.
관능 시험( 디글리코시다제 및 각 시판 효소 제제에 의해 처리된 두유의 풍미 개선)
이렇게 하여 수득된 효소 처리액을 물로 3배 정도 희석하고, 관능 시험에 제공하였다. 평가는 숙련된 5명의 패널리스트에 의해 좋은 맛, 쓴 맛·떫은 맛, 뒷맛을 효소 비처리된 대조군과 비교하여 수행하였다(표 42)
관능 시험의 결과, 표에 나타낸 디글리코시다제와 시판 효소 제제의 모든 조합(디글리코시다제와 ADG-S-DS, 디글리코시다제와 아밀라제 AD「아마노」1, 디글리코시다제와 셀룰라제 A「아마노」3, 디글리코시다제와 헤미셀룰라제「아마노」90G)에서, 단맛이 느껴지고, 쓴 맛·떫은 맛이 감소하거나, 뒷맛이 개선된다고 하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 효소 처리에 의해서, 대두 단백질 특유의 풋내감도 감소되는 등의 전체적으로 풍미가 개선되는 것이 확인되었다. 이들 사실로부터, 디글리코시다제 단독 또는, 시판 효소 제제 단독보다도 디글리코시다제와 시판 효소 제제의 조합에서, 풍미 개선의 효과가 보다 더 증강되는 것이 입증되었다.
실시예 13
디글리코시다제에
의한
위내
pH에서의 탈지 대두 단백질로부터의 아글리콘 이소플라본의 생성
탈지 대두 단백질(후지세이유 가부시키가이샤제) 0.05g을 pH 4.0의 20 mM 아세트산 완충액에 현탁하였다. 현탁액의 pH를 측정하고, 1N 염산 용액으로 pH를 4.0으로 조정하면서 액량을 4.5㎖로 조정하였다. 조 디글리코시다제의 디글리코시다제 활성을 1.88 AU/㎖로 조정한 효소액을 0.5㎖ 첨가하고, 최종 액량을 5.0㎖(탈지 대두 단백질의 농도: 1%(w/v))로 하고, 37℃에서 3시간 처리하였다. 처리 후 반응물 25㎕에 메탄올 75㎕와 물 500㎕을 가하고 0.2μm의 필터로 여과후 물로 또한 2.5배 희석한 후 HPLC 분석하였다.
상기한 바와 같이, 탈지 대두 단백질을 식사 중의 위내 pH의 범위인 pH 4로 처리한 결과, 효소를 가하지 않은 pH 4의 처리에서는 아글리콘 이소플라본의 유리는 보이지 않았지만, 디글리코시다제로 처리한 것에는 아글리콘 이소플라본의 유리가 확인되었다. 따라서, 위내 pH의 조건에서 디글리코시다제는 이소플라본 글리코사이드를 아글리콘 이소플라본으로 변환할 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 14
디글리코시다제에 의한 위내 pH에서의 볶은 콩가루로부터의 아글리콘 이소플라본의 생성
2.5g의 볶은 콩가루(가구다이산교사제)를 100㎖의 50mM 아세트산 완충액(pH 5)에 현탁시켰다.
이 현탁액 3㎖에 디글리코시다제(290 AU/g) 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.15, 0.374, 0.75 또는 1.5㎎을 첨가하고, 37℃에서 30분간 진탕하면서 항온처리하였다. 반응 후, 10㎖의 메탄올을 첨가하고, 아글리콘 이소플라본을 추출하여 HPLC로 분석하였다.
상기한 바와 같이, 위내 환경을 상정하고, pH 5로 37℃에서 30분간 반응시킨 때의 콩가루에 포함되는 이소플라본 글리코사이드로부터의 아글리콘 이소플라본의 생성을 조사한 결과, 표 43 및 도 3에 나타낸 바와 같이 이소플라본 글리코사이드의 80% 이상을 이소플라본 아글리콘으로 변환시킬 수 있었다. 이 결과는 디글리코시다제를 경구 투여하였을 때, 위내에서 이소플라본 글리코사이드로부터 아글리콘 이소플라본이 생성될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
| 디글리코시다제 | 아글리콘 이소플라본(%) |
| 1.500 0.750 0.374 0.150 0.075 0.050 0.025 0.010 0.005 0.002 0.001 0 | 86.1% 81.3% 74.7% 65.4% 56.3% 51.1% 44.3% 31.0% 20.3% 12.8% 9.2% 5.0% |
실시예 15
디글리코시다제에
의한
위내
pH에서의 이소플라본 제제로부터의 아글리콘 이소플라본의 생성
150㎎의 이소플라본 제제(Nature's Bounty사제, 미국)를 100㎖의 50mM 아세트산 완충액(pH 5)에 현탁시켰다. 이 현탁액 3㎖에 디글리코시다제(290 AU/g) 0, 0.00045, 0.00113, 0.00225, 0.0045, 0.009, 0.0225, 0.045, 0.09, 0.18, 0.45 및 0.9㎎을 첨가하고, 37℃에서 30분간 진탕하면서 항온처리하였다. 반응 후, 10㎖의 메탄올을 첨가하고, 아글리콘 이소플라본을 추출하여 HPLC로 분석하였다.
상기한 바와 같이, 위내 환경을 상정하고, pH 5로 37℃에서 30분간 반응시켰을 때의 이소플라본 제제에 포함되는 이소플라본 글리코사이드로부터의 아글리콘 이소플라본의 생성을 조사한 결과, 표 44 및 도 4에 나타낸 바와 같이 이소플라본 글리코사이드의 약 80%를 이소플라본 아글리콘으로 변환시킬 수 있었다. 이 결과는 디글리코시다제를 경구 투여하였을 때, 위내에서 이소플라본 글리코사이드로부터 아글리콘 이소플라본이 생성될 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
| 디글리코시다제(㎎) | 아글리콘 이소플라본(%) |
| 0.90000 0.45000 0.18000 0.09000 0.04500 0.02250 0.00900 0.00450 0.00225 0.00113 0.00045 0.00000 | 79.4% 78.7% 75.3% 70.7% 64.6% 59.2% 47.5% 38.9% 30.3% 25.6% 21.5% 20.0% |
산/알칼리 처리나 발효 공정에 의하지 않고, 소재의 물리적 성질을 실질적으로 변경하지 않고, 또한 아글리콘 유형의 생리 활성 물질을 효율적으로 제조할 수 있다.
디글리코시다제는 기존의 글루코시다제로는 분해시키기 어려운 6"-O-아세틸 및 6"-O-말로닐글루코사이드에 잘 작용하는 성질이 있는 점에서, 문헌[일본 공개특허공보 제(평)10-117792호]에 기재된 난분해성 이소플라본 글리코사이드를 알칼리 처리에 의해 글루코시다제 분해성의 이소플라본 글리코사이드로 변환하는 공정을 수행할 필요가 없고, 1 단계로 공정을 수행할 수 있다. 또한 본 방법에서는, 강산을 사용한 가수분해에 의한 방법으로 야기되는 단백질이나 인지질 등의 분해에 기인하는 원료의 물성 변화를 거의 야기하지 않는다. 또한, 디글리코시다제 및/또는 특정한 효소 제제를 사용함으로써, 단백질 또는 단백질 함유 식품의 아글리콘 함량을 높이고, 또한 이의 풍미를 개선할 수 있다.
Claims (3)
- 단백질 또는 단백질 함유 식품에 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제, 프로테아제, 리파제, α-글루코시다제, α-갈락토시다제 및 효모 용해성 효소로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 함유하는 효소 제제를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질 또는 단백질 함유 식품이 아글리콘으로서 후라보노이드를 함유하는 글리코사이드를 함유하는 것인, 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 또는 단백질 함유 식품이 아글리콘으로서 이소플라본을 함유하는 글리코사이드를 함유하는 것인, 풍미가 개선된 단백질 또는 당해 단백질 함유 식품의 제조 방법.
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