KR20050121681A

KR20050121681A - 면역조절 헤테로고리 화합물

Info

Publication number: KR20050121681A
Application number: KR1020057017070A
Authority: KR
Inventors: 이안 리차드 매튜스
Original assignee: 아비덱스 리미티드
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2005-12-27
Also published as: US7598247B2; US8309552B2; EA009680B1; ECSP056104A; BRPI0408365B1; US20070021428A1; BRPI0408365B8; EP2284172A1; JP2006520372A; EA200501370A1; CA2519063C; NO20054710D0; US20090312334A1; DK1603917T3; PL383655A1; US20080045527A1; SI1603917T1; KR101133959B1; HK1090921A1; MXPA05009667A

Abstract

다음식(I)의 화합물은 CD80의 억제제이고, 면역 조절 치료에 유용하다:

상기식에서

R₁과 R₃는 각각 H; F; Cl; Br; -NO₂; -CN; F 또는 Cl에 의하여 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬; 또는 F에 의하여 임의로 치환된 C₁-C₆ 알콕시를 나타내며;

R₄는 카르복실산기 (-COOH) 또는 이의 에스테르 또는 -(C(=O)NR₆R₇, -NR₇C(=O)R₆, -NR₇C(=O)OR₆, -NHC(=O)NR₇R₆ 또는 -NHC(=S)NR₇R₆, 여기서

R₆는 H 또는 식 -(Alk)_m-Q기를 나타내며,

이 식에서 m는 0 또는 1이고,

Alk는 임의로 치환된 2가 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₁₂ 알킬렌 또는 C₂-C₁₂ 알켄일렌 또는 C₂-C₁₂ 알킨일렌기 또는 2가 C₃-C₁₂ 탄소고리기이고, 이 기들은 하나 또는 그 이상의 -O-, -S- 또는 -N(R₈)- 결합(여기서, R₈은 H 또는 C₁-C₄ 알킬, C₃-C₄ 알켄일, C₃-C₄ 알킨일 또는 C₃-C₆ 시클로알킬을 나타낸다)을 함유하며,

Q는 H; -NR₉R₁₀(여기서, R₉과 R₁₀은 각각 H; C₁-C₄ 알킬; C₃-C₄ 알켄일; C₃-C₄ 알킨일; C₃-C₆ 시클로알킬; 에스테르기; 임의로 치환된 탄소고리 또는 헤테로고리기를 나타내거나 또는 R₉와 R₁₀은 이들에 결합되는 수소와 함께 취했을 때 환이 임의로 치환되는 환을 형성한다)을 나타내고;

R₇은 H 또는 C₁-C₆ 알킬을 나타내거나 또는 R₆와 R₇은 이들에 결합되는 원자 또는 원자들을 함께 취했을 때 5, 6 또는 7의 환원자를 갖는 임의로 치환된 단일고리 헤테로고리환을 형성하며;

X는 결합기 또는 식 -(Z)_n-(Alk)- 또는 -(Alk)-(Z)_n-(여기서, Z는 -O-, -S- 또는 -NH-을 나타내고, Alk는 R₆에서 정의한 바와 같고, n은 0 또는 1이다)의 2가기를 나타낸다.

Description

면역조절 헤테로고리 화합물 {IMMUNOMODULATING HETEROCYCLIC COMPOUNDS}

본 발명은 새로운 헤테로고리 화합물, 이들의 제조방법, 이들을 함유하는 조성물과 면역조절로 유익해지는 질병증상, 예를들어, 자가면역질병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 천식, 이식, 전신홍반성 낭창과 건선의 임상치료 방법과 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 면역-억제에 유용한 CD80과 CD28 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 CD80 결합물질인 새로운 헤테로고리 화합물에 관한 것이다.

면역계는 면역 반응 동안과 그 후 여러가지 조정 메카니즘을 통하여 림프구의 활성화와 비활성화 사이의 생리적 평형을 제어하는 능력을 갖는다. 이들 사이에는 면역 반응을 특별히 억제 와/또는 전향시키는 메카니즘이 있다. 따라서, 항원이 MHC 분자에 의하여 T-세포 수용체로 나타낼 때 T-세포는 부가적 공동-자극 신호의 존재하에서만 적당히 활성화된다. 이러한 보조 신호가 없을 때 림프구 활성화는 없고 기능적 비활성화 기간의 아네르기 또는 내성 상태가 유발되거나 아니면 T-세포가 고사에 의하여 특별히 삭제된다.

이와 같은 공동-자극 신호의 하나는 T-세포에서의 CD28과 특화된 항원-존재 세포에서의 CD80의 상화작용을 포함한다(Lenschow 등 (1996) Annu. Rev. Immunol., 14, 232-258). 그러므로 이러한 CD80/CD28 상호작용을 억제하는 화합물을 공급하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라서 다음식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이들의 염, 수화물이나 용매화물을 제공한다:

상기식에서

R₆는 H 또는 식 -(Alk)_m-Q기를 나타내며,

이 식에서 m는 0 또는 1이고,

화합물(I)는 다음식(I¹)과 (I²)과 같은 호변이성체의 형태로 존재한다:

이 후, 본 발명의 화합물은 호변이성체형(I)으로 나타내고, 이에 관하여 언급할 것이며 구조식(I), 특히 (I¹)과 (I²)의 모든 호변이성체형은 본 발명에 포함됨을 이해할 것이다.

일반식(I)의 화합물은 CD80 길항물질이다. 이들은 CD80과 CD28 사이의 상호작용을 억제하며, 따라서, T-세포가 활성화하므로서 면역반응을 조절한다.

따라서, 본 발명에 다음과 같은 것이 포함된다:

(i) 면역조절에, 특히 면역-억제에 유익한 증상을 치료하는데 사용하는 일반식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이들의 염.

(ii) 면역조절에, 특히 면역-억제에 유익한 증상을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하는 일반식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이들의 염.

(iii) 면역조절의 유효투약량의 일반식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이의 염을 치료가 필요한 포유류에 투여하여서 하는 사람을 포함한 포유류의 면역조절, 특히 면역-억제 방법.

(iv) 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 부형제 또는 담체와 함께 일반식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이들의 염으로 이루어지는 약학적 또는 수의학적 조성물.

면역조절에 유익한 증상은 다음과 같다:

급성 산포 뇌척수염

부신 부전

알레르기성 맥관염과 육아종

아밀로이드증

강직성 척추염

천식

자가면역 에디슨병

자가면역 탈모증

자가면역 만성 능동간염

자가면역 용혈성 빈혈

자가면역 신경병

자가면역 혈소판 감소성 자반병

배체트병

소뇌퇴화

급성 능동간염

금성 염증 탈수초성 다신경근병증

단일 클론 감마병증을 갖는 급성 신경병

고전적 다발성 동맥염 혹

선천성 부신 과형성증

한랭병

포진성 피부염

당뇨병

이튼-램버트 근무력증 증후군

뇌척수염

후천성 표피 수포증

결절홍반

글루텐-민감성 장병증

굿패스처 증후군

기앵 바레 증후군

하시모토 감상선염

갑상선기능항진증

특발성 혈구색시증

특발성 막성 사구체신염

중추신경계의 격리맥관염

카와자키 질병

최소변화신질병

잡맥관염

혼합된 결합조직 질병

전달블록을 갖는 다초점성 운동 신경병

다발성 경화증

중증근무력증

옵소클로누스-미오클로누스 증후군

유천포창

천포창

악성빈혈

다발성 근염/피부근염

후-감염성 관절염

원발성 담즙성 경화증

건선

반응성 관절염

라이터 병

망막병

류마티스성 관절염

경화 담관염

쇼그랜 증후군

구강직 증후군

아급성 갑상선염

전신 홍반성 낭창

전신 괴사성 맥관염

전신 경화증(피부경화증)

타카야수 관절염

관자 관절염

폐쇄성 혈전혈관염

타입 I과 타입 II의 자기면역 다수선 증후군

궤양성 대장염

포도막염

베게너 육아종증

여기서 사용된 "에스테르"란 용어는 -COOR 형태의 기에 관한 것이고, 여기서 R은 알코올 ROH에서 통상적으로 유도되는 기이다. 에스테르기의 예를들면, 메틸, 에틸, n-와 이소-프로필, n-, sec-와 tert-부틸과 벤질 에스테르와 같은 생리적으로 가수분해할 수 있는 에스테르가 있다.

여기서 사용된 "알킬렌"이란 용어는 두가지 불만족한 원자가를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬에 관한 것으로, 예를들면, -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂-, -CH(CH₂CH₃)CH₂CH₂CH₂-와 -C(CH₃)₃가 있다.

여기에 사용된 "알켄일렌"이란 용어는 두가지 불만족한 원자가를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알켄일에 관한 것으로, 예를들면, -CH=CH-, -CH₂CH=CH-, -C(CH₃)=CH-와 -CH(CH₂CH₃)CH=CHCH₂-가 있다.

여기에 사용된 "알킨일렌"이란 용어는 두가지 불만족한 원자가를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킨일을 뜻하는 것으로, 예를들면, -C≡C-, -CH₂C≡C-와 -CH(CH₂CH₃)C≡CCH₂가 있다.

여기서 표현되는 문장에서 다른 언급이 없는 한 어떠한 부분에 사용된 "치환"이란 용어는 예를들어, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알켄일, (C₂-C₆)알킨일, 플루오로-치환(C₁-C₆)알킬, 플루오로-치환(C₁-C₆)알켄일, 플루오로-치환(C₂-C₆)알킨일, (C₁-C₆)알콕시와 플루오로-치환(C₁-C₆)알콕시(환이 메틸렌디옥시 또는 에틸렌디옥시와 같은 알킬렌디옥시에 의하여 인접한 환 C 원자에서 치환되는 특별한 경우도 포함한다), (C₁-C₆)알킬티오, 페닐, 벤질, 펜옥시, 벤질옥시, 히드록시, 머캅토, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, 시아노, 니트로, 옥소, -COOH, -SO₂OH, -CONH₂, -SO₂NH₂, -COR^A, -COOR^A, -SO₂OR^A, -NHSO₂R^A, -NHSO₂R^A, -CONHR^A, -SO₂NHR^A, -NHR^A, -NR^AR^B, -CONR^AR^B 또는 -SO₂NR^AR^B(여기서, R^A와 R^B는 각각 (C₁-C₆)알킬 또는 (C₂-C₆)알콕시기 또는 5-7원환이 단고리, 탄소고리 또는 헤테로고리기이거나 또는 R^A와 R^B는 이에 결합되는 질소와 함께 취할 때 환을 형성한다)에서 선택한 최소한 하나의 치환기로 치환되는 것을 의미한다.

"치환"이란 용어가 페닐, 벤질, 펜옥시 또는 벤질옥시에 의하여 치환되는 것을 의미하는 경우 이들의 페닐환은 그 자체, 페닐, 벤질, 펜옥시 또는 벤질옥시를 제외하고 전술한 어는 것으로 치환될 수 있다.

여기서 사용된 "아릴"이란 용어는 모노-, 비- 또는 트리-고리 탄소고리방향족기와 서로 공유결합하는 이러한 두 기를 뜻한다. 이러한 기를 예시하면, 페닐, 비페닐과 나프틸이 있다.

여기서 사용된 "카르보시클일" 또는 "탄소고리"란 무제한 용어에는 아릴, 시클로알킬과 시클로알켄일이 포함되고, 환원자가 모두 탄소인 환시스템(모노고리, 디고리, 트리고리 또는 다리)을 뜻한다.

여기서 사용된 "시클로알킬"이란 무제한 용어는 환탄소 사이에 단일 결합만 함유하는 탄소고리 환시스템을 뜻한다.

여기서 사용된 "시클로알켄일"이란 무제한 용어는 한 쌍의 환탄소 사이에 최소한 하나의 이중결합을 함유하는 탄소고리 환시스템을 뜻한다.

여기에 사용된 "헤테로아릴"이란 용어는 S, N과 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노-, 디- 또는 트리-고리 방향족기를 뜻한다. 이러한 기를 예시하면, 티에닐, 벤즈티에닐, 푸릴, 벤즈푸릴, 피롤일, 이미다졸일, 벤즈이미다졸일, 티아졸일, 벤즈티아졸일, 이소티아졸일, 벤즈이소티아졸일, 피라졸일, 옥사졸일, 벤즈옥사졸일, 이소옥사졸일, 벤즈이소옥사졸일, 이소티아졸일, 트리아졸일, 벤즈트리아졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 피리딘일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 인돌일과 인다졸일이 있다.

여기에 사용된 "헤테로시클일" 또는 "헤테로고리"란 무제한 용어에는 상술한 "헤테로아릴"을 포함하고, 특히 S, N와 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노-, 디- 또는 트리-고리 또는 다리 비-방향족기를 의미하고, 이러한 다른 기에 공유결합되는 하나 또는 그 이상의 이러한 헤테로원자를 함유하는 모노고리 비-방향족기로 이루어지는 기와 모노고리 탄소고리기를 뜻한다. 이러한 기를 예시하면, 피롤일, 푸란일, 테트라하이드로푸란일, 티에닐, 피페리딘일, 이미다졸일, 옥사졸일, 이소옥사졸일, 티아졸일, 티아디아졸일, 피라졸일, 피리딘일, 피롤리딘일, 피리미딘일, 몰포린일, 피페라진일, 인돌일, 벤즈푸란일, 피란일, 테트라하이드로피란일, 퀴누클리딘일, 이소옥사졸일, 벤즈이미다졸일, 메틸렌디옥시페닐, 에틸렌디옥시페닐, 말레이미도와 석신이미도기가 있다.

본 발명의 몇몇 화합물은 비대칭 탄소원자가 존재하기 때문에 하나 또는 그 이상의 키랄 중심을 갖는다. 비대칭 탄소원자는 각 키랄 중심에서 R 또는 S 입체화학으로 입체이성질체 또는 부분 입체 이성질체를 일으킨다. 본 발명은 이와같은 입체이성질체 및 부분입체 이성질체와 이들의 혼합물 모두를 포함한다.

본 발명의 화합물을 형성하는 염의 염들에는 생리적으로 수용할 수 있는 산부가염과 염기염이 있다. 적당한 산부가염은 비-독성염을 형성하는 산에서 형성된다. 예를들어, 초산염, 아스팔트산염, 벤조산염, 베실산염, 중탄산염/탄산염, 중화산염/황산염, 붕산염, 캄실산염, 시트르산염, 에디실산염, 에실산염, 포름산염, 푸마르산염, 글루셉트산염, 글루콘산염, 글루쿠론산염, 헥사플루오로인산염, 히벤즈산염, 염산염/염화물, 브롬화수소산염/브롬화물, 요오드화수소산염/요오드화물, 이세티온산염, 락트산염, 말산염, 말레산염, 말론산염, 메실산염, 메실황산염, 나프틸산염, 2-나프실산염, 니코틴산염, 질산염, 오로트산염, 옥살산염, 팔미트산염, 파모산염, 인산염/인산수소/인산이수소, 삭카르산염, 스테아르산염, 석신산염, 타르타르산염, 토실산염과 트리플루오로초산염이 있다. 적당한 염기염은 비-독성염을 형성하는 염기에서 형성된다. 예를들면, 알루미늄, 알기닌, 벤즈아틴, 칼슘, 콜린, 디메틸아민, 디올아민, 글리신, 리신, 마그네슘, 메글루민, 올라민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민과 아연염이 있다.

방법

R₄가 아미드기 -C(=O)NR₆R₇을 나타내는 본 발명의 화합물은 적당한 아민 NHR₆R₇을 다음식(II)의 화합물과 반응시켜서 카르복실산기를 아미드화하여 제조한다:

기호 R₁, R₃, X, R₆와 R₇은 상기식(I)에서 정의한 바와 같다.

화합물(즉, R₄가 카르복실산기인 본 발명의 화합물(I))은 다음식(III)의 화합물을 다음식(IV)의 히드라진과 반응시켜서 제조한다:

이 반응은 위치이성질체(IIA)와 (IIB):

혼합물의 제조를 가져오고, 이로부터 원하는 이성질체(IIA)를 분리한다.

또한, R₄가 에스테르 또는 아미드기인 화합물은 중간체(III)로부터 적당한 히드라진(IVA)과 반응시켜서 제조할 수 있다.

상기식에서 R₄는 에스테르 또는 아미드기이다. 다시 반응은 카르복실산(IIA)과 (IIB)의 에스테르 또는 아미드 유사체의 혼합물을 가져오고, 이로부터 원하는 에스테르 또는 아미드 이성질체(I)를 분리한다. 선택적으로 카르복실산 화합물(II)은 간단하게 에스테르화 또는 아미드화할 수 있다.

R₄가 "역성 아미드"기 -NR₇C(=O)R₆인 화합물(I)은 카르복실산(II)을 커어티스 재배열(Ninomiya, K.; Shioiri, T.; Yamada, S. Tetrahedron (1974), 30(14), 2151-7 참조)하여 하기 이소시아네이트(V)로 제조한 다음,

이소시아네이트기를 가수분해하여 아미노기로 하고 아미노기를 예를들어, 산염화물 Cl-C(=O)R₆로 아실화하여 제조한다. R₇이 수소가 아닌 경우, R₇ 치환기는 이소시아니에트 환원 단계 후 또는 아실기화 단계 후에 도입된다.

본 발명의 "역성 아미드" (R₄=NR₇C(=O)R₆) 화합물에 대한 선택적 방법에 있어, 이소시아네이트 부분을 니트로기로 대체한 구조식(V)의 화합물을 대응하는 아민으로 환원한 다음 이를 아실화하여 원하는 역성 아미드기를 형성시킨다.

또한 R₄가 우레아기 -NHC(=O)NHR₆ 또는 티오우레아기 -NHC(=S)NHR₆인 화합물은 이소시아네이트(V) 또는 대응하는 이소티오시아네이트를 적당한 아민 H₂NR₆와 반응시켜서 제조한다.

R₄가 카르바메이트기 -NR₇C(=O)OR₆인 화합물(I)은 이소시아네이트를 적당한 알코올 R₆OH와 반응시켜서 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물(I)과 (III)과 같은 중간체를 제조하는 합성방법의 더 상세한 설명은 하기 실시예들에서 볼 수 있다.

본 발명의 화합물에 있어:

기 R₄X-는 페닐환의 4-위치에 있는 것이 바람직하다.

X는 예를들어, 결합기 또는 -CH₂- 또는 -CH₂CH₂-기이다. 결합기가 바람직하다.

R₃는 예를들어, H, F, Cl, 메틸, 메톡시 또는 메틸렌디옥시이고, 이는 R₃가 H인 것이 바람직하다.

R₁은 예를들어, H, F, Cl, 메틸, 메톡시 또는 메틸렌디옥시이고, R₁이 특히 3-옥소-1,3-디하이드로-2H-파리졸로[4,3-C]신노린-2-일 환 시스템의 6-위치에서 수소 또는 플루오로인 것이 바람직하다.

R₄는 카르복실산기 (-COOH) 또는 이들의 에스테르 또는 -C(=O)NR₆R₇, -NR₇C(=O)R₆, -NR₇C(=O)OR₆ 또는 -NHC(=O)NHR₆, 상술한 모든 기를 나타낸다.

R₄가 에스테르기일 때, 예를들면, R이 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸 또는 벤질에스테르인 식 -COOR의 기가 있다.

R₆가 존재할 때, 이는 H 또는 식 -(Alk)_m-Q(여기서, m, Alk와 Q는 상술한 바와 같다)의 기를 나타낸다. m이 1일 때, Alk는 예를들어, -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂-와 -CH₂CH(CH₃)CH₂와 같은 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₆ 알킬렌기이다. 또한, Alk는 예를들어, 2가 시클로프로필렌, 시클로펜틸렌 또는 시클로헥실렌기이다. 기 Alk는 예를들어, OH, 옥소, CF₃, 메톡시 또는 에톡시에 의하여 임의로 치환될 수 있다. 기 Alk는 예를들어, 에테르, 티오에테르 또는 아미노 결합 형태로 헤테로원자를 임의로 함유할 수 있다.

기 Q는 예를들어, 수소; -NR₉R₁₀을 나타내고, 여기서 R₉과 R₁₀은 같거나 다른 것으로 수소, 메틸, 에틸, n- 또는 이소프로필 또는 tert-부틸; 에스테르기, 예를들어, 메틸, 에틸 또는 벤질에스테르; 또는 임의로 치환된 아릴, 아릴옥시, 시클로알킬, 시클로알켄일 또는 헤테로고리기, 예를들어, 페닐, 펜옥시, 시클로펜틸, 시클로헥실, 푸릴, 티에닐, 퀴누클리딘일, 피페리딜 또는 피페라진일기에서 선택된다.

R₇이 존재할 때, 이는 H 또는 C₁-C₆ 알킬, 예를들어, 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸을 나타내고; 또는 R₆와 R₇은 이들에 결합되는 원자 또는 원자들과 함께 취했을 때 5, 6 또는 7개의 환원자를 갖는 단일고리 헤테로고기를 형성한다.

특히 바람직한 것은 R₄가 -C(=O)NR₆R₇ 또는 -NHC(=O)NR₇R₆인 경우이고, 여기서 R₇은 수소이고, R₆는 식 -(Alk)_m-Q의 기를 나타내고, 이 식에서 m은 1이고, 2가기 Alk는 3 또는 4개의 탄소원자를 함유하고 비치환되며, Q는 -NR₉R₁₀을 나타내고, 여기서 R₉과 R₁₀은 각각 H; C₁-C₄ 알킬; C₃-C₄ 알켄일; C₃-C₄ 알킨일; C₃-C₆ 시클로알킬; 에스테르기; 임의로 치환된 탄소고리 또는 헤테로고리기를 나타내고; 또는 이들에 결합되는 질소와 함께 취했을 때 환이 임의로 치환되는 환을 형성한다.

특히 바람직한 본 발명의 다른 화합물은 다음식(IC)을 갖는다:

상기식에서 X는 상기에서 언급한 바와 같다. 이 다른 화합물에서 기 R₄X-는 페닐환의 4-위치에 있다. 이는 특히 X가 결합기이고, R₄가 -C(=O)NR₆R₇(여기서, R₆와 R₇은 상술한 바와 같다)인 화합물을 포함한다. 예를들면, 이와같은 화합물에서 R₆는 퀴누클리딘일이고, R₇은 수소이다.

본 발명의 바람직한 화합물은 다음식(A)의 4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-피라졸로[4,3-C]신노린-2-일)-N-(2,2-디플루오로-에틸)-벤즈아미드

또는 이들의 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매화물이 있다.

본 발명의 다른 바람직한 화합물에는 다음식(B)의 N-[3-(tert-부틸-메틸-아미노)-부틸]-4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-피로졸로[4,3-C]신노린-2-일)-벤즈아미드

상술한 바와 같이 본 발명은 식(I)의 화합물 또는 이들의 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염과 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 부형제 또는 담체와 함께 이루어지는 약학적 또는 수의학적 조성물을 포함한다. 이러한 조성물에 있어 어떠한 특수 환자에 대한 특별한 투약량 수준은 사용되는 특수 화합물의 활성도, 나이, 체중, 일반 건강, 성별, 식이요법, 투약시간, 투약방법, 배설율, 약조합과 치료를 받는 특별한 질병의 원인 및 정도를 포함한 여러가지 요인에 따르게 됨을 이해할 것이다. 최적의 투약량 수준과 투약 횟수는 임상시험에 의하여 결정된다.

본 발명이 관련되는 화합물은 이들의 약동적 성질을 이루는 방식으로 투여하기 위하여 제조할 수 있다. 경구투여성 조성물은 정제, 캡슐, 분제, 입제, 함당정제, 경구적 국소적 또는 살균 비경구적 용액 또는 현탁액과 같은 액제 또는 겔제의 형태를 갖는다. 경구 투여용 정제와 캡슐은 단위 투약 표시 형태로 할 수 있고, 결합제, 예를들어, 시럽, 아라비아고무, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트 또는 폴리비닐-피롤리돈; 충전제, 예를들어, 락토스, 당분, 옥수수-전분, 인산칼슘 또는 글리신; 정제윤활제, 예를들어, 스테아르산 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실리카; 붕해제, 예를들어, 감자전분 또는 황산 라우릴 나트륨과 같은 수용할 수 있는 습윤제와 같은 일반적 부형제를 함유할 수 있다. 정제는 일반 제약계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 코팅한다. 경구액제는 예를들어, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유액, 시럽 또는 엘릭스 형태로 하거나 또는 사용 전 물 또는 다른 매체와 재구성되는 건조생성물로 할 수 있다. 이와 같은 액제는 현탁제, 예를들어, 솔비톨, 시럽, 메틸 셀루로오스, 글루코오스 시럽, 젤라틴 수소화 식용유; 유탁제, 예를들어, 레시틴, 모노올레산 솔비탄 또는 아라비아 고무; 비-수성 매체(이는 식용유를 포함한다), 예를들어, 아몬드유, 분별된 코코넛유, 글리세린과 같은 오일상 에스테르, 프로필렌 글리콜 또는 에틸알코올, 방부제, 예를들어, 메틸 또는 프로필 P-히드록시벤조에이트 또는 소르브산과 같은 일반적 첨가제를 함유하고, 필요하면 일반적 향미료 또는 착색제를 함유할 수 있다.

피부에 국소적 사용에 있어, 약제는 크림, 로션 또는 연고로 만들 수 있다. 약제로 사용되는 크림 또는 연고제형은 예를들어, 영국 약전과 같은 표준 약학 교재에 기술된 바와 같이 본 분야에 잘 알려져 있는 일반적 제형이다.

눈에 국소적 사용에 있어, 약제는 적당한 살균 수성 또는 비수성 매체에서 용액 또는 현탁액으로 만들 수 있다. 또한, 첨가제, 예를들어, 메타아황산 나트륨 또는 에데산 이나트륨과 같은 완충제; 페닐 수은 초산염 또는 질산염, 염화 벤즈알코늄 또는 클로로헥시딘과 같은 살박테리아제 및 살균제를 포함하는 방부제와 히드로멜로오스와 같은 농후제도 포함시킬 수 있다.

또한, 유효성분을 살균매체에 비경구적으로 투여할 수 있다. 사용되는 매체와 농도에 따라 액제를 매체에 현탁시키거나 아니면 용해시킬 수 있다. 유리하기로는 국소마취제, 방부제와 완충제와 같은 보조제를 매체에 용해시킬 수 있다.

본 발명의 구성을 비-제한적인 다음 실시예에서 기술한다:

다음 약어는 실험 설명에 사용된다.

DMF 디메틸 포름아미드

DMA 디메틸 아세트아미드

DMSO 디메틸 술폭시드

HBTU O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

LCMS 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼

NMR 핵자기공명분광학

실시예 1

단계 1: (페닐히드라조노)말론산의 제조:

메소옥살산 나트륨 일무수물(5.00g, 27.8mmol)을 1M 염산(50㎖)에 용해시켜서 무색의 흐린 용액을 얻는다. 페닐히드라진(300g, 2.72㎖, 27.8mmol)을 교반된 혼합물에 실온에서 적가한다. 형성된 황색 침전물을 90분 여과하여 수집하고 물(50㎖)로 세척한다. 필터 케이크를 초산 에틸/헥산[1:1]과 분쇄하고, 여과하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물이 황색분말(4.74g, 22.7mmol, 82%)로서 단리된다. LCMS: m/z 207 [M-H]⁺.

또한 생성물을 수성상에서 초산 에틸(2×50㎖)로 추출하고, 유기상을 황산 마그네슘에서 건조시키고, 여과하고 용매를 진공하에 제거한다.

단계: (페닐히드라조논)말로노일 이염화물의 제조:

(페닐히드라조노)말론산(1.00g, 4.80mmol)을 비활성분위기하에 건조클로로포름(15㎖)과 혼합하여 황색현탁액을 얻는다. 혼합물을 실온에서 교반하고 오염화인(2.19g, 10.5mmol)을 적가한다. 반응혼합물을 1.5시간 동안 환류하에 가열하여 녹색 용액을 얻는다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 헥산(15㎖)으로 희석한다. 형성된 녹색 침전물을 여과하여 수집하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물을 녹색분말(645㎎, 2.63mmol, 53%)로 단리한다.

단계 3: 메틸 4-히드록시신노린-3-카르복실레이트의 제조

(페닐히드라조노)말로노일 이염화물(2.45g, 0.01mmol)을 비활성 분위기하에 1,2-디클로로에탄(15㎖)과 혼합하여 황색현탁액을 얻는다. 사염화티타늄(1.89g, 1.09㎖)을 적가하여 갈색용액을 형성시킨다. 혼합물을 환류하에 하룻밤 가열하고 실온하에 냉각시키고, 방울을 메탄올(15㎖)로 급냉시킨다. 교반을 30분 동안 계속하고 휘발물을 진공하에 제거한다. 물(100㎖)을 가하고 얻은 현탁액을 n-부탄올(2×50㎖)로 추출한다. 조합된 유기상을 물(2×20㎖)로 세척하고 진공하에 농축한다. 제목의 화합물을 녹색고체(1.04g, 5.10mmol, 51%)로 단리한다. LCMS: m/z 205 [M+H]⁺.

단계 4: 메틸 4-클로로신노린-3-카르복실레이트의 제조:

염화티오닐(8.15g, 5㎖)을 비활성분위기하에 메틸 4-히드록시신노린-3-카르복실레이트(0.50g, 2.45mmol)를 적가한다. 혼합물을 1.5시간 동안 환류하에 가열하고 실온으로 냉각하고 과량의 염화티오닐을 진공하에 제거한다. 톨루엔(5㎖)을 잔재에 가한다. 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반한다. 고체를 여과하여 수집하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물을 갈색고체(248㎎, 1.11mmol, 45%)로서 단리한다. LCMS: m/z 223 [M+H]⁺.

단계 5: 4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-C]신노린-2-일)벤조산의 제조:

4-히드라지노벤조산(68.4㎎, 0.45mmol)을 실온에서 에탄올(5㎖)과 혼합하여 크림색 현탁액을 얻는다. 메틸 4-클로로신노린-3-카르복실레이트(100㎎, 0.45mmol)를 가하고 혼합물을 1시간 동안 45-50℃로 가열한다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고 용매를 진공하에 제거한다. 초산에틸(10㎖)을 잔재에 가한다. 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반한다. 고체를 여과하여 수집하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물을 갈색분말(120㎎, 0.39mmol, 86%)로 단리한다. LCMS: m/z 307 [M+H]⁺. NMR[DMSO-d₆];δ=7.69-7.77(m, 1H_aryl); 7.81-7.90(m, 2H_aryl); 8.05(d, J=8.85, 2H_aryl); 8.20(d, J=7.92Hz, 1H_aryl); 8.33(d, J=8.85Hz, 2H_aryl); 14.64(s, NH).

선택적으로 반응을 실온에서 행한다. 이 경우 2-3시간의 더 긴 반응시간이 필요하다.

실시예 2

N-[(디메틸아미노)프로필]-4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-C]신노린-2-일)벤즈아미드의 제조:

4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조산(25㎎, 0.08mmol)을 DMF(1㎖)와 혼합한다. 디이소프로필에틸아민(21㎎, 28㎕, 0.16mmol)과 3-디메틸아미노프로필아민(8.2㎎, 10.0㎕, 0.09mmol)을 가한 다음 HBTU(30.3㎎, 0.08mmol)를 가한다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한다. 생성물을 정제 HPLC에 의하여 정제한다. 제목의 화합물을 적색 고체(12.6㎎, 0.032mmol, 40%)로 단리한다. LCMS: m/z 391 [M+H]⁺.

실시예 3

N-벤질-4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤즈아미드의 제조:

4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조산(52㎎, 0.17mmol)을 DMF(2㎖)와 혼합한다. 디이소프로필에틸아민(22㎎, 29㎕, 0.17mmol)과 벤질아민(18.2㎎, 18.6㎕, 0.17mmol)을 첨가한 다음 HBTU(64.5㎎, 0.17mmol)를 가한다. 혼합물을 4시간 동안 실온에서 교반한다. 생성물을 정제 HPLC에 의하여 정제한다. 제목의 화합물을 적색고체(6.6㎎, 0.02mmol, 10%)로 단리한다. LCMS: m/z 396 [M+H]⁺.

실시예 4

단계 1: 4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조일염화물의 제조:

염화티오닐(90㎖)을 4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로-[4,3-c]신노린-2-일)벤조산(2.36g, 7.70mmol)에 가한다. 혼합물을 2시간 동안 질소 분위기에서 환류하에 가열한다. 짙은 적색용액을 얻고, 실온으로 냉각시키고 과량의 염화티오닐을 진공하에 제거한다. 톨루엔(30㎖)을 잔재에 가하고 혼합물이 침전이 완료될 때까지 질소분위기하에 실온에서 교반한다. 고체를 여과하여 수집하고 톨루엔(2×30㎖)으로 세척한다. 제목의 화합물을 적색고체(2.20g, 6.77mmol, 88%)로 단리한다. LCMS: m/z 321 [M+H]⁺ (메탄올에서 조제한 시료에서 나온 메틸 에스테르).

단계 2: N-[(시클로헥실아미노)프로필]-4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤즈아미드의 제조:

4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조일염화물(97㎎, 0.30mmol)을 무수 DMA(2㎖)에 용해시킨다. 디이소프로필에틸아민(39㎎, 53㎕, 0.60mmol)을 가한 다음 N-시클로헥실-1,3-프로판디아민(52㎎, 0.60mmol)을 가한다. 혼합물을 30분 동안 가하고, 물(5㎖)을 가하여 짙은 적색 현탁액을 얻는다. 혼합물을 n-부탄올(2×20㎖)로 추출하고, 조합된 유기상을 수세하고 침전이 관찰될 때까지 진공하에 농축한다. 헥산(20㎖)과 초산 에틸(10㎖)을 가하고, 고체를 여과하여 수집하고 진공하에 건조한다. 생성물을 짙은 적색 고체(82㎎, 0.18mmol, 62%)로 단리한다. LCMS: m/z 445 [M+H]⁺.

실시예 5:

단계 1: [(2-플루오로페닐)히드라조노]말론산의 제조:

메소옥살산 나트륨 일수화물(2.31g, 12.3mmol)을 1M 염산에 용해시켜서 무색의 흐린 용액을 얻는다. 2-플루오로-페닐히드라진 하이드로 클로라이드(200g, 12.3mmol)을 실온에서 교반한 혼합물에 적가한다. 형성된 황색침전물, 혼합물을 물(50㎖)로 희석하고 교반을 하룻밤 계속한다. 초산 에틸(150㎖)을 가하고, 상을 고체가 용해될 때까지 강하게 혼합하다. 상을 분리하고 수성상을 초산 에틸(50㎖)로 세척한다. 조합된 유기상을 황산마그네슘에서 건조하고, 여과하고 용매를 진공하에 제거한다. 제목의 화합물을 황색 분말(2.55g, 11.7mmol, 92%)로 단리한다. LCMS: m/z 227 [M+H]⁺.

단계 2: [(2-플루오로페닐)히드라조노]말로노일 이염화물의 제조:

(2-플로오로페닐히드라조노)말론산(1.33g, 5.88mmol)을 비활성분위기하에 건조 클로로포름(20㎖)과 혼합하여 황색현탁액을 얻는다. 혼합물을 실온에서 교반하고 오염화인(2.69g, 12.9mmol)을 적가한다. 반응혼합물을 2시간 동안 환류하에 가열하여 짙은 황색용액을 얻는다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 침전이 일어날 때까지 진공하에 농축한다. 고체를 여과하여 수집하고, 헥산(30㎖)으로 세척하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물을 황색분말(760㎎, 2.89mmol, 49%)로 단리한다.

단계 3: 메틸 8-플루오로-4-히드록시신노린-3-카르복실레이트의 제조:

(2-플루오로페닐히드라조노)말로노일이염화물(19.4g, 74mmol)을 비활성분위기하에 1,2-디클로로에탄(100㎖)과 혼합하여 황색현탁액을 얻는다. 사염화티타늄(13.9g, 8.08㎖, 74mmol)을 적가하여 갈색용액을 형성시킨다. 혼합물을 하룻밤 환류하에 가열하고, 사염화티타늄(13.9g, 8.08㎖, 74mmol)을 더 가하고 24시간 동안 가열을 계속한다. 반응혼합물을 0-5℃로 냉각시키고 방울을 메탄올(50㎖)로 급냉시킨다. 교반을 1시간 동안 실온에서 계속하고 휘발물을 진공하에 제거한다. 물(300㎖)을 가하고 얻은 현탁액을 초산에틸(3×100㎖)로 추출한다. 조합된 유기상을 황산마그네슘에서 건조하고, 여과하고 진공하에 농축한다. 황색고체를 얻는다(12g 조생성물). LCMS: m/z 223 [M+H]⁺.

단계 4: 4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조산의 제조:

전단계에서 나온 조 8-플루오로-4-히드록시신노린-3-카르복실레이트(1.00g, 4.95mmol)를 염화티오닐(50㎖)에 용해시키고, 가스방출이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 용액을 2-3시간 동안 환류하에 가열한다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고 과량의 염화티오닐을 진공하에 제거한다. 조중간체를 톨루엔(3×25㎖)과 함께 끓이고, 얻은 짙은 갈색 고체를 에탄올(25㎖)에 용해시킨다. 4-히드라지노벤조산(640㎎, 4.21mmol)을 가하고 혼합물을 하룻밤 실온에서 교반한다. 고체를 여과하여 수집하고, 1M HCl(100㎖)에 혼합하고, 여과하고, 헥산(50㎖)으로 세척하고 진공하에 건조한다. 갈색고체를 얻는다(890㎎의 조생성물). LCMS: m/z [M+H]⁺ 325.

실시예 6

단계 1: 4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조산 염화물의 제조:

전단계에서 나온 조 4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4-3c]신노린-2-일)벤조산(1.45㎎)를 염화티오닐(50㎖)에 용해시킨다. 혼합물을 더 이상 가스방출이 관찰되지 않을 때까지 용액을 2-3시간 동안 70℃로 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고 과량의 염화티오닐을 진공하에 제거한다. 잔재를 톨루엔(2×20㎖)과 함께 끓여서 고체를 얻는다. 고체를 여과하여 수집하고, 톨루엔으로 세척하고 진공하에 건조한다. 생성물을 황색분말(670㎎, 1.95mmol)로 단리한다. LCMS: m/z [M+H]⁺ 339 (메탄올에서 조제한 시료에서 나온 메틸 에스테르).

단계 2:4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)-N-(피롤리딘-1-일-부틸)벤즈아미드의 제조:

4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3c]신노린-2-일)벤조일염화물(100㎎, 0.29mml)을 무수 DMA(2㎖)에 용해시킨다. 디이소프로필에틸아민(75㎎, 101㎕, 0.58mmol)을 가한 다음 1-(4-아미노부틸)피롤리딘(41㎎)을 가한다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하고, 물(5㎖)과 n-부탄올(5㎖)을 가한다. 상을 분리하고, 유기상을 물(2×5㎖)로 세척한다. 휘발물을 진공하에 제거한다. 생성물을 갈색분말(50㎎, 0.11mmol, 37%)로 단리한다. LCMS: m/z [M+H]⁺ 463.

실시예 7

4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)-N-(1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘-4-일)벤즈아미드의 제조:

4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조일염화물(100㎎, 0.29mmol)을 무수 DMA(2㎖)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(75㎎, 101㎕, 0.58mmol)을 가한 다음 4-아미노-1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘(49㎎, 0.29mmol)을 가한다. 혼합물을 하룻밤 교반한다. 물(5㎖)과 n-부탄올(5㎖)을 가하고, 상을 분리한다. 유기상을 물(2×5㎖)로 세척하고 용액을 진공하에 농축한다. 제목의 화합물을 짙은 적색고체(50㎎, 0.105mmol, 36%)로 단리한다. LCMS: m/z [M+H]⁺ 477.

실시예 8

단계 1: 2-(4-니트로페닐)-1,2-디하이드로-3H-피라졸로[4,3-c]신노린-3-온

염화티오닐(326g, 200㎖)을 비활성분위기하에 메틸 4-히드록시신노린-3-카르복실레이트(10.0g, 49mmol)를 적가한다. 혼합물을 2.5시간 동안 환류하에 가열하고, 실온에서 냉각시키고 과량의 염화티오닐을 진공하에 제거한다. 톨루엔(100㎖)을 잔재에 가하고 진공하에 제거한다. 이 과정을 다른 톨루엔(100㎖)로 반복한다. 갈색 반-고체 물질을 얻고 에탄올(200㎖)에 용해시키고, N-니트로페닐히드라진(5.99g, 29.3mmol)을 적가한다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하고, 혼합물을 1시간 동안 40-45℃로 가열하고 실온으로 냉각시킨다. 고체를 여과하여 수집하고, 에탄올(100㎖)과 분쇄하고 진공하에 건조한다. 제목의 화합물을 갈색고체(8.42g, 27.4mmol, 70%)로 단리한다. LCMS: m/z 308 [M+H]⁺.

단계 2: 2-(4-아미노페닐)-1,2-디하이드로-3H-피라졸로[4,3-c]신노린-3-온의 제조:

2-(4-니트로페닐)-1,2-디하이드로-3H-피라졸로[4,3-c]신노린-3-온(11.4g, 37.2mmol)을 에탄올(100㎖)과 물(100㎖)의 혼합물에 현탁시킨다. 철분(11.1g, 200mmol)과 염화암모늄(5.34g, 100mmol)을 가한다. 혼합물을 하룻밤 80℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고 탄산칼륨으로 pH9-10으로 염기화한다. 고체를 Celite 패드로 여과하여 제거한다. 여액을 n-부탄올(2×200㎖)로 추출하고, 조합된 유기상을 진공하에 농축하여 짙은 적색 고체를 얻는다. 제목의 화합물을 짙은 적색분말(5.58g, 20.1mmol, 57%)로 단리한다. LCMS: m/z 278 [M+H]⁺.

단계 3: N-[3-(디메틸아미노)프로필]-N'-[4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)페닐]우레아의 제조:

2-(4-아미노페닐)-1,2-디하이드로-3H-피라졸로[4,3-c]신노린-3-온(44㎎, 0.16mmol)을 0-5℃에서 질소분위기하에 톨루엔(0.5㎖)에 현탁시키고, DMA(0.5㎖)를 가한 다음 N,N'-카르보닐디이미다졸(26㎎, 0.16mmol)을 가한다. 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반한 후 톨루엔(0.5㎖)에 용해한 3-디메틸아미노프로필아민(18㎎, 0.18mmol)의 용액과 혼합한다. 1시간 동안 교반을 계속하고 생성물을 정제 HPLC에 의하여 정제한다. 제목의 화합물을 짙은 적색분말(2.6㎎, 6μmol, 4%)로 단리한다. LCMS: m/z 406 [M+H]⁺.

실시예 9: 4-(3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)벤조산 에틸 에스테르의 제조:

제목의 화합물은 모산 대신에 4-히드라지노벤조산 에틸 에스테르를 사용하여 실시예 1 단계 5의 방법으로 제조한다. MS: MH⁺=335.2

결과

BIAcore 생체 분자 상호작용 분석의 사용

바이오티닐화된 인체 CD80(hCD80-BT)은 CD28에 결합하여 T세포활성화를 개시하는 막결합 수용체분자(CD80)의 재조합 용해 형태이다. CD80과 CD28 사이의 상호작용은 광범위하게 연구되었다(Collins 등, 2002). 비오틴일화된 인체 HLA-A2-tax는 대조단백질로서 이 실시예에서 사용되고, 화합물과 상호작용이 기대되지 않는 각 결합수용체 분자의 재조합 용해 형태이다.

BIAcore S51^TM은 상기 실시예 1-4의 화합물을 선별하는데 사용한다. A 시리즈 S 센서 쳅 CM5는 BIAcore S51^TM에 설치된다. 스트렙타비딘은 표준 아민 결합을 사용하여 카르복시메틸 표면에 결합된다. 칩 표면은 0.2M EDC/0.05M NHS로 활성화된 다음 스트렙타비딘(10mM 초산나트륨 pH5.0에서 0.25㎎/㎖)을 결합하고, 1M 에틸렌디아민으로 비점유된 부위를 포화시킨다.

BIAcore S51 센서 칩은 단백질을 부동화하는 두가지 분리된 센서점을 갖는다. hCD80-BT는 약 3000RU의 반응이 관찰될 때까지 첫번째 센서점의 스트렙타비딘-피복 표면에서 부동화된다. 화합물의 비-특이적 결합을 대조하는 단백질은 두번째 센서점에서 부동화된다. 이들 실험에 사용되는 대조 단백질은 인체 HLA 단백질의 비오틴일화된 용해 형태이다.

희석시리즈의 화합물(100mM-0.05mM)은 실행완충제(10mM, pH7.4, 150mM NaCl, 0.005% P20; 5% DMSO)에서 제조한다.

BIAcore S51^TM은 실행 완충제를 사용하여 30㎕/분의 유속으로 행한다. 용매 효과 데이타를 보정하기 위한 화합물과 DMSO 표준 용액이 분사된다. 데이타는 자동적으로 기록되고 BIAcore S51 평가 소프트웨어를 사용하여 분석한다.

CD80과 내인성 단백질 리간드(CD28) 사이의 상호작용은 4750mM의 K_D와 0.2 s^-1 이상의 오프-율로 아주 특이하나, 비교적 약하다. 실시예 2, 3, 4, 6, 7은 100mM 이하의 K_Ds와 2×10^-2의 오프-율을 갖는 CD28보다 CD80에서 더 큰 친화성과 더 긴 체류시간을 가지며, 신노린이 내인성 리간드와 효과적으로 경쟁할 수 있음을 나타낸다. 신노린은 대조 단백질과의 상호작용이 검출되지 않았다.

참고

Collins AV 등 (2002) Immunity 17, 201-210 "재체류된 공동 자극 분자의 상호 활동성"

인체 쥬르카트 T세포에 의한 인터류킨 -2(1L-2)의 생성 억제.

방법

사람의 라지 세포는 10% 우태아 혈청으로 보충된 RPM1-1640 매체, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 96-웰 둥근 바닥 마이크로 적정판에서의 1% 글루타민(RPM1 매체)에서 웰 당 2×10⁵ 세포의 농도로 분배된다. 연구하에 화합물(100% DMSO에 용해)을 RPM1 매체에서 원하는 최종 농도의 8배로 희석하고 웰 당 200㎕의 전체 체적에 대하여 요구되는 최종 농도로 가한다. 37℃에서 배양 20분 후, 쥬르카트 T세포는 웰 당 2×10⁵ 세포의 농도로 첨가된다. CD3(UCH1, R&D 시스템)에 대한 단클론성 항체는 ㎖ 당 1㎍의 최종 농도로 배양물에 첨가되고, 여기서 표시된 바와 같이 CD28(CD28.2, BC-Pharmingen)에 대한 단클론성 항체는 ㎖ 당 2.5㎍의 농도로 첨가된다. 세포는 5시간 동안 37℃에서 배양하고, 이후 플레이트를 원심분리하고, 상청액은 제조자 지시에 따라서 1L-2-Eli-쌍키트(DIACLONE Research, Besancon, France)를 사용하여 1L-2 ELISA 분석으로 수확한다.

예를들어, 실시예 2의 화합물(AV1142005)은 30μM에서 65% 억제를 나타낸다.

균일 시간 분해 형광 분석

상술한 실시예들을 세포 유리 균일 시간 분해 형광(HTRF) 분석으로 시험하여 CD80-CD28 상호작용의 억제제로서 그들의 활성을 측정한다.

분석에서 유로피움과 알로피코시아닌(APC)은 CD28과 CD80과 간접적으로(항체 가교제를 통하여) 결합되어 복합체를 형성하고, 이는 유로피움과 APC를 밀접한 근접을 가져오게 하여 신호를 발생시킨다. 복합체는 다음의 6가지 단백질로 이루어진다: 형광 표지 1, 가교체 항체 1, CD28 융합 단백질, CD80 융합 단백질, 가교제 항체 2와 형광 표지 2. 하기 표에서 이들 시약을 더 상세하게 설명한다.

형광 표지 1	유로피움으로 표지된 항-토끼 IgG (1㎍/㎖)
가교제 항체 1	마우스 Fc 단편에 특이한 토끼 IgG (3㎍/㎖)
CD28 융합 단백질	CD28-마우스 Fc 단편 융합 단백질 (0.48㎍/㎖)
CD80 융합 단백질	CD80 마우스 Fab 단편(C215) 융합 단백질 (1.9㎍/㎖)
가교제 항체 2	GαMκ-비오틴: 마우스 카파쇄에 특이한 비오틴화된 염화 IgG (2㎍/㎖)
형광 표지 2	SA-APC: 스트렙타비딘 표지 알로피코시아닌 (8㎍/㎖)

복합체의 형성에서 유로피움과 APC는 근접성을 가져오고 신호를 발생한다.

비-특이적 상호작용은 마우스 Fab 단편(C215)를 CD80 마우스 Fab 단편 융합 단백질(1.9㎍/㎖)로 치환하여 측정한다. 분석은 30㎕의 최종 체적으로 블랙 384 웰 플레이트에서 행한다. 분석완충제: 0.1% 사용직전에 가한 BSA(w/v)을 함유하는 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl pH7.8.

화합물을 100μM-1.7nM 사이의 농도 시리즈 범위에서 상기 시약에 가한다. 실온에서 4시간 동안 반응물을 배양한다. Wallac Victor 1420 다표지 계수기를 사용하여 두 측정을 이룬다. 제일측정: 여기 340㎚, 방출 665㎚, 지연 50㎲, 창시간 200㎲, 형광 교차, 급냉과 배경에 대하여 계수는 자동적으로 보정된다. 시험된 화합물의 EC50 활성도는 다음과 같이 기록된다:

EC50: *=>10μM, **=1-10μM, ***=<1μM.

실시예 1-8의 화합물은 상술한 HTRF 분석에서 다음과 같은 활성도를 갖는다:

실시예 1*

실시예 2***

실시예 3***

실시예 4***

실시예 5*

실시예 6***

실시예 7***

실시예 8***

실시예 9**

부가적 실시예

본 발명 화합물의 다른 실시예는 상기 실시예 1-8의 방법과 유사한 방법으로 합성하는 것이다. 합성된 화합물의 구조식은 상술한 HTRF 분석에서의 그들의 활성도와 함께 하기 표에 표시했다:

표

상술한 인체 쥬르카트 T세포에 의한 인터류킨-2(1L-2)의 생성을 억제하는 분석에서 상기 화합물을 시험한 결과의 실시예들은 다음과 같다:

실시예 번호(표참조)	화합물 농도(μM)	억제 퍼센트(DMSO=%에 대한것)
478	10	56.0
376	10	56.7
353	10	77.4
429	10	58.5
349	10	79.5
68	10	71.7
235	10	59.3
288	30	72
162	30	54.4
350	10	74.2
381	10	48.5
442	10	58.9
482	10	39.2
472	10	58.4
453	10	55.7
53	30	63.8

Claims

다음식(I)의 화합물 또는 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 이들의 염, 수화물이나 용매화물:

상기식에서

R₁과 R₃는 각각 H; F; Cl; Br; -NO₂; -CN; F 또는 Cl에 의하여 임의로 치환된 C₁-C₆ 알킬; 또는 F에 의하여 임의로 치환된 C₁-C₆ 알콕시를 나타내며;

R₄는 카르복실산기 (-COOH) 또는 이의 에스테르 또는 -(C(=O)NR₆R₇, -NR₇C(=O)R₆, -NR₇C(=O)OR₆, -NHC(=O)NR₇R₆ 또는 -NHC(=S)NR₇R₆, 여기서

R₆는 H 또는 식 -(Alk)_m-Q기를 나타내며,

이 식에서 m는 0 또는 1이고,

Alk는 임의로 치환된 2가 직쇄 또는 분지쇄 C₁-C₁₂ 알킬렌 또는 C₂-C₁₂ 알켄일렌 또는 C₂-C₁₂ 알킨일렌기 또는 2가 C₃-C₁₂ 탄소고리기이고, 이 기들은 하나 또는 그 이상의 -O-, -S- 또는 -N(R₈)- 결합(여기서, R₈은 H 또는 C₁-C₄ 알킬, C₃-C₄ 알켄일, C₃-C₄ 알킨일 또는 C₃-C₆ 시클로알킬을 나타낸다)을 함유하며,

Q는 H; -NR₉R₁₀(여기서, R₉과 R₁₀은 각각 H; C₁-C₄ 알킬; C₃-C₄ 알켄일; C₃-C₄ 알킨일; C₃-C₆ 시클로알킬; 에스테르기; 임의로 치환된 탄소고리 또는 헤테로고리기를 나타내거나 또는 R₉와 R₁₀은 이들에 결합되는 수소와 함께 취했을 때 환이 임의로 치환되는 환을 형성한다)을 나타내고;

R₇은 H 또는 C₁-C₆ 알킬을 나타내거나 또는 R₆와 R₇은 이들에 결합되는 원자 또는 원자들을 함께 취했을 때 5, 6 또는 7의 환원자를 갖는 임의로 치환된 단일고리 헤테로고리환을 형성하며;

X는 결합기 또는 식 -(Z)_n-(Alk)- 또는 -(Alk)-(Z)_n-(여기서, Z는 -O-, -S- 또는 -NH-을 나타내고, Alk는 R₆에서 정의한 바와 같고, n은 0 또는 1이다)의 2가기를 나타낸다.
제1항에 있어서, 기 R₄X-가 페닐환의 4-위치에 있는 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, X가 결합기인 화합물.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, R₃가 수소인 화합물.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, R₁이 수소 또는 플루오로인 화합물.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, R₄가 -C(=O)NR₆R₇(여기서, R₆와 R₇은 제1항에서 정의한 바와 같다)을 나타내는 화합물.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, R₄가 -NHC(=O)NR₆R₇(여기서, R₆와 R₇은 제1항에서 정의한 바와 같다)을 나타내는 화합물.
제7항에 있어서, R₆가 퀴누클리딘일기인 화합물.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, R₆가 식 -(Alk)_m-Q의 기를 나타내고, 이 식에서 m는 1이고, 2가기 Alk는 3 또는 4개의 탄소원자를 함유하고 비치환되며, Q는 -NR₉R₁₀을 나타내고, 여기서 R₉와 R₁₀은 각각 H; C₁-C₄ 알킬; C₃-C₄ 알켄일; C₃-C₄ 알킨일; C₃-C₆ 시클로알킬; 에스테르기; 임의로 치환된 탄소고리 또는 헤테로고리기를 나타내거나; 또는 이들에 결합된 질소와 함께 취했을 때 환이 임의로 치환되는 환을 형성하는 화합물.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R₇이 수소인 화합물.
제1항에 있어서, Q가 H; -CF₃; -OH; -SH; -NR₈R₈을 나타내고, 여기서 각 R₈은 독립적으로 H; C₁-C₄ 알킬; C₃-C₄ 알켄일; C₃-C₄ 알킨일; C₃-C₈ 시클로알킬; 에스테르기; 임의로 치환된 아릴, 아릴옥시, 시클로알킬, 시클로알켄일 또는 헤테로고리기를 나타내거나; 또는 이들에 결합되는 질소와 함께 취했을 때 환을 형성하고;

R₇은 H 또는 알킬을 나타내고; R₆와 R₇은 이들에 결합되는 원자 또는 원자들을 함께 취했을 때 5, 6 또는 7개의 환원자를 갖는 단일고리 헤테로고리환을 형성하는 화합물.
제11항에 있어서, R₄가 카르복실산기 (-COOH) 또는 식 -COOR의 에스테르기(여기서, R은 메틸, 에틸, n- 또는 이소-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸 또는 벤질이다)를 나타내는 화합물.
제11항 또는 제12항에 있어서, R₆는 식 -(Alk)_m-Q의 기를 나타내고, 여기서 m은 1이고, Alk는 -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH₂CH₂CH₂- 또는 -CH₂CH(CH₃)CH₂- 또는 OH, 옥소, CF₃, 메톡시 또는 에톡시에 의하여 임의로 치환된 2가 시클로프로필렌, 시클로펜틸렌 또는 시클로헥실렌기이고, Q는 수소; -NR₈R₈를 나타내고, 여기서 각 R₈는 동일하거나 다르고, 수소, 메틸, 에틸, n- 또는 이소프로필 또는 tert-부틸; 메틸, 에틸 또는 벤질; 또는 임의로 치환된 페닐, 펜옥시, 시클로펜틸, 시클로헥실, 푸릴, 티에닐, 피페리딜 또는 피페라진일기에서 선택하는 화합물.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, R₇이 메틸, 에틸, n- 똔,ㄴ 이소-프로필, n-, sec- 또는 tert-부틸을 나타내고; 또는 R₆와 R₇는 이들에 결합되는 원자 또는 원자들과 함께 취했을 때 5, 6 또는 7개의 환원자를 갖는 단일고리 헤테로고리환을 형성하는 화합물.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R₁이 H, F, Cl, 메틸, 메톡시 또는 메틸렌디옥시인 화합물.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R₁이 F이고, 3-옥소-1,3-디하이드로-2H-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일 환시스템의 6위치에 있는 화합물.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R₃가 H, F, Cl, 메틸, 메톡시 또는 메틸렌디옥시인 화합물.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, X가 결합기 또는 -CH₂- 또는 -CH₂CH₂-기인 화합물.
다음식(IC)의 화합물, 이들의 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매화물:

상기식에서 X와 R₄는 제3, 7 내지 10 또는 11 내지 18항 중 어느 한 항에 명시된 바와 같다.
제18항에 있어서, 기 R₄X-가 페닐환의 4-위치에 있는 화합물.
제19항 또는 제20항에 있어서, X가 결합기이고, R₄가 -C(=O)NR₆R₇(여기서, R₆와 R₇은 제11항 또는 제13항이나 제14항에 각각 명시된 바와 같다)인 화합물.
다음식(A)의 화합물 4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)-N-(2,2-디플루오로-에틸일)-벤즈아미드 또는 이들의 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매화물:
다음식(B)의 화합물 N-[3-(tert-부틸-메틸-아미노)-부틸]-4-(6-플루오로-3-옥소-1,3-디하이드로-피라졸로[4,3-c]신노린-2-일)-벤즈아미드 또는 이들의 약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 염, 수화물 또는 용매화물:
약학적으로 또는 수의학적으로 수용할 수 있는 부형제 또는 담체와 함께 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 화합물로 이루어지는 약학적 또는 수의학적 조성물.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 조절에 유익한 증상을 치료하는데 사용하는 화합물.
면역 조절에 유익한 증상을 치료하기 위한 의약품을 제조하는데 사용하는 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
면역 조절 유효 투약량의 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 치료가 필요한 포유류에 투여하여서 하는 사람을 포함한 포유류의 면역 조절 방법.
면역 조절이 면역-억제인 제25항에서 사용하는 화합물, 제26항에 따른 용도 또는 제27항에 따른 방법.
증상이 자가 면역 질병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 천식, 이식, 전신홍반성 낭창과 건선인 제25항에서 사용하는 화합물, 제26항에 따른 용도 또는 제27항에 따른 방법.