KR20060035622A - 스클레로스틴에 특이적인 항체 및 골 미네랄화를증가시키기 위한 방법 - Google Patents

스클레로스틴에 특이적인 항체 및 골 미네랄화를증가시키기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

TGF-베타 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 조성물 및 방법이 제공된다. 이러한 방법 및 조성물은 TGF-베타 결합 단백질 스클레로스틴과 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원, 특히 골형성 단백질 간의 상호작용을 방해함으로써 골 미네랄 밀도를 변화시키는 것과 관련된다. 골 미네랄 밀도의 증가는 낮은 골 미네랄 밀도가 특징이 되는 질병 및 증상, 예를 들어 골 감소증, 골다공증 및 뼈 골절에 사용된다.
TGF-베타 결합 단백질, 스클레로스틴, 골형성 단백질, 골 미네랄

Description

스클레로스틴에 특이적인 항체 및 골 미네랄화를 증가시키기 위한 방법{ANTIBODIES SPECIFIC FOR SCLEROSTIN AND METHODS FOR INCREASING BONE MINERALIZATION}
본 발명은 일반적으로 제약학적 제품 및 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 골의 미네랄 함량을 증가시키는데 적합한 스클레로스틴 특이적 항체 및 방법에 관한 것이다. 이같은 조성물 및 방법은 예를 들어, 골감소증, 골다공증, 골절 및 낮은 골 밀도가 질병의 특징인 기타 질병을 비롯한 폭 넓은 다양한 증상을 치료하는데 사용될 수 있다.
각 개인의 일생 동안, 골량 (bone mass)에 있어서 2 단계 또는 3 단계의 상이한 변화가 일어난다 (Riggs, West J. Med. 154:63-77 (1991) 참조). 제1 단계는 남녀 모두에서 일어나고, 최대 골량 달성에 도달하게 된다. 이 제1 단계의 성장은 연골내 성장판의 직선 성장과 골막주위 골부가 성장률에 의한 방사상 성장을 통해 달성된다. 제2 단계는 지주골 (척추골 및 골반과 같은 편평골)에 대해 약 30대에 시작하고, 피질골 (예를 들어, 장골/팔다리에서 발견됨)에 대해 약 40대에 시작해서, 노년까지 계속된다. 이 단계는 느린 골 손실의 특징이 있으며, 남녀 모두에서 일어난다. 여성의 경우, 제3 단계의 손실이 또한 일어나는데, 주로 폐경기 에스트 로겐 결핍에 의한 것이다. 이 단계에서만 여성은 피질골로부터 추가적인 10%의 골량 손실이 일어나고, 지주 구획에서 25%의 골량 손실이 일어난다 (상기, Riggs 참조).
골 미네랄 함량의 손실은 매우 다양한 증상에 의해 일어날 수 있고, 심각한 의학적 문제를 초래할 수 있다. 예를 들어, 골다공성은 인간에서 쇠약성 질병으로, 골격 골량 및 미네랄 밀도의 감소, 골의 구조적 퇴행, 골 미세구성의 붕괴 및 그에 따른 골 약화의 증가 및 병에 걸린 사람들에게서 골절에 대한 감수성 증가라는 특징을 갖는다. 인간은 골다공증 전에 임상적 골감소증 (젊은 성인의 골의 경우, 골 미네랄 밀도가 평균 값 미만에서 1 표준 편차보다 크고, 2.5 표준 편차보다 낮은 값)이 나타나는데, 이 증상은 미국에서 약 2,500만명에서 나타난다. 미국내 다른 7-800만 명의 환자는 임상적 골다공증 (골 미네랄 함량이 성숙한 젊은 성인의 골의 미네랄 함량 미만에서, 2.5 표준 편차보다 크게 낮은 함량)으로 진단되었다. 골다공증은 건강 관리 시스템에서 가장 비용이 많이 드는 질병 중의 하나로, 미국 내에서 일년간 수십억 달러의 비용 지출을 가져온다. 건강 관리 관련 비용 외에도, 장기 요양 보호 및 근로일수의 감소가 이 질병의 경제적 및 사회적 비용 증가를 가져온다. 전세계적으로, 약 7,500만명이 골다공증의 위험이 있다.
인구 내에서 골다공증의 빈도는 나이에 따라 증가한다. 백인에서, 여성에서 주로 나타난다 (미국 내에서, 골다공증 환자 집단의 80%를 차지). 노인에서 골 약화의 증가와 골격뼈의 골절에 대한 감수성은 이 집단에서 추락의 위험이 증가한다는 점에 의해 악화된다. 매년, 미국 내에서 150만 이상의 골다공증 관련된 골 골 절이 보고된다. 골절된 골반, 손목 및 척추골이 골다공증과 관련된 가장 흔한 상해이다. 특히 골반 골절이 매우 불편하고, 환자에게 고비용을 요구하게 되는 것이고, 여성의 경우, 높은 사망률 및 질병률과 관련있다.
골다공증이 감소된 골량으로 인해 골절 위험의 증가를 가져오는 것으로 생각되지만, 현재 골격 질병 치료용으로 사용되고 있는 치료법 중 어느 것도 실질적으로 성인의 골 밀도를 증가시킬 수 없다. 많은 의사들이 확실하게 인식하고 있는 것은 성인에서 골 밀도를 증가시킬 수 있는, 특히, 골감소증 및 골다공증에서 위험에 처해 있는 손목, 척수 및 골반부의 골 밀도를 증가시킬 수 있는 약물이 필요하다는 점이다.
골다공증을 예방하기 위한 현재 사용되고 있는 방법들은 약간의 이점을 줄 수 있지만, 질병의 치료를 보증할 수는 없다. 이들 방법들은 나이가 많아질 때 물리적 활동 (특히, 체중 부하 활동)을 완화시키는 것, 식이 중 적절한 칼슘을 제공하는 것 및 알콜 또는 담배를 함유한 제품의 소비를 피하는 것을 포함한다. 임상적 골결핍증 및 골다공증을 나타내는 환자의 경우, 현재 일반적으로 사용되는 치료 약물 및 방법은 구조적으로 일어나는 골 리모델링 과정의 자연적인 현상인, 골 흡수 과정을 억제하여 추가적인 골량 소실을 감소시키는 것에 관한 것이다.
예를 들어, 현재 에스트로겐이 골 소실을 지연시키기 위해 처방되고 있다. 그러나, 환자들이 어떤 장기적 이점을 얻을 수 있는지 여부 및 에스트로겐이 75세 이상의 환자에서 어떤 영향을 미칠 수 있는지 여부에 대해서 일부 논란이 있다. 또한, 에스트로겐의 사용은 유방암 및 자궁내막암의 위험을 증가시키는 것으로 생 각된다. 또한, 칼시토닌, 오스테오칼신과 비타민 K, 또는 비타민 D와 함께, 또는 비타민 D 없이, 고용량의 식이성 칼슘이 폐경기 여성에게 제안되었다. 그러나, 고용량의 칼슘은 흔히 불쾌한 위장관 부작용을 나타내고, 혈청 및 소변 중의 칼슘 수준이 계속해서 모니터링되어야 한다 (예를 들어, Khosla and Rigss, Mayo Clin. Proc. 70:978-982, 1995 참조).
골다공증에 대한 다른 치료적 방법은 비스포스포네이트 (예를 들어, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, 올파드로네이트, 네리드로네이트, 스켈리드, 보네포스), 부갑상성 호르몬, 칼실리틱스, 칼시미메틱 (예를 들어, 시나칼세트), 스타틴, 아나볼릭 스테로이드, 란탄넘 및 스트로니움염 및 불화나트륨을 포함한다. 그러나, 이같은 치료제들은 흔히 그 효과적인 사용을 불가능하게 하는, 바람직하지 않은 부작용과 관련이 있다 (골 밀도는 적당히 증가하지만, 예를 들어, 칼시토닌 및 스테로이드는 메스꺼움을 일으키고, 면역 반응을 불러 일으킬 수 있고, 비스포스포네이트 및 불화나트륨은 골절의 회복을 저해할 수 있다) (상기 Khosla and Riggs 참조).
과도한 또는 불충분한 골 미네랄화와 관련된 증상, 예를 들어, 골다공증 또는 골 미네랄화의 소실에 특징이 있는 기타 질환을 치료하기 위해 현재 실시되고 있는 치료법은 골량을 변경 (즉, 통계적으로 유의한 방식으로, 증가 또는 감소)시키는 약물의 사용을 수반한다. 특히, 현재 사용되고 있는 어떤 방법도 새로운 골량의 성장을 치료적으로 촉진시키거나 또는 향상시키지 않는다. 본 발명은 골 미네랄화를 증가시키고, 따라서, 골량의 증가가 바람직한 매우 다양한 증상들을 치료 하는데 사용될 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 기타 관련된 장점들을 제공한다.
발명의 요약
간단히 말해, 본 발명은 TGF-베타 결합 단백질, 스클레로스틴 (SOST)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 골 형성 단백질과 같은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원과 상호작용하는 SOST의 영역으로부터 유래된 SOST 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68의 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편을 제공한다. 여기서, 항체들은 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하고, 여기서, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 또는 AAB33865 (서열 79)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 또는 NM_001204 (서열 82)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이다. 한 특정 실시태양에서, 항체 또는 그 항원 결합 단편은 서열 2-6, 12-15, 21, 22, 25, 26, 47, 48, 49, 또는 50에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하거나, 다른 특정 실시태양에서는, 항체가 서열 5, 6 또는 14에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 서열 2-19, 21-28 또는 47-50의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 사용하여 비인간 동물을 면역화시켜 생성되는 단리된 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공하는데, 항체는 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 항체는 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하고, 여기서, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드 (본원에 제시된 진뱅크 서열 중 어느 하나)에 결합할 수 있다. 특정 바람직한 실시태양에서, 항체는 서열 5, 6, 10, 11, 14 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 사용하여 비인간 동물을 면역화시켜서 생산된다.
또한, 본 발명은 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공한다. 여기서, SOST 폴리펩티드는 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하고, 항체는 서열 29-31, 33-36, 41-43 또는 51-54의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 29-46, 51, 52, 53 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 사용하여 비인간 동물을 면역화시켜 생성되는 단리된 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공하는데, 여기서, 항체 또는 그 항원 결합 단편은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 항체는 SOST 동종이량체의 형성을 억제한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 다른 실시태양에서, 항체는 모노클로날 항체로, 마우스, 인간, 래트 또는 햄스터 모노클로날 항체이다. 또한, 본 발명은 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포 또는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 항체는 인간화된 항체 또는 키메라 항체이다. 또한, 본 발명은 인간화된 또는 키메라 항체를 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 특정 실시태양에서, 항체의 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fd 또는 Fv 단편이다. 또한, 본 발명은 단일쇄 항체인 항체를 제공하고, 단일쇄 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 이같은 항체 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 여기서 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있는 것이다. 여기서, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 또는 AAB33865 (서열 79)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 또는 NM_001204 (서열 82)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이다.
다른 실시태양에서, 면역원은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상, 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함한다. 여기서, 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있는 것이다. 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드 (본원에 제시된 진뱅크 서열 중 하나)에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드 (본원에 제시된 진뱅크 서열 중 하나)에 결합할 수 있는 것이다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 2-19, 21-28, 47, 48, 49 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 여기서 펩티드는 비인간 동물에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있는 것이고, 항체는 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것이다. 여기서, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 또는 AAB33865 (서열 79)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 또는 NM_001204 (서열 82)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 5, 6, 10, 11, 14 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 29-46, 51, 52, 53 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 여기서, 펩티드는 비인간 동물에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있는 것이고, 항체는 SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 것이다. 다른 실시태양에서, 면역원은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68의 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 항체를 유발할 수 있는 것이다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상, 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 면역원을 제공한다. 여기서, 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 항체를 유발할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 면역원은 담체 분자와 결합되어 있다. 특정 실시태양에서, 담체 분자는 담체 폴리펩티드이고, 특정 실시태양에서, 담체 폴리펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin)이다.
또한, 본 발명은 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 서열을 갖는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상, 50개 이하의 연속적인 아미노산, 또는 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 사용하여 비인간 동물을 면역화시키는 것을 포함하는, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있다. 여기서, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 또는 AAB33865 (서열 79)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 또는 NM_001204 (서열 82)에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 서열 2-19, 21-28, 47, 48, 49 또는 50의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 사용하여 비인간 동물을 면역화시키는 것을 포함하는, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 여기서, 펩티드는 비인간 동물에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있는 것이고, 항체는 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것이고, BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드로 결합할 수 있는 것이다. 특정 실시태양에서, 면역원은 서열 5, 6, 10, 11, 14 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 펩티드를 포함한다.
다른 특정 실시태양에서, 본 발명은 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 억제할 수 있는 항체를 유발할 수 있는, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 서열을 갖는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상, 50개 이하의 연속적인 아미노산, 또는 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 사용하여 비인간 동물을 면역화시키는 것을 포함하는, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 항체를 유발할 수 있는 펩티드로, 서열 29-46, 51, 52, 53 또는 54의 아미노산 서열을 포함하는, 20개 이상, 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원을 사용하여 비인간 동물을 면역화시키는 것을 포함하는, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항체/SOST 펩티드 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, 서열 2-19, 또는 21-54의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하여, TGF-베타 시그날 경로를 조절하는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, TFG-베타 시그날 경로를 조절하는 항체를 동정하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 항체/SOST 펩티드 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서, (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 (ii) 서열 2-19, 21-28, 또는 47-50의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키는 단계; 및 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하여, BMP의 SOST 폴리펩티드로의 결합을 억제하는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, BMP의 SOST 폴리펩티드로의 결합을 억제하는 항체를 동정하는 방법을 제공한다. TGF-베타 시그날 경로를 조절하는 항체를 동정하는 방법 및 BMP의 SOST 폴리펩티드로의 결합을 억제하는 항체를 동정하는 방법의 특정 실시태양에서, SOST 펩티드는 서열 5, 6, 10, 11, 14 또는 18의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항체/SOST 펩티드 복합체 형성을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서, (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68 중 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, (ii) 서열 29-46 또는 51-54의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키는 단계; 및 항체/SOST 펩티드 복합체 수준을 검출하여, SOST 동종이량체의 형성을 억제하는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, SOST 동종이량체 형성을 억제하는 항체를 동정하는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 항체/SOST 펩티드 복합체 형성을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 하에서, (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68 중 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, (ii) 서열 2-19 또는 21-54의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키는 단계; 및 항체/SOST 펩티드 복합체 수준을 검출하여, 골 미네랄 함량을 증가시키는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 골 미네랄 함량을 증가시키는 항체를 동정하는 방법을 제공한다.
TGF-베타 시그날 경로를 조절하는 항체를 동정하는 방법, SOST 폴리펩티드로의 BMP의 결합을 억제하는 항체를 동정하는 방법, SOST 동종이량체 형성을 억제하는 항체를 동정하는 방법, 또는, 골 미네랄 함량을 증가시키는 항체를 동정하는 방법에 대한 특정 실시태양에서, 항체는 생물학적 샘플에 존재하거나, 또는 정제된 항체일 수 있다. 특정 실시태양에서, 정제된 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는, 이들 임의의 항체의 항원 결합 단편이다.
본 발명의 이들 및 기타 실시태양은 하기 구체적인 기술 및 첨부된 도면을 참조할 때, 명백할 것이다. 본원에 개시된 모든 참조문헌은 그 각각이 개별적으로 삽입된 것 같이, 그 전체 내용이 본원에 참조문헌으로 삽입되었다.
도면의 간단한 설명
도 1은 SOST 폴리펩티드 및 가장 가까운 동족체들의 특징적 시스틴 매듭을 함유한 영역의 배열을 나타낸다. 시스틴 매듭을 형성하는 세개의 디설파이드 결합을 실선으로 예시하였다. 점선으로 나타낸, 추가적인 디설파이드 결합이 이 패밀리에서 독특한 것인데, 이는 3D 구조에서 두개의 β-헤파린 팁을 연결한다. 묘사된 폴리펩티드는 SOST: 스클레로스틴 (서열 95); CGHB: 인간 융모성 고나도트로핀 β (서열 96); FSHB: 여포자극호르몬 베타 서브유닛 (서열 97); TSHB: 갑상샘자극호르몬 베타 사슬 전구체 (서열 98); VWF: 폰빌레브란트인자 (서열 99); MUC2: 인간 뮤신 2 전구체 (서열 100); CER1: 세르베루스 1 (제노푸스 레비스 (Xenopus laevis) 동족체) (서열 101); DRM: 그레밀린 (서열 102); DAN: (서열 103); CTGF: 결합조직 성장 인자 전구체 (서열 104); NOV: NovH (콩팥모세포종 과발현된 유전자 단백질 동족체) (서열 105); CYR6 (서열 106)이다.
도 2는 SOST의 코어 영역 (SOST_Core)의 3D 모델을 예시하고 있다.
도 3은 SOST 동종이량체의 3D 모델을 나타낸다.
도 4A 및 B는 5종의 상이한 동물로부터의 Noggin 아미노산 서열 배열을 나타낸다: 인간 (NOGG_인간 (서열 107); 닭 (NOGG_CHICK, 서열 108); 아프리카발톱개구리 (NOGG_XENLA, 서열 109); NOGG_FUGRU, 서열 110); 및 제브라피쉬 (NOGG_ZEBRA, 서열 111); 및 인간 유래 SOST (SOST_인간, 서열 1), 래트 (SOST_래트, 서열 20), 및 마우스 20 (SOST_마우스, 서열 112).
도 5는 Noggin/BMP-7 복합체 구조를 나타낸다. 도면의 바닥에 나타낸 BMP 동종이량체는 표면 모드이다. BMP 이량체의 상부에 나타낸 Noggin 동종이량체는 카툰 모드이다. 원은 N-말단 결합 영역, 코어 영역 및 N-말단과 코어 영역 사이의 링커의 윤곽을 나타낸다.
도 6은 SOST N-말단 영역에 위치한 잠재적 BMP-결합 단편의 3D 모델을 나타낸다. BMP 이량체는 표면 포드에서 나타냈고, 잠재적 BMP-결합 단편은 스틱 모드로 나타냈다. BMP 표면 상의 소수성 포켓에 들어맞는 페닐알리닌 잔기를 표시하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 이같은 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 이들 항체의 생성 및 분석에 사용될 수 있는 SOST 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 항체는 TGF-베타 결합 단백질인 SOST 폴리펩티드가 리간드, 특히, 골 형성 단백질로 결합하는 것을 차단하거나 또는 억제하는데 유용할 수 있고, 또한, SOST 폴리펩티드가 하나 이상의 기타 리간드로 결합하는 것을 차단하거나 또는 억제할 수 있다.
본 발명의 얼마간 놀라운 발견은, 스클레로스틴 폴리펩티드 서열 내에, 스클레로스틴 폴리펩티드의 BMP로의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있는 항-스클레로스틴 항체에 의해 특이적으로 인식되는 특이적인 짧은 펩티드 서열을 발견한 것으로, 이같은 스클레로스틴-BMP 결합이 억제되지 않는 경우에는, BMP 타입 I 수용체 결합 부위 및/또는 BMP 타입 II 수용체 결합 부위를 통해 일어난다. 하나 이상의 골 형성 단백질 (BMPs)를 비롯하여, TGF-베타 패밀리의 단백질의 하나 이상의 구성원으로의 TGF-베타 결합 단백질의 결합을 억제하는 항체와 같은 분자는, 예를 들어, TGF-베타 패밀리 구성원 또는 BMP의 활성화를 허용하거나, 또는, TGF-베타 구성원이 TGF-결합 단백질로 결합하는 것을 제거하거나, 또는 억제하여, 하나 이상의 BMPs를 비롯한 TGF-베타 패밀리 구성원의 이들 각각의 수용체로의 결합하는 것을 허용하는 분자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명은 예상치 않게, TGF-베타 결합 단백질 SOST가 하나 이상의 BMPs로 결합하는 것을 억제, 예방 또는 억제할 수 있는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 감소시킴) 항체 또는 이들의 단편을 생성 및/또는 동정하는데 사용될 수 있는 펩티드 및 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 예시적인 펩티드 면역원은 본원에서 제공된 것과 같은 스클레로스틴 폴리펩티드 (또는 그 변이체)의 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20-25, 21-50, 26-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 또는 71-75개의 연속적인 아미노산을 포함하고, 이같은 펩티드는 예를 들어, 서열 2-19, 21-53 및 54에 제시된 것과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 SOST 동종이량체의 형성을 억제, 예방 또는 억제시킬 수 있는 항체 또는 그 단편을 생성 및/또는 동정하는데 사용될 수 있는 펩티드 및 폴리펩티드 면역원을 제공한다. 본 발명의 항체는 골의 미네랄 함량 및 미네랄 밀도를 증가시켜서, 골 미네랄 함량의 손상을 초래하는 다수의 증상, 예를 들어, 골 사용의 소실을 가져오는 질환, 유전적 소인, 사고 (예를 들어, 골절에 의한), 골 재흡수에 영향을 주거나, 또는 골 형성 세포를 사멸시키는 약물 및 정상적인 노화를 개선시키는데 유용하다.
경화협착증 (Sclerosteosis)
경화협착증은 인간에서 비정상적인 골 미네랄 밀도와 관련된 질환이다. 경화협착증은 반 부켐 (van Buchem) 전신성 피질성 과골증과 유사하지만, 골 변화의 방사성 양상 및 많은 경우 검지 및 중지의 비대칭적 피부 합지증이 나타난다는 점에서, 다른 것으로 보이는 질환에 대해서 한센 (Hansen)에 의해 사용된 용어이다 (Hansen, H. G., Sklerosteose in: Opitz et al., eds. Handbuch der Kinderheilkunde, (Berlin: Springer 1967) 351-355). 오늘날 경화협착증은 성인의 뼈에 넓게 퍼진 경화상 병변의 특징을 갖는, 상염색체성 반우성 질환으로 이해되고 있다. 증상은 진행성이다. 또한, 경화협착증은 합지증 (두 개 이상의 손가락이 합쳐짐)과 관련된 발생상의 양상을 갖는다. 경화협착증 증상은 큰 신장과 관련되어 있고, 질환에 걸린 많은 수의 사람들이 6 피트 이상의 신장을 갖는다. 아울러, 이 증상을 가진 사람의 턱은 비정상적인 네모난 모양을 갖는다. 동형접합체의 골 미네랄 함량은 정상적인 개체의 1 내지 6배를 초과할 수 있고, 골 미네랄 밀도는 정상 수치의 1 내지 4 배를 초과할 수 있다 (예를 들어, 질환에 걸리지 않은 형제와 비교하여).
경화협착증 증후군은 남아프리카의 네덜란드계 백인에서 주로 발생한다. 네덜란드계 백인 주민 140명 당 약 1명이 돌연변이된 유전자의 캐리어이다 (이형접찹체). 돌연변이는 100%의 침투도를 나타낸다. 일화성 보고는 이형접합체에서 증가된 골 미네랄 밀도가 관착되었지만, 관련된 이상 증상 (예를 들어, 합지증 또는 두개골 과성장)은 없다고, 나타내고 있다.
경화협착증 환자에서 뇌하수체 시상하부 축의 이상은 관찰되지 않았다. 특히, 성장 호르몬 및 코르티손의 과생산은 일어나지 않고, 병에 걸린 개체에서 성 호르몬 수준은 정상이다. 골 대사회전 마커 (예를 들어, 골모세포 특이적 알칼라인 포스파타제, 오스테오칼신, 타입 1 프로콜라겐 C' 프로펩티드 (PICP) 및 총 알칼리성 포스파타제 (Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1995) 참조)는 과골형성 활성이 질병과 관련이 있지만, 골 재흡수의 마커 (피리디놀린, 디옥시피리디놀린, N-텔로펩티드, 뇨중 히드록시프롤린, 혈장 주석산염 내성 산 포스파타제 및 갈락토실 히드록시리신 (상기 Comier 참조))로 측정된 바에 따르면, 정상 내지 약간 감소된 파골세포 활성이 관찰됨을 나타낸다.
경화협착증은 병에 걸린 개체에서 평생 동안 골격 전반에 걸쳐 계속적인 골 퇴적이 일어난다는 특징이 있다. 동형접합체에서, 골 미네랄의 계속적인 퇴적은 피부감각수용기가 없는 골격 영역 (예를 들어, 두개골, 턱, 머리뼈)에서 골의 과성장을 초래한다. 경화협착증이 있는 동형접합체에서, 두개골 뼈의 과성장은 두개골의 압착증을 일으키고, 최종적으로 뇌줄기 상의 과도한 정수압으로 인해 사망에 이른다. 전신성 및 범발성 경화증은 골격의 다른 부분 전부에서 관찰된다. 장골의 피층은 매우 두껍게 되어서, 골 강도의 상당한 증가를 가져온다. 두꺼운 부분에서 지주 연결이 증가하고, 이는 이어서 지주골의 강도를 증가시킨다. 경화성 골이 x-선에서 현저하게 불투명하게 보인다.
경화협착증 증상을 일으키는 희귀한 유전적 돌연변이는 인간 염색체 17번의 영역에 집중되어 있다. 이 영역 내의 유전자는 신규한 TGF-베타 결합 단백질 패밀리의 구성원을 코딩한다 (미국 특허 제6,395,511호; 제6,489,445호; 및 제6,495,736호; Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet. 68:577-89(2001) 참조). 따라서, 스클레로스틴의 수준을 변경하거나 또는 조절하는데 관여하는 치료제가 비정상적 골 발육 또는 퇴행과 관련된 증상 및 질병을 치료하는데 유용할 것이다. 하기에서 보다 자세히 기술되듯이, TGF-베타 결합 단백질, 스클레로스틴 (Beer 또는 SOST로도 지칭됨)에 특이적으로 결합하는 항체는 골 미네랄 함량을 증가시키는데 사용될 수 있고, 따라서, 다수의 질환의 증상을 치료, 예방, 진행 지연 또는 개선시키는데 사용될 수 있다.
TGF-베타 슈퍼패밀리
본원에서 언급되는 중요한 분자들은 골 형성 단백질 (BMPs)을 비롯한, 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리의 임의의 공지의 또는 신규 구성원을 포함한다. 또한, TGF-베타 슈퍼패밀리에는 TGF-베타 수용체 (이는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 특정한 구성원 (BMPs를 포함)에 대해 특이적인 하나 이상의 수용체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다) 및 TGF-베타 결합 단백질 (이는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원 (BMPs를 포함)의 특정 구성원 또는 부분집합에 대해 특이적인 결합 친화도를 갖는, 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다)이 포함된다. TGF-베타 결합 단백질의 구체적인 예는 스클레로스틴 또는 SOST를 포함한다. 인간을 비롯한 다양한 동물에서 SOST 및 SOST 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열 55, 56, 57, 59, 61, 63, 65, 67 및 69로 제공된다 (코딩된 폴리펩티드 서열은 각각 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70으로 제공됨) (미국 특허 제6,395,511호; 제6,489,445호; 및 제6,495,736호 참조; 또한, Balemans et al., 2000 Dev. Biol. 250:231; Schmitt et al., 1999 J. Orthopaed. Res. 17:269; Khalil, 1999 Microbes Infect. 1:1255; Miyazono et al., 1993 Growth Factors 8:11; von Bubnoff et al., 2001 Dev. Biol. 239:1; Koli et al., 2001 Micros. Res. Tech. 52:354; Ebara et al., 2002 Spine 27(16 Suppl. 1):S10; Bondestam, 2002, Ligands & Signaling Components of the Transforming Growth Factor β Family, Helsinki University Biomedical Dissertations No.17).
TGF-베타 슈퍼패밀리는 2차원 및 3차원 수준에서 공통적인 서열 인자 및 구조적 모티브를 공유하는 다양한 성장 인자를 함유한다. 이 단백질 패밀리는 매우 다양한 세포 유형에 영향을 미치는 광범위한 스펙트럼의 생물학적 반응을 일으킨다. TGF-베타 패밀리의 다수의 구성원은 배아 발생 단계에서 패턴 형성 및 조직 특정화에서 중요한 역할을 한다. 성인에서, TGF-베타 패밀리 구성원은 예를 들어, 상처 치료, 골 회복 및 골 리모델링 및 면역계의 조절에 관여한다. TGF-베타 폴리펩티드 외에도, 이 슈퍼패밀리는 BMPs, 액티빈, 인히빈, 성장 및 분화 인자 (GDFs), 및 아교세포 유래 신경영양 인자 (GDNFs)를 포함한다. 일차적인 분류는 특정 단백질을 일반적인 슈퍼패밀리에 넣도록 하는 일반적인 서열 특징을 통해 확립된다. 서브패밀리 내에서 추가적인 계급화는 소그룹의 구성원들 간의 보다 엄격한 서열 보전에 의해 가능하다. BMP-5, BMP-6 및 BMP-7과 같은 일정한 경우, 아미노산 % 동일성은 소그룹의 구성원 사이에 75% 정도로 높을 수 있다. 이 동일성 수준은 하나의 대표적인 서열이, 서브그룹을 큰 패밀리의 다른 구성원들로부터 분리시키는, 핵심이 되는 생화학적 요소를 예시할 수 있도록 한다.
TGF-베타2의 결정 구조가 결정되었다. TGF-베타2 단량체의 전체적인 폴드 (fold)는 3개의 디설파이드 브릿지로 형성된 안정한, 콤팩트한 시스테인 매듭형 구조를 갖는다. 1개의 디설파이드 브릿지에 의해 안정화되는 이량체는 서로 반대 방향으로 평행하다.
TGF-베타 패밀리 구성원은 헤테로-올리고머 수용체 복합체 형성을 유도하여 시그날을 준다. TGF-베타 시그날의 신호 전달에는 막횡단 세린/트레오닌 키나제 수용체의 두개의 상이한 서브패밀리, 타입 I 및 타입 II가 관여한다. 최소한 7 종류의 타입 I 수용체와 5 종류의 타입 II 수용체가 동정되었다 (Kawabata et al., Cytokine Growth Factor Rev. 9:49-61 (1998); Miyazono et al., Adv. Immunol. 75:115-57 (2000) 참조). TGF-베타 패밀리의 각각의 구성원은 이 둘 모두가 시그날 전달에 필요한 타입 I 및 타입 II 수용체의 독특한 조합에 결합한다. TGF-베타 수용체 활성화에 대한 현재의 모델에서, TGF-베타 리간드는 먼저 타입 II 수용체 (TbR-II)에 결합하고, 이는 이어서, 타입 I 수용체 (TbR-I)을 모집하여 리간드/타입 II/타입 I 3개로 이루어진 복합체를 형성한다. 타입 I 수용체는 TbR-II가 없는 경우, 리간드에 결합할 수 없다. 이어서, TbR-II는 막 근처 영역에서, 글리신 및 세린 잔기가 풍부한 도메인 (GS 도메인)에서 주로 TbR-I을 인산화시키고, 이에 의해 TbR-I을 활성화시킨다. 활성화된 타입 I 수용체 키나제는 이어서 핵으로 이동하여, 특정 유전자의 전사를 조절하는, Smad 패밀리의 단백질의 특정한 구성원을 인산화시킨다.
골 형성 단백질 (BMPs): 골 미네랄 밀도의 핵심 조절 단백질
골 형성 이해의 주요한 전진은 생체 내에서 연골 및 골 분화를 조절하는 골형성 단백질 (OPs), BMPs의 동정이었다. BMPs/OPs는 간엽줄기세포가 골 조직에 의해 재흡수되고, 재배치되는 연골 구조를 만드는 연골세포로 분화되어 가는 일련의 이벤트를 통해 연골내 골분화를 유도한다 (Balemans et al., Dev. Biol. 250:231-50 (2002) 참조). 따라서, 이 과정은 연골의 형성, 연골의 비대화 및 석회화, 혈관 침습, 골모세포의 분화 및 골의 형성을 수반한다. 상기에서 기술된 바와 같이, BMPs/OPs (BMP 2-14, 및 골형성 단백질 1 및 -2, OP-1 및 OP-2) (예를 들어, 진뱅크 P12643 (BMP-2); 진뱅크 P12645 (BMP3); 진뱅크 P55107 (BMP-3b, 성장/분화 인자 10) (GDF-10); 진뱅크 P12644 (BMP4); 진뱅크 P22003 (BMP5); 진뱅크 P22004 (BMP6); 진뱅크 P18075 (BMP7); 진뱅크 P34820 (BMP8); 진뱅크 Q9UK05 (BMP9); 진뱅크 O95393 (BMP10); 진뱅크 O95390 (BMP11, 성장/분화 인자 11 전구체 (GDF-11)); 진뱅크 O95972 (BMP15)는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원이다. BMP/OP 서브패밀리의 구성원들간의 현저한 진화적 보전은 이들이 동물의 정상적인 발달 및 기능에 중요하다는 것을 제시한다. 태아 단계 이후의 연골세포의 분화 및 골형성에 더해, BMPs/OPs는 악안면 및 치아 조직의 발달을 비롯하여 골격 형성 과정에서 여러가지 역할을 한다. 또한, 상이한 BMP 패밀리 구성원들이 단핵구, 상피 세포, 중간엽 세포 및 신경 세포를 비롯한 다양한 기타 세포 조직에서 생물학적 활성을 가진다. BMPS는 세포 증식 및 분화, 화학주성 및 세포자멸사를 조절하고, 기본적인 역할, 예를 들어, 좌우 비대칭성, 신경발생, 중배엽 패턴 형성 및 신장, 소화관, 폐, 치아, 팔다리, 양막 및 고환을 비롯한 다수의 기관의 배아 발생 및 기관형성을 조절한다 (상기 Balemans 참조).
BMPs는 거대한 전구체 단백질로 합성된다. 이량체화 후, BMPs는 세포 내에서 단백질 분해되어, 카르복시 말단 성숙 단백질을 생성하고, 이는 이어서 세포로부터 방출된다. BMPs는 다른 TGF-베타 패밀리 구성원과 마찬가지로, 타입 I 및 타입 II 세린/트레오닌 키나제 수용체 모두에 협력적으로 결합한다. BMPs가 리간드로 작용할 수 있는 타입 I 수용체는 BMPR-IA (ALK-3로도 알려져 있음), BMPR-IB (ALK-6로도 알려져 있음), ALK-1 및 ALK-2 (ActR-I으로도 알려져 있음)을 포함한다. 타입 II 수용체로 BMPs가 BMP 타입 II 수용체 (BMPR-II)에 결합할 수 있는 것은, 액티빈 타입 II (ActR-II) 및 액티빈 타입 IIB (ActR-IIB)을 포함한다 (상기 Balemans et al., 및 이 문헌에 인용된 참조문헌들 참조). BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열이 진뱅크 데이터베이스에서 제공되는데, 예를 들어, NM_004329 (서열 85에 의해 코딩되는 서열 71); D89675 (서열 86에 의해 코딩되는 서열 72); NM_001203 (서열 87에 의해 코딩되는 서열 73); S75359 (서열 88에 의해 코딩되는 서열 74); NM_030849 (서열 89에 의해 코딩되는 서열 75); 및 D38082 (서열 90에 의해 코딩되는 서열 76)이다. 타입 I 수용체의 다른 폴리펩티드 서열이 진뱅크 데이터베이스에서 제공되는데, 예를 들어, NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)이다. BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열이 진뱅크 데이터베이스에서 제공되는데, 예를 들어, U25110 (서열 91에 의해 코딩되는 서열 80); NM_033346 (서열 92에 의해 코딩되는 서열 81); NM_001204 (서열 93에 의해 코딩되는 서열 82), 및 Z48923 (서열 94에 의해 코딩되는 서열 83)이다. 또한, 타입 II 수용체의 폴리펩티드 서열이 진뱅크 데이터베이스에서 제공되는데, 예를 들어, CAA88759 (서열 84)이다.
BMPs는 다른 시스틴-매듭 단백질과 유사하게, 동종이량체 구조를 형성한다 (Scheufler et al., J.Mol.Biol. 287:103-15 (1999)). BMP/TGF-β 패밀리에 대해 수행된 진화 흔적 분석에 따르면, BMP 타입 I 수용체 결합 부위 및 타입 II 수용체 결합 부위는 BMP 구조의 표면 상에 맵핑되었다 (Innis et al., Protein Eng. 13:839-47 (2000)). BMP 상의 타입 I 수용체 결합 부위의 위치는 후에 BMP-2/BMP 수용체 IA 복합체의 x-선 구조에 의해 확인되었다 (Nickel et al., J. Joint Surg. Am. 83A(Suppl 1(Pt 1):S7-S14 (2001)). 예측된 타입 II 수용체 결합 부위는 BMP/BMP 수용체 II 시스템과 매우 유사한, TGF-β3/TGF-β 타입 II 수용체 복합체의 x-선 구조와 잘 일치하였다 (Hart et al., Nat. Struct. Biol. 9:203-208 (2002)).
BMP 및 액티빈 서브-패밀리는 TGF-베타 결합 단백질에 의해 상당한 번역후 조절을 받는다. 복잡한 세포외 조절 시스템이 존재하고, 이에 의해 높은 친화도의 길항제가 합성되고, 방출되고, BMPs 또는 액티빈과 선택적으로 복합체를 형성하여, 이들의 생물학적 활성을 붕괴시킨다 (Smith, Trends Genet. 15:3-6(1999)). 다수의 이같은 TGF-베타 결합 단백질들이 동정되었으며, 서열 발산성 기준으로, 길항제가 독립적으로 발달되어 왔는데, 이는 일차 서열 보전이 결여되어 있기 때문이다. 척추동물에서, 길항제는 노긴 (Noggin), 코르딘, 코르딘 유사체, 폴리스타틴, FSRP, DAN/세르베루스 (Cerberus) 단백질 패밀리 및 스클레로스틴 (SOST)을 포함한다 (상기 Balemans et al. 및 이 문헌에 인용된 참조문헌들 참조). 길항제의 기작은 상이한 길항제마다 다른 것으로 보인다 (Iemura et al.(1998) Proc. Natal. Acad. Sci. USA 95:9337-9342).
또한, BMP 길항제 노긴 상의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위가 맵핑되었다. 노긴은 BMPs에 높은 친화도로 결합한다 (Zimmerman et al., 1996). 노긴/BMP-7 복합체 구조의 연구는 두개의 단백질 사이의 결합 상호작용을 밝혀냈다 (Groppe et al., Nature 420:636-42 (2002)). 노긴-BMP-7 구조를 BMP 시그날 전달 복합체 모델 상에 중첩한 것은 노긴 결합이 BMP-7 상의 두 쌍의 결합 에피토프 (즉, BMP 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위)를 효과적으로 감춘다는 것을 보여주었다. 노긴의 시스테인 농후 골격 서열은 "클립 (clip)"으로 지칭되는 약 20개의 아미노산 잔기 (잔기 28-48)의 N-말단 세그먼트 뒤에 나타난다. 타입 I 수용체 결합 부위는 노긴의 클립 도메인의 N-말단 부분에 의해 차단되고, 타입 II 수용체 결합 부위는 클립 도메인의 카르복시 말단 부분에 의해 차단된다. 또한, 노긴의 C-말단 근처의 코어 영역 중의 두개의 β-사슬은 타입 II 수용체 결합 영역에서 BMP-7과 접촉한다. 이 결합 모드는 노긴 이량체가 BMP 이량체 상의 모든 수용체 결합 부위 (두개의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위)를 효과적으로 차단하도록 만든다.
스클레로스틴 폴리펩티드 및 코딩 폴리뉴클레오티드
BMP 길항제 스클레로스틴 (미국 특허 제67,395,511호, 제6,489,445호 및 제6,495,736호; 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68 및 70 참조)은 인간 DAN, 인간 그레믈린 (Gremlin) 및 인간 세르베루스 및 SCGF (미국 특허 제5,780,263호)와 비교했을 때, 거의 동일한 시스테인 (디설파이드) 골격을 갖지만, 뉴클레오티드 수준에서는 상동성이 거의 없다 (기본 정보로는 일반적으로 Hsu et al., Mol. Cell 1:673-683 (1998) 참조). 또한, 스클레로스틴은 TGF-베타 결합 단백질의 변이체 (예를 들어, 서열 60 및 62)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 것과 같이, TGF-베타 결합-단백질 변이체 폴리뉴클레오티드는 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 또는 69의 변형 (하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환)인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 이같은 변이체는 TGF-베타 결합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드의 천연형 다형체 또는 대립유전자 변이체와 아울러, 이들 아미노산 서열의 보존적 아미노산 치환을 코딩하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업자들에게 공지된 다양한 기준이 펩티드 또는 폴리펩티드 중의 특정 위치에서의 아미노산이 유사한지를 나타낸다. 예를 들어, 유사한 아미노산 또는 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘); 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파르긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘); 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라민, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판); 베타-분지쇄 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판)을 포함하는, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 분류하기 보다 어려운 것으로 생각되는 프롤린은 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, Leu, Val, Ile 및 Ala)과 성질을 공유한다. 특정 환경 하에서, 글루탐산의 글루타민으로의 치환, 또는 아스파르트산의 아스파르긴으로의 치환은 글라타민 및 아스파르긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산의 아미드 유도체이기 때문에 유사한 치환으로 생각될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 코딩하는 TGF-베타 결합 단백질의 추가적인 변이체 형태는 본원에서 기술된 뉴클레오티드 서열 내에서 발견되는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실을 함유하는 핵산 분자이다. TGF-베타 결합 단백질의 변이체 또는 돌연변이체는 TGF-베타 결합 단백질의 변형된 버전이 야생형 TGF-베타 결합 단백질과 경쟁하도록 제조되거나 또는 동정될 수 있다. 이같은 경쟁은 바람직하게는 야생형 TGF-베타 결합 단백질의 활성을 차단하고, 따라서, 증가된 골 밀도에 이른다.
단리된 폴리뉴클레오티드는 유기체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드)이다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 천연 환경의 일부이지 않은 벡터로 클로닝된다면 단리되는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 진핵 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 TGF-결합 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 단리된 DNA 분자이다. 단리된 핵산 분자의 다른 예는 유기체의 게놈으로 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 DNA, cDNA, RNA일 수 있거나, 적어도 핵산 유사체의 일부를 포함할 수 있다.
TGF-베타 결합-단백질 변이체 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 엄격 조건하에서 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 또는 69의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 혼성화되는지를 측정하는 것에 의해 확인될 수 있다. 또한, TGF-베타 결합-단백질 변이체 폴리뉴클레오티드는 시스테인 골격을 갖는 단백질을 코딩한다. TGF-베타 결합-단백질 변이체 폴리뉴클레오티드는 또한 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 최대 상응도로 배열되는 경우 2개의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 동일하다면, 본원에서 사용되는 바와 같은 2개의 아미노산 서열은 "100% 아미노산 서열 동일성"을 갖는다. 유사하게, 최대 상응도에 대하여 배열되는 경우 2개의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드가 동일하다면, 2개의 뉴클레오티드 서열은 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 갖는다. 서열 비교는 DNASTAR (Madison, Wisconsin)에 의해 제조되는 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트, 또는 NCBI 웹 사이트 ([인터넷]<http:www.ncbi.nlm.nih.gov>)에서 이용가능한 BLAST 알고리즘에 포함되는 것과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 최적 배열을 결정하는 것에 의한 2 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법은 당업자들에게 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌[Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)], [Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)], 및 [Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)] 참조).
변이체 TGF-베타 결합 단백질은 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 및 68에 적어도 50% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 초과 동일성을 가져야 한다. 별법으로, TGF-베타 결합-단백질 변이체는 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 또는 69에 적어도 70% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 것에 의해 확인될 수 있다. 나아가, 본 발명은 서열 55 또는 57에 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과 동일성을 갖는 TGF-베타 결합-단백질 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. TGF-베타 결합-단백질 변이체 폴리뉴클레오티드 또는 변이체 TGF-베타 결합 단백질을 확인하기 위해 사용되는 특정 방법에 관계없이, 이러한 변이체는 예를 들면, 단백질의 TGF-베타 패밀리의 선택된 일원에 결합하고(하거나) 그 신호전달을 억제하는 능력에 의해서, 또는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의해서 기능적으로 특성화될 수 있다.
본 발명과 관련하여, TGF-베타 결합-단백질 폴리뉴클레오티드의 "기능적 단편"은 (1) 본원에 기술된 바와 같은 기능적 활성을 갖거나, 또는 (2) 항-TGF-베타 결합 단백질 항체에 특이적으로 결합하는, TGF-베타 결합-단백질 폴리뉴클레오티드의 일부를 코딩하는 핵산 분자를 지칭한다. 예를 들면, 본원에 기술된 TGF-베타 결합 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드의 기능적 단편은 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67 또는 69의 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함한다.
본원에서 지칭되는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드이다. 예를 들면, 천연에서 폴리펩티드와 연관된 탄수화물, 지질, 핵산 또는 단백성 불순물과 같은 천연 시스템에서 공존하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 분리되는 경우, 천연 발생 단백질은 단리되는 것이다. 바람직하게는, 이러한 단리된 폴리펩티드는 적어도 약 90% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95% 순수, 가장 바람직하게는 적어도 약 99% 순수하다.
TGF-베타 결합 단백질에 대한 특이적인 항체
본 발명은 SOST에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하고, 또한 이들 항체의 생성 및 분석에 사용될 수 있는 SOST 폴리펩티드 면역원을 제공하며, 또한 상기 항체를 이용하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 이에 의해 BMP의 SOST 폴리펩티드에 대한 결합을 봉쇄 또는 억제, 즉 BMP 및 SOST 간의 상호작용을 방지 또는 손상시킨다. 상기 상호작용의 봉쇄 효과는 골 미네랄 밀도를 변화 (통계적으로 유의한 방식으로 증가 또는 감소)시키고, 바람직하게는 골 미네랄 밀도를 증가시키는 것이다.
SOST 특이적 항체의 면역화 및(또는) 분석에 사용되는 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 보다 더 숙주 동물에서 항원 반응을 일으킬 것 같은 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 당업자들에게 공지되고 본원에 기술된 방법에 따라서 TGF-베타 결합 단백질의 일차, 이차 및 삼차 구조를 분석하는 것에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207 (1991)]; [Berzofsky, Science 229:932-40 (1985)] 참조. 모델링 및 x-선 결정분석 데이타가 또한 TGF-베타 결합 단백질의 어느 부위 또는 영역이 BMP와 같은 TGF-베타 결합 단백질 리간드의 어느 부위와 상호작용하는지를 예측 및(또는) 분석하기 위해 이용될 수 있다. 상호작용 부위 또는 영역 내의 또는 주위의 아미노산 서열을 포함하는 TGF-베타 결합 단백질 펩티드 면역원이 설계되고 제조될 수 있다. 이들 항체는 TGF-베타 결합 단백질의 동일 리간드에의 결합을 봉쇄 또는 손상시킬 수 있고, 또한 TGF-베타 결합 단백질의 1 이상의 다른 리간드에의 결합을 봉쇄 또는 손상시킬 수 있다.
본 발명에 의한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SOST에 특이적으로 결합가능하고, BMP와 같은 TGF-베타 폴리펩티드의 SOST에의 결합을 경쟁적으로 억제가능한 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 의한 항체는 SOST 폴리펩티드의 BMP 상의 BMP 타입 I 수용체 부위에의 결합, 또는 BMP 타입 II 수용체 결합 부위에의 결합을 경쟁적으로 억제하거나, 또는 SOST의 BMP 상의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위 모두에의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원치 않으면서, 항-SOST 항체가 BMP 폴리펩티드의 타입 I 및(또는) 타입 II 결합 부위의 SOST에의 결합을 경쟁적으로 억제하고, 따라서 SOST의 길항 활성을 봉쇄하는 경우, BMP 상의 수용체 결합 부위는 타입 I 및 타입 II 수용체에 결합이 가능하고, 따라서 골 미네랄화를 증가시킨다. SOST와 같은 TGF-베타 결합 단백질 및 BMP와 같은 TGF-베타 폴리펩티드 간의 결합 상호작용은 일반적으로 각각의 리간드 쌍이 동종이량체를 형성하는 경우 일어난다. 따라서, BMP에 대한 SOST의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것에 의해 BMP에 대한 SOST의 결합을 봉쇄, 손상 또는 방지하기 위하여 SOST에 대한 항체를 이용하는 것 대신에 또는 추가로, SOST 특이적 항체를 사용하여 SOST 동종이량체 형성을 봉쇄 또는 손상시킬 수 있다.
예를 들면, 고 친화도로 BMP에 결합하는 능력을 갖는 BMP 길항제인 인간 Noggin의 한 다이머(Zimmerman et al., supra)가 인간 BMP-7의 한 다이머와의 복합체로 단리되었고, 다파장 회절(multiwavelength anomalous diffraction; MAD)에 의해 분석되었다(Groppe et al., Nature 420:636-42 (2002)). 본원에 논의된 바와 같이, 상기 연구는 Noggin 다이머가 BMP 다이머 상의 모든 수용체 결합 부위 (2개의 타입 I 및 2개의 타입 II 수용체 결합 부위)를 효율적으로 봉쇄할 수 있다는 것을 밝혔다. BMP-7과 접촉하는 Noggin의 아미노산의 위치는 스클레로스틴(sclerostin; SOST)와 같은 다른 TGF-베타 결합 단백질과 BMP간의 상호작용을 모델링하고, 따라서 상기와 같은 상호작용을 봉쇄 또는 손상시키는 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있는 펩티드를 설계하는 것을 보조하는 것에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 BMP 상에 위치하는 골 형태형성 단백질(BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 적어도 하나 또는 양자 모두에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 상기 항체들이 결합하는 SOST 상의 에피토프는 SOST 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 인접 아미노산 서열 내에 포함되거나 포함할 수 있다(서열 1의 약 1-56 위치의 아미노산). 폴리펩티드는 또한 서열 47 (인간) 및 서열 48 (래트)에서 제공되는 바와 같은 코어 영역, 예를 들면 폴리펩티드에 N-말단 영역을 연결하는 짧은 링커 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 인간 SOST (예를 들면, 서열 1)의 더 짧은 대표적 N-말단 펩티드 서열은 서열 2-6을 포함하고, 대표적인 래트 SOST (예를 들면, 서열 20) 펩티드 서열은 서열 12-15를 포함한다.
SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, 예를 들면 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위 중 1 이상에 상응하는 BMP의 아미노산에의 결합을 봉쇄 또는 억제하는 것에 의해 BMP에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 봉쇄 또는 경쟁적으로 억제하는 항체는 또한 SOST의 코어 영역 (서열 1의 약 57-146 위치의 아미노산)에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 코어 영역을 포함하는 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드를 담체 분자에 접합시키기에 유용할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하도록 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 모두에서 연장되는 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 인간 및 래트 SOST의 대표적인 코어 폴리펩티드는 예를 들면, 각각 서열 49 및 서열 50에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 항체는 또한 더 짧은 폴리펩티드 서열에 결합할 수 있다. 대표적인 인간 SOST 코어 펩티드 서열은 서열 21-24에 제공되고, 대표적인 래트 SOST 코어 서열은 서열 25-28에 제공된다.
다른 실시태양에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST 동종이량체의 형성을 손상 (억제, 방지 또는 봉쇄, 예를 들면 통계적으로 유의한 방식으로 감소)시킨다. SOST 및 BMP 간의 상호작용은 SOST의 동종이량체 및 BMP의 동종이량체를 포함할 수 있기 때문에, SOST의 동종이량체 형성을 방지 또는 손상시키는 항체는 따라서 골 미네랄 밀도를 변화시키고, 바람직하게는 골 미네랄 밀도를 증가시킬 수 있다. 일 실시태양에서, SOST의 코어 영역에 결합하는 항체는 동종이량체 형성을 방지한다. 이러한 항체는 또한 예를 들면 서열 29, 30 및 53 (인간 SOST) 및 서열 31 및 54 (래트 SOST)의 코어 영역에 상응하는 인접 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합할 수 있다. SOST 폴리펩티드의 C-말단 영역(서열 1 또는 20의 약 147-190 아미노산 위치) 상에 위치하는 에피토프에 결합하는 항체는 또한 동종이량체 형성을 손상시킨다. 인간 및 래트 SOST의 대표적인 C-말단 폴리펩티드는 예를 들면, 각각 서열 51 및 서열 52에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 항체는 또한 더 짧은 폴리펩티드 서열에 결합할 수 있다. 대표적인 인간 SOST C-말단 펩티드 서열은 서열 33-36에 제공되고, 대표적인 래트 SOST C-말단 서열은 서열 41-43에 제공된다.
항체가 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 개시된 SOST 폴리펩티드 및 펩티드는 면역원으로 유용하다. 본 발명의 이러한 면역원은 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 부위에 특이적으로 결합하거나 또는 모두 BMP 상에 위치하고, SOST의 N-말단 영역으로부터 유래하는 펩티드를 포함하거나, 또는 SOST 동종이량체 형성을 방지할 수 있는 항체의 제조에 이르는 체액성 면역 반응을 생성하도록 동물을 면역화하기 위하여 이용될 수 있다.
면역원으로 유용한 상기 SOST 폴리펩티드 및 펩티드는 또한 항체를 함유하는 샘플, 예를 들면 정제된 항체, 항혈청 또는 세포 배양물 상층액의 샘플 또는 SOST에 특이적인 항체 1종 이상을 함유할 수 있는 임의의 다른 생물학적 샘플을 스크리닝하는 방법에 이용될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 SOST에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 1 이상의 B 세포를 생물학적 샘플로부터 확인 및 선택하는 방법에 이용될 수 있다(예를 들면, 플라크 형성 분석 등). 이어서, B 세포는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 재조합 분자 생물학에 의해 클로닝되고(되거나) 변형될 수 있는 SOST 특이적 항체 코딩 폴리뉴클레오티드의 근원으로 이용될 수 있다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 특정 실시태양에서 SOST 폴리펩티드에 특이적인 1종 이상의 항체를 함유하는 샘플을 지칭하고, 생물학적 샘플은 혈액 샘플 (이로부터 혈청 또는 혈장이 제조될 수 있는 혈액 샘플), 생검 표본, 조직 이식편, 기관 배양물 또는 대상 또는 생물 원천으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제를 얻는 것에 의해 제공될 수 있다. 샘플은 추가로 해부, 해리, 가용화, 분별, 균질화, 생화학 또는 화학적 추출, 미분화, 동결건조, 초음파분해 또는 대상 또는 생물 원천으로부터 유래하는 샘플을 가공하기 위한 임의의 다른 수단에 의해 형태학적 통합성 또는 물리적 상태가 붕괴된 조직 또는 세포 제제를 지칭한다. 대상 또는 생물 원천은 인간 또는 비인간 동물, 일차 세포 배양물(예, 시험관내 면역화된 B 세포) 또는 염색체 통합된 또는 에피솜 재조합 핵산 서열, 불멸화된 또는 불멸화가능한 세포주, 체세포 하이브리드 세포주, 분화된 또는 분화가능한 세포주, 형질전환된 세포주 등을 포함할 수 있는 유전공학적으로 변형된 세포주를 포함하는 이에 한정되지 않는 배양 적응된 세포주일 수 있다.
SOST 펩티드 면역원은 또한 총체적으로 SOST 폴리펩티드의 전체 폴리펩티드 서열을 나타내고, 각각 계열 중 다른 펩티드와 공통적인 SOST 아미노산 서열의 일부를 갖는, 일련의 펩티드를 합성하는 것에 의해 제조될 수 있다. 상기 중복 부분은 바람직하게는 적어도 4개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산일 수 있다. 각 펩티드는 동물을 면역화하고, 혈청을 동물로부터 수집하고, 어느 동물이 SOST의 TGF-베타 단백질에 대한 결합을 손상 또는 봉쇄하는 항체를 생산하는지 확인하기 위한 분석에서 시험하기 위하여 사용될 수 있다. 이어서, 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법에 따라서 이러한 확인된 면역화된 동물로부터 항체가 제조된다.
SOST와 같은 TGF-베타 결합 단백질에 특이적으로 결하하느 펩티드, 폴리펩티드 및 다른 비펩티드 분자가 본 발명에 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은, 분자는 TGF-베타 결합 단백질과 검출가능한 수준으로 반응하나, 비연관 서열 또는 상이한 TGF-베타 결합 단백질의 서열을 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드와 검출가능하게 반응하지 않는다면, 이러한 분자는 TGF-베타 결합 단백질에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 바람직한 결합 분자는, 예를 들면 폴리클로날, 모노클로날, 단일쇄, 키메라, 항-이디오타입 또는 CDR-그래프트 면역글로불린 또는 이의 단편, 예를 들면 단백분해적으로 생성 또는 재조합적으로 제조된 면역글로불린 F(ab')2, Fab, Fab'Fv 및 Fd 단편일 수 있는 항체를 포함한다.
특히 유용한 것은 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66 또는 68의 TGF-베타 결합-단백질에 "특이적으로 결합"하나, Dan, Cerberus, SCGF 또는 Gremlin과 같은 다른 TGF-베타 결합-단백질에는 그렇지 않은 항-TGF-베타 결합-단백질 항체이다. 항체가 104 M-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 105 M-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 106 M-1 이상, 더더욱 바람직하게는 107 M-1 이상, 더더욱 바람직하게는 108 M-1 이상의 Ka로 결합하고, 다른 TGF-베타 결합-단백질에 결합하지 않는 경우, 항체는 특이적 TGF-베타 패밀리 일원 또는 TGF-베타 결합-단백질에 특이적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 동족 항원에 대한 항체의 친화도는 또한 해리 상수 KD로 공통적으로 표현되고, 10-4 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-5 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-6 M 이하, 더더욱 바람직하게는 10-7 M 이하, 더더욱 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD로 결합하는 경우, 항-SOST 항체는 TGF-베타 패밀리 일원에 특이적으로 결합한다. 나아가, 본 발명의 항체는 바람직하게는 TGF-베타 패밀리 일원에 대한 TGF-베타 결합 단백질의 결합을 봉쇄, 손상 또는 억제(예를 들면, 통계적으로 유의하게 감소)한다.
항체 또는 결합 파트너의 친화도 뿐만 아니라 항체가 결합을 억제하는 정도는 통상적인 기술, 예를 들면 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)]에 기술된 기술을 이용하거나, 또는 표면 플라스몬 공명 (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)에 의해서 당업자들에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명의 경우, 표적 분자는 고상에 고정되고, 흐름 세포를 따라 흐르는 이동상 중 리간드에 노출된다. 고정화된 표적에 대한 리간드의 결합이 발생하면, 국소 굴절지수가 변화하고, SPR 각 변화에 이르며, 이는 굴절된 광의 강도의 변화를 검출하는 것에 의해 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화률을 분석하여 결합 반응의 회합 및 해리상에 대한 겉보기 속도 상수를 얻을 수 있다. 상기 값의 비로서 겉보기 평형 상수 (친화도)를 얻는다(예를 들면, 문헌[Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
본 발명에 따른 항체는 임의의 면역글로불린 군, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA에 속할 수 있다. 이는 동물, 예를 들면 가금류(예: 닭) 및 포유동물(이는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 다른 설치류, 소, 말, 양, 염소, 낙타, 인간 또는 다른 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않음)로부터 얻거나 유래될 수 있다. 항체는 내재화 항체일 수 있다.
당업계에 공지된 방법을 이용하여 SOST와 같은 TgF-베타 결합 단백질에 특이적인 항체, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 항체는 또한 요망되는 성질을 갖도록 고안된 유전공학적으로 변형된 면역글로불린(Ig) 또는 Ig 단편으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 한정하지 않고 예시하자면, 항체는 제1 포유동물 종으로부터의 1 이상의 가변(V) 영역 도메인 및 제2의 상이한 포유동물 종으로부터의 1 이상의 불변 영역 도메인을 갖는 키메라 융합 단백질인 재조합 IgG를 포함할 수 있다. 가장 통상적으로는, 키메라 항체는 쥐 가변 영역 서열 및 인간 불변 영역 서열을 갖는다. 이러한 쥐/인간 키메라 면역글로불린은 항원에 대한 결합 특이성을 인간-유래 V 영역 프레임워크 영역 및 인간 유래 불변 영역에 부여하는, 쥐 항체로부터 유래하는 상보성 결정 영역(CDRs)를 그래프팅하는 것에 의해 "인간화"될 수 있다. 상기 분자의 단편은 단백분해성 소화에 의해서, 또는 임의로는 단백분해성 소화 및 이어서 디술피드 결합의 온화한 환원 및 알킬화에 의해 생성될 수 있다. 별법으로, 상기 단편은 또한 재조합 유전공학 기술에 의해 생성될 수 있다.
특정 바람직한 항체는 본원에 기술된 바와 같은 시험관내(in vitro) 분석에서 TGF-베타 결합 단백질 활성을 억제 또는 봉쇄하는 항체이다. TGF-베타 결합 단백질에 대한 항체의 결합 성질은 예를 들면, 당업자들에게 의해 용이하게 수행될 수 있는 효소-연결된 면역흡착 검정법(ELISA), 면역침전, 면역블로팅, 역전류 면역전기영동, 방사성면역검정법, 도트 블롯 검정법, 억제 또는 경쟁 검정법 등(예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호 및 제4,486,530호; 및 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조)을 비롯한 면역검출방법을 이용하여 일반적으로 평가될 수 있다.
면역원은 SOST 폴리펩티드, 정제 또는 부분 정제된 SOST 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편(즉, 펩티드) 또는 SOST 폴리펩티드로부터 유래한 펩티드와 같은 TGF-베타 결합 단백질을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 펩티드는 더 큰 폴리펩티드의 단백분해 절단에 의해서, 재조합 분자 방법론에 의해서 생성될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, SOST 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 본원에 제공되고, 당업자들은 면역원으로 사용하기 위한 SOST 폴리펩티드를 일상적으로 제조할 수 있다. 펩티드는 본원에 기술되고 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 별법으로, 펩티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 임의의 수의 크로마토그래피 또는 다른 분리 방법과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 단리된 개별 펩티드 및 SOST 폴리펩티드의 단백분해 절단에 의해 생성될 수 있다. 면역원으로 유용한 펩티드는 통상적으로 본원에 기술된 바와 같은 SOST 폴리펩티드 아미노산 서열로부터의 적어도 4 또는 5개의 연속적인 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있고, 바람직하게는 SOST 폴리펩티드의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 또는 20개의 연속적인 아미노산 서열을 가질 수 있다. 특정 다른 바람직한 펩티드 면역원은 SOST 폴리펩티드 서열의 6 이상 12 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 다른 바람직한 펩티드 면역원은 20 이상 75 이하의 연속적인 아미노산을 포함하고, 다른 바람직한 펩티드 면역원은 SOST 폴리펩티드의 21 이상 50 이하의 아미노산을 포함한다. 다른 바람직한 펩티드 면역원은 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-50, 또는 21 및 100을 포함하고 이들 사이의 연속적인 아미노산 및 100 내지 190의 연속적인 아미노산의 임의의 전체 정수의 아미노산의 SOST 폴리펩티드 서열을 포함한다.
SOST에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는 본원에 기술되고 당업자들에게 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]; [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Pres 1995)] 참조). TGF-베타 결합 단백질에 대한 항체는 예를 들면, 동물을 발현 벡터의 TGF-베타 결합 단백질 생성물로 면역화하는 것에 의해서, 또는 본원에 기술된 바와 같은 단리된 TGF-베타 결합 단백질 또는 이의 펩티드 단편으로 면역화하는 것에 의해서 얻을 수 있다. 폴리클로날 항체는 통상적으로 래트, 마우스, 토끼, 염소, 소 또는 양과 같은 동물에서 생성되고, 본 발명의 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 또한 인간이하의 영장류로부터 얻을 수 있다. 비비(baboons)에서 진단적으로 및 치료학적으로 유용한 항체를 생성하는 일반적인 기술은 WO 91/11465 (1991) 및 문헌[Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990]에서 찾아볼 수 있다.
동물에 주사하기 위한 면역원의 제조는 TGF-베타 결합 단백질 (또는 이의 변이체 또는 단편)을 다른 면역원성 단백질, 예를 들면 키홀 임펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소혈청 알부민(BSA)등과 같은 캐리어 단백질에 공유 결합하는 것을 포함한다. 폴리펩티드 또는 펩티드 면역원은 컨쥬게이션 과정을 촉진하는 N-말단 또는 C-말단에 1 이상의 추가 아미노산을 포함할 수 있다(예를 들면, KLH에 대한 펩티드의 컨쥬게이션을 촉진하기 위한 시스테인의 첨가). 폴리펩티드 또는 펩티드 내의 다른 아미노산 잔기는 치환되어 그 특정 아미노산 부위에서 캐리어 폴리펩티드에 대하 컨쥬게이션을 방지할 수 있거나(에를 들면, 폴리펩티드/펩티드의 내부 부위에서 시스테인을 세린 잔기로 치환), 또는 용해도를 촉진하기 위하여 또는 면역원성을 증가시키기 위하여 치환될 수 있다.
면역원으로 사용되는 TGF-베타 결합 단백질 펩티드, 폴리펩티드 또는 TGF-베타 결합 단백질 발현 세포는 아쥬반트, 예를 들면 프로이트 완전 또는 불완전 아쥬반트 또는 Ribi 아쥬반트 시스템(Corixa Corporation, Seattle, WA)에 유화될 수 있다. 또한, 예를 들면 문헌[Harlow et al., supra] 참조. 면역원은 복강내, 근육내, 안구내, 피부내 또는 피하를 비롯한 임의의 수의 상이한 경로를 통하여 동물에 주사될 수 있다. 일반적으로, 첫번재 주사 후, 동물은 특히 항원, 아쥬반트(존재하는 경우) 및(또는) 특정 동물 종에 따라서 달라질 수 있는 바람직한 스케쥴에 따라서 1회 이상 부스터 면역화된다. 면역 반응은 동물을 주기적으로 채혈하고, 혈청을 제조하고 ELISA 또는 오쉬터로니(Ouchterlony) 확산 검정법 등과 같은 면역검정법에서 분석하여 특이적 항체 역가를 측정하는 것에 의해서 모니터링될 수 있다. 적절한 항체 역가가 확립되면, 동물을 주기적으로 채혈하여 폴리클로날 항 혈청을 축적하거나 또는 출혈사시킬 수 있다. 이어서, TGF-베타 결합 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A를 이용한 친화도 크로마토그래피에 의해서 이러한 항혈청으로부터 정제될 수 있다. 별법으로, 특정 면역화된 동물종의 Ig 불변 영역에 대한 특이적인 TGF-베타 결합 단백질 또는 펩티드 또는 항체가 적당한 고체 지지체 상에 고정화된 친화도 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
본 발명에 사용되기 위한 항체는 본원에 기술되고 당업계에 공지된 통상적인 고정화 및 세포 융합 과정에 의해 제조된 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 특이적 항원에 결합하는 모노클로날 항체는 당업자들에게 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다(예를 들면, 문헌[Kohler et al., Nature 256:495, 1975]; [Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)]; 미국 특허 RE32,011, 제4,902,614호, 제4,543,439호 및 제4,411,993호; 문헌[Monoclonal Antibodies Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKeam, and Bechtol (eds.) (1980)]; 및 [Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]; [Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)] 참조). 항체 단편은 단백분해성 소화에 의해서, 또는 임의로는 단백분해성 소화(예를 들면, 파파인 또는 펩신을 이용) 및 이어서 디술피드 결합의 온화한 환원 및 알킬화와 같은 임의의 적당한 표준 기술을 이용하여 이로부터 유도될 수 있다. 별법으로, 이러한 단편은 또한 재조합 유전공학 기술에 의해 생성될 수 있다.
간략하게, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법에 따라서 동물(예: 래트, 햄스터 또는 바람직하게는 마우스)에 TGF-베타 결합-단백질 유전자 생성물 또는 이의 펩티드 단편을 포함하는 면역원을 주사하는 것에 의해 얻을 수 있다. 특이적 항체 제조의 존재는 최초 주사(주사는 폴리클로날 항체의 생성에 대하여 본원에 기술된 바와 같은 다수의 경로 중 임의의 하나에 의해 투여될 수 있음) 후 및(또는) 부스터 주사 후 혈청 샘플을 얻고, 당업계에 공지되고 본원에 기술된 여러 면역검출 방법 중 임의의 하나를 이용하여 TGF-베타 결합-단백질 또는 펩티드에 결합하는 항체의 존재를 검출하는 것에 의해서 모니터링될 수 있다. TGF-베타 결합 단백질에 결합하는 항체를 생성하는 동물로부터, 비장 또는 림프절에서 가장 흔한 세포, 림프계 세포를 제거하여 B-림프구를 얻는다. 이어서, B-림프구는 약물-감작된 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계이고 임의로 다른 바람직한 성질(예를 들면, P3X63 - Ag8.653 (ATCC 번호, CRL 1580), NS0, SP20과 같은 내재성 Ig 유전자 생성물을 발현하는 능력의 결여)을 갖는 것과 융합되어 불멸의 진핵 세포주인 하이브리도마를 제조한다. 림프계 (예: 비장) 세포 및 골수종 세포는 수 분 동안 막 융합 촉진제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제와 병합되고, 이어서 저밀도로 하이브리도마 세포의 성장을 지지하나 비융합된 골수종 세포의 성장은 지지하지 않는 선별 배지 상에 플레이팅한다. 바람직한 선별 배지는 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)이다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2 주 후, 세포 집락을 관찰한다. 단일 집락을 단리하고, 세포에 의해 제조된 항체를 당업계에 공지되고 본원에 기술된 다양하 면역검정법 중 임의의 하나를 이용하여 TGF-베타 결합 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편에 대한 결합 활성을 시험할 수 있다. SOST에 대하여 고 친화도 및 특이성을 가즌 모노클로날 항체를 제조하는 하이브리도마가 바람직하다. TGF-베타 결합 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하는 하이브로도마가 따라서 본 발명에 포함된다. 하이브리도마는 클로닝되고(예를 들면, 제한 희석 클로닝에 의해서 또는 연 한천 플라크 단리에 의해서), 항원에 특이적인 항체를 제조하는 양성 클론을 선별하고 배양한다. TGF-베타 패밀리 일원에 대한 TGF-베타 결합 단백질의 결합을 봉쇄, 억제 또는 손상시키는 항체가 바람직하다.
하이브리도마 배양물로부터의 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물의 상층액으로부터 단리될 수 있다. 쥐 모노클로날 항체의 별도 제조 방법은 동계 마우스, 예를 들면 모노클로날 항체를 함유하는 복수 형성을 촉진하도록 처리(예를 들면, 프리스탄-프라임)된 마우스의 복막강 내로 하이브리도마 세포를 주사하는 것이다. 모노클로날 항체는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 단리되고 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 세파로즈, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다(예를 들면, Coligan의 문헌 2.7.1-2.7.12 및 2.9.1-2.9.3; [Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Moledular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)] 참조). 모노클로날 항체는 항체의 특정 성질 (예를 들면, 중쇄 또는 경쇄 이소타입, 결합 특이성 등)에 기초하여 선택된 적합한 리간드를 이용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 고체 지지체 상에 고정화된 적합한 리간드의 예로는 단백질 A, 단백질 G, 항-불변 영역 (경쇄 또는 중쇄) 항체, 항-이디오타입 항체 및 TGF-베타 결합 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 당업자들이 익숙할 수 있는 임의의 수의 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 인간 말초 혈액 세포 (예를 들면, B 림프구를 함유)의 엡스타입 바 바이러스(EBV) 형질전환, 인간 B 세포의 시험관내(in vitro) 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 수반하는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터의 비장 세포의 융합, 인간 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리의 단리 또는 당업계에 공지되고 본원 개시사항에 기초한 다른 과정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 인간 모노클로날 항체는 항원 투여에 반응하여 특이적 인간 항체를 제조하도록 공학변형된 트랜스제닉 마우스로부터 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 예를 들면, 문헌[Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994]; [Lonberg et al., Nature 368:856, 1994]; [Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994]; 미국 특허 제5,877,397호; 문헌[Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58]; [Jakobovits et al., 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35]에 기술되어 있다. 상기 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 좌위의 요소가 내재 중쇄 및 경쇄 좌위의 표적 붕괴를 포함하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스 계통으로 도입된다 (또한, 문헌[Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)] 참조). 예를 들면, 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 미니-유전자 구조물, 또는 마우스 림프계 조직 중에서 B 세포 특이적 DNA 재배열 및 과다돌연변이를 겪는 효모 인공 염색체 상의 전위유전자일 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 항원에 특이적인 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 유전자를 면역화하는 것에 의해 얻을 수 있다. 면역화된 트랜스제닉 마우스의 림프계 세포를 이용하여 본원에 기술된 방법에 따라서 인간 항체-분비 하이브리도마를 제조할 수 있다. 인간 항체를 함유하는 폴리클로날 혈청은 또한 면역화된 동물의 혈액으로부터 얻을 수 있다.
인간 TGF-베타 결합 단백질 특이적 모노클로날 항체를 생성하는 다른 방법은 EBV 형질전환에 의해 인간 말초 혈액 세포를 불멸화하는 것을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,464,456호 참조. 이러한 TGF-베타 결합 단백질 (또는 이의 변이체 또는 단편)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 불멸화된 B 세포주 (또는 림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주)는 본원에 제공된 면역검출 방법(예: ELISA)에 의해 확인되고, 이어서 표준 클로닝 기술에 의해 단리될 수 있다. 항-TGF-베타 결합 단백질 항체를 생산하는 림포블라스토이드 세포주의 안정성은 형질전환된 세포주를 쥐 골수종과 융합하여 당업계에 공지된 방법에 따라 마우스-인간 하이브리드 세포주를 생산하는 것에 의해 개선될 수 있다(예를 들면, 문헌[Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)] 참조). 인간 모노클로날 항체를 생성하는 또 다른 방법은 인간 비장 B 세포를 항원으로 프라이밍하고, 이어서 프라이밍된 B 세포를 헤테로하이브리드 융합 파트너와 융합하는 것을 포함하는 시험관내(in vitro) 면역화이다. 예를 들면, 문헌[Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95] 참조.
특정 실시태양에서, 항-SOST 항체를 생산하는 B 세포가 선별되고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 당업계에 공지되고 본원에 기술된 분자 생물학 기술에 따라서 B 세포로부터 클로닝된다 (WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052호; 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)]). 바람직하게는, 면역화된 동물로부터의 B 세포는 비장, 림프절 또는 말초 혈액 샘플로부터 SOST에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포를 선별하는 것에 의해 단리된다. B 세포는 또한 인간으로부터, 예를 들면 말초 혈액 샘플로부터 단리될 수 있다. 요망되는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 단일 B 세포를 검출하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 플라크 형성, 형광 활성화 세포 분류, 시험관내 자극 및 이어서 특이적 항체의 검출 등이 있다. 특이적 항체를 생산하는 B 세포의 선별 방법은 예를 들면, SOST 또는 이의 펩티드 단편을 함유하는 연 한천 중 B 세포의 단일 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. 항원에 대한 B 세포에 의해 생산되는 특이적 항체의 결합은 면역침전으로 가시화될 수 있는 복합체의 형성을 일으킨다. 특이적 항체를 생산하는 B 세포가 선별된 후, 특이적 항체 유전자는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 방법에 따라서 DNA 또는 mRNA를 단리하고 증폭하는 것에 의해 클로닝될 수 있다.
특정 용도에 대하여, 항-TGF-베타 결합 단백질 항체의 단편이 바람직할 수 있다. 항체 단편, F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, Fd는 전체 항체의 항원 결합 부위를 보유하고, 따라서 동일 에피토프에 결합한다. 항체로부터 유래한 이러한 항원-결합 단편은 예를 들면, 항체의 단백분해성 가수분해, 예를 들면 통상적인 방법에 따른 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해서 얻을 수 있다. 예를 들어 설명하자면, 항체 단편은 펩신을 이용한 항체의 효소적 절단에 의해 F(ab')2로 나타내는 5S 단편을 제공하는 것에 의해 제조될 수 있다. 상기 단편은 티올 환원제를 이용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab' 일가 단편을 제조할 수 있다. 임의로, 절단 반응은 디술피드 결합의 절단으로부터 유래하는 술프히드릴 기에 대한 블로킹기를 이용하여 수행될 수 있다. 별법으로, 파파인을 이용한 효소적 절단은 2개의 일가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 제조한다. 이들 방법은 예를 들면, 골덴버그(Goldenberg)의 미국 특허 제4,331,647호, 문헌[Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960]; [Porter, Biochem. J. 73:119, 1959]; [Edelman et al., in Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967)]; 및 [Coligan, 2.8.1-2.8.10 및 2.10-2.10.4 페이지]에 기술되어 있다. 항체를 절단하기 위한 다른 방법, 예를 들면 중쇄를 분리하여 일가 경쇄 단편 (Fd)를 형성하는 것, 단편의 추가 절단 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술이 또한 단편이 완전 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한 이용될 수 있다.
항체 단편은 또한 복합체를 형성하도록 특이적 항원에 결합하는 항체와 같이 작용하는 합성 또는 유전공학적으로 변형된 단백질일 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자(scFv 단백질), 및 고변이 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위를 포함한다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 1 이상의 가변 영역 도메인을 포함한다. 가변 영역 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조합일 수 있고, 항원 결합을 주도하고, 1 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 프레임 내에 위치하는 1 이상의 고변이 아미노산 서열을 일반적으로 포함할 수 있다. 일반적으로, 가변 (V) 영역 도메인은 임의의 적합한 배열의 면역글로불린 중쇄(VH) 및(또는) 경쇄(VL) 가변 도메인일 수 있다. 따라서, 예를 들면, V 영역 도메인은 모노머일 수 있고, 허용가능한 친화도로 독립적으로 항원 결합가능한 VH 또는 VL 도메인일 수 있다. 별법으로, V 영역 도메인은 다이머일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 다이머를 포함할 수 있다. 바람직하게는, V 영역 다이머는 비공유적으로 연관된 1 이상의 VH 및 1 이상의 VL 쇄를 포함한다(이하, Fv로 지칭함). 요망되는 경우, 쇄는 예를 들면, 2개의 가변 도메인 간의 디술피드 결합을 통하여 또는 링커(예: 펩티드 링커)를 통하여 각각 직접적으로 공유 커플링되어 단쇄 Fv (scFv)를 형성할 수 있다.
가변 영역 도메인은 임의의 천연 발생 가변 도메인이거나 또는 이의 공학변형된 버전일 수 있다. 공학변형 버전은 재조합 DNA 공학 기술을 이용하여 창제된 가변 영역 도메인을 의미한다. 이러한 공학변형된 버전은 예를 들면, 특이적 항체의 아미노산 서열 중의 또는 서열에의 삽입, 결실 또는 변화에 의한 특이적 항체 가변 영역으로부터 창제된 것을 포함한다. 특정 실시예는 제1항체로부터의 1 이상의 CDR 및 임의로 1 이상의 프레임워크 아미노산, 및 제2 항체로부터의 나머지의 가변 영역 도메인을 포함하는 공학변형된 가변 영역 도메인을 포함한다.
가변 영역 도메인은 1 이상의 다른 항체 도메인 또는 이의 단편에 C-말단 아미노산에서 공유적으로 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 가변 영역 도메인 중에 존재하는 VH 도메인은 면역글로불린 CH1 도메인 또는 이의 단편에 될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 상기 방법에서, 예를 들면 항체는 항원 결합 도메인은 각각 CH1 및 CK 도메인에 이들의 C-말단에서 공유적으로 연결된 연계된 VH 및 VL 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 추가 아미노산을 이용하여 연장되어, 예를 들면 Fab' 단편에서 발견되는 바와 같은 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부를 제공하거나, 또는 항체 CH2 및 CH3 도메인과 같은 추가 도메인을 제공할 수 있다.
다른 형태의 항체 단편은 단일 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR 펩티드 ("최소 인식 단위")는 목적하는 항체의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구성하는 것에 의해 얻을 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 주형으로 항체 생산 세포의 mRNA를 이용하여 가변 영역을 합성하기 위한 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 것에 의해 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106. 1991]; [Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)]; 및 [Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)] 참조).
별법으로, 항체는 항체 가변 및(또는) 불변 영역을 코딩하는 DNA의 조작 및 재발현을 비롯한 재조합 DNA 기술의 이용에 의해 얻어지는 재조합 또는 공학변형된 항체일 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고(있거나) 예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 비롯한 DNA 라이브러리로부터 용이하게 입수가능하거나(문헌[Chiswell and McCafferty, Tibtech. 10:80-84 (1992)] 참조), 요망되는 경우 합성될 수 있다. 표준 분자 생물학 및(또는) 화학적 과정을 이용하여 DNA를 조작하여 예를 들면, 코든을 도입하여 시스테인 잔기를 창제하거나 또는 다른 아미노산 또는 요망되는 도메인을 변형, 첨가 또는 결실시킬 수 있다.
TGF-베타 결합 단백질에 특이적이고, 인간화 항체를 포함하는 키메라 항체가 또한 본 발명에 따라서 생성될 수 있다. 키메라 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유래하는 1 이상의 불변 영역 도메인, 및 제2의 상이한 포유동물 종으로부터 유래하는 1 이상의 가변 영역 도메인을 갖는다(예를 들면, 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)] 참조). 바람직한 실시태양에서, 키메라 항체는 쥐, 래트 또는 햄스터 모노클로날 항체로부터 유래하는 가변 영역과 같은 비인간 모노클로날 항체로부터 유래하는 1 이상의 가변 영역 도메인을 1 이상의 인간 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터로 클로닝하는 것에 의해 구성될 수 있다(예를 들면, 문헌[Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76 (1989)]; [Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29 (1993)] 참조). 예를 들면, 쥐 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 카파(kappa) 경쇄 불변 영역 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터로 삽입될 수 있다. 별개의 벡터에서, 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 인간 IgG 불변 영역(예를 들면, 인간 IgG1 불변 영역)을 코딩하는 서열 프레임 내로 클로닝될 수 있다. 선별되는 특정 인간 불변 영역은 특정 항체에 요망되는 작용기 기능에 의존할 수 있다(예를 들면, 보체 고정, 특정 Fc 수용체에의 결합 등). 바람직하게는, 구성된 벡터는 키메라 항체의 안정한 발현을 위하여 진핵 세포로 형질감염될 수 있다. 키메라 항체를 생성하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법은 동종 재조합이다(예를 들면, 미국 특허 제5,482,856호 참조).
비인간/인간 키메라 항체는 추가로 유전공학적으로 변형되어 "인간화" 항체를 생성할 수 있다. 이러한 인간화 항체는 비인간 포유동물 종의 면역글로불린 유래의 복수의 CDRs, 1 이상의 인간 가변 프레임워크 영역 및 1 이상의 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 설계하기 위한 유용한 전략은 한정함이 없이 예를 들면, 키메라 항체의 비인간 프레임워크 영역에 가장 동종성인 인간 가변 프레임워크 영역을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원치 않으면서, 이러한 전략은 인간화 항체는 TGF-베타 결합 단백질에 대하여 특이적 결합 친화도를 보유할 수 있으며, 여기서 일부 바람직한 실시태양에서 TGF-베타 결합 단백질 또는 이의 변이체 또는 단편에 대하여 실질적으로 동일한 친화도를 가질 수 있고, 특정 다른 바람직한 실시태양에서 TGF-베타 결합 단백질에 대하여 더 큰 친화도를 가질 수 있다. 예를 들면, 문헌[Jones et al., 1986 Nature 321:522-25]; [Riechmann et al., 1988 Nature 332:323-27] 참조. 이러한 인간화 항체를 설계하는 것은 따라서, 예를 들면 컴퓨터 모델링에 의해서 CDR 루프 배치 및 구조 결정물을 측정하고, 이어서 CDR 루프 또는 결정물을 공지의 인간 CDR 루프 구조 또는 결정물과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Padlna et al., 1995 FASEB 9:133-39]; [Chothia et al., 1989 Nature, 342:377-383] 참조. 컴퓨터 모델링은 또한 비인간 가변 영역과 서열 상동성에 의해 선택된 인간 구조 주형을 비교하기 위하여 이용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2:95-103]; EP-0578515-A3 참조. 비인간 CDRs의 인간화가 결합 친화도 감소를 일으킨다면, 컴퓨터 모델링은 부분적으로, 완전히 또는 최적이상으로 (즉, 비인간화 항체의 것보다 더 높은 수준으로 증가) 친화도를 보유하도록 위치 지향 또는 다른 돌연변이발생 기술에 의해 변화될 수 있는 특이적 아미노산 잔기를 확인하는 것을 보조할 수 있다. 당업자들은 상기 기술에 익숙하고, 상기 설계 전략에 대한 많은 변화 및 변형을 용이하게 이해할 수 있다.
인간화 항체를 제조하기 위한 이러한 한 방법은 베니어링(veneering)으로 불린다. 본원에서 사용되는 용어 "베니어링된 FRs" 및 "재조합적으로 베니어링된 FRs"는 실질적으로 모든 천연 FR 폴리펩티드 폴딩 구조를 보유하는 항원-결합 부위를 포함하는 이종 분자를 제공하도록 예를 들면 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기를 인간 FR 잔기로 선택적으로 대체하는 것을 지칭한다. 베니어링 기술은 항원-결합 부위의 리간드 결합 특성은 일차적으로 항원-결합 표면 내의 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 배치에 의해 결정된다는 이해에 기초한다. 문헌[Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59:439-73, 1990]. 따라서, CDR 구조, 이들의 서로간의 상호작용 및 나머지 V 영역 도메인과의 이들의 상호작용이 주의깊게 유지되는 경우에만 인간화 항체에서 항원 결합 특이성이 보존될 수 있다. 베니어링 기술을 이용하는 것에 의해서, 면역계와 용이하게 마주치는 외부(예: 용매 접근가능한) FR 잔기가 인간 잔기로 선택적으로 대체되어 약하게 면역원성이거나 또는 실질적으로 비면역원성인 베니어링된 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 제공한다.
베니어링 방법은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987)]에 의해 편집된 인간 항체 가변 도메인에 대한 이용가능한 서열 데이타, 카바트(Kabat) 데이타베이스에 대한 업데이트 및 다른 접근가능한 미국 및 외국의 데이타베이스(핵산 및 단백질 모두)를 이용한다. V 영역 아미노산의 용매 접근가능성은 인간 및 쥐 항체 단편에 대한 공지의 3차원 구조로부터 추론될 수 있다. 처음에, 목적 항체 분자의 가변 영역의 FRs는 상기 규정한 원천으로부터 얻은 인간 가변 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교된다. 이어서, 가장 상동성인 인간 V 영역이 상응하는 쥐 아미노산과 잔기 대 잔기로 비교된다. 인간 대응물과 상이한 쥐 FR 중의 잔기는 당업계에 공지된 재조합 기술을 이용하여 인간 잔기 중에 존재하는 잔기로 대체된다. 잔기 교체는 적어도 부분적으로 노출된(용매 접근가능한) 잔기만으로 수행되고, 프롤린, 글리신 및 하전된 아미노산과 같은 V 영역 도메인의 3차 구조 상에 현저한 효과를 가질 수 있는 아미노산 잔기의 대체에는 주의를 기울인다.
상기 방법에서, 얻은 "베니어링된" 항원-결합 부위는 따라서 쥐 CDR 잔기, CDRs에 실질적으로 인접한 잔기, 숨겨진 또는 대개 숨겨진(용매 접근불가능한) 것으로 확인된 잔기, 중쇄 및 경쇄 도메인 간의 비공유(예: 정전기 및 소수성) 접촉에 관여하는 것으로 여겨지는 잔기, 및 CDR 루프의 "정규(canonical)" 3차 구조에 영향을 주는 것으로 여겨지는 FRs의 보존된 구조적 영역으로부터의 잔기를 보유하도록 설계된다. 이어서, 상기 설계 기준을 이용하여 쥐 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 인간 항체의 발현을 위한 포유동물 세포를 형질전환하기 위하여 이용될 수 있는, 인간에 나타나는 FRs로 항원 결합 부위의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDRs를 병합하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 제조한다.
TGF-베타 결합 단백질 또는 그의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 추가적 방법은 파지 디스플레이에 의한 것이다. 예를 들면, 문헌[Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280] 참조. 인간 또는 쥐 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리는 TGF-베타 결합 단백질 또는 그의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편(Fab, Fv, sFv, 또는 그의 다량체(multimer))을 선별하기 위해 스크리닝될 수 있는 파지 벡터에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,223,409호; 문헌[Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52] 및 그에 인용된 문헌 참조. 예를 들면, Ig 가변 영역 단편을 코딩하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 라이브러리는 파지 외피 단백질을 코딩하는 서열을 갖는 프레임 내에서 M13 또는 그의 변이체와 같은 사상 박테리오파지의 게놈으로 삽입될 수 있다. 융합 단백질은 외피 단백질과 경쇄 가변 영역 도메인 및(또는) 중쇄 가변 영역 도메인의 융합일 수 있다. 특정 실시태양에 따르면, 면역글로불린 Fab 단편은 파지 입자 상에 디스플레이될 수 있다(예를 들면 미국 특허 제5,698,426호 참조).
중쇄 및 경쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리는 또한 예를 들면 λ이뮤노ZapTM(H) 및 λ이뮤노ZapTM(L) 벡터(Stratagene, La Jolla, California)를 사용하여 람다 파지에 제조될 수 있다. 간략히, mRNA를 B 세포 집단으로부터 단리하고 λ이뮤노Zap(H) 및 λ이뮤노Zap(L) 벡터에 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 cDNA 발현 라이브러리를 생성시키기 위하여 사용한다. 이 벡터는 개별적으로 스크리닝되거나 공동-발현되어 Fab 단편 또는 항체를 형성할 수 있다(문헌[Huse et al., 상동] 참조; 또한 문헌[Sastry et al., 상동] 참조). 추후 양성 플라크를 이.콜라이로부터 모노클로날 항체 단편의 고 수준 발현을 가능하게 하는 비-용해성 플라스미드로 전환시킬 수 있다.
유사하게, 항체의 Fab 및 Fv 단편과 같은 부분 또는 단편을 TGF-베타 결합 단백질에 대해 특이적인 항체를 코딩하는 유전자의 가변 영역을 혼입시키는 통상의 효소 분해 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작할 수도 있다. 한 실시태양 내에서, 하이브리도마에서 관심 있는 모노클로날 항체를 발현하는 유전자의 가변 영역을 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 이 프라이머는 당업자가 합성할 수 있거나 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 구입할 수 있다(예를 들면, VHa, VHb, VHC, VHd, CHl, VL 및 CL 영역에 대한 프라이머를 비롯한 마우스 및 인간 가변 영역에 대한 프라이머를 판매하는 스트라타진(Stratagene; La Jolla, California) 참조). 이 프라이머는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭하기 위하여 사용될 수 있고, 그 후 각각 이뮤노ZAPTM H 또는 이뮤노ZAPTM L(Stratagene)과 같은 벡터로 삽입시킬 수 있다. 그 후 이 벡터를 발현을 위해 이. 콜라이, 효모 또는 포유류-기반 시스템에 도입할 수 있다. VH 및 VL 도메인의 융합을 함유하는 다량의 단일-가닥 단백질을 이 방법을 사용하여 생산할 수 있다(문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988] 참조). 또한, 이러한 기술을 사용하여 항체의 결합 특이성을 변경시키지 않고 비-인간 항체 V 영역을 인간화시킬 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 조합 파지 라이브러리를 비-인간 가변 영역의 인간화에 사용할 수도 있다. 예를 들면, 문헌[Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:22611-18; Rader et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-15] 참조. 파지 라이브러리를 스크리닝하여 당업계에 공지되고 본원에 기재된 면역검출 방법에 의해 관심 있는 Ig 가변 영역 단편을 선별할 수 있고, 이렇게 선별된 파지에 삽입된 면역글로불린 유전자의 DNA 서열을 표준 기술에 의해 결정할 수 있다. 문헌[Sambrook et al., 2001 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조. 그 후 선별된 Ig-코딩 서열을 Ig 단편의 발현을 위해 다른 적합한 벡터 내로 클로닝할 수 있고, 또는 임의로, 전체 면역글로불린 사슬의 발현을 위해 Ig 불변 영역을 함유하는 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
다른 특정 실시태양에서, 본 발명은 다량체 항체 단편인 SOST-특이적 항체를 고안한다. 유용한 방법은 예를 들면 문헌[Hayden et al. 1997, Curr Opin. Immunol. 9:201-12; Coloma et al., 1997 Nat. Biotechnol. 15:159-63]에 일반적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 다량체 항체 단편은 미니항체(미국 특허 제5,910,573호) 또는 디아바디(diabody)(Holliger et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45:128-130)를 형성하는 파지 기술에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, SOST에 특이적인 항체는 세포내 단백질로서 발현되는 항체일 수 있다. 이러한 세포내 항체는 또한 인트라바디(intrabody)로도 불리며, Fab 단편을 포함하거나, 바람직하게는 scFv 단편을 포함할 수 있다(예를 들면, 문헌[Lecerf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4764-49 (2001)] 참조). CDR 영역을 플랭킹하는 프레임워크 영역을 변경시켜서 세포내 환원 환경에서 인프라바디의 발현 수준 및 용해도를 향상시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Worn et al., J. Biol. Chem. 275:2795-803 (2000)] 참조). 인트라바디는 예를 들면 세포 내의 특정 표적 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 융합될 수 있는 인트라바디의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제작함으로써, 특정 세포 위치 또는 세포기관에 대한 것일 수 있다(예를 들면, 문헌[Graus-Porta et al., Mol. Cell Biol. 15:1182-91 (1995); Lener et al., Eur. J. Biochem. 267:1196-205 (2000)] 참조). 인트라바디는 유전자 치료 벡터, 또는 지방 혼합물(예를 들면, 임제넥스 코포레이션(Imgenex Corporation, San Diego, CA)에서 제조된 프로벡틴(Provectin)TM)을 통해, 또는 광화학적 내재화 방법에 따르는 것을 비롯한 당업자가 이용 가능한 다양한 기술에 의해 세포 내로 도입할 수 있다.
TGF-베타 결합 단백질에 대해 특이적인 면역글로불린 분자 내로 아미노산 돌연변이를 도입하는 것은 TGF-베타 결합 단백질에 대한 특이성 또는 친화도를 증가시키거나 이펙터(effector) 기능을 변경시키는데 유용할 수 있다. TGF-베타 결합 단백질에 대한 높은 친화도를 갖는 면역글로불린은 특정 잔기의 부위-특이적 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. TGF-베타 결합 단백질에 대한 친화도를 향상시키기 위하여 컴퓨터 보조 삼차원 분자 모델링을 사용하여 변경될 아미노산 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Mountain et al., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142] 참조. 별법으로, CDR의 조합 라이브러리를 M13 파지에 생성시키고 향상된 친화도를 갖는 면역글로불린 단편에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Glaser et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913; Barbas et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13]; 미국 특허 5,792,456호 참조.
또한, 이펙터 기능은 부위-특이적 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997 Biotechniques 23:830-34] 참조. 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 부분 상의 글리코실화 부위의 돌연변이는 면역글로불린이 보체를 고정하는 능력을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Wright et al., 1997 Trends Biotechnol. 15:26-32] 참조. 불변 영역 도메인에서의 다른 돌연변이는 면역글로불린이 보체를 고정하거나 항체-의존성 세포 독성을 일으키는 능력을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Duncan et al., 1988 Nature 332:563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86:319-24; Sensel et al., 1997 Mol. Immunol. 34:1019-29] 참조.
특정 실시태양에 따르면, 본원에 기재된 Ig 분자의 비인간, 인간, 또는 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 단일 사슬 Fv(scFv) 폴리펩티드 단편(단일 사슬 항체)으로서 제작할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조. 다기능성 scFv 융합 단백질은 다양한 공지의 이펙터 단백질 중 어느 것을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열과 프레임 내에서 scFv 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결함으로써 생성될 수 있다. 이 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, EP-B1-0318554, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호, 및 미국 특허 제5,476,786호에 개시되어 있다. 예로써, 이펙터 단백질은 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Methods 188:1-7] 참조. 이펙터 단백질의 다른 예는 효소이다. 비-제한적 예로서, 이러한 효소는 치료적 목적을 위해 생물학적 활성을 제공할 수 있거나(예를 들면, 문헌[Siemers et al., 1997 Bioconjug. Chem. 8:510-19] 참조), 진단용으로, 다수의 공지된 기질 중 어느 것을 검출가능한 생성물로 양고추냉이 퍼옥시다제 촉매 하에 전환시키는 것과 같은 검출가능한 활성을 제공할 수 있다. scFv 융합 단백질의 또다른 예는 Ig-독소 융합, 또는 면역독소를 포함하고, 여기서 scFv 폴리펩티드는 독소에 연결된다.
scFv 또는 본원에 기재된 임의의 항체 단편은, 특정 실시태양에서, 융합 단백질 및 항원(예를 들면, TGF-베타 결합 단백질) 사이의 특이적 결합의 검출을 가능하게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들면, 융합 폴리펩티드 도메인은 당업자가 잘 아는 다양한 기술 중 어느 것에 의해 scFv 융합 단백질의 TGF-결합 단백질에의 결합을 검출하기 위한 친화성 태그 폴리펩티드일 수 있다. 펩티드 태그의 예는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His(예를 들면, 폴리히스티딘)을 포함한다. 검출 기술은 또한 예를 들면 아비딘 또는 스트렙타비딘 융합 단백질의 바이오틴 또는 바이오틴 모방 서열에의 결합(예를 들면, 문헌[Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225] 및 그에 인용된 문헌 참조), 검출가능한 모이티(예를 들면, 표지 모이티)를 사용한 융합 단백질의 직접 공유결합적 변경, 융합 단백질의 특이적 표지화 리포터 분자에의 비-공유 결합, 효소 활성을 갖는 부분을 포함하는 융합 단백질에 의한 검출가능한 기질의 효소적 변형, 또는 융합 단백질의 고상 지지체에의 고정(공유 또는 비-공유)을 포함할 수 있다. scFv 융합 단백질의 제작을 위한 다른 유용한 친화성 폴리펩티드는 예를 들면 WO 89/03422, 미국 특허 5,489,528호, 미국 특허 5,672,691호, WO 93/24631, 미국 특허 5,168,049호, 미국 특허 5,272,254호에 개시된 스트렙타비딘 융합 단백질; 아비딘 융합 단백질(예를 들면, EP 511,747호 참조); 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 같은 효소; 및 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 TGF-베타 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 핵산 절제, 라이게이션, 형질전환, 및 다수의 공지 발현 벡터를 사용하는 형질감염에 대한 다수의 공지의 방법에 따라 증식 및 발현될 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 항체 단편의 발현은 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)와 같은 원핵 숙주에서 선호될 수 있다(예를 들면, 문헌[ Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515] 참조). 다른 특정 실시태양에서, 항체 또는 그의 단편의 발현은 효모(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))를 비롯한 원핵 숙주 세포, 동물 세포(포유류 세포 포함), 또는 식물 세포에서 선호될 수 있다. 적절한 동물 세포의 예는 골수종(예, 마우스 NSO 라인), COS, CHO, 또는 하이브리도마 세포를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 식물 세포의 예는 담배, 옥수수, 대두 및 쌀 세포를 포함한다.
가변 및(또는) 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 하나 이상의 복제가능한 발현 벡터를 제조하여 적절한 세포주, 예를 들면 마우스 NSO 라인과 같은 비-생산(non-producing) 골수종 세포주 또는 이.콜라이와 같은 세균을 형질전환시키는데 사용할 수 있고, 여기서 항체의 생산이 일어날 것이다. 효율적인 전사 및 번역을 얻기 위하여, 각 벡터 내의 DNA 서열은 적절한 조절 서열, 특히 가변 도메인 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 리더 서열을 포함해야 한다. 이러한 방법으로 항체를 생산하는 특정 방법은 일반적으로 잘 알려져 있고 흔히 사용된다. 예를 들면, 기초 분자 생물학 과정은 매니아티스(Maniatis) 등(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989; 또한, 문헌[Maniatis et al, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)] 참조)에 의해 기재되어 있다. DNA 서열분석은 문헌[Sanger et al., PNAS 74: 5463, (1977)] 및 [Amersham International plc sequencing handbook]에 기재된 대로 수행할 수 있고, 부위 특이적 돌연변이는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다(Kramer et al.,Nucleic Acids Res. 12: 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd handbook). 또한, 수많은 출판물에서 DNA의 조작, 발현 벡터의 생성 및 적절한 세포의 형질전환에 의한 항체의 제조에 적합한 기술에 대해 기재하고 있다(Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK); 국제 특허 명세서 WO 91/09967호).
특정 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체는 그에 부착된 하나 이상의 이펙터 또는 리포터 분자를 가질 수 있다. 리포터 분자는 효소, 세포독성제, 또는 염료, 방사성핵종, 발광기, 형광기 또는 바이오틴을 비롯한 기타 리포터 분자 등과 같은 검출가능한 모이티 또는 라벨일 수 있다. TGF-베타 결합 단백질-특이적 면역글로불린 또는 그의 단편은 진단적 또는 치료적 적용을 위해 방사성표지될 수 있다. 항체의 방사성 표지를 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Adams 1998 In Vivo 12:11-21; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32:831-9] 참조. 치료적 적용은 하기에 매우 상세하게 기재되어 있고 다른 치료제와 복합된 TGF-베타 결합 단백질 특이적 항체(또는 그의 단편)의 용도를 포함할 수 있다. 이펙터 또는 리포터 분자는 부착 또는 부착 과정이 분자의 유용성이 없어질 정도로 결합 성질에 부정적으로 영향을 미치지 않는다면, 항체에 위치한 이용가능한 아미노산 측쇄, 말단 아미노산, 또는 탄수화물 작용기를 통해 항체에 부착될 수 있다. 특정 작용기는, 예를 들면, 유리 아미노, 이미노, 티올, 히드록실, 카르복실, 또는 알데히드기를 포함한다. 항체 및 이펙터 및(또는) 리포터 분자의 부착은 이러한 기 및 이펙터 또는 리포터 분자 내의 적절한 관능기를 통해 달성될 수 있다. 연결은 직접적이거나 스페이싱(spacing) 또는 브리징(bridging) 기를 통해 간접적일 수 있다.
이펙터 분자는, 예를 들면, 항신생물제, 독소, 예를 들면 세균(슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 엑소톡신 A) 또는 식물 기원의 효소적으로 활성 있는 독소 및 그의 단편을 포함한다(예를 들면 리신(ricin) 및 그의 단편, 식물 겔로닌(gelonin), 브리오니아 디오이카(Bryonia dioica)로부터의 브리오딘(bryodin) 등 예를 들면, 문헌[Thrush et al. , 1996 Annu. Rev. Immunol. 14:49-71; Frankel et al., 1996 Cancer Res. 56:926-32] 참조). 추가의 이펙터 분자는 생물학적으로 활성이 있는 단백질(예를 들면, 효소), 핵산 및 그의 단편, 자연 발생 및 합성 폴리머, 예를 들면, 다당류 및 폴리알킬렌 폴리머, 예를 들면 폴리(에틸렌글리콜) 및 그의 유도체, 방사성 핵종, 특히 방사성요오다이드, 및 킬레이트된 금속을 포함한다. 적합한 리포터 기는 킬레이트된 금속, 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광분석법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다. 특히 유용한 이펙터 기는 칼리케미신(calichaemicin) 및 그의 유도체이다(예를 들면, 남아프리카 특허 명세서 제85/8794, 88/8127 및 90/2839호 참조).
화학요법제, 항-유사분열제, 항생체, 어팝토시스 유도제(또는 "어팝토젠", 문헌[Green and Reed, 1998, Science 281:1309-1312] 참조) 등을 비롯한 다양한 기타 독소는 당업자에게 잘 알려져 있고, 본원에 제공된 예는 본 발명의 범위 및 취지를 제한하지 않고 예시적인 것으로 의도된다. 특정 항신생물제는 세포독성 및 세포증식억제제, 예를 들면 알킬화제, 예를 들면 질소 머스타드(예를 들면, 클로람부실, 멜팔란, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 또는 우라실 머스타드) 및 그의 유도체, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 부술판, 또는 시스플라틴; 항대사제, 예를 들면 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 시타라빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 플루오로아세트산 또는 플루오로시트르산, 항생제, 예를 들면 블레오마이신(예를 들면, 블레오마이신 술페이트), 독소루비신, 도노루비신, 미토마이신(예를 들면, 미토마이신 C), 액티노마이신(예를 들면, 댁티노마이신) 플리카미신, 칼리캐미신 및 그의 유도체, 또는 에스퍼라미신 및 그의 유도체; 유사분열 억제제, 예를 들면 에토포시드, 빈크리스틴 또는 빈블라스틴 및 그의 유도체; 알칼로이드, 예를 들면 엘립티신; 폴리올, 예를 들면 탁시신-I 또는 탁시신-II; 호르몬, 예를 들면 안드로겐(예를 들면, 드로모스타놀론 또는 테스토락톤), 프로게스틴(예를 들면, 메게스테롤 아세테이트 또는 메드록시프로게스테론 아세테이트), 에스트로겐(예를 들면, 디메틸스틸베스트롤 디포스페이트, 폴리에스트라디올 포스페이트 또는 에스트라무스틴 포스페이트) 또는 안티에스트로겐(예를 들면, 타목시펜); 안트라퀴논, 예를 들면 미토잔트론, 우레아, 예를 들면 히드록시우레아; 히드라진, 예를 들면 프로카르바진; 또는 이미다졸, 예를 들면 다카르바진을 포함한다.
이펙터 분자로서 유용한 킬레이트화 금속은 (8을 포함하여) 2 내지 8의 배위수를 갖는 2가 또는 3가 양이온 금속의 킬레이트를 포함한다. 이러한 금속의 특정 예는 테크네튬(Tc), 레늄(Re), 코발트(Co), 구리(Cu), 금(Au), 은(Ag), 납(Pb), 비스무쓰(Bi), 인듐(In), 갈륨(Ga), 이트륨(Y), 테르븀(Tb), 가돌리늄(Gd), 및 스칸튬(Sc)을 포함한다. 일반적으로, 금속은 바람직하게는 방사성핵종이다. 특정 방사성 핵종은 99mTc, 186Re, 188Re, 58Co, 60Co, 67Cu, 195Au, 199Au, 110Ag, 203Pb, 206Bi, 207Bi, 111In, 67Ga, 68Ga, 88Y, 90Y, 160Tb, 153Gd, 및 47Sc를 포함한다. 킬레이트화 금속은 예를 들면 임의의 적정한 폴리덴테이트 킬레이트화제, 예를 들면 비시클릭 또는 시클릭 폴리아민, 폴리에테르(예를 들면 크라운 에테르 및 그의 유도체), 폴리아미드; 포르피린; 및 카르보시클릭 유도체와 킬레이트된 상기 유형의 금속 중 하나일 수 있다. 일반적으로, 킬레이트화제의 유형은 사용되는 금속에 의존할 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 컨쥬게이트에 특히 유용한 군의 킬레이트제는 비시클릭 및 시클릭 폴리아민, 특히 폴리아미노카르복실산, 예를 들면 디에틸렌트리아민펜타아세트산 및 그의 유도체, 및 마크로시클릭 아민, 예를 들면 시클릭 트리-아자 및 테트라-아자 유도체(예를 들면, 국제 특허 명세서 WO 92/22583호에 기재되어 있는 것); 및 폴리아미드, 특히 데스페리옥사민 및 그의 유도체를 포함한다.
항체에 부착의 지점으로서 티올기가 사용될 때, 이펙터 분자는 이펙터 또는 리포터 분자에 존재하는 티올-반응성기에서 일어나는 반응에 따라 부착될 수 있다. 이러한 기의 예는 할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들면 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들면 말레이미드, 비닐 술폰, 또는 디술피드를 포함한다. 이러한 연결 과정 또한 기타의 적합한 연결 과정은 국제 특허 명세서 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/091195, 및 WO 89/01476호에 일반적이고 더욱 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 바와 같은 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(또는 그의 항원-결합 단편), 또는 그의 변이체 또는 단편을 인식하는 항-개별특이형 항체의 생성을 고안한다. 항-개별특이형 항체는 항-TGF-베타 결합 단백질 항체(또는 그의 항원-결합 단편)을 면역원으로 사용하여 본원에 기재된 방법에 의해 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체로서 생성될 수 있다. 항-개별특이형 항체 또는 그의 단편은 또한 상기 재조합 유전 공학 방법 중 어느 것에 의해서, 또는 파지 디스플레이 선택에 의해 생성될 수 있다. 항-개별특이형 항체는 항체의 SOST 폴리펩티드에 대한 결합이 경쟁적으로 억제되도록 항-SOST 항체의 항원 결합 부위와 반응할 수 있다. 별법으로, 본원에 제공된 항-개별특이형 항체는 항-TGF-베타 결합 단백질 항체가 TGF-베타 결합 단백질에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하지 않을 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, SOST에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST 폴리펩티드의 발현을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 항체 또는 항체의 패널을 SOST 폴리펩티드를 발현하는 세포에 노출시킬 수 있고, SOST 폴리펩티드의 발현은 항체 또는 검정법에서 최초로 사용된 항체와 다른 에피토프에 결합하는 다른 SOST 특이적 항체를 사용하는 검출에 의해 결정될 수 있다.
골 밀도를 증가시키는 약제를 선별하기 위한 검정법
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명은 골 밀도를 증가시킬 수 있는 약제를 선별하고(하거나) 단리하기 위한 방법을 제공한다. 바람직한 특정 실시태양에서, 약제는 SOST(TGF-베타 결합 단백질)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 예를 들면, 본 발명의 한 실시태양 내에서, (a) 후보 약제를 TGF-베타 결합 단백질 및 단백질의 TGF-베타 패밀리의 일원과 접촉 또는 혼합시키는 단계 및 (b) 후보 약제가 단백질의 TGF-베타 패밀리에 의한 신호절달을 자극하거나, 단백질의 TGF-베타 패밀리의 하나 이상의 일원에 TGF-베타 결합 단백질이 결합하는 것을 억제 또는 손상시키는지 결정하는 단계를 포함하는, 약제가 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 방법을 제공한다. 특정 실시태양 내에서, 약제는 TGF-베타가 중간엽 세포 분화의 양성 조절제로서 기능하는 능력을 상승시킨다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항체 플러스(+) SOST(항체/SOST) 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 동안 그러한 조건 하에서 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 본원에 개시된 펩티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 SOST 펩티드와 접촉시킨 후 SOST/항체 복합체의 수준을 검출(예를 들면 그 양을 정량)하여 TGF-베타 신호전달 경로를 조절하는 항체의 존재를 결정하는 것을 포함하는, TGF-베타 신호전달 경로를 조절하는 항체를 확인하는 방법이 제공된다. 이 방법은 SPR 또는 ELISA, 면역블롯 등을 비롯한 당업계에 공지되고 본원에 개시된 다수의 상이한 면역검정법을 사용하여 수행할 수 있다. TGF-베타 신호전달 경로는 BMP가 그에 의해 세포 상의 타입 I 및 타입 II 수용체에 결합하여 골 미네랄 함량을 조절하는 경로를 자극하거나 유도하는 신호전달 경로를 포함한다. 본 발명의 바람직한 특정 실시태양에서, SOST에 특이적으로 결합하는 항체는 골 미네랄 함량을 증가시키기 위한 경로를 자극하거나 상승시킨다. 이러한 항체는 SOST 특이적 펩티드에의 항체의 결합을 검출하기 위한 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 BMP가 결합하는 SOST 상의 영역 또는 영역의 부분에 위치하는 SOST 펩티드, 예를 들면 SOST의 아미노 말단의 펩티드 및 SOST의 코어 영역(도킹 코어)의 일부(예를 들면, 서열 번호 2-19, 21-28 및 47-50) 및 아미노 말단 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드에 항체가 결합하는지를 검출함으로써 BMP가 SOST 폴리펩티드에 결합하는 것을 손상, 억제(경쟁적 억제 포함) 또는 방지하는 항체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 SOST 동종이량체의 형성을 손상, 방지, 또는 억제하는 항체를 확인하기 위하여 사용될 수도 있다. SOST에 특이적으로 결합하는 이러한 항체는 SOST의 코어 또는 카르복시 말단 영역(예를 들면, 서열번호: 29-46 및 51-54)으로부터 유래된 펩티드에 항체가 결합하는 것을 검출함으로써 확인될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양 내에서, (a) TGF-베타 결합 단백질을 발현하는 세포에 후보 약제를 접촉시키는 단계 및 (b) 노출된 세포에서 TGF-베타 결합-단백질의 발현이 감소되는지 또는 TGF-베타 결합 단백질의 활성이 감소되는지 결정함으로써 화합물이 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 단계를 포함하는, 약제가 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하기 위한 방법이 제공된다. 한 실시태양 내에서, 세포는 골 생검 또는 랫트 두정골 골모세포로부터 자발적으로 형질전환되거나 형질전환되지 않은 정상 인간 골을 포함할 수 있다.
면역검정법은 TGF-베타 결합 단백질의 발현을 검출하고 정량하기 위하여 사용될 수 있고, 예를 들면 향류 면역-전기영동(CIEP), 방사성면역검정법, 방사성면역침전법, 효소-연결 면역-흡착 검정법(ELISA), 면역블롯 검정법, 예를 들면 도트 블롯 검정법 및 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 검정법, 및 샌드위치 검정법(미국 특허 4,376,110 및 4,486,530호 참조; 또한 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, 상동] 참조)를 포함한다. 이러한 면역검정법은 본원에 기재된 항-스클레로스틴 항체와 같은 TGF-베타 결합 단백질에 대해 특이적인 항체를 사용할 수 있거나, TGF-베타 결합 단백질에 부착된 리포터 분자에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 또한 폴리펩티드 발현의 수준은 TGF-베타 결합 단백질 리간드에 결합하는 TGF-베타 결합 단백질의 양을 정량함으로써 결정할 수 있다. 예로써, 시료 중에서 스클레로스틴의 BMP에의 결합은 표면 플라스몬(plasmon) 공명에 의해 검출될 수 있다. 별법으로, 특이적 TGF-베타 결합 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현의 수준을 정량할 수 있다.
다른 실시태양에서, TGF-결합 단백질에 결합하기 위한 항체와 경쟁할 약제를 확인하기 위하여 후보 약제를 스크리닝하는 경쟁 검정법과 같은 방법에 SOST에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 항체와 TGF-베타 단백질 사이의 상호작용은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 면역검정 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
예로써, TGF-베타 결합 단백질과 같은 TGF-베타 수퍼패밀리의 패밀리 일원 또는 TGF-베타 결합 단백질의 리간드인 TGF-베타 수퍼패밀리 일원을 처음에 고상에 결합시킨 후, 후보 약제를 첨가한다. 고상에 결합하는 TGF-베타 수퍼패밀리 일원의 리간드를 동시에 또는 추후 단계에서 첨가하고, 고상을 세척하고, 패밀리 일원에 결합한 리간드의 양을 결정하며, 이는 후보 약제가 TGF-베타 일원에의 리간드의 결합을 차단하는지를 나타낸다. 별법으로, TGF-베타 수퍼패밀리 일원의 리간드를 고상에 부착시킬 수 있고, TGF-베타 수퍼패밀리 일원을 후보 분자의 첨가와 동시에 또는 순차적으로 첨가할 수 있다. TGF-베타 수퍼패밀리 일원에 결합하는 리간드의 양은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 검출가능한 분자로 리간드를 표지함으로써 측정할 수 있다. 별법으로, TGF-베타 수퍼패밀리 일원에의 리간드의 결합은 하나 이상의 검출 분자, 예를 들면 리간드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 첨가하고, 리간드에 결합한 분자의 양을 정량함으로써 측정할 수 있다. 본원에 기재된 골 미네랄 함량을 증가시키는데 사용하기에 적합한 약제는 통계적으로 유의한 방식으로 TGF-베타 결합 단백질이 TGF-베타 수퍼패밀리의 일원인 그의 리간드에 결합하는 것을 감소시키는 약제이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, (a) TGF-베타 단백질을 발현시키는 세포와 후보 약제를 접촉시키는 단계 및 (b) 노출된 세포로부터의 TGF-베타 단백질의 활성이 변경되는지를 결정하고, 그로부터 화합물이 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 단계를 포함하는, 약제가 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 방법과 유사하게, TGF-베타 결합 단백질을 생산하는 세포가 선택된 시험 화합물에 노출될 때 TGF-베타 결합-단백질 발현에서의 변화를 평가하기 위하여 다양한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, (a) 후보 약제를 TGF-베타-결합-단백질 및 단백질의 TGF-베타 패밀리의 선택된 일원과 접촉시키는 단계, 및 (b) 선택된 약제가 단백질의 TGF-베타 패밀리의 신호전달을 상향조절하거나 TGF-베타 결합 단백질이 TGF-베타 패밀리 일원에 결합하는 것을 억제하는지 결정하는 단계를 포함하는, 약제가 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 방법이 제공된다. 특정 실시태양에서, 분자는 TGF-베타 패밀리 일원이 중간엽 세포 분화의 양성 조절제로서 기능하는 능력을 향상시킨다.
상기 기재된 방법과 유사하게, SOST에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 시험 화합물에 의한 TGF-베타 패밀리 일원의 자극을 평가하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그러한 하나의 대표적 방법(또한 문헌[Durham et al., Endo. 136:1374-1380] 참조)은 BMP(예를 들면, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7)와 같은 TGF-베타 패밀리 일원을 그의 Kd와 동등한 농도로 고상에 부착하는 것을 포함한다. 해리 상수(Kd)는 당업계에 공지되고 제조자(Biosensor, Piscataway, NJ)에 의해 기재된 기술에 따라 BIA코어 기구를 사용하여 표면 플라스몬 공명과 같은, 당업계에 공지된 결합 속도 상수를 측정하는 방법에 따라 결정할 수 있다. 그 후 길항제 후보 약제의 집합물을 고정된 농도에서 첨가한다(전형적으로, 작은 유기 분자 집합물에 대해 20 μM(본원에 사용된 단리된 작은 유기 분자는 당업계에 공지된 방법(예를 들면, NMR, 융점)에 따라 측정시 분자가 90% 보다 큰 순도를 갖는 것을 의미함) 및 후보 항체에 대해 1 μM). 약제가 SOST에 대한 BMP의 결합을 억제할 때, 즉, 약제가 없을 때 관찰된 SOST에 대한 BMP 결합의 수준에 비하여 40% 이상, 바람직하게는 50% 또는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 또는 90% 이상까지 결합 수준의 감소가 관찰될 때 약제는 이 상호작용의 길항제로 여겨진다. 이러한 약제는 그 억제 상수 및 TGF-베타 결합-단백질 결합 친화도에 미치는 영향이 결정되는 적정 연구에 기초하여 잠재적 억제제로서 추가로 평가될 수 있다. 또한 유사한 특이성 조절 검정법을 수행하여 BMP 리간드 작용에 의존하는 검정법을 사용하는 연구에 따라 확인된 길항제에 대한 선택도 프로파일을 확립할 수 있다(예를 들면, BMP/BMP 리포터 경쟁 연구).
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 후보 약제가 TGF-베타 결합 단백질의 골 또는 그의 유사체에의 부착을 억제하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 후보 약제가 골 미네랄 함량을 증가시킬 수 있는지 결정하는 방법이 제공된다. 본원에 사용될 때, 골 또는 그의 유사체는 히드록시아파타이트, 또는 골의 분말 형태로 이루어진 표면, 분쇄된 골 또는 그대로의 골을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 방법과 유사하게, 다양한 방법을 골 매트릭스에 대한 TGF-베타 결합-단백질 편재의 억제를 측정하기 위하여 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌[Nicolas et al., Calcif. Tissue Int. 47:206-12 (1995) 참조).
본원에 기재된 방법이 각 후보 약제의 분석을 참고할 수 있지만, 본 발명이 그렇게 한정되어서는 안된다. 특히, 약제는 후보 약제의 혼합물에 함유될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 후보 약제는 작은 유기 분자일 수 있거나 항체 또는 그의 단편 또는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 항체 또는 단편은 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있거나 본원에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 인용된 방법은 TGF-베타 패밀리 일원에 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 억제하는 약제를 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 TGF-베타 패밀리 일원의 SOST 폴리펩티드에의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 항체 또는 항체 단편이 BMP와 같은 TGF-베타 패밀리 일원이 SOST에 결합하는 것을 손상 또는 차단하는 능력은 본원에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있다. SOST에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 SOST 동종이량체 형성을 손상시킴으로써 TGF-베타 패밀리 일원이 SOST에 결합하는 것을 손상, 차단 또는 방지할 수 있다. SOST에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST가 BMP에 결합하는 것을 억제 또는 손상시킴으로써 SOST의 활성을 확인하는데 사용될 수도 있다. 별법으로, 항체 또는 그의 단편을 세포-기반 검정법 또는 SOST가 한정된 활성을 갖는 동물 모델에 혼입시켜서 항체가 그 활성을 변경시키는지를(통계적으로 유의한 방법으로 증가 또는 감소시키는지) 결정할 수 있다. SOST에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편은 신호 전도 경로에서의 이러한 항체의 효과를 검사하여 신호전달 경로를 조절(자극 또는 억제)하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 항체의 SOST에의 결합은 신호전달 경로를 자극 또는 유도한다.
단백질의 생산
본원에 기재된 폴리펩티드는 TGF 결합 단백질 스클레로스틴 및 그의 변이체 및 스클레로스틴에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드(또한, 적절한 경우, 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및 펩티드 및 그의 유도체를 포함하는 단백질)와 실질적으로 유사한 유도체를 포함한다. 본원에 사용될 때, (a) 뉴클레오티드 서열이 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역으로부터 유래되고 예를 들면 상기에서 논의된 서열의 일부 또는 그 서열의 대립유전자 변이를 포함하거나, 또는 TGF-베타 패밀리의 일원에 TGF-베타 결합-단백질이 결합하는 것을 억제하는 분자를 코딩하고; (b) 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드에 중간 정도이거나 높거나 또는 매우 높은 엄격도 하에 혼성화될 수 있고(있거나)(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001] 참조); (c) 폴리뉴클레오티드 서열이 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열의 특정 아미노산에 대한 코돈 서열에 대하여 퇴화된 것이라면 뉴클레오티드 서열이 "실질적으로 유사한" 것으로 여겨진다. 또한, 본원에 개시된 핵산 분자는 서열이 본원에 기재된 기준을 달리 만족한다면 상보 및 비-상보 서열 모두를 포함한다. 본 발명의 경우에 있어서, 높은 엄격도는 표준 혼성화 조건(예를 들면, 5XSSPE, 55-65℃에서 0.5% SDS, 또는 등가물; 5xSSPE (1xSSPE = 180 mM 염화나트륨; 10 mM 인산나트륨; 1 mM EDTA (pH 7.7); 5x 덴하르트 용액 (100x 덴하르트 = 2% (w/v) 소 혈청 알부민, 2% (w/v) 피콜, 2% (w/v) 폴리비닐피롤리돈); 및 0.5% SDS)을 의미한다. 높은 엄격도에서의 혼성화 후 세척은 전형적으로 55-60℃에서 0.5xSSC (1xSSC = 150 mM 염화나트륨, 15 mM 구연산 삼나트륨) 또는 0.5xSSPE에서 수행된다.
SOST를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA 라이브러리에서, 생물학적 시료, 조직 또는 세포주의 세포에서 단리될 수 있고, 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Sambrook, supra] 참조). 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 적절한 세포 또는 조직에서 제조된 cDNA로부터 증폭될 수 있다. 이 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 서열에 기초하여 디자인되거나, 구입 또는 합성될 수 있는 서열 특이적 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 서열 특이적 탐침 및 프라이머를 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. PCR에 의해 라이브러리를 스크리닝하는 일반적 방법은, 예를 들면, 문헌[Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 211-215 (Humana Press, Inc. 1993)]에 의해 제공된다. 또한, PCR을 사용하여 관련된 유전자를 단리하는 기술은 예를 들면 문헌[Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 317-337 (Humana Press, Inc. 1993)]에 기재되어 있다.
TGF-베타 결합 단백질 c-DNA 또는 TGF-베타 결합-단백질 게놈 단편의 서열은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, TGF-베타 결합 단백질 프로모터 또는 조절 요소를 함유하는 게놈 단편의 확인은 결실 분석과 같은 잘 확립된 기술을 사용하여 달성될 수 있다(일반적으로, 문헌[Ausubel (1995)] 참조).
별법으로, TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상호 프라이밍하는(priming) 장쇄 올리고뉴클레오티드 및 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 얻을 수 있다(예를 들면, 문헌[Ausubel (1995)] 8-8 내지 8-9 면 참조). PCR이 방법에 도입된다면, 길이가 2 킬로베이스 이상인 DNA 분자가 합성될 수 있다(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131, 1993; Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266, 1993; Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299, 1995).
변이체 TGF-베타 결합-단백질을 코딩하는 핵산 분자는 본원에 기재된 방법을 사용하여, 다양한 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67, 및 69에 기초한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 탐침으로 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. TGF-베타 결합-단백질 폴리뉴클레오티드 변이체는 합성하여 제작할 수도 있다. 예를 들면, 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 또는 70의 아미노산 서열과 비교할 때 보존적 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 디자인할 수 있다. 즉, 서열 1, 20, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 또는 70의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체를 얻을 수 있고, 여기서 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 알킬 아미노산 대신 알킬 아미노산이 치환되거나; TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 방향족 아미노산 대신 방향족 아미노산이 치환되거나; TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 황-함유 아미노산 대신 황-함유 아미노산이 치환되거나; TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 히드록시-함유 아미노산 대신 히드록시-함유 아미노산이 치환되거나; TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 산성 아미노산 대신 산성 아미노산이 치환되거나; TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 염기성 아미노산 대신 염기성 아미노산이 치환되거나; 또는 TGF-베타 결합-단백질 아미노산 서열의 이염기성 모노카르복실 아미노산 대신 이염기성 모노카르복실 아미노산이 치환된다.
통상의 아미노산 중, 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은 각각의 하기 군 이내의 아미노산 사이의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신(비-극성 알킬기-함유 측쇄); (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판(방향족 측쇄) (3) 세린 및 트레오닌(히드록실기 측쇄), (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트(카르복실산기 측쇄); (5) 글루타민 및 아스파라긴(아미드기-함유 측쇄) 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘(아미노산 측쇄). 이러한 치환을 만드는데 있어서, 가능한 경우, 도 1에 도시된 시스테인 골격을 유지하는 것이 중요하다.
SOST에서 보존적 아미노산 변화는 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67, 또는 69 중 하나에 언급된 뉴클레오티드 대신 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 변이체는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이, 링커-스캐닝 돌연변이, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용한 돌연변이 등에 의해 얻을 수 있다(문헌[Ausubel (1995)] 8-10 내지 8-22면; 및 문헌[McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)] 참조). 이러한 변이체의 기능적 활성은 본원에 기재된 표준 방법 및 검정법을 사용하여 결정될 수 있다. 별법으로, 변이체 TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드는 항-SOST 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
핵산 분자의 통상의 결실 분석을 수행하여 TGF-베타 결합-단백질 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 "기능적 단편"을 얻을 수 있다. 예로써, 서열 55-57, 59, 61, 63, 65, 67, 또는 69 중 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자는 Bal31 뉴클레아제로 소화되어 일련의 네스티드(nested) 결실을 얻을 수 있다. 그 후, 단편을 적절한 리딩 프레임에서 발현 벡터로 삽입하고, 발현된 폴리펩티드를 단리하고 활성에 대해, 또는 항-TGF-베타 결합-단백질 항체에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 엑소뉴클레아제 소화에 대한 한가지 대안은 올리고뉴클레오티드-특이적 돌연변이를 사용하여 결실 또는 정지 코돈을 도입하여 원하는 단편의 생산을 특정하는 것이다. 별법으로, 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 TGF-베타 결합-단백질의 특정 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 합성할 수 있다. 본원에 개시된 검정법 및 방법 이외에, 단백질의 기능적 분석을 위한 표준 기술이 예를 들면 문헌[Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113, 1993; Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon," in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270, 1995; Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291, 1995; Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295, 1995; and Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1, 1996]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 구조는 예를 들면 P/C 진(Gene) 또는 인텔리제네틱스 스위트(Intelligenetics Suite)(Intelligenetics, Mountain View, California)를 사용하여, 또는 문헌[Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982)]에 기재된 방법에 따라 1차 번역 생성물로부터 예측될 수 있다. 폴리펩티드는 산성 또는 염기성 염의 형태 또는 중성 형태로 제조될 수 있다. 또한, 각 아미노산 잔기는 산화 또는 환원에 의해 변경될 수 있다. 또한, 그 최종 효과가 돌연변이체 또는 야생형 단백질의 생물학적 활성을 유지하거나 더 증가 또는 감소시키는 것인 다양한 치환, 결실 또는 첨가를 아미노산 또는 핵산 서열에 가할 수 있다. 바람직하게는, SOST 변이체, 또는 그의 단편은 SOST 특이적 항체에 결합하는 능력을 유지하거나 증가시켰다. 또한, 유전 코드의 퇴화로 인해, 예를 들면 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상당히 변경될 수 있다.
본원에 제공된 단백질의 다른 유도체는 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 단백질의 컨쥬게이트를 포함한다. 이는 예를 들면 단백질의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위하여 첨가될 수 있는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질의 합성에 의해 달성될 수 있다(미국 특허 4,851,341호 참조, 또한, 문헌[Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988] 참조). 별법으로, 단백질의 확인, 발현, 및 분석을 돕기 위하여 FLAG®/TGF-베타 결합-단백질을 제작할 수 있다.
본원에 기재된 단백질은 본원에 기재된 다양한 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 또한, 제한 부위에 의해 플랭킹된 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 천연 서열의 단편에 라이게이션되게 함으로써 특정 유전자좌에 돌연변이를 도입할 수 있다. 라이게이션 후, 생성된 재구축된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유도체를 코딩한다.
별법으로, 올리고뉴클레오티드-특이적 부위-특이적(또는 절편 특이적) 돌연변이 방법을 사용하여 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 상기 변경을 가하는 예시적 방법은 문헌[Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); and Sambrook et al. (supra)]에 기재되어 있다. 단백질의 결실 또는 절단 유도체(예를 들면, 가용성 세포외 부분)는 원하는 결실에 인접한 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 제작할 수 있다. 제한에 이어, 돌출(overhang)이 채워질 수 있고 DNA는 다시 라이게이션된다. 상기 변경을 가하는 예시적 방법은 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]에 개시되어 있다.
핵산 분자에 만들어진 돌연변이는 바람직하게는 코딩 서열의 리딩 프레임을 보존한다. 또한, 돌연변이는 바람직하게는 전사되었을 때 혼성화되어 mRNA의 번역에 부정적 영향을 미칠 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조를 생산하는 상보 영역을 생성하지 않을 것이다. 돌연변이 부위가 미리 결정될 수 있지만, 돌연변이 자체의 성질이 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에 돌연변이체의 최적 특성을 선택하기 위하여, 표적 코돈에 무작위 돌연변이를 유발시킬 수 있고 생물학적 활성의 획득, 손실 또는 유지에 대하여 발현된 돌연변이체를 스크리닝할 수 있다. 별법으로, 천연 서열의 단편에의 라이게이션을 가능하게 하는 제한 부위에 플랭킹된, 돌연변이체 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 돌연변이를 도입할 수 있다. 라이게이션 후, 생성된 재구축된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 유도체를 코딩한다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발(Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83:3402-3406, 1986), 강제 뉴클레오티드 오혼입(forced nucleotide misincorporation)(예를 들면 문헌[ Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990] 참조), 또는 무작위 돌연변이화된 올리고뉴클레오티드의 사용(Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989)과 같은 기술을 사용하여 제작할 수도 있다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 및 본 발명 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이러한 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양함으로써 조작 및 발현시킨다. 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 지시할 수 있는 재조합 핵산 제작물을 말한다. 벡터는 데옥시리보핵산(DNA), 합성 또는 cDNA-유도된, 리보핵산(RNA), 또는 이들의 조합(예를 들면, DNA-RNA 키메라)로 이루어질 수 있다. cDNA 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 mRNA와 같은 RNA 분자를 전사함으로써 제조되는 DNA 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로 이해된다. 원하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 이 벡터 또는 벡터 제작물은 바람직하게는 적절한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 적절한 조절 요소는 세균, 진균, 바이러스, 포유류, 곤충, 또는 식물 유전자를 비롯한 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 적절한 조절 요소의 선택은 선택된 숙주 세포에 의존하고, 당업자가 용이하게 수행할 수 있다. 조절 요소의 예는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 전사 종결자, 및 번역 개시 신호를 포함하는 리보솜 결합 서열을 포함한다. 임의로, 벡터는 폴리아데닐화 서열, 하나 이상의 제한 부위, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 또는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 하나 이상의 선택가능한 마커 또는 당업계에 공지된 기타 마커를 포함할 수 있다. 또한, 선택된 숙주 세포 및 사용된 벡터에 의존하여, 다른 유전적 요소, 예를 들면, 복제의 원점, 추가의 핵산 제한 부위, 인핸서, 전사의 유도성을 부여하는 서열, 및 선택가능한 마커를 본원에 기재된 벡터에 혼입할 수 있다.
상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 세균, 포유류, 효모 또는 기타 진균, 바이러스, 곤충, 또는 식물 세포를 비롯한 다양한 원핵 및 진핵 숙주 세포에 의해 용이하게 발현될 수 있다. 이러한 세포를 형질전환 또는 형질감염시켜서 외인성 DNA를 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 이타쿠라(Itakura) 등의 미국 특허 4,704,362호; 문헌[Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978]; 머레이(Murray) 등의 미국 특허 4,801,542호; 웁샬(Upshall) 등의 미국 특허 4,935,349호; 하겐(Hagen) 등의 미국 특허 4,784,950호; 악셀(Axel) 등의 미국 특허 4,399,216호; 괴델(Goeddel) 등의 미국 특허 4,766,075호; 및 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]; 식물 세포에 대해서는 문헌[Czako and Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994]; 및 [Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992] 참조).
본 발명을 수행하기에 적합한 세균 숙주 세포는 이. 콜라이 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, 및 ER1647 (예를 들면, 문헌[Brown (Ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)] 참조); 비. 서브틸리스(B. subtilis) (BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170 (예를 들면 문헌[Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (Ed.) (IRL Press 1985)] 참조); 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 다양한 종, 및 당업자에게 잘 알려진 기타 많은 세균 종을 포함한다. 세균 숙주 세포의 대표적 예는 이. 콜라이 DH5α(Stratagene, LaJolla, California)를 포함한다.
박테리아 발현 벡터는 바람직하게는 숙주 세포에서 기능하는 프로모터, 하나 이상의 선택가능한 표현형 표지, 및 박테리아 복제 원점을 포함한다. 대표적인 프로모터로는 β-락탐아제 (페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템 (문헌[Chang 등, Nature 275:615, 1978] 참조), T7 RNA 중합효소 프로모터 (문헌[Studier 등, Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990] 참조), 람다 프로모터 (문헌[Elvin 등, Gene 87:123-126, 1990] 참조), trp 프로모터 (문헌[Nichols 및 Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983] 참조), 및 tac 프로모터 (문헌[Russell 등, Gene 20:231, 1982] 참조)이 포함된다. 추가적인 프로모터로는 T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인지할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, recA, 열충격, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, 및 이. 콜라이 (E. coli)의 lacZ 프로모터, B. 서브틸리스 (B. subtilis)의 프로모터, 바실루스 (Bacillus)의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 및 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터가 포함된다. 원핵 프로모터가 문헌들[Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987; Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987); Ausubel 등 (1995)]에 의해 검토되어 왔다. 대표적인 선택가능한 표지로는, 카나마이신 또는 암피실린 저항성 유전자와 같은 다양한 항생제 저항성 표지가 포함된다. 숙주 세포를 형질전환시키는데 적절한 많은 플라스미드가 당업계에 공지되어 있으며, 이들에는 pBR322 (문헌[Bolivar 등, Gene 2:95, 1977] 참조), pUC 플라스미드인 pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (문헌[Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983] 및 문헌[Vieira 및 Messing, Gene 19:259-268, 1982] 참조), 및 pNH8A, pNH16a, pNH18a, 및 블루스크립트 M13 (Stratagene, La Jolla, California)가 있다.
본 발명을 수행하기 적절한 효모 및 곰팡이 숙주 세포로는, 특히 사카로마이세스 폼베 (Saccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 (Pichia) 속 또는 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 속 및 다양한 종류의 아스퍼길루스 (Aspergillus) 속 (문헌 [McKnight 등, 미국 특허 4,935,349]참조)이 포함된다. 효모 및 곰팡이에 대한 적절한 발현 벡터로는, 다른 것중에서, 효모에 대한 YCp50 (ATCC No. 37419), 및 amdS 클로닝 벡터 pV3 (문헌[Turnbull, Bio/Technology 7:169, 1989]), YRp7 (문헌[Struhl 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1978]), YEp13 (문헌[Broach 등, Gene 8:121-133, 1979]), pJDB249 및 pJDB219 (문헌[Beggs, Nature 275:104-108, 1978]) 및 그의 유도체가 포함된다.
효모에 사용하기 위한 바람직한 프로모터로는, 효모 해당 유전자(문헌[Hitzeman 등, J Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980]; 문헌[Alber 및 Kawasaki, J Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982]) 또는 알코올 탈수소효소 유전자 (문헌[Young 등, Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender 등 (eds.), p.355, Plenum, New York, 1982]; 문헌[Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-201, 1983])로부터의 프로모터가 포함된다. 곰팡이 벡터에 대한 유용한 프로모터의 예로는, 아스퍼길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans) 해당 유전자로부터 유도된 것들, 예컨대 adh3 프로모터 (문헌[McKnight 등, EMBO J. 4:2093-2099, 1985])이 포함된다. 상기 발현 단위는 또한 전사 터미네이터를 포함할 수 있다. 적절한 터미네이터의 예는 adh3 터미네이터 (문헌[McKnight 등, supra, 1985])가 포함된다.
박테리아 벡터에서와 같이, 효모 벡터는 선택가능한 표지를 일반적으로 포함할 것이고, 이는 표현형 검정법이 형질전환주가 선택되게 할 수 있는 우성 표현형을 나타내는 임의의 수의 유전자 중 하나일 수 있다. 바람직한 선택가능 표지는 숙주 세포 영양요구성을 보상하고, 항생제 저항성을 제공하고, 또는 세포가 특정 탄소원을 사용할 수 있게 하는 것들이며, leu2 (문헌[Broach 등, ibid.]), ura3 (문헌[Botstein 등, Gene 8:17, 1979]), 또는 his3 (문헌[Struhl 등, ibid.])이 포함된다. 또 다른 적절한 선택가능 표지는 캐트(CAT) 유전자가 있는데, 이는 효모 세포상에 클로람페니콜 저항성을 부여한다. 많은 효모 클로닝 벡터가 고안되어왔으며, 용이하게 사용할 수 있다. 이들 벡터로는, YIp5와 같은 YIp계 벡터, YRp17와 같은 YRp 벡터, YEp13와 같은 YEp 벡터, 및 YCp19와 같은 YCp 벡터가 포함된다. 당업자는 다양한 적절한 벡터가 효모세포에서 발현에 대해 유용할 것이라는 것을 이해할 것이다.
곰팡이의 형질전환 기술은 문헌에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Beggs (ibid.)], 문헌[Hinnen 등 (Proc. Natl. A cad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978)], 문헌[Yelton 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984)], 및 문헌[Russell (Nature 301:167-169, 1983)]에 기재되어 있다. 숙주 세포의 유전자형은 발현 벡터상에 존재하는 선택가능 표지에 의해 보상되는 (complemented) 유전적 결함을 함유할 수 있다. 특정 숙주 및 선택가능 표지의 선택은 당업자의 수준 안에 있다.
효모의 형질전환에 대한 프로토콜도 역시 당업계의 당업자에 공지되어 있다. 예컨대, 형질전환은 DNA를 갖는 효모의 스페로플라스트 (spheroplast)의 제조 (문헌[Hinnen 등, PNAS USA 75:1929, 1978]) 또는 LiCl과 같은 알칼리염으로의 처리(문헌[Itoh 등, J. Bacteriology 153:163, 1983])에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 곰팡이의 형질변환은 문헌[Cullen 등 (Bio/Technology 5:369, 1987])에 의해 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 수행될 수 있다.
바이러스 벡터로는 상기한 바와 같이 원하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자의 발현을 지시하는 프로모터를 포함하는 것들이 포함된다. 다양한 프로모터는 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있으며, 이로는, 예컨대 MoMLVLTR; RSVLTR (예컨대, 문헌들[Gorman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982]); 프렌드 MuLV LTR; 아데노바이러스 프로모터 (문헌[Ohno 등, Science 265:781-784, 1994]); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 프로모터/인핸서; 파르보바이러스 후기 프로모터 (문헌[Koering 등, Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994]); 헤르페스 TK 프로모터 (예컨대, 문헌[McKnight, Cell 31:355, 1982]); SV40 프로모터 (예컨대, SV40 초기 프로모터 (문헌[Benoist 등, Nature 290:304, 1981]); 메탈로티오네인 IIa 유전자 인핸서/프로모터; 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 (문헌[Hamer 등, J Molec. Appl. Genet. 1:273, 1982]); 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터 (일반적으로, 문헌들[Etcheverry, "Expression of Engineered Protein in Mammallian Cell Culture," Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등 (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]); 사이토메갈로바이러스 최조기 (immediate early) 프로모터, 및 사이토메갈로 바이러스 최후기 (immediate late) 프로모터가 포함된다. 다르게는, 원핵 프로모터, 예컨대 박테리오파지 T3 RNA 중합효소 프로모터는 원핵 프로모터가 진핵프로모터에 의해 조절되는 경우 포유동물 세포에서 TGF-베타 결합-단백질 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다 (문헌들[Zhou 등, Mol. Cell. Biol. 10:4529, 1990; Kaufman 등, Nucl. Acids Res. 19:4485, 1991]).
본 발명의 매우 바람직한 실시태양에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터가다 (문헌[예컨대, WO91/02805; EP 0,415,731; 및 WO90/07936]). 그러한 적절한 조직 특이적 프로모터의 대표적인 예로는, 신경 특이적 에놀라아제 프로모터, 혈소판 유도된 성장 인자 베타 프로모터, 골형성 단백질 프로모터, 인간 알파1-키마에린 프로모터, 시냅신 I 프로모터 및 시냅신 II 프로모터가 포함된다. 상기한 프로모터에 부가하여, 기타 바이러스-특이적 프로모터 (예컨대, 레트로바이러스 프로모터 (HIV 프로모터와 같은 다른 것뿐만 아니라 상기한 것 포함), 간염, 헤르페스 (예컨대, EBV), 및 박테리아, 곰팡이 또는 기생충 (예컨대, 말라리아)-특이적 프로모터가, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 또는 기생충에 감염된 특정 세포 또는 조직을 표적으로 하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위해 적절한 포유류 세포로는 특히 COS, CHO, SaOS, 뼈육종, KS483, MG-63, 1차 뼈모세포, 및 인간 또는 포유류 골수 기질이 포함된다. 추가의 포유류 숙주 세포로는 아프리칸 그린 원숭이 신장세포 (Vero; ATCC CRL 1587), 인간 태아 신장 세포 (293-HEK; ATCC CRL 1573), 유아 햄스터 신장 세포 (BHK-21; ATCC CRL 8544), 개 신장 세포 (MDCK; ATCC CCL 34), 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61), 래트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 래트 간암 세포 (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-형질전환된 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐 태아 세포 (NH-3T3; ATCC CRL 1658)가 포함된다.
본 발명을 수행하는데 사용하기 위한 포유류 발현 벡터로는 클로닝된 유전자 또는 cDNA의 전사를 지시할 수 있는 프로모터가 포함될 것이다. 바람직한 프로모터로는 바이러스 프로모터와 세포 프로모터가 포함된다. 뼈 특이적 프로모터로는 뼈 시알로단백질에 대한 프로모터 및 오스테오칼신에 대한 프로모터가 포함된다. 바이어스 프로모터로는, 사이토메갈로바이러스 중간 초기 프로모터 (문헌[Boshart 등, Cell 41:521-530, 1985]), 사이토메갈로바이러스 중간 후기 프로모터, SV40 프로모터 (문헌[Subramani 등, Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981]), MMTV LTR, RSV LTR, 메탈로티오네인-1, 아데노바이러스 Ela가 포함된다. 세포 프로모터로는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터 (문헌[Palmiter 등, 미국 특허 4,579,821]), 마우스 VK 프로모터 (문헌들[Bergman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983; Grant 등, Nucleic Acids Res. 15:5496, 1987]) 및 마우스 VH 프로모터 (문헌[Loh 등, Cell 33:85-93, 1983])가 포함된다. 프로모터의 선택은, 적어도 일부는 트랜스펙션될 수용자 세포 라인 또는 원하는 발현수준에 좌우될 것이다.
그러한 발현 벡터는 프로모터로부터는 다운스트림 (downstream) 쪽에 위치하고 관심있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열로부터는 업스트림 (upstream) 쪽에 위치한 한 세트의 RNA 스플라이스 자리를 함유할 수도 있다. 바람직한 RNA 스플라이스 자리는 아데노바이러스 및(또는) 면역글로불린 유전자로부터 얻어질 수 있다. 또한, 발현 벡터에는, 관심있는 코딩 서열의 다운스트림에 위치된 폴리아데닐화 신호가 함유된다. 적절한 폴리아데닐화 신호로는 SV40 (문헌[Kaufman 및 Sharp, ibid.])로부터의 초기 또는 후기 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 E1B 영역으로부터의 폴리아데닐화 신호 및 인간 성장 호르몬 유전자 터미네이터 (DeNoto 등, Nucleic Acids Res. 9:3719-3730, 1981)가 포함된다. 상기 발현 벡터로는 프로모터와 RNA 스플라이스 자리사이에 위치한, 아데노바이러스 2 트리파르티트 리더와 같은 비코딩 바이러스 리더 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 벡터는 또한 SV40 인핸서와 같은 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 아데노바이러스 VA RNA을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 적절한 발현 벡터는 상업 원료 (예컨대, Stratagene, La Jolla, California)로부터 수득될 수 있다.
클로닝된 DNA 서열을 포함하는 벡터 구조체는, 예컨대 리포좀-매개 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 매개 트랜스펙션 (문헌들[Wigler 등, Cell 14:725, 1978; Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham 및 Van der Eb, Virology 52:456, 1973]), 전기 천공 (문헌[Neumann 등, EMBO J. 1:841-845, 1982]), 또는 DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션 (문헌[Ausubel 등 (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987]); 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 원형질체 융합-매개 트랜스펙션 (문헌[Sambrook 등, supra])에 의해 배양된 포유류 세포안으로 도입될 수 있다. 나벡터 구조체 (naked vector)도 또한 포유 동물 (또는 다른 동물)의 근육에 주입후 근육 세포 또는 다른 적절한 세포에 의해 섭취될 수도 있다. 클로닝된 DNA를 함유하는 벡터로 안정적으로 트랜스펙션된 세포를 확인하기 위해, 선택가능 표지가 일반적으로 관심있는 cDNA 또는 유전자와 함께 세포로 도입된다. 배양된 포유류 세포에 사용하기 위한 바람직한 선택가능 표지로는, 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 저항성을 부여하는 유전자가 포함된다. 상기 선택가능 표지는 증폭성 선택가능 표지일 수 있다. 바람직한 증폭성 선택가능 표지는 DHFR 유전자 및 네오마이신 저항성 유전자이다. 선택가능 표지는 문헌[Thilly, Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Massachusetts]에 의해 검토되었다.
적절한 벡터를 함유하는 포유류 세포는 일정시간, 통상적으로 1 내지 2일의 기간동안 성장하게 하여 관심있는 DNA 서열(들)의 발현을 개시하게 한다. 약물 선택은 이어서 적용되어 안정한 방식으로 선택가능 표지를 발현하고 있는 세포의 성장을 위해 선택한다. 증폭성, 선택가능 표지로 트랜스펙션된 세포에 대해서는, 약물 농도를 단계적 방식으로 증가시켜 클로닝된 서열의 카피수가 증가된 것을 선택할 수 있고, 이로써 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 원하는 수준 또는 형태에 관심있는 단백질의 제조를 위해 도입된 서열을 발현하는 세포가 선택되고 스크리닝된다. 이들 기준을 만족하는 세포는 이어서 클로닝되고 생산을 위해 스케일업된다.
당업계에서 공지된 다수의 곤충 숙주 세포도 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 예컨대, 곤충 세포에서 이종유래 DNA 서열을 발현하기 위한 벡터로서 바쿨로바이러스가 사용될 수 있다 (문헌[Atkinson 등, Pestic. Sci. 28:215-224 (1990)]). 상기 바쿨로바이러스 시스템은 곤충 세포내로, 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 클로닝된 TGF-베타 결합-단백질을 도입하기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 적절한 발현 벡터는 오토그래파 캘리포니카 (Autographa californica) 다중 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcMNPV)에 기초하고, 이는 드로소필라 (Drosophila) 열충격 단백질 (hsp) 70 프로모터, 오토그래파 캘리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스 최조기 유전자 프로모터 (immediate-early; ie-1), 및 지연조기 (delayed early) 39K 프로모터, 바쿨로바이러스 p10 프로모터, 및 드로소필라 (Drosophila) 메탈로티오네인 프로모터와 같은 공지된 프로모터를 함유한다. 적절한 곤충 숙주 세포로는, IPLB-Sf-21로부터 유도된 세포 라인, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 푸팔 난소 세포 라인, 예컨대 Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf2lAE, 및 Sf21 (인비트로젠 코포레이션; 캘리포니아주 산디에고 소재), 및 드로소필라 슈나이더-2 세포가 포함된다. 바쿨로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 제조하기 위해 확립된 기술은 문헌들[Bailey 등, "Manipulation of Baculovirus Vectors," Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991); Patel 등, "The baculovirus expression system" DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover 등 (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995); Ausubel (1995) pages 16-37 내지 16-57; Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995); 및 Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등 (eds.), pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]에 기재되어 있다.
다르게는, 다양한 식물 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 아그로박테리움 리조제네스 (Agrobacterium rhizogenes)(문헌[Sinkar 등 J Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987])와 같은 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 유용할 수 있다. 발현 벡터는 또한, 식물 원형질체, 완전 식물 조직, 또는 단리된 식물 세포에 도입될 수 있다. 식물 조직 배양의 일반적인 방법은, 예컨대, 문헌[Miki 등, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 등 (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993)]에 제공된다.
본 발명의 관련 실시태양에서, 본 발명의 단백질은, 그의 배아세포 및 체세포가 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 유전자의 발현에 대해 효과적인 프로모터와 작동가능하게 연결된 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있다. 다르게는, 유사한 방식으로, 원하는 유전자가 없는 (예컨대 "녹아웃" 마우스)트랜스제닉 동물이 준비될 수 있다. 그러한 트랜스제닉은 다양한 비인간 동물 (마우스, 래트, 토끼, 양, 개, 염소 및 돼지 포함)에서 제조될 수 있다 (문헌들[Hammer 등, Nature 315:680-683, 1985; Palmiter 등, Science 222:809-814, 1983; Brinster 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985; Palmiter 및 Brinster, Cell 41:343-345, 1985; 및 미국 특허들 5,175,383, 5,087,571, 4,736,866, 5,387,742, 5,347,075, 5,221,778, 및 5,175,384] 참조). 간략하게, 발현 벡터 (적절하게 위치한 발현 조절 서열과 함께 발현될 핵산 분자를 포함)는 수정란의 전핵에, 예컨대 마이크로주입에 의해 도입된다. 주입된 DNA의 통합은 조직 샘플로부터 DNA의 얼룩 분석에 의해 검출된다. 도입된 DNA가, 동물의 후손에게 전달되도록 동물의 생식계열안에 혼입되는 것이 바람직하다. 조직-특지적 발현이 조직-특이적 프로모터의 사용을 통해, 또는 유발가능 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 유전자 프로모터 (문헌[Palmiter 등, 1983, supra], 트랜스유전자의 발현이 조절되게 함)의 사용을 통해 달성될 수 있다.
단백질은 특히, 적절한 숙주 및 벡터 시스템을 배양하여 본 발명의 재조합 번역 생성물을 생성함으로써 단리될 수 있다. 그러한 세포 라인으로부터의 상청액, 또는 단백질 봉입체, 또는 단백질이 상청액으로 분비되지 않은 전체 세포는 이어서 원하는 단백질을 단리하기 위해 다양한 정제 단계에 의해 처리될 수 있다. 예컨대, 상기 상청액은 시판중인 단백질 농축 필터, 예컨대 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포아 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 우선 농축될 수 있다. 농축에 이어서, 상기 농축액을 친화도 매트릭스 (예컨대, 적절한 지지체에 결합된 특정 항체)와 같은 적절한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 다르게는, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 또는 크기배제 매트릭스가 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 또다른 대체물로서, 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계가 단백질을 더 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 단백질을 단리하는 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 순도는 쿠마시 블루 스테이닝 또는 실버 스테이닝 후의 SDS-PAGE 분석에 의해 결정될 수 있다.
포유류 세포 시스템에 의해 제조된 이종 단백질을 발현하고 회수하는 일반적인 방법은, 예컨대 문헌[Etcheverry,"Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등 (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)에 의해 제공된다. 박테리아 시스템에 의해 생성된 단백질을 회수하는 표준 기술은 예컨대, 문헌[Grisshammer 등,"Purification of over- produced proteins from E. coli cells," DNA Cloning 2 : Expression Systems, 2nd Edition, Glover 등 (eds. ), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)]에 의해 제공된다. 바쿨로바이러스 시스템으로부터 재조합 단백질을 단리하기 위한 확립된 방법은 문헌[Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. , 1995)]에 기재되어 있다.
더욱 일반적으로는 TGF-베타 결합-단백질은 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 등과 같은 표준 기술에 의해 단리될 수 있다. TGF-베타 결합-단백질 단리 및 정제에서의 추가적인 변형은 당업계의 당업자에 의해 고안될 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 바와 같이 수득된 항-TGF-베타 결합-단백질 항체는 면역친화도 정제에 의해 대량의 단백질을 단리하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체의 정제는 본원에 추가로 기재된다.
검출가능한 표지
검출가능 표지는 폴리펩티드 (그의 항체 또는 단편 포함) 또는 폴리뉴클레오티드에 컨쥬케이션되어 진단에 유용한 분자를 제공할 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능 표지의 예로는, 킬레이터, 광활성 제제, 방사성 동위원소, 형광 제제, 상자성 이온, 효소, 및 기타 표지 잔기가 포함된다. 상기한 TGF 결합 단백질 또는 후보 분자에 특이적으로 결합하는 TGF 결합 단백질 또는 항체는, 예컨대, 형광 분자, 독소, 및 방사선핵종을 포함하는 다양한 화합물로 표지될 수 있다. 형광 분자의 대표적인 예로는, 형광물질, 피코빌리 (Phycobili) 단백질, 예컨대 피코에리트린, 로다민, 텍사스 레드, 및 루시퍼라제가 포함된다. 독소의 대표적인 예로는, 리신, 아브린 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 억새풀 항바이러스 단백질, 트리틴, 쉬젤라 (Shigella) 독소, 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 A가 포함된다. 방사성 핵종의 대표적인 예로는, Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 및 Bi-212가 포함된다. 추가로, 상기한 항체는 표지될 수도 있고 또는 리간드 결합쌍의 한쪽 파트너에 컨쥬케이션될 수도 있다. 대표적인 예로는, 아비딘-비오틴, 스트렙타비딘-비오틴, 및 리보플라빈-리보플라빈 결합 단백질이 포함된다.
상기한 대표적인 표지로 본원에 기재한 분자를 표지 또는 컨쥬케이션하는 방법은 당업계의 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다 (문헌들[Trichothecene antibody Conjugate, 미국 특허 4,744,981; Antibody Conjugate, 미국 특허 5,106,951; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, 미국 특허 4,018,884; Metal Radionuclide Labeled Protein for Diagnosis and Therapy, 미국 특허 4,897,255; Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, 미국 특허 4,988,496; Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; Wilchek 및 Bayer, "The Abidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171:1-32, 1988]참조). 면역컨쥬케이트는 항체 (예컨대 항-TGF-베타 결합 단백질 항체) 또는 이들의 항체 단편, 및 검출가능한 표지를 포함하는 조성물이다. 바람직하게는, 상기 면역컨쥬케이트의 항체 잔기는 특이적으로 컨쥬케이션전과 같이 컨쥬케이션후에 동일하거나 약간 감소된 결합 친화도를 갖는 그의 인지체 항원에 결합한다.
제약 조성물
상기한 바와 같이, 본 발명은 또한 다양한 제약 조성물을 제공하며, 이는 TGF-베타 패밀리의 구성원에 TGF-베타 결합-단백질의 결합을 억제하는 상기 분자를 제약학적 또는 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 적절한 담체는 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있다. 치료 용도용 담체는 잘 공지되어 있으며, 예컨대 문헌 [Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro ed. (1985))]에 기재되어 있다. 일반적으로, 그러한 담체는 사용된 투약량 및 농도에서 환자에 비독성이어야 한다. 보통, 그러한 조성물의 제조는 치료제제와, 완충액; 아스코르빈산, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드와 같은 항산화제; 단백질; 아미노산; 말토오스, 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 글루타티온; 및 다른 안정화제 및 부형제를 배합하는 것을 수반한다. 중성 완충화 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 예시적인 희석제이다. 다르게는, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 조제될 수 있다.
일반적으로, 담체의 타입은 투여 방식에 기초하여 선택된다. 제약 조성물은 투여의 적절한 임의의 방식에 대해 조제될 수 있는데, 이에는 예컨대, 국소, 경구, 비강, 수막강, 직장, 질, 설하 또는 비경구적 투여, 예컨대 피하, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면체내, 관입구내, 또는 요도내 주사 또는 주입이 포함된다. 제약 조성물 (예컨대, 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한)이 액체 (예컨대, 엘릭시르, 시럽, 용액, 유화액 또는 현탁액)의 형태일 수 있다. 액체 제약 조성물은, 예컨대 이하의 것을 포함할 수 있다: 주사용 수, 식염수 용액 (바람직하게는 생리 식염수), 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 살균된 희석제; 항박테리아 제제; 항산화제; 킬레이트화제; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장력의 조절을 위한 제제. 비경구적 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰퓰, 1회용 주사기 또는 다투약 바이알에 동봉될 수 있다. 생리 식염수의 사용이 바람직하고, 주입가능한 제약 조성물은 바람직하게는 살균된다.
본원에 기재된 조성물은 지속 방출을 위해 제제화될 수 있다 (즉, 투여후 화합물을 느리게 방출하는 캡슐 또는 스펀지와 같은 제형). 그러한 조성물은 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 예컨대, 경구, 직장 또는 피하 이식, 또는 원하는 표적 부위에의 이식에 의해 투여될 수 있다. 지속 방출 제제는 속도 조절 멤브래인에 의해 둘러싸인 저장소에 함유되고(되거나) 담체 매트릭스에 분산된 제제를 함유할 수 있다. 그러한 제제에 사용하기 위한 담체는 생적합성이고, 또한 생분해성일 수 있다: 바람직하게는 상기 제제는 상대적으로 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 지속 방출 제형에 함유된 활성 화합물의 양은, 이식 부위, 방출의 속도 및 예상 지속시간, 및 치료 또는 예방될 증상의 특징에 따라 좌우된다. 이러한 점에서 유용한 예시적인 담체로는, 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미세입자가 포함된다. 다른 예시적인 지연-방출 담체로는, 초분자 바이오벡터가 있으며, 이는 비액체 친수성 코어 (예컨대, 가교된 다당류 또는 올리고당류) 및 임의로 양쪽성 화합물 (예컨대, 인지질(문헌[미국 특허 5,151,254 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO/94/23701 및 WO 96/06638))을 포함하는 외측층을 포함한다.
또다른 예시적인 실시태양에서, 생분해성 마이크로스피어 (예컨대, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트)가 본 발명의 조성물용 담체로서 사용된다. 적절한 생분해성 마이크로스피어는, 예컨대, 미국 특허 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 및 5,942,252에 개시되어 있다. WO/99 40934와 상기 인용된 문헌에 기재된 변형된 간염 B 코어 단백질 담체 시스템도 또한 많은 용도에 유용할 것이다. 또다른 예시적인 담체/전달 시스템은 입자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용한다, 이는 US 5,928,647에 기재되어 있으며, 숙주에서의 I클래스-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있다.
또다른 예시적인 실시태양에서, 칼슘 포스페이트 코어 입자는 본 발명의 조성물에 대한 조절된 방출 매트릭스로서 또는 담체로서 사용된다. 예시적인 칼슘 포스페이트 입자는 예컨대 국제특허출원공개 WO/0046147에 개시되어 있다.
항-SOST 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및(또는) 조정제 (폴리펩티드 및(또는) 조정제가 그 자리에서 (in-situ)로 생성도록)를 포함하는 제약 조성물에 대해, 상기 폴리뉴클레오티드는 핵산, 및 박테리아, 바이러스 및 포유류 발현시스템을 포함하는 당업자에 공지된 다양한 전달 시스템에 존재할 수 있다. DNA를 그러한 발현 시스템에 혼입시키기 위한 기술은 당업자에 공지되어 있다. DNA는 예컨대 문헌[Ulmer 등, Science 259:1745-1749, 1993; Cohen, Science 259:1691-1692, 1993에 의해 검토됨]에 기재되어 있는 바와 같이 "나형"(naked)일 수도 있다. 나형 DNA의 섭취는, 세포에 효과적으로 전송되는 생분해성 비드상에 DNA를 코팅함으로써 증가될 수 있다.
다양한 치료 요법 (경구, 비경구적, 정맥내, 비강내 및 근육내 투여 및 제형 포함)에 상기한 특정 조성물을 사용하기 위한 적절한 투약량 및 치료 요법의 개발은 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 예시의 일반적 목적으로 이하에 간단히 논의되어 있다.
특정 용도에서, 상기 개시된 제약 조성물은 동물에 경구 투여를 통해 전달될 수 있다. 따라서, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 조제될 수 있거나, 이들은 경성 또는 연성-쉘 젤라틴 캡슐에 동봉될 수 있거나, 또는 이들은 정제로 압축될 수도 있으며, 또는 이들은 식품의 음식에 직접 혼입될 수도 있다.
특정 환경에서, 본원에 개시된 제약 조성물을 비경구적, 정맥내, 근육내 또는 복강내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 그러한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 예컨대, 미국 특허 5,543,158; 미국 특허 5,641,515 및 미국 특허 5,399,363에 기재되어 있다. 특정 실시태양에서, 유리 염기 또는 제약학적 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액이 계면활성제(예컨대, 히드록시프로필셀룰로오스)와 적절히 혼합되어 물에서 제조될 수 있다. 분산액도 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 통상적인 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로 미생물의 성장을 예방하기 위한 보존제를 함유할 것이다.
주입 용도에 적절한 예시적인 제약학적 형태로는, 살균된 수용액 또는 분산액 및 살균 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 살균된 분말(예컨대미국 특허 5,466,468)이 포함된다. 모든 경우에, 상기 형태는 살균되어야 하며, 주사성이 용이하도록 하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관조건하에서 안정적이어야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아와 곰팜이의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 상기 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및(또는) 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성이, 예컨대, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구된 입자 크기를 유지함으로써, 및(또는) 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 촉진될 수 있으며, 그 예로는, 파라벤스, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티머로살 등이 있다. 많은 경우, 예컨대, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주입가능한 조성물의 연장된 흡수는, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물에 사용함으로써 얻어질 수 있다.
일실시태양에서, 수용액에서 비경구 투여를 위해, 상기 용액은 필요한 경우 적절히 완충화되어야 하며, 상기 액체 희석제는 우선 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장화되어야 한다. 이들 특정 수용액은 특히, 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 투여에 대해 적절하다. 이러한 관계에서, 사용될 수 있는 살균된 수성 매질은 본 개시에 비추어 당업자에게 공개될 것이다. 예컨대, 일 투약량은 1 mL의 등장성 NaCl 용액에 용해될 수 있고 예정된 주입부위에 주입되거나 1000 mL의 피하세척 유체 (hypodermoclysis fluid)에 첨가된다 (문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pp. 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투약량에서의 약간의 변화는 치료될 환자의 상태에 따라 필수적으로 좌우되어 일어날 것이다. 또한, 인간 투여에 대해서는, 제제는 물론 바람직하게는 생물학적 표준의 FDA 기관에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안정성 및 순도 기준을 만족할 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 조제될 수 있다. 예시적인 제약학적-허용되는 염으로는 산 첨가염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)이 포함되고, 이는 무기산 (예컨대, 염산, 인산) 또는 유기산 (아세트산, 옥산산, 타르타르산, 만델산 등)으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염도 또한 무기 염기 (예컨대, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화철) 및 유기 염기 (예컨대, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)으로부터 유도될 수 있다. 조제시, 용액은 투약 제제와 호환성인 방식으로, 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다.
담체는 임의의 그리고 모든 용액, 분산액, 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 더 포함할 수 있다. 그러한 제약학적 활성 물질용 매질 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 호환성이 떨어지는 경우를 제외하고는, 치료 조성물에의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분도 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 표현 "제약학적-허용되는"은 인간에 투여될 때 알레르기 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 분자 및 조성물을 지칭한다.
특정 실시태양에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 비히클 등이 본 발명의 조성물이 적절한 숙주 세포/생물에 도입되기 위해 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노구 또는 나노입자 등에 캡슐화 전달을 위해 조제될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 조성물은 공유적으로 또는 비공유적으로 그러한 담체 비히클의 표면에 결합될 수 있다.
잠재 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀형 제제의 조제 및 사용은 당업계의 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다 (본원에 그 전체가 참조로 포함된 문헌들[Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21,1998 ; Takakura, Nippon Rinsho 56(3): 691-95, 1998; Chandran 등, Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; 미국 특허 5,567,434; 미국 특허 5,552,157; 미국 특허 5,565,213; 미국 특허 5,738,868 및 미국 특허 5,795,587]참조). 리포좀은 기타 과정에 의해 트랜스펙션되기가 정상적으로는 어려운 다수의 세포타입, 예컨대 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물 및 PC 12 세포등과 성공적으로 사용되어 왔다 (문헌[Renneisen 등, J. Biol. Chem. 265(27):16337-42, 1990; Muller 등, DNA Cell Biol. 9(3):221-29, 1990]). 또한, 리포좀은 바이러스계 전달 시스템에 전형적인 DNA 길이 제한이 없다. 리포좀은 유전자, 다양한 약물, 방사선치료제제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 효과기 등을 다양한 배양된 세포 라인 및 동물에 도입하기 위해 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀의 사용은 전신 전달후 자가면역 반응 또는 용인가능하지 않은 독성을 수반하지 않는 것으로 나타난다. 특정 실시태양에서, 리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 다중라멜라 동심형 이층 소포를 형성한다 (또한 다중라멜라 소포(MLVs)로도 지칭됨).
다르게는, 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제약학적 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 반복재현가능한 방식으로 화합물을 포함할 수 있다 (문헌[Quintanar-Guerrero 등, Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12):1113-28, 1998]). 세포간 중합체 오버로딩으로 인한 부작용을 방지하기 위해, 그러한 초미세 입자 (약 0.1 ㎛크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 고안될 수 있다. 그러한 입자는 예컨대 문헌[Couvreur 등, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1):1-20, 1988; zur Muhlen 등, Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2):149-55, 1998; Zambaux 등, J. Controlled Release 50(1-3):31-40, 1998; 및 미국 특허 5,145,684]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 제약 조성물은, 그러한 제약 조성물의 사용에 관한 지침을 제공하는 포장 재료와 함께 용기에 위치될 수 있다. 일반적으로, 그러한 지침은 특정 실시태양에서뿐만 아니라 시약 농도, 제약 조성물을 재구성하기 위해 필요할 수 있는 부형제 또는 희석제 (물, 식염수 또는 PBS) 성분의 상대량을 기재하는 유형적 표현을 포함할 것이다.
치료 방법
본 발명은 또한, 뼈의 미네랄 함량 및 미네랄 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 간략히, 다양한 증상이 골 미네랄 함량의 손실을 야기하며, 이들로는, 예컨대 질병, 유전적 소인, 뼈의 사용 결핍을 야기하는 사고 (예컨대, 골절), 뼈재흡수에 영향을 주거나 뼈형성 세포를 죽이는 치료, 및 정상적 노화가 포함된다. TGF-베타 결합-단백질의 TGF-베타 패밀리 구성원에의 결합을 억제하는 상기한 분자의 사용을 통해, 그러한 증상들은 치료 또는 예방될 수 있다. 상기한 바와 같이, 골 미네랄 함량이 선택된 부위에 통계학적으로 상당한 방식으로 증가한 경우, 골 미네랄 함량이 증가한 것으로 이해된다.
골 미네랄 함량의 손실을 야기하는 다양한 증상은 본원에 기재된 분자로 치료될 수 있다. 그러한 증상을 갖는 환자는 공지된 기술을 사용하여 임상 진단을 통해 확인될 수 있다 (문헌[Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, Inc.]). 치료될 수 있는 질병의 대표적인 예로는, 뼈의 성장 또는 발달이 비정상인 형성이상이 포함된다. 그러한 증상의 대표적인 예로는, 연골무형성, 쇄골두개이골증, 골내연골종증, 섬유형성이상, 고쉐병, 저인산혈성구룻병, 마르팡 증후군, 다발성 유전성 외골증, 신경섬유종증, 불완전골생성증, 골화석증, 골반문증, 경화성 병변, 골절, 치주병, 가성관절증, 및 화농성 골수염이 포함된다.
치료 또는 예방될 수 있는 다른 증상으로는, 골감소증의 다양한 원인이 포함된다 (즉, 유아기에서 피크 골 미네랄 함량 미만의 골 미네랄 함량 또는 밀도의 표준 편차이상을 야기하는 증상). 그러한 증상의 대표적인 예로는, 빈혈 상태, 스테로이드에 의해 야기되는 증상, 헤파린에 의해 야기되는 증상, 골수 장애, 괴혈병, 영양실조, 칼슘 결핍, 원인불명 골다공증, 선천성 골 감소증 또는 골다공증, 알코올 중독, 만성 간질환, 노인성치매, 폐경후 상태, 희발월경, 무월경, 임신, 당뇨병, 갑상선기능항진증, 쿠싱병, 말단거대증, 생식샘기능저하증, 부동화 또는 남용, 반사교감신경 증후군, 일과성 영역적 골다공증, 및 골연화증이 포함된다.
본 발명의 일실시태양에서, 골 미네랄 함량 또는 밀도는 온혈동물에 치료적 유효량의, SOST 폴리펩티드가 TGF-베타 패밀리 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자를 투여함으로써 증가될 수 있다. 치료될 수 있는 온혈 동물의 예로는, 척추동물 및 포유동물, 예컨대, 인간, 말, 소, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트 및 마우스 등의 모두가 포함된다. 치료 분자의 대표적인 예로는, 상기한 리보자임, 리보자임 유전자, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 항체가 포함된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 골 밀도를 증가시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은,
SOST가 TGF-베타 패밀리 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자의 발현을 지시하는 벡터를 뼈로 향하는 세포로 도입하는 단계; 및
상기 벡터함유 세포를 온혈 동물에 투여하는 단계
를 포함한다. 간단하게, 뼈로 향하는 세포는 환자의 뼈(예컨대, CD34+, 뼈모세포, 뼈세포 등과 같은 골수로부터 얻어진 세포), 말초혈액, 또는 배양물로부터 직접 수득할 수 있다. 적절한 벡터의 대표적인 예로는, 바이러스 벡터, 예컨대 헤르페스 바이러스 벡터 (예컨대, 미국 특허 5,288,641); 아데노바이러스 벡터 (예컨대, WO 94/26914, WO 93/9191; 문헌들[Kolls 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11498-502, 1993; Guzman 등, Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman 등, Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner 등, Cell 75(2):207-216,1993 ; Li 등, Hum. Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud 등, Eur.J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993; Vincent 등, Nat. Genet. 5(2):130-134, 1993 ; Jaffe 등., Nat. Genet. 1(5):372-378, 1992; 및 Levrero등, Gene 101(2):195-202, 1991] 참조); 아데노관련 바이러스 벡터 (문헌들[WO 95/13365; Flotte 등, PNAS 90(22):10613-10617, 1993]); 바쿨로바이러스 벡터; 파르보바이러스 벡터 (문헌[Koering 등, Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994]); 폭스 바이러스 벡터 (문헌[Panicali 및 Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931, 1982; 및 Ozaki 등, Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2):653-660, 1993]), 및 레트로바이러스 (예컨대, 문헌들[EP 0,415,73 1; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 미국 특허 5,219,740; WO 93/11230; WO 93/10218])이 포함된다. 상이한 바이러스 또는 비바이러스 소스로부터 상이한 요소 (예컨대, 프로모터, 외막 (envelope) 서열 등)의 혼합물을 함유하는 바이러스 벡터가 마찬가지로 구성될 수 있다. 다양한 실시태양에서, 바이러스 벡터 자체 또는 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자는 후술하는 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 기타 실시태양에서, SOST 폴리펩티드가 TGF-베타 패밀리 자체의 구성원에 결합하는 것을 억제하는 분자를 코딩하는 핵산 분자는 다양한 기술에 의해 투여될 수 있으며, 그 예로는, 폴리 L-리신 DNA 복합체와 컨쥬게이션된 아시알로오소무코이드 (ASOR)의 투여 (문헌[Cristano 등, PNAS 92122-92126, 1993]); 죽은 아데노바이러스에 연결된 DNA (문헌[Curiel 등, Hum. Gene Ther. 3(2):147-154, 1992]); 시토펙틴-매개 도입 (문헌[DMRIE-DOPE, Vical, California]); 직접 DNA 주입 (문헌[Acsadi 등, Nature 352:815-818, 1991]); DNA 리간드 (문헌[Wu 등, J of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989]); 지질감염 (문헌[Felgner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989]); 리포좀 (문헌[Pickering 등, Circ. 89(1):13-21, 1994; 및 Wang 등, PNAS 84:7851-7855, 1987]); 미세 발사 충격 (문헌[Williams 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730, 1991]); 및 단백질 자체를 코딩하는 핵산의 직접 전달 (문헌[Vile 및 Hart, Cancer Res. 53:38603864, 1993]), 또는 PEG핵산 복합체의 사용이 포함된다.
증가된 골 미네랄 함량의 측정은 X-선의 사용을 통해 직접 측정할 수 있고 (예컨대, Dual Energy X-ray Absorptometry 또는 "DEXA"), 또는 뼈 전환 표지(뼈모세포 특이적 알칼리성 포스파타제, 오스테오칼신 (osteocalcin), 타입 1 프로콜라겐 C' 프로펩티드 (PICP), 및 토탈 알칼리성 포스파타제 (문헌[Cornier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243 (1995)))를 통해 추론에 의해 측정할 수 있거나, 또는 뼈 재흡수의 표지 (이에 제한되지는 않으나, 피리디놀린, 데옥시피리디놀린, N-텔로펩티드, 방광 히드록시프롤린, 플라즈마 타르트레이트-저항성 산 포스파타제, 및 갈락토실 히드록시리신 (문헌[Cornier, id.))에 의해 측정할 수 있다. 뼈 질량의 양은 또한 다른 방법을 사용하거나 신체 중량으로부터 계산될 수 있다 (문헌[Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5:177-181, 1984]).
투여의 양 및 빈도가 물론 치료될 징조, 원하는 반응, 환자의 증상 등의 특성 및 경중도와 같은 인자에 좌우될 것이라는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 통상적으로, 상기 조성물은 상기한 바와 같이 다양한 기술에 의해 투여될 수 있다.
다음 실시예는 도시의 방식으로 제공되고 제한하는 방식은 아니다.
실시예 1
스클레로스틴 코어 영역의 모델링
상동성 인식 기술 (예컨대, PSI-BLAST (문헌[Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)]), FUGUE (문헌[Shi 등, J. Mol. Biol. 310:243-57 (2001)])은 SOST의 코어 영역 (SOST_Core)이 시스틴-매듭 폴드를 조절한다고 제안하였다. FUGUE는 서열과 구조 간의 상동성을 검출하기 위한 민감한 방법이다. 그의 실험적으로 측정된 3D 구조가 공지된 인간 융모성 고나도트로핀 β (hCG-β)가 FUGUE (Shi 등, supra)에 의해 가장 가까운 상동체 SOST_코어로 인식되었다. 따라서, hCG-β를 SOST_코어에 대한 3D 모델을 구축하기 위한 구조적 원형으로서 사용하였다.
SOST_코어와 그의 근사한 상동체의 정렬이 도 1에 도시되어 있다. 상기 정렬에 도시된 상동체 중에서, 단지 hCG-β (CGHB)만이 3D 구조가 알려져 있었다. SOST_코어와 hCG-β사이의 서열 동일성은 대략 25%였다. 여덟개의 CYS 잔기를 패밀리 전체에 걸쳐 보존하여 SOST_코어와 hCG-β사이의 전체 구조적 유사성을 강조하였다. 세쌍의 시스틴 (1-5, 3-7, 4-8)이 디설파이드 결합 (도 1에서 실선으로 도시됨)을 "매듭" 형태로 형성하였고, 이는 시스틴-매듭 폴드 (fold)에 대한 특징이다. 도 1에서 점선으로 나타낸 추가의 디설파이드 결합 (2-6)은 이 패밀리에 유일하였고, 다른 시스틴-매듭 패밀리 (예컨대, TGF-β, BMP)로부터 단백질 패밀리에서 구별되었다.
SOST_코어는 PDB (문헌[Berman 등, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58(Pt 6 Ptl):899-907 (2002)]) 엔트리 1HCN을 사용하여 모델링하였고, hCG-β의 3D 구조 (문헌[Wu 등, Structure 2:545-58 (1994)])를 구조 원형으로 하였다. 모델을 모델러(MODELER, 문헌[Sali & Blundell, J. Mol. Biol. 234:779-815 (1993)])로 계산하였다. 가장 좋은 모델의 스냅샷을 도 2에 도시한다.
대부분의 시스틴-매듭 단백질은 이량체를 형성하는데, 이는 단량체에서 소수성 코어의 결핍으로 인한 것이다 (문헌[Scheufler 등, supra; Schlunegger 및 Grutter, J. Mol. Biol. 231:445-58 (1993)); Wu 등, supra]). SOST는 동일한 법칙을 따르고 동종이량체를 형성하여 안정성을 증가시키는 것으로 보인다. 이량화된 SOST_코어 영역에 대한 모델을 구성하는 것은 많은 어려움을 나타내는데, 이는 (1) SOST_코어와 hCG-β사이의 서열 유사성이 낮고 (25%); (2) 동종이량체 대신에, hCG-β는 hCG-α와 이종이량체를 형성하고; 그리고 (3) 단량체의 다수의 상이한 상대적 입체형태가 상이한 패밀리(예컨대, PDGF, TGF-β, 뉴트로핀, IL-17F, 고나도트로핀)로부터 이량화된 시스틴-매듭 단백질에서 관찰되었고, 이는 SOST의 이량체 입체형태가 hCG-α/β 이종이량체 입체형태와는 상당히 다를 수 있다는 것을 제안하기 때문이다. 모델을 구성함에 있어, hCG-α를 수동 조절과 결합하여 구조 중복기술을 사용하여 이종이량체 구조 (1HCN)으로부터 hCG-β으로 치환하였고, 이어서 SOST_코어 동종이량체 모델이 가성 hCG-β 동종이량체 구조에 따라 제조되었다. 최종 모델은 도 3에 도시된다.
실시예 2
SOST-BMP 상호작용 모델링
본 실시예는 BMP와 SOST사이의 상호작용과 연관된 BMP 상의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합부위의 단백질 모델링을 기재한다.
경쟁 연구결과는 BMP에 결합하기 위한 타입 I 및 타입 II 수용체 모두와 SOST가 경쟁한다는 것을 나타내었다. ELISA계 경쟁 검정법에서, BMP-6은 높은 친화도 (KD=3.4 nM)을 갖는 스클레로스틴-코팅된 표면(300 ng/웰)과 선택적으로 상호작용한다. BMP 수용체 IA (FC 융합 구조)의 증가량은 BMP-6 (11 nM) (IC50 = 114nM)에 결합하기 위한 스클레로스틴과 경쟁하였다. BMP 수용체의 10배 몰과량은 스클레로스틴의 BMP-6에 대한 결합을 약 50% 감소시키기에 충분하였다. 이러한 경쟁은 BMP 수용체 II-FC 융합 단백질 (IC50=36nM) 및 DAN (IC50=43nM)로 관찰되었다. 상기 검정법의 특이성은, 스클레로스틴과 r악티빈 R1B-FC 융합 단백질, BMP에 결합하지 않는 TGF-β 수용체 패밀리 사이의 BMP-6에 결합하기 위한 경쟁의 결여에 의해 나타내어졌다.
BMP 폴리펩티드상의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위는 맵핑하였고, 공간적으로 분리하였다 (문헌[Scheufler 등, supra; Innis 등, supra; Nickel 등, supra; Hart 등 supra]). 높은 친화도를 갖는 BMP에 결합하는 또다른 BMP 길항제인 노긴(Noggin)은 노긴의 N-말단부를 통해 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위에서 BMP와 접촉하였다 (문헌[Groppe 등, supra]). C-말단 근방의 코어 영역에서의 2개의 β-가닥도 타입 II 수용체 결합 부위에서 BMP와 접촉한다.
노긴과 SOST의 수동 조정 정렬은 두 폴리펩티드가 단백질의 N-말단 부분 및 코어 영역 간에 서열 유사성을 공유하고 있음을 나타낸다. 아미노산 서열 정렬은 도 4에 나타냈다. 특징적인 cys-매듭을 형성하는 시스테인 잔기는 노긴과 SOST 간 에 보존되어 있었다. 전체 서열 동일성은 24%였고, N-말단 결합 영역 내 (정렬 위치 1-45)에서의 서열 동일성은 33%였다. 노긴 N-말단 결합 영역 내의 2개의 잔기, 즉 정렬 위치 21의 Leu (L) 및 위치 23의 Glu (E)는 BMP 결합에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다 (Groppe et al., 상기 문헌). 두 잔기 모두 SOST에서도 보존되어 있었다. 코어 영역 내 (정렬 위치 131-228)에서의 서열 유사성은 약 20%였지만, cys-매듭 스캐폴드는 유지되어 있었고 충분한 수의 핵심 잔기들이 보존되어 있어, 노긴과 SOST 간의 상동성을 뒷받침하고 있다.
2개의 SOST 단량체가 어떻게 이량체화되는지도 이해하기 위해, 노긴 구조를 SOST와 비교했다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 노긴 구조는 N-말단 영역과 코어 영역 간의 링커가 두 영역을 연결하는 역할을 할 뿐만 아니라, 2개의 노긴 단량체 간의 이량체화 경계면 부분도 형성한다는 것을 시사하고 있다. 노긴과 SOST 간의 하나의 주요한 차이점은, N-말단 영역과 코어 영역 간의 링커가 SOST에서 훨씬 더 짧다는 점이다.
SOST의 C-말단 영역은 SOST 이량체화에서 역할을 할 수 있다. 노긴의 서열은 코어 영역으로 끝나지만, SOST는 여분의 C-말단 영역을 갖고 있다. 노긴 구조에서는, 디설파이드 결합이 2개의 노긴 단량체의 C-말단을 연결하고 있다. 따라서, SOST의 C-말단 영역은 2개의 단량체의 경계면에 인접하여 시작되고 이량체화에 기여할 수 있다. 또한, 2차 구조 예측에서는 SOST의 C-말단 영역의 일부 부분들이 나선형을 이루는 경향을 갖는 것으로 나타났다. SOST에서 이 영역은 아마도 나선-나선 팩킹을 통해 이량체화 활성의 원인이 될 수 있고, 이는 노긴에서 보다 긴 링 커의 기능을 모방한다. 노긴 구조와 SOST의 다른 차이점은, 정렬 위치 169-185의 SOST 코어 영역에서의 아미노산 삽입이었다 (도 4 참조). 이러한 삽입은 β-헤어핀을 펼치고, 이는 노긴 구조에서 이량체화 경계면을 향하고 있다 (도 5에서 C-말단 Cys 잔기 위 및 단량체 중간에 루프 영역으로 나타냄). 이러한 연장된 β-헤어핀은 SOST 이량체화에도 기여할 수 있다.
실시예 3
SOST 펩티드 면역원의 설계 및 제조
본 실시예에서는 동물을 면역화하고 BMP와 SOST 간의 상호작용을 차단하고 SOST 단량체의 이량체 형성을 방지하는 항체를 생성하는데 사용되는 SOST 펩티드 면역원의 설계에 대해 기술한다.
BMP 결합 단편
SOST와 노긴 간의 전체적인 유사성 및 2개의 폴리펩티드 N-말단 영역 간의 유사성은, SOST가 노긴과 유사한 방식으로 BMP와 상호작용할 수 있음을 시사하고 있다. 즉, SOST의 N-말단 영역은 BMP 상의 타입 I 및 타입 II 수용체 결합 부위 모두와 상호작용할 수 있고, 코어 영역의 일부 (도 4의 아미노산 정렬 위치 190-220)는 타입 II 수용체 결합 부위와 상호작용할 수 있어, 상기 SOST 영역에 특이적인 항체는 BMP의 SOST에 대한 결합을 차단하거나 손상시킬 수 있다.
래트 및 인간 SOST에 대한 상기 SOST 폴리펩티드 단편의 아미노산 서열을 아래에 제시했다.
SOST_N_링커: N-말단 영역 (코어 영역을 연결하는 짧은 링커를 포함한다)
Figure 112005073782073-PCT00001
SOST_코어_바인드 (Bind): 타입 II 수용체 결합 부위에서 BMP와 접촉할 가능성이 있는 코어 영역의 부분 (양쪽 말단에서 약간 연장되어 CYS 잔기 앵커를 포함):
Figure 112005073782073-PCT00002
SOST 이량체화 단편
SOST의 C-말단 영역은 SOST 동종이량체의 형성에 관련될 가능성이 있다 (실시예 2 참조). 연장된 β-헤어핀은 동종이량체 형성에도 역할을 할 수 있다. 상기 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 SOST 단량체의 이량체화를 방지하거나 손상시킬 수 있고, 이는 이어서 SOST와 BMP 간의 상호작용을 방해할 수 있다. 상기 영역에 상응하는 래트 및 인간 SOST의 폴리펩티드 단편은 다음과 같다.
SOST_C: C-말단 영역
Figure 112005073782073-PCT00003
SOST_코어_이량체: SOST 이량체화에 관련될 가능성이 있는 코어 영역의 부분 (양쪽 말단에서 약간 연장되어 Cys 잔기 앵커를 포함):
Figure 112005073782073-PCT00004
SOST N-말단에서의 BMP 결합 단편
BMP와 상호작용할 것 같은 SOST N-말단의 아미노산 잔기를 동정하기 위해, 노긴/BMP-7 복합체 구조 (단백질 데이터 뱅크 등록번호(Entry No): 1M4U) 및 아미노산 서열 정렬 (도 4 참조)에 기초하여 SOST의 핵심 N-말단 결합 영역 (도 4에서 정렬 위치 1-35)을 모델링했다. SOST의 모델은 도 6에 나타냈다. 비교 모델에서, SOST 서열의 정렬 위치 8 (화살표 및 수반된 텍스트 참조)의 페닐알라닌 (Phe, F)은 BMP 이량체 표면 상의 소수성 포켓 내로 돌출되어 있다. 이와 동일한 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 특징은 BMP 및 타입 I 수용체 복합체 구조에서 관찰되었는데 (Nickel et al., 상기 문헌), 여기서 수용체의 Phe85는 동일한 포켓 내에 들어맞고 (fit), 이것이 TGF-β 슈퍼패밀리 구성원 (예를 들어, TGF-β 패밀리, BMP 패밀리 등을 포함)에 대한 리간드-타입 I 수용체 인식의 핵심적인 특징이다. 모델에 따르면 프롤린 (Pro) 유도성 회전도 보존되었는데, 이는 N-말단 결합 단편이 BMP 이량체 표면을 따라 감기면서, 타입 I 수용체 결합 부위로부터 복합체의 다른쪽 상의 타입 II 수용체 결합 부위로 이동하도록 한다. 또한, 결합 단편의 카르복시 말단 근처에서 다른 Pro-유도성 회전도 보존되어 있는데, 이는 링커 영역을 연결한다. SOST와 BMP 간의 광범위한 접촉은 도 6에서도 명백하다.
펩티드 면역원
BMP 단백질과 접촉하는 것으로 예측된 SOST N-말단 영역을 포함하도록 펩티드를 설계했다. 펩티드 서열은 아래에 나타냈다. 동물을 면역화하기 위해 펩티드 서열이 중첩되도록 설계했고, 추가의 시스테인을 C-말단에 첨가하여 KLH에 대한 가교결합이 용이하도록 했다. 그 다음, 펩티드를 면역화에 사용했다. 면역원의 펩티드 서열은 다음과 같다.
Figure 112005073782073-PCT00005
Figure 112005073782073-PCT00006
BMP 단백질과 접촉하는 것으로 예측된 코어 영역의 아미노산 부분을 포함하도록 하기 펩티드를 설계했다. KLH에 컨쥬게이션시키기 위해 각 펩티드의 C-말단에 시스테인을 첨가했고, 컨쥬게이션된 펩티드를 면역화에 사용했다. 도킹 코어 N-말단 펩티드에서는, KLH와의 이중 컨쥬게이션을 피하기 위해 내부 시스테인을 세린으로 바꾸었다.
Figure 112005073782073-PCT00007
Figure 112005073782073-PCT00008
잠재적으로 상호작용하여 SOST 동종이량체를 형성하는 SOST 내의 두 영역은, 노긴에는 존재하지 않는 SOST 코어 영역을 갖는 아미노산을 포함한다. 이 서열을 포함하도록 설계된 인간 SOST 펩티드는, KLH에 컨쥬게이션된 C-말단 또는 N-말단 Cys를 가졌다. 래트 SOST 펩티드에 대해서는, 서열 (서열 31)의 카르복시 말단에 시스테인을 첨가했다. KLH 컨쥬게이션된 펩티드를 면역화에 사용했다.
Figure 112005073782073-PCT00009
잠재적으로 상호작용하여 SOST 동종이량체를 형성하는 SOST 내의 제2 영역은 C-말단 영역을 포함한다. 이 영역 내의 아미노산 서열을 포함하도록 펩티드 면역원을 설계했다 (이하 참조). KLH에 컨쥬게이션시키기 위해 C-말단에 시스테인 잔기를 첨가했고, 컨쥬게이션된 펩티드를 면역화에 사용했다.
Figure 112005073782073-PCT00010
실시예 4
항체의 TGF-베타 결합-단백질에 대한 결합을 검출하기 위한 검정법
본 실시예에서는 리간드, 예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편의 스클레로스틴에 대한 결합을 검출하기 위한 검정법에 대해 기술한다.
플래그 (FLAG)
Figure 112005073782073-PCT00011
-스클레로스틴 융합 단백질을, 제조자 (시그마 알드리치, 미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 제공되는 프로토콜 및 미국특허 제6,395,511호에 기술된 바와 같이 제조했다. 96 웰 미량역가 플레이트의 각 웰을 항-플래그
Figure 112005073782073-PCT00012
모노클로날 항체 (시그마 알드리치)로 코팅한 다음, PBS 중의 10% BSA로 블로킹했 다. 융합 단백질 (20 ng)을 100 ㎕의 PBS/0.2% BSA에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 96-웰 플레이트 상에서 흡착시켰다. 이 단백질 용액을 제거하고, 웰을 세척하여 결합하지 않은 융합 단백질을 제거했다. BMP, 예를 들어 BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7을 PBS/0.2% BSA에 희석하고, 10 pM 내지 500 nM의 농도 범위로 각 웰에 첨가했다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 결합 용액을 제거하고, 플레이트를 200 ㎕ 부피의 PBS/0.2% BSA로 3회 세척했다. BMP의 스클레로스틴에 대한 결합은 표준 ELISA 기술에 따라, 폴리클로날 항혈청 또는 BMP에 대해 특이적인 모노클로날 항체와 적절한 효소-컨쥬게이션된 제2단계 시약을 사용하여 검출했다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Mol Biol. Vol 2 11.2.1-11.2.22(1998)] 참조). 특이적인 결합은 총 결합에서 비특이적 결합을 빼서 계산하고, 리간드 프로그램을 사용하여 분석했다 (Munson and Podbard, Anal. Biochem. 107:220-39 (1980)).
스클레로스틴의 BMP에 대한 결합은 균일 시간분해(time resolved) 형광 검출에 의해서도 검출했다 (Mellor et al., J Biomol. Screening, 3:91-99 (1998)). 스클레로스틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 핵산 제작물 내의 인간 면역글로불린 불변 영역에 작동가능하게 연결시키고, 당 분야에 공지된 방법 및 본원에 기술된 방법에 따라 인간 Fc-스클레로스틴 융합 단백질으로서 발현시켰다. 이와 유사하게, BMP 리간드를 유전자 조작하고 BMP-마우스 Fc 융합 단백질로서 발현시켰다. 이 2가지의 융합 단백질을 함께 인큐베이션시키고, 문헌 [Mellor et al]에 기술된 바와 같이 검정법을 수행했다..
실시예 5
TGF-베타 패밀리 구성원의 TGF-베타 결합 단백질에 대한 결합을 억제하는 항체에 대한 스크리닝 검정법
본 실시예에서는 TGF-베타 패밀리 구성원의 스클레로스틴에 대한 결합을 억제하는 항체의 검출 방법에 대해 기술한다. BMP 농도를 그의 Kd (예를 들어, BlA코어 분석으로 측정된)에 고정시킨 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같이 ELISA를 수행했다. 또한, 항체 또는 항체의 라이브러리나 집합을 1 μM의 농도로 웰에 첨가했다. 항체를 실온에서 2시간 동안 BMP 및 스클레로스틴과 인큐베이션하고, 용액을 제거하여, 결합된 BMP를 기술한 바와 같이 정량했다 (실시예 4 참조). 항체 부재시 관찰된 BMP 결합의 40%를 억제하는 항체를 본 상호작용의 길항제로 간주했다. 적정 연구를 수행하여 이 항체의 억제 상수 및 TGF-베타 결합-단백질 결합 친화도에 대한 영향을 측정함으로써, 이 항체를 잠재적인 억제제로서 추가로 평가했다. 동정된 길항제에 대한 선택성 프로파일을 확립하기 위해, BMP 리간드 작용에 의해 좌우되는 검정법 (예를 들어, BMP/BMP 수용체 경쟁 연구)을 사용하여 비교 특이성 대조군 검정법도 수행할 수 있다.
실시예 6
TGF-베타 결합-단백질의 뼈 기질로의 국소화의 억제
니콜라스 (Nicolas)의 방법 (Calcif Tissue Int. 57:206-12(1995))의 변형을 사용하여, 뼈 기질 (히드록시아파타이트)로의 국소화 억제 평가를 수행했다. 간단 히 말하자면, 125I-표지된 TGF-베타 결합-단백질을 니콜라스 (상기 문헌)에 기술된 바와 같이 제조했다. 히드록시아파타이트를 폴리프로필렌 여과막 (폴리필트로닌크 (Polyfiltroninc), 메사추세츠주 웨이마우쓰)이 장착된 96-웰 미량역가 플레이트의 각 웰에 첨가했다. 그 다음, PBS 완충액 중의 0.2% 알부민에 희석한 TGF-베타 결합-단백질을 웰에 첨가했다. 기질을 함유하는 웰을 PBS 완충액 중의 0.2% 알부민으로 3회 세척했다. 0.3 M NaOH를 사용하여 흡착된 TGF-베타 결합-단백질을 용리한 다음, 정량했다.
TGF-베타 결합 단백질을 항체와 인큐베이션하고 혼합물을 상기 기술한 바와 같이 기질에 적용함으로써, 스클레로스틴 TGF-베타 결합 단백질의 히드록시아파타이트에 대한 결합을 억제하거나 손상시키는 항체 또는 기타 약물을 동정했다. 기질을 PBS 완충액 중의 0.2% 알부민으로 3회 세척했다. 흡착된 스클레로스틴을 0.3 M NaOH로 용리한 다음, 정량했다. 스클레로스틴의 히드록시아파타이트에 대한 결합 수준을 항체 부재시 관찰되는 결합 수준에 비해 40% 이상 억제하는 항체를, 뼈 국소화 억제제로 간주했다. 상기 항체를 용량 반응 연구 (dose response studies)에서 추가로 특징화하여, 억제 상수 및 TGF-베타 결합-단백질 결합 친화도에 대한 영향을 측정했다.
이상으로부터, 본 발명의 실시태양은 설명 목적으로 본 명세서에 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 영역에 벗어남이 없이 다양한 변화를 가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Celltech R & D, Inc. <120> ANTIBODIES SPECIFIC FOR SCLEROSTIN AND METHODS FOR INCREASING BONE MINERALIZATION <130> 60117-127 <140> <141> 2004-06-15 <160> 112 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 190 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr 20 25 30 Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu 35 40 45 Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg 50 55 60 Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu 65 70 75 80 Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile 85 90 95 Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile 100 105 110 Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly 115 120 125 Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys 130 135 140 Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 145 150 155 160 Thr Glu Ala Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Arg Ala 165 170 175 Arg Ser Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185 190 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu 1 5 10 15 Leu Glu Asn Asn 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Glu Pro Pro Pro Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala 1 5 10 15 Glu Asn Gly Gly 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro 1 5 10 15 Phe Glu Thr Lys 20 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human SOST peptide fragment with additional 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additional cysteine added <400> 17 Pro Glu Pro Pro Gln Glu Leu Glu Asn Asn Gln Thr Met Asn Arg Ala 1 5 10 15 Glu Asn Gly Gly Cys 20 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat SOST peptide fragment with additional cysteine added <400> 18 Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Thr Lys Asp Val 1 5 10 15 Ser Glu Tyr Ser Cys 20 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat SOST peptide fragment with additional cysteine added <400> 19 Thr Glu Ile Ile Pro Gly Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gln Glu 1 5 10 15 Leu Glu Asn Asn Cys 20 <210> 20 <211> 190 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 20 Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Ile Pro Gly 1 5 10 15 Leu Arg Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Gln Glu Leu Glu Asn Asn Gln Thr 20 25 30 Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp 35 40 45 Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg 50 55 60 Phe Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr 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570 <210> 56 <211> 570 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 56 caggggtggc aagccttcaa gaatgatgcc acagaaatca tcccgggact cagagagtac 60 ccagagcctc ctcaggaact agagaacaac cagaccatga accgggccga gaacggaggc 120 agaccccccc accatcctta tgacaccaaa gacgtgtccg agtacagctg ccgcgagctg 180 cactacaccc gcttcgtgac cgacggcccg tgccgcagtg ccaagccggt caccgagttg 240 gtgtgctcgg gccagtgcgg ccccgcgcgg ctgctgccca acgccatcgg gcgcgtgaag 300 tggtggcgcc cgaacggacc cgacttccgc tgcatcccgg atcgctaccg cgcgcagcgg 360 gtgcagctgc tgtgccccgg cggcgcggcg ccgcgctcgc gcaaggtgcg tctggtggcc 420 tcgtgcaagt gcaagcgcct cacccgcttc cacaaccagt cggagctcaa ggacttcgga 480 cctgagaccg cgcggccgca gaagggtcgc aagccgcggc cccgcgcccg gggagccaaa 540 gccaaccagg cggagctgga gaacgcctac 570 <210> 57 <211> 2301 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 agagcctgtg ctactggaag gtggcgtgcc ctcctctggc tggtaccatg cagctcccac 60 tggccctgtg tctcgtctgc ctgctggtac acacagcctt ccgtgtagtg gagggccagg 120 ggtggcaggc gttcaagaat gatgccacgg aaatcatccc cgagctcgga gagtaccccg 180 agcctccacc ggagctggag aacaacaaga ccatgaaccg ggcggagaac ggagggcggc 240 ctccccacca cccctttgag accaaagacg tgtccgagta cagctgccgc gagctgcact 300 tcacccgcta cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctcagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020 agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc 1080 cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caactgtaga tgtggtttct agtcctggct ctgccactaa cttgctgtgt aaccttgaac 1200 tacacaattc tccttcggga cctcaatttc cactttgtaa aatgagggtg gaggtgggaa 1260 taggatctcg aggagactat tggcatatga ttccaaggac tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 caaacagaaa aaaaaaagta aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500 tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560 ccctccatct caaagaaata acatcatcca ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620 ggtgggaggg atagaaatca catccgcccc aacttcccaa agagcagcat ccctcccccg 1680 acccatagcc atgttttaaa gtcaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740 ccttgcaggc ccgagggagc agccatcaca aactcacaga ccagcacatc ccttttgaga 1800 caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc 1860 tcttacatgt gatggcatat cttacactaa aagaatatta ttgggggaaa aactacaagt 1920 gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc cacccaaaaa tctttttgaa 1980 aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160 atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220 aatattgctt tatgaattaa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280 acaatgaatc atgaccgaaa g 2301 <210> 58 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Thr 1 5 10 15 Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg 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cgtgaccgat gggccgtgcc gcagcgccaa gccggtcacc gagctggtgt 360 gctccggcca gtgcggcccg gcgcgcctgc tgcccaacgc catcggccgc ggcaagtggt 420 ggcgacctag tgggcccgac ttccgctgca tccccgaccg ctaccgcgcg cagcgcgtgc 480 agctgctgtg tcccggtggt gaggcgccgc gcgcgcgcaa ggtgcgcctg gtggcctcgt 540 gcaagtgcaa gcgcctcacc cgcttccaca accagtcgga gctcaaggac ttcgggaccg 600 aggccgctcg gccgcagaag ggccggaagc cgcggccccg cgcccggagc gccaaagcca 660 accaggccga gctggagaac gcctactaga gcccgcccgc gcccctcccc accggcgggc 720 gccccggccc tgaacccgcg ccccacattt ctgtcctctg cgcgtggttt gattgtttat 780 atttcattgt aaatgcctgc aacccagggc agggggctga gaccttccag gccctgagga 840 atcccgggcg ccggcaaggc ccccctcagc ccgccagctg aggggtccca cggggcaggg 900 gagggaattg agagtcacag acactgagcc acgcagcccc gcctctgggg ccgcctacct 960 ttgctggtcc cacttcagag gaggcagaaa tggaagcatt ttcaccgccc tggggtttta 1020 agggagcggt gtgggagtgg gaaagtccag ggactggtta agaaagttgg ataagattcc 1080 cccttgcacc tcgctgccca tcagaaagcc tgaggcgtgc ccagagcaca agactggggg 1140 caactgtaga tgtggtttct 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ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt tttaaagagt taagttacat 2160 atttattttc tcacttaagt tatttatgca aaagtttttc ttgtagagaa tgacaatgtt 2220 aatattgctt tatgaattaa cagtctgttc ttccagagtc cagagacatt gttaataaag 2280 acaatgaatc atgaccgaaa g 2301 <210> 60 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Ile Cys Leu Leu Val His Thr 1 5 10 15 Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala 100 105 110 Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 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tccagtgcct tttgaatggg 1320 cagaggtgag agagagagag agaaagagag agaatgaatg cagttgcatt gattcagtgc 1380 caaggtcact tccagaattc agagttgtga tgctctcttc tgacagccaa agatgaaaaa 1440 caaacagaaa aaaaaaagta aagagtctat ttatggctga catatttacg gctgacaaac 1500 tcctggaaga agctatgctg cttcccagcc tggcttcccc ggatgtttgg ctacctccac 1560 ccctccatct caaagaaata acatcatcca ttggggtaga aaaggagagg gtccgagggt 1620 ggtgggaggg atagaaatca catccgcccc aacttcccaa agagcagcat ccctcccccg 1680 acccatagcc atgttttaaa gtcaccttcc gaagagaagt gaaaggttca aggacactgg 1740 ccttgcaggc ccgagggagc agccatcaca aactcacaga ccagcacatc ccttttgaga 1800 caccgccttc tgcccaccac tcacggacac atttctgcct agaaaacagc ttcttactgc 1860 tcttacatgt gatggcatat cttacactaa aagaatatta ttgggggaaa aactacaagt 1920 gctgtacata tgctgagaaa ctgcagagca taatagctgc cacccaaaaa tctttttgaa 1980 aatcatttcc agacaacctc ttactttctg tgtagttttt aattgttaaa aaaaaaaagt 2040 tttaaacaga agcacatgac atatgaaagc ctgcaggact ggtcgttttt ttggcaattc 2100 ttccacgtgg gacttgtcca caagaatgaa agtagtggtt 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agccgcggcc ccgcgcccgg 600 ggggccaaag ccaatcaggc cgagctggag aacgcctact ag 642 <210> 64 <211> 213 <212> PRT <213> Cercopithecus pygerythrus <400> 64 Met Gln Leu Pro Leu Ala Leu Cys Leu Val Cys Leu Leu Val His Ala 1 5 10 15 Ala Phe Arg Val Val Glu Gly Gln Gly Trp Gln Ala Phe Lys Asn Asp 20 25 30 Ala Thr Glu Ile Ile Pro Glu Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Asn Lys Thr Met Asn Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg 50 55 60 Pro Pro His His Pro Phe Glu Thr Lys Asp Val Ser Glu Tyr Ser Cys 65 70 75 80 Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala 100 105 110 Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro Ser 115 120 125 Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val 130 135 140 Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val Arg 145 150 155 160 Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg Leu Thr Arg Phe His Asn Gln 165 170 175 Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly 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accatgaaaa tggatctctc 1260 tatgacttcc tgaaatgtgc tacactggac accagagccc tgcttaaatt ggcttattca 1320 gctgcctgtg gtctgtgcca cctgcacaca gaaatttatg gcacccaagg aaagcccgca 1380 attgctcatc gagacctaaa gagcaaaaac atcctcatca agaaaaatgg gagttgctgc 1440 attgctgacc tgggccttgc tgttaaattc aacagtgaca caaatgaagt tgatgtgccc 1500 ttgaatacca gggtgggcac caaacgctac atggctcccg aagtgctgga cgaaagcctg 1560 aacaaaaacc acttccagcc ctacatcatg gctgacatct acagcttcgg cctaatcatt 1620 tgggagatgg ctcgtcgttg tatcacagga gggatcgtgg aagaatacca attgccatat 1680 tacaacatgg taccgagtga tccgtcatac gaagatatgc gtgaggttgt gtgtgtcaaa 1740 cgtttgcggc caattgtgtc taatcggtgg aacagtgatg aatgtctacg agcagttttg 1800 aagctaatgt cagaatgctg ggcccacaat ccagcctcca gactcacagc attgagaatt 1860 aagaagacgc ttgccaagat ggttgaatcc caagatgtaa aaatctgatg gttaaaccat 1920 cggaggagaa actctagact gcaagaactg tttttaccca tggcatgggt ggaattagag 1980 tggaataagg atgttaactt ggttctcaga ctctttcttc actacgtgtt cacaggctgc 2040 taatattaaa cctttcagta ctcttattag gatacaagct 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aagaaaatag cctggcagtg 1800 aggtcactca aggagacaat cgaagactgt tgggaccagg atgcagaggc tcggcttact 1860 gcacagtgtg ctgaggaaag gatggctgaa cttatgatga tttgggaaag aaacaaatct 1920 gtgagcccaa cagtcaatcc aatgtctact gctatgcaga atgaacgcaa cctgtcacat 1980 aataggcgtg tgccaaaaat tggtccttat ccagattatt cttcctcctc atacattgaa 2040 gactctatcc atcatactga cagcatcgtg aagaatattt cctctgagca ttctatgtcc 2100 agcacacctt tgactatagg ggaaaaaaac cgaaattcaa ttaactatga acgacagcaa 2160 gcacaagctc gaatccccag ccctgaaaca agtgtcacca gcctctccac caacacaaca 2220 accacaaaca ccacaggact cacgccaagt actggcatga ctactatatc tgagatgcca 2280 tacccagatg aaacaaatct gcataccaca aatgttgcac agtcaattgg gccaacccct 2340 gtctgcttac agctgacaga agaagacttg gaaaccaaca agctagaccc aaaagaagtt 2400 gataagaacc tcaaggaaag ctctgatgag aatctcatgg agcactctct taaacagttc 2460 agtggcccag acccactgag cagtactagt tctagcttgc tttacccact cataaaactt 2520 gcagtagaag caactggaca gcaggacttc acacagactg caaatggcca agcatgtttg 2580 attcctgatg ttctgcctac tcagatctat cctctcccca agcagcagaa ccttcccaag 2640 agacctacta gtttgccttt gaacaccaaa aattcaacaa aagagccccg gctaaaattt 2700 ggcagcaagc acaaatcaaa cttgaaacaa gtcgaaactg gagttgccaa gatgaataca 2760 atcaatgcag cagaacctca tgtggtgaca gtcaccatga atggtgtggc aggtagaaac 2820 cacagtgtta actcccatgc tgccacaacc caatatgcca ataggacagt actatctggc 2880 caaacaacca acatagtgac acatagggcc caagaaatgt tgcagaatca gtttattggt 2940 gaggacaccc ggctgaatat taattccagt cctgatgagc atgagccttt actgagacga 3000 gagcaacaag ctggccatga tgaaggtgtt ctggatcgtc ttgtggacag gagggaacgg 3060 ccactagaag gtggccgaac taattccaat aacaacaaca gcaatccatg ttcagaacaa 3120 gatgttcttg cacagggtgt tccaagcaca gcagcagatc ctgggccatc aaagcccaga 3180 agagcacaga ggcctaattc tctggatctt tcagccacaa atgtcctgga tggcagcagt 3240 atacagatag gtgagtcaac acaagatggc aaatcaggat caggtgaaaa gatcaagaaa 3300 cgtgtgaaaa ctccctattc tcttaagcgg tggcgcccct ccacctgggt catctccact 3360 gaatcgctgg actgtgaagt caacaataat ggcagtaaca gggcagttca ttccaaatcc 3420 agcactgctg tttaccttgc agaaggaggc actgctacaa ccatggtgtc taaagatata 3480 ggaatgaact gtctgtgaaa tgttttcaag cctatggagt gaaattattt tttgcatcat 3540 ttaaacatgc agaagatgtt taccgggcgg ggtgacagga gagagcgtca gcggcaagct 3600 gtggaggatg gggctcagaa tgcagacctg ggctggccgc atggcctctc cctgagccct 3660 gatttgtggt agggaagcag tatgggtgca gtcccctcct aggcctccct ctggggtccc 3720 ccgatcctat cccacctctt cagggtgagc cagcctcacc tcttcctagt cctgagggtg 3780 agggcaggct gaggcaacga gtgggaggtt caaacaagag tgggctggag ccaagggaaa 3840 atagagatga tgtaatttct ttccggaatt c 3871 <210> 95 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Cys Arg Glu Leu His Phe Thr Arg Tyr Val Thr Asp Gly Pro Cys Arg 1 5 10 15 Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys Ser Gly Gln Cys Gly Pro 20 25 30 Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg Gly Lys Trp Trp Arg Pro 35 40 45 Ser Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp Arg Tyr Arg Ala Gln Arg 50 55 60 Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Glu Ala Pro Arg Ala Arg Lys Val 65 70 75 80 Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys 85 <210> 96 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro 1 5 10 15 Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr 20 25 30 Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val 35 40 45 Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys 50 55 60 Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys 65 70 75 80 Gln Cys <210> 97 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu Cys Arg 1 5 10 15 Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr 20 25 30 Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr 35 40 45 Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys 50 55 60 Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys 65 70 75 80 His Cys <210> 98 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Cys Ile Pro Thr Glu Tyr Thr Met His Ile Glu Arg Arg Glu Cys Ala 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Met Thr 20 25 30 Arg Asp Ile Asn Gly Lys Leu Phe Leu Pro Lys Tyr Ala Leu Ser Gln 35 40 45 Asp Val Cys Thr Tyr Arg Asp Phe Ile Tyr Arg Thr Val Glu Ile Pro 50 55 60 Gly Cys Pro Leu His Val Ala Pro Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Ala Leu 65 70 75 80 Ser Cys Lys Cys <210> 99 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Cys Asn Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys 1 5 10 15 Lys Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala 20 25 30 Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys 35 40 45 Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His 50 55 60 Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu 65 70 75 80 Cys Lys Cys <210> 100 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Cys Ser Thr Val Pro Val Thr Thr Glu Val Ser Tyr Ala Gly Cys Thr 1 5 10 15 Lys Thr Val Leu Met Asn His Cys Ser Gly Ser Cys Gly Thr Phe Val 20 25 30 Met Tyr Ser Ala Lys Ala Gln Ala Leu Asp His Ser Cys Ser Cys Cys 35 40 45 Lys Glu Glu Lys Thr Ser Gln Arg Glu Val Val Leu Ser Cys Pro Asn 50 55 60 Gly Gly Ser Leu Thr His Thr Tyr Thr His Ile Glu Ser Cys Gln Cys 65 70 75 80 <210> 101 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Cys Arg Thr Val Pro Phe Ser Gln Thr Ile Thr His Glu Gly Cys Glu 1 5 10 15 Lys Val Val Val Gln Asn Asn Leu Cys Phe Gly Lys Cys Gly Ser Val 20 25 30 His Phe Pro Gly Ala Ala Gln His Ser His Thr Ser Cys Ser His Cys 35 40 45 Leu Pro Ala Lys Phe Thr Thr Met His Leu Pro Leu Asn Cys Thr Glu 50 55 60 Leu Ser Ser Val Ile Lys Val Val Met Leu Val Glu Glu Cys Gln Cys 65 70 75 80 <210> 102 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Cys Lys Thr Gln Pro Leu Lys Gln Thr Ile His Glu Glu Gly Cys Asn 1 5 10 15 Ser Arg Thr Ile Ile Asn Arg Phe Cys Tyr Gly Gln Cys Asn Ser Phe 20 25 30 Tyr Ile Pro Arg His Ile Arg Lys Glu Glu Gly Ser Phe Gln Ser Cys 35 40 45 Ser Phe Cys Lys Pro Lys Lys Phe Thr Thr Met Met Val Thr Leu Asn 50 55 60 Cys Pro Glu Leu Gln Pro Pro Thr Lys Lys Lys Arg Val Thr Arg Val 65 70 75 80 Lys Gln Cys Arg Cys 85 <210> 103 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Cys Glu Ala Lys Asn Ile Thr Gln Ile Val Gly His Ser Gly Cys Glu 1 5 10 15 Ala Lys Ser Ile Gln Asn Arg Ala Cys Leu Gly Gln Cys Phe Ser Tyr 20 25 30 Ser Val Pro Asn Thr Phe Pro Gln Ser Thr Glu Ser Leu Val His Cys 35 40 45 Asp Ser Cys Met Pro Ala Gln Ser Met Trp Glu Ile Val Thr Leu Glu 50 55 60 Cys Pro Gly His Glu Glu Val Pro Arg Val Asp Lys Leu Val Glu Lys 65 70 75 80 Ile Leu His Cys Ser Cys 85 <210> 104 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapies <400> 104 Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser 1 5 10 15 Gly Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys 20 25 30 Thr Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val 35 40 45 Glu Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe 50 55 60 Ile Lys Thr Cys Ala Cys 65 70 <210> 105 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His Leu Gln Phe Lys 1 5 10 15 Asn Cys Thr Ser Leu His Thr Tyr Lys Pro Arg Phe Cys Gly Val Cys 20 25 30 Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys Thr Ile Gln Ala 35 40 45 Glu Phe Gln Cys Ser Pro Gly Gln Ile Val Lys Lys Pro Val Met Val 50 55 60 Ile Gly Thr Cys Thr Cys 65 70 <210> 106 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Cys Ser Lys Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys 20 25 30 Val Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met 35 40 45 Arg Phe Arg Cys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met 50 55 60 Ile Gln Ser Cys Lys Cys 65 70 <210> 107 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gln His Tyr Leu His Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp 35 40 45 Pro Gly Phe Met Ala Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu 65 70 75 80 Leu Arg Gln Arg Pro Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu 85 90 95 Glu Phe Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys 100 105 110 Lys Leu Arg Arg Lys Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys 115 120 125 Pro Val Leu Tyr Ala Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg 130 135 140 Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro 145 150 155 160 Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val Leu 165 170 175 Arg Trp Arg Cys Gln Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile Pro 180 185 190 Ile Gln Tyr Pro Ile Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 195 200 205 <210> 108 <211> 197 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 108 Gln His Tyr Leu His Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Leu Leu Arg Ser Leu Met Gly Gly His Phe Asp 35 40 45 Pro Asn Phe Met Ala Met Ser Leu Pro Glu Asp Arg Leu Gly Val Asp 50 55 60 Asp Leu Ala Glu Leu Asp Leu Leu Leu Arg Gln Arg Pro Ser Gly Ala 65 70 75 80 Met Pro Gly Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Tyr Asp Gly Leu Gln Pro 85 90 95 Gly Lys Lys His Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys Leu Gln Met 100 105 110 Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Thr Trp Asn Asp 115 120 125 Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Tyr 130 135 140 Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Ala 145 150 155 160 Lys Ser Val His Leu Thr Ile Leu Arg Trp Arg Cys Gln Arg Arg Gly 165 170 175 Gly Gln Arg Cys Thr Trp Ile Pro Ile Gln Tyr Pro Ile Ile Ala Glu 180 185 190 Cys Lys Cys Ser Cys 195 <210> 109 <211> 196 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 109 Gln His Tyr Leu His Ile Arg Pro Ala Pro Ser Glu Asn Leu Pro Leu 1 5 10 15 Val Asp Leu Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Tyr Asp Pro Lys Glu Lys 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Met Val Gly His Phe Asp 35 40 45 Pro Asn Phe Met Ala Thr Ile Leu Pro Glu Glu Arg Leu Gly Val Glu 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Leu Asp Leu Leu Leu Arg Gln Lys Pro Ser Gly Ala 65 70 75 80 Met Pro Ala Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Tyr Glu Gly Leu Gln Ser 85 90 95 Lys Lys His Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys Leu Gln Met Trp 100 105 110 Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Thr Trp Asn Asp Leu 115 120 125 Gly Thr Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Tyr Ser 130 135 140 Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Ala Ala Lys 145 150 155 160 Ser Met His Leu Thr Ile Leu Arg Trp Arg Cys Gln Arg Arg Val Gln 165 170 175 Gln Lys Cys Ala Trp Ile Thr Ile Gln Tyr Pro Val Ile Ser Glu Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Cys 195 <210> 110 <211> 195 <212> PRT <213> Takifugu rubripes <400> 110 Gln Pro Tyr Tyr Leu Leu Arg Pro Ile Pro Ser Asp Ser Leu Pro Ile 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Glu Asp Pro Gly Pro Val Phe Asp Pro Lys Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Glu Leu Lys Ser Val Leu Gly Asp Phe Asp Ser 35 40 45 Arg Phe Leu Ser Val Leu Pro Pro Ala Glu Asp Gly His Ala Gly Asn 50 55 60 Asp Glu Leu Asp Asp Phe Asp Ala Gln Arg Trp Gly Gly Ala Leu Pro 65 70 75 80 Lys Glu Ile Arg Ala Val Asp Phe Asp Ala Pro Gln Leu Gly Lys Lys 85 90 95 His Lys Pro Ser Lys Lys Leu Lys Arg Arg Leu Gln Gln Trp Leu Trp 100 105 110 Ala Tyr Ser Phe Cys Pro Leu Ala His Ala Trp Thr Asp Leu Gly Ser 115 120 125 Arg Phe Trp Pro Arg Phe Val Arg Ala Gly Ser Cys Leu Ser Lys Arg 130 135 140 Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Thr Cys Lys Pro Ala Thr Ser Thr 145 150 155 160 His Leu Thr Ile Leu Arg Trp Arg Cys Val Gln Arg Lys Val Gly Leu 165 170 175 Lys Cys Ala Trp Ile Pro Met Gln Tyr Pro Val Ile Thr Asp Cys Lys 180 185 190 Cys Ser Cys 195 <210> 111 <211> 196 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 111 Gln His Tyr Tyr Leu Leu Arg Pro Ile Pro Ser Asp Ser Leu Pro Ile 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Glu Asp Pro Asp Pro Val Leu Asp Pro Lys Glu Arg 20 25 30 Asp Leu Asn Glu Thr Glu Leu Arg Ala Ile Leu Gly Ser His Phe Glu 35 40 45 Gln Asn Phe Met Ser Ile Asn Pro Pro Glu Asp Lys His Ala Gly Gln 50 55 60 Asp Glu Leu Asn Glu Ser Glu Leu Met Lys Gln Arg Pro Asn Gly Ile 65 70 75 80 Met Pro Lys Glu Ile Lys Ala Met Glu Phe Asp Ile Gln His Gly Lys 85 90 95 Lys His Lys Pro Ser Lys Lys Leu Arg Arg Arg Leu Gln Leu Trp Leu 100 105 110 Trp Ser Tyr Thr Phe Cys Pro Val Val His Thr Trp Gln Asp Leu Gly 115 120 125 Asn Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Leu Lys Val Gly Ser Cys Tyr Asn Lys 130 135 140 Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Pro Lys Ser 145 150 155 160 Ser His Leu Thr Val Leu Arg Trp Arg Cys Val Gln Arg Lys Gly Gly 165 170 175 Leu Lys Cys Ala Trp Ile Pro Val Gln Tyr Pro Val Ile Ser Glu Cys 180 185 190 Lys Cys Ser Cys 195 <210> 112 <211> 188 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 112 Gln Gly Trp Gln Ala Phe Arg Asn Asp Ala Thr Glu Val Ile Pro Gly 1 5 10 15 Leu Gly Glu Tyr Pro Glu Pro Pro Pro Glu Asn Asn Gln Thr Met Asn 20 25 30 Arg Ala Glu Asn Gly Gly Arg Pro Pro His His Pro Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Gly Val Ser Glu Tyr Ser Cys Arg Glu Leu His Tyr Thr Arg Phe Leu 50 55 60 Thr Asp Gly Pro Cys Arg Ser Ala Lys Pro Val Thr Glu Leu Val Cys 65 70 75 80 Ser Gly Gln Cys Gly Pro Ala Arg Leu Leu Pro Asn Ala Ile Gly Arg 85 90 95 Val Lys Trp Trp Arg Pro Asn Gly Pro Asp Phe Arg Cys Ile Pro Asp 100 105 110 Arg Tyr Arg Ala Gln Arg Val Gln Leu Leu Cys Pro Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Pro Arg Ser Arg Lys Val Arg Leu Val Ala Ser Cys Lys Cys Lys Arg 130 135 140 Leu Thr Arg Phe His Asn Gln Ser Glu Leu Lys Asp Phe Gly Pro Glu 145 150 155 160 Thr Ala Arg Pro Gln Lys Gly Arg Lys Pro Arg Pro Gly Ala Arg Gly 165 170 175 Ala Lys Ala Asn Gln Ala Glu Leu Glu Asn Ala Tyr 180 185

Claims (51)

  1. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하며, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 단리된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 21, 22, 25, 26, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  3. 서열 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드로 비인간 동물을 면역화하여 생산된, 단리된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이며, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 항체 또는 이들 의 항원-결합 단편.
  6. 서열 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드로 비인간 동물을 면역화하여 생산되고, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이며, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  7. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, SOST 동종이량체의 형성을 저해하는, 단리된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 서열 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 41, 42, 43, 51, 52, 53 및 54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  9. 서열 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 및 54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드로 비인간 동물을 면역화하여 생산된, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  12. 서열 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 및 54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드로 비인간 동물을 면역화하여 생산되고, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며, SOST 동종이량체의 형성을 저해하는, 항체 또는 이들의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 마우스 모노클로날 항체, 인간 모노클로날 항체, 래트 모노클로날 항체 및 햄스터 모노클로날 항체로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  16. 제14항의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
  17. 제14항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체 또는 키메라 항체인 항체.
  19. 제18항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 F(ab')2, Fab', Fab, Fd 및 Fv로 구성된 군으로부터 선택된 것인 항체.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 항체를 포함하는 항체.
  22. 제21항의 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 및 생리학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  24. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 (i) 골 형성 단백질(BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진 뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이며, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 면역원.
  25. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체를 유발할 수 있고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이며, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서 열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 면역원.
  26. 서열 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원.
  27. 제26항에 있어서, 상기 펩티드가 비인간 동물에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있는 것인 면역원.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 대한 SOST 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩 티드에 결합할 수 있는 것이고, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 면역원.
  29. 서열 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 47, 48, 49 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있으며, 상기 항체는 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하고, 여기서 BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이며, BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열 을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 면역원.
  30. 서열 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 및 54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하는 면역원.
  31. 제30항에 있어서, 상기 펩티드가 비인간 동물에서 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있는 것인 면역원.
  32. 제31항에 있어서, 상기 항체가 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 것인 면역원.
  33. 서열 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51, 52, 53 및 54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 20개 이상의 아미노산 및 75개 이하의 아미노산의 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 유발할 수 있으며, 상기 항체는 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 것인, 면역원.
  34. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체를 유발할 수 있는 것인, 면역원.
  35. 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드의 21개 이상의 연속적인 아미노산 및 50개 이하의 연속적인 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하고, 여기서 상기 펩티드는 비인간 동물에서, SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하며 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체를 유발할 수 있는 것인, 면역원.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 담체 분자와 접합된 (associated) 것인 면역원.
  37. 제36항에 있어서, 상기 담체 분자가 담체 폴리펩티드인 면역원.
  38. 제37항에 있어서, 상기 담체 폴리펩티드가 키홀 림펫 헤모시아닌인 면역원.
  39. 비인간 동물을 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 면역원으로 면역화 하는 것을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 생산 방법으로서, (a) 상기 SOST 폴리펩티드는 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하고; (b) 상기 항체는 (i) 골 형성 단백질 (BMP) 타입 I 수용체 결합 부위 및 (ii) BMP 타입 II 수용체 결합 부위 중 하나 이상에 SOST 폴리펩티드가 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하며; (c) BMP 타입 I 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 (GenBank Acc. Nos.) NM_004329 (서열 71); D89675 (서열 72); NM_001203 (서열 73); S75359 (서열 74); NM_030849 (서열 75); D38082 (서열 76); NP_001194 (서열 77); BAA19765 (서열 78); 및 AAB33865 (서열 79)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 I 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것이고; (d) BMP 타입 II 수용체 결합 부위는 진뱅크 등록번호 U25110 (서열 80); NM_033346 (서열 81); Z48923 (서열 83); CAA88759 (서열 84); 및 NM_001204 (서열 82)로 구성된 군으로부터 선택된 서열에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 BMP 타입 II 수용체 폴리펩티드에 결합할 수 있는 것인, 항체의 생산 방법.
  40. 비인간 동물을 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 면역원으로 면역화하는 것을 포함하는, 서열 1, 20, 58, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 SOST 동종이량체의 형성을 저해하는 항체의 생산 방법.
  41. (a) 서열 1, 20, 58, 60, 62 및 68 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, 항체/SOST 펩티드 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 이에 충분한 시간 동안 서열 2-19 및 21-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키고;
    (b) 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하고, 이로써 TGF-베타 신호전달 경로를 조정하는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는,
    TGF-베타 신호전달 경로를 조정하는 항체의 동정 방법.
  42. (a) (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 및 68 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, (ii) 항체/SOST 펩티드 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 이에 충분한 시간 동안 서열 2-19, 21-28 및 47-50으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키고;
    (b) 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하고, 이로써 BMP가 SOST 폴리펩티드에 결합하는 것을 저해하는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는,
    BMP가 SOST 폴리펩티드에 결합하는 것을 저해하는 항체의 동정 방법.
  43. (a) (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 및 68 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, (ii) 항체/SOST 펩 티드 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 이에 충분한 시간 동안 서열 29-46 및 51-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키고;
    (b) 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하고, 이로써 SOST 동종이량체 형성을 저해하는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는,
    SOST 동종이량체 형성을 저해하는 항체의 동정 방법.
  44. (a) (i) 서열 1, 20, 58, 60, 62 및 68 중 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를, (ii) 항체/SOST 펩티드 복합체를 형성하기 위한 조건하에서 이에 충분한 시간 동안 서열 2-19 및 21-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 SOST 펩티드와 접촉시키고;
    (b) 항체/SOST 펩티드 복합체의 수준을 검출하고, 이로써 골 미네랄 함량을 증가시키는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함하는,
    골 미네랄 함량을 증가시키는 항체의 동정 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 생물학적 샘플 및 정제된 항체에 존재하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 정제된 항체가 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및 항체의 항원-결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 5, 6 및 14로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  48. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 5, 6, 10, 11, 14 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
  49. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 서열 5, 6, 10, 11, 14 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역원.
  50. 비인간 동물을 제49항에 따른 면역원으로 면역화하는 것을 포함하는, 서열 1, 20, 28, 60, 62 또는 68에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 SOST 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 생산 방법.
  51. 제41항, 제42항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SOST 펩티드가 서열 5, 6, 10, 11, 14 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
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Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040009535A1 (en) * 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
NZ552959A (en) 1998-11-27 2008-06-30 Darwin Discovery Ltd Compositions and methods for increasing bone mineralization
US7799523B2 (en) 2002-04-03 2010-09-21 Celltech R & D, Inc. Association of polymorphisms in the SOST gene region with bone mineral density
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
US7585501B2 (en) 2002-06-14 2009-09-08 Stowers Institute For Medical Research Compositions and methods for treating kidney disease
ES2586401T3 (es) 2003-06-16 2016-10-14 Ucb Pharma S.A. Anticuerpos específicos para la esclerostina y métodos para aumentar la mineralización ósea
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
EP1771470B1 (en) 2004-07-23 2013-06-26 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
ITMI20050739A1 (it) * 2005-04-22 2006-10-23 Effebi Spa Piastrina di connsessione valvola-attuatore
AU2012238247B2 (en) * 2005-05-03 2016-06-16 Amgen, Inc. Sclerostin binding agents
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
KR20190006086A (ko) 2005-11-23 2019-01-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
WO2008133722A2 (en) * 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
EP2423226A3 (en) 2006-11-10 2012-05-30 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
WO2009131553A2 (en) 2006-12-29 2009-10-29 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
EP2111229B1 (en) 2007-02-01 2013-04-10 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists for use in preventing or treating breast cancer metastasis or breast cancer related bone loss
TWI548647B (zh) 2007-02-02 2016-09-11 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2120999B1 (en) 2007-02-09 2012-08-29 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists and use thereof in preventing or treating multiple myeloma
DK2131860T3 (da) * 2007-03-20 2014-01-13 Lilly Co Eli Anti-sclerostin-antistoffer
DK2602323T3 (en) 2007-06-01 2018-04-16 Open Monoclonal Tech Inc Compositions and Methods for Inhibiting Endogenous Immunoglobin Genes and Producing Transgenic Human Idiotypic Antibodies
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
CN103877564A (zh) 2007-09-18 2014-06-25 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20110044978A1 (en) * 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture
US8071914B2 (en) * 2007-12-26 2011-12-06 Noboru Oshima Heating apparatus
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
LT3750552T (lt) 2008-08-14 2023-06-26 Acceleron Pharma Inc. Gdf gaudyklės
EP2387412A4 (en) 2009-01-13 2013-04-03 Acceleron Pharma Inc METHODS FOR INCREASING ADIPONECTIN
EP3702001A1 (en) * 2009-03-30 2020-09-02 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
WO2010115932A1 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Novartis Ag Combination for the treatment of bone loss
WO2010130830A2 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against sclerostin and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
BRPI1010587A2 (pt) 2009-06-08 2019-04-09 Acceleron Pharma Inc. métodos para aumentar adipócitos termogênicos
EP2440577A4 (en) 2009-06-12 2013-01-23 Acceleron Pharma Inc SHORTEN ACTRIIB FC FUSION PROTEINS
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
MX2012011629A (es) 2010-04-07 2013-03-05 Abbvie Inc Proteinas de union a tnf-alfa.
AU2011239935A1 (en) 2010-04-16 2012-11-08 Novartis Ag Methods and compositions for improving implant osseointegration
EA037392B1 (ru) 2010-05-14 2021-03-23 Эмджен Инк. Композиции с высокой концентрацией антител
CN102971424B (zh) * 2010-05-27 2014-11-12 香港大学 针对硬骨素蛋白质的高亲和力核酸适配体
US9493541B2 (en) 2010-06-07 2016-11-15 Joshua Rabbani Antibodies specific for sulfated sclerostin
US9617323B2 (en) 2010-06-07 2017-04-11 Joshua Rabbani Sulfonated sclerostin, antibodies, epitopes and methods for identification and use therefor
EP2582717A2 (en) 2010-06-15 2013-04-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hcv ns5b polymerase mutants
US20140308242A1 (en) 2010-10-21 2014-10-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
TWI616204B (zh) 2010-11-05 2018-03-01 諾華公司 Ｉｌ-１７抗體用於製備治療牛皮癬性關節炎之藥物之用途
JP2014502260A (ja) 2010-11-08 2014-01-30 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド Ａｃｔｒｉｉａ結合剤およびその使用
MX2013010011A (es) 2011-03-01 2014-10-24 Amgen Inc Agentes de unión biespecífica.
AU2012236962B2 (en) 2011-03-25 2017-05-11 Amgen Inc. Anti-sclerostin antibody crystals and formulations thereof
RS57877B1 (sr) 2011-04-19 2018-12-31 Amgen Inc Metoda za lečenje osteoporoze
US20140056912A1 (en) 2011-04-29 2014-02-27 Novartis Ag Methods of treating squamous cell carcinoma
PT2739311T (pt) 2011-08-04 2018-03-26 Amgen Inc Método para tratamento de defeitos de lacunas ósseas
TW201323440A (zh) * 2011-10-24 2013-06-16 Abbvie Inc 抗骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）之免疫結合物
BR112014009810A2 (pt) 2011-10-24 2017-04-25 Abbvie Inc imunoligantes biespecíficos dirigidos contra tnf e il-17
BR112014009799A2 (pt) 2011-10-24 2017-06-13 Abbvie Inc imunoligantes dirigidos conra tnf
SG10201509629QA (en) 2011-12-28 2015-12-30 Amgen Inc Method Of Treating Alveolar Bone Loss Through The Use Of Anti-Sclerostin Antibodies
EP3626267A1 (en) 2012-07-05 2020-03-25 UCB Pharma, S.A. Treatment for bone diseases
WO2014015217A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Biomarkers for hcv infected patients
MX366336B (es) 2012-11-02 2019-07-05 Celgene Corp Antagonistas de activina - actrii y usos para el tratar trastornos oseos y otros.
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014118705A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Novartis Ag Methods of treating chronic kidney disease-mineral and bone disorder using sclerostin antagonists
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
WO2014155278A2 (en) 2013-03-26 2014-10-02 Novartis Ag Methods of treating autoimmune diseases using il-17 antagonists
CN103550785B (zh) * 2013-10-30 2016-05-18 清华大学深圳研究生院 TGF-β受体结合蛋白-1的用途
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
BR122023023170A2 (pt) 2014-06-13 2024-02-20 Acceleron Pharma Inc. Uso de um antagonista de actrii no tratamento ou prevenção de úlcera cutânea associada com beta-talassemia
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
AU2015358469B2 (en) 2014-12-03 2021-05-27 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for treating anemia
MA41142A (fr) 2014-12-12 2017-10-17 Amgen Inc Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
US10449250B2 (en) * 2015-03-13 2019-10-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-sclerostin antibody, antigen binding fragment and medical use thereof
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
GB201609235D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Univ Cape Town Production of a horseradish peroxidase-IGG fusion protein
GB201610044D0 (en) * 2016-06-08 2016-07-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JP2019527710A (ja) 2016-08-08 2019-10-03 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体を用いた結合組織付着の改善方法
JP2020502218A (ja) 2016-12-21 2020-01-23 メレオ バイオファーマ ３ リミテッド 骨形成不全症の処置における抗スクレロスチン抗体の使用
EP3868780A1 (en) 2016-12-21 2021-08-25 Mereo Biopharma 3 Limited Use of anti-sclerostin antibodies in the treatment of osteogenesis imperfecta
RU2647571C1 (ru) * 2017-08-25 2018-03-16 Владимир Глебович Лунин Рекомбинантный белок склеростина, способ получения рекомбинантного белка склеростина, способ повышения костной массы позвоночного животного
CN108101984B (zh) * 2017-12-18 2019-10-15 中国人民解放军总医院 骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途
CN111712573B (zh) * 2018-02-12 2023-10-20 安沛治疗有限公司 针对骨硬化蛋白的适体及其用途
EP3774879A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 Amgen Inc. C-terminal antibody variants
GB201810746D0 (en) 2018-06-29 2018-08-15 Mereo Biopharma 3 Ltd Use of sclerostin antagonist
CN112702991A (zh) 2018-08-10 2021-04-23 安进公司 制备抗体药物配制品的方法
JP2022544495A (ja) 2019-08-12 2022-10-19 アムジエン・インコーポレーテツド 抗スクレロスチン抗体製剤
CN113214479B (zh) * 2021-05-08 2022-03-18 四川大学 一种矿化防龋材料及其制备方法

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4427115A (en) 1981-10-19 1984-01-24 Laipply Thomas C One piece alcohol preparation device
USRE32011E (en) 1981-12-14 1985-10-22 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US6054561A (en) 1984-02-08 2000-04-25 Chiron Corporation Antigen-binding sites of antibody molecules specific for cancer antigens
DE3417525C1 (de) 1984-05-11 1986-01-09 Matter + Siegmann Ag, Wohlen Vorrichtung zur quantitativen und qualitativen Erfassung von kohlenwasserstoffhaltigen Schwebeteilchen in Gasen
US5272254A (en) 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
JP2624470B2 (ja) 1984-10-02 1997-06-25 バイオジェン インコーポレイテッド ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
SG64329A1 (en) 1984-11-16 1999-04-27 American Cyanamid Co Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US5811128A (en) 1986-10-24 1998-09-22 Southern Research Institute Method for oral or rectal delivery of microencapsulated vaccines and compositions therefor
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
GB8723661D0 (en) 1987-10-08 1987-11-11 British Bio Technology Synthetic gene
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
ES2059464T3 (es) 1987-10-30 1994-11-16 American Cyanamid Co Formas especificamente dirigidas de agentes antitumorales de metiltritio.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
AU5741590A (en) 1989-05-04 1990-11-29 Southern Research Institute Improved encapsulation process and products therefrom
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5177197A (en) 1990-02-27 1993-01-05 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleotide sequence expressing human transforming growth factor-β1-binding protein
US5466468A (en) 1990-04-03 1995-11-14 Ciba-Geigy Corporation Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
JPH04141095A (ja) 1990-10-02 1992-05-14 Chemo Sero Therapeut Res Inst 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法
US5070108A (en) 1990-10-12 1991-12-03 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treating osteoporosis, increasing bone mineral content and preventing the occurrence of compression fractures in a mammal
WO1992006693A1 (en) 1990-10-22 1992-04-30 Fox Chase Cancer Center Dna construct for providing rna therapy
US5399363A (en) 1991-01-25 1995-03-21 Eastman Kodak Company Surface modified anticancer nanoparticles
US5145684A (en) 1991-01-25 1992-09-08 Sterling Drug Inc. Surface modified drug nanoparticles
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
DE122009000019I1 (de) * 1991-04-25 2009-07-16 Chugai Seiyaku K K 5 1 Rekombinierte humane antikörper gegen den humanen interleukin-6 rezeptor
DE4135543A1 (de) 1991-10-28 1993-04-29 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes core-streptavidin
EP0578515A3 (en) 1992-05-26 1995-05-10 Bristol Myers Squibb Co Humanized monoclonal antibodies.
CA2136178A1 (en) 1992-05-29 1993-12-09 Vasantha Nagarajan Production of streptavidin from bacillus subtilis
ES2131676T3 (es) 1993-01-11 1999-08-01 Dana Farber Cancer Inst Inc Induccion de respuestas con linfocitos t citotoxicos.
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
NZ267838A (en) 1993-06-07 1997-12-19 Genentech Inc Preparation of an hiv gp 120 subunit vaccine involving determining a neutralising epitope in the v2 and/or c4 domains
US5543158A (en) 1993-07-23 1996-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable injectable nanoparticles
US5453492A (en) 1993-07-28 1995-09-26 La Jolla Cancer Research Foundation 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
EP0756628B1 (en) 1994-04-29 2007-11-14 Curis, Inc. Morphogenic protein-specific cell surface receptors and uses therefor
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5846770A (en) 1994-11-22 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding human chordin
US6057421A (en) 1994-11-30 2000-05-02 Immpheron, Inc. Variable heavy and light chain regions of murine monoclonal antibody 1F7
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
IE80468B1 (en) 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
CA2220912A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Gregg A. Hastings Human ccn-like growth factor
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
DK0912738T3 (da) 1996-05-22 2008-11-17 Viventia Biotech Inc Antigen-bindende-fragmenter der specifikt detekterer cancerceller, nukleotider der koder fragmenterne og anvendelse deraf til profylakse og detektion af cancere
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5989909A (en) 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof
US6117911A (en) 1997-04-11 2000-09-12 Neorx Corporation Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies
ES2301198T3 (es) 1997-06-12 2008-06-16 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Polipeptidos artificiales de anticuerpos.
US6075007A (en) 1997-07-17 2000-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified noggin polypeptide and compositions
EP1000152A2 (en) 1997-08-01 2000-05-17 Genset 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN MUSCLE AND OTHER MESODERMAL TISSUES
US6815201B2 (en) 1997-09-08 2004-11-09 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. HIV-1 gp120 V1/V2 domain epitopes capable of generating neutralizing antibodies
DE69911175T2 (de) 1998-02-12 2004-07-29 Apovia, Inc., San Diego Strategisch modifizierte hepatitis b kernproteine und ihre derivate
GB9818881D0 (en) * 1998-08-28 1998-10-21 Glaxo Group Ltd Compounds
US6544485B1 (en) 2001-01-29 2003-04-08 Sharper Image Corporation Electro-kinetic device with enhanced anti-microorganism capability
NZ552959A (en) 1998-11-27 2008-06-30 Darwin Discovery Ltd Compositions and methods for increasing bone mineralization
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
AU2753100A (en) 1999-02-03 2000-08-25 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
ATE440109T1 (de) * 1999-06-09 2009-09-15 Genentech Inc Methoden zur diagnose von tumoren
WO2001064885A1 (en) 2000-03-02 2001-09-07 Amgen, Inc. Chordin-like-2 molecules and uses thereof
EP1290169A2 (en) 2000-06-01 2003-03-12 Amgen, Inc. Cystine-knot polypeptides: cloaked-2 molecules and uses thereof
CA2412110A1 (en) 2000-06-19 2001-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Osteolevin gene polymorphisms
EP1341814A2 (en) 2000-09-01 2003-09-10 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2002213441B2 (en) 2000-10-12 2006-10-26 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2374027A1 (en) 2001-03-13 2002-09-13 The Minister Of National Defence Cloning, expression, sequencing, and functional enhancement of monoclonal scfv antibody against venezuelan equine encephalitis virus(vee)
DE10145772A1 (de) 2001-09-17 2003-04-10 Bayer Cropscience Ag DELTA·1·-Pyrroline
AU2002357107B2 (en) 2001-12-06 2008-01-10 Biocontrol Systems, Inc. Sample collection and testing system
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
US7332276B2 (en) 2002-03-01 2008-02-19 Celltech R&D, Inc. Methods to increase or decrease bone density
US7799523B2 (en) 2002-04-03 2010-09-21 Celltech R & D, Inc. Association of polymorphisms in the SOST gene region with bone mineral density
AU2003276430A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Stowers Institute For Medical Research Wise/sost nucleic acid sequences and amino acid sequences
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
AU2003304107B2 (en) 2002-11-01 2008-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory CpG oligonucleotides
US7642238B2 (en) * 2002-12-05 2010-01-05 Shaughnessy John D Molecular determinants of myeloma bone disease and uses thereof
US20040141875A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-22 Rajiv Doshi System and method for treating microorganisms within motor vehicle heating, ventilation, and air conditioning units
SI1608399T1 (sl) 2003-03-14 2012-05-31 Usb Mfg Inc A Company Inc Under The Laws Of The State Of Delaware Kompleks sklerostina in noggina ali chordina in sredstva ki modulirajo tvorbo navedenega kompleksa
CU23403A1 (es) 2003-04-23 2009-08-04 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores
ES2586401T3 (es) * 2003-06-16 2016-10-14 Ucb Pharma S.A. Anticuerpos específicos para la esclerostina y métodos para aumentar la mineralización ósea
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2008133722A2 (en) 2006-11-10 2008-11-06 Ucb Pharma S.A. Anti human sclerostin antibodies
EP2423226A3 (en) * 2006-11-10 2012-05-30 Amgen Inc. Antibody-based diagnostics and therapeutics
WO2009131553A2 (en) 2006-12-29 2009-10-29 Osteogenex Inc. Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
NZ578235A (en) 2007-02-02 2012-05-25 Novartis Ag Modulators of sclerostin binding partners for treating bone-related disorders
DK2131860T3 (da) 2007-03-20 2014-01-13 Lilly Co Eli Anti-sclerostin-antistoffer
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
AU2008320823B2 (en) 2007-11-02 2013-01-17 Novartis Ag Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)
US20110044978A1 (en) * 2007-12-14 2011-02-24 Amgen Inc. Method for treating bone fracture

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