KR20060036050A - 피루베이트를 생산하는 효모 균주 - Google Patents

피루베이트를 생산하는 효모 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가지며 그 야생형 효모 균주가 크랩트리 양성인, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 포도당 내성 C2 탄소원-의존성 효모 균주의 선별 방법 및 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 이용한 피루브산 또는 그 염의 생산 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 갖는 GCSI 효모 균주에 관한 것이다.

Description

피루베이트를 생산하는 효모 균주 {PYRUVATE PRODUCTING YEAST STRAIN}
본 발명은 일반적으로 포도당과 함께 호기성 환경에서 생육시킬 때 상당량의 에탄올은 생산하지 않으면서 상대적으로 고농도의 피루브산 또는 그 염을 생산하는, 크랩트리(Crabtree) 양성 효모에서 유래하는 효모에 관한 것이다. 본 발명은 피루베이트 탈탄산효소(decarboxylase) 활성이 없고 포도당이나 기타 당류를 함유하는 미네랄 배지 내의 호기성 환경에서 증식하여 피루브산 또는 그 염을 생산할 수 있는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 등의 크랩트리 양성 효모에 관한 것이다. 본 발명은 또한 배양시 비교적 고농도의 락트산(lactic acid)을 생산할 수 있는 효모에 관한 것이다.
특정 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 다량의 탄수화물(예컨대 포도당)의 존재 하에 혐기성 환경 및 호기성 환경 모두에서 당을 급속히 에탄올과 이산화탄소로 발효시키는데 이용될 수 있다는 것은 당업계에 공지된 사실이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 다른 곰팡이들을 이용하여 에탄올 외에도 시판용 화합물(chemical compound)을 생산할 수 있다. 상업 공정에 있어서는 생산 수율 및/또는 농도를 최대화하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위하여 이용되어 왔던 하나의 방법은 알코올 발효에서 탄소 플럭스 (flux)를 재유도(redirection)하고 생산이 목적하는 생성물 쪽으로(toward) 진행되도록 하는 것을 포함한다.
모든 살아있는 세포의 당 대사에서 흔한 중간산물인 피루브산(및 그 염)을 회수하는 것은 상업적인 관심사이다. 피루브산 또는 그 염은 특정 약품의 화학적 합성에서 시작 원료물질로 사용될 수 있다. 또한 피루브산과 그 염은 특정 농작물 보호제, 폴리머, 화장품 및 식품 첨가제 생산에 유용하게 쓰인다. 몇몇 증거들에 따르면 피루베이트는 사람의 건강 증진에도 도움을 줄 수 있다고 한다. 또한 피루브산 또는 그 염으로부터 시판용 화학 제품이 생화학적으로 유도될 수도 있다. 예를 들어, 락테이트나 알라닌은 단일 효소 반응에 의해 피루브산으로부터 각각 생산될 수 있다. 마찬가지로 말레이트도 2 단계 효소 반응을 통해 생산될 수 있다.
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모는 피루브산, 그 염 및 당이나 탄수화물 공급 원료(feed stock)에서 얻은 화학적 유도체를 생산하기 위한 좋은 미생물로 주목을 받아 왔다. 이는 효모가 당분해 플럭스(예컨대 비교적 높은 피루브산 생성 속도)와 내산성 등의 바람직한 성질을 가지고 있기 때문이다.
어떤 효모, 그 중에서도 크랩트리 양성 효모가 과량의 탄소원을 이용하여 성장할 때 그 탈탄산화의 주요 경로는 피루베이트 탈탄산효소를 포함한다. 크랩 양성 효모는 다량의 당(예컨대 포도당)의 존재 하에 호기성 조건이나 또는 그 배양균의 비증식 속도가 임계(critical) 비증식 속도보다 높을 때 피루베이트로부터 알코올을 생산한다. 크랩트리 양성 효모의 예들은 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)(당업계에 알려진 다른 명칭들 중 토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)로도 알려져 있음), 지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) 및 치조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등에서 찾을 수 있다. 통기성(facultative) 발효 효모(예컨대 알코올 발효 또는 호흡 또는 양자 모두로 살아갈 수 있는 효모) 내 피루베이트 탈탄산화는 2가지 효소, 피루베이트 탈수소효소 복합체(complex) 및/또는 피루베이트 탈탄산효소를 통해 일어날 수 있다. 에탄올 생성으로부터 탄소 플럭스를 재유도하여(redirect) 배양액 내 피루베이트 및 그 유도체의 농도와 수율을 향상시키기 위해서는 피루브산의 탈탄산화를 제한하는 것이 바람직하다.
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 함유하는 피루베이트 탈탄산효소(EC 4.1.1.1)는 피루베이트의 아세트알데히드로의 전환을 촉매하며, 이는 당 발효 대사작용의 첫 단계이다. 피루베이트 탈탄산효소는 이러한 이화(catabolic) 활성 외에도 생합성 작용을 한다고 알려져 왔다. 피루베이트 탈탄산효소 음성(Pdc 음성)(예컨대 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가짐) 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 소량의 에탄올이나 아세테이트(예컨대 성장에 필요한 5% 탄소) 첨가 없이 포도당이 단독 탄소원인 경우에는 호기성 포도당 제한 케모스탯 내의 합성 배지 상에서 성장하지 못한다는 점은 당업계에 공지된 사실이다. 상기 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 유일한 다른 탄소원으로 포도당을 함유하는 합성 배양 배지 상에서 회분 배양하는 경우에는 소량의 에탄올이나 아세테이트가 존 재하는 경우에조차 성장하지 못하는 것으로 알려져 있다. 이와 대조적으로 피루베이트 탈탄산효소 활성이 없는 크랩트리 음성 효모는 당을 이용한 호기성 성장시 상기와 같은 성장을 위한 요구 조건을 나타내지 않는다.
Pdc 음성 쓰레오닌 알돌라제(threonine aldolase)를 과다발현하는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 호기성 당-제한 케모스탯에서 생육할 수 있다는 점에서, 효모 내 쓰레오닌 안돌라제(EC 4.1.2.5)을 대량생산함으로써 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 피루베이트 탈탄산효소의 생합성 활성이 손상되는 것을 피할 수 있다는 사실 또한 널리 알려져 있다. 그러나 피루베이트 탈탄산효소 활성이 없는 쓰레오닌 알돌라제 대량생산 균주는 높은 당농도에서 성장을 약화시킨다.
락트산(2-히드록시프로피온산, CH3CHOHCOOH)은 발효 또는 화학합성으로 생산이 가능한 자연 발생 히드록실산이다. 락트산은 방부제나 향미증진제의 형태로 식품에 사용될 수 있다. 락트산 유도체는 페인트와 전착 코팅제(electrodeposition coating) 등의 공업 용도 뿐 아니라 약품과 화장품으로 이용될 수도 있다. 락트산을 탈수시켜서 만들 수 있는 주요 화합물로는 폴리(락트산) 플라스틱이 있다.
락테이트 탈수소효소를 함유(예컨대 LDH-함유)한 플라스미드로 형질전환시킨 야생형 에스.세레비지에(S.cerevisiae)는 배양시 락트산을 약간 생산할 수 있다. 바람직하게 락트산은 가능한 가장 고순도로 회수 및 정제되는 것이 좋다. (예컨대 복합 질소원에서 유래한)유기 불순물, (배지 성분 및 중화제와 연관된) 무기 불순 물 및 발효 과정에서 생산 미생물이 분비하는 대사 중간산물은 모두 제거하는 것이 바람직하다.
발명의 개시
일 구체예에서, 본 발명은 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가지며, 단독 탄소 및 에너지원으로 비교적 높은 농도의 포도당을 함유하는 합성 배지를 이용한 호기성 회분 배양에서 생육하여, 비교적 고농도의 피루브산과 그 염을 생산할 수 있는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 효모 균주 및 다른 크랩트리 양성 효모에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 효모 균주들은 표적(targeted) 대사 공학을 이용하지 않고서 얻을 수 있다. 일 구체예에서 상기 효모는 야생형 균주보다 높은 수준의 쓰레오닌 알돌라제 활성을 나타내지 않는다.
본 발명의 일 구체예는 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가지며 그 야생형 효모 균주가 크랩트리 양성인, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주에 관한 것이다. 일 구체예에서, GCSI 효모 균주는 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 가수분해 전분, 갈락토스, 고과당(high fructose) 옥수수 시럽, 락토스 및 가수분해 리그노셀룰로스 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한가지 이상의 탄소원을 함유하는 배양 배지에서 생육할 수 있다. 본 발명에 따른 GCSI 효모 균주를 합성 배지에서 호기성 회분 배양하는 경우 적어도 약 0.5moles피루브산/리터 이상의 농도로 피루브산을 생산할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 GCSI 효모 균주는 에스.세레비지에(S. cerevisiae) 효모일 수 있다. 다른 구체예에서 상기 GCSI 효모 균주는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)일 수 있다. 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 효모 균주가 탄소원으로 이용할 수 있는 당(예컨대 포도당)을 함유하는 최소 배지에서 본 발명에 따른 GCSI 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 효모 균주를 배양하는 경우 약 700mM 이상으로 피루브산 또는 그 염을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 GCSI 효모 균주를 선별하는 방법에 관한 것이며, 다른 구체예는 상기 방법을 이용하여 선별될 수 있는 효모 균주에 관한 것이다. 선별 방법은 호기성 탄소 제한 케모스탯에서 효모 배양균을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 효모 배양은 Pdc 음성 효모 균주를 첫번째 미네랄 배지에 접종함으로써 시작된다. Pdc 음성 효모 균주의 야생형 효모 균주는 크랩트리 양성이다. Pdc 음성 효모 균주는 야생형 효모 균주 내 피루베이트 탈탄산효소 활성을 없애는 경우에 유래될 수 있다.
배양균의 생육이 시작되는 시기의 첫번째 미네랄 배지는 효모 배양균이 성장하기에 충분한 농도의 포도당과 C2 탄소원을 단독 탄소원으로 포함할 수 있다. 케모스탯 내에서 효모 배양균이 성장하는 동안에는 주입 배지 내의 C2 탄소원의 농도를 떨어뜨려 그 C2 탄소원의 농도가 총 탄소 약 10% 내지 0%의 표적 범위 내에 있도록 할 수 있다.
적어도 하나 이상의 C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 그 C2 탄소원의 농도가 표적 범위에 도달하고 나면 케모스탯에서 회수할 수 있다. 회수된 C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가진다. 그 후 두번째 미네랄 배지를 사용하여 단일 호기성 회분 배양 또는 일련의(series) 호기성 회분 배양으로 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 배양할 수 있다. 포도당은 회분 배양 내에서 단독 탄소원일 수 있으며, 그 포도당의 농도는 일련의 회분 배양 전반에 걸쳐 높아질 수 있다. 회분 배양이나 일련의 배양을 시작하는 초기 회분 배양에서 포도당의 농도는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주가 성장할 수 있을 정도이다. "성장할 수 있는 포도당의 양"으로 배양을 시작하게 되면 요컨대 결과적으로 포도당 내성의 초기 선별이 가능할 수 있다. 그래서 일 구체예에서 C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 단독 탄소원으로 낮은 수준의 포도당에서는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 돌연변이체가 될 때까지 자라지 못하고 회분 배양에서 포도당의 존재 하에 자라기 시작한다. 선별된 돌연변이체는 탄소원으로 포도당을 이용하여 성장할 수 있다. 일련의 회분 배양에서는 그 배양 초기에 얻은 회분 배양액에서 자란 효모를 각 연속 회분 배양에 접종(seed)하였다.
적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 일련의 회분 배양 중의 하나의 회분 배양에서 회수할 수 있다. 상기 GCSI 효모 균주는 C2 탄소원 없이 단독 탄소원으로 포도당을 이용하여 자랄 수 있다. 상기 회수된 GCSI 효모 균주는 회수된 C2 탄소원-비의존성 효모 균주보다 더욱 포도당 내성이며, 상기 GCSI 효모 균주는 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는다. 일 구체예에서 상기 GCSI 효모 균주는 (A)야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나 이상의 PDC 구조 유전자, (B)야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나의 PDC 조절 유전자, (C)PDC 구조 유전자의 프로모터, 및 (D)PDC 조절 유전자의 프로모터를 포함할 수 있다. (A)-(D) 중 적어도 한가지 이상이 (i)돌연변이되거나, (ii)파괴되거나, 또는 (iii)결실되어 피루베이트 탈탄산효소 활성 결핍의 원인이 된다.
일 구체예는 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주를 선별하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 선택된 GCSI 효모 균주에 관한 것이다. 상기 방법은 Pdc 음성 효모 균주(예컨대 상술한 Pdc 음성 효모)를 미네랄 배지에 접종하는 것을 포함할 수 있다. 상기 Pdc 음성 효모 균주는 호기 배양될 수 있다. 상기 효모 배양균의 생육 개시시, 미네랄 배지는 효모 배양균이 생육하기에 충분한 농도의 C2 탄소원과 포도당을 단독 탄소원으로 포함한다. 상기 C2 탄소원 농도는 효모 배양균이 자람에 따라 그 배양균이 C2 탄소원 없이 생육할 수 있을 때까지 감소한다. 상기 포도당 농도는 효모 배양균이 성장함에 따라 증가한다. 피루베이트 탈탄산효소 활성을 결핍한 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 마지막에 회수할 수 있다. 일 구체예에서, C2 탄소원 농도의 감소 단계와 포도당 농도의 증가 단계를 동시에 수행할 수 있으며, 상기 동시 수행 단계는 하나의 호기성 케모스탯에서 행해지는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서는 C2 탄소원의 농도를 감소시키는 단계에 앞서 포도당 농도를 증가시키는 단계가 행해지며, 바람직하기는 양 단계가 단일 호기성 케모스탯 내에서 이루어지는 것이다. 다른 구체예에서는 C2 탄소원 농도를 감소시키는 단계가 포도당 농도를 증가시키는 단계 이전에 이루어진다. 감소 단계가 먼저 행해지는 경우, 일 구체예에서는 증가 및 감소 단계 모두가 케모스탯(들)에서 행해지거나 또는 다른 방편으로 감소 단계는 케모스탯에서 행해지고 증가 단계는 일련의 회분 배양에 걸쳐 행해질 수도 있다.
본 발명의 일 구체예는 피루브산 또는 그 염을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 피루브산 또는 그 염을 생산하기 위하여 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주를 첫번째 배양 배지에서 호기성 배양하는 것을 포함한다. GCSI 효모 균주의 야생형 균주는 크랩트리 양성이다. 첫번째 배양 배지는 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 락토스, 갈락토스, 가수분해 전분, 고과당 옥수수 시럽 및 가수분해 리그노셀룰로스 등으로 구성된 군 중에서 선택된 적어도 한가지 이상의 탄소원을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 GCSI 효모 균주를 첫번째 배양 배지로 호기성 회분 배양하는 경우 적어도 약 1.53moles피루브산/리터의 피루브산을 생산할 수 있다. 첫번째 배양 배지는 미네랄 배지일 수 있고, 일 구체예에서는 특히 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 미네랄 배지일 수 있다. 생산된 피루브산 또는 그 염은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 상술한 바대로 GCSI 효모 균주 내에서 발현가능한 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 포함하는 게놈으로 이루어진 GCSI 효모 균주에 관한 것이다. 외인성 락테이트 유전자의 발현으로 얻어진 단백질은 락테이트 탈수소효소 활성을 갖는다. 몇몇 구체예에서, 상기 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 갖는 GCSI 효모 균주(GCSI-L)는 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 배양하는 경우 약 70g락트산/100g포도당보다 많은 락트산을 생산할 수 있다. GCSI-L 균주는 일 구체예에서 유전자형 pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52 YEpLpLDH를 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 몇몇 구체예에서 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 보바인(bovine), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 또는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophylus) 락테이트 탈수소효소 유전자일 수 있다. 상기 유전자들의 뉴클레오티드 서열은 각각 기탁번호 AJ293008, NP776524, M76708, M22305, Q9P4B6, 및 M19396로서 Genbank로부터 입수할 수 있다. 외인성 LDH를 갖는 GCSI 효모 균주는 일 구체예에서 최소 배지에서의 호기 배양시 배양 브로쓰 내에 약 100g/l 이상의 락트산을 생산할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 외인성 LDH를 갖는 GCSI 효모 균주는 L-락트산으로 필수 구성된 락트산을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 락트산 또는 그 염을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 첫번째 배양 배지에서 GCSI-L 효모 균주를 호기 배양하는 것을 포함한다. 외인성 LDH를 함유하는 상기 GCSI 효모 균주는 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서의 생육시 적어도 약 70g락트산/100g포도당 이상으로 락트산을 생산할 수 있다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
"피루베이트 탈탄산효소(Pyruvate decarboxylase)"(Pdcp)는 피루베이트의 아세트알데히드로의 전환(conversion)을 촉매할 수 있는 임의 단백질(예컨대 효소)를 의미한다. "PDC"는 특정 야생형 피루베이트 탈탄산효소 유전자를 의미한다. "검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성"은 이전의 방법(24)을 사용하여 측정하였을 때 효모 내의 피루베이트 탈탄산효소 활성이 검출 한계인 0.005micromol/min/mg단백질 이하인 경우를 의미한다. 당업계에 알려진 방법을 이용하여 효모 균주로부터 피루베이트 탈탄산효소 활성을 감소시키거나 또는 본질적으로 제거할 수 있다. 예를 들어, 피루베이트 탈탄산효소 구조 유전자, 피루베이트 탈탄산효소 구조 유전자의 프로모터, 피루베이트 탈탄산효소 구조 유전자 발현을 조절하는 유전자, 또는 조절 유전자의 프로모터를 돌연변이시키거나 파괴시키거나 또는 적어도 일부의 유전자를 결실시킬 수 있다. 이로써 감소된 피루베이트 탈탄산효소 활성 또는 효모 균주 내 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성이 가능할 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 그밖의 방법들을 이용하여 유전자 발현을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 안티센스 작제물을 효모 균주 내로 도입하여 피루베이트 탈탄산효소 mRNA의 피루베이트 탈탄산효소 단백질로의 번역(translation)을 감소시킬 수 있다.
"Pdc 음성 효모 균주"는 검출불가능한 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가지며 단독 탄소원으로 포도당이 있는 합성 배양 배지상의 호기성 환경에서는 생육하지 않는 효모를 의미한다. 적어도 몇몇 Pdc 음성 균주는 미네랄 배지 내의 호기성 환경에서 생육하는 동안 검출가능한 양의 에탄올을 전혀 생산하지 않는다. Pdc 음성 균주인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 합성 배지상의 포도당-제한 케모스탯(chemostat)에서 생육시키는 경우에는 소량의 C2 탄소원(예컨대 에탄올, 아세트알데히드, 및/또는 아세테이트)의 첨가가 필수적이다. 같은 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)라도 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 합성 배지상의 회분 배양에서는 설사 소량의 에탄올이나 아세테이트가 존재할지라도 자라지 않을 것이다. Pdc 음성 균주에 상응하는 동질유전자(isogenic) 야생형 균주는 크랩트리(Crabtree) 양성이다(하기 설명 참조). 야생형 균주는 검출가능한 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가진다. 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 배양 배지에서 생육할 수 없는 Pdc 음성 균주는 야생형 균주로부터 피루베이트 탈탄산효소 활성이 제거된 경우(예컨대 구조 유전자의 파괴나 돌연변이, 또는 유전자 발현 조절의 파괴 등등)에 유도될 수 있다.
"락테이트 탈수소효소(Lactate dehydrogenase)"(Ldhp)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 촉매하는 단백질(예컨대 효소)를 의미한다. "LDH"는 발현시 락테이트 탈수소효소 활성을 갖는 단백질을 얻을 수 있는 야생형 유전자를 의미한다. "ldh"는 락테이트 탈수소효소의 돌연변이 유전자를 의미한다. 본 출원에서의 LDH는 발현시 락테이트 탈수소효소 활성을 갖는 단백질로 발현된다면 당업계에서 락테이트 탈수소효소로 명명되지 않은 유전자를 포함할 수 있다. 락테이트 탈수소효소 유전자는 입체특이적(stereospecific)일 수 있다. 즉, 락테이트 탈수소효소 유전자는 반응을 촉매하여 L-락테이트 또는 D-락테이트 한가지만을 생산할 수 있다. 다른 락테이트 탈수소효소는 반응을 촉매하여 L-락테이트와 D-락테이트 둘다를 생산한다. L-락테이트 탈수소효소 유전자는 피루베이트의 L-락테이트로의 전환을 촉매한다.
"야생형(wild type) 효모"는 그 게놈 상에 유전성의(heritable) 유전자 변이(genetic alteration)가 일어나 돌연변이 효모를 생산하는 효모를 의미한다. 다시 말하면 야생형 효모 균주의 게놈에는 존재하지 않던 어떤 염기가 돌연변이, 즉 결실 또는 삽입의 형태로 게놈 내로 도입되었다는 점에서 돌연변이 효모 균주는 야생형 균주와는 상이한 유전자형(genotype)을 갖는다. 따라서 야생형 효모 균주는 돌연변히 효모 균주의 게놈상에 존재하는 변화가 없다. 몇몇 돌연변이 효모 균주의 경우에는 야생형 균주와 상이한 표현형(phenotype)을 가진다. 돌연변이 효모 균주는 상동(homologous) 재조합, 부위특이적 돌연변이 또는 무작위 돌연변이 등등 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 어떤 돌연변이 효모 균주의 경우에는 자연 선별(natural selection)을 포함한 과정에 의하여 회수(recover)될 수 있다.
"모(parent) 효모"는 새로운 효모 균주가 직접 유래한 효모를 의미한다. 예를 들어, 모균주는 그 생육에 C2 탄소원(하기 참조)을 요구하는 외인성(exogenous) 락테이트 탈수소효소 유전자를 게놈 내에 가진 효모를 포함한다. 락테이트 탈수소효소 유전자를 가진 내산성(acid tolerant) 효모 균주는 내산성 선별 과정을 통하여 모균주로부터 유래할 수 있다. 내산성 C2 탄소원 의존성 효모 균주는 이번에는 내산성 효모 균주 중 C2 탄소원 비의존성 선별 과정을 통하여 락테이트 탈수소효소 유전자를 갖는 내산성 C2 탄소원 비의존성 효모 균주의 모균주가 될 수 있다. 반드시 그럴 필요는 없지만 몇몇 경우의 모균주는 야생형 균주일 수도 있다.
"C2 탄소원-비의존성(independent) 효모 균주"는 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 미네랄 배지에서 배양시켰을 때 C2 탄소원을 필요로 하지 않는 검출불가능한 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 효모를 의미한다. C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 호기성 포도당-제한 케모스탯에서 탄소원인 포도당뿐인 미네랄 배지에서 생육하기 위하여 C2 탄소원을 요구하는 Pdc 음성 모균주의 조작(manipulation)을 통하여 유래한다. C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 몇몇 구체예에서 동일 조건에서 생육하는 야생형 균주보다 높은 수준의 쓰레오닌 알돌라제 활성을 가지지는 않는다.
본원에서의 "포도당 내성 효모 균주"는 단일 또는 다중 단계 선별 과정에 따라 Pdc 음성 또는 C2 탄소원-비의존성 효모 모균주로부터 유래한 효모를 의미한다. 포도당 내성 효모 균주는 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가지지 않는다. 포도당 내성 효모 균주와 그 모균주를 같은 조건(pH, 온도 등등)의 동일한 미네랄 배지에서 생육시키게 되면 포도당 내성 효모 균주는 모균주가 자랄 수 있는 것보다 높은 농도의 포도당을 함유한 배지에서도 자랄 수 있다. 다른 방편으로 동일 또는 유사한 조건 하에서 같은 농도의 포도당을 단독 탄소원으로 함유한 동일한 배지에서 포도당 내성 효모 균주와 모균주를 성장시킬 경우, 포도당 내성 효모 균주는 모균주보다 높은 세포 밀도로 증식할 수 있다(예컨대 Pdc 음성 균주가 이로부터 유래한 C2 탄소원-비의존성 효모 균주의 모균주일 수 있다). 또다른 방편으로 동일 또는 유사한 조건 하에서 같은 농도의 포도당을 단독 탄소원으로 함유한 동일한 배지에서 포도당 내성 효모 균주와 모균주를 성장시킬 경우, 포도당 내성 효모 균주는 그 모균주보다 높은 비증식속도(specific growth rate)를 가질 수 있다. 본 발명의 구체예에서 피루베이트 탈탄산효소 활성이 없는 포도당 내성 효모 균주는 적어도 0.5 g/리터 포도당을 함유하는 미네랄 배지에서 성장할 수 있다.
"더욱 포도당 내성이 있는"은 필수 동일 조건 하에 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 필수 동일 배양 배지에서 효모 균주를 성장시키는 경우 하나의 효모 균주보다 높은 농도의 포도당에서 자랄 수 있는 또다른 효모 균주를 의미한다. 다른 식으로 말해보면 상기 용어는 필수 동일 조건 하에 단독 탄소원으로서 완전 동일한 농도의 포도당을 함유한 동일 배양 배지에서 효모 균주를 성장시키는 경우 하나의 효모 균주보다 높은 배양균 밀도로 성장할 수 있는 또다른 효모 균주를 의미한다. 동일 또는 유사한 조건 하에 단독 탄소원인 포도당을 완전 동일한 농도로 함유한 같은 배지에서 효모 균주를 성장시키는 경우에는 포도당 내성이 큰 효모 균주일수록 더욱 높은 비증식속도를 가질 수 있다.
"크랩트리(Crabtree) 효과"는 (a)과잉량의 산소와 당(예컨대 탄수화물)을 포함하는 환경(일 구체예에서 "과잉량의 당"은 약 1mM 이상의 농도이다), 또는 (b)효모 균주의 비증식속도가 포도당에 대한 임계 비증식속도보다 높은 배양(예컨대 포도당에 대한 최대 비증식속도의 약 2/3)에서 효모 균주에 의해 수행되는 알코올 발효로 정의된다. 효모 균주가 "크랩트리 양성"으로 그 균주가 크랩트리 효과를 나타낸다면 크랩트리 양성 효모 균주는 그 주된 피루베이트 탈탄산화 경로(pathway)로서 다량의 당 존재 하에서는 피루베이트 탈탄산효소 경로(route)를 사용한다. 크랩트리 양성 효모의 예들은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)(토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata) 등으로도 알려져 있음), 지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii) 및 치조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등에서 찾을 수 있다. "크랩트리 음성 효모 균주"는 피루베이트 탈탄산화 반응의 주된 메카니즘으로 피루베이트 탈탄산효소 복합체 반응을 사용한다. 다량의 당으로 호기 성장시키는 경우 크랩트리 음성 효모 균주 내에서는 알코올 발효는 거의 일어나지 않고 호흡성 피루베이트 대사작용이 우세하다. 크랩트리 음성 효모 균주 내 피루베이트 탈탄산효소 활성을 없애면 당을 이용한 호기성 성장에 아무런 효과가 없는 것으로 보인다. 크랩트리 음성 효모의 예는 칸디다 유틸리스(Candida utilis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 및 야로이야 리포리티카(Yarrowia lipolytica) 중에서 발견할 수 있다.
"쓰레오닌 알돌라제(threonine aldolase)(예컨대, Glylp)"는 쓰레오닌을 아세트알데히드와 글리신 혼합물로 전환하는 반응을 촉매할 수 있는 임의 단백질(예컨대 효소)를 의미한다. "쓰레오닌 알돌라제 활성 부족(lack)"은 이전에 알려진 방법(24)을 이용한 균주 내 활성 측정시 그 활성이 검출 한계인 0.005micromoles/minute/mg단백질 이하인 쓰레오닌 알돌라제 활성으로서 정의된다. "감소된(reduced) 쓰레오닌 알돌라제 활성"은 특정 효모 균주가 동일 또는 유사한 조건 하에서 자라는 야생형 균주나 모균주의 쓰레오닌 알돌라제 활성보다 낮게 나타내는 활성으로서 정의된다. 본 발명에서의 "쓰레오닌 알돌라제의 과발현(overexpression)"은 동일 또는 유사한 조건 하에서 자라는 야생형 균주에서 보이는 활성보다 높은 특정 효모 균주의 쓰레오닌 알돌라제 활성을 의미한다.
"배양 배지(culture medium)"라 함은 미생물(예컨대 효모)이 생육할 수 있는 적어도 하나 이상의 탄소원을 포함하여 충분한 영양분을 함유하는 고체 또는 액체 배지를 의미한다.케모스탯이나 회분 배양에서 배지는 액체이다.
"액체 배지에서의 배양"은 미생물의 생육 및/또는 액체 배양 배지에서 미생물이 생산하는 락트산과 피루브산의 연속 축적을 의미한다.
"탄소원"은 미생물(예컨대 효모)에 의해 동화될 수 있고 새로운 세포 물질을 만드는데 사용될 수 있는 유기 화합물(예컨대 포도당) 또는 유기 화합물의 혼합물을 의미한다.
"C2 탄소원"은 2개의 탄소를 갖는 탄소원을 의미한다. C2 탄소원으로는 아세테이트, 아세트알데히드, 및 에탄올 등이 있다.
"미네랄 배지", "최소 배지", 또는 "합성 배지"는 그 조성이 모두 정의되어 있는 질소원, 염, 미량 원소, 비타민, 및 탄소원을 포함하여 미생물(예컨대 효모)을 성장시키는데 필요한 배양 배지를 의미한다. 탄소원은 적어도 하나 이상의 포도당, 수크로스, 락토스, 갈락토스 또는 프럭토스 등등을 포함한다. 합성 배지는 복합 배양 배지에 사용될 수 있는 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물 또는 펩톤 등 그 조성이 정의되지 않은 영양원을 포함하지 않는다. 구체예에서, 미네랄 배지는 (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, EDTA, ZnSO4, CoCl2, MnCl2, CuSO4, CaCl2, FeSO4, Na2MoO4, H3BO3, KI 및 선택적으로 소포제를 포함할 수 있다.
"고체 배양 배지 상에서 생육가능한"은 굳힌(solidified) 배양 배지에 미생물을 스트리킹(streaking)하거나 스프레딩(spreading)하였을 때는 그 콜로니를 육안으로 식별할 수 없다가 접종 후 적합한 환경에서 일정시간 경과후 육안 식별 가능한 콜로니를 적어도 하나 이상 생산할 수 있는 미생물의 능력을 의미한다.
"액체 배양 배지 내에서 생육가능한"은 미생물을 알맞은 배양 조건(예컨대 pH와 온도 등) 하에서 액체 배양 배지 내에 주입하였을 때 배양의 증식기 동안 배양액의 균체를 증가시키는 것과 같은 미생물의 복제 능력을 의미한다.
"케모스탯"은 비증식속도와 세포수 양자를 독립적으로 제어할 수 있는 미생물(예컨대 효모)의 연속 배양에 사용되는 장치를 의미한다. 연속 배양은 본질적으로 일정한 부피의 유동(flow) 시스템으로 장치내로 배지가 연속 첨가되고 장치로부터 임의의 유출물(overflow)의 연속 제거가 일어난다. 상기 시스템이 평형 상태가 되면 세포수와 영양 상태가 일정하고 그 시스템은 정상 상태(steady state)에 있다. 케모스탯은 탄소원이나 질소원 등 제한 영양물질의 농도 변경과 희석 속도를 통하여 배양균의 비증식속도와 개체 밀도 모두를 제어한다.
케모스탯를 이용하여 미생물의 돌연변이체를 선별할 수 있다는 것은 당업계에 주지된 사실이다. 배양균이 케모스탯에서 성장함에 따라 그 조건을 바꾸어줌으로써(예컨대 접종 균주의 성장에 필요한 두번째 탄소원의 농도 감소 등), 개체들 중에서 바뀐 배양 조건에서 더욱 빠르게 성장할 수 있는 미생물을 선별하고 새로운 조건에 잘 적응하지 못하는 미생물은 버린다(outgrow). 일반적으로 상기와 같은 선별을 위해서는 케모스탯 배양의 생육 과정에 걸쳐 적어도 한가지 이상의 배양 성분을 차츰차츰 증가시키거나 감소시킬 필요가 있다.
"회분 배양(batch culture)"은 미생물의 증식 작용에 따라 계속적으로 그 상태가 변화하는 일정(fixed) 부피의 배양 배지 내에서 그 배지가 더 이상 증식에 적합하지 않을 때까지 미생물의 증식이 진행되는 폐쇄(closed) 시스템이나, 또는 (b)(예컨대 케모스탯에서와 같이) 균체는 제거하지 않고 영양분을 미생물 배양액에 주입하면서 미생물로 인하여 배지(예컨대 환경)의 상태가 변화하는 시스템을 의미한다. 회분 배양(예컨대 진탕 플라스크) 내 미생물의 길어진(extended) 배양은 접종 균주가 자라지 못하거나 또는 불충분하게 자라는 조건 하에서도 비교적 잘 자라는 자연 발생 돌연변이체를 선별하는데 이용될 수 있는 것으로 알려져 있다.
"일련의 회분 배양(series of batch cultures)"은 전 배양 과정에 걸쳐 변화될 수 있는 적어도 한가지의 한정(defined) 성분(즉, 특정 탄소원의 농도)을 함유한 배양 배지에서 첫번째 효모 균주의 첫번째 회분 배양균을 증식시키는 것을 포함한다. 증식된 첫번째 회분 배양액의 분주물을 이용하여 두번째 회분 배양에 접종한다. 그런 다음 증식된 두번째 회분 배양액의 분주물을 세번째 배양에 접종시키는 식으로 계속 반복한다. 일련의 배양 단계의 갯수는 달라질 수 있다. 한정 성분의 농도는 일련의 회분 배양 과정에 걸쳐서 증가 또는 감소한다. 일련의 회분 배양 내 주어진 단계(예컨대 회분 배양)에서의 조건 하에 가장 잘 증식할 수 있는 미생물이 선별되어(예컨대 특정 배양 조건 하에 잘 자라지 못하는 다른 미생물을 제거함으로써 선별됨) 다음 회분 배양시의 접종물로 이용된다. 따라서 일련의 과정에 걸쳐 첫번째 균주가 자라지 못하는 조건 하에서 성장할 수 있는 미생물이나 또는 첫번째 균주의 성장 조건과 동일한 조건 하에서 보다 뛰어나게 성장하는 미생물이 선별될 수 있다. 선별된 배양균에서 개별의 순수한 균주를 분리하는 것은 당업계에서 일반적이다. 이러한 분리는 소량의 배양 미생물을 평판 배지에 스트레킹하거나 또는 그밖의 공지의 방법으로 행해질 수 있다.
"선별가능한 마커(selectable marker)"는 발현되었을 때 그 핵산 서열을 포함하는 세포를 쉽게 동정할 수 있는 표현형을 부여하는 핵산 서열을 의미한다. 선별가능한 마커는 독성 화합물에 대한 내성(예컨대 암피실린 내성, 카나마이신 내성)을 부여하거나 영양분 결핍(예컨대 우라실, 히스티딘, 류신)을 보충하거나 또는 육안으로 구별되는 특성(예컨대 색상 변화, 형광)을 덧붙이는 경우 등을 포함한다.
"선별(selection)"은 하나 또는 그 이상의 특정 유전자형을 가진 세포의 생육이 유리한 조건 하에 효모를 두는 것을 의미한다. 특정 유전자형(종종 유전자 돌연변이의 결과물)은 선별된 효모가 어떠한 환경 조건 하에서는 유리하도록 하여 선별된 효모의 다음 세대들이 모균주보다 빨리 자라고 또는 나아가 그 모균주를 대체할 수 있도록 한다.
"유전자(gene)"이라 함은 염색체 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 RNA 분자를 코딩하는 그밖의 DNA 및 발현 조절에 관련된 코딩 서열에 이웃해 있는(flanking) 영역을 포함한다.
"플라스미드(plasmid)"는 고리모양(circular)으로 염색체와 별개로 존재하며(extrachromosomal), 자기복제할 수 있는 DNA 조각을 의미한다.
"2 마이크론(micron) 플라스미드"는 특정 효모 세포(예컨대 에스.세레비지에) 내에서 복제가능한 효모 클로닝 벡터를 의미한다. 이 플라스미드 상에 위치할 수 있는 특정 유전자는 플라스미드 상에서 효모 숙주 세포(예컨대 2 마이크론 플라스미드로 형질전환된 효모) 내에서 인지되고 사용되는 프로모터에 작동가능하도록 연결될 때 발현될 수 있다.
"게놈(genome)"이라 함은 숙주 세포 내의 염색체와 플라스미드 모두를 의미한다.
"혼성화(hybridization)"는 2 가닥의 핵산 내의 상보 서열이 서로 결합하는 경우 염기 짝짓기(base pairing) 혼성화를 통하여 상보성 가닥과 결합하고자 하는 핵산 가닥의 능력을 의미한다.
"돌연변이(mutation)"은 핵산 서열 상의 임의의 변화 또는 변경을 의미한다. 점(point) 돌연변이, 구조전환(frame shift) 돌연변이 등의 몇몇 형태가 존재하며 스플라이싱(splicing) 돌연변이가 특이적 또는 무작위적으로 행해질 수 있다.
"오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)"은 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 영역을 의미한다.
"프로모터(promoter)" 또는 "프로모터 영역(promoter region)"이라 함은 RNA 중합효소 인지 지점 및/또는 정확한 지점에서의 전사 개시에 필요한 그밖의 인자들을 제공함으로써 메신저 RNA(mRNA)의 생산을 제어하는 성분을 포함하는 DNA 서열을 의미한다.
"전사(transcription)"는 DNA 주형으로부터 상보적인 RNA를 만들어내는 과정을 의미한다.
"번역(translation)"은 메신저 RNA로부터의 단백질 생산을 의미한다.
"수율(yield)"이라 함은 생산된 피루브산 또는 그 염의 전체양을 피루브산 또는 그 염을 생산하는 과정의 끝지점과 이러한 전환을 촉매하는 균체에서 소모된 포도당의 양(g/l)으로 나누어 나온 값을 의미한다.
"피루브산(pyruvic acid)"은 해리형 및 비해리형의 2-옥소프로판산의 합으로 정의된다.
"적어도 농도 이상의"는 특정 효모 배양액에서 도달할 수 있는 최소한의 농도(예컨대 g 피루브산/l 또는 mM)를 의미한다.
본원에서의 "락트산(lactic acid)"은 비해리산은 물론 락트산 염도 포함한다. 따라서 Xg 락트산/100g 포도당은 발효시 주입한 100g 포도당 각각에 비례하여 혼합된 락테이트 음이온과 비해리 락트산의 총량을 의미한다. 발효 브로쓰가 약 3.0 내지 4.5의 pH 값을 가지게 되면 현저한 양의 락트산이 비해리형으로 될 것이다. 또한 pH 3.0, 25℃에서 락테이트 이온에 대한 비해리 락트산의 몰비는 약 7.0이며, 약 pH 4.5, 25℃에서의 몰비는 약 0.23이다. 용액 내 존재하는 비해리 락트산의 총량은 용액의 pH와 혼합물 내 락트산의 전체 농도 모두의 함수이다. 용액의 pH가 낮아지면 질수록 비해리형으로 존재하는 락트산의 백분율비는 더욱 높아진다. 예를 들어, 배지의 pH가 락트산의 pKa(약 3.8)와 같은 경우, 50%의 락트산이 비해리 형태로 존재한다. pH 4.2에서는 약 31%의 락트산이 비해리되고 pH 4.0과 3.9에서는 각각 41%와 47%의 락트산이 비해리된다. 비해리 락트산의 몰분율은 pH 4.5에서 18%, pH 5.0에서 6.6% 등과 같이 pH가 높아질수록 더욱 낮아진다.
"발효 브로쓰(broth)"는 미생물(예컨대 효모)을 액체 발효 배지에서 배양시킬 때 만들어지는 브로쓰를 의미한다. 발효 브로쓰는 액체 발효 배지 중 사용되지 않은 임의 성분과 임의의 대사산물 또는 그 미생물의 발효에서 얻어진 생성물을 포함한다.
"산소 제한" 또는 "제한된 산소 공급"이라 함은 가스상에서 액체상으로의 산소 운반 용량(oxygen transfer capacity)이 미생물의 산소 요구량보다 낮은 임의의 상태를 의미한다. 이는 영(zero)에 가까운 용존 산소 농도(dissolved O2 tension)에 의해 나타날 수 있지만 영보다 높은 용존 산소 농도에서도 발생할 수 있으며 사용 미생물의 O2에 대한 친화력에 따라 달라진다.
본원에 언급된 어떤 종의 명칭, 예컨대 토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)는 Barnet, Payne 및 Yarrow(1)이 종들에 대해 기재한 내용에서의 명칭을 의미할 수 있음을 유념할 필요가 있다.
도 1에 대한 참고자료를 통해 본 발명의 구체예들을 더욱 잘 이해할 수 있다. C2 탄소원 비의존성 균주 2를 회수할 수 있도록 Pdc 음성 균주 1을 선별한다. 야생형 Pdc 음성 균주는 크랩트리 양성이다. 야생형 크랩트리 양성 효모 균주에서 피루베이트 탈탄산효소 활성이 제거될 때 Pdc 음성 효모 균주가 유래될 수 있다. Pdc 음성 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 토룰라스포라(Torulaspora), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 및 데케라(Dekkera)(당업계에 알려진 다른 명칭들 중 브렛타노마이세스(Brettanomyces)로도 알려져 있음)로 구성된 군에서 선택된 하나의 속(genus)에 속할 수 있다. 바람직하게 Pdc 음성 효모 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로부터 선택된 하나의 속에 속하며, 더욱 바람직하게는 사카로마이세스(Saccharomyces)속에 속한다. 일 구체예에서, Pdc 음성 효모 균주는 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans), 지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 치조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa), 토룰라스포라 델브룩키(Torulaspora delbruckii), 데케라 브룩셀렌시스(Dekkera bruxellensis) 또는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)(토룰롭시스 글라브라타(Torulopsis glabrata)로도 알려져 있음) 중 하나의 균주에 속한다. 바람직한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에 속하며, 더욱 바람직한 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 속한다.
Pdc 음성 효모 균주는 (A) 야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나 이상의 PDC 구조 유전자, (B) 야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나의 PDC 조절 유전자, (C) PDC 구조 유전자의 프로모터, (D) PDC 조절 유전자의 프로모터를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, (A)-(D) 중 적어도 한가지 이상이 Pdc 음성 돌연변이체를 생산하는 부분으로서 (i) 돌연변이되거나, (ii) 파괴되거나, 또는 (iii) 결실된다. 일 구체예에서, Pdc 음성 효모 균주는 야생형 효모 균주에서 발현가능한 모든 PDC 구조 유전자가 (예컨대 돌연변이, 결실, 파괴 또는 안티센스 mRNA에 의하여) 불활성이 되도록 한다. 예를 들어 당업계에 알려져 있는 loxP 시스템을 이용하여 야생형 PDC 구조 유전자를 방해할 수 있다. 또한 야생형 PDC 구조 유전자는 상동 재조합에 의해 그 유전자 내로 선별 마커(selectable marker)를 삽입시키면 파괴될 수 있다. 또다른 구체예에서, 안티센스 RNA를 이용함으로써(예컨대 당업계에 알려진 방법 이용) 야생형으로부터 피루베이트 탈탄산효소 활성을 제거하여 PDC mRNA 또는 PDC 조절 유전자의 mRNA가 번역되는 것을 방지할 수 있다. 바람직한 Pdc 음성 효모 균주는 에스.세레비지에(S.cerevisiae)에 속하며, Pdc 음성 효모 균주는 pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP의 유전자형을 갖는다. 몇몇 구체예에서, Pdc 음성 효모는 유전자형 pdc1,5,6△(예컨대 PDC 1,5,6 구조 유전자의 일부 또는 완전 결실)를 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일 구체예에서, Pdc 음성 효모 균주 1와 야생형 균주를 같은 조건에서 생육시킬 때 Pdc 음성 효모 균주 1은 야생형 균주보다 높은 수준의 쓰레오닌 알돌라제 활성을 나타내지 않는다. 몇몇 구체예에서, Pdc 음성 효모 균주는 ura, leu 또는 his 등의 영양요구주일 수 있다. 일 구체예에서 Pdc 음성 효모 균주는 ura-이다.
C2 탄소원 비의존성 효모 균주 2의 선별은 호기성 탄소 제한 케모스탯에서 효모 배양균을 성장시키는 것을 포함할 수 있다. Pdc 음성 효모 균주 1을 함유한 첫번째 미네랄 배지를 접종하였다. 케모스탯에서 그 배양균의 생육 개시시에는 단독 탄소원으로 C2 탄소원과 포도당을 함유하는 첫번째 미네랄 배지를 효모 배양균이 생육하기에 충분한 농도로 사용하였다. 첫번째 미네랄 배지에서 C2 탄소원의 농도를 낮추어 케모스탯에서의 효모 배양균이 생육하는 동안 첫번째 미네랄 배지 내의 C2 탄소원의 농도가 총 탄소 약 10% 내지 0%의 표적 범위, 바람직하게는 약 5% 내지 0%, 더욱 바람직하게는 약 0%에 도달하도록 한다. 몇몇 균주가 Pdc 음성 균주의 성장에 상이한 C2 탄소원 요구조건을 가지는 것과 같이, C2 탄소의 표적 범위는 효모 균주가 달라지면 변할 수 있다. 예를 들어, Pdc 음성 효모 균주는 총 탄소가 2%일 때 생육하며 이 경우의 표적 범위는 2% 미만, 바람직하게는 0%이다. Pdc 음성 효모 균주 1이 영양요구주(leu-, his-, 및 ura- 등)인 일 구체예에서, 효모가 성장에 필요로 하는 영양요구성에 관계된 화합물을 배양균이 성장하기에 충분한 양으로 배지에 첨가한다. 예를 들어, 효모 균주가 ura-라면 최종 미네랄 배지는 Pdc 음성 효모 균주 1의 영양요구주가 자라기에 충분한 양의 우라실을 함유할 수 있다.
케모스탯에서 효모 배양균이 성장하는 동안 첫번째 미네랄 배지 내의 C2 탄소원 농도가 표적 범위에 도달한 후에는 적어도 하나 이상의 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2를 그 배양액에서 회수할 수 있다. C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2는 Pdc 음성 효모 균주 1에 대해 상술한 바의 속이나 종에 속하는 것이 바람직하다. C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2는 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는다. 바람직하게도 검출가능한 활성 결핍은 Pdc 음성 모 균주에서 유전된 돌연변이가 그 원인이다. 일 구체예에서, C2 탄소원-비의존성 효모 2와 야생형 균주를 같은 조건에서 생육시킬 때 C2 탄소원-비의존성 효모 2는 야생형 균주보다 높은 수준의 쓰레오닌 알돌라제 활성을 나타내지 않는다. C2 탄소원-비의존성 효모 2는 당업계에 알려진 방법에 따라 회수할 수 있다. 예를 들어, C2 탄소원이 표적 범위 내에 있는 배양액에서 얻은 분주물을 단독 탄소원으로 2% 에탄올을 함유하는 고체 배양 배지에 스프레딩할 수 있다. 몇몇 경우에는 당업계에 알려져 있는 바와 같이 평판 배지 상에 스프레딩하기에 앞서 분주물의 희석이 필요할 수 있다. 그런 다음에는 배지 상의 효모가 그 생육에 도움이 되는 환경으로 옮겨진 후에 당업계에 공지된 방법을 사용하여 개별 콜로니를 고체 배양 배지에서 분리할 수 있다. 개별 콜로니로부터 증식한 배양균은 단일 유전자형을 가진 효모로 이루어져 있다. 또한 분리된 효모 균주를 테스트하여 실제로 C2 탄소원-비의존성인지를 확인하였다. C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2 또한 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖고 있는지 여부를 테스트하였다. 일 구체예에서, C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2는 미네랄 성장 배지 내의 포도당 농도가 상대적으로 높으면(예컨대 약 5mM 이상) 잘 생육하지 않으며, 몇몇 경우 균주 2는 단독 탄소원으로 소량의 포도당을 함유한 미네랄 배지에서조차 자라지 않는다.
몇몇 구체예에서 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2는 두번째 미네랄 배지를 이용한 일련의 호기성 회분 배양에서 성장시켜 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주 3을 선별할 수 있다. 두번째 미네랄 배지에서 포도당은 단독 탄소원이다. 일련의 배양 초기에 얻은 회분 배양액에서 자란 효모를 각 연속 회분 배양에 접종(seed)하였다. 배지 내에 포도당이 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2가 성장할 수 있을 정도로 존재하도록 하여 일련의 회분 배양을 개시한다. 초기 회분 배양시 자라는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주의 돌연변이체(예컨대 GCSI 균주)일 수 있으며, 상기 돌연변이체는 단독 탄소원으로 포도당을 이용하여 생육할 수 있다(예컨대 회분 배양 초기의 성장은 선별의 결과라 할 수 있다). 포도당 농도는 일련의 회분 배양에 걸쳐 두번째 미네랄 배지에서 증가한다. 일 구체예에서, 각 연속 회분 배양은 바로 앞의 회분 배양에서보다 높은 포도당 농도로 시작한다. 다른 구체예에서, 상기 농도는 일련의 배양에 걸쳐 각각 그리고 모든 회분 배양에서 증가하지 않는다. 예를 들어 5개의 일련의 순차적 회분 배양의 포도당 농도는 100mM, 100mM, 200mM, 300mM 및 400mM 순이다. 일련의 회분 배양의 초기 회분 배양이나 또는 다른 회분 배양으로부터 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주 3을 회수할 수 있다. 일 구체예에서 상기 GCSI 효모 균주 3은 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 고형 평판 배지 상에 배양액 분주물을 스프레딩하는 것을 포함하여 상술한 방법을 이용하여 분리될 수 있다.
일 구체예에서, C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2는 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 두번째 미네랄 배지를 이용하여 단일 호기성 회분 배양으로 생육시켜 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주 3을 선별할 수 있다. 균주 3은 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2의 돌연변이체로서 단독 탄소원인 포도당에서 생육할 수 있고 단일 회분 배양(일련의 회분 배양과 대비됨)에서 배양된 후 GCSI 효모 균주 3으로 회수될 수 있다.
GCSI 효모 균주 3의 선별을 위해 일련의 회분 배양을 사용하는 방법을 대신하여, 일 구체예에서는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2를 호기성 케모스탯 내 두번째 미네랄 배지에서 배양할 수 있다. 케모스탯은 C2 탄소원-비의존성 효모를 선별할 때 사용했던 것과 같거나 또는 다른 케모스탯일 수 있다. 두번째 미네랄 배지의 단독 탄소원은 포도당이며, 케모스탯 배양을 시작할 때 배지 내 포도당 농도는 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2의 증식 제한 농도 정도였다. 케모스탯 내 주입하는 배지 내 포도당 농도는 배양균이 증식함에 따라 점차로 증가하게 되며, 그래서 또다른 배지 성분이 증식을 제한하고 포도당은 배양액 내에 과잉 존재하게 된다. 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주 3을 상기한 일련의 회분 배양에서의 경우와 같이 상기 케모스탯으로부터 회수할 수 있다.
GCSI 효모 균주 3은 단독 탄소원으로 포도당을 이용하여 생육할 수 있으며 상기 GCSI 효모 균주 3은 회수된 C2 탄소원-비의존성 효모 균주 2보다 포도당 내성이 더 크다. 또한 상기 GCSI 효모 균주 3은 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가진다. 검출가능한 활성 결핍의 바람직한 원인은 Pdc 음성 균주로부터 유전된 돌연변이로 인한 것이다. 일 구체예에서, GCSI 효모와 야생형 균주를 같은 조건에서 배양시키는 경우 상기 GCSI 효모 3의 쓰레오닌 알돌라제 활성은 야생형 균주보다 높지 않은 수준이다. 상기 GCSI 효모 균주 3은 호기성 회분 배양 및/또는 호기성 케모스탯에서 생육할 수 있다. 또한, GCSI 효모 균주 3은 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 락토스, 가수분해 전분, 갈락토스, 고과당 옥수수 시럽, 및 리그노셀룰로스 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 탄소원, 바람직하게는 포도당을 포함하는 배양 배지에서 성장할 수 있다.
포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주 3을 첫번째 배양 배지에서 호기 배양시켜서 피루브산 또는 그 염을 생산할 수 있다. GCSI 효모 균주 3의 야생형 균주는 트랩트리 양성이다. 바람직하게 상기 GCSI 효모 균주 3은 앞서 기술한 Pdc 음성 효모 균주의 속이나 종에 속한다. 바람직하게 상기 GCSI 효모 균주 3은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에 속하며, 더욱 바람직하게 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 속한다. 상기 GCSI 효모 3의 야생형 균주는 크랩트리 양성이다.
피루브산 또는 그 염 4를 생산하는 경우 상기 GCSI 효모 균주 3의 배양에 사용되는 첫번째 배양 배지는 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 락토스, 가수분해 전분, 고과당 옥수수 시럽 및 가수분해 리그노셀룰로스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 한가지 이상의 탄소원을 포함할 수 있다. 바람직하게 첫번째 배양 배지는 수크로스나 포도당 중에서 한가지 이상을 포함하며, 포도당이 배지 내 단독 탄소원인 것이 더욱 바람직하다. 또한 첫번째 배양 배지는 GCSI 효모 균주의 영양요구주를 자라게 할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다. 사용되는 화합물 및 영양요구주의 성질은 효모 종류에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 효모가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), ura-라면 효모의 생육을 위해 배지 내에 우라실을 첨가할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 ura- 영양요구주를 자라게 하는 다른 방안으로 그 효모 내로 기능성 유전자(예컨대 URA3)을 도입할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드에서 발현될 수 있는 유전자(예컨대 URA3)을 형질전환이나 전기천공(electroporation)을 이용하여 효모 내로 도입함으로써 영양요구성을 극복할 수 있다. 첫번째 배양 배지는 몇몇 구체예에서 미네랄 배지일 수 있다. 첫번째 배양 배지가 미네랄 배지인 경우, 그 배지는 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 및 락토스로 구성된 군, 바람직하게는 수크로스나 포도당, 더욱 바람직하게는 포도당으로부터 선택된 적어도 한가지 이상의 탄소원을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 호기성 회분 배양 내 또는 호기성 조건하의 케모스탯 내에서 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 미네랄 배지에서 GCSI 균주 3을 배양할 수 있다. 미네랄 배지는 포도당이 단독 탄소원인 회분 배양의 개시시에 약 1mM 내지 1M 사이의 포도당을 포함하는 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 회분 배양 배지는 약 100mM 내지 610mM 사이의 포도당을 포함할 수 있으며, 다른 구체예에서 회분 배양 배지는 약 250mM 내지 610mM 사이의 포도당을 포함할 수 있다.
피루브산 또는 그 염 4를 생산하기 위해 GCSI 효모 균주 3을 배양하는 경우, 그 배양균은 회분 배양, 바람직하게는 pH가 제어된 회분 배양에서 자랄 수 있다. GCSI 효모 균주 3의 회분 배양 pH를 제어하는 경우에는 바람직하게는 약 2.5 내지 8 사이, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 6 사이, 가장 바람직하게는 약 4.5 내지 5.5 사이에서 제어하는 것이 좋다. 마찬가지로 GCSI 효모 균주 3을 피루브산 또는 그 염을 생산하기 위해 케모스탯에서 배양하는 경우, 케모스탯 내 배양액 pH 역시 유사한 방식(예컨대 회분 배양에서의 비슷한 pH)으로 제어되어진다.
일 구체예에서, GCSI 효모 균주 3을 첫번째 배양 배지에서 호기성 회분 배양으로 배양하는 경우에는 적어도 약 0.5moles피루브산4/리터 이상의 피루브산을 생산할 수 있다. 바람직하게는 적어도 약 0.8moles피루브산4/리터 이상의 피루브산을 생산할 수 있고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1.53moles피루브산4/리터 이상의 피루브산을 생산할 수 있다. 피루브산 4 생산시의 배양액의 pH는 약 4.8 내지 5.2인 것이 바람직하다. 첫번째 배양 배지는 미네랄 배지일 수 있다. 몇몇 미네랄 배지는 단독 탄소원으로 포도당을 포함할 수 있다. 일 구체예에서 상기 GCSI 효모 균주 3d을 단독 탄소원으로 적어도 포도당을 함유하는 배양 배지에서 호기성 회분 배양하는 경우 적어도 약 0.54g피루브산/g포도당의 수율로 피루브산을 생산할 수 있다. 일 구체예에서는 상기 GCSI 효모 균주 3이 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)이며, 상기 GCSI 효모 균주 3을 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)가 탄소원으로 이용할 수 있는 당(예컨대 포도당)을 함유하는 최소 배지에서 배양하는 경우 피루브산 또는 그 염 4를 약 0.7M 이상으로 생산할 수 있다.
GCSI 효모 균주의 배양액에서 생산될 수 있는 피루브산의 염 4은 소듐 피루베이트, 포타슘 피루베이트, 암모늄 피루베이트, 및 칼슘 피루베이트를 포함한다. 염이 존재하는 경우라면 그 염은 포타슘 피루베이트가 바람직하다. 한 가지 이상의 염이 배양액 내에 존재할 수도 있다.
피루브산 및/또는 그 염 4를 GCSI 효모 균주 3으로부터 5로 정제할 수 있다. 바람직하게는 균체를 발효 브로쓰에서 제거하는 것이 바람직하다. 균체는 당업계에 공지된 방법에 따라 제거될 수 있다. 예를 들면, 상기 균체는 원심분리나 여과 등의 방법으로 제거될 수 있다. 피루브산 또는 그 염 4는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 발효 브로쓰로부터 회수 및/또는 정제할 수 있다. 예컨대 발효 브로쓰를 농축시킬 수도 있다. 일 구체예에서, 피루브산 또는 그 염 4를 포함하는 발효 브로쓰는 침전과 특정 불순물 제거 등의 초기 정제 단계를 거칠 수 있다. 또한 정제는 발효 브로쓰 내에 존재하는 유리 유기산을 더 얻기 위한 산성화를 포함할 수 있다. 피루브산 또는 그 염 4를 포함하는 발효 브로쓰의 정제는 또한 여과에 의한 고형물의 조심스런 분리를 포함할 수 있고, 선택적으로 막 여과에 의한 큰 용질 분자 종류의 분리를 포함할 수 있다. 또한 양이온 교화기를 이용하여 양이온을 제거할 수 있으며, 무기산은 일반적인 고체 음이온 교환기로 제거할 수 있다. 따라서 상술한 바대로, 발효 브로쓰를 증류, 이온 교환, 나노여과 또는 용매 추출 중 한가지 이상을 포함하는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 정제하여 정제된 피루브산 또는 그 염 5를 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 Pdc 음성 효모 균주를 최소 배지에 접종하는 것을 포함하여, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주를 선별하는 방법에 관한 것이다. 배양균의 호기성 성장 개시시 첫번째 최소 배지는 단독 탄소원으로 C2 탄소원과 포도당을 효모 배양균이 성장하기에 충분한 농도로 포함한다. 첫번째 최소 배지 내 C2 탄소원의 농도는 효모 배양균이 성장하는 동안 감소하며, 포도당 농도는 효모 배양균이 성장하는 동안 증가한다. 일 구체예에서는 C2 탄소원의 농도를 감소시키는 단계, 및 포도당의 농도를 증가시키는 단계가 동시에 행해진다. 양 단계는 호기성 케모스탯에서 수행되는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서는 C2 탄소원의 농도를 감소시키는 단계에 앞서 포도당 농도를 증가시키는 단계가 행해진다. 바람직하게는 양 단계가 단일 호기성 케모스탯 내에서 이루어지거나, 또는 다른 방안으로 하나의 호기성 케모스탯에서 증가 단계가 일어나고 감소 단계는 또다른 호기성 케모스탯에서 일어나는 것이 바람직하다. 또다른 구체예에서는 C2 탄소원 농도를 감소시키는 단계가 포도당 농도를 증가시키는 단계 이전에 이루어진다. 바람직하게는 감소 단계가 하나의 호기성 케모스탯에서 행해지는 동안 증가 단계는 동일한 그 케모스탯, 또다른 호기성 케모스탯, 단일 회분 배양, 또는 일련의 회분 배양에 걸쳐서 행해지는 것이 바람직하다. 탄소원 농도와 pH에 대해서는 앞서 기재한 바 있다. 증가 및 감소 단계가 행해진 후에는 당업계에 공지된 방법에 따라 GCSI 효모 균주를 회수할 수 있다. 일 구체예에서, C2 탄소원-비의존성 효모 균주는 선별 과정에서의 중간 단계로서 회수되지 않는다. 회수된 GCSI 효모 균주는 앞에서 기술하고 있다.
본 발명의 일 구체예는 상술한 바대로 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자(GCSI-L)을 포함한 게놈을 포함하는 GCSI 효모 균주에 관한 것이다. LDH는 GCSI 효모 균주에서 발현가능하고, 그 발현 결과물인 단백질은 락테이트 탈수소효소 활서을 가진다. 몇몇 구체예에서, GCSI 효모 균주의 염색체는 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 포함한다. 몇몇 구체예에서, GCSI-L 균주는 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 포함하는 적어도 하나의 플라스미드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 플라스미드는 2 마이크론 플라스미드일 수 있다. 바람직하게 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자는 프로모터와 기능적으로 연결되어 있다. 몇몇 구체예에서, 프로모터는 피루베이트 탈탄산효소 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 및 L-쓰레오닌 탈수소효소 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게 상기 프로모터는 트리오스 포스페이트 이소머라제(triose phosphate isomerase) 프로모터이다. 몇몇 구체예에서 상기 프로모터는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 피루베이트 탈탄산효소 프로모터일 수 있다.
몇몇 구체예에서, GCSI-L 균주는 pH 약 5.0에서 락트산을 생산할 수 있다. GCSI-L 균주는 pH가 약 5.0 내지 2.67일 때 락트산을 생산할 수 있다. GCSI-L 균주는 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 배양할 때 약 50g락트산/100g포도당 이상으로 락트산을 생산할 수 있다. 바람직하게 GCSI-L 균주는 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서의 배양시 약 60g락트산/100g포도당 이상으로 락트산을 생산할 수 있으며, 더욱 바람직하게 GCSI-L 균주는 약 70g락트산/100g포도당 이상으로 락트산을 생산할 수 있다.
몇몇 구체예에서, GCSI-L 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군으로부터 선택된 속에 속한다. 바람직한 GCSI-L 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 몇몇 구체예에서 상기 GCSI-L 균주는 유전자형 pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52 YEpLpLDH를 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 일 구체예는 플라스미드 YEpLpLDH를 갖는 에스.세레비지에(S.cerevisiae)인 GCSI 효모 균주에 관한 것이다(기탁번호 NRRL Y-30742).
YEpLpLDH는 락토바실러스 플란타룸 LDH(서열 3 참조)를 포함하는 효모 플라스미드로 아래에 더욱 상세히 기재되어 있다. 몇몇 구체예에서 외인성 LDH는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 보바인(bovine), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 또는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophylus) 락테이트 탈수소효소 유전자일 수 있다. 상기 유전자들의 뉴클레오티드 서열은 각각 기탁번호 AJ293008, NP776524, M76708, M22305, Q9P4B6, 및 M19396로서 Genbank로부터 입수할 수 있다. 바람직한 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 락테이트 탈수소효소 유전자이다.
일 구체예에서, GCSI-L 균주를 최소 배지에서 호기 배양 또는 산소 제한 배양하게 되면 GCSI-L 균주는 배양 브로쓰 내에 약 60g/l 이상의 락트산을 생산할 수 있다. 바람직하게, GCSI-L 균주는 최소 배지에서 호기 배양시 배양 브로쓰 내에 약 80g/l 이상의 락트산을 생산할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 GCSI-L은 약 100g/l 이상의 락트산을 생산할 수 있다. 일 구체예에서, GCSI-L 효모 균주는 L-락트산으로 필수 구성된 락트산을 생산할 수 있다. 일 구체예에서, GCSI-L 효모 균주는 호기성 조건하에 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 배양하는 경우 락트산을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 락트산 또는 그 염을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 최소 배지에서 성장할 때 적어도 약 70g락트산/100g포도당을 생산할 수 있는 GCSI-L 효모 균주를 첫번째 배양 배지에서 호기 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 배양은 호기성 회분 배양으로 행할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 락트산 또는 그 염을 회수하고 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 정제 단계는 증류, 이온 교환, 나노여과 또는 용매 추출 중 적어도 하나 이상의 방법을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 설명하기 위한 것이다. 당업자는 대표 기술에 따른 실시예에 개시된 기술들이 발명의 실시에 잘 작용할 수 있도록 발명자에 의해 발견된 것이며 따라서 그 실시에 있어 바람직한 양상을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 이해할 필요가 있다. 그러나 당업자는 본 발명의 개시에 비추어 본원에 개시된 특정 구체예에 다양한 변화가 가해질 수 있고 본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않는 한 비슷한 결과가 얻어질 수 있음을 이해할 필요가 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예의 개략도이다.
도 2는 포도당에서 생육하는 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 대사 작용을 나타내는 개략도이다.
도 3은 (a)사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Pdc 음성 균주, (b)피루베이트 탈탄산효소 활성이 없는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) C2 탄소원-비의존성 균주, (c)피루베이트 탈탄산효소 활성이 없을 뿐 아니라 C2 탄소원-비의존성(예컨대 GCSI 효모)인 본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 포도당 내성 균주, (d)단독 탄소원로서 에탄올(좌 평판 배지)이나 포도당(우 평판 배지)만을 함유한 합성 배지 아가 플레이트 상의 야생형(예컨대 피루베이트 탈탄산효소 활성을 가진) 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 생육을 나타낸다.
도 4는 GCSI 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)(예컨대 본 발명의 선별된 TAM 균주)를 포도당에서 호기성 반복 회분 배양하는 동안의 생육과 피루베이트 생산을 나타내는 그래프이다. 그 결과는 하나의 대표적인 회분 실험에서 나온 것이다. 반복 실험으로부터 동일한 결과를 얻었다. ■는 피루베이트 농도를 나타낸다. ◇와 ○는 각각 포도당 농도(◇)와 OD660(○)을 나타낸다.
도 5는 단독 탄소원으로 포도당을 이용하여 질소-제한 케모스탯 배양한 본 발명에 따른 GCSI 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 그 동질유전자 야생형 간의 주요 6탄당 운반자(hexose transporter)(HXTL-7)를 전사 수준에서 비교한 것이다. 야생형 데이터는 Boer 등(2003)(2)이 사용했던 것과 같은 배양에서 얻었다. 대표 데이터는 독자적인 이중(TAM) 또는 삼중(야생형) 케모스탯 배양으로부터 얻었다. 회색 막대는 야생형에 상응하고 흑색 막대는 TAM 균주(예컨대 GCSI 균주)에 상응한다.
도 6은 발효 1의 첫번째 단계에서 회분 시기(batch age)의 함수로서 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/min 및 430mlN2/min을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 산소 주입 또는 공급이 제한적이었다.
도 7은 발효 1의 첫번째와 두번째 단계에서 회분 시기의 함수로서 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/min 및 430mlN2/min을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 초기 포도당이 결핍됨에 따라 산소 농도가 제한적이었으며, 포도당을 분말 형태로 가하여 재차 100g포도당/l의 농도가 되도록 하였다.
도 8은 발효 1의 첫번째와 두번째 단계에서 회분 시기의 함수로서 포도당, 락테이트, 피루베이트, 숙시네이트 및 글리세롤의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/분 및 430mlN2/분을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 초기 포도당이 결핍됨에 따라 산소 농도가 제한적이었으며, 포도당을 분말 형태로 가하여 100g/l의 농도가 되도록 하였다.
도 9는 발효 1에서 (회분 시기의 함수로서 산소화가 제한되는 시간 동안인) 24 내지 82시간 사이의 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다.
도 10은 발효 2의 첫번째 단계에서 회분 시기의 함수로서 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/min 및 430mlN2/min을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 산소 농도가 제한적이었다.
도 11은 발효 2의 첫번째와 두번째 단계에서 회분 시기의 함수로서 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/min 및 430mlN2/min을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 산소 농도가 제한적이었다. 초기 포도당이 결핍됨에 따라 포도당을 분말 형태로 첨가하여 100g/l의 농도가 되도록 하였다.
도 12는 발효 2의 첫번째와 두번째 단계에서 회분 시기의 함수로서 포도당, 락테이트, 피루베이트, 숙시네이트 및 글리세롤의 농도이다. 본 회분 배양에서는 70ml공기/min 및 430mlN2/min을 혼용하여 통기 속도를 고정시켰다. 24시간 후부터 산소 농도가 제한적이었다. 초기 포도당이 결핍됨에 따라 포도당을 분말 형태로 첨가하여 100g/l의 농도가 되도록 하였다.
도 13은 발효 2에서 (회분 시기의 함수로서 산소화가 제한되는 시간 동안인) 24 내지 82시간 사이의 건중량, 포도당, 락테이트 및 피루베이트의 농도이다.
도 14는 pH를 조절하지 않고 TAM YEpLpLDH를 회분 배양시킨 후 111시간 경과 후 락테이트 및 포도당의 농도 그래프이다.
실시예 1
2회(round)의 자연 선별을 이용하여 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 포도당 내성을 가지며 C2 탄소원-비의존성이며 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 얻었다. 도 2에 의하여 Pdc 음성 균주의 성질을 더 욱 잘 이해할 수 있다.
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 피루베이트 탈탄산효소(반응 a)를 코딩하는 모든 유전자를 결실시킴으로써, 중요한 두 과정(점선)을 손상시켰다. 먼저 알코올 탈수소효소(반응 b)를 통한 세포질(cytosolic) NADH의 첫번째 재산화(reoxidation)를 차단시켰다. 이로서 세포질 NADH는 외부 NADH 탈수소효소(반응 c)를 통하거나 또는 산화환원 셔틀 시스템(redox shuttle system)을 통하여 미토콘드리아에 의하여 산화될 수 밖에 없다. 다음으로 아세트알데히드로부터의 세포질 아세틸-CoA 생성을 차단하였다. 따라서 이를 대신해서 라이신 지방산 생합성(반응 d)에 필요한 아세틸-CoA 공급자로서 요구되는 C2 탄소원 화합물을 주변 환경에서 흡수하여야 한다. 산소 소모량이 포도당의 피루베이트로의 산화에 필요한 산소를 초과하게 됨에 따라 피루베이트 탈수소효소(반응 e)와 트리카르복실산 회로(TCA 회로)을 통한 피루베이트의 미토콘드리아성 산화가 일어나게 되고 그로 인하여 CO2 생성 및 내부 NADH 탈수소효소(반응 f)을 통한 NADH의 산화를 초래하게 된다.
아세테이트 투입량을 단계적으로 낮추면서 탄소-제한(예컨대 포도당과 아세테이트가 단독 탄소원임) 조건의 호기성 케모스탯 배양을 통해 Pdc 음성 균주 유래의 아세테이트 비의존성 돌연변이체를 수득하였다. 호기성 진탕 플라스크 내에서 포도당 내성 균주를 추가 선별하여, 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 합성 배지 상에서의 호기성 회분 배양으로 성장할 수 있으면서 피루베이트 탈탄소효소 활성이 나 쓰레오닌 알돌라제 과발현은 없는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 돌연변이체(TAM)을 수득하였다. TAM 균주의 생리 특성은 강한 피루베이트 생산 경향을 나타내었다. pH를 제어한 회분 배양에서는 지수증식기 동안 135g/l 농도의 피루베이트(피루브산의 분자량으로 계산한 피루베이트)를 약 6-7mmol/(g균체)/h의 피루베이트 비생산속도와 약 0.54g피루베이트/포도당의 전체 수율로 수득하였다.
균주 및 유지. 본 실시예에 사용된 모든 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)(표 1)는 유사유전자형(congenic) CEN.PK 계통에서 유래되었다(19). 진탕 플라스크나 케모스탯 배양을 통해 얻은 배양액에 20%(v/v) 글리세롤을 첨가하여 저장 배양액을 제조한 다음, 멸균 바이얼에 2ml씩 분주하여 -80℃에 보관하였다. 균주 동일성(identity)의 음성 대조군으로서의 우라실 영양요구주(auxotrophy) 여부를 모든 균주에 대해 정기적으로 확인하였다.
Figure 112005063190985-PCT00001
균주 중 쓰레오닌 알돌라제를 대량 생산하는 균주는 하나도 없음에 유의할 필요가 있다.
균주 작제 . CEN.PK182와 CEN.PK111-61A(둘다 Dr.P.Kotter, Frankfurt, Germany로부터 제공받음)를 교차(cross)시켜서 RWB837을 얻었다. 그로부터 얻은 2배체(diploid)가 포자를 형성하면 그 포자를 56℃에서 15분간 가열시켰다. 그런 다음 0.2% 아세테이트를 탄소원으로 함유하는 YP(효모 펩톤 배지)상에 그 혼합물을 평판 배양시켰다(plate). 이로부터 나온 콜로니가 포도당이나 에탄올 함유 YD 배지 상에서 생육하는지를 테스트하였다. 그 후 포도당에서 생육하지 않았던 콜로니에 대해 PCR을 행하여 파괴된 PDC6 유전자와 교배형(mating type)이 존재하는지를 확인하였다. 그런 다음 이 경우 ura3-52에 존재하는 영양요구성 마커를 RWB837에서 확인하였다. 하기 기재한 바와 같이 선별된 최종 균주(TAM)를 Gietz and Woods(9)가 기술한 고효율 프로토콜(protocol)에 따라 YEplac195(8)로 형질전환시켜서 자가영양성(prototrophic)(ura+)인 TAM+YEplacl95 균주를 수득하였다.
일 측면에서, 본 발명은 본원에서 개시하고 있는 바의 포도당 내성과 C2 탄소원 비의존성을 갖는 곰팡이 숙주 세포 및 세포 배양균, 특히 RWB837 및 그 유도체(예컨대 TAM 등)를 포함한 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 세포, 특히 C2 탄소원 비의존성이거나 또는 탄소원 비의존성이면서 포도당 내성(예컨대 TAM)인 균주들을 개시, 주장하고 있다.
상기 세포 및 세포 배양균들은 실질적으로 단일 균주를 포함하거나 필수적으로 단일 균주로 구성되거나 또는 단일 균주로 구성된 생물학적 순수배양균일 수 있다. 본 발명의 구체예들은, 37 C.F.R.§1.14 및 35 U.S.C.§112 하에 본 특허출원의 존속기간 동안 미합중국 특허상표청에 의해 자격이 있다고 확인받은 자들만이 상기 배양균의 입수가 가능하도록 한다는 보장 조건 하에, RWB837(MATa pdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52), RWB837*("MATa pdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52" 피루베이트 탈탄산효소 활성이 없고, C2 탄소원 비의존적이며, 포도당 비내성인 ura- 효모), 및 TAM("MATa pdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52" 피루베이트 탈탄산효소 활성이 없고, C2 탄소원 비의존적이며, 포도당 내성인 ura- 효모) 균주의 생물학적 순수배양균의 형태로 기탁되었다. 상기 기탁물들은 본 대상 출원의 대응출원이나 그 자출원(progency)이 출원된 제외국 특허법의 요구에 따라 입수가능하다. 그러나, 기탁물을 입수할 수 있다고 해서 이것이 국가 작용에 의해 부여된 특허권의 손상시 본 대상 출원의 실시 허락을 구성하지는 않는다는 점을 이해할 필요가 있다.
또한, 본 배양 기탁물은 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 일반인들의 입수가 가능하다. 즉, 기탁물들은 기탁 시료 관리를 위한 가장 최근의 요청 이후 적어도 5년의 기간 동안, 어떤 경우에는 기탁일 이후 적어도 30년의 기간 동안 또는 그 미생물의 개시를 공표하는 어느 특허의 강제가능한 시기 동안, 그 기탁물의 생존을 유지하고 오염되지 않도록 모든 주의를 다하여 보관한다. 기탁자에게는 기탁물의 상태 때문에 요청시 수탁기관이 시료를 분양할 수 없을 경우에는 그 기탁물을 대체해야 하는 의무가 있다. 대상이 되는 미생물 기탁물에 대한 일반인의 입수 가능성을 제한하는 모든 제약들은 그 기탁물을 개시하고 있는 특허가 허여되면 완전히 없어지게 된다.
배양균 CEN.PK113.7D, CEN.PK182, CEN.PK111-61A, RWB837, RWB837* 및 TAM을 부다페스트 조약에 따라 2003년 4월 29일자로 미국 일리노이주 61604 페오리아시 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 미합중국 농무부 산하 국립농산물이용연구센터 농업연구청미생물보존센터 북부지역연구센터(NRRL)의 영구 보존센터에 기탁하였다(각각 기탁번호 NRRL Y-30646, NRRL Y-30647, NRRL Y-30648, NRRL Y-30649, NRRL Y-30650, 및 NRRL Y-30651).
케모스탯 배양. 이전에 알려진 바에 따라(23) 호기성 탄소 제한 또는 질소 제한 케모스탯 배양을 수행하였다. 영양요구성 균주를 자라게 하기 위하여 우라실(15)을 배지에 첨가하였다. 포도당 제한 케모스탯 배양에 사용하는 합성 배지에는 250mM 기질 탄소를 함유시켰다. 아세테이트 존재시에는 기질 탄소 기준에 대한 아세테이트 농도를 0-5% 사이에서 변동시키면서 포도당으로부터의 250mM 탄소에 더하여 아세테이트를 첨가하였다. 질소 제한 배양액의 경우에는 합성 배지 내의 포도당 농도를 조절하여 배양 브로쓰 내 잔여 포도당 농도가 약 100mM가 될 수 있도록 하였다.
진탕 플라스크 배양. 100ml 합성 배지(27)를 함유하는 500ml 짜리 진탕 플라스크를 로터리 진탕기(200rpm)에서 30℃로 항온배양하였다. 영양요구성 균주가 자랄 수 있도록 0.15g/l 우라실(15)을 배지에 가하였다. RWB837의 전배양액을 2% 에탄올에서 생육시켰다. 모든 다른 진탕 플라스크 배양의 경우 포도당을 2 내지 10%의 농도 사이에서 바꾸어가면서 탄소원으로 사용하였다. 선별된 균주에 대해 배양균의 순도를 표지하는 우라실 영양요구주 여부를 정기적으로 확인하였다.
발효조 회분 배양. 1리터의 작동 부피(working volume)를 가진 2L 발효조(Applikon사 제품, Schiedam, the Netherlands)로 호기성 회분 배양을 30℃에서 수행하였다. pH는 10M KOH의 자동 첨가(Applikon ADI 1030 biocontroller)를 통해 pH가 5.0이 되도록 제어하였다. 800-1000rpm 사이에서 교반기 속도를 조절하고 0.50-0.75l/min 사이에서 공기 주입을 조절하여 모든 시간 동안 공기 포화도가 10% 이상이 되도록 용존 산소 농도를 유지하였다. Verduyn 등(27)이 기재했던 농도의 2배를 함유하는 합성 배지를 사용하였다. 초기 포도당 농도는 100g/l이었다. 회분 배양을 반복하는 동안 비멸균 고형 포도당 100g을 접종 후 32시간과 48시간 경과시에 2회 첨가하였다. 소포제(BDH)는 필요한 경우에 발효조에 가하였다. 배양액의 순도는 발효가 끝나는 시점에 현미경으로 확인하였고 오염물질은 보이지 않았다.
마이크로어레이 ( microarray ) 분석. 이전에 알려진 바에 따라(14), 케모스탯으로부터 세포를 시료화(sampling)하고, 탐침 제조 및 Affymetrix GeneChip®에 대한 혼성화를 수행하였다. 그 결과들은 독자 배양시킨 3개의 야생형 복제물(replicate)과 독자 배양시킨 2개의 선별된 Pdc 음성 균주 복제물로부터 유래된 것들이다.
마이크로어레이 데이터 수집과 분석. Affymetrix 소프트웨어 패키지(Microarray Suite v5.0, MicroDB v3.0 및 Data Mining Tool v3.0)를 이용하여 어레이 이미지 및 데이터 필터링의 수집 및 정량화를 수행하였다. 추가적으로 통계 분석하기 위해서 최소 기대 중앙값 오판율(minimum expected median false-positive)과 2배의 최소 변화에 상응하는 델타값과 함께 Significance Analysis of Microarrays(SAM; vl.12) add-in을 구동하는 Microsoft Excel을 사용하였다. 경험상 이러한 기준(criteria)은 각 실험실에서 독자적으로 재생산할 수 있는 데이터 세트를 확립한다(14).
비교에 앞서 모든 어레이를 국제 기준화하여 Microarray Suite v5.0을 사용하여 모든 유전자의 특성에서 얻은 평균 시그널(signal)을 이용한 표적치(targen value) 150이 되도록 하였다. 필터를 적용하여 YG-S98 어레이 상의 9,335 개 전사물(transcript) 특성으로부터 6,383개의 효모 오픈 리딩 프레임을 추출하였으며 이들 중에는 6,084개의 상이한 유전자가 있었다. 그 불일치의 원인은 준최적(sub-optimal) 탐침 세트를 어레이 설계에 사용할 때 한번만이 아니라 몇번 나타났던 몇개의 유전자에 있었다. 가장 적은 900개의 전사물은 신뢰할 수 있도록 측정될 수 없으므로 이들 수준을 비교 분석에서는 12의 값으로 맞추었다.
프로모터 분석은 이미 알려진 바에 따라(2) 웹 기반 소프트웨어인 "Regulatory Sequence Analysis Tools"(20)를 이용하여 수행하였다.
분석 과정. 이전에 알려져 있는 방법에 따라(24) 건중량 측정, 포도당, 아세테이트 및 대사산물 분석, 가스 분석 및 피루베이트 탈탄산효소 및 쓰레오닌 알돌라제 어세이를 행하였다. 전체 세포의 단백질 함량은 수정된 뷰렛법(modified burette method)으로 측정하였다(25).
결과
케모스탯 배양한 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae )로부터 C 2 탄소원 비의존성 사카로마이세스 세레비지에의 선별. 본 연구에서, 미생물의 선별 도구로서의 케모스탯 배양을 이용하여(3,10), Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 C2-탄소원 요구를 없애는 시도를 하였다(4,5). pdcl ,5,6△ ura3 △사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주(RWB837)을 사용하여 선별하였다. 배양균 순도에 대한 대조군으로서 ura3 △영양요구성 마커를 사용하였다. 먼저, 탄소 기준으로 5% 아세테이트와 95% 포도당의 혼합물 상에서 정상상태의 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 수득하였다. 이 배양균의 대사 작용은 소모 산소에 대해 생성된 이산화탄소의 호흡률(respiratory quotient)이 나타내는 바와 같이, 완전 호흡이었으며, 탄소에 대한 균체 수율은 14.6g균체/Cmol이었고 모든 포도당과 아세테이트를 소모하였다. 그런 다음 합성 배지의 아세테이트 함량을 5번에 걸쳐 순차적으로 낮추어 총 탄소 함량이 5%에서 0이 되도록 하였다. 각 단계는 5번의 부피 변화를 지속하였다. 이처럼 천천히 이루어진 변화 동안 RWB837은 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 호기성 탄소-제한 케모스탯 배양액에서 0.10/h의 희석 속도로 증식할 수 있도록 적응하였다. 상기 포도당 제한 배양에서의 균체 수율(14.7g균체/Cmol), 산소 소모 속도 및 이산화탄소 생성 속도(둘다 2.9mmol/g균체/h)로부터, C2 탄소원-비의존성(예컨대 피루베이트 탈탄소효소 활성 결핍 및 에탄올 생성 결핍) 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주가 이들 조건 하에서의 야생형 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 경우와 마찬가지로(21) 완전 호흡 대사를 한다는 것을 알 수 있었다.
C 2 탄소원 비의존성 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae ) 균주의 전사체 ( transcriptome ) 분석. 포도당-제한 케모스탯 배양한 C2 탄소원 비의존성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 전사체 분석을 행하였다. C2 탄소원 비의존성 Pdc 음성 균주를 야생형의 포도당-제한 케모스탯 배양 결과(14)과 비교하였다. 선별된 균주 내에 존재하는 이미 알려진 기능을 갖는 유전자들 중 18개의 유전자만이 상향조절되었고(upregulate) 16개의 유전자만이 하향조절되었다(downregulate). 상향조절된 유전자에는 세포분열(meiosis)과 포자형성(sporulation)과 관련있는 11개의 유전자(HOP2 , IME2 , REC102, REC104 , RED1 , SLZ1 , SPO13 , SPO16 , SPRI , YER179 및 ZIP1)가 포함되었다. 나머지 7개의 상향조절된 유전자는 CAR1 , ECM1 , HXT3 , HXT4 , IRE1 , NUF1 및 NUF2이었다. 하향조절된 유전자에는 매우 당연한 유전자(PDC1 , PDC5 , PDC6 및 URA3)와 그외에 ALP1 , AQY1 , GND2 , FU11 , HSP30 , HXT5 , MEP2 , MLS1 , PDR12 , PHO4 , SSA3 및 SSA4 등이 포함되었다. 대량발현시 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 C2 탄소원 영양요구성이 자랄 수 있도록 하는 유전자인 GLY1의 발현은 선별된 균주 내에서 그다지 현저하게 변하지 않았다.
진탕 플라스크 배양액에서 포도당 내성의 선별. C2 탄소원 비의존성의 선별을 끝낸 후에는 케모스탯 배양액의 소량 분주물을 우라실과 20g/l 포도당을 함유한 합성 배지가 들어있는 진탕 플라스크로 운반하였다. 이전 결과를 통해 기대되는 바와 같이, 본래의 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 C2-비의존성 균주 모두 합성 배지, 우라실과 포도당을 함유한 아가 평판배지에서 자라지 않았으며, 반면 양 균주 모두 합성 배지, 우라실과 에탄올을 함유한 아가 평판 배지에서는 자랐다(도 3).
이에 따라 C2 탄소원-비의존성 균주를 포도당 상에서 진탕 플라스크 배양하였을 때 처음 7일 동안은 전혀 성장이 관찰되지 않았다. 그러나 C2 탄소원-비의존성 균주를 장기 배양한 경과 자연발생적으로 포도당-내성 돌연변이가 축적되면서 현저한 균체 생성을 보였다. 이때 관찰된 비증식속도는 0.01/h보다 낮았다. 피루브산 분비로 인한 배양액의 산성화로 균체 밀도가 상대적으로 낮아진 상태에서 일어나는 성장 멈춘 현상이 생긴 후에는, 배양액 1ml를 100ml의 동일한 합성 배지를 함유한 500ml짜리 다음 진탕 플라스크로 운반하였다.
일련의 배양 과정을 총 27번 반복하였다. 6번째 진탕 플라스크에서 Pdc 음성 균주의 비증식속도는 20g/l 포도당에 대해 0.10/h이었다. 14번째 진탕 플라스크 배양으로 0.18/h의 비증식속도가 얻어진 후 배지 내 포도당 함량은 순차(consecutive) 배양액에서 32, 54, 69, 및 100g/l로 증가하였다. 포도당 농도가 높을 때 얻어진 C2 탄소원-비의존성 및 포도당-내성 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 단독 탄소원으로 포도당을 사용하는 진탕 플라스크에서 0.20/h의 비증식속도로 생육하였다.
여러가지 자연발생 돌연변이체의 혼합물이 존재할 것으로 보이는 배양액을 합성 배지, 포도당 및 우라실을 함유한 아가 평판 배지 상에 스트리킹하였다. 얻어진 콜로니 중 4개를 골라서 진탕 플라스크 내 포도당 상에서의 생육을 테스트하였으며 비증식속도에서는 별다른 두드러진 차이가 관찰되지 않았다. 앞으로의 연구를 위해 이들 배양액 중 하나를 선택하였고 상기 C2 탄소원-비의존성 포도당 내성 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 다음 설명하는 TAM라 명명하였다.
단독 탄소원으로 포도당이나 에탄올을 함유하는 합성 배지 상에서 본래의 Pdc 음성(RWB837), C2 탄소원-비의존성 효모 균주, TAM 균주와 야생형의 생육 차이는 도 3에 도시된 바와 같이 아가 평판배지 상에서의 생육을 통해 명백히 입증되었다.
도 3에서, 양 평판 배지 모두에 우라실을 보충하여 Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주의 영양요구성 균주가 자랄 수 있도록 하였다. 에탄올 평판 배지는 7일 동안 항온배양하였으나, 포도당 평판 배지는 3일간 항온배양하였다. 단독 탄소원으로 에탄올(좌 평판 배지) 또는 포도당(우 평판 배지)을 함유하는 합성배지 아가 평판 배지 상에 사용된 균주는 다음과 같다: a. RWB837(Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), b. RWB837*(선별된 C2 탄소원-비의존성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), c. TAM(선별된 C2 탄소원-비의존성 및 포도당 내성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)), d. CEN.PK113-7D(야생형)
TAM 균주가 3일 이상 잠복기(lag phase)를 나타내는 경우라도 탄소원으로 에탄올을 함유한 평판 배지 상에서 4 균주 모두가 생육하였다. 상술한 바와 같이, 포도당이 탄소원인 경우에는 본래 Pdc 음성 균주(RWB837)과 C2 탄소원 비의존성 균주 모두 생육하지 않았다. 야생형은 물론 선별된 TAM 균주도 포도당 함유 아가-평판 배지에서 아주 잘 증식하는데(도 3), 이는 진탕 플라스크 내 포도당에서의 성장과 동일하다.
발효조 배양액에서 선별된 TAM 균주에 의한 피루베이트 생산. 진탕 플라스크에서 포도당 내성을 선별하는 동안에는 피루베이트의 분비로 인하여 배양액의 빠른 산성화가 관찰되었다. TAM 균주의 피루베이트 생산 잠재성을 추가로 평가해보기 위해, 발효조에 고형 포도당을 첨가하면서 반복 회분으로 발효를 지속하였다(도 4). pH가 일정하게 유지되는 발효조에서 초기 포도당 농도 100g/리터로 호기성 회분 배양을 행하였다. 이와 같이 반복 회분 동안의 비증식속도는 성장이 멈출 때까지 점차로 감소하였는데, 이는 배지 내 영양분 제한에 기인하는 것으로 보인다. 지수증식기(도 4) 동안 TAM 균주의 최대 비증식속도는 0.20/h이었으며, 이는 진탕 플라스크에서의 최대 비증식속도와 일치하는 값이다. 진탕 플라스크에서 관찰된 바와 동일하게 다량의 피루베이트가 발효조 배양에서도 생산되었다. 상등액의 피루베이트 농도는 발효조에 접종한 후 60시간 이내 100g/l를 넘어섰다. 대수증식기 동안 피루베이트의 생성 속도는 6-7mmol/g균체/h이었다. 낮은 균체 농도(OD660=0.1)로 개시한 후 본 회분 배양의 처음 40시간 동안에는 0.55g피루베이트/g포도당의 수율로 50g/l 농도의 피루베이트를 수득하였다. 100시간 경과 후 얻은 피루브산의 최종 농도는 135g/l이었고 이때의 수율은 0.54g피루베이트/g포도당이었다.
TAM 균주의 포도당-제한 케모스탯 배양. 포도당을 이용한 회분 배양에서 TAM 균주의 최대 비증식 속도는 0.20/h이었다. 동일 조건 하에서 야생형 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK113-7D는 TAM 균주보다 높은 0.37/h의 최대 비증식속도로 성장하였다(데이터 없음). 증식에 있어 이러한 편차(deviation)를 부가적으로 연구하기 위하여, 희석 속도를 높여가면서 TAM 균주를 포도당-제한 케모스탯 배양하였다. TAM 균주는 희석 속도가 0.10/h일 때 소모 포도당이 이산화탄소와 물이 되도록 완전 호흡(respire)하였다. 야생형 수율(0.48g균체/g포도당)에 비하여 낮은 선별된 균주의 수율(0.43g균체/g포도당)을 고려하면, 그밖의 생리학적 파라미터(parameter)들은 van Hoek 등(21)이 기술한 바와 같이 야생형에 필적하는 정도였다. 희석 속도 0.15/h에서 TAM 균주의 균체 수율은 0.45g균체/g포도당까지 올라갔으나, 이 역시 같은 희석 속도에서 야생형의 수율인 0.50g균체/g포도당보다는 낮은 수치이다. TAM 균주는 포도당 제한 케모스탯 배양시 0.20/h의 희석 속도에서도 성장할 수 있었지만, 이러한 성장은 매우 일정치 않은 피루베이트 생산(0.25-0.45mmol피루베이트/g균체/h)을 가져온다. 0.23/h의 희석 속도에서는 TAM 균주가 케모스탯 밖으로 씻겨져 나가는데, 이때 포도당-제한 케모스탯 배양에서는 0.20/h 내지 0.23/h의 최대 균체 비증식속도를 나타낸다. 장기간의 포도당 제한 케모스탯 배양 후에는 하나의 배양 분주물(aliquot)을 100g/l 포도당을 함유한 한 개의 진탕 플라스크로 운반하였다. 진탕 플라스크에서는 빠른 성장이 관찰되었으며, 이때 그 배양균은 포도당 내성 표현형을 유지하였다.
TAM 균주의 질소-제한 케모스탯 배양. 높은 포도당 농도와 배지 내에 C2 화합물이 없는 상태에서, 선별된 TAM 균주와 야생형 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK113-7D를 비교하는 것이 가장 적당하다. 단독 탄소원으로 포도당을 함유한 같은 희속 속도의 질소-제한 케모스탯 배양은 상기 여러 조건들을 정량적인 생리학적 연구에서의 케모스탯 배양의 장점과 혼용한 배양이다. 대략 동일한 잔여 포도당 농도를 양 균주의 배양에서 얻을 수 있었다는 것에서 합성 배지 내 포도당 농도를 정하였다(표 2).
표 2는 희석 속도가 0.10/h인 호기성 질소-제한 케모스탯 배양에서의 TAM(GCSI 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)) 균주와 동질유전자 야생형 CEN.PK113-7D의 성질을 요약해 놓은 것이다. 야생형 데이터는 Boer 등(2003)(2)이 사용했던 것과 동일한 배양에서 얻었다. 평균과 평균편차는 독자적인 정상상태 배양액을 이용하여 이중(TAM) 또는 삼중(야생형) 실험으로부터 각각 얻었다. 균체의 탄소 함량인 48%(w/w)를 기준으로 탄소 회수량(recovery)을 계산하였으며 이 때 계산치는 브로쓰 내의 잔여 포도당 농도를 포함한다. YSX', YNX 및 YATP는 포도당, 질소 및 ATP에 대한 균체 수율을 나타낸다. P/O 비를 1이라고 가정하여 Verduyn(1992)(27)에 따라 YATP를 계산하였다.
Figure 112005063190985-PCT00002
야생형은 포도당 과잉 상태에서 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 특성인 알코올 발효를 나타내었다. 그 결과 포도당에 대한 균체 수율이 낮았고(0.09g균체/g포도당), 에탄올 생산속도는 8.0mmol/g균체/h, 호흡률은 4.5mmol생성이산화탄소/mmol소모산소이었다. 단백질 함량(0.29g단백질/g균체)과 질소에 대한 균체 수율(18.8g균체/g질소)은 이전에 공개된 야생형의 질소 제한 케모스탯 배양에서의 값과 아주 잘 일치한다.
알코올 발효가 일어나지 않는 상태에서 완전 호흡만 하는 TAM 균주는 동일 조건에서 상기 경우보다 포도당에 대한 균체 수율이 높았고(0.21g균체/g포도당), 하나의 부산물로서 피루베이트를 2.8mmol/g균체/h 속도로 생산하였다(표 2). 산소 소모 속도는 4.0mmol/g균체/h이었으며, 이에 비해 야생형의 경우는 2.7mmol/g균체/h이었다. 피루베이트 생성 기간 동안 만들어진 NADH의 호흡적 산화로 인하여 호흡률은 0.70mmol생성이산화탄소/mmol소모산소로 떨어졌다. 균체의 단백질 함량은 TAM의 경우(0.33g단백질/g균체)가 야생형의 경우(0.29g단백질/g균체)보다 약간 높았다. 이와 같은 세포의 높은 단백질 함량은 TAM 균주의 질소에 대한 수율(14.7g균체/g질소)이 야생형의 경우(18.8g균체/g질소)에 비해 현저히 낮은 까닭의 일부를 설명해준다.
TAM 균주의 전사체 분석. 전사체 분석에서는 비교에 알맞은 배양 조건의 선택이 중요하다. 선별된 TAM 균주의 경우에 그 표현형을 드러내는 전형적인 모습은 브로쓰 내에 포도당이 고농도로 존재하고 C2 화합물은 없다는 것이다. 마이크로어레이 연구에 케모스탯 배양의 장점을 결합해보기 위해서, TAM 균주와 그 동질유전자 야생형 CEN.PK113-7D의 질소 제한 케모스탯 배양을 선택하여 전사체 분석을 행하였다.
질소 제한 케모스탯 배양균을 비교하여 TAM 균주에서 그 mRNA 수준이 야생형에 비해 적어도 2배 이상인 305개의 유전자를 찾아내었다. 168개의 유전자는 mRNA의 양이 야생형보다 TAM 균주가 최소 2배 이상 낮았다. mRNA 수준이 적어도 2배 이상 변화된 유전자를 합쳐보니 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 총 게놈의 약 8%를 차지한다. 이들 변화된 유전자 중에서, 273개(58%)는 그 기능이 알려져 있지 않으며 이는 전체 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 게놈에서 완전히 알려진 유전자의 백분율(47%)보다 높은 비율이다.
선별된 균주 내 상향조절된 상류(upstream) 영역의 유전자에 대한 서열 분석으로부터 이들 유전자 중에 Mig 결합 지점 같은 것이 대량 보여지고(overpresentation) 있음을 알았다. 우선해서 전사후(posttranscription) 조절된 MIG1의 전사 수준은 변하지 않더라도 그 닫힌 상동체(close homologue)인 MIG2의 전사 수준은 거의 11배 가까이 하향조절되었다. 성장시 포도당이 아닌 다른 탄소원을 필요로 하는 여러 유전자들은 TAM 균주에서 상향조절되었다. 이는 포도당 신생(gluconeogenesis) 및 에탄올의 사용(ACS1, ADH2, ADR1, CAT8, FBP1, SIP4), 지방산 대사(CAT2, CRC1, ECI1, FAA2, FOX2, PEX11, POTI, POTI, YAT2), 갈락토스 대사(GAL2, GAL3, GAL4), 말토스 대(YDL247W, YFL052W, YJRI60C)와 피루베이트 및 락테이트 대사(DLD1, JEN1)와 연관있는 유전자를 포함하였다.
6탄당 운반자(transporter)를 코딩하는 유전자 발현이 변한다는 엄청난 사실이 관찰되었다. 질소 제한 조건 하에서 포도당 농도가 높음에도, 친화력이 낮은 운반자(HXT1 및 HXT3)가 TAM 균주 내에서 야생형에 비해 50배 정도 하향조절되었다(도 5). 친화력이 높은 것으로 알려진 운반자(HXT6 및 HXT7) 역시 이 균주 내에서 하향조절(4배)되었다(도 5). 그 결과, 어레이 상에 나타나는 모든 HXT들(HXT1-10, HXT12, HXT14 및 HXT16)의 전사 합은 질소 제한 조건에 있는 TAM 균주 내에서의 경우가 야생형의 경우보다 4배나 낮다. HXT의 포도당 반응 조절 네트워크에서는(16), 당 농도 의존성 발현 조절자(modulator)인 STD1이 야생형에 비해 TAM 균주 내에서 12배 하향조절된 것만이 현저한 전사성 변화일 뿐이었다.
TAM 균주는 포도당 조건에서 성장을 위한 C2 화합물에 비의존적일 뿐 아니라 포도당 내성을 가졌으므로, 어느 정도의 전사성 변화로 인하여 C2 탄소원 비의존성을 얻을 수 있는지를 아는 것은 중요한 일이다. 이전에 세포질 C2-화합물원(source)으로 설명했던(24) GLY1의 전사는 TAM 균주 내에서 2.5배 상향조절되었다. 그러나 TAM 균주 내의 쓰레오닌 알돌라제 활성은 여전히 검출 한계인 0.005micromol/min/단백질 이하였다. 또한 아세틸-CoA 연관 반응을 포함하는 아르기닌 대사에서의 2개 유전자(CAR1 및 CAR2)는 TAM 균주 내에서 6배 상향조절되었다. 선별된 Pdc 음성 균주 내 상향조절된 유전자의 상당수가 교배(3개 유전자), 세포분열(17개 유전자) 및 포자형성(8개 유전자)과 관련이 있다는 점을 언급하면서 전사체 분석을 마무리하여야 한다. 본래 균주(RWB387)과 선별된 Pdc 음성 균주 양자 모두가 확실한 반수체(haploid)라 초기 세포분열 전사 인자인 IME1을 포함하여 이들 유전자 발현의 기원과 이면의 메카니즘은 여전히 알려지지 않은 채 남아있다. 선별된 Pdc 음성 균주 내 상향조절된 유전자의 상류 영역에 대한 서열 분석 또한 세포분열 조절에 연관있는 두 유전자인 UME6 및 IME1의 결합 지점이 대량 보여지고 있음을 분명히 하였다.
TAM 균주와 야생형 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae )의 대사 플럭스 (metabolic flux). 0.1/h의 희석 속도로 탄소 제한 성장하는 동안에는 TAM 균주의 균체 수율이 야생형보다 약 10% 정도 낮기는 하지만 어쨌든 최종 TAM 균주와 야생형 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 모두 완전 호흡적 포도당 대사작용을 보인다. 선별된 포도당 내성 표현형을 나타내기에 더욱 적절한 환경인 0.1/h 희석 속도의 질소 제한 케모스탯 배양에서 TAM 균주의 산소 소모 속도(4.0mmol/g균체/h)는 야생형의 경우(2.7mmol/g균체/h)보다 높았다(표 2). 흥미로운 것은 산소 소모의 증가량(4.0-2.7=1.3mmol/g균체/h)이 피루베이트 생성 동안 만들어진 세포질 NADH를 재생하는데 필요한 산소량(0.5x2.8=1.4mmol/g균체/h)과 거의 일치함을 보인다는 점이다. 상기 희석 속도의 질소 제한 케모스탯 배양에서, TAM 균주와 야생형 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 미토콘드리아에 의한 산화적 피루베이트 대사 속도는 외관상(appearently) 동일하다.
이러한 질소 제한 배양의 에너지 효율은 ATP에 대한 실험 균체 수율(YATP)을 TAM 균주(±8.3g균체/molATP)와 야생형(±6.8g균체/molATP)에 대해 구해서 이를 비교하여 얻을 수 있다. TAM 균주의 YATP가 야생형의 경우보다 약간 높긴 하지만 양자의 질소 제한 배양액에서의 값은 이전에 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대한 다른 질소 제한 케모스탯 배양에서 관찰된 바와 마찬가지로(11), 포도당 제한 조건 하에서 관찰된 값(26)의 절반 정도의 수준에 불과하다. 피루베이트를 생성하는 동안 만들어진 NADH의 산화적 재생과 보다 높은 YATP는 질소 제한 조건 하에서 TAM 균주의 포도당에 대한 균체 수율을 야생형에 비해 2배 이상 높일 수 있다.
야생형 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 질소 제한 케모스탯 배양 플럭스는 불일치를 보인다는 점에 유의하여야 한다(표 2). 이산화탄소 생성 속도가 에탄올 생성 속도 및 산소 소모 속도를 합친 값보다 13% 높다고 되어 있으나(표 2), 이들 값은 거의 일치하여야 한다. 소모된 탄소의 회수가 상대적으로 낮다는 점에서 볼 때, 이산화탄소 생성을 지나치게 고려한 것이 이러한 편차의 원인인 것 같지는 않다. 따라서 상기 불일치는 에탄올 또는 다른 휘발성 화합물, 예컨대 아세트알데히드의 증발(evaporation)을 고려하지 않아 나타나는 것이라 할 것이다.
선별된 TAM 균주에 의한 피루베이트의 고축적 . 피루베이트 탈탄산효소 활성이 감소되었거나 또는 그 활성이 아예 없는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 의한 피루베이트의 분비에 대해서는 예전부터 관찰된 바 있다(6,17). 그러나 TAM 균주는 포도당을 함유한 합성 배지 상에서 빠른 성장을 보인 반면, Pdc 음성 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 상기 조건에서는 전혀 자라지 않는다. 또한 TAM 균주는 부산물로서의 에탄올을 검출가능하지 않은 양으로 가지고 있고 여러 다른 피루베이트 생산 미생물과는 대조적으로 배지 내에 특정 화합물의 부가나 삭감을 필요로 하지 않는다(12). TAM 균주 배양액은 적어도 약 135g/l 농도로 피루베이트를 생산할 수 있다. 피루베이트의 높은 비생산속도(6-7mmol피루베이트/g균체/h)로 인하여 밀도가 낮은 접종물(OD600=0.1)로 시작하여 60시간이 경과하기 전에 100g/l의 피루베이를 수득할 수 있었다.
실시예 2
본 실시예는 YEpLpLDH로 형질전환된 TAM 균주의 생산 특성에 관한 것이다. 이 균주를 LDH 유전자의 대량발현(overexpression)을 위한 숙주로 사용함으로써 적어도 일부의 당분해 플럭스(glycolytic flux)는 락테이트 생산 쪽으로 재유도(redirect)될 수 있다.
본 실험은 30℃, pH 5.0(KOH 10M로 적정)에서 산소 제한(oxygen limitation) 조건의 미네랄 배지에서 행하는 두 번의 회분 배양(batch cultivation)을 포함한다.
플라스미드의 작제
엘. 플란타룸 ( L. plantarum ) 게놈( genomic ) DNA로부터 LDH 유전자의 증폭
LDH 유전자를 증폭시키기 위해 엘. 플란타룸(L. plantarum)에서 게놈 DNA를 추출하여 PCR을 실행하였다. 플라스미드 작제물(construct)의 일부분로 서열화된 LDH 유전자의 서열은 하기 서열 3과 같다. 아미노산 서열은 하기 서열 4와 같다.
올리고:
LDH 정방향
서열 1: 5' TGA CTT ATT ATG TCA AGC AT 3'
LDH 역방향
서열 2: 5' ATC GTA TGA AAT GAT TAT TTA TT 3'
PCR 조건:
95℃ 3'
Figure 112005063190985-PCT00003
95℃ 1'
Figure 112005063190985-PCT00004
48℃ 1'
Figure 112005063190985-PCT00005
x 33 사이클
72℃ 2'
72℃ 10'
4℃ ∞
서열 3(cds 유전자 61-1023)
ggtaccacgc atgntgcagacgcgttacgtatcggatccagaattcgtga ttgacttatt 60
atg tca age atg cca aat cat caa aaa gtt gtg tta gtc ggc gac ggc 108
get gtt ggt tct agt tac getttt gcc atg gca caa caa gga att get 156
gaa gaattt gta att gtc gat gtt gtt aaa gat egg aca aag ggt gac 204
gcc ctt gat ctt gaa gac gcc caa gca ttc acc get ccc aag aag att 252
tac tca ggc gaa tat tea gat tgt aag gac get gac tta gtt gtt att 300
aca gcc ggt gcg cct caa aag cct ggt gaa tca cgt tta gac tta gtt 348
aac aag aat tta aat atc cta tcatcc att gtc aaa cca gtt gtt gac 396
tec ggcttt gac ggc atc ttc tta gtt get get aac cct gtt gac atc 444
tta act tac get act tgg aaa ttc tea ggt ttc cca aag gat cgt gtc 492
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gaa gat tta gcc aag tta gaa gat ggt gtt cgt aac aaa get tac gac 732
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서열 4
엘. 플란타룸(L.plantarum)의 락테이트 탈수소효소 유전자
Met Ser Ser Met Pro Asn HisGln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly
Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala
Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Lys Gly Asp
Ala Leu Asp Leu Glu Asp AlaGln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile
Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile
Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val
Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp
Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile
Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val
Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu
Gly LysGln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met
Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile
Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp
Glu Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp
Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu
Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro
Val Gly Ala Tyr Met Asp GlyGln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile
Gly Thr Pro Ala Val Ile Gly Gly Thr Gly Leu LysGln Ile Ile Glu
Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys MetGln Asp Ser Ala Ala
Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys
증폭된 PCR 단편의 이. 콜라이 ( E. coli ) 벡터( pSTblue -1, pSTplLDH 생산)로의 서브클로닝 :
얻어진 단편을 키트("Perfectly Blunt® Cloning Kit", Novagene사 제품)를 이용하여 pSTblue-1 벡터(상용 가능하고 EcoRV 지점에 열려진 평활 말단이 있음) 내로 서브클로닝하였다. 이 서브클로닝 단계를 거친 결과 플라스미드 pSTplLDH가 완성되었다.
시퀀싱(sequencing):
상기 방법으로 얻어진 플라스미드 중 하나를 시퀀싱하였고, 그 결과물인 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 기탁(deposited) 서열과 정렬시켜 보았다(align).(첨부 파일 참조)
증폭된 단편의 에스 . 세레비지에 ( S. cerevisiae ) 발현 벡터( pYX022 , p022TLP 생산)로의 서브클로닝 :
EcoRI 제한 효소를 이용하여 상기에서 수득한 시퀀싱된 플라스미드 pSTplLDH에서 plLDH의 코딩 서열을 잘라내었다. 그로부터 얻어진 단편을 에스.세레비지에(S.cerevisiae) 통합(integrative) 발현 벡터 pYX022(R&D Systems사 제품)(EcoRI이 열려있고 탈인산화되어 있음) 내로 서브클로닝하였다. 그 결과물인 발현 플라스미드를 pYX022TLP로 명명하였다. pYX022TLP는 Paola Branduardi에 의해 제조되었다.
플라스미드 pYX022TLP를 AatII로 절단하고 링커(linker)를 그 지점에 연결시켜 AatII 지점을 다섯개의 새로운 지점인 XhoI, BamHI, SmaI/XmaI 및 NheI으로 대체하였다. 상기 새로운 플라스미드 pYX022LpLDH-Aat를 NheI과 SacI으로 잘랐다. TPI1 프로모터 및 엘.플란타룸(L. plantarum) LDH를 포함하는 단편과 XbaI 및 SacI으로 절단한 YEplac195를 연결시켜 YEpLpLDH(Ron Winkler에 의해 제조)를 만들었다.
균주 및 유지(maintenance)
균주로는 효모 플라스미드 pLpLDH를 포함하는 TAM을 사용하였다. TAM 숙주 균주에 대해서는 상기에서 기재한 바 있다. YEpLpLDH는 tpi 프로모터와 기능적으로 연결된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 LDH 유전자를 포함한다. 효모 플라스미드 pLpLDH를 포함하는 TAM를 부다페스트 조약에 따라 2004년 4월 23일자로 미국 일리노이주 61604 페오리아시 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 미합중국 농무부 산하 국립농산물이용연구센터 농업연구청미생물보존센터 북부지역연구센터(NRRL)에 기탁하였다(기탁번호 NRRL Y-30742).
상기 균주를 포도당 함유 미네랄 배지를 넣은 진탕 플라스크에 접종하여 30℃에서 진탕배양하며 생육하였다. 24 시간 경과 후, 상기 배양액을 글리세롤 P.A.와 함께 20%(v/v) 글리세롤과 혼합한 후 2ml 바이얼에 넣어 -80℃에 보관하였다. 상기 바이얼은 모든 후속 실험에서 접종물(inoculate)로서 사용되었다.
배지
ME 미량원소 용액 농축 미량원소 용액은 하기 성분으로 이루어진다:
화합물 화학식 gl-1 ml
EDTA (티트리플렉스 (Ⅲ®)
Figure 112005063190985-PCT00006
 15.00
아연 설페이트 헵타하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00007
 4.50
망간 클로라이드 디하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00008
 0.84
코발트(Ⅱ)설페이트 펜타하이드레이트(독성)
Figure 112005063190985-PCT00009
 0.30
구리(Ⅱ)설페이트 펜타하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00010
 0.30
디-소디움 몰리브데눔 디하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00011
 0.40
칼슘 클로라이드 디하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00012
 4.50
철 설페이트 헵타하이드레이트
Figure 112005063190985-PCT00013
 3.00
보르산
Figure 112005063190985-PCT00014
 1.00
포타슘 아이오다이드
Figure 112005063190985-PCT00015
 0.10
탈염수 1000
NaOH(p.a.)를 사용하여 pH는 6.0으로 유지하였다. 이어서 pH를 그대로 유지하면서 기타 성분들을 하나씩 용해시켰다. 일단 용해가 끝난 다음에는 1M HCl을 사용하여 pH를 4.0으로 조절하고 전체 부피를 1 리터로 맞추었다. 상기 용액을 121℃에서 20분 동안 멸균시켰다.
ME 비타민 용액 농축 비타민 용액은 하기 성분으로 이루어진다:
화합물 화학식 gl-1 ml
비오틴 (D-)
Figure 112005063190985-PCT00016
 0.05
칼슘 D(+) 판토테네이트
Figure 112005063190985-PCT00017
 1.00
니코틴산
Figure 112005063190985-PCT00018
 1.00
미오-이노시톨
Figure 112005063190985-PCT00019
 25.00
티아민 클로라이드 디하이드로클로라이드
Figure 112005063190985-PCT00020
 1.00
피리독솔 하이드로클로라이드
Figure 112005063190985-PCT00021
 1.00
p-아미노벤조산
Figure 112005063190985-PCT00022
 0.20
탈염수 1000
비오틴을 0.1M NaOH 용액 10ml에 녹였다. 이 용액에 탈염수 750ml를 가하고 1M HCl로 pH 6.5가 되도록 조절한 다음 이 용액에 모든 성분을 하나씩 용해시켰다. 이 때 pH는 6.5로 계속해서 유지하였다. 모든 성분을 첨가한 후의 부피는 1000ml, pH 6.5로 조절하였다.
포도당 함유한 회분 미네랄 배지 발효조 내의 회분 배지는 하기 성분으로 이루어진다:
화합물 화학식 그램 리터
암모늄 설페이트
Figure 112005063190985-PCT00023
 10.0
포타슘 디하이드로겐 포스페이트
Figure 112005063190985-PCT00024
 6.0
마그네슘 설페이트 7H2O
Figure 112005063190985-PCT00025
 1.0
ME-미량 0.002
실리콘 소포제 0.0002
탈염수 1.0
멸균후 첨가
ME-비타민 0.002
포도당 H2O
Figure 112005063190985-PCT00026
 110
탈염수 0.200
진탕 플라스크 배양
진탕 플라스크 실험을 로터리 진탕기(rotary shaker)에서 둥근 바닥 플라스크를 이용하여 30℃의 온도에서 행하였다. 200rpm의 속도로 진탕하고 총 부피 500ml인 진탕 플라스크의 1/5까지만 채움으로써 호기성 조건을 유지하였다.
발효조 배양
발효조 배양은 1리터의 작동 부피(working volume)를 가진 생물반응기(Applikon Dependable Instruments사 제품, Schiedam, The Netherlands)로 수행하였다. pH는 10M 수산화칼륨으로 적정하면서 pH 5.0이 되도록 자동 제어하였다. 수산화칼륨의 첨가량은 중량을 기준으로 결정하였다(Balance Mettler Toledo PB3001-5, Tiel). 히팅 핑거(heating finger)를 통해 온수를 순환시켜서 온도를 30℃로 유지시켰다. 소포제(anti-foam)로 실리콘(Silicone)(BDH사 제품, Poole England)을 배지에 첨가하였다.
2개의 Rushton 임펠러(impeller)를 사용하여 교반 속도를 800rpm으로 일정하게 유지시켰다. 가스 유량(flow)은 2개의 Brooks 5876 유량 제어기(mass-flow controller)(Brooks BV사 제품, Veenendaal, The Netherlands)를 사용하여 70ml공기/min 및 430mlN2/min으로 구성하였으며 0.5l/min이 되도록 유지하였다.
pH, DOT(용존 산소 농도, dissolved oxygen tension) 및 KOH 주입은 온라인 데이터 수집 및 제어 시스템(on-line data acquisition&control system)(Bioscada사 제품, TUDelft에서 사내 개발됨)으로 연속 모니터링하였다.
회분 조건
회분 발효가 진행되는 동안 상이한 두 단계로 구별되어졌다. 산소화가 일정하게 유지됨에 따라 산소가 제한적으로 될 때까지 균주가 최대 성장 속도로 성장하였다. 산소 제한 하에서는 포도당이 고갈될 때까지 균체 생성, 락테이트 생산 및 포도당 소모가 선형을 이루었다.
포도당이 다 소모됨에 따라 100g/l의 포도당을 분말 형태로 첨가하였다.
pH, DOT 및 KOH 주입은 온라인 데이터 수집 및 제어 시스템(Bioscada사 제품, TUDelft에서 사내 개발됨)으로 연속 모니터링하였다.
폐가스 (off-gas) 분석
발효조 배양에서 나오는 배출가스는 응축기(2℃)에서 냉각시키고 Perma Pure 건조기(type PD-625-12P)로 건조시켰다. 산소와 이산화탄소 농도는 ADC 7000 가스 분석기로 측정하였다. 배출가스의 유량(flow rate)은 Saga Digital Flow 측정기(meter)(Ion Science사 제품, Cambridge)로 측정하였다. 이전에 기재한 바에 따라(28) 이산화탄소 생성 비속도(specific rate) 및 산소 소모 비속도를 계산하였다.
시료 제조
균체, 기질 및 생성물 분석을 위한 시료를 얼음 위에서 수집하였다. 발효 브로쓰(broth) 시료와 무세포(cell free) 시료(10분간 10,000xg에서 원심분리하여 제조)는 추후 분석에 대비하여 -20℃에 보관하였다.
HPLC 측정
HPX-87H Aminex 이온 배제 컬럼(300X7.8mm, BioRad사 제품)을 장착한 Waters HPLC 2690 system을 이용하여 당, 유기산 및 폴리올(polyol)의 존재 유무를 동시에 측정하였다(60℃, 0.6ml/min 5mM H2SO4). Waters 2487 UV 검출기(detector)와 Waters 2410 굴절율(refractive index) 검출기를 연결하였다.
건중량 (dry weight) 측정
배양액의 효모 건중량은 0.45㎛ 필터(Gelman sciences사 제품)에 5ml의 배양액을 통과시켜 여과시킴으로써 측정하였다. 필요하다면 시료를 희석하여 최종 농도가 5 내지 10g/l이 되도록 하여 사용하였다. 필터들은 80℃ 항온배양기(incubator)에서 최소한 24시간 이상 두어 사용전에 건중량을 측정할 수 있도록 하였다. 시료 중의 효모 세포가 필터 상에 붙인 채로 10ml의 탈염수로 필터를 세척하였다. 그런 다음 세포가 붙어있는 필터를 전자레인지(Amana Raderrange사 제품, 1500Watt)에 넣어 20분 동안 50%의 용량(capacity)으로 건조시켰다. 2분간 냉각시킨 후 세포가 부착된 건조 필터를 칭량하였다. 건중량은 세포가 붙어있는 필터 중량에서 필터 자체의 중량을 빼서 계산하였다.
광밀도 측정( OD 660 )
분광광도계(spectrophotometer), Novaspec II(Amersham Pharmacia Biotech사 제품, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 4ml 큐벳(cuvette)으로 660nm에서 효모 배양액의 광밀도를 측정하였다. 필요한 경우에는 0.1 내지 0.3의 광밀도를 얻을 수 있도록 시료를 희석하여 사용하였다.
발효 실험의 결과가 표 6a 및 표 6b에 요약되어 있다. 각각의 발효의 상세한 설명은 표들과 도 6-13에 나타나 있다.
회분 배양 1의 결과 개요
시간 [h] 생성 균체
Figure 112005063190985-PCT00027
 생성 균체 [OD660 l-1.h-1] 생성 락테이트
Figure 112005063190985-PCT00028
 생성 피루 베이트
Figure 112005063190985-PCT00029
 생성 글리 세롤
Figure 112005063190985-PCT00030
 생성 숙시 네이트
Figure 112005063190985-PCT00031
 락테이트 비생산성
Figure 112005063190985-PCT00032
 피루 베이트 비생 산성
Figure 112005063190985-PCT00033
 포도당 Yxs에 대한 건중량 수율
Figure 112005063190985-PCT00034
 포도당 Yxs에 대한 락테이트 수율
Figure 112005063190985-PCT00035
 포도당 Yxs에 대한 피루베이트 수율
Figure 112005063190985-PCT00036
1 22-80#1 0.09 0.12 0.69 0.050 0#2 0.012 0.53 0.070 0.079 0.63 0.045
1 80-175#3 0.015 0.04 0.39 0.15 0.03 0.033 0.56 0.26 0.016 0.42 0.15
#1: 24-80시간 사이에서 산소 운반의 가정적 제한
#2: 글리세롤 농도 일정
#3: 추가로 포도당 가한 후의 두번째 단계
회분 배양 2의 결과 개요
시간 [h] 생성 균체
Figure 112005063190985-PCT00037
 생성 균체 [OD660 l-1.h-1] 생성 락테이트
Figure 112005063190985-PCT00038
 생성 피루 베이트
Figure 112005063190985-PCT00039
 생성 글리 세롤
Figure 112005063190985-PCT00040
 생성 숙시 네이트
Figure 112005063190985-PCT00041
 락테이트 비생산성
Figure 112005063190985-PCT00042
 피루 베이트 비생 산성
Figure 112005063190985-PCT00043
 포도당 Yxs에 대한 건중량 수율
Figure 112005063190985-PCT00044
 포도당 Yxs에 대한 락테이트 수율
Figure 112005063190985-PCT00045
 포도당 Yxs에 대한 피루베이트 수율
Figure 112005063190985-PCT00046
2 22-80 0.08 0.15 0.88 0.120 0.019 0.019 0.22 0.020 0.060 0.70 0.093
#1: 24-80시간 사이에서 산소 운반의 가정적 제한
양 발효에서 산소화의 총량을 고정시킴으로써 24시간 경과후 이루어진 산소 제한으로 인하여 포도당의 선형 소모 프로파일과 락테이트의 선형 생성 프로파일이 도출되었다.
발효 1
진탕 플라스크 전배양액(preculture)로부터 접종을 받아 99.2g포도당/l의 초기 농도로 회분 발효를 시작하였다. 회분 발효를 시작한지 처음 24시간 동안에는 균체가 0.13±0.02/h로 지수증가함에 따라 산소화(oxygeation)가 제한되지 않았다. 이 단계에 이어 선형 추세를 보이는(표 1과 도 1 내지 5 참조) 포도당 소모와 균체, 락테이트, 피루베이트 및 숙시네이트의 생성에 따라 산소가 제한되었다. 초기 포도당 농도를 소모하는데는 80시간이 걸렸다. 이 단계에서의 락테이트 생산성(productivity)은 0.69g/l/h, 비생산성(specific productivity)은 0.53g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.63g/g이었다. 피루베이트의 생산성은 0.05g/l/h, 비생산성은 0.07g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.045g/g이었다. 도 6-9 참조.
첫번째 회분 배양에서 포도당을 다 소모한 후 포도당을 분말로 추가로 가하여 포도당 농도가 98.4g포도당/l이 되도록 하였다. 이 단계에서의 락테이트 생산성은 0.039g/l/h, 비생산성은 0.56g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.42g/g이었다. 피루베이트의 생산성은 0.15g/l/h, 비생산성은 0.26g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.15g/g이었다. 락테이트의 총 생산성은 100g/l/h이었고, 총 수율은 0.48g/g, 락테이트 비생산성은 0.53g/g/h이었다.
발효 2
진탕 플라스크 전배양액으로부터 접종을 받아 96.3g포도당/l의 초기 농도로 회분 발효를 시작하였다. 회분 발효를 시작한지 처음 24시간 동안에는 균체가 0.13±0.02/h로 지수증가함에 따라 산소화가 제한되지 않았다. 이 단계에 이어 선형 추세를 보이는(표 1과 도 1 내지 5 참조) 포도당 소모와 균체, 락테이트, 피루베이트 및 숙시네이트의 생성에 따라 산소가 제한되었다. 초기 포도당 농도를 소모하는데는 106시간이 걸렸다. 이는 더욱 심한 산소 제한을 나타내는 이중(duplicate) 발효보다 30시간 더 긴 시간이었다. 이 단계에서의 락테이트 생산성은 0.88g/l/h, 비생산성은 0.22g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.70g/g이었다. 피루베이트의 생산성은 0.12g/l/h, 비생산성은 0.22g/g/h이고 포도당에 대한 수율은 0.093g/g이었다. 도 10-13 참조.
실시예 3
본 실시예는 YEpLpLDH로 형질전환된 TAM 균주의 생산 특성에 관한 것이다. 본 실험은 32℃에서 pH 조절 없이 미네랄 배지에서 행하는 회분 배양을 포함한다.
균주
사용 균주는 효모 플라스미드 pLpLDH를 포함하는 TAM를 사용하였다. TAM 숙주 균주에 대해서는 상기에서 기재한 바 있다. YEpLpLDH는 tpi 프로모터와 기능적으로 연결된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 LDH 유전자를 포함하며, 이에 대해서는 상기 기재되어 있다.
포도당 함유 미네랄 배지를 포함한 진탕 플라스크에서 균주를 32℃ 진탕배양하여 생육시켰다. 100ml 배지가 들어있는 250ml 삼중 배플(triple baffled) 진탕 플라스크에서 진탕 발효시켰다. 배지 조성은 하기 표에 나타나 있다.
배지
포도당 75g/L, 미량원소, 비타민 및 염은 다음과 같다.
미량원소는 하기 성분으로 이루어진다:
화학식 ㎍l-1
Figure 112005063190985-PCT00047
 712
Figure 112005063190985-PCT00048
 62.5
Figure 112005063190985-PCT00049
 235
Figure 112005063190985-PCT00050
 500
Figure 112005063190985-PCT00051
 450
Figure 112005063190985-PCT00052
 200
Figure 112005063190985-PCT00053
 100
비타민은 하기 성분으로 이루어진다:
화합물 ㎍l-1
비오틴 (D-) 2
Ca D(+) 판토테네이트 400
이노시톨 2000
엽산 2
티아민 하이드로클로라이드 400
피리독신 하이드로클로라이드 400
p-아미노벤조산 200
리보플라빈 200
니아신 400
염:
화합물 ㎍l-1
우레아 1
Figure 112005063190985-PCT00054
 1
Figure 112005063190985-PCT00055
 0.5
Figure 112005063190985-PCT00056
 0.1
Figure 112005063190985-PCT00057
 2.78
Figure 112005063190985-PCT00058
 0.1
포도당은 50% 저장용액(stock solution)으로 제조한 다음 따로따로 고압증기멸균(autocalve)하였다. 약간의 Ca2 +를 가하여 세포가 활성 생리 단계에서 좀 더 좋은 상태로 유지되도록 하였다. 본 실시예에서는 총 1112ppm의 Ca2 +를 첨가하였다. New Brunswick G-25 진탕기를 이용하여 180rpm의 속도로 32℃에서 발효를 행하였다. TAM YEpLpLDH의 발효 결과는 하기 표 10과 도 14에 기재되어 있다.
시간 (h) OD660 pH 포도당 g/L 락테이트 g/L
0 2.47 5.86 74.47 0
39 7.38 3.01 47.80 15.9
63 8.70 2.80 35.08 25.74
88.5 10.48 2.72 26.80 30.78
111 10.72 2.67 21.28 32.88
상기 표와 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락트산 생성 속도는 63시간 후부터 감소하였다. 63시간 이상의 발효 시간(63시간에서 111시간)은 락테이트의 농도를 7.14g/L 더 증가시킬 뿐이었다. 포도당 기준(basis)의 수율(wt/wt)은 62.8%이었다.
참고문헌
하기 참고문헌은 본원에 개시되는 내용들을 보충하는 좋은 예가 되는 절차상 또는 그밖의 상세한 설명을 제공한다 점에서 특별히 본원에 참고로 인용하고 있다.
Figure 112005063190985-PCT00059
Figure 112005063190985-PCT00060
Figure 112005063190985-PCT00061
Figure 112005063190985-PCT00062
<110> A.E. Staley Manufacturing Co. <120> Pyruvate Producing Yeast Strain <150> US 60/467,724 <151> 2003-05-02 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 tgacttatta tgtcaagcat 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 atcgtatgaa atgattattt att 23 <210> 3 <211> 1117 <212> DNA <213> lactate dehydrogenase gene of L. Plantarum <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> N=C, G, A, or T <220> <221> CDS <222> (61)..(1020) <400> 3 ggtaccacgc atgntgcaga cgcgttacgt atcggatcca gaattcgtga ttgacttatt 60 atg tca agc atg cca aat cat caa aaa gtt gtg tta gtc ggc gac ggc 108 Met Ser Ser Met Pro Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 gct gtt ggt tct agt tac gct ttt gcc atg gca caa caa gga att gct 156 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 gaa gaa ttt gta att gtc gat gtt gtt aaa gat cgg aca aag ggt gac 204 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Lys Gly Asp 35 40 45 gcc ctt gat ctt gaa gac gcc caa gca ttc acc gct ccc aag aag att 252 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile 50 55 60 tac tca ggc gaa tat tca gat tgt aag gac gct gac tta gtt gtt att 300 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 aca gcc ggt gcg cct caa aag cct ggt gaa tca cgt tta gac tta gtt 348 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 aac aag aat tta aat atc cta tca tcc att gtc aaa cca gtt gtt gac 396 Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp 100 105 110 tcc ggc ttt gac ggc atc ttc tta gtt gct gct aac cct gtt gac atc 444 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 tta act tac gct act tgg aaa ttc tca ggt ttc cca aag gat cgt gtc 492 Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val 130 135 140 att ggt tca ggg act tcc tta gac tct tca cgt tta cgc gtt gcg tta 540 Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu 145 150 155 160 ggc aaa caa ttc aat gtt gat cct cgt tcc gtt gat gct tac atc atg 588 Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met 165 170 175 ggt gaa cac ggt gat tct gaa ttt gct gct tac tca act gca acc atc 636 Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile 180 185 190 ggg aca cgt cca gtt cgc gat gtc gct aag gaa caa ggc gtt tct gac 684 Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp 195 200 205 gaa gat tta gcc aag tta gaa gat ggt gtt cgt aac aaa gct tac gac 732 Glu Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp 210 215 220 atc atc aac ttg aag ggt gcc acg ttc tac ggt atc ggg act gct tta 780 Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 225 230 235 240 atg cgg att tcc aaa gcc att tta cgt gat gaa aat gcc gtt tta cca 828 Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro 245 250 255 gta ggt gcc tac atg gac ggc caa tac ggc tta aac gac att tat atc 876 Val Gly Ala Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 ggg act ccg gct gtg att ggt gga act ggt ttg aaa caa atc atc gaa 924 Gly Thr Pro Ala Val Ile Gly Gly Thr Gly Leu Lys Gln Ile Ile Glu 275 280 285 tca cca ctt tca gct gac gaa ctc aag aag atg caa gat tcc gcc gca 972 Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Gln Asp Ser Ala Ala 290 295 300 act ttg aaa aaa gtg ctt aac gac ggt tta gct gaa tta gaa aat aaa 1020 Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys 305 310 315 320 taatcatttc atacgatatc tgaattcgtc gacaagcttc tcgagcctag gctagctcta 1080 gaccacacgt gtgggggccc gagctcgcgg ccgctgt 1117 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> lactate dehydrogenase gene of L. Plantarum <400> 4 Met Ser Ser Met Pro Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Asp Arg Thr Lys Gly Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Gln Ala Phe Thr Ala Pro Lys Lys Ile 50 55 60 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Ser Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Ser Ile Val Lys Pro Val Val Asp 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ser Arg Leu Arg Val Ala Leu 145 150 155 160 Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Pro Arg Ser Val Asp Ala Tyr Ile Met 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Thr Ala Thr Ile 180 185 190 Gly Thr Arg Pro Val Arg Asp Val Ala Lys Glu Gln Gly Val Ser Asp 195 200 205 Glu Asp Leu Ala Lys Leu Glu Asp Gly Val Arg Asn Lys Ala Tyr Asp 210 215 220 Ile Ile Asn Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 225 230 235 240 Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro 245 250 255 Val Gly Ala Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Ile Gly Gly Thr Gly Leu Lys Gln Ile Ile Glu 275 280 285 Ser Pro Leu Ser Ala Asp Glu Leu Lys Lys Met Gln Asp Ser Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Lys Lys Val Leu Asn Asp Gly Leu Ala Glu Leu Glu Asn Lys 305 310 315 320

Claims (78)

  1. 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는, 그 야생형 균주가 크랩트리(Crabtree) 양성인, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(C2 carbon source-independent, GCSI) 효모 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 토룰라스포라(Torulaspora), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 및 데케라(Dekkera)로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 속(genus)에 속하는, GCSI 효모 균주.
  3. 제 1항에 있어서, 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 치조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 속에 속하는, GCSI 효모 균주.
  4. 제 1항에 있어서, 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans)인 GCSI 효모 균주.
  5. 제 1항에 있어서, 지고사카로마이세스 바일리(Zygosaccharomyces bailii)인 GCSI 효모 균주.
  6. 제 1항에 있어서, 사카로마이세스(Saccharomyces)속에 속하는 GCSI 효모 균주.
  7. 제 1항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 GCSI 효모 균주.
  8. 제 1항에 있어서, 유전자형 pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52를 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, GCSI 효모 균주.
  9. 제 1항에 있어서, 유전자형 pdc1,5,6△을 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, GCSI 효모 균주.
  10. 제 1항에 있어서, 치조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 GCSI 효모 균주.
  11. 제 1항에 있어서, 토룰라스포라 글로보사(Torulaspora globosa) 및 토룰라스포라 델브룩키(Torulaspora delbruckii)로 구성된 군으로부터 선택된 GCSI 효모 균 주.
  12. 제 1항에 있어서, 데케라 브룩셀렌시스(Dekkera bruxellensis)인 GCSI 효모 균주.
  13. 제 1항에 있어서, 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)인 GCSI 효모 균주.
  14. 제 1항에 있어서, 씨.글라브라타(C.glabrata)가 탄소원으로 사용할 수 있는 당 함유 미네랄 배지 내에서 약 700mM보다 높은 농도로 피루브산 또는 그 염을 생산할 수 있는 씨.글라브라타(C.glabrata)인 GCSI 효모 균주.
  15. 제 1항에 있어서, (A)야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나 이상의 PDC 구조 유전자, (B)야생형 효모 균주에서 발현가능한 적어도 하나 이상의 PDC 조절 유전자, (C)PDC 구조 유전자의 프로모터, 및 (D)PDC 조절 유전자의 프로모터를 포함하는 GCSI 효모 균주로서, 이 때 (A)-(D) 중 적어도 한가지 이상이 (i)돌연변이되거나, (ii)파괴되거나, 또는 (iii)결실된, GCSI 효모 균주.
  16. 제 15항에 있어서, 야생형 효모 균주에서 발현가능한 모든 PDC 구조 유전자가 돌연변이된 GCSI 효모 균주.
  17. 제 1항에 있어서, 완전 동일 배양 조건에서 야생형 및 GCSI 효모 균주를 배양할 때 야생형 효모 균주에 비해 그 활성 수준이 낮은 쓰레오닌 알돌라제을 갖는 GCSI 효모 균주.
  18. 제 1항에 있어서, 호기성 회분 배양에서 증식할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  19. 제 1항에 있어서, 호기성 케모스탯에서 증식할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  20. 제 1항에 있어서, 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 가수분해 전분, 갈락토스, 락토스, 고과당 옥수수 시럽 및 가수분해 리그노셀룰로스로 구성된 군으로부터 선택된 한가지 이상의 탄소원을 함유하는 배양 배지 내에서 증식할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  21. 제 1항에 있어서, 배양 배지 내 증식 개시시 단독 탄소원으로 약 1mM 내지 1M 농도의 포도당을 함유하는 미네랄 배지 내에서 호기성 회분 배양으로 증식할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 회분 배양 배지가 약 100mM 내지 610mM 농도의 포도당을 함유하는 GCSI 효모 균주.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 회분 배양 배지가 약 250mM 내지 610mM 농도의 포도당을 함유하는 GCSI 효모 균주.
  24. 제 1항에 있어서, 단독 탄소원으로 약 1mM 내지 1M 농도의 포도당을 함유하는 미네랄 배지 내에서 호기성 케모스탯으로 증식할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  25. 제 1항에 있어서, 미네랄 배지에서 호기성 회분 배양으로 배양할 때 적어도 약 0.5moles 피루브산/리터 이상의 농도로 피루브산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  26. 제 25항에 있어서, 적어도 약 0.8moles 피루브산/리터 이상의 농도로 피루브산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  27. 제 26항에 있어서, 적어도 약 1.53moles 피루브산/리터 이상의 농도로 피루브산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  28. 제 25항에 있어서, pH 약 4.8 내지 5.2에서 배양되는 GCSI 효모 균주.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 미네랄 배지가 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 GCSI 효모 균주.
  30. 제 1항에 있어서, 균주 내에서 발현가능한 외인성 락테이트 탈수소효소 활성을 포함하는 게놈을 가지며, 그 발현 결과물인 단백질이 락테이트 탈수소효소 활성을 갖는 GCSI 효모 균주.
  31. 제 30항에 있어서, pH 약 5.0에서 락트산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  32. 제 30항에 있어서, 포도당을 단독 탄소원으로 함유하는 미네랄 배지에서 배양할 때 약 70g 락트산/100g 포도당보다 많은 양으로 락트산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  33. 제 30항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 GCSI 효모 균주.
  34. 제 30항에 있어서, 유전자형 pdc1(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52 YEpLpLDH를 갖는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, GCSI 효모 균주.
  35. 제 30항에 있어서, 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 보바인(bovine), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 또는 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophylus) 락테이트 탈수소효소 유전자인 GCSI 효모 균주.
  36. 제 30항에 있어서, 상기 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자가 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 락테이트 탈수소효소 유전자인 GCSI 효모 균주.
  37. 제 30항에 있어서, 약 100g/l 이상의 락트산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  38. 제 30항에 있어서, GCSI 효모 균주의 염색체가 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 함유하는 GCSI 효모 균주.
  39. 제 30항에 있어서, 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 함유하는 하나 이상의 플라스미드가 GCSI 효모 균주 내에 존재하는 GCSI 효모 균주.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 플라스미드가 2 마이크론(micron) 플라스미드인 GCSI 효모 균주.
  41. 제 30항에 있어서, 상기 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자가 기능적으로 프로모터에 연결되어 있는 GCSI 효모 균주.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터가 트리오스 포스페이트 이소머라제(triose phosphate isomerase) 프로모터인 GCSI 효모 균주.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터가 피루베이트 탈탄산효소 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 및 L-쓰레오닌 탈수소효소 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 GCSI 효모 균주.
  44. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터가 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 피루베이트 탈수소효소 프로모터인 GCSI 효모 균주.
  45. 제 30항에 있어서, L-락트산으로 필수 구성된 락트산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  46. 제 30항에 있어서, 호기성 조건 하에 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 미네랄 배지에서 배양할 때 락트산을 생산할 수 있는 GCSI 효모 균주.
  47. (a) 야생형이 크랩트리 양성인 Pdc 음성 효모 균주를 효모 배양균의 증식 개 시 시점에는 단독 탄소원으로 포도당과 C2 탄소원을 그 배양균이 자라기에 충분한 농도로 함유하는 첫번째 미네랄 배지에 접종하는 것으로 시작하여 효모 배양균을 호기성 탄소 제한 케모스탯에서 증식시키고,
    (b) 케모스탯에서 효모 배양균이 증식하는 동안 첫번째 미네랄 배지 내 C2 탄소원의 농도를 낮추어 그 C2 탄소원 농도의 표적 범위가 총 탄소 약 10% 내지 0%에 도달할 때까지 낮추고,
    (c) C2 탄소원 농도가 표적 범위에 도달하면 케모스탯 효모 배양액에서 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 적어도 하나 이상의 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 회수하고,
    (d) 상기 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 전체 일련의 회분 배양 기간 동안 그 농도가 증가하는 포도당을 단독 탄소원으로 함유하는 두번째 미네랄 배지를 이용하여 그 배양 초기에 얻은 회분 배양액에서 자란 효모를 각 연속 회분 배양에 접종(seed)하여 일련의 호기성 회분 배양으로 배양하고,
    (e) 일련의 회분 배양액에서 단독 탄소원으로 C2 탄소원 없이 포도당으로 자랄 수 있으며, 상기 회수된 C2 탄소원-비의존성 효모 균주에 비해 더욱 포도당 내성이며, 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 회수하는 것을 포함하는 선별 과정을 통해 회수된, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주.
  48. (a) 야생형이 크랩트리 양성인 Pdc 음성 효모 균주를 효모 배양균의 증식 개시 시점에는 단독 탄소원으로 포도당과 C2 탄소원을 그 배양균이 자라기에 충분한 농도로 함유하는 첫번째 미네랄 배지에 접종하는 것으로 시작하여 효모 배양균을 호기성 탄소 제한 케모스탯에서 증식시키고,
    (b) 케모스탯에서 효모 배양균이 증식하는 동안 첫번째 미네랄 배지 내 C2 탄소원의 농도를 낮추어 그 C2 탄소원 농도의 표적 범위가 총 탄소 약 10% 내지 0%에 도달할 때까지 낮추고,
    (c) C2 탄소원 농도가 표적 범위에 도달하면 케모스탯 효모 배양액에서 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 적어도 하나 이상의 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 회수하고,
    (d) 상기 C2 탄소원-비의존성 효모 균주를 전체 일련의 회분 배양 기간 동안 그 농도가 증가하는 포도당을 단독 탄소원으로 함유하는 두번째 미네랄 배지를 이용하여 그 배양 초기에 얻은 회분 배양액에서 자란 효모를 각 연속 회분 배양에 접종(seed)하여 일련의 호기성 회분 배양으로 배양하고,
    (e) 일련의 회분 배양액에서 단독 탄소원으로 C2 탄소원 없이 포도당으로 자 랄 수 있으며, 상기 회수된 C2 탄소원-비의존성 효모 균주에 비해 더욱 포도당 내성이며, 검출불가능한 양의 피루베이트 탈탄산효소 활성을 갖는 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 회수하는 것을 포함하는, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주의 선별 방법.
  49. 야생형이 크랩트리 양성인 Pdc 음성 효모 균주를 미네랄 배지에 접종하고,
    효모 배양균의 증식 개시 시점에는 단독 탄소원으로 포도당과 C2 탄소원을 그 배양균이 자라기에 충분한 농도로 함유하는 미네랄 배지에서 Pdc 음성 효모 균주를 호기성 배양하고,
    효모 배양균이 증식함에 따라 C2 탄소원의 농도를 감소시켜 C2 탄소원 없이 배양균이 자랄 수 있을 때까지 그 농도를 감소시키고,
    효모 배양균이 증식함에 따라 포도당 농도를 증가시켜 피루베이트 탈탈산효소 활성이 부족한 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 회수하는 것을 포함하는, 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주의 선별 방법.
  50. 제 49항에 있어서, C2 탄소원의 농도 감소 단계와 포도당의 농도 증가 단계가 호기성 케모스탯에서 동시에 행해지는 것인, 방법.
  51. 제 49항에 있어서, C2 탄소원의 농도 감소 단계 이전에 포도당 농도의 증가 단계가 행해지는 것인, 방법.
  52. 제 49항에 있어서, 포도당의 농도 증가 단계 이전에 C2 탄소원의 농도 감소 단계가 행해지는 것인, 방법.
  53. 야생형이 크랩트리 양성인 Pdc 음성 효모 균주를 미네랄 배지에 접종하고,
    효모 배양균의 증식 개시 시점에는 단독 탄소원으로 포도당과 C2 탄소원을 그 배양균이 자라기에 충분한 농도로 함유하는 미네랄 배지에서 Pdc 음성 효모 균주를 호기성 배양하고,
    효모 배양균이 증식함에 따라 C2 탄소원의 농도를 감소시켜 C2 탄소원 없이 배양균이 자랄 수 있을 때까지 그 농도를 감소시키고,
    효모 배양균이 증식함에 따라 포도당 농도를 증가시켜 피루베이트 탈탈산효소 활성이 부족한 적어도 하나 이상의 GCSI 효모 균주를 회수하는 것을 포함하여, 선별 과정을 통해 수득한 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성 효모 균주.
  54. 첫번째 배양 배지에서 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주를 호기성 배양하는 것을 포함하는, 피루브산 또는 그 염의 생산 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 GCSI 효모 균주가 회분 배양으로 배양되는 방법.
  56. 제 55항에 있어서, 상기 회분 배양의 pH가 제어되는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 배양의 pH가 약 2.5 내지 8 사이에서 제어되는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 배양의 pH가 약 3 내지 6 사이에서 제어되는 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 상기 배양의 pH가 약 4.5 내지 5.5 사이에서 제어되는 방법.
  60. 제 54항에 있어서, 상기 GCSI 효모 균주가 그 pH가 제어되는 케모스탯 내에서 배양되는 방법.
  61. 제 54항에 있어서, 상기 GCSI 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 방법.
  62. 제 54항에 있어서, 상기 GCSI 효모 균주가 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)인 방법.
  63. 제 54항에 있어서, 상기 첫번째 배양 배지가 포도당, 수크로스, 프럭토스, 말토스, 락토스, 갈락토스, 가수분해 전분, 고과당 옥수수 시럽 및 가수분해 리그노셀룰로스로 구성된 군으로부터 선택된 한가지 이상의 탄소원을 포함하는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 상기 첫번째 배양 배지가 수크로스나 포도당 중 적어도 한가지 이상을 포함하는 방법.
  65. 제 54항에 있어서, 적어도 한가지 이상의 당을 함유하는 첫번째 배양 배지에서 GCSI 효모 균주를 배양할 때 적어도 약 0.5moles 피루브산/리터 이상의 농도로 피루브산을 생산하는 것인, 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 적어도 약 0.8moles 피루브산/리터 이상의 피루브산을 생산하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 적어도 약 1.53moles 피루브산/리터 이상의 피루브산을 생산하는 방법.
  68. 제 65항에 있어서, 상기 배양의 pH가 약 4.8 내지 5.2 사이에서 제어되는 방 법.
  69. 제 65항에 있어서, 상기 탄소원이 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 방법.
  70. 제 54항에 있어서, 소듐 피루베이트, 포타슘 피루베이트, 암모늄 피루베이트 및 칼슘 피루베이트로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 염을 생산하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 염이 포타슘 피루베이트인 방법.
  72. 제 54항에 있어서, 피루브산 또는 그 염을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, 상기 정제 단계가 증류, 이온 교환, 나노여과 또는 용매 추출 중 적어도 한가지 방법을 포함하는 방법.
  74. 제 54항에 있어서, 상기 첫번째 배양 배지가 미네랄 배지인 방법.
  75. 재조합 효모 균주에서 발현가능한 외인성 락테이트 탈수소효소 유전자를 포함하며, 그 발현 결과물인 단백질이 락테이트 탈수소효소 활성을 가지는 게놈을 가 지며, 단독 탄소원으로 포도당을 함유하는 미네랄 배지에서 증식시 적어도 약 70g 락트산/100g 포도당 이상으로 락트산을 생산하는 포도당 내성 C2 탄소원-비의존성(GCSI) 효모 균주를 첫번째 배양 배지에서 호기성 배양하는 것을 포함하는, 락트산 또는 그 염의 생산 방법.
  76. NRRL Y-30651로 기탁된 GCSI 효모 균주.
  77. NRRL Y-30742로 기탁된 플라스미드 YEpLpLDH를 갖는 GCSI 효모 균주.
  78. NRRL Y-30650로 기탁된 C2 탄소원-독립성 효모 균주.
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