KR20050083971A - 인지능 손상의 치료를 위한 표적 - Google Patents

인지능 손상의 치료를 위한 표적 Download PDF

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파울라인 케이 룬드
제프리 디. 로스스테인
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더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본 발명은 인지능 손상을 치료하기 위한 조성물 및 인지능 손상에 관련된 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다.

Description

인지능 손상의 치료를 위한 표적 {TARGET FOR THERAPY OF COGNITIVE IMPAIRMENT}
1. 관련 출원의 상호 참조
본 출원은 전체가 본원에 참조로 통합되는 2002년 11월 22일자로 출원된 미국 출원 번호 제 60/413,152호의 이익을 주장한다.
2. 정부 지원
본 발명은 국립노화연구원(the National Institutes on Aging)에 의해 부여된 승인 번호 제 PO1 AG09973호 하에 정부 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가질 수 있다.
3. 발명의 배경기술
인지능 손상에 대한 이해가 증가함에 따라 손상을 검출하는 고감도의 방법 및 손상의 치료법을 개발할 필요가 증가한다. 인지능 손상의 고감도 검출의 수혜를 받는 질환에는 치매(예를 들어, 루이체 치매, 혈관성 치매, 알츠하이머병, 및 HIV 관련 치매), 헌팅톤병, 파킨슨병, 정신분열증, 우울증, 근위축성측삭경화증, 경증 인지기능 장애(MCI), 및 연령-관련 인지능 감퇴(ARCD)과 같은 많은 질환이 있다.
인지능 손상의 다양한 질환(예를 들어, 루이체 치매, 혈관성 치매, 알츠하이머병, HIV 관련 치매, 헌팅톤병, 파킨슨병, 근위축성측삭경화증, MCI 및 ARCD)에 대한 주요 위험 인자는 노화이다. 이러한 질환을 가진 개체는 질병의 과정에 걸쳐 중증도가 증가하는 인지능 증상을 가진다. 이러한 질환이 없는 경우에, 인지능에 대한 노화의 효과는 병과 정상적인 노화 간의 경계를 규정하는 데 있어 중요하다. 동시에, 인지능에 대한 노화의 효과는 병의 위약성, 진행속도 또는 다른 특징을 결정하는 데에 신경퇴행성 질병의 질병 과정과 상호작용을 가질 수 있다.
인지능 손상에 대한 검출 방법 및 치료법을 개발하기 위한 중요한 수단은 실험용 동물을 사용하는 것을 포함한다. 동물 모델에서의 인지능 손상을 규명하는 특징은 인간에서의 인지능 손상으로 연장되는 것이 가능하다. 연령-관련 인지능 손상과 관련하여, 광범한 행동 특징 규명은 노화된 롱-에반스(Long-Evans) 래트의 이계 교배된 계통에서의 자연에서 나타나는 형태의 인지능 손상을 확인하였다(참조: Charles River Laboratories; Gallagher M, et al., Behav. Neurosci. 107: 618-626; 1993). 이러한 인지능 노화의 모델은 살아 있는 동안 무균 상태로 유지되는 동물을 사용한다. 모든 노화된 래트에 수행된 생리적 기능의 시험 및 검시를 사용하여 병 또는 질병과 노화를 혼동케 하는 상태의 동물을 배제시켰다. 이러한 모델의 중요한 특성은 이것이 중장년층의 인간 중의 인지능 감퇴의 다양성을 반영한다는 것이다. 또한, 이러한 모델에서 노화된 래트의 인지능 감퇴의 개체간 차이는 인간의 서술적 기억에 필수적인 시스템인 내측두엽의 상호연결 구조의 기능에 민감한 행동 평가에서 볼 수 있다.
이러한 모델의 다른 중요한 특징은 연령-관련 인지능 손상의 원인이 되는 유전자의 다중성을 이해하는 것에 관한 것이다. 연령-관련 인지능 손상에 대한 유전적 기여는 하나의 유전자에서의 결실 또는 돌연변이에 의해 유발되는 것을 의미하는 단일유전자성(monogenic)이 아닐 것이다. 단일유전자성 질병은 매우 드물고 통상적으로 젊은이들에게 영향을 미친다. 이들의 중증도로 인하여, 단일유전자성 질병은 종종 평균 기대 수명의 달성과 조화되지 않는다. 인간에서, 일반적이지만 중요한 다수의 질환은 성인 집단에 영향을 미치고, 연대순의 연령이 증가함에 따라 빈도와 중증도가 증가하며, 단일 유전자로 인한 것일 수 없다(예를 들어, 문헌[Hegele RA, Trends Endocrinol Metab, 2003, 8:371-377; Shih DQ et al., Curr Diab Rep, 2002, 2:125-134; Barlassina C et al., J Am Soc Nephrol, 2002, Suppl 3: S155-S164] 참조). 축적된 증거는 성숙 개시 또는 연령-관련 질환의 유전적 요소가 단일유전자성 질병의 기초가 되는 절대적 결핍 또는 극적인 획득 보다 여러 유전자의 발현에 보다 미묘한 변화를 반영한다는 것을 제시한다. 이러한 연령-관련 질환의 분자적 기초를 규정하기 위한 연구는 유전자의 다중성을 확인하고, 규정된 그룹의 유전자의 발현에 있어 상대적으로 작은 변화가 인간 집단과 같은 이계 교배된 집단에서 질환을 유도하거나 질환과 실제로 관련되는 지를 확립한다. 따라서, 노화의 포유동물 이계 교배된 모델을 사용하는 것은 이계 교배된 젊은 피검체 및 노화된 피검체에서 해마(hippocampus) 내의 다수의 유전자의 발현 수준과 학습 능력의 관계의 분석을 용이하게 한다.
모리스 물 미로(Morris Water Maze, MWM)를 이용한 행동 평가에서, 래트는 미로 주변의 공간적 신호의 형태에 의해 유도되는 탈출 플랫폼의 위치를 학습하고 기억한다. 행위의 인지적 기초는 탈출 플래폼의 위치를 탐구하는 동물의 공간적 편향의 측정을 사용하여 프로브 시도에서 시험된다. 본 연구 집단에서 노화된 래트는 보이는 플래폼으로 수영하는 데에 어려움을 갖지 않지만 연령-의존적 손상dms 공간적 정보의 사용이 요구되는 플래폼이 위장된 경우에 검출된다. 여러 문헌에서 보고된 바와 같이, 이계 교배된 롱-에반스 계통의 개별적인 노화된 래트에 대한 행동은 매우 다양하였고, 이들 래트의 일부는 젊은 성체와 동일하게 행동하였으나 대략 40-50%는 젊은 성체의 행동 범위 밖이었다(참조: Gallagher et al., Behav. Neurosci. 107: 618-626, 1993). 노화된 래트의 이러한 다양성은 확실한 개체간 차이를 반영한다. 이와 같이, 노화된 집단 내에서, 일부 동물은 인지능이 손상되고 이를 노화된 손상 개체(AI)라고 한다. 다른 노화된 동물은 인지능이 손상되지 않았으며, 즉 노화된 비손상 개체(AU)이다.
최초 규명 후 몇 주 후에 새로운 공간적 환경에서 MWM을 사용하는 재평가에서, AI 동물은 지속적으로 손상된 반면에, AU는 다시 능숙하게 행동하였다(참조: Colombo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 14195-14199, 1997). AI 및 AU 래트를 위한 MWM 평가에서 인지능의 차이는 3개월의 간격에도 신뢰할만 했다(참조: Gallagher and Burwell, Neurobiol. Aging 10: 691-708, 1989). 또한, MWM에서 AI 및 AU 특성 규명은 반즈 환상 미로(Barnes circular maze)(참조: Gallagher and Burwell Neurobiol. Aging 10: 691-708, 1989) 및 방사상 암 미로(radial arm maze, RAM)과 같은 동일한 인지능을 필요로 하는 다른 행동 과제에서 동일한 노화 피검체의 행동을 구별지었다. 이러한 자연에서 나타나는 설치류의 노화 집단에서의 손상은 인지능의 노화는 연대순의 연령에 면하기 어렵거나 이에 강하게 관련되어 있고, 중요하게는 이는 기억력을 저감시키거나 보존하는 뇌의 변화 궤도를 비교할 기회를 제공한다. 이러한 모델을 사용하는 추가의 배경 연구는 인지능 손상이 뉴런의 손실 또는 해당 서킷(circuit)의 광범한 퇴행과 관련된 신경퇴행과 무관하게 일어난다(참조: Rapp and Gallagher, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 9926-9930, 1996). 이와 같이, 이러한 모델은 뉴런 손상의 효과를 측정하도록 의도된 제조물 보다 인지능의 노화의 보다 민감한 시험일 것이다.
신뢰도에 더해, 이러한 모델에 사용된 인지능 평가는 해당 뇌 시스템에 대한 노화의 효과에 민감한 것으로 증명되었다. 중요한 생물학적 차이가 MWM에서 평가된 인지능에 중요한 신경 서킷 내에서 AU 래트와 AI 래트에 나타남이 관찰되었다. 예를 들어, 해마의 뉴런은, AU 및 젊은 래트 둘 모두에 비하여 AI 래트에서 아세틸콜린 및 글루타메이트와 같은 특정 화학 트랜스미터에 감소된 반응을 보인다(참조: Nicolle et al., J. Neurosci. 19: 9604-9610, 1999). 글루타메이트 수용체 서브타입의 해부학적 특성의 연구에서, 이러한 모델의 사용은 노화된 비손상 래트에 제한되고 젊은 손상 래트 및 노화된 손상 래트 둘 모두와 다른 해마의 CA3 영역에서의 카이네이트 결합의 감소를 밝혔다(참조: Nicolle et al., Neuroscience 74: 741-756, 1996). 인지능 손상의 생물학적 및 유전학적 기초를 보다 깊이 이해할 필요가 있다.
4. 발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은, 요망되는 행동을 보이는 피검체의 시험 집단을 제공하는 단계; 요망되는 행동이 결핍된 피검체의 대조 집단을 제공하는 단계; 시험 집단 및 대조 집단의 해마와 같은 신경 조직으로부터 발현 RNA를 분리하고 푸울링(pooling)하는 단계; 대조 및 시험 RNA 푸울 각각에서 다수의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 포유동물의 시험 집단 및 대조 집단 간에 발현이 상이한 유전자를 다수의 유전자로부터 선택하는 단계를 포함하는 피검체의 요망되는 행동과 관련된 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이 선택된 유전자는 상기 요망되는 행동과 관련된 유전자 후보이다. 다수의 유전자의 발현 수준은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 브랏(Nothern blot) 분석법 또는 닷 블랏(dot blot) 분석법에 의해, 또는 웨스턴 블랏, 단백질 슬롯 블랏 또는 단백질 어레이를 포함하는 단백질 수준을 측벙하는 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. 다수의 유전자는 글루타메이트 수송에 관여하는 유전자, 예를 들어 EAAT 1, EAAT 2, EAAT 3, EAAT 4, 및 EAAT 5, 글루타메이트 수송체 EAAT 1, EAAT 2, EAAT 3, EAAT 4, 및 EAAT 5 이외의 유전자, 또는 시냅스 틈새 및/또는 뉴런 사이의 시냅스외 공간의 글루타메이트의 이화작용에 관여하는 유전자, 예를 들어 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 다수의 유전자로부터 선택된 유전자는 증가된 수준의 발현을 보인다. 대안적으로, 선택된 유전자는 감소된 발현 수준을 보일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 요망되는 인지능을 가지는 포유동물의 시험 집단을 제공하는 단계; 상기 인지능이 결핍된 포유동물의 대조 집단을 제공하는 단계; 시험 및 대조 집단의 해마와 같은 신경 조직으로부터 발현 RNA를 분리하고 푸울링하는 단계; 대조 및 시험 RNA 푸울 각각에서 다수의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 피검체의 시험 집단과 대조 집단 간에 발현이 상이한 유전자를 다수의 유전자로부터 선택하는 단계를 포함하는 피검체의 인지능과 관련된 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이 선택된 유전자가 요망되는 인지능과 관련된 유전자 후보이다. 다수의 유전자의 발현 수준은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 브랏(Nothern blot) 분석법 또는 닷 블랏(dot blot) 분석법에 의해, 또는 웨스턴 블랏, 단백질 슬롯 블랏 또는 단백질 어레이를 포함하는 단백질 수준을 측정하는 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 다수의 유전자는 글루타메이트 수송에 관여하는 유전자, 예를 들어 EAAT 1, EAAT 2, EAAT 3, EAAT 4, 및 EAAT 5, 글루타메이트 수송체 EAAT 1, EAAT 2, EAAT 3, EAAT 4, 및 EAAT 5 이외의 유전자, 또는 시냅스 틈새 및/또는 뉴런 사이의 시냅스외 공간의 글루타메이트의 이화작용에 관여하는 유전자, 예를 들어 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 다수의 유전자로부터 선택된 유전자는 증가된 수준의 발현을 보인다. 대안적으로, 선택된 유전자는 감소된 발현 수준을 보일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 시험 화합물을 포유동물과 같은 피검체에 투여하는 단계; 상기 시험 화합물을 투여한 후에 상기 포유동물의 해마와 같은 신경 조직의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 유전자의 발현 수준을 상기 시험 화합물이 투여되지 않은 피검체의 신경 조직에서의 이의 기준 발현 수준과 비교하는 단계; 상기 유전자의 발현 수준이 이들의 대응하는 기준 발현 수준과 차이가 있는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 차이가 시험 화합물이 인지능 향상을 위한 치료제 후보임을 나타내는, 인지능을 향상시키기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 시험 화합물은 화학식 (I), (II), 또는 (III)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 소분자일 수 있다. 또한, 방법은 유전자의 발현 수준을 세프트리악손이(ceftriaxon) 투여된 피검체의 신경 조직에서 이의 기준 발현 수준과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 블랏 분석법, 및 닷 블랏 분석법에 의해서, 또는 웨스턴 블랏, 단백질 슬롯 블랏 또는 단백질 어레이를 포함하는 단백질 수준을 측정하는 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. 유전자는 EAAT 1, EAAT 2, EAAT 3, EAAT 4, 및 EAAT 5와 같은 글루타메이트 수송에 관여할 수 있거나, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제와 같은 뉴런 사이의 시냅스 틈새 및/또는 시냅스외 공간에서의 글루타메이트의 이화작용에 관여할 수 있다. 바람직하게는, 다수의 유전자로부터 선택된 유전자는 증가된 수준의 발현을 보인다. 대안적으로, 선택된 유전자는 감소된 수준의 발현을 보일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 시험 화합물을 포유동물과 같은 피검체에 투여하는 단계; 시험 화합물의 투여 후에 해마와 같은 피검체의 신경 조직에 글루타메이트 트랜스포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 유전자의 발현 수준을 시험 화합물이 투여되지 않은 피검체의 신경 조직에서의 이의 기준 발현 수준과 비교하는 단계; 및 유전자의 발현 수준이 이의 대응하는 기준 발현 수준과 차이가 있는지를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 차이가 시험 화합물이 인지능 향상을 위한 치료제 후보임 나타내는, 인지능을 향상시키기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 시험 화합물은 화학식 (I), (II) 또는 (III)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소분자일 수 있다. 유전자의 발현 수준은 임의의 적절한 수단, 예를 들어 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 블랏 분석법, 및 닷 블랏 분석법에 의해서, 또는 웨스턴 블랏, 단백질 슬롯 블랏 또는 단백질 어레이를 포함하는 단백질 수준을 측정하는 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 다수의 유전자로부터 선택된 유전자는 증가된 발현 수준을 보인다. 대안적으로, 선택된 유전자는 감소된 발현 수준을 보일 수 있다.
포유동물과 같은 피검체의 인지능 향상을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법은 도 4에 나열된 유전자, 예를 들어 글루타메이트 트랜스포터 유전자 EAAT1, 2, 3, 4, 또는 5, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성화 폴리펩티드(PACAP)를 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 및 상기 유전자의 발현 수준이 상기 세포와 시험 화합물의 접촉에 의해 변화되는 지를 결정하는 단계를 포함하고, 변화가 존재하는 경우에 이러한 변화는 인지능 향상이 필요한 포유동물과 같은 피검체의 인지능을 향상시키는 화합물의 능력을 나타낸다. 화합물은 화학식(I), (II), 또는 (III)의 분자와 같은 소분자일 수 있다. 세포는 배양된 뉴런, 배양된 신경교 세포, 또는 1차 뉴런 배양물로부터 유래되거나, 불멸화된 세포, 신경세포주, 신경교세포주, 또는 성상세포주일 수 있다. 바람직하게는, 다수의 유전자로부터 선택된 유전자는 증가된 발현 수준을 보인다. 대안적으로, 선택된 유전자는 감소된 발현 수준을 보일 수 있다.
본 발명의 상기 언급된 측면 각각에 사용된 시험 화합물은 3세대 세팔로스포린(세프술로딘, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 목살락탐 및 세프타지딤), 발프로산 또는 MS-153 중 어느 하나와 같은 소분자일 수 있다. 또한, 시험 화합물은 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5로 구성된 군으로부터 선택된 글루타메이트 트랜스포터 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자를 포함하며, 유전자 발현을 활성화할 수 있다. 대안적으로, 시험 화합물은 유전자 발현의 억제제일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에서 인지능의 보존시에 포유동물 신경 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 코딩하는 다수의 cDNA 서열을 포함하는 라이브러리에 관한 것이다. 바람직하게는, 라이브러리는 세프트리악손, 발프로산 또는 MS-153으로 포유동물을 치료하는 경우에 신경 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 코딩하는 cDNA 서열을 포함한다. 라이브러리는 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5와 같은 글루타메이트 트랜스포터 유전자로부터 유래된 cDNA 서열 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제로부터 유래된 서열을 함유할 수 있다. 라이브러리는 글루타메이트 트랜스포터 유전자로부터 유래된 서열의 20%, 50%, 또는 80% 이상의 cDNA를 함유한다.
본 발명의 다른 측면은 마이크로어레이 칩으로서, 이에 개별적으로 지정된 위치에서 부착되어 있는 고형 지지체, 상기 언급된 cDNA 라이브러리의 원에 해당하는 cDNA 서열, 예를 들어 세프트리악손 또는 발프로산으로 피검체를 치료하는 경우 또는 피검체의 인지능의 보존시에 신경 세포에서 상이하게 발현되는 cDNA 서열을 포함하는 마이크로어레이 칩이다. 마이크로어레이 칩의 원은 EEAT1, EEAT2, EEAT3, EEAT4 및 EEAT로 구성된 군으로부터 선택된 글루타메이트 트랜스포터 서열 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 도 4에 나열된 유전자, 예를 들어 글루타메이트 트랜스포터 유전자 EAAT1, 2, 3, 4, 또는 5, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성화 폴리펩티드(PACAP)의 신경 조직 발현을 자극하는 치료학적 유효량의 화합물을 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 약제 조성물은 소분자를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 화학식(I), (II), 또는 (III)을 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 약제 조성물은, 포유동물과 같은 피검체 또는 세포에 화합물을 투여함에 의해 인지능을 향상시키기 위한 화합물을 스크리닝하고 화합물에 노출되거나 노출 없이 상기 피검체 또는 세포간에 유전자 발현의 차이를 측정하는 방법에 의해 동정된 세프트리악손 또는 발프로산 이외의 화합물을 치료학적 유효량 포함할 수 있다. 이들 화합물은 인지능 향상을 위한 후보 화합물이다.
본 발명의 다른 특성은, 신경 조직에서 글루타메이트 수송 또는 글루타메이트 이화작용에 관련된 유전자의 신경 조직 발현을 자극시킴에 의해 인간과 같은 포유동물의 손상된 인지능을 치료하거나 인간과 같은 포유동물의 인지능을 보존하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 인지능 보존을 필요로 하는 인간과 같은 포유동물의 인지능을 보존하는 것은, 도 4에 나열된 유전자, 예를 들어 글루타메이트 트랜스포터 유전자 EAAT 1, 2, 3, 4, 또는 5, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성화 폴리펩티드(PACAP)의 신경 조직 발현을 자극하는 약제 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 인지능 보존을 필요로 하는 인간과 같은 포유동물에서 인지능을 향상시키는 방법이 화학식 (I), (II) 또는 (III) 중 어느 하나의 소분자인 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다. 인지능 보존을 필요로 하는 인간과 같은 포유동물의 인지능을 보존하는 방법에 대해서, 포유동물은 항생제 치료가 지시된 감염 질병의 증상이 없다.
본 발명은 또한 하기 인지능을 향상시키기에 충분한, 도 4에 나열된 유전자의 신경 조직 발현을 자극하는 약제 조성물의 양을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 인지능 향상을 필요로 하는 인간과 같은 포유동물의 인지능을 향상시키는 것을 특징으로 한다: 공간 기억 습득, 장기 공간 기억, 또는 공간 기억 복구. 본 발명은 또한, 치료학적 유효량의 세프트리악손 또는 이의 유사체 또는 유도체, 발프로산 또는 이의 유사체 또는 유도체, 또는 MS-153 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포유동물에 투여함에 의해, 인간과 같은 노화된 포유동물에서 인지능을 보존하거나 인지능 손상을 치료하고, 인간과 같은 포유동물에 인지능 손상을 치료하는 것을 특징으로 한다. 포유동물이 인지능 손상을 나타내는 경우에, 손상된 인지능은 하기 질환 중 하나와 관련될 수 있다: 경증 인지기능 장애, 연령-관련 인지능 손상, 기억 상실증, 노망, 및 치매. 또한, 포유동물이 인지능 손상을 나타내는 경우에, 손상된 인지능은 알츠하이머병과 관련될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위에 기초하여 자명할 것이다.
5. 도면의 간단한 설명
도 1은 MWM 평가에서 젊은 래트 및 노화된 래트의 행동 평가를 도시하는 그래프이다.
도 2는 10마리의 노화된 래트에 대한 초기 MWM 특성규명 및 RAM에서의 이들의 기억 능력 간의 신뢰도를 도시하는 그래프이다.
도 3은 포유동물 글루타메이트 트랜스포터의 분포와 뇌 조직에서 발견되는 다양한 세포 타입에서의 이들의 인간 유사체를 요약하는 표이다.
도 4는 마이크로어레이를 이용한 젊은 동물(Y), 손상된 노화 동물(AI) 및 손상되지 않은 노화 동물(AU)에서의 EAAT2/GLT1, EAAT1/GLAST, 및 EAAT3/EEAC1 mRNA의 발현을 요약하는 표이다.
도 5는 인 시튜 하이브리드화 조직화학법을 이용한 젊은 동물(Y), 손상된 노화 동물(AI) 및 손상되지 않은 노화 동물(AU)에서의 EAAT2/GLT1, EAAT1/GLAST, 및 EAAT3/EEAC1 mRNA의 발현을 요약하는 표이다.
도 6은 세프트리악손으로 처리된(1주일 동안 매일 200㎎/㎏ im 주사) AI 래트의 기억 오류의 감소를 도시하는 그래프이다.
6. 발명의 상세한 설명
편의상, 본 명세서, 실시예 및 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모았다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
6.1 정의
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상(예를 들어 적어도 하나")를 언급하는 것으로서 본원에 사용된다. 예를 들어, "an element"는 하나의 구성요소 또는 하나 이상의 구성요소를 의미한다.
"노화(된)"은 평균 수명의 말기 또는 말기 가까이에 있는 포유동물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어 노화된 래트는 약 24 내지 30 월령이다. 노화된 인간은 70세 이상이다.
"지방족"은 본 기술분야에 인식되어 있으며, 선형, 분지형, 고리형 알칼, 알켄, 또는 알킨을 의미한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 지방족 기는 선형 또는 분지형이며 1 내지 약 20개 탄소원자를 가진다.
"알킬"은 본 기술분야에 인식되어 있으며, 직쇄 알킬기, 분지쇄 알킬기, 시클로알킬(지환식) 기, 알킬 치환된 시클로알킬기, 및 시클로알킬 치환된 알킬 기를 포함하는 포화된 지방족 기를 포함한다. 특정 구체예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 주쇄에 약 30개 이하의 탄소원자를 가지고(예를 들어, 직쇄에 대해서는 C1-C30, 분지쇄에 대해서는 C3-C30), 대안적으로 약 20개 이하의 탄소원자를 가진다. 게다가, 시클로알킬은 고리 구조에 약 3 내지 약 10개 탄소원자를 가지고, 대안적으로 고리 구조에 약 5, 6, 또는 7개 탄소를 가진다. "알킬"은 또한 할로치환된 알킬을 포함하는 것으로 정의된다.
"아민" 및 "아미노"는 본 기술분야에 인식되어 있으며, 치환되지 않거나 치환된 아민, 예를 들어 하기의 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 의미한다:
상기 식에서, R50, R51, 및 R52는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R61, 또는 R50 및 R51을 나타내며, 이들이 결합된 N 원자와 함께 고리 구조에 4 내지 8개 원자를 가지는 헤테로사이클을 형성하고; R61은 아릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로사이클, 또는 폴리사이클을 나타내며; m은 0 또는 1 내지 8의 정수이다. 특정 구체예에서, R50 및 R51 중 단지 하나는 카르보닐일 수 있고, 예를 들어 R50, R51 및 질소는 함께 이미드를 형성하지 않는다. 다른 구체예에서, R50 및 R51 (및 선택적으로 R52)은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 또는 -(CH2)m-R61을 나타낸다. 이와 같이, "알킬아민"은 치환되거나 치환되지 않은 알킬이 부착된, 상기 정의된 바와 같은 아민기를 포함하고, 즉, R50 및 R51 중 하나 이상은 알킬기이다.
"아실아미노"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기에 관한 것이다:
상기 식에서, R50은 상기 정의된 바와 같고, R54는 수소, 알킬, 알케닐, 또는 -(CH2)m-R61이며, 여기서 m 및 R61은 상기 정의된 바와 같다.
"아미도"는 아미노-치환된 카르보닐로서 본 기술분야에 인지되어 있고 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 포함한다:
상기 식에서, R50 및 R51은 상기 정의된 바와 같다. 본 발명에서 아미드의 특정 구체예는 불안정할 수 있는 이미드를 포함하지 않을 것이다.
"아킬티오"는 황 라디칼이 부착되어 있는, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기이다. 특정 구체예에서, "알킬티오" 잔기는 -S-알킬, -S-알케닐, -S-알키닐, 및 -S-(CH2)m-R61 중 하나를 나타내고, 여기서 m 및 R61은 상기 정의된 바와 같다. 대표적인 알킬티오기는 메틸티오, 에틸티오 등을 포함한다.
"아르알킬"은 본 기술분야에 인식되어 있고, 아릴기로 치환된 알킬기(예를 들어, 방향족 또는 헤테로방향족기)를 의미한다.
"알케닐" 및 "알키닐"은 본 기술분야에 인식되어 있고, 길이상의 불포화된 지방족 기 유사체이며 상기 설명된 바와 같이 알킬기로 치환이 가능하며 각각 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 것을 의미한다.
탄소의 수가 다르게 특정되지 않는다면, "저급 알킬"은 1 내지 약 10개의 탄소를 가지거나, 대안적으로 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 주쇄 구조에 가지는 상기 정의된 바와 같은 알킬기에 관한 것이다. 마찬가지로, "저급 알케닐" 및 "저급 알키닐"은 유사한 사슬 길이를 가진다.
"알콕실" 또는 "알콕시"는 본 기술분야에 인식되어 있고, 산소 라디칼이 부착되어 있는 상기 정의된 알킬 기를 의미한다. 대표적인 알콕실기는 메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 3차-부톡시 등을 포함한다. "에테르"는 산소에 의해 공유결합되어 있는 두개의 탄화수소이다. 이와 같이, 알킬을 에테르로 만드는 알킬 치환제는 알콕실이거나 알콕실기와 유사하여, 이는 -O-알킬, -O-알케닐, -O-알키닐, -O--(CH2)m-R61 중 하나로 나타낼 수 있고, 여기서, m 및 R61은 상기 기술되어 있다.
"유사체"는 기능적으로 다른 화학적 본체를 닯았지만 이와 동일한 화학적 구조를 공유하지 않는 화합물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 세프트리악손 유사체는, 세프트리악손의 구조와 구조적으로 다소 다르지만, 세프트리악손과 충분히 유사하여 치료 용도에서 세프트리악손을 대체할 수 있다.
"어레이" 및 "매트릭스"는 장치에 지적된 위치 또는 "주소"의 배열을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 위치는 이차원 어레이, 삼차원 어레이, 또는 다른 매트릭스 포맷으로 배열될 수 있다. 위치의 수는 수개에서 수천수만 이하일 수 있다. 가장 중요하게는, 각 위치는 완전히 독립적인 반응 위치를 나타낸다. "핵산 어레이"는 올리고누클레오티드 또는 유전자의 보다 큰 부분과 같은 핵산 프로브를 함유하는 어레이에 관한 것이다. 어레이 상의 핵산은 단일 가닥일 수 있다. 프로브가 올리고누클레오티드인 어레이는 "올리고누클레오티드 어레이" 또는 "올리고누클레오티드 칩"으로서 언급된다. "마이크로어레이"는 또한 "바이오칩", "생물학적 칩" 또는 "유전자 어레이"로서 본원에 언급되며, 이는 약 100/cm2 이상, 바람직하게는 약 1000/cm2 이상의 분리된 영역의 밀도를 가지는 영역의 어레이이다. 마이크로어레이의 상기 영역은 전형적인 치수, 예를 들어 약 10-250㎛의 지름을 가지고, 거의 동일한 거리 만큼 어레이에서 다른 영역으로부터 떨어져 있다.
"아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제"는 옥살로아세테이트 및 글루타메이트가 아스파르테이트 및 2-옥소글루타레이트로 전환하는 것을 촉매하는 효소(E.C. 2.6.1.1) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제 활성을 가지는 아미노산을 엔코딩하는 핵산 및 동족체(예를 들어, 진뱅크 등록번호(accession number): BC000498 또는 XM_062678)를 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제는 시냅스 틈새 및 시냅스외 공간에서의 글루타메이트의 이화작용에 관여한다. 상기의 동족체는 영장류, 개과, 고양이과, 및 설치류를 포함하는 다른 포유동물에 존재하는 것으로 생각된다.
"베타-아레스틴 2"는 활성화된 G 단백질-결합된 수용체로부터 추가의 시그날의 전달을 용이하게 하는 세포내 스캐폴드/어뎁터 단백질을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 따라서, 이러한 단백질은 막간 수용체 내포작용의 내포작용에 관여한다. 베타-아레스틴 2는 또한 β-아레스틴 단백질을 엔코딩하는 핵산을 의미한다. 상기의 동족체는 영장류, 개과, 고양이과, 및 설치류를 포함하는 다른 포유동물에 존재하는 것으로 생각된다.
"카르보사이클"은 본 기술분야에 인지되어 있고 고리의 각 원자가 탄소인 방향족 또는 비방향족 고리를 의미한다.
"카르보닐"은 본 기술분야에 인지되어 있고 하기 화학식일 수 있는 잔기를 포함한다:
상기 식에서, X50은 결합이거나 산소 또는 황을 나타내고, R55 및 R56은 수소, 알킬, 알케닐, -(CH2)m-R61 또는 약제학적 허용 염을 나타내고, R56은 수소, 알킬, 알케닐 또는 -(CH2)m-R61을 나타내고, 여기서 m 및 R61은 상기 정의된 바와 같다. X50이 산소이고 R55 또는 R56이 수소가 아닌 경우에, 화학식은 "에스테르"를 나타낸다. X50은 산소이고 R55는 상기 정의된 바와 같은 경우에, 잔기는 카르복실기로서 본원에 언급되고, 특히 R55가 수소인 경우에 화학식은 "카르복실산"을 나타낸다. X50은 산소이고 R56은 수소인 경우에 화학식은 "프로메이트"를 나타낸다. 일반적으로, 상기 화학식의 산소 원자가 황으로 치환된 경우에, 화학식은 "티오카르보닐"기를 나타낸다. X50이 황이고, R55 또는 R56이 수소가 아닌 경우에, 화학식은 "티올에스테르"를 나타낸다. X50이 황이고 R55가 수소인 경우에 화학식은 "티올카르복실산"을 나타낸다. X50이 황이고 R56이 수소인 경우에 화학식은 "티올포르메이트"를 나타낸다. 다른 한편, X50이 결합이고 R55가 수소가 아닌 경우에 상기 화학식은 "케톤"기이다. X50가 결합이고 R55가 수소인 경우에, 상기 화학식은 "알데하이드"기이다.
"키랄"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 거울상 파트너의 비수퍼임포서빌러티(non-superimposability)의 특성을 가지는 분자에 관한 것이고, "비키랄"은 거울상 파트너 상에 수퍼임포서블(superimposable)한 분자를 의미한다. "프로키랄 분자"는 특정 공정에서 키랄 분자로 전환될 수 있는 포텐셜을 가지는 분자이다.
"시스"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 원자 또는 기가 이중 결합의 동일한 쪽에 있는 이중결합 주변의 2개 원자 또는 기의 배열을 의미한다. 시스 배열은 (Z) 배열로서 종종 표시된다.
"인지능"은 주의력, 습득력, 단기 기억력, 장기 기억력, 및 기억 복구를 포함하지만 이에 한정되지 않는 학습 및 기억과 주변과 자신 보호에 대한 관심의 표현과 관련된 고급 지적 뇌 과정을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 동물 모델 시스템에서, 인지능은 하기 장치를 사용하는 것을 포함하는, 본 기술분야에 인지된 많은 방법에 의해 측정될 수 있다: 모리스 물 미로(Morris water maze), 반즈 원형 미로(Barnes circle maze), 상승된 환상 암 미로(elevated radial arm maze), T 미로, 또는 피검체가 공간 정보를 사용하는 임의의 다른 미로. 본 기술분야에 인지된 다른 시험, 예를 들어 공포 조건화, 능동적 회피, 조명된 개방-필드(illuminated open-field), 암 활동 미터(dark activity meter), 상승된 플러스-미로(elevated plus-maze), 이-구역 탐구 시험(two-compartment exploratory test), 또는 강제 수영법이 인지능을 평가하는 데에 사용될 수 있다. 인간에서, 인지능은, 제한없이 알츠하이머병 평가척도 중 인지분야(Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale, ADAS-cog); 임상적 표현의 변화 스케일(CIBIC-plus scale); 알츠하이머병 일상 생활 동작 능력의 상호 연구(Alzheimer's Disease Cooperative Study Activities of Daily Living Scale, ADCS-ADL); 간이 정신 상태 검사(Mini Mental State Exam, MMSE); 신경정신의학항목표(Neuropsychiatric Inventory, NPI); 임상적 치매 분류등급 (Clinical Dementia Rating Scale, CDR); 캠브리지 신경정신 시험 자동 배터리(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery, CANTAB) 또는 산도즈 임상 평가-노인병학(Sandoz Clinical Assessment-Geriatric, SCAG)에 의해 평가될 수 있다. 또한, 인지능은 양전자 방출 촬영(PET), 기능성 자기공명영상(MRI), 단일광전자 방출촬영(SPECT) 또는 뇌 기능을 측정 가능하게 하는 다른 영상 기술과 같은 영상 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
"향상되는" 인지능은 연령대가 같은 정상, 비손상된 피검체의 기능과 보다 더 유사하도록 손상된 인지능에 영향을 주는 것을 의미하고, 인지능이 정상 피검체에 비하여 예를 들어 약 10%, 30%, 50%, 75%, 90%, 또는 95% 손상된 상태에 영향을 주는 것을 포함한다. 인지능은 임의의 검출가능한 정도로 향상될 수 있으나, 바람직하게는 손상된 피검체가 정상적인 삶의 일상 생활을 수행하기에 충분하게 향상된다.
"보존되는" 인지능은 1차 제시 또는 진단시에 피검제에서 관찰되는 것 미만으로 떨어지지 않거나 감소되지 않도록 정상 또는 손상된 인지능에 영향을 주는 것에 관한 것이다.
"손상된 인지능"은 연령이 일치되는 정상 피검체에서 관찰되는 것 만큼 건강하지 않은 인지능을 의미하고 연령이 일치되는 정상 피검체에서 측정된 인지능에 비하여 예를 들어 약 10%, 30%, 50%, 75%, 90%, 또는 95% 정도 감소된 상태를 포함한다. 손상된 인지능은 치매(예를 들어, 루이체 치매, 혈관성 치매, 알츠하이머병, 및 HIV 관련 치매), 헌팅톤병, 파킨슨병, 정신분열증, 근위축성측삭경화증, 경증 인지기능 장애(MCI), 및 연령-관련 인지능 감퇴(ARCD)와 관련되는 많은 질병 또는 질환과 관련될 수 있다. 대안적으로, 손상된 인지능은 진단가능한 질병 또는 질환을 나타내지 않는 피검체에서 나타날 수 있다. 예를 들어, 손상된 인지능은 피검체에서 미묘한 대사성, 독성, 신경독성, 의원병성(iatrogenic), 열 또는 화학적 변화로부터 기인될 수 있다. 이러한 미묘한 변화는 제한 없이 국소빈혈, 저산소증, 뇌졸중, 외상, 외과술, 압력, 종괴 효과(mass effect), 출혈, 방열(radiation), 연축, 신경퇴행성 질병 또는 감염을 포함한다.
"대조 집단"은 인지능과 관련된 요망되는 행동이 결핍된 포유동물에 관한 것으로 본원에서 사용되었고, 통상 젊지 않은 포유동물을 포함한다.
"공유 결합"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 전자가 두 원자의 핵 둘 모두에 정전기적으로 결합되어 있는 2개 원자간의 결합에 관한 것이고, 핵 사이의 증가된 전자 밀도의 실효과는 핵간 반발력과 상쇄된다. 공유결합은 결합이 금속 이온과 이루어진 경우에 배위 결합을 포함한다.
"조합 라이브러리" 또는 "라이브러리"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 합성됐거나 그렇지 않으면 라이브러리의 각 반응에서 동일하거나 상이한 반응물 또는 반응 조건을 사용함에 의해 하나 이상의 출발물질로부터 제조된, "원(member)"이라고 할 수 있는 다수의 화합물을 의미한다. (다른 기술 뿐만 아니라) 조합 라이브러리와 관련성이 있는 많은 용어가 있다. "동정 태그"는 본 기술 분야에 인지되어 있고, 화학 라이브러리의 합성에 사용되는 일련의 반응의 단계를 기록하는 수단을 의미한다. "고정화된"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 종(species)과 관련하여 사용되는 경우에, 종이 의도된 그 표면 사용 환경에 존재하고 종에 작용하는 인력보다 강한 인력으로 표현에 부착된 조건을 의미한다. "고형 지지체"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 불용성 매트릭스이고 (임의로) 경질 또는 반경질 표면을 가질 수 있는 물질을 의미한다. "링커"는 고형 지지체 또는 중합 지지체를 포함하는 지지체와 조합 라이브러리 원을 연결하는 분자 또는 분자의 기를 의미한다. "중합 지지체"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 화학 잔기가 중합 지지체의 작용기와 반응하여 공유 결합될 수있는 수용성 또는 불용성 중합체에 관한 것이다. "중합 지지체의 작용기"는 본 기술분야에 인식되어 있고 화학 잔기와 결합하여 중합체-지지된 아미노 에스테르를 형성할 수 있는 중합 지지체의 화학 잔기에 관한 것이다.
"유도체"는 화합물, 예를 들어 세팔로스포린 또는 발프로산의 화학적 변형에 관한 것으로 본원에 사용된다. 화합물은 화학적 변형은 예를 들어 알킬, 아실, 또는 아미노기에 의한 수소의 치환을 포함할 수 있다. 화합물의 유도체는 본래 화합물의 하나 이상의 작용 특성을 보유한다.
"요망되는 행동"은 정상의 손상되지 않은 피검체에서 관찰되는 인지능의 행동 목록에 관한 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 동물에서 요망되는 행동은 모리스 물 미로, 반즈 원형 미로, 상승된 환상 암 미로, T 미로와 같은 많은 장치 중 어느 하나; 또는 공포 조건화, 능동적 회피, 조명된 개방-필드(illuminated open-field), 암 활동 미터, 상승된 플러스-미로, 이-구역 탐구 시험, 또는 강제 수영법과 같은 많은 시험 중 어느 하나에 의해 측정되는 동물의 인지능을 반영한다. 인간에서, 요망되는 행동은 정상적인 삶의 일상 활동을 수행하는 피검체의 능력에 의해 측정된 피검체의 인지능을 반영하거나, ADAS-cog, CIBIC-plus scale, ADCS-ADL, MMSE, NPI, CDR, CANTAB 또는 SCAG를 비제한적으로 포함하는 인지능에 대한 많은 시험을 수행함에 의해 측정될 수 있다.
"헤테로원자"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 탄소 또는 수소 이외의 다른 원소의 원자를 의미한다. 대표적인 헤테로원자는 붕소, 질소, 산소, 인, 황 및 셀레늄을 포함한다.
"아릴"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 0 내지 4개 헤테로원자를 포함할 수 있는 5-, 6-, 및 7-원 단일 고리 방향족 기, 예를 들어 벤젠, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 및 피리미딘 등을 의미한다. 고리 구조에 헤테로원자를 가지는 아릴기는 또한 "헤테로아릴"로서 언급될 수 있다. 방향족 고리는 상기 기술된 바와 같이 치환체, 예를 들어 할로겐, 아지드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 하이드록실, 알콕실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등으로 하나 이상의 고리 위치에서 치환될 수 있다. "아릴"은 또한 둘 이상의 탄소가 두개의 인접한 고리에 공통되는 둘 이상의 시클릭 고리를 가지는 폴리시클릭 고리계(고리는 융합된 고리)를 포함하고, 여기서, 고리 중 하나 이상은 방향족이고, 예를 들어, 다른 시클릭 고리는 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로시클릴일 수 있다.
오르쏘, 메타, 및 파라는 본 기술분야에 인지되어 있고, 각각 1,2-, 1,3-, 및 1,4-이치환된 벤젠을 의미한다. 예를 들어, 1,2-디메틸벤젠 및 ㅇ르쏘-디메틸벤젠은 동의어이다.
"헤테로시클릴"또는 "헤테로시클릭 기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 3 내지 약 10 원 고리구조, 대안적으로 3 내지 7 원 고리를 의미하고, 여기서 고리는 1 내지 4개 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 또한 폴리사이클일 수 있다. 헤테로시클릴 기는 예를 들어 티오펜, 티안트렌, 푸란, 피란, 이소벤조푸란, 클로멘, 잔텐, 페녹산텐, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 이소티아졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 피리다진, 인돌리진, 이소인돌, 인돌, 인다졸, 푸린, 퀴놀리진, 이소퀴놀린, 퀴놀린, 프탈라진, 나프티리딘, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 카르볼린, 페난트리딘, 아크리딘, 피리미딘, 페난트롤린, 페나진, 페나르사진, 페노티아진, 푸라잔, 페녹사진, 피롤리딘, 옥솔란, 티올란, 옥사졸, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 락톤, 아제티디논 및 피롤리디논과 같은 락탐, 술탐, 술톤 등을 포함한다. 헤테로시클릭 고리는 예를 들어 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 하이드록실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 술포닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등의, 상기 기술된 바와 같은 치환체로 하나 이상의 위치에서 치환될 수 있다.
"상이하게 발현되는"은 상이하게 치료되거나 상이한 환경 요소 또는 생리학적 환경의 변화에 노출된 조직에서 대상 유전자의 정량적 및 정성적 측정치를 포함하는 상이한 수준의 발현을 의미하는 것으로 본원에 사용된다.
"유전자" 또는 "유전자 서열"은 일부 또는 전부의 유전자의 코딩 서열, 이의 컴플리먼트(compliment), 및 이의 5' 또는 3' 비번역 영역에 관한 것으로 본원에서 사용된다. 유전자의 "코딩 서열"은 유전자의 mRNA 전사체에 존재하는 누클레오티드의 세트이다. "유전자 발현"은 유전자의 DNA 서열 상에 기초한 RNA를 만들거나 전사하는 과정을 말한다. 유전자 발현의 "활성화제"는 유전자의 DNA 서열을 RNA 전사체로 전사하는 것을 자극하는 화합물에 관한 것이다. "내인성" 유전자는 종 내에서 천연적으로 발견되는 것으로 유기체 또는 세포의 게놈으로 무작위로 삽입하거나 트랜스펙션시키는 것과 같이 인공적으로 혼입되는 것이 아닌 유전자이다.
"글루타메이트 트랜스포터"는 시냅스 틈새 및 시냅스외 공간을 포함하는 세포외 공간으로부터 포유동물 중추신경계(CNS)의 제 1 자극성 신경전달물질인 L-글루타메이트를 제거하는 막횡단 단백질을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 글루타메이트 트랜스포터는 뉴런 및 신경교 세포의 막에서 발견될 수 있다. 몇몇 글루타메이트 트랜스포터는 인간에서 동정되었고, 예를 들어 용질 운반자 패밀리 1(Solute Carrier Family 1), 멤버 1(SLC1A1 또는 EAAC1 또는 EAAT3; 예를 들어 진뱅크 등록 번호: NM_004170), 용질 운반자 패밀리 1, 멤버 2(SLC1A2 또는 EAAT2 또는 GLT1; 예를 들어 진뱅크 등록 번호: NM_004171), 용질 운반자 패밀리 1, 멤버 3(SLC1A3 또는 EAAT1, GLAST 또는 GLAST1; 예를 들어 진뱅크 등록 번호: NM_004172), 용질 운반자 패밀리 1, 멤버 6(SLC1A6 또는 EAAT4; 예를 들어 진뱅크 등록 번호: NM_005071) 및 용질 운반자 패밀리 1, 멤버 7(SLC1A7 또는 EAAT5; 예를 들어 진뱅크 등록 번호: NM_006671)을 포함한다. 또한, 글루타메이트 트랜스포터는 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) 및 무스 무스쿨러스(Mus musculus)(Slc1 al/Eaac1/REAAC1, Slc1a2/GluT/GLT-1/GluT-R, Scl1a3/Eaat1/GLAST/GluT-1 및 Slc1a6/Eaat4)에서 동정되었다. 이들의 동족체는 영장류, 개과, 고양이과 및 설치류를 포함하는 다른 포유동물에 존재하는 것으로 생각된다. 글루타메이트 트랜스포터 단백질의 활성은 글루타메이트 트랜스포터 단백질의 글루타메이트 수송 활성을 증가시키는 제제의 투여에 의해 증가된다. 글루타메이트 수송 단백질 활성을 증가시키는 것으로 보고된 제제의 예에는 예를 들어 ((R)-(-)-5-메틸-1-니코티노일-2-피라졸린(MS-153; Shimada et al., Eur J Pharmacol. 386: 263-70, 1999); 리도카인(Do et al., Anesth Analg. 95: 1263-8, 2002) 및 카이네이즈 억제제(예를 들어, Conradt, J Neurochem. 68: 1244-51, 1997)이 포함된다.
유전자의 "발현 수준"은, 예를 들어 mRNA 수준(예를 들어 "노던 블랏" 또는 "마이크로어레이 분석"에 의해) 또는 단백질(예를 들어 전장 또는 트렁케이션된 폴리펩티드 유전자 생성물을(예를 들어 면역학적으로 항체를 이용하여) 검출함에 의해)을 측정함에 의해 유전자의 발현의 정량적 또는 정성적 측정의 역치의 존재를 검출하는 데 사용되는 임의의 방법에 의해 측정된 유전자 발현 수준에 관한 것으로 본원에 사용된다.
"메조 화합물"은 본 기술분야에 인식되어 있고 둘 이상의 키랄 중심을 가지지만 대칭면 또는 대칭점으로 인하여 비키랄인 화학적 화합물을 의미한다.
"메타보트로픽(metabotropic) 글루타메이트 수용체"(mGluR)은 신경전달물질 글루타메이트에 반응하는 G-단백질-결합된 수용체를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 이들의 1차 서열 유사성에 기초하여, 신경 전달 연계 및 약리학적 프로파일에 기초하여, 세개 그룹의 mGluR이 있다. 그룹 I은 포스포리파아제 C에 양성적으로 결합된 mGluR1(mGluR1a, mGluR1b, mGluR1c, mGluR1d; 예를 들어 인간 스플라이스 변이체 mGluR1a에 대한 진뱅크 등록 번호 NM_000838) 및 mGluR5(mGluR5a, mGluR5b; 예를 들어 인간 스플라이스 변이체 mGluR5a에 대한 진뱅크 등록 번호 NM_000842)로 구성된다. 그룹 II는 아데닐 사이클라아제에 음성적으로 결합된 mGluR2(예를 들어 진뱅크 등록 번호 NM_000839) 및 mGluR3(예를 들어 진뱅크 등록 번호 NM_000840)로 구성된다. 그룹 II는 아데닐 사이클라아제에 음성적으로 결합된 mGluR4(mGluR4a, mGluR4b; 예를 들어 진뱅크 등록 번호 NM_000841), mGluR6(예를 들어 진뱅크 등록 번호 NM_000843), mGluR7(mGluR7a, mGluR7b; 예를 들어 mGluR7a의 인간 스플라이스 변이체에 대한 진뱅크 등록 번호 NM_000844) 및 mGluR8(예를 들어, 진뱅크 등록 번호 NM_000845)로 구성된다. 다양한 mGluR 그룹에 대한 많은 시판되는 작용제 및 길항제가 있다. 예를 들어, 그룹 I 작용제는 L-퀴스쿠알산 ((L)-(+)-α-아미노-3,5-디옥소-1,2,4-옥사디아졸리딘-2-프로파논산), (S)-3,5-디하이드록시페닐글리신((S)-3,5-DHPG), 트랜스-아제티딘-2,4-디카르복실산(tDNA), (1S,3R)-1-아미노시클로펜탄-1,3-디카르복실산 ((1S,3R)-ACPD) 및 (RS)-2-클로로-5-하이드록시페닐글리신(CHPG)를 비제한적으로 포함하고, 길항제는 (S)-4-카르복시-3-하이드록시페닐글리신 ((S)-4C3HPG), 7-(하이드록시이미노)시클로프로파[b]크로멘-1a-카르복실레이트 에틸 에스테르(CPCCOEt), (RS)-1-아미노인단-1,5-디카르복실산(AIDA; UPF 523), 2-메틸-6-(페닐에티닐)피리딘(MPEP 하이드로클로라이드), 2-메틸-6-(2-페닐에테닐)피리딘(SIB-1893), 6-메틸-2-(페닐아조)-3-피리디놀(SIB-1757), 및 (S)-(+)-α-아미노-4-카르복시-2-메틸벤젠아세트산(LY 367385)를 비제한적으로 포함한다. 그룹 II 작용제는 (2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-디카르복시시클로프로필)글리신(DCG IV), (2S,1'S,2'S)-2-(카르복시시클로프로필)글리신(L-CCG-I); (2S,3S,4S)-CCG), (S)-3 카르복시-4-하이드록시페닐글리신((S)-3C4HPG) 및 (2R,4R)-4-아미노피롤리딘-2,4-디카르복실레이트((2R,4R)-APDC)를 포함하고; 길항제는 (2S)-α-에틸글루탐산(EGLU) 및 (2S)-2-아미노[(1S,2S)-2-카르복시시클로프로프-1-일]-3(잔트-9-일)프로파논산(LY 341495)를 비제한적으로 포함한다. 그룹 III 작용제는 (1S,3R,4S)-1-아미노시클로펜탄-1,2,4-트리카르복실산(ACPT-I), L(+)-2-아미노-4-포스포노부티르산 (L-AP4), (R,S)-4-포스포노페닐글리신((R,S)-PPG) 및 O-포스포-L-세린(L-SOP)를 포함하고; 길항제는 (RS)-α-시클로프로필-4-프로포노페닐글리신(CPPG), (S)-2-아미노-2-메틸-4-포스포노부타노산(MAP4) 및 (RS)-α-메틸세린-O-포스페이트(MSOP)를 포함한다. 최근 증거는 신경교와 관련된 메타보트로픽 글루타메이트 수용체는 글루타메이트 트랜스포터의 발현을 변경할 수 있다(참조: Aronica et al., Eur. J. Neurosci. 2003; 17: 2106-18, 2003).
"중간 연령"은 성적으로 성숙된 연령을 지난, 즉 젊지 않지만 종의 평균 수명에 도달하지 않았고 노화되지 않은 포유동물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 중간 연령 래트는 약 12 내지 18 월령일 것이다. 중간 연령의 인간은 20 내지 70세일 것이다.
"신경 조직"은 신경계의 조직, 예를 들어 뉴런 및 신경교 둘 모두를 포함하는 조직을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 구체화되는 경우, 신경 조직은 "해마 조직"을 포함하는 뇌에서 발견되는 특정 구조를 의미할 수 있다. 해마 조직은 하기를 포함하는 측두엽 피질에서 발견되는 해마형 구조물을 의미한다: 내후각뇌피질, 전해마이행부, 해마이행부, 원해마이행부, 치아이랑 및 CA1, CA2, CA3, 및 CA4로서 공지된 영역. 해마는 단기 기억, 장기 기억의 형성, 기억 복구, 서술 기억, 공간적 탐색과 같은 과정에 관여한다.
"신경보호적"은 손상된 인지능을 감소시키거나, 고정하거나, 치료하고, 손상된 인지능 가진 신경 조직을 보호하거나, 소생시키거나, 부활시키는 효과를 가지는 조성물 및 치료를 의미하는 것으로 본원에 사용된다.
"니트로"는 본 기술분야에 인식되어 있고, -NO2에 관한 것이고; "할로겐"은 본 기술분야에 인식되어 있고, -F, -Cl, -Br, 또는 -I를 의미하고; "설프하이드릴"은 본 기술분야에 인식되어 있고, -SH를 의미하며; "히드록실"은 -OH를 의미하며, "설포닐"은 본 기술분야에 인식되어 있고 -SO2 -를 의미힌다. "할라이드"는 할로겐의 대응하는 음이온을 의미하고, "슈도할라이드(pseudohalide)"는 코튼 및 윌킨슨(Cotton and Wilkinson)의 "고급 무기 화학(Advanced Inorganic Chemistry)"의 560에 제시된 정의를 가진다.
"포스포릴"은 본 기술분야에 인식되어 있고, 일반적으로 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
상기 식에서, Q50은 S 또는 O이고, R59는 수소, 저급 알킬 또는 아릴이다. 치환체에 사용되는 경우에, 예를 들어 포스포릴알킬의 알킬, 포스포릴 기는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
상기 식에서, Q50 및 R59는 각각 독립적으로 상기 정의된 바와 같고, Q51은 O, S, 또는 N이다. Q50이 S인 경우에, 포스포릴 잔기는 "포스포로티오에이트"이다.
"포스포르아미디트"은 본 기술분야에 인식되어 있고 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
상기 식에서, Q51, R50, R51 및 R59는 상기 정의된 바와 같다.
"포스폰아미디트"는 본 기술분야에 인식되어 있고 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:
상기 식에서, Q51, R50, R51, 및 R59는 상기 정의된 바와 같고, R60은 저급 알킬 또는 아릴이다.
알케닐 및 알키닐 기로 유사체 치환되어 예를 들어 아미노알케닐, 아미노알키닐, 아미도알케닐, 아미도알키닐, 이미노알케닐, 이미노알키닐, 티오알케닐, 티오알키닐, 카르보닐-치환된 알케닐 또는 알키닐을 생성할 수 있다. 각 임의의 구조 내에서 한번 이상 나타나는 경우에, 각 표현, 예를 들어 알킬, m, n 등의 정의는 동일한 구조 내에서 다른 위치의 정의에 독립적인 것으로 의도된다.
"셀레노알킬"은 본 기술분야에 인식되어 있고, 이에 부착된 치환된 셀레노기를 가지는 알킬기에 관한 것이다. 알킬에서 치환될 수 있는 대표적인 "셀레노에테르"는 -Se-알킬, -Se-알케닐, -Se-알키닐, 및 -Se-(CH2)m-R61 중 하나로부터 선택되고, m 및 R61은 상기 정의된 바와 같다.
트리플릴, 토실, 메실 및 논아프릴은 본 기술분야에 인식되어 있고, 각각 트리플루오로메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, 메탄설포닐, 및 논아플루오로부탄설포닐(nonafluorobutanesulfonyl) 기에 관한 것이다. 트리플레이트, 토실레이트, 메실레이트, 및 논아플레이트는 본 기술분야에 인지되어 있고, 각각 트리플루오로메탄설포네이트 에스테르, p-톨루엔설포네이트 에스테르, 메탄설포네이트 에스테르, 및 논아플루오로부탄설포네이트 에스테르 작용기 및 이들 기를 함유하는 분자를 의미한다.
약어 Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts 및 Ms는 각각 메틸, 에틸, 페닐, 트리플루오로메탄설포닐, 논아플루오로부탄설포닐, p-톨루엔설포닐 및 메탄설포닐을 의미한다. 당업자인 유기 화학자에 의해 사용되는 보다 포괄적인 일련의 약어들은 저널 오브 올가닉 케미스트리(the Journal of Organic Chemistry)의 각 권의 초판에 있다.
"뇌하수체 아데닐 시클라아제 활성화 폴리펩티드" (PACAP)는 cAMP-의존성 신호전달 경로의 유효한 활성화제인 뉴로폴리펩티드에 관한 것으로 본원에 사용된다. PACAP는 호르몬 분비, 에너지 대사, 뉴런 생존의 조절과 같은 다양한 과정에 관여하며, 신경교 글루타메이트 트랜스포터 EAAT1 및 EAAT2의 조절제이다(참조: Figiel and Engele, J. Neurosci. 15: 3596-3605, 2000). PACAP는 세크레틴/글루카곤/혈관 활성 소장 펩티드(VIP) 수퍼패밀리에 속하고 동일한 전구체로부터 유래된 PACAP38(38개 아미노산 잔기) 및 PACAP27(27개 아미노산 잔기)로서 2개의 아미드화된 형태로서 존재한다. PACAP의 주요 구조는 튜니카타(tunicata), 이츠티옵시다(ichthyopsida), 양서류, 및 포유류 중에 진화 과정에서 상당히 보존되었고, PACAP 유사 뉴로펩티드는 또한 초파리에서 결정되었다. PACAP-38 및 PACAP-27에 더해, PACAP 수용체의 제 3 작용제는 막사딜란(Maxadilan)이다. 막사딜란은 식혈성 모래파리의 침샘 추출물로부터 분리된 유효한 혈관 확장 펩티드이다. 최근에, 막사딜란은 PACAP와 그다지 아미노산 서열 상동성이 없지만, 막사딜란은 PACAP 수용체 타입 1에 결합된다는 것이 증명되었다(참조: Moro and Lerner: Maxadilan, J. Biol. Chem. 272(2): 966-70, 1997). PACAP 및 이의 수용체 둘 모두는 높은 효능으로 다향성을 보이는 주로 신경계 및 내분비계에 분포되어 있다. 따라서, PACAP 펩티드, 막사딜란 또는 펩티드 유도체 및 유사체, PACPA 수용체를 자극(trigger)하는 펩티드 유사 화합물 및 소분자 작용제가 글루타메이트 트랜스포터 활성을 증가하는 데 사용될 수 있다.
"폴리시클릭" 또는 "폴리시클릭기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 두개의 인접한 고리에 두개 이상의 탄소가 공통인(즉, 고리가 "융합된 고리"인) 둘 이상의 고리(예를 들어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로시클릴)을 의미한다. 인접하지 않은 원자를 통해 결합된 고리는 "가교된" 고리라고 한다. 폴리사이클의 고리 각각은 상기 기술된 바와 같은 치환체 예를 들어, 할로겐, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 하이드록실, 아미노, 니트로, 설프하이드릴,이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카르보닐, 카르복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기, -CF3, -CN 등으로 치환될 수 있다.
"다수"는 둘 이상을 의미하는 것으로 본원에 사용된다.
"전구약물"은 생리학적 조건하에서 본 발명의 항균제로 전환되는 화합물을 포괄하는 것으로 의도된다. 전구약물을 제조하는 공통된 방법은 요망되는 화합물을 제공하기 위해서 생리학적 조건 하에서 가수분해되는 잔기를 선택하는 것이다. 다른 구체예에서, 전구약물은 숙주 동물의 효소 활성에 의해 전환된다.
"보호기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 요망되지 않는 화학적 변형으로부터 잠재적으로 반응성인 작용기를 보호하는 임시적인 치환체를 의미한다. 이러한 보호기의 예는 카르복실산의 에스테르, 알코올의 실릴 에테르, 알데하이드 및 케톤의 아세탈 및 케탈을 포함한다. 보호기 화학 분야는 문헌(Protective Groups in Organic Synthesis (2nd., Wiley: New York, 1991))에서 그린(Greene) 및 워츠(Wuts)에 의해 검토되었다.
"하이드록실-보호기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 합성 과정동안 요망되지 않는 반응에 대해 하이드록실 기를 보호하도록 의도된 기를 의미하고, 예를 들어 벤질 또는 다른 적합한 에스테르 또는 본 기술분야에 인지된 에테르기를 포함한다.
"카르복실-보호기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 합성 과정동안 요망되지 않는 반응에 대해 아미노산 또는 펩티드의 C-말단 또는 산성 또는 하이드록실 아제핀 고리 치환체과 같은 카르복실산기를 보호하는 것으로 의도되고, 카르복실기에 대한 보호기의 예에는 예를 들어 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 4-니트로벤질 에스테르, t-부틸 에스테르, 4-피리딜메틸 에스테르 등을 포함한다.
"아미노-차단 기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 아미노기가 일부의 다른 작용기에 수행된 반응에 참여하지 못하도록 하고, 요망되는 경우에 아민으로부터 제거될 수 있는 기를 의미한다. 이러한 기는 상기 인용된 그린 및 워츠의 문헌 7장 및 바톤(Batron)의 문헌(Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenum Press, New Yorl, 1973)에서 논의된다. 적합한 기의 예에는 아실 보호기, 예를 들어 포르밀, 단실, 아세틸, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 숙시닐, 메톡시숙시닐, 벤질, 및 3,4-디메톡시벤질과 같은 치환된 벤질, O-니트로벤질 및 트리페닐메틸; R이 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 2,2,2-트리클로로에틸, 1-메틸-1-페닐에틸, 이소부틸, t-부틸, t-아밀, 비닐, 알릴, 페닐, 벤질, p-니트로벤질, 0-니트로벤질, 및 2,4-디클로로벤질과 같은 기를 포함하는 화학식 -COOR의 기; 아실기 및 포르밀, 아세틸, 클로로아세틸, 디클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 벤조일 및 p-메톡시벤조일과 같이 치환된 아실; 및 메탄설포닐, p-톨루엔설포닐, p-브로모벤젠설포닐, p-니트로페닐에틸 및 p-톨루엔설포닐-아미노카르보닐과 같은 다른 기를 포함한다. 바람직한 아미노-차단 기는 벤질 (-CH2C6H5), 아실[C(O)R1] 또는 SiRl3(여기서 R1은 C1-C4 알킬, 할로메틸, 또는 2-할로-치환된-(C2-C4 알콕시), 방향족 우레탄 보호기, 예를 들어 카르보닐벤질옥시(Cbz); 및 t-부틸옥시카르보닐(Boc) 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐(FMOC)과 같은 지방족 우레탄 보호기이다.
각 표현, 예를 들어 저급 알킬, m, n, p 등의 정의는 이것이 임의의 구조에 한번 이상 나오는 경우에 동일한 구조의 다른 위치에서의 정의와 독립적인 것으로 의도된다.
"전자-끄는 기"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 이웃하는 원자로부터 원자가 전자를 끄는 치환체의 경향을 의미하는 것으로, 즉 치환체는 이웃하는 원자에 대하여 전기음전성이다. 전자 끄는 능력의 수준의 정량은 하메트(Hammett) 시그마(σ) 상수에 의해 주어진다. 이 널리 공지된 상수는 많은 참조문헌, 예를 들어 문헌(Advanced Organic Chemistry 251-59, McGraw Hill Book Company: New York, 1977)에 기술되어 있다. 하메트 상수치는 일반적으로 전자-제공 기에 대해 음의 값이고(NH2에 대해 σ(P)=-0.66) 전자-끄는 기에 대해서는 양의 값이며(니트로 기에 대해 σ(P)=0.78), σ(P)는 파라치환체이다. 대표적인 전자-끄는 기는 니트로, 아실, 포르밀, 설포닐, 트리플루오로메틸, 시아노, 클로라이드 등을 포함한다. 대표적인 전자-제공 기는 아미노, 메톡시 등을 포함한다.
"RNA"는 메신저 RNA, 성숙 RNA, 폴리아데닐화된 RNA, 폴리아데닐화되지 않은 RNA 및 인트론 및/또는 5' 또는 3' 비번역된 영역을 함유하는 RNA와 같은 리보핵산의 다양한 종을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. "발현된 RNA"는 폴리머라아제에 의해 게놈 또는 미토콘드리아 DNA로부터 전사된 RNA를 의미하는 것으로 본원에 사용된다.
"위치이성질체"는 본 기술분야에 인지되어 있고 동일한 분자식을 가지지만 원자의 결합이 상이한 화합물에 관한 것이다. 따라서, "위치선택성 공정"은 다른 것에 비해 특정 위치이성질체의 생산이 많은 공정, 즉 특정의 위치이성질체의 수율에 통계적으로 의미있게 증가된 반응을 의미한다.
"에피머"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 동일한 화학적 구성을 가지고 하나 이상의 위치중심을 함유하지만 이들 위치중심 중 하나만이 구조가 상이한 분자를 의미한다.
"소분자"는 약 5kD 미만의 분자량, 가장 바람직하게는 약 4kD 미만의 분자량을 가지는 조성물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 소분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 탄수화물, 지방, 또는 다른 유기(탄소함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 많은 제약회사 및 공급자는 광범한 라이브러리의 화학 및/또는 생물학적 혼합물, 종종, 균류(fungal), 박테리아, 아가 추출물을 가지며, 이들은 요망되는 행동 또는 인지능과 같은 생활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위하여 본 발명의 검정 중 어느 하나로 스크리닝될 수 있다.
"입체이성질체"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 동일한 화학적 구성을 가지지만 공간에서 원자 또는 기의 배열이 상이한 화합물을 의미한다. 특히, "거울상이성질체"는 서로의 넌-수퍼임포서블(non-superimposable)한 거울상인 화합물의 2개의 입체이성질체를 의미한다. 다른 한편, "부분입체이성질체"는 비대칭의 두개 이상의 중심을 가지는 입체이성질체로서 이의 분자가 서로 거울상이 아닌 것을 의미한다.
또한, "입체선택성 공정"은 반응 생성물의 특정 입체이성질체를 이 생성물의 다른 가능한 입체이성질체에 우선하여 생성하는 것이다. "거울상이성질체선택성" 공정은 반응 생성물의 두개의 가능한 거울상이성질체 중 하나의 생성이 우세한 것을 의미한다.
"구조-활성 관계" 또는 "(SAR)"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 약물 또는 다른 화합물의 분자 구조를 변경하는 것이 수용체, 효소, 핵산, 또는 다른 표적 등과의 상호작용을 변경하는 방식을 의미한다.
"피검체"는 포유동물, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 양, 소, 돼지, 말, 고양이, 쥐, 또는 개 과를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 바람직하게는, 피검체는 인간이다. 본 발명에 따른 치료법을 "필요로 하는" 피검체 또는 포유동물은 본원에 기술된 방법 및 조성물에 의해 개선될 수 있는 손상된 인지능은 가진다. "치환" 또는 "∼로 치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허가된 원자가에 따르고, 치환이 안정한 화합물, 예를 들어 재배열 고리화, 제거 또는 다른 반응과 같은 변형을 자발적으로 거치지 않는 화합물을 생성한다는 절대적인 단서를 포함하는 것으로 이해된다.
"치환체"는 또한 유기 화합물의 모든 허용되는 치환체를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용되는 치환체는 유기 화합물의 비시클릭 및 시클릭, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환체를포함한다. 대표적인 치환체는 예를 들어 상기 본원에 기술된 것들을 포함한다. 허용되는 치환체는 하나 이상일 수 있고 적절한 유기 화합물에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 질소와 같은 헤테로원자는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기술된 유기 화합물의 임의의 허용되는 치환체 및/또는 수소 치환체를 가질 수 있다. 본 발명은 유기 화합물의 허용되는 치환체에 의해 임의의 방식으로 제한된 것으로 의도되지 않는다.
"설포네이트"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타날 수있는 잔기를 의미한다:
상기 식에서, R57은 전자쌍, 수소, 알킬, 시클로알킬, 또는 아릴이다.
"설페이트"는 본 기술분야에 인지되어 있고 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 포함한다:
상기 식에서, R57은 상기 정의된 바와 같다.
"설폰아미도"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 포함한다:
상기 식에서 R50 및 R56은 상기 정의된 바와 같다.
"설파모일"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 의미한다:
상기 식에서, R50 및 R51은 상기 정의된 바와 같다.
"설포닐"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 의미한다:
상기 식에서, R58은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴 또는 헤테로아릴 중 하나이다.
"설폭시도"는 본 기술분야에 인지되어 있고, 하기 식으로 나타낼 수 있는 잔기를 의미한다:
상기 식에서 R58은 상기 정의된 바와 같다.
"합성"은 본 기술분야에 인지되어 있고, 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의한 생성에 관한 것이다.
"시험 집단"은 요망되는 행동 또는 인지능을 가지는 피검체에 관한 것으로 본원에서 사용된다. 시험 집단의 원은 젊은 피검체, 중간-연령 피검체 및 노화된 피검체를 포함할 수 있다.
"치료제"는 피검체에 적절하게 투여된 경우에 요망되는 치료 또는 예방 효과를 유발할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물에 관한 것으로 본원에서 사용된다. "치료제"는 피검체에 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 생물학적, 생리학적 또는 약제학적 활성 성분인 임의의 화학적 잔기 또는 생물 제제일 수 있다. 화학적 치료제의 예는 "약물"로도 언급될 수 있고 머크 인덱스(Merk Index), 탁상용 내과 지침(Physicians Desk Reference), 및 치료제의 약리학적 기초(Pharmacological Basis of Therapeutics)와 같은 널리 공지된 참조 문헌에 기술되어 있고, 이들은 제한 없이 약제, 비타민, 무기 공급물질, 질병 또는 병의 치료, 예방, 진단, 케어 또는 완화용 성분; 신체의 구조 또는 기능에 영향을 주는 성분; 또는 생리학적 환경에 놓여진 후에 생물학적으로 활성이 되거나 보다 활성이 커지는 전구약물을 포함한다. 항생제 및 FabI/FabK 억제제는 치료제의 예이다. 생물제제의 치료제의 예에는 유전자를 함유하고 이 유전자를 피검체에 전달하는 바이러스 벡터를 포함한다.
치료제는 동물, 특히 포유동물, 보다 특히 인간에서 약리학적 활성 성분에 의해 유발되는 국소적 또는 전신성 효과를 일으킨다. 따라서, 치료제는 유해한 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방을 위해 또는 동물 또는 인간에서 요망되는 신체적 또는 정신적 발달 및/또는 질환의 향상에 사용될 수 있다.
유효하기 위해서, 치료제는 임의의 치료에 적용될 수 있는 합당한 이익/위험 비율로 요망되는 국소적 또는 전신적 효과를 보이는 양 또는 농도로 전달된다. 이러한 치료제의 효과적인 양은 치료될 피검체 및 질환, 피검체의 체중 및 연령, 질환의 중증도, 투여 방식 등에 따라 다양할 것이고, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 조성물은 이러한 치료에 적용될 수 있는 타당한 이익/위험 비율로 효과를 보이는 충분한 양으로 투여될 수 있다. 손상된 인지능의 관계에 있어서, 치료 효과의 정도의 존재는 인지능을 평가하기 위한 본 기술분야에 인지된 다른 시험 또는 표준 행동 시험을 사용하여 평가될 수 있다.
"트란스"는 본 기술분야에 인지되어 있고 이중 결합의 양쪽에 원자 또는 기가 있는 이중 결합 주변의 두개의원자 또는 기의 배열에 관한 것이다. 트란스 배열은 종종 (E) 배열로서 표지된다.
피검체의 손상된 인지능을 "치료"하거나 손상된 인지능을 가지는 피검체를 "치료"하는 것은, 예를 들어 약물의 투여와 같은 임의의 적절한 수단에 의해 치료제로 피검체에 제공하여 손상된 인지능의 증상의 하나 이상이 안정화되거나 감소되는 것을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 손상된 인지능을 치료하는 것은 손상을 막거나, 손상의 진행을 지연시키거나 손상을 개선하거나(질병의 중증도를 완화시키거나) 손상을 치유하는 것일 수 있다.
"벡터"는 DNA 또는 RNA를 조직에 도입하는 데 사용될 수 있는 조성물을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 적절한 전사/번역 조절 신호에 연결된 대상 단백질을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Sambrook & Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 2001, 및 Ausebel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y., 1989)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
세포에 벡터 또는 플라스미드를 전달하기에 적합한 방법은 미국 특허 제 5,578,475호, 제 5,627,175호, 제 5,705,308호, 제 5,744,335호, 제 5,976,567호, 제 6,020,202호, 및 제 6,051,429호에 기술된 바와 같이 지질/DNA 복합체를 포함한다. 적합한 시약은 리포펙타민, 폴리-양이온성 지질 2,3-디옥레일옥시-N-[2(스퍼민카르복스-아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA)(화합물 등록명(Chemical Abstracts Registry name): N-[2-(2,5-비스[(3-아미노프로필)아미노]-1-옥스펜틸)아미노)에틸]-N,N-디메틸-2,3-비스(9-옥타데세닐옥시)-1-프로판아민-트리플루오로아세테이트)의 3:1(w/w) 리포좀 제형, 및 막 여과 물 중의 중성 지질 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)를 포함한다. 예를 들어, 제형 리포펙타민 2000TM(인비트로겐(전 지브코/라이프 테크놀로지)으로부터 입수 가능 #11668019)이 있다. 다른 시약은, FuGENETM6 트랜스펙션 시약(비리포솜 형태의 지질 혼합물 및 80% 에탄올 중의 다른 화합물, 로쉐 다이아그노스틱 코포레이션 #1814443으로부터 입수 가능) 및 리포TAXITM 트랜스펙션 시약(인비트로겐 코포레이션의 지질 제형, 요망되는 생물학적 활성 단백질 생성. #204110)을 포함한다. 세포의 트랜스펙션은 예를 들어 문헌(Roach and McNeish, Methods in Mol. Biol. 185:1, 2002)에 기술된 바와 같은 일렉트로포레이션에 의해 수행될 수 있다. 안정한 유전적 변형으로 세포를 생성하기 위한 적합한 바이러스 벡터 시스템은 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 다른 바이러스에 기초할 수 있고, 상업적으로 입수가능한 바이러스 성분을 사용하여 제조할 수 있다. 벡터는 (예를 들어 뇌의 특정 영역으로의) 주사를 포함하는 공지된 방법에 의해, 뇌실 공간 또는 뇌척수액으로의 문합 및 다른 기계적 수단을 사용하여 뉴런 세포 및 조직으로 도입될 수 있다.
"젊은"은 성적으로 성숙된 연령 정도, 해마가 막 완전히 성숙된 연령의 청소년 및 정상 성체 포유동물을 의미한다. 래트의 경우, "젊은" 래트는 6 내지 9월령이다. 인간의 경우에, "젊은" 인간은 10 내지 20세이다.
6.2 도입: 인지능의 행동 및 유전자 평가의 조합 연구
모리스 물 미로 및 방사상 암 미로로 인지능의 행동 평가는 인지능의 연령 관련 변화를 동정하는 데 유용하다. 이러한 행동 평가를 인지능에 기초한 동물의 표현형을 확인하는 방법으로서 사용하는 경우에, 뇌에 대한 노화의 효과의 차이를 검출하기 위하여 인지능의 유전적 및 생리적 측정을 행동 평가와 조합할 수 있다.
유전자 발현 어레이의 사용은 뇌의 연령 및 행동 관련 변화의 유전자 주형을 얻기 위하여 수천 이하의 발현된 유전자를 동시에 분석하는 잠재력을 제공한다. 이러한 접근법은 또한 일부 한계를 제공한다. 첫째, 노화된 인간 집단에서처럼, 본 발명자들의 래트 모델은 유전자 발현 프로파일링에서 혼동 인자로서 개체 다양성을 첨가할 수 있는 유전학적으로 이계 교배된 집단을 포함한다. 둘째, 해마에서 특정 mRNA의 수준을 평가하기 위하여 전통적인 정량적 방법을 사용하여, 본 발명자들은 유전자 발현에서 연령 및 행동 관련된 변화가 종종 상대적으로 적거나, 현존하는 제네칩® 또는 마이크로어레이 접근법에서 파워를 구별하는 한계로서 보고된 유전자 발현의 수준에서 2배차 보다 작다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 랜드필드(Landfield)와 그 동료에 의한 작업은 유전자 발현에서 2배 미만 차를 검출할 수 없기 때문에 제한된다(WO 03/025122 A2).
본원에서는, 노화된 래트 및 젊은 래트를 구별하기 위하여 전통적인 방법에 의해 증명한 유전자의 발현에서의 적은 차이의 신뢰성 있는 검출을 증명함에 의해 이러한 한계점을 극복하는 전략을 기술한다. 보다 넓은 범위의 유전자의 분석은 이러한 방법이 노화된 래트의 행동 상태와 관련된 해마 내에서 발현의 변화를 보이는 상당한 수의 유전자를 재현성 있게 밝힌다는 것을 나타낸다.
인지능 손상과 관련된 유전자의 확인은 후보 화합물이 정상적인 인지능과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 지를 결정하는 것을 처음으로 허용한다. 요망되는 인지능을 가지는 포유동물 예를 들어 인간에서 이러한 유전자의 발현 수준에 보다 가깝게 접근하도록 하는 유전자의 발현을 조절하는 화합물은 치료제로서 사용되는 경우에 인지능을 회복하거나 개선시키는 것으로 기대된다. 이러한 접근법을 사용하여, 노화된 포유동물에서의 인지능의 보존과 관련된 유전자의 발견을 보고한다. 추측에 의해 제한됨 없이, 이러한 보존은 적절한 치료제로 치료함에 의해 야기되거나 유도될 수 있는 활성의 생물학적 방법을 나타내는 것으로 생각된다. 실제로, 본원에서 이러한 제제는 제 3세대 세팔로스포린인 세프트리악손임을 보고한다. 다른 제제는 발프로산 및 MS-153이다. 추가의 치료제는 하기 기술된 스크리닝 방법을 사용하여 확인되고 최적화될 수 있다. 본 발명에 이르는 실험 방법 및 본 발명 그 자체 뿐만 아니라 본 발명의 실시를 위한 기술은 하기에 제시된다.
6.2.1 RNA 분리
개체로부터 조직 시료 또는 세포로부터의 RNA를 분리하는 경우에, 조직 또는 세포가 피검체로부터 제거된 후에 유전자 발현에서 추가의 변화를 막는 것이 중요하다. 발현 수준의 변화는 빠르게 하기 불안요인을 발생시키는 것으로 알려져 있다: 예를 들어, 열 쇼크 또는 리포폴리사카라이드(LPS)와의 활성화 또는 다른 시약. 또한, 조직 및 세포에서의 RNA는 빠르게 분해되어 갈 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 피검체로부터 얻은 조직 또는 세포는 가능한한 신속하게 스냅 냉동된다.
RNA는 다양한 방법, 예를 들어 실시예에 기술된 방법 또는 CsCl 원심분리(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299)가 후속하는 구아니디움 티오시아네이트 분해에 기술된 방법에 의해 조직 시료로부터 추출될 수 있다. 냉동된 조직으로부터의 RNA는 조직을 페놀/구아니디늄 티오시아네이트 혼합물(인비트로겐에서 입수) 중에서 균질화하여 분리하고 클로로포름으로 추출하고 이소프로판올로 정제할 수 있다. RNA 펠릿은 다음에 재현탁되고 RN이지(RNeasy) 칼럼(Qiagen)으로 추가 정제할 수 있다. 모든 RNA는 RNase 억제제의 부재 하에 -80℃에서 보관될 수 있고, 완전성은 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가된다. 단일 세포로부터의 RNA는 문헌(Dulac, C., 1998, Curr. Top. Dev. Biol. 36, 245 및 Jena et al., 1996, J. Immunol. Methods 190: 199)에 기술된 바와 같은 단일 세포로부터의 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 방법에 기술된 바와 같이 수득될 수 있다. RNA 분해를 피하기 위하여 예를 들어 RNase 억제제의 삽입에 의해 조치 될 수 있다.
RNA 시료는 다음에 특정 종에서 농축될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리(A)+ RNA는 RNA 시료로부터 분리된다. 일반적으로 이러한 정제는 mRNA상의 폴리-A 꼬리를 이용한다. 특히 상기 언급한 바와 같이, 폴리-T 올리고누클레오티드는 mRNA에 대한 친화성 리간드로서 작용하기 위하여 고형 지지체 내에 고정될 수 있다. 이러한 목적의 키트, 예를 들어 메시지메이커 키트(MessageMaker kit)(인비트로겐 #10298016)가 구입가능하다.
특정 구체예에서, RNA 집단은 인지능에 관여하는 유전자의 서열과 같은 대상 서열로 농축된다. 농축은 예를 들어 프라이머-특이적 cDNA 합성 또는 cDNA 합성에 기초한 수회의 선형 증폭 및 주형에 대한 시험관내 전사에 의해 수행될 수 있다(참고: Wang et al, 1989, PNAS 86, 9717; Dulac et al., supra and Jena et al., supra).
특정 종 또는 서열로 농축되거나 농축되지 않은 RNA 집단은 추가로 증폭될 수 있다. 이러한 증폭은 하나 또는 수개의 세포로부터 RNA를 사용하는 경우에 특히 중요하다. 다양한 증폭 방법은 예를 들어 PCR, 리가아제 연쇄 반응(LCR)(참조예: Wu and Wallace, Genomics 4, 560, 1989, Landegre et al., Science 241, 1077, 1988), 자생적 서열 복제(self-sustained sequence replication, SSR)(참조예: Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874, 1990), 핵산 기재 서열 증폭(NASBA) 및 전사 증폭(참조예: Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173, 1989)을 포함하여 본 발명의 방법에 사용되기에 적합하다. PCR 기술에 대하여, 문헌[PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A.Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967, 1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17, 1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press., Oxford)] 및 미국 특허 제 4,683,202호를 참조할 수 있다. 증폭 방법은 예를 들어 문헌[Ohyama et al., 2000, Bio Techniques 29: 530; Luo et al., 1999, Nat. Med. 5, 117; Hagde et al., 2000, Curr. Biol. 10: 301, Spirin et al., 1999, Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40: 3108, 및 Sakai et al, 2000, Anal Biochem. 287: 32]에 기술되어 있다. RNA 증폭 및 cDNA 합성은 또한 세포 본래의 장소에서 수행될 수 있다(참조예: Eberwine et al., 1992, PNAS 89: 3010). "정량적 PCR"은 시료에서 반응 생성물의 양 또는 반응 생성물의 수를 결정하는 것을 가능하게 하는 PCR 프로토콜을 사용하는 것에 관한 것이다.
당업자는, 정량적 결과가 요망되는 경우에 어떤 증폭 방법이 사용되는 지에 관계 없이 정량적 증폭을 수행하기 위하여 증폭된 핵산의 상대적인 빈도를 유지하거나 조절하는 방법을 사용하는 조치가 취해져야 한다는 것을 인식할 것이다. "정량적" 증폭의 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 정량적 PCR은 동시에 동일한 프라이머를 사용하여 대조 서열의 공지된 양을 함께 증폭하는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응을 조정하는 데 사용될 수 있는 내부 표준을 제공한다. 다음, 고밀도 어레이는 증폭된 핵산의 정량을 위한 내부 표준에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다.
하나의 바람직한 내부 표준은 합성 AW106 cRNA이다. AW106 cRNA는 당업자에게 공지된 표준 기술에 따라 시료로부터 분리된 RNA와 조합될 수 있다. 다음에, RNA는 역전사효소를 사용하여 역전사되어 DNA 복사체를 제공한다. cDNA 서열은 다음에 표지된 프라이머를 사용하여 (예를 들어 PCR에 의해) 증폭된다. 증폭 생성물은 통상적으로 전기영동에 의해 분리되고 방사선활성의 양(증폭된 생성물의 양에 비례)으로 측정된다. 다음에, 시료 중에 mRNA의 양은 공지된 AW106RNA 표준에 의해 생성되는 신호와 비교함에 의해 계산된다. 정량적 PCR에 대한 상세한 프로토콜은 문헌(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., 1990)에 제공된다.
바람직한 구체예에서, 시료 mRNA는 역전사효소, 올리고(dT) 및 파지 T7 프로모터를 엔코딩하는 서열로 구성된 프라이머로 역전사되어 단일 가닥 DNA 주형을 제공한다. 제 2 DNA 주형은 DNA 폴리머라아제를 사용하여 중합된다. 이중나선 cDNA의 합성 후에, T7 RNA 폴리머라아제가 첨가되고 RNA가 cDNA 주형으로부터 전사된다. 각 단일의 cDNA 주형으로부터 연속적인 전사는 증폭된 RNA를 제공한다. 시험관내 중합의 방법은 당업자에 널리 공지되어 있다(참조예: Sambrook & Russell, (supra), 이 특정 방법은 문헌(Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1663-1667, 1990)에 상세하게 기술되어 있고, 여기서 본 발명에 따른 시험관내 증폭이 다양한 RNA 전사체의 상대적인 빈도를 보존한다는 것을 증명한다). 더욱이, 문헌(Eberwine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014)는 본래 출발 물질의 106배 초과의 증폭을 달성하기 위하여 시험관내 전사를 통해 2회 증폭시켜 발현이 생물학적 시료가 어디로 제한되는 지를 모니터링하도록 하는 프로토콜을 제공한다.
상기 기술된 직접적인 전사 방법이 안티센스(aRNA) 푸울을 제공한다는 것은 당업자에게 인지되어 있다. 안티센스 RNA가 표적 핵산으로 사용되는 경우에, 어레이에 제공된 올리고누클레오티드 프로브는 안티센스 핵산의 부분 서열에 상보적인 것으로 선택된다. 거꾸로, 표적 핵산 푸울이 센스 핵산 푸울인 경우에 올리고누클레오티드 프로브는 센스 핵산 서열의 부분 서열에 상보적인 것으로 선택된다. 최종적으로, 핵산 푸울이 이중 나선인 경우, 프로브는 표적 핵산이 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함하는 때에 어느 하나는 센스이다.
6.2.2. RNA 분석
특정 구체예에서, 수천수만의 유전자에 대하여 하나의 또는 수개의 유전자의 발현을 결정하는 것은 충분하다. 마이크로어레이는 이러한 구체예에서 사용될 수 있는 데도 불구하고, 유전자 발현의 검출을 위한 다양한 방법이 사용가능하다. 본 절에서는 mRNA 또는 이에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 검출하고 정량하기 위한 예시적인 수개의 방법을 기술한다. 방법의 제 1 단계는 세포로부터 mRNA의 분리를 포함하는 경우에 이러한 단계는 상기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 하나 이상의 핵산을 표지하는 것이 하기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 시료로부터 수득된 mRNA는 제 1 cDNA 가닥으로 역전사되고 PCR 예를 들어 RT-PCR을 거친다. 하우스킵핑(House keeping) 유전자 또는 발현이 변화하지 않는 다른 유전자는 내부 대조군 및 시험과정의 대조군으로서 사용될 수 있다. PCR 반응 후에, 증폭된 생성물은 전기영동에 의해 분리될 수 있고 검출될 수 있다. 정량적 PCR을 사용함에 의해 증폭된 생성물의 수준은 시료에 존재하는 RNA 수준과 상관관계를 가진다. 증폭된 시료는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리될 수 있고 필터로 옮겨지고, 필터는 대상 유전자에 특이적인 프로브로 하이브리드화된다. 많은 시료가 병렬적 PCR 증폭, 예를 들어 복합 PCR을 수행함에 의해 동시에 분석될 수 있다.
사용될 수 있는 정량적 PCR 기술은 태크맨TM 프로브의 사용에 기초한다. 특정 서열 검출은, 5' 말단 및 3' 말단에 각각 두개의 PCR 프라이머 사이를 어닐링하는 리포터 및 퀀처(quencher) 형광 염료로 표지된 올리고누클레오티드 프로브의 존재 하에 PE 어플라이드 바이오시스템즈 7700 시퀀스 디텍션 시스템(PE Applied Biosystmes 7700 Sequence Detection System)에서 표적 서열의 증폭에 의해 수행된다. 특정 생성물만이 프로브가 프라이머 사이에 결합한 경우에 검출될 것이다. PCR 증폭이 진행됨에 따라, Taq 폴리머라아제의 5'-누클레아제 활성은 초기에 프로브로부터 리포터 염료를 절단한다. 리포터 염료가 물리적으로 퀀처 염료로부터 분리된 경우에 발생되는 신호는 신호를 부착된 CCD 카메라로 측정함에 의해 검출된다. 또한, SYBR 그린과 같은 삽입성(intercalating) 염료를 사용할 수 있다. 생성된 각 신호는 하나의 표적 가닥의 증폭에 해당하는 하나의 절단된 프로브와 같다. PCR 반응은 제공된 지시에 따라 PE 어플라이드 바이오시스템 택맨 PCR 코어 리전트 키트(PE Applied Biosystem TaqMan PCR Core Reagent Kit)을 사용하여 제공될 수 있다. 이러한 기술을 예를 들어 미국특허 제 6,326,462호에 추가로 기술되어 있다. 대안적으로, 프로브는 인비트로겐 플래티늄 정량적 PCR 키트 및 로토르진(Rotorgene) 3000을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈 및 퀴아겐(Qiagen)으로부터 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, mRNA 수준은 닷블랏 분석 및 관련 방법에 의해 결정된다(참조예: G.A. Belts et al., in Methods in Enzymology, Vol. 100, Part B,R. Wu, L. Grossmam, K. Moldave, Eds., Academic Press, New York, Chapter 19, pp 266-308, 1985). 일 구체예에서, 세포로부터 추출된 특정 양의 RNA가 필터 상에 블라팅되고(예를 들어 비공유결합), 필터는 대상 유전자의 프로브로 하이브리드화된다. 많은 RNA 시료는 동시에 분석될 수 있는데, 이는 블랏이 다수의 RNA 스팟(spot)을 포함할 수 있기 때문이다. 하이브리드화는 프로브의 표지의 타입에 따라 다른 방법을 사용하여 검출된다. 다른 닷블랏 방법에서, 인지능에 있어 상향 및 하향 조절되는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 프로브가 막에 부착되고 그 막은 피검체의 세포 또는 조직의 RNA로부터 얻어지거나 이로부터 임의로 유래된 표지된 핵산과 인큐베이션된다. 이러한 닷 블랏은 필수적으로 마이크로어레이 보다 적은 프로브를 포함하는 어레이이다.
"닷 블랏" 하이브리드화는 다양한 용도를 가지고 많은 버젼이 개발되어 있다(참조예: M.L.M. Anderson and B.D. Young, in Nicleic Acid hybridization-A Practical Approach, B.D. Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Washington D.C., CHapter 4, pp.73-111, 1985).
다른 포맷, 즉 "샌드위치" 하이브리드화는 고형 지지체에 올리고누클레오티드 프로브를 공유결합에 의해 부착하고 이들을 여러 핵산 표적을 포획하고 검출하는데 사용하는 것을 포함한다(참조예: M. Ranki et al., Gene, 21, pp 77-85, 1983; A.M. Palva, T.M. Ranki, and H.E. Soderlund, in UK Patent Application GB 2156074A, Oct. 2, 1985; T.M. Ranki and H.E.Soderlund in US Pat No. 4,563,419, Jan. 7, 1986; A.D.B. Malcolm and J.A. Langdale, in PCT WO 86/03782, Jul. 3, 1986; Y. Stabinsky, in U.S. Pat. No. 4,751,177, Jan. 14, 1988; T.H.Adams et al., in PCT WO 90/01564, Feb. 22, 1990; R.B. Wallace et al., 6 Nucleic Acid Res. 11, p3543, 1979; 및 B.J. Connor et al., 80 Proc. Natl. Acad. Sci. USA pp. 278-282, 1983). 이러한 포맷의 여러 버젼을 "역방향 닷 블랏(reverse dot blot)"이라고 부른다.
mRNA 수준은 또한 노던 블랏에 의해 측정될 수 있다. 특정 양의 RNA는 겔 전기영동에 의해 분리되고 대상 유전자에 대응하는 프로브로 하이브리드화되는 필터 상에 옮겨진다. 이러한 방법은, 많은 시료와 유전자가 분석되어야 하는 경우에 보다 부담이 되지만 매우 정확하는 점에서 이점을 제공한다.
유전자 발현의 고효율 분석을 위한 바람직한 방법은 유전자 발현의 연쇄 분석(serial analysis of gene expression, SAGE) 기술로서 문헌(Velculescu et al., 1995, Science 270, 484-487)에 기술되어 있다. SAGE의 이점 중에, 소정의 세포 타입에서 발현되는 모든 유전자를 검출하는 능력을 가지고, 이러한 유전자의 상대적일 발현에 관한 정보를 제공하고, 두 세포의 유전자의 유전자 발현의 용이한 비교를 가능하게 하고, 검출된 유전자를 확인하는데 사용될 수 있는 서열 정보를 수득한다는 것이다. 따라서, SAGE 방법은 다양한 세포 타입에서 조절되고 비조절된 유전자의 발현을 용이하게 검출할 수 있다(참조예: Velculescu et al., 1997, Cell 88, 243-251; Zhang et al., 1997, Science 276, 1268-1272, and Velculescu et al., 1999, Nat. Genet. 23, 387-388).
핵산을 생성하고 프로빙하기 위한 기술은 예를 들어 문헌(Sambrook & Russell, supra)에 추가로 기술되어 있다.
대안적으로, 인지능 손상을 상향 또는 하향 조절하는 하나 이상의 유전자의 발현 수준은 인 시튜 하이브리드화 조직화학법에 의해 결정된다. 일 구체예에서, 조직 시료는 피검체로부터 얻어지고, 얇은 절편이 제조되고 인 시튜 하이브리드화가 본 기술분야에 인지된 방법에 따라 수행되어 대상 유전자의 발현 수준을 결정한다.
상기 방법은, 포유동물에 내인성 유전자의 제 2 엑손에 작동적으로 결합되어 있는, 외인성 조절 서열, 외인성 엑손 및 스플라이스 위치를 포함하는 새로운 전사 단위 또는 유전자 활성화 구조물을 도입함에 의해 활성화될 수 있는 내인성 유전자의 증가된 발현(여기서 세포는 내인성 유전자에 존재하는 엑손에 더하여 외인성 엑손을 포함한다)을 평가하기 위하여 사용될 수 있다(참조예: 미국 특허 제 5,641,670호, 제 5,773,746호, 제 5,733,761호, 제 5,968,502호, 제 6,702,989호, 및 제 6,565,844호).
다른 방법에서, 유전자의 발현 수준은 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질 수준을 측정함에 의해 검출된다. 이는 예를 들어 면역침강, ELISA, 또는 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질을 특이적으로 검출하는 항체와 같은 시약을 사용하는 면역조직화학법에 의해 수행할 수 있다. 다른 기술은 웨스턴 블랏 분석을 포함한다. 면역검정은 공통적으로 세포 시료에 단백질 수준을 정량하는 데 통상 사용되고 많은 다른 면역검정 기술이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 특정 검정 방법에 한정되지 않고, 따라서 동종성 및 이종성 방법 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따라 수행될 수 있는 예시적인 면역검정은 형광물질 분극화 면역검정(FPIA), 형광물질 면역검정(FIA), 효소 면역검정(EIA), 비탁계 억제 면역검정(NIA), 효소 결합된 면역흡착 검정(ELISA), 및 방사선면역검정(RIA)를 포함한다. 인디케이터 잔기 또는 표지 기는 해당 항체에 부착될 수 있고 검정 기구 및 호환성 면역검정 방법의 입수가능성에 의해 종종 지시되는 다양한 방법의 사용의 필요성을 충족시키도록 선택된다. 상기 언급된 다양한 면역검정을 수행하는 데 사용되는 일반적인 기술은 당업자에게 공지되어 있다.
세포로부터 분비되는 폴리펩티드의 경우에, 이러한 폴리펩티드의 발현 수준이 생물학적 유체에서 측정될 수 있다.
일부 구체예에서, mRAN 수준은 하기 절에서 상세히 기술되는 마이크로어레이 분석에 의해 검출되고/거나 측정된다.
6.3 도입: 마이크로어레이
일반적으로, 어레이를 이용하여 발현 프로파일을 결정하는 것은 하기 단계를 포함한다: (a) 피검체로부터 mRNA 시료를 수득하고 이들로부터 표지된 핵산("표적 핵산" 또는 "핵산")을 제조하는 단계; (b) 표적 핵산이, 예를 들어 하이브리드화 또는 특정 결합에 의해 어레이에서 대응하는 프로브와 결합하기에 충분한 조건 하에서 어레이와 표적 핵산을 접촉시키는 단계; (c) 선택적으로 어레이로부터 결합되지 않은 표적을 제거하는 단계; (d) 결합된 표적을 겁출하는 단계; 및 (e) 결과를 분석하는 단계. 본원에서 사용된 바와 같이, "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 어레이에 부착된 핵산이고, 반면에 "표적 핵산"은 어레이에 하이브리드화된 핵산이다. 이들 단계 각각은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
6.3.1 마이크로어레이 분석을 위한 핵산 표지
일반적으로, 표적 분자는 마이크로어레이로의 표적 분자의 하이브리드화의 검출을 허용하도록 표지될 것이다. "표지된"은 신호 생성 시스템의 원을 포함하여 직접적으로 또는 신호 생성 시스템의 하나 이상의 추가 원과의 조합을 통하여 검출될 수 있음을 의미한다. 직접적으로 검출가능한 표지의 예에는, 예를 들어 프라이머의 dNMP의 누클레오티드 단일 유닛과 같은 프로브의 잔기에 혼입된, 통상적으로 공유결합된 동위원소 및 형광 잔기, 또는 프로브 잔기의 작용기에 결합될 수 있는 검출가능한 표지의 광활성 또는 화학적 활성 유도체를 포함한다.
핵산은 RNA의 농축 및/또는 증폭 후 또는 그 동안에 표지될 수 있다. 예를 들어, 표지된 cDNA는 올리고 dT-프라이밍되거나 임의로 프라이밍된 역전사효소에 의해 mRAN로부터 제조될 수 있고, 이들 둘 모두는 당업계에 공지되어 있다(참조: Klug and Berger, 1987, Methods Enzymol. 152: 316-325). 역전사는 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된 dNTP, 가장 바람직하게는 형광 표지된 dNTP의 존재 하에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 분리된 mRNA는 표지된 dNTP의 존재 하에 이중가닥 cDNA의 시험관내 전사에 의해 합성된 표지된 안티센스 RNA로 전환될 수 있다(참조: Lockhart et al., Nature Biotech. 14: 1675, 1996). 대안적인 구체예에서, cDNA 또는 RNA 프로브는 검출가능한 표지의 부재하에 합성되고 후속하여 바이오티닐화된 dNTP 또는 rNTP를 혼입시키거나 유사한 수단(예를 들어 바이오틴의 소랄렌(psoralen) 유도체를 RNA에 광-교차-결합시킴)에 의해 표지되고, 표지된 스트렙타비딘(예를 들어 피코에리트린-컨쥬게이션된 스트렙타비딘) 또는 등가물이 첨가된다.
일 구체예에서, 표지된 cDNA는 RNA 및 0.5mM dGTP, dATP, 및 형광 디옥시리보누클레오티드(예를 들어, 0.1mM 로다민 110 UTP(Perken Elmer Cetus)) 또는 0.1mM Cy3 dUTP(애머샴)를 함유하는 혼합물을 60분 동안 42℃에서 역전사효소(예를 들어 수퍼스크립트TMII, LTI Inc.)과 인큐베이션함에 의해 합성된다.
대상 형광 잔기 또는 표지는 쿠마린 및 이의 유도체, 예를 들어 7-아미노-4-메틸쿠마린, 아미노쿠마린, 바디피 에프엘(Bodipy FL)과 같은 바디피(bodipy) 염료, 캐스캐이드 블루, 플루오로신, 및 이의 유도체 예를 들어 플루오르신 이소티오시아네이트, 오레곤 그린, 로다민 염료 예를 들어 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 에오신 및 에리트로신, 시아닌 염료 예를 들어 Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX, 란타니드 이온의 마클로시클릭 킬레이트 예를 들어 퀀텀 염료TM, 티아졸 오렌지-에티디움 헤테로다이머와 같은 형광 에너지 전이 염료, TOTAB, 단실 등을 포함한다. 본 발명의 장치 또는 검정에서 요망되어 검출되는 요소에 결합되기 위한 작용기를 가지거나, 이러한 작용기를 혼입하기 위하여 개질될 수 있는 개별적인 형광 화합물은, 예를 들어 단실 클로라이드, 플루오르신 예를 들어 3,6-디하이드록시-9-페닐산티드롤; 로다민에이소티오시아네이트; N-페닐 1-아미노-8-설포네이토나프탈렌; N-페닐 2-아미노-6-설폰아토나프탈렌; 4-아세트아미도-4-이소티오시아네이토-스틸벤-2,2'-디설폰산; 피렌-3-설폰산; 2-톨루이디노나프탈렌-6-설포네이트; N-페닐-N-메틸-2-아미노아프탈렌-6-설포네이트; 에티디움 브로마이드; 스테브린; 아우로민-0,2-(9'-안트로일)팔미테이트; 단실 포르파티딜에탄올아민; N,N'-디옥타데실 옥사카르보시아닌: N,N'-디헥실 옥사카르보시아닌; 메로시아닌, 4-(3'-피레닐)스테아레이트; d-3-아미노데스옥시-데퀼레닌; 12-(9'-안트로일)스테아레이트; 2-메틸안트라센; 9-비닐안트라센; 2,2'(비닐렌-p-페닐렌)비스벤족사졸; p-비스(2--메틸-5-페닐-옥사졸릴))벤젠; 6-디메틸아미노-1,2-벤조페나진; 레티놀; 비스(3'-아미노피리디늄) 1,10-데칸디일 디요오다이드; 헬리브리에닌의 설포나프틸하이드라존; 클로로테트라사이클린; N-(7-디메틸아미노-4-메틸-2-옥소-3-크로메닐)말레이미드; N-(p-(2벤즈이미다졸릴)-페닐)말레이미드; N-(4-플루오란틸)말레이미드; 비스(호모바닐산); 레사자린; 4-클로로-7-니트로-2,1,3-벤조옥사디아졸; 메로시아닌 540; 레소루핀; 로즌 벤갈; 및 2,4-디페닐-3(2H)-푸라논을 포함한다(참조: Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif.). 많은 형광 태그는 시그마-알드리치, 애머샴 바이오사이언스, 몰레큘러 프로브, 화이자(전 파마시아), BD 바이오사이언스(전 클론텍), 켐진 코포레이션, 글렌 리서치 코포레이션, 인비트로겐, 플루카 케미카-바이오케미카 어넬리티카(플루카 케미 아게, 부취즈(Buchs), 스위스) 및 어플라이드 바이오시스템즈(포스터 시티, 칼리프) 뿐만 아니라 당업자에 공지된 다른 판매되는 공급원으로부터 구입이 가능하다.
화학발광 표지는 루시페린 및 2,3-디하이드로프탈라진디온 예를 들어 루미놀을 포함한다.
대상 동이원소 잔기 또는 표지는 32P, 33P, 35S, 125I, 2H, 14C 등을 포함한다(참조: Zhao et al., Gene 256:207, 1995; Pietu et al., Genome Res 6: 492, 1996).
표지는 또한 검출가능한 신호를 제공하기 위하여 동일한 시스템의 하나 이상의 추가 원과 협력하여 작용하는 신호 생성 시스템의 원일 수 있다. 이러한 표지의 예는 리간드, 예를 들어 바이오틴, 플루오르신, 디곡시게닌, 항원, 다가 양이온, 킬레이트 기 등와 같은 특정 결합쌍의 원이고, 이 원은 신호 생성 시스템의 추가의 원에 특이적으로 결합하고, 추가의 원은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공하며, 예를 들어 형광 잔기에 컨쥬게이션된 항체 또는 기질을 발색성 산물로 전환할 수 있는 효소 잔기, 예를 들어 알카라인 포스파타아제 컨쥬게이트 등이다.
추가의 표지는 이들이 결합되는 프로브가 표적 분자에 특이적으로 결합되는 경우에만 신호를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 이러한 표지는 문헌(Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology 14: 303, 1996 및 EP 0 070 685 B1)에 기술된 "분자 비콘(beacon)"을 포함한다. 다른 표지는 미국 특허 제 5,563,037호, WO 97/17471 및 WO 97/17076에 기술된 것들을 포함한다.
일부 경우에, 하이브리드화된 표적 핵산은 하이브리드화 후에 표지될 수 있다. 예를 들어 바이오틴 표지된 dNTP가 예를 들어 증폭 또는 전사에 사용되는 경우에, 스트렙타비딘 결합된 리포터 기는 하이브리드화된 복합체를 표지하는 데 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 표적 핵산은 표지되지 않는다. 이러한 경우에, 하이브리드화는 예를 들어 문헌(Thiel et al., Anal. Chem. 69: 4948, 1997)에 기술된 바와 같은 플라즈몬 공명에 의해 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 다수(예를 들어 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상)의 표적 핵산 세트가 표지되고 하나의 하이브리드화 반응("다중" 분석)에 사용된다. 예를 들어, 하나의 세트의 핵산은 하나의 세포 또는 조직 시료로부터의 RNA에 해당할 수 있고, 다른 세트의 핵산은 다른 세포 또는 조직 시료로부터의 RNA에 해당할 수 있다. 다수의 세트의 핵산은 상이한 표지, 즉 상이한 표지 예를 들어 구별될 수 있도록 하는 구별된 발산 스펙트럼을 가지는 상이한 형광 표지로 표지될 수 있다. 이 세트는 다음에 혼합되고 동시에 하나의 마이크로어레이에 하이브리드화될수 있다.
유전자 발현의 변경을 규정하는 이색 형광 표지 및 검출 방법의 사용이 문헌 (Shena et al., Science 270: 467-470, 1995)에 기술되어 있다. 2개의 상이한 플루오로포어로 표지된 cDNA를 사용하는 이점은, 두개의 세포 상태에서 각각 배열된 유전자에 해당하는 mRNA 수준의 직접적이고 내부 대조군에 의한 비교는 후속하는 분석에 영향을 주지 않는다는 것이다.
다수의 표적 핵산을 하나의 어레이에 하이브리드화하는 경우에 사용하기 위한 구별되는 표지의 예는 당업계에 공지되어 있고, Cy3 및 Cy5와 같은 2개 이상의 상이한 발산 파장 형광 염료, 피코에리트린 및 Cy5와 같은 형광 단백질 및 염료의 조합체, 32P 및 33P와 같은 상이한 에너지 발산의 2개 이상의 동이원소, 또는 상이한 분산 스펙트럼을 가지는 금 또는 은 입자, 온도, pH, 추가 화학 제제에 의한 처리 등과 같은 상이한 처리 상태에서 신호를 생성하거나 처리 후에 상이한 시점에 신호를 생성하는 표지를 포함한다. 신호 생성을 위하여 하나 이상의 효소를 사용하는 것은 효소(알카라인 포스파타아제/페록시다아제)의 상이한 기질 특이성에 기초하여 보다 다양한 구별되는 표지의 사용을 가능하게 한다.
또한, 개별적인 유전자 또는 어레이 스팟 위치에 특유한 바이어스를 감소시키기 위하여 이색 구별 하이브리드화 실험에서 형광 표지를 역전시키는 것이 실험 오류를 감소시키기 위하여 바람직하다. 즉, 먼저 측정될 두개의 세포로부터의 mRNA의 하나의 표지(예를 들어, 제 1 세포로부터의 핵산을 제 1 형광 색소로 표지하고 제 2 세포로부터의 핵산을 제 2 형광 색소로 표지)로 유전자 발현을 측정하고, 다음에 역전된 표지(예를 들어 제 1 세포로부터의 핵산을 제 2 형광색소로 포지하고 제 2 세포로부터의 핵산을 제 1 형광 색소로 표지)를 사용하여 두개 세포로부터 유전자 발현을 측정하는 것이 바람직하다. 노출 수준 및 미세변동 조절 파라미터 수준에 대한 다중 측정은 추가의 실험적 오류 제어를 제공한다.
표지된 핵산의 질은 어레이로의 하이브리드화 전에 평가될 수 있다. 예를 들어, 표지된 핵산의 시료는 핵산 시료에 존재하는 것으로 알려진 유전자 또는 이러한 것으로 의심되는 유전자의 5', 중간, 및 3' 부분으로부터 유래된 프로브에 하이브리드화될 수 있다. 이것은 표지된 핵산이 전장 핵산이거나 이들이 분해되었는지 여부를 나타낼 것이다. 일 구체예에서, 아피메트릭스(Affymetrix)(산타 바바라, CA)로부터의 진칩(GeneChip)® 테스트3 어레이가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 이 어레이는 포유동물을 포함하는 수개의 유기체로부터 특징화된 유전자의 서브세트를 나타내는 프로브를 함유한다. 따라서, 표지된 핵산 시료의 질은 시료 분획의 어레이로의 하이브리드화(예를 들어 아피메트릭스(산타 바바라, CA)로부터의 진칩® 테스트3 어레이)에 의해 결정될 수 있다.
6.3.2 마이크로어레이 분석
본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 어레이, 예를 들어 마이크로어레이는 인지능과의 관련성을 가지는 후보 유전자인 유전자의 하나 이상의 프로브를 포함한다. 예시적인 어레이는, 신경생물학의 연구에 적합한 1,200개 이상의 서열을 함유하는(카이네이즈에 대한 유전자 포함, 세포 표면), 진칩® 래트 신경생물학 U34 어레이 또는 진칩® 래트 발현 세트 230에서 발견된 유전자와 같은 인지능을 연구하기 위하여 하나 이상의 유전자를 포함한다. 추가적으로, 게놈 전반에 분산되어 있는 단일 누클레오티드 다형성(SNP)으로서 알려진 약 1,500 유전자 변형을 동시에 추적함에 의해 전체 인간 게놈을 관찰하는 진칩® HuSNPTM 어레이를 사용할 수 있다. SNP는 이들이 간단하고, 풍부하고, 널리 퍼져 있고, 인간 집단의 유전적 다양성을 설명하기 때문에 게놈 연구를 위해 우수한 마커이다. 진칩® 어레이와 같은 고성능 기술을 사용하여 SNP는 마이크로세틀라이드 서열과 같은 전통적인 마커보다 용이하게 추적될 수 있다.
어레이는 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 1000개 이상의 유전자에 해당하는 프로브를 포함할 수 있다. 이 어레이는 도 3에 나열된 유전자 또는 마이크로어레이에 이용가능한 다른 유전자의 약 10%, 20%, 50%, 70%, 90%, 또는 95%에 해당하는 프로브를 포함할 수 있다. 어레이는 도 3에 도시된 유전자 또는 세포에서 발현이 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배, 5배, 7배 이상, 가장 바람직하게는 약 10배 이상인 다른 유전자의 약 10%, 20%, 50%, 70%, 90% 또는 95%에 해당하는 프로브를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 하나의 예시적인 바람직한 어레이는 실시예에서 사용되고 기술된 어레이이다.
마이크로어레이 상의 각 유전자에 해당하는 하나 이상의 프로브일 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이는 하나의 유전자에 해당하는 2 내지 20개 프로브, 바람직하게는 약 5 내지 10개를 함유할 수 있다. 프로브는 후보 질병 유전자의 특징적인 유전자의 전장 RNA 서열 또는 이의 보체에 해당할 수 있거나, 이들은 특이적 하이브리드화를 허가하는 충분한 길이인 부분에 해당할 수 있다. 이러한 프로브는 약 50개의 누클레오티드 내지 약 100, 200, 500, 또는 1000개의 누클레오티드 또는 1000개 누클레오티드 초과를 포함할 수 있다. 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 마이크로어레이는 약 10 내지 50개 누클레오티드, 바람직하게는 마이크로어레이는 약 15 내지 30개 누클레오티드 및 보다 더 바람직하게는 20 내지 25 누클레오티드를 함유할 수 있다. 프로브는 바람직하게는 단일 가닥이다. 프로브는 요망되는 수준의 서열 특이적 하이브리드화를 제공하기 위하여 이의 표적에 충분히 상보성을 가져야 한다(하기를 참조).
통상적으로, 본 발명에 사용되는 어레이는 cm2 당 100개 초과의 상이한 프로브의 위치 밀도를 가질 것이다. 바람직하게는, 어레이는 500/cm2 초과의 위치 밀도, 보다 바람직하게는 약 1000/cm2초과의 위치 밀도, 가장 바람직하게는 약 10,000/cm2 초과의 위치 밀도를 가질 것이다. 바람직하게는 어레이는 하나의 단일 가닥에 100개 초과의 상이한 프로브를 가지고, 보다 바람직하게는 약 1000개 초과의 프로브를 가지고, 보다 더 바람직하게는 10,000개 초과의 프로브를 가지고, 가장 바람직하게는 100,000개의 상이한 프로브를 가진다.
마이크로어레이는 하기 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 아피메트릭스(산타 바바라, CA)에 의해 제조된 상품일 수 있다.
일반적으로, 2개 타입의 마이크로어레이가 사용될 수 있다. 이러한 2개 타입은 "합성" 및 "전달"로서 언급된다. 합성 타입에서, 마이크로어레이는 누클레오티드로부터 핵산의 인 시튜 합성에 의해 순차적으로 제조된다. 각 회의 합성으로, 누클레오티드는 요망되는 길이가 달성될 때까지 증가되는 사슬에 첨가된다. 전달 유형의 마이크로어레이에서, 제조된 핵산은 다양한 전달 기술을 사용하여 공지된 위치 상에 놓여진다. 많은 논문은 상이한 마이크로어레이 기술을 기술한다(참조례: Shena et al., Tibetech 16: 301, 1998; Duggan et al., Nat. Genet. 21: 10, 1999; Bowtell et al., Net. Genet. 21: 25, 1999).
하나의 새로운 합성 기술은 포토리쏘그래피 기술과 DNA 합성 화학법의 결합하여 고밀도 올리고누클레오티드 마이크로어레이 제조를 가능하게 하는 아피메트 릭스(산타 바바라, CA)에 의해 개발된 것이다. 이러한 칩은 약 1.6cm2의 영역에 400,000 이하의 그룹의 올리고누클레오티드를 함유한다. 올리고누클레오티드는 3' 말단에서 고정되어 있어서 하이브리드화를 위한 단일 가닥 핵산의 입수가능성을 극대화한다. 일반적으로 이러한 칩("진칩®"로서 언급됨)은 특정 유전자의 수개의 올리고누클레오티드, 예를 들어 16개 올리고누클레오티드와 같은 15 내지 20개 올리고누클레오티드를 함유한다. 아피메트릭스(산타 클라라, CA)는 주문 제작된 마이크로어레이를 제조하기 때문에, 인지능을 상향 또는 하향 조절하는 유전자를 함유하는 마이크로어레이는 아피메트릭스(산타바바라, CA)로부터 구입을 위하여 주문될 수 있다.
마이크로어레이는 또한 신테니(Synteni)(Fremont, CA)에서 상업화된 것들과 같이 기계적 마이크로스팟팅에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법에 따르면, 소량의 핵산은 고체 표면에 프린팅된다. 신테니에서 제조된 마이크로스팟팅된 어레이는 약 3.6cm2의 면적에서 10,000 그룹의 cDNA와 만큼 함유한다.
제 3 그룹의 마이크로어레이 기술은 "드랍-온-디맨드(drop-on-demand)" 전달 방법을 구성하고, 이들의 가장 개선된 것은 잉크-제트 기술이며, 이는 압전기(piezoelectric) 및 소형 노즐로부터 고형 표면으로 핵산을 전달하는 추진 수단의 다른 형태를 사용한다. 잉크젯 기술은 인사이트 파마수티컬즈(Palo Alto, CA) 및 프로토진(팔로 알토, CA)를 포함하는 수개의 센터에서 개발된다. 이러한 기술은 cm2 당 10,000 스팟의 밀도를 유발한다. 또한, 문헌(Hughes et al., Nat. Biotechim. 19: 342, 2001)을 참조할 수 있다.
어레이는 바람직하게는 대조군 및 참조 핵산을 포함한다. 대조군 핵산은 하이브리드화가 효과적인 것이라는 것을 알리는 핵산이다. 예를 들어, 모든 아피메트릭스(산타 바바라, CA) 발현 어레이는 수개의 원핵생물 유전자 예를 들어 대장균의 바이오틴 합성으로부터의 바이오B, 바이오C, 및 바이오 D 및 P1 박테리오파지로부터의 cre를 위한 프로브 세트를 함유한다. 이러한 어레이로의 하이브리드화는 이러한 유전자 또는 이들의 부분의 혼합물, 예를 들어 아피메트릭스(산타 바바라, CA)에 의해 제공되는 혼합물의 존재하에 수득되어 작용하여(파트 번호 900299) 하이브리드화가 효과적인것이라는 것을 확인한다. 표적 핵산과 함께 포함되는 대조 핵산은 또한 시험관내 전사에 의해 cDNA 클론으로부터 합성된 mRNA일 수 있다. 어레이에 포함될 수 있는 다른 대조 유전자는 폴리 A 대조군, 예를 들어 dap, lys, phe, thr, 및 trp(아피메트릭스 진칩®에 포함된다)이다.
참조 핵산은 하나의 실험으로부터 다른 실험으로 결과를 표준화하는 것을 허용하고, 여러 실험을 정량적인 수준에서 비교하는 것을 허용한다. 예시적인 참조 핵산은 공지된 발현 수준의 하우스킵핑 유전자, 예를 들어 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH), 헥소키나아제 및 액틴을 포함한다.
미스매치(mismatch) 대조군은 또한 발현 수준 대조 또는 표준화 대조를 위하여 표적 유전자에 대한 프로브를 위하여 제공된다. 미스매치 대조군은 이들의 대응하는 시험에 동일한 올리고누클레오티드 또는 다른 핵산 프로브 또는 올리고누클레오티드 프로브 또는 하나 이상의 미스매치된 염기의 존재를 제외한 대조 프로브이다.
어레이는 또한 유전자의 하나 이상의 대립 유전자에 하이브리드화되는 프로브를 함유한다. 예를 들어, 어레이는 대립유전자 1을 인지하는 하나의 프로브 및 특정 유전자의 대립유전자 2를 인지하는 다른 프로브를 함유할 수 있다.
마이크로어레이는 하기와 같이 제조될 수 있다. 일 구체예에서, 올리고누클레오티드의 어레이는 고형 지지체 상에서 합성된다. 예시적인 고형 지지체는 유리, 플라스틱, 중합체, 금속, 메탈로이드, 세라믹, 유기물 등을 포함한다. 칩 차단 기술 및 광보호 화학법을 사용하여 핵산 프로브의 정렬된 어레이를 셍성하는 것이 가능하다. 예를 들어 "DNA 칩"으로서 또는 매우 큰 규모의 고정된 중합체 어레이("VLSIPSTM" 어레이)로서 공지된 이들 어레이는 약 1 cm2 T 수 cm2의 면적을 가지는 기판에 규정된 수백만의 프로브 영역을 포함할 수 있어, 수개 내지 수백개의 프로브의 세트를 혼입할 수 있다(미국 특허 제 5,631,734호 참조).
표적 핵산을 검출하기 위한 고형 파지 핵산 어레이의 제조는 문헌에 잘 기술되어 있다. 문헌(Fodor et al., Science 152: 767-777, 1991; Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4): 718-719, 1993; Kozal et al., Nature Medicine 2(7): 753-759, 1996 및 Hubbell U.S. Pat. No. 5,571,639; Pinkel et al., PCT/US95/16155(WO 96/17958); U.S. Pat. Nos. 5,677,195; 5,624,711; 5,599,695; 5,451,683; 5,424,186; 5,412,087; 5,384,261; 5,252,743 및 5,143,854; PCT Patent Publication Nos. 92/10092 및 93/09668; 및 PCT WO 97/10365)를 참조할 수 있다. 간략하게, 조합 방법은 최소의 합성 단계를 사용하여 다수의 프로브를 함유하는 어레이의 합성을 허용한다. 예를 들어, 단지 32개 화학 합성 단계를 사용하여 모든 가능한 DNA 8-량체 올리고누클레오티드(48, 또는 65, 536의 가능한 조합물)을 합성하고 부착하는 것이 가능하다. 일반적으로 VLSIPSTM 방법은 단지 4n개 합성 단계를 사용하여 기판에 4n개의 상이한 올리고누클레오티드 프로브를 생성하는 방법을 제공한다(예를 들어, 미국 특허 제 5,631,734 5호; 제 143,854호 및 PCT 특허 공개 번호 WO 90/15070; WO 95/11995 및 WO 92/10092).
유리 표면상의 올리고누클레오티드의 광-유도 조합 합성은 컴퓨터 칩 산업에서 포토레지스트 기술과 유사한 자동화된 포스포라미디트 화학 및 칩 차단 기술로 수행될 수 있다. 통상적으로 유리 표면은 작용기 예를 들어 열-불안정한 보호기에 의해 차된된 하이드록실 또는 아민 기를 함유하는 실란 시약으로 유도체화된다. 포토리쏘그래픽 마스크를 통한 광분해는 들어오는 5'-광보호 누클레오시드 포스포르아미디트와 반응할 준비가 된 작용기를 노출하는 데 선택적으로 사용된다. 포스포르아미디트는 조명된 이들의 영역과만 반응한다(따라서, 광불안정한 차기 기의 제거에 의해 노출된다). 이와 같이, 포스포르아미디트는 선행 단계로부터 선택적으로 노출된 영역에 단지 첨가된다. 이러한 단계는 요망되는 서열의 어레이가 고형 표면에서 합성될 때까지 반복된다.
합성 사이클의 수를 감소시키는 마스크의 설계를 위한 알고리즘은 문헌(Hubbel et al), 미국 특허 제 5,571,639호 및 미국 특허제 5,593,839호에 의해 기술된다. 미국 특허 제 5,571,639호에 기술된 바와 같이 기판상의 핵산 프로브를 선택하고 어레이의 배치를 설계하기 위해 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다.
고밀도 어레이를 합성하기 위한 또 다른 방법은 미국 특허 제 6,083,697호에 기술되어 있다. 이 방법은 중합체 서열의 합성을 보조하기 위해 방사선에 의해 개시되는 촉매 시스템을 사용하는 신규한 화학적 증폭 방법을 이용한다. 이러한 방법은 중합체 서열의 형성을 촉진하는 방식으로 합성 중간체를 화학적으로 변경시키기 위한 촉매로서 작용하는 광민감성 화합물을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 광민감성 화합물은 방사선 활성화된 촉매 (RAC), 더욱 상세하게는 광 활성화된 촉매 (PAC)로서 일반적으로 일컬어지는 것들을 포함한다. RAC는 그 자체로 합성 중간체를 화학적으로 변경시킬 수 있거나, RAC는 합성 중간체가 후속 첨가되는 합성 중간체 또는 다른 화합물과 화학 결합할 수 있도록 하는 방식으로 합성 중간체를 화학적으로 변경시키는 자가촉매 화합물을 활성화시킬 수 있다.
또한, 어레이는 단량체들을 기계적으로 속박된 유로에 의해 지지체의 셀(cell)에 전달함으로써 조합적 방식으로 합성될 수 있다 (참조: Winkler et al., EP 624,059). 또한, 어레이는 잉크젯 프린터를 사용하여 단량체 시약들을 지지체상으로 스폿팅(spotting)함으로써 합성될 수 있다 (참조: 상기 인용한 EP 624,059 및 피즈(Pease) 등의 EP 728,520).
cDNA 프로브는 당 분야에 공지되고 본원에 추가로 설명된 방법, 예를 들어 서열 특이적 프라이머를 사용하는 RNA의 역전사 PCR (RT-PCR)에 따라 제조될 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브는 화학적으로 합성될 수 있다. 프로브가 제조되는 유전자 또는 cDNA의 서열은, 예를 들어 젠뱅크(GenBank), 그 밖의 공개 데이터베이스 또는 간행물로부터 입수할 수 있다.
핵산 프로브는 이들이 결합 화학과 양립할 수 있는 활성화된 히드록실기를 지니고 있는 한은 천연 핵산, 화학적으로 변형된 핵산, 예를 들어 누클레오티드 유사체로 구성된 핵산일 수 있다. 보호기는 그 자체로 광불안정성일 수 있다. 또한, 보호기는 특정 화학 조건, 예를 들어 산의 존재하에서 불안정할 수 있다. 이러한 예에 있어서, 고형 지지체의 표면은 광에 노출시에 산을 발생시키는 조성물을 함유할 수 있다. 따라서, 기판의 특정 영역이 광에 노출되면 그 영역에서 산이 발생되고, 이는 노출된 영역에 있는 보호기를 제거한다. 또한, 합성 방법은 3'-보호된 5'-0-포스르아미다이트-활성화된 데옥시누클레오시드를 사용할 수 있다. 이 경우, 올리고누클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 합성되며, 이는 유리 5' 단부를 생성시킨다.
어레이의 올리누클레오티드는 몇 천개의 올리고누클레오티드를 생성시킬 수 있는 96 웰 자동화 복합 올리고누클레오티드 합성기 (A.M.O.S.)를 사용하여 합성될 수 있다 (Lashkari et al., PNAS 93: 7912, 1995).
올리고누클레오티드 설계는 의도된 적용에 의해 영향을 받는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 모든 프로브에 대해 유사한 용융 온도를 지니는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 프로브의 길이는 어레이상의 모든 프로브에 대한 용융 온도가 매우 유사하게 되도록 조정된다 (다양한 프로브에 대한 다양한 길이는, 다양한 프로브가 다양한 GC 함량을 지니는 특정 T[m]을 달성하기 위해 필요할 수 있는 것으로 인식될 것이다). 용융 온도가 프로브 설계에 있어서 1차적 고려사항이라고 하더라도, 프로브 구성을 추가로 조정하기 위해, 예를 들어 프라이머 자체-상보성에 대해 선택하는 것 등을 위해 그 밖의 인자가 임의로 사용된다.
어레이, 예를 들어 마이크로어레이는 장래의 사용을 위해 제작 또는 구입 후에 편리하게 저장될 수 있다. 적합한 조건하에서, 본 발명의 어레이는 약 6개월 이상 동안 저장될 수 있고, 1년 이하 또는 그 이상 동안 저장될 수 있다. 어레이는 일반적으로 약 -20℃ 내지 실온에서 저장되며, 이 경우 어레이는 바람직하게는 플라스틱 용기, 예를 들어 백(bag)내에 밀폐되고, 빛으로부터 차폐된다.
6.3.3 마이크로어레이에 대한 표적 핵산의 하이브리드화
다음 단계는 표적 핵산과 어레이의 프로브를 결합시키기에 충분한 조건하에서 표적 핵산을 어레이와 접촉시키는 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 표적 핵산은, 표적 핵산과 마이크로어레이상의 프로브 사이에 하이브리드화를 일으키기에 충분한 조건하에서, 어레이와 접촉될 것이며, 여기서 하이브리드화 조건은 요망되는 수준의 하이브리드화 특이성을 제공하기 위해 선택될 것이다.
어레이와 표적 핵산의 접촉은 어레이를 표적 핵산을 포함하는 수성 매질과 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 어레이의 특정 형상에 따라 다수의 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 어레이가 단순히 "플레이트형(plate-like)"의 단단한 기판의 표면상에 크기 분리된 프로브의 패턴을 포함하는 경우, 접촉은 단순히 어레이를 표적 핵산 용액을 포함하는 용기, 예를 들어 폴리에틸렌 백 등에 넣음으로써 달성될 수 있다. 어레이가 두 개의 단단한 플레이트에 의해 결합된 분리 매질내에 엔트랩핑(entrapping)되는 다른 구체예의 경우, 전기영동 수단에 의해 표적 핵산을 전달할 가망이 존재한다. 또한, 어레이가 유체 유입구 및 유출구를 지닌 바이오칩 장치내로 혼입되는 경우, 표적 핵산 용액은 표적 분자의 패턴이 유입구를 통해 제공되는 챔버내로 도입될 수 있으며, 여기서 유체 도입은 수동적으로 수행되거나 자동화 장치에 의해 수행될 수 있다. 멀티웰(multiwell) 구체예에 있어서, 표적 핵산 용액은 수동적 방법, 예를 들어 피펫을 사용하거나, 자동화 유체 취급 장치를 사용하여 어레이를 포함하는 반응 챔버내로 도입될 것이다.
표적 핵산 용액과 프로브의 접촉은 표적과 프로브 사이의 결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 유지될 것이다. 프로브 및 표적의 성질에 좌우되기는 하지만, 접촉은 약 10분 내지 24시간, 통상적으로 약 30분 내지 12시간, 더욱 통상적으로 약 1시간 내지 약 6시간 동안 일반적으로 유지될 것이다.
시판되는 마이크로어레이를 사용하는 경우, 적합한 하이브리드화 조건은 제조업자에 의해 제공된다. 시판되지 않는 마이크로어레이를 사용하는 경우, 적합한 하이브리드화 조건은 하이브리드화 가이드라인 뿐만 아니라 마이크로어레이의 사용에 관한 다수의 간행 논문에 기술된 하이브리드화 조건을 기초로 하여 결정될 수 있다.
핵산 하이브리드화 및 세척 조건은 프로브가 특정 어레이 부위에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적으로 하이브리드화"되도록, 즉, 프로브가 상보적 핵산 서열을 지닌 서열 어레이에는 하이브리드화되거나, 듀플렉스(duplex)화하거나 결합하지만 상보적이지 않은 핵산 서열을 지닌 부위에는 하이브리드화되지 않게 되도록 최적으로 선택된다. 본 명세서에서 있어서, 보다 짧은 폴리누클레오티드가 25개 염기 이하인 경우에는 표준 염기쌍형성 규칙을 사용하여 미스매치가 없거나, 보다 짧은 폴리누클레오티드가 25개 염기 보다 긴 경우에는 5% 이하의 미스매치가 존재하면, 하나의 폴리누클레오티드 서열은 또 다른 폴리누클레오티드 서열과 상보적인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 폴리누클레오티드는 완전히 상보적 (미스매치 없음)이다. 특이적 하이브리드화 조건이 특이적 하이브리드화를 일으킨다는 것은 네거티브 대조군을 포함하는 하이브리드화 검정을 수행함으로써 용이하게 입증될 수 있다.
하이브리드화는 본질적으로 특이적 하이브리드화를 가능하게 하는 조건에서 수행된다. 프로브의 길이 및 GC 함량은 하이브리드의 Tm을 결정하며, 이로써 주형 핵산에 대한 프로브의 특이적 하이브리드화를 수득하는 데에 필요한 하이브리드화 조건을 결정할 것이다. 이들 인자는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 또한 검정법으로 시험될 수 있다. 핵산의 하이브리드화에 대한 포괄적 지침은 티이센(Tijssen)의 문헌 [(1993), "Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes"]에서 나타나 있다. 일반적으로, 스트린젠트(stringent) 조건은 규정된 이온 농도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열융점(Tm) 보다 약 5℃ 낮게 되도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전 매칭된 프로브에 하이브리드화되는 온도 (규정된 이온 농도 및 pH 하에서)이다. 고도의 스트린젠트 조건은 특정 프로브에 대한 Tm 점과 동일하도록 선택된다. 때때로, 프로브의 절반 이상이 완전 매칭된 표적 핵산으로부터 해리되는 온도를 규정하기 위해 용어 "Td"가 사용된다. 어떠한 경우에도, Tm 또는 Td를 평가하기 위한 다양한 평가 기술이 이용가능하며, 이는 일반적으로 상기 제시된 티이센의 문헌에 기재되어 있다. 전형적으로, 듀플렉스 중의 G-C 염기쌍은 Tm에 약 3℃을 기여하는 것으로 평가되며, A-T 염기쌍은 약 80 내지 100℃의 이론적 최대값에 이르기까지 약 2℃를 기여하는 것으로 평가된다. 그러나, G-C 스택킹 상호작용, 용매 효과, 요망되는 검정 온도 등이 참작된 Tm 및 Td의 보다 정교한 모델이 이용가능하며 적당하다. 예를 들어, 프로브는 하기 식을 이용하여 약 60℃의 해리 온도 (Td)를 지니도록 설계될 수 있다: Td = (((((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) - 562)#bp)-5 ; 상기 식에서 #GC, #AT 및 #bp는 각각, 프로브를 주형 DNA에 대해 어닐링시키는 데에 포함되는, 구아닌-시토신 염기쌍의 수, 아데닌-티민 염기쌍의 수, 및 전체 염기쌍의 수이다.
완전 매칭된 듀플렉스 및 미스매칭된 듀플렉스 사이의 안정성 차이는, 특히 미스매치가 단지 하나의 염기인 경우, 매우 작을 수 있으며, 이는 0.5도로 작은 두 듀플렉스 사이의 Tm의 차이에 상응한다 (참조: Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19, 1984 및 Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083, 1992). 더욱 중요하게는, 상동성 영역의 길이가 증가함에 따라, 전체 듀플렉스 안정성에 미치는 하나의 염기 미스매치의 효과는 감소하는 것으로 이해된다.
핵산 하이브리드화의 이론 및 실제는 문헌 [S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; 및 Tijssen (1993) "Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes"]에 기재되어 있으며, 예를 들어 문헌 [part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York]은 핵산 하이브리드화에 대한 기초적 지침을 제공한다.
특정 마이크로어레이는 "활성" 성질을 지는데, 즉, 이들 마이크로어레이는 각각의 특정 마이크로로케이션(microlocation)에서 일어나는 모든 양상의 하이브리드화 반응 (또는 임의의 다른 친화성 반응)에 대한 독립적인 전자적 제어를 제공한다. 이들 장치는 전자적 스트린젠시(stringency) 제어 (ESC)라고 일컬어지는 하이브리드화 반응에 영향을 미치기 위한 신규한 메커니즘을 제공한다. 이러한 활성 장치는 각각의 마이크로로케이션에서 "다양한 스트린젠시 조건"을 전자적으로 생성시킬 수 있다. 따라서, 모든 하이브리드화는 동일한 벌크 용액에서 최적으로 수행될 수 있다. 이러한 어레이는 소스노우스키(Sosnowski) 등의 미국 특허 제 6,051,380호에 기재되어 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 백그라운드 시그널은 특이적이지 않은 결합을 감소시키기 위해 하이브리드화 동안 세정제 (예를 들어, C-TAB) 또는 블록킹 시약 (예를 들어, 정자 DNA, cot-1 DNA 등)을 사용함으로써 감소된다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 하이브리드화는 약 0.5mg/ml DNA (예를 들어, 청어(herring) 정자 DNA)의 존재하에서 수행된다. 하이브리드화에서 블록킹 작용제를 사용하는 것은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (참조: Chapter 8 in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)).
본 발명의 방법은, 표적 핵산상에 사용되는 특정 표지에 따라, 검출 단계 전에 결합되지 않은 표지 제거 단계를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 특정 검정 포맷 (예를 들어, "균일 검정 포맷")에 있어서, 검출가능한 시그널은 표적이 프로브에 특이적으로 결합한 경우에만 생성된다. 이와 같이, 이러한 검정 포맷의 경우, 하이브리드화 패턴은 결합되지 않은 표지 제거 단계 없이 검출될 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 사용되는 표지는 표적이 이의 프로브에 특이적으로 결합되든지 아니든지 간에 시그널을 생성시킬 것이다. 이러한 구체예에 있어서, 결합되지 않은 표지된 표적은 지지체 표면으로부터 제거된다. 결합되지 않은 표지된 표적을 제거하는 한 가지 수단은 널리 공지된 세척 기술을 수행하는 것이며, 여기서 결합되지 않은 표지를 제거하는 데에 사용되는 다양한 세척 용액 및 프로토콜은 당업자에게 공지되어 있고 사용될 수 있다. 또한, 결합되지 않은 표지된 표적이 전기영동 수단에 의해 제거될 수 있다.
모든 표적 서열이 동일한 표지를 사용하여 검출되는 경우, 다양한 어레이가 각각의 생리학적 공급원에 대해 사용될 것이다 (여기서, 다양한이란 상이한 시간에서 동일한 어레이를 사용하는 것을 포함할 수 있다). 상기 방법은 다양한 표적 개체군 (검정되는 다양한 생리학적 공급원 각각을 나타냄)에 대해 다양하고 구별되는 표지를 사용함으로써 복합적 분석을 제공하도록 달라질 수 있다. 이러한 복합적 방법에 따르면, 동일한 어레이가 다양한 표적 개체군 각각에 대해 동일한 시간에서 사용된다.
또 다른 구체예에 있어서, 하이브리드화는 전하 결합 소자 (charge-coupled device, CCD) 이미지화 카메라 (Guschin et al., Anal. Biochem. 250:203, 1997)를 사용하여 실시간으로 모니터된다. 광섬유 다발상에서의 어레이의 합성은 용이하고 민감한 판독을 가능하게 한다 (Healy et al., Anal. Biochem. 251:270, 1997). 또 다른 구체예에 있어서, 실시간 하이브리드화 검출은 표면에 결합되는 형광물질만을 여기시키는 소실성 파동 효과를 이용하여 세척없이 마이크로어레이상에서 수행된다 (참조: Stimpson et al., PNAS 92:6379, 1995).
6.3.4 하이브리드화된 핵산의 검출 및 마이크로어레이로부터의 결과 분석
상기 단계들은 어레이 표면상에 표적 핵산의 하이브리드화 패턴을 생성시킨다. 이들 패턴은 다양한 방식으로 가시화되거나 검출될 수 있는데, 특정 검출 방식은 표적 핵산의 특정 표지를 기초로 하여 선택된다. 대표적인 검출 수단은 신틸레이션 카운팅, 자동방사선사진법, 형광 측정, 비색 측정, 발광 측정, 광 산란 등을 포함한다.
한 가지 검출 방법은 애피메트릭스(Affymetrix, Santa Clara, CA)로부터 시판되는 어레이 스캐너, 예를 들어 417TM 어레이어(Arrayer), 418TM 어레이 스캐너 또는 애질런트 진어레이 (Agilent GeneArray)TM 스캐너를 포함한다. 이러한 스캐너는 윈도우즈R 인터페이스 및 사용하기 쉬운 소프트웨어 도구를 지닌 시스템 컴퓨터로부터 제어된다. 출력은 다양한 소프트웨어 응용제품내로 직접 불러질 수 있거나 이들에 의해 직접 읽혀질 수 있는 16-bit.tif 파일이다. 바람직한 스캐닝 장치는, 예를 들어 미국 특허 제 5,143,854호 및 5,424,186호에 기재되어 있다.
형광 표지된 프로브가 사용되는 경우, 전사체 어레이의 각각의 부위에서의 형광 방출은 스캐닝 공초점 레이저 현미경검사에 의해 검출될 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 적합한 여기 라인 (excitation line)을 사용하는 별도의 스캔이 사용되는 두 가지 형광물질 각각에 대해 수행된다. 또한, 두 가지 형광물질에 대해 특이적인 파장에서의 동시 표본 조명을 가능하게 하는 레이저가 사용될 수 있고, 두 가지 형광물질로부터의 방출이 동시에 분석될 수 있다 (참조: Shalon et al., Genome Research 6:639-645, 1996). 바람직한 구체예에 있어서, 어레이는 컴퓨터 제어되는 X-Y 스테이지 및 현미경 대물렌즈를 지닌 레이저 형광 스캐너에 의해 스캐닝된다. 두 가지 형광물질의 순차적 여기는 멀티-라인(multi-line) 혼합 가스 레이저에 의해 달성될 수 있으며, 방출된 광은 파장에 의해 분할되고 두 개의 광증폭기 튜브에 의해 검출된다. 형광 표적 핵산이 사용되는 한 가지 구체예에 있어서, 어레이는 프로브 어레이의 영역들로 하이브리드화된 형광 표지된 표적을 여기시키기 위해 레이저를 사용하여 스캐닝될 수 있으며, 그 후, 어레이의 광범위 스캐닝을 위해 전하 결합 소자 ("CCD")를 사용하여 이미지화될 수 있다. 형광 레이저 스캐닝 장치는, 예를 들어 상기 스케나(Schena) 등의 문헌에 기재되어 있다. 또한, 퍼거슨(Ferguson) 등의 문헌 [Nature Biotech. 14:1681-1684, 1996]에 기재된 광섬유 다발이 mRNA 존재 수준을 모니터하기 위해 사용될 수 있다.
데이터 수집 연산을 수행한 후, 데이터는 전형적으로 데이터 분석 연산에 보고될 것이다. 샘플 분석 연산을 촉진시키기 위해, 장치로부터 판독기에 의해 수득된 데이터는 전형적으로 디지털 컴퓨터를 사용하여 분석될 것이다. 전형적으로, 컴퓨터는 장치로부터 데이터를 접수 및 저장하는 것 뿐만 아니라 수집된 데이터를 분석하고 보고하는 것, 예를 들어 백그라운드의 공제(subtraction), 멀티-컬러 이미지의 디컨볼루션(deconvolution), 허상의 플래깅(flagging) 또는 제거, 대조군이 적절하게 기능하였음을 입증하는 것, 시그널 정상화, 하이브리드화된 표적의 양을 측정하기 위한 형광 데이터의 해석, 백그라운드의 정상화 및 단일 염기 미스매치 하이브리드화 등을 위해 적절히 프로그래밍될 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 시스템은, 예를 들어 인식 손상을 지닌 환자로부터의 샘플의 발현 프로파일 및 대응하는 정상 피검체로부터의 발현 프로파일 사이의 차별적 유전자 발현과 관련된 패턴과 같은 특정 패턴을 검색할 수 있게 하는 검색 기능을 포함한다. 시스템은 바람직하게는 둘 이상의 샘플 사이의 유전자 발현의 패턴을 검색할 수 있게 해준다.
데이터를 분석하기 위한 바람직한 시스템은 유전자 발현 데이터의 가시화, 조작 및 분석을 위한 총괄적이고 유연한 시스템이다. 이러한 시스템은 바람직하게는 발현 데이터를 브라우징하고 네이게이팅하기위한 그래픽 유저 인터페이스를 포함하여, 사용자가 관심있는 유전자를 선택적으로 관찰하고 돋보이도록 할 수 있게 해준다. 또한, 시스템은 바람직하게는 분류 및 검색 기능을 포함하며, 이는 바람직하게는 PC, Mac 또는 Unix 워크스테이션을 이용하는 일반 사용자가 이용할 수 있다. 또한, 바람직하게는 기존의 클러스터링(clustering) 알고리듬 보다 질적으로 더욱 효율적인 클러스터링 알고리듬이 시스템에 포함된다. 이러한 알고리듬의 정확도는 바람직하게는 계통적으로 조정가능하여, 클러스터링의 상세함의 수준이 요망에 따라 체계적으로 다듬어질 수 있다.
유전자 발현 프로파일 데이터, 예를 들어 수행되는 비교의 유형을 분석하기 위한 다양한 알고리듬이 이용가능하다. 특정 구체예에 있어서, 공동 조절되는 유전자를 그룹화하는 것이 바람직하다. 이는 다수의 프로파일의 비교를 가능하게 한다. 이러한 유전자의 그룹을 확인하기 위한 바람직한 구체예는 클러스터링 알고리듬을 포함한다 (클러스터링 알고리듬의 검토를 위해서는, 다음 문헌들을 참조할 수 있다 [Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley; Sneath and Sokai, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman; Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York).
클러스터링 분석은 수 천개의 시간 곡선의 복잡한 패턴을 보다 적은 세트의 대표적 클러스터로 감소키는 것을 보조하는 데에 유용하다. 몇몇 시스템은 서열을 기초로 하여 유전자의 클러스터링 및 관찰을 가능하게 한다. 그 밖의 시스템은 유전자의 그 밖의 특징, 예를 들어 발현 수준 (참조: 미국 특허 제 6,203,987호)을 기초로 하여 클러스터링을 가능하게 한다. 그 밖의 시스템은 시간 곡선의 클로스터링을 가능하게 한다 (참조: 미국 특허 제 6,263,287호). 클러스터링 분석은 hclust 루틴을 사용하여 수행될 수 있다 (참조: 소프트웨어 패키지 S-Plus (MicroSoft, Inc., Cambridge, Mass.)으로부터의 "hclust" 루틴).
일부 특정 구체예에 있어서, 유전자는 미국 특허 제 6,203,987호에 기술된 바와 같이 전사의 공동 변이, 아마도 공동 조절의 정도에 따라 그룹화된다. 공동 변이성 전사체를 지니는 유전자의 그룹은 "진셋(geneset)"라 일컬어진다. 클러스터 분석 또는 그 밖의 통계적 분류 방법이 예를 들어 질병 또는 약물에 의해 야기된 다양한 동요(pertubation)에 반응하는 유전자의 전사의 공동 변이를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 한 가지 특정 구체예에 있어서, 클러스터링 알고리듬은 나타나는 공동 조절의 양에 의해 유전자를 관련시키는 "유사성 트리 (similarity tree)" 또는 "클러스터링 트리"를 구성하기 위해 발현 프로파일에 적용된다. 진셋은 가지 계통에서의 다양한 수준에서 클러스터링 트리를 절단함으로써 클러스터링 트리의 가지상에서 규정된다.
몇몇 구체예에 있어서, 유전자 발현 프로파일은 투영된 유전자 발현 프로파일로 전환된다. 투영된 유전자 발현 프로파일은 진셋 발현 값들의 수집물이다. 전환은 몇몇 구체예에서는 각각의 진셋내에서의 유전자들의 발현의 수준을 평균냄으로써 달성된다. 몇몇 다른 구체예에 있어서, 다른 선형 투영 프로세스가 사용될 수 있다. 투영 연산은 보다 작고 생물학적으로 보다 의미있는 좌표의 세트상에서 프로파일을 나타내는데, 이들을 각각의 세포 구성요소 세트에 대해 평균내고 프로파일의 생물학적 해석을 보조함으로써 측정 오차의 효과를 감소시킨다.
비교될 수 있는 값들은 총체적 발현 수준; 예를 들어 다양한 실험, 동일한 피검체로부터의 다양한 샘플 또는 상이한 피검체로부터의 샘플로부터의 발현 수준의 평균; 및 발현 수준의 비를 포함한다.
6.3.5 마이크로어레이에 대한 데이터 분석 방법
인식 손상의 억제의 부재하에서의 발현 수준, 예를 들어 질병에 특유한 발현 수준 또는 정상 피검체에서의 발현 수준을 참조하여 인식 손상의 억제에 반응하여 상향 조절되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 비교는 바람직하게는 컴퓨터 시스템을 사용하여 수행된다. 한 가지 구체예에 있어서, 하나 이상의 발현 수준은 두 개의 샘플로부터 수득되며, 이러한 발현 수준의 두 가지 세트는 비교를 위해 컴퓨터 시스템내로 도입된다. 바람직한 구체예에 있어서, 하나 이상의 발현 수준 중 하나의 세트가 컴퓨터 시스템내에 이미 존재하는 값과의 비교를 위해 컴퓨터 시스템내로 입력되거나, 컴퓨터 판독 형태로 입력된 후에 컴퓨터 시스템내로 입력된다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 유전자 발현 프로파일 데이터 또는 피검체내에서 인식 손상의 억제에 반응하여 상향 조절되는 하나 이상의 유전자의 발현의 수준에 상응하는 값들의 컴퓨터 판독가능한 형태를 제공한다. 상기 값들은 실험, 예를 들어 마이크로어레이 분석으로부터 수득되는 mRNA 발현 수준일 수 있다. 상기 값은 또한 다수의 조건하에서 다수의 세포에서 발현이 일정한 기준 유전자, 예를 들어 GAPDH에 대해 정상화된 mRNA 수준일 수 있다. 그 밖의 구체예에 있어서, 컴퓨터내의 값들은 다양한 샘플 중의 정상화된 mRNA 수준 또는 정상화되지 않은 mRNA 수준의 비 또는 이들 사이의 차이이다.
컴퓨터 판독 가능한 매체는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 그 이상의 유전자 값을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 컴퓨터 판독 가능한 매체는 하나 이상의 발현 프로파일을 포함한다.
유전자 발현 데이타는 테이블, 예컨대, 엑셀 테이블의 형태일 수 있다. 그러한 데이타는 단독이거나, 예를 들어, 그 밖의 발현 프로파일, 예를 들어, 공중 입수 가능한 데이타베이스를 포함하는 보다 큰 데이타베이스의 일부일 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 형태는 컴퓨터에 내장될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 유전자 발현 프로파일 데이타를 디스플레이하는 컴퓨터를 제공한다.
본 발명은 단일 유전자의 발현 수준이 둘 또는 그 이상의 세포 또는 조직 샘플에서 비교될 수 있는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 많은 유전자의 발현 수준이 비교된다. 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 그 이상의 유전자의 발현 수준. 한가지 구체예에서, 발현 프로파일이 비교된다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 인식 손상의 억제에 대한 반응이 상향 조절된 하나 이상의 유전자의 발현 수준 사이의 유사성을 측정하는 방법을 제공한다. 방법은 바람직하게는 첫번째 샘플에서 인식 손상의 억제에 대한 반응이 상향 조절된하나 이상의 유전자의 발현 수준을 얻고, 이들 값을 컴퓨터로서 (i) 대조 비처리 샘플중의 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 상응하는 값을 포함하는 기록을 포함한 데이타베이스 및 (ii) 컴퓨터에 저장되는 데이타와 비교를 위한 하나 이상의 값중 선택된 값을 수용할 수 있는 프로세서 인스트럭션(processor instructions), 예를 들어, 유저 인터페이스(user interface)를 포함하는 컴퓨터에 입력함을 포함한다. 컴퓨터는 비교 데이타를 다이아그램 또는 챠트 또는 그 밖의 출력 형태로 전환시키는 수단을 추가로 포함할 수 있다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 하나 또는 다수의 유전자에 대한 유전자 발현 데이타를 수용하는 수단; 상기 하나 또는 다수의 유전자로부터 일반적인 참조 프레임까지 유전자 발현 데이터를 비교하는 수단; 및 비교 결과를 표현하는 수단을 포함하는 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 추가로 데이타를 클러스터링하는 수단을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 (i) 다수의 유전자에 대해서 입력 유전자 발현 데이타로서 수용하는 컴퓨터 코드 및 (ii) 다수의 유전자 각각으로부터 일반적인 참조 프레임까지의 유전자 발현 데이타를 비교하는 컴퓨터 코드를 포함하는 유전자 발현 데이타를 분석하는 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명은 또한 (i) 의문의 세포에서 NMD의 억제에 대한 반응이 상향 조절된 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 상응하는 다수의 값을 하나 이상의 참조 세포의 참조 발현 및 세포 타입의 주해를 포함하는 기록을 포함한 데이타베이스와 비교하는 단계, 및 (ii) 발현 수준의 유사성을 기준으로 가장 유사한 의문의 세포를 표시하는 단계를 수행하는 프로그램 명령을 포함한 기계 판독 또는 컴퓨터 판독 매체를 제공한다.
두개의 생물학적 샘플에서의 mRNA의 상대적인 발현 수순, 예를 들어, 존재비가 섭동(perturbation)(상대 존재비 차이) 또는 비섭동(즉, 상대 존재비가 동일하다)으로 기록될 수 있다. 예를 들어, 섭동은 두 RNA 공급원 사이의 발현 수준에서의 약 25% 이상의 인자의 차이(한 공급원으로부터의 RNA는 다른 공급원 보다 한가지 소스에서 25% 이상 많다), 더욱 일반적으로는 약 50%, 더욱 더 빈번하게는 약 2(2 배 존재), 3(3배 존재), 또는 5(5 배 존재)배의 인자까지의 차이일 수 있다. 섭동은 컴퓨터에 의해서 비교 데이타를 계산하고 발현시키는데 사용된다.
바람직하게는, 양성 또는 음성 섭동을 확인하는 것에 추가로, 섭동의 크기를 측정하는 것이 유리하다. 이러한 측정은 상기된 바와 같이 감별 표시(differential labeling)에 사용되는 두 형광발색단의 방출 비를 계산함으로써 수행되거나, 당업자에게는 자명한 유사한 방법에 의해서 수행될 수 있다.
컴퓨터 판독 매체는 추가로, 예를 들어, 소스로부터 얻어지는, 예를 들어, 환자로부터 얻어지는 발현의 수준 또는 발현의 프로파일의 디스크립터(descriptor)에 대한 포인터(pointer)를 포함할 수 있다. 디스크립터는 질환의 단계, 환자에게서 진행중인 치료법, 또는 발현 수준 공급원의 어떠한 다른 설명을 반영한다.
작동시에, 본 발명의 시스템의 환경내에 있는 유전자 발현 데이타를 수용하는 수단, 유전자 발현 데이타를 비교하는 수단, 이를 표현하는 수단, 표정하는 수단, 및 글러스터링하는 수단은 하드웨어와 소프트웨어 또는 하드웨어에서 실행되는 본원에 기재되어 있는 각각의 작용성으로 프로그램화된 컴퓨터; 컴퓨터 프로그램에 의해서 명령되는 본원에서 특이적으로 확인된 작업을 수행하는 프로그램화된 컴퓨터의 론리회로 또는 그 밖의 성분; 또는 본원에 기재된 특정의 양상으로 컴퓨터를 작동시키는 컴퓨터 프로그램을 나타내는 실행 가능 명령으로 엔코팅된 컴퓨터 메모리를 포함할 수 있다.
당업자라면 본 발명의 시스템 및 방법은 MS-DOS 또는 마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows)를 구동하는 IBM 호환 퍼스널 컴퓨터 포함한 다양한 시스템에 적용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 추가로, 퍼스널 컴퓨터는 그러한 시스템과 일반적으로 연관된 모든 하드웨어 및 소프트웨어 성분을 지녀서 사용자가 다양한 컴퓨터 언어로 가능한 메모리, 네트워크 접속성, 인쇄 가능성 및 프로크래밍 가능성을 갖출 수 있다. 적절한 컴퓨터 시스템에 있어서, 사용자는 발현 프로파일 데이타를 컴퓨터 시스템에 로딩시킬 수 있다(미국특허 제6,203,987호). 진세트(geneset) 프로파일 정의가 저장 매체 또는 원격 검퓨터, 바람직하게는 다이나믹 진세트 데이타베이스 시스템(dynamic geneset database system)으로부터 네트워크를 통해서 메모리에 로딩된다. 이어서, 사용자는 발현 프로파일을 프로젝팅된 발현 프로파일로 전환시키는 단계를 수행하는 프로젝션(projection) 소프트웨어를 실행시킨다. 프로젝팅된 발현 프로파일이 이어서 디스플레이된다.
또 다른 예시적인 실시에서, 사용자는 먼저 프로젝팅된 프로파일을 메모리내로 읽는다. 사용자는 이어서 참조 프로파일을 메모리내로 로딩시킨다. 이어서, 사용자는 프로파일을 객관적으로 비교하는 단계를 수행하는 비교 소프트웨어를 실행시킨다.
7. 인식 기능을 촉진하거나 보존하는 화합물에 대한 스크리닝
본 발명에 따르면, 인식 기능과 연관된 유전자 발현을 조절하는 작용제가 본 발명의 시험관내 또는 생체내 스크리닝 방법을 이용함으로써 동정될 수 있다.
본 발명은 포유동물, 예를 들어, 래트 및 사람에서의 인식 기능을 촉진하거나 보존하는데 유용한 작용제를 동정하는 방법을 제공한다. 한가지 특징으로, 스크리닝 방법은 글루타메이트 수송 단백질, 예를 들어, EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4 또는 EAAT5를 엔코딩하는 유전자의 발현, 또는 그러한 유전자에 의해서 엔코딩된 글루타메이트 수송 단백질의 활성을 조절하는 작용제를 동정하는 검정을 수행함을 포함한다. 편리를 위해서, 이하 "EAAT"에 대한 참조는 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4 및 EAAT5 각각, 모든 유전자/단백질을 포함하는 군, 및 모든 이들의 서브조합(예, EAAT1과 EAAT2)를 나타내는 것이다. 또한, 스크리닝 방법은 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 발현을 조절하는 작용제를 동정하는 검정을 수행함을 포함한다.
많은 상이한 스크리닝 원안이 사용되어 포유동물 세포(예, 래트, 비사람 영장류 세포 또는 사람 세포)에서의 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 발현 수준을 조절하는 작용제를 동정할 수 있다. 일반적으로, 스크리닝 방법은, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, EAAT 폴리펩티드에 결합시키거나, 억제제가 EAAT 폴리펩티드에 결합되지 않게 하거나, EAAT 유전자의 발현을 증가시킴으로써 EAAT의 활성 또는 수준을 변화시키는 작용제를 동정하기 위해서 다수의 작용제("시험 작용제")를 스크리닝함을 포함한다. 또한, 스크리닝 방법은, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩티드에 결합시키거나, 억제제가 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩티드에 결합되지 않게 하거나, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자의 발현을 증가시킴으로써 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제의 활성 또는 수준을 변화시키는 작용제를 동정하기 위해서 다수의 작용제를 스크리닝함을 포함한다.
"시험 작용제"는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 작은 유기 분자, 공지된 약제, 폴리펩티드; 탄수화물, 예컨대, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드; 폴리누클레오티드; 지질 또는 인지질; 지방산; 스테로이드; 또는 아미노산 유사체를 포함한 다양한 일반적인 형태의 화합물을 포함한다. 시험 작용제는 라이브러리, 예컨대, 천연 생성물 라이브러리 및 조합성 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 많은 상이한 형태의 라이브러리가 시판중에 있으며, 그러한 라이브러리를 제조하는 방법이, 예를 들어, PCT 공보 WO 93/06121호, WO 95/12608호, WO 95/35503호, WO 94/08051호 및 WO 95/30642호를 포함한 많은 문헌에 기재되어 있다. 또한, 단기간에 수천 화합물을 스크리닝하는 자동화 검정 방법이 공지되어 있다.
특정의 스크리닝 방법은 세포에서의 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 화합물을 스크리닝함을 포함한다. 그러한 방법은 시험 화합물이 EAAT 유전자 또는 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포와 접촉되는 세포 기재 검정을 수행하고, 이어서 EAAT 발현(예, EAAT RNA의 수준) 또는 활성에서의 변화를 검출함을 포함할 수 있다. 또 다른 방법은 시험 화합물이 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 또는 단백질을 발현하는 하나 이상의 세포와 접촉되는 세포 기재 검정을 수행하고, 이어서 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 발현(예, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 RNA의 수준) 또는 활성에서의 변화를 검출함을 포함할 수 있다. 따라서, 한가지 구체예에서, 방법은 세포를 시험 작용제와 접촉시키고, 유전자의 발현 수준이 시험 작용제의 존재하에 변화되는지를 특정함을 포함하며, 상기 발현에서의 변화(증가)는 시험 작용제가 인식 기능을 촉진하거나 보존하기에 유용함을 나타낸다. 세포는 시험관내, 생체내 도는 생체외 접촉될 수 있다. 전형적으로는 발현은 시험 화합물의 부재하의 발현에 비해서 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 50% 이상, 약 75% 이상 또는 약 100% 이상까지 증가한다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 포유동물 신경 세포에 의해서 발현되는 글루타메이트 수송체 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자를 발현하는 세포를 제공하고, 세포를 시험 작용제와 접촉시키고, 글루타메이트 수송체(예, 하나 이상의 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4 및 EAAT5) 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AT)의 활성 또는 발현 수준이 시험 화합물의 존재하에 증가하는 가를 측정함으로써 인식 손상의 감쇄에 대한 유용성을 측정하도록 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 증가는 시험 작용제가 인식 기능을 촉진시키거나 보존하기에 유용함을 나타낸다. 발현은 EAAT 또는 AT mRNA의 비율 또는 존재비에서의 변화를 검출함을 포함하는 공지된 방법에 의해서 검정될 수 있다. 글루타메이트 수송 단백질 활성은 세포로의 3H-글루타메이트의 흡수를 측정함을 포함한 공지된 방법으로 검정될 수 있다[문헌: Lin et al., Nature 410: 84-88, 2001]. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 활성은 NADH의 존재하에 말레이트 데히드로게나제와의 결합반응을 포함한 공지된 반응에 의해서 검정될 수 있다[문헌: Karmen, J Clin Invest 34:131, 1955; Amador and Wacker, Clin Chem 8:343, 1962].
일반적으로는, 측정은 시험 화합물과 접촉되지 않은 유사한 세포 또는 세포들(즉, 대조 세포)에 비한 시험 세포에서의 활성 또는 발현을 비교함을 포함한다. 관련된 구체예에서, 시험 화합물은 다세포 유기체(예, 동물)에 투여된다. EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 성분은 세포 또는 다세포 생물체에 완전히 내생성이거나, 하나 이상의 재조합 발현된 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질을 포함하는 재조합 세포 또는 유전자이식 생물체일 수 있다. 재조합 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질의 발현은 공개된 유전자 및 단백질 서열 및 정례적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다 (참조: Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2002년 동안 보충됨)).
검정은 다양한 구체예에서 배양된 세포 (예를 들어, 1차 배양물 중의 세포 또는 확립된 세포주) 및 생체내 세포를 포함하는 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자를 발현시키는 임의의 세포 유형을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적 세포로는 뉴런, 아교세포, EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 발현이 재조합체 발현에 의해 유도되는 혼합된 뉴런 배양물 또는 세포가 있다. 이러한 세포 (예를 들어, 1차 배양물)는 태아 해마로부터 수득될 수 있다. 많은 다른 적합한 세포 또는 세포주를 당업자는 알 수 있을 것이다.
세포 또는 시험관내 시스템내에서의 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 발현에 대한 작용제의 효과는 전형적으로 시험 작용제의 부재하에서의 세포 또는 시험관내 시스템에 의한 발현의 수준인 기선 값과 비교될 수 있다. 또한, 발현 수준은 네거티브 대조군으로서의 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 발현시키지 않는 세포에 대해 측정될 수 있다. 이러한 세포는 일반적으로 시험 세포와 유전적으로 실질적으로 동일하다.
다른 세포-기초 검정은 반드시 EAAT 및/또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 발현하지는 않는 세포를 사용하여 수행되는 리포터 검정이다. 이들 검정 중 몇몇은 검출가능한 생성물을 엔코딩하는 리포터 유전자에 작동가능하게 결합된 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 프로모터를 포함하는 이종성 핵산 구성물을 사용하여 수행된다. EAA 유전자 프로모터는 대부분의 경우에 전사 개시 부위의 약 300 내지 1000bp 업스트림 (또는 5')에 있는 영역내에 위치하며, 예를 들어 수(Su) 등의 문헌 [PNAS 100:1955-1960, 2003]에 기재되어 있다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 프로모터는 대부분의 경우에 전사 개시 부위의 약 300 내지 1000bp 업스트림 (또는 5')에 있는 영역내에 위치하며, 예를 들어 오바루(Obaru) 등의 문헌 [J Mol Biol. 200:13-22, 1988]에 기재되어 있다. 특정한 EAAT 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자 프로모터는 젠뱅크 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 학술 문헌에 기재되어 있다. 다수의 다양한 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 예시적 리포터로는 녹색 형광 단백질, J-글루쿠로니다아제, 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 루시퍼라아제, J-갈락토시다아제, 알칼리 포스파타아제 등이 있다. 이들 검정에서, 리포터 구성물을 함유하는 세포가 시험 화합물과 접촉된다. 프로모터가 결합하게 함으로써 프로모터를 활성화시키거나 프로모터를 활성화시키는 분자를 생성시키는 연쇄반응(cascade)을 유발시키는 시험 화합물은 검출가능한 리포터의 발현을 초래한다. 다수의 다양한 유형의 세포가 리포터 검정에서 사용될 수 있다 (예를 들어, 효모, COS, CHO, HepG2 및 HeLa 세포주와 같은 진핵 세포).
또한, EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질의 활성을 증가시키는 작용제의 확인은 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질에 결합할 수 있는 화합물에 대해 스크리닝하는 것을 포함할 수 있는데, 이는 이렇게 확인된 화합물들 중 일부 이상이 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 조절물질인 것으로 여겨지기 때문이다. 이러한 스크린 동안 확인된 선도(lead) 화합물은 보다 활성인 유사체의 합성을 위한 기초로서 기능할 수 있다. 따라서, 한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 (a) EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 유전자에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, (b) 상기 폴리펩티드가 시험 화합물에 결합하는 지의 여부를 결정함으로써 인식 손상을 경감시키는 데에 있어서의 유용성을 결정하기 위해 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 결합은 시험 작용제가 인식 손상을 경감시키는 데에 유용함을 나타내준다. 결합 검정은 통상적으로 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩티드를 하나 이상의 시험 화합물과 접촉시키고, 단백질 및 시험 화합물이 결합 복합체를 형성하도록 충분한 시간 동안 유지시키는 것을 포함한다. 시험 화합물이 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩티드에 직접 결합하는 능력을 측정하는 것은, 예를 들어 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 대한 화합물의 결합이 복합체내의 표지된 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 폴리펩티드를 검출함으로써 측정될 수 있도록 화합물을 방사성동위원소 또는 효소 표지에 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 형성된 임의의 결합 복합체는 다수의 확립된 분석 기술 중 어느 하나를 사용하여 검출될 수 있다. 단백질 결합 검정은 공동-침전, 비변성 SDS-폴리아크릴아미드겔상에서의 공동-이동, 웨스턴 블롯상에서의 공동-이동을 측정하는 방법을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다 (참조: E.C. Hulme, 1992, "Receptor-Ligand Interactions" in A Practical Approach/The Practical Approach Series (Series Eds D. Rickwood and BD Hames) IRL Press at Oxford University Press). 이러한 검정에서 사용되는 EAAT (또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제) 폴리펩티드는 정제될 수 있거나 재조합될 수 있다. 상기 주지된 바와 같이, EAAT (또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제) 단백질의 재조합적 발현 및 정제는 정례적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질은 본 명세서에서 "결합 파트너"라 일컬어지는 하나 이상의 세포성 및 세포외 분자 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 호르몬, 보조인자 및 핵산이 있지만 이들에 제한되지 않음)와 생체내에서 상호작용할 수 있다. EAAT의 천연 생체내 결합 파트너를 확인하기 위한 방법, 예를 들어 2-하이브리드 및 3-하이브리드 검정은 공지되어 있다 (참조: 미국 특허 제 5,283,317호; Zervos et al, 1993, Cell 72:223-232; Madura et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al, 1993, Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al, 1993 Oncogene 8:1693-1696; Brent WO94/10300). 이러한 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 결합 파트너는 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 또는 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜퍼라아제 단백질 매개된 시그널링 경로의 다운스트림 엘리먼트에 의한 시그널의 전파에 관여할 수 있거나, EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질의 억제제인 것으로 발견될 수 있다. 당 분야에 공지된 검정은 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 및 이의 결합 파트너 사이의 상호작용을 조절하는 (예를 들어, 포지티브하게 또는 네거티브하게 영향을 주는) 화합물을 확인하기 위해 본 발명을 사용함으로써 고안될 수 있다. 전형적으로, EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 및 이의 결합 파트너 사이의 상호작용을 간섭하는 화합물을 위한 검정은 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 이의 결합 파트너를 함유하는 반응 혼합물을, 두 개의 생성물이 상호작용하고 결합하여 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서 이를 위해 충분한 시간 동안 준비시키는 것을 포함한다. 억제 활성에 대해 작용제를 시험하기 위해, 반응 혼합물은 시험 화합물의 존재 및 부재하에서 준비된다. 또한, 본 발명의 범위내에는 추가의 샘플 조작없이 균일 또는 불균일 검정 시스템에서 EAAT 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 단백질 및 이의 천연 결합 파트너 및/또는 시험 화합물 사이의 상호작용을 직접 검출하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 형광 에너지 전달 기술이 이용될 수 있다 (참조: 라코윅츠(Lakowicz) 등의 미국 특허 제 5,631,169호; 스타브리아노폴스(Stavrianopoulos) 등의 미국 특허 제 4,868,103호).
한 가지 양태에 있어서, 상기 기술된 검정(들)에 의해 확인된 작용제들은 이들의 인식 촉진 및 보존 활성을 측정하기 위해 실험 동물에 투여될 수 있다 (하기 실시예 참조).
한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 시험 화합물을 포유동물에 투여하고, 상기 시험 화합물의 투여 후의 포유동물의 신경 조직에서의 하나 이상의 EAAT 또는 AT 유전자(들)의 발현 수준을 측정하고, 유전자(들)의 발현 수준을 시험 화합물이 투여되지 않은 포유동물의 신경 조직에서의 기준 발현 수준과 비교하고, 유전자의 발현 수준이 상응하는 기준 수준과 차이가 있는 지의 여부를 결정함으로써, 포유동물의 인식 기능을 촉진시키는 데에 있어서의 유용성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법을 특징으로 하며, 여기서 차이가 있다는 것은 시험 화합물이 인식 기능을 촉진시키기 위한 후보 치료제임을 나타낸다. 또한, 본 발명의 방법은 유전자의 발현 수준을 세프트리악손 또는 발프로산이 투여된 포유동물의 신경 조직에서의 기준 발현 수준과 비교하는 추가 단계를 포함한다. 한 가지 구체예에 있어서, 포유동물은 래트, 예를 들어 노령의 래트이다.
8. 치료 방법 및 조성물
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 논의된 치료 효과 중 어느 하나를 위해 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제 또는 멸균 조성물을 투여하는 것에 관한 것이다. 이러한 약제 조성물은 노화 동안 인식 기능의 보존 또는 촉진과 관련된 유전자의 발현을 유익하게 조절하는 분자, 예를 들어 소분자를 함유할 수 있다.
본 발명자들은 시냅스 틈새 및 시냅스외 공간을 포함하는 뇌내의 뉴런 및 아교세포를 둘러싸는 세포외 공간에서의 L-글루타메이트 수준의 감소가 노화 동안 인식 기능의 보존 또는 촉진과 상관있다는 것을 의외로 발견하였다. 한 가지 양태에 있어서, 본 발명은 뇌세포에 의한 글루타메이트 수송 단백질의 발현을 증가시킴으로써 포유동물에서의 인식 기능을 보존 또는 촉진 (예를 들어, 노화와 관련된 인식 손상을 치료)하는 방법을 제공한다. 관련된 양태에 있어서, 본 발명은 뇌세포에서 발현되는 글루타메이트 수송 단백질의 활성을 증가시킴으로써 포유동물의 노화와 관련된 인식 손상을 감소시키는 방법을 제공한다.
한 가지 양태에 있어서, 글루타메이트 수송 단백질의 발현 또는 활성은 포유동물에게 소분자를 투여함으로써 증가된다. 예시적인 소분자는 세팔로스포린 및 이의 유사체 또는 유도체, 발프로산 및 이의 유사체 또는 유도체, MS-153 및 이의 유사체 또는 유도체; 메타보트로픽(metabotropic) 글루타메이트 수용체의 효능제 (mGluR's; 상기 아로니카(Aronica) 등의 문헌 참조)를 포함한다. 소분자는 수송 단백질의 발현 또는 활성을 직접적으로 (예를 들어, 수송 단백질-엔코딩 유전자의 프로모터와 상호작용하거나 단백질 산물 자체와 상호작용함으로써) 또는 간접적으로 (수송 단백질의 발현 또는 활성을 자극하는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키거나 수송 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단백질 및 PACAP ("뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성화제 폴리펩티드")의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써) 증가시킬 수 있다.
글루타메이트 전송 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있는 다른 예시 화합물은 리도카인(Do et al., Anesth Analog. 2002 95:1263-8 "The effects of lidocaine on the activity of glutamate transporter EAAT3: the role of protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase") 및 키나아제 저해제(예를 들어, Conradt, J Neurochem. 1997 68:1244-51 "Inhibition of the high-affinity brain glutamate transporter GLAST-1 via direct phosphorylation")를 포함한다.
예시 및 비한정에 대하여, 예시적인 치료 화합물은 다음 섹션에서 보다 상세하게 설명된다.
8.1 예시적인 치료 조성물
노화 과정중 인지 기능을 촉진하거나 보존하는 것과 연관된 유전자(예를 들어, EAAT 유전자)의 발현을 유익하게 조절하는 소분자의 예는 하기 화학식(I)의 세팔로스포린과 관련된 화합물을 포함한다:
상기 식에서,
L은 O 또는 S이고;
R은 H, C1-10알콕시, 아릴, 아르알킬, -OCH2CO2H이고;
R1은 X가 OH, NR2, SH, O-알칼리 메탈, 또는 -OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2이고, n이 0 내지 6를 포함하는 정수인 -(CH2)n-C(O)X이며;
R2는 R3가 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)NR2, 아릴, 아르알킬, 또는 A이고; W가 O, S, 또는 NR4이고; a가 1 내지 6을 포함하는 정수인(R3가 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)NR2, 아릴, 아르알킬이거나, R3 및 R4가 함께 치환되지 않거나 치환된 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있음) H, C1-10알킬, C2-8알케닐 또는 -(CH2)a-W-R3이고;
선 은 단일 결합 또는 이중 결합이고
R5는 R1, H, SO3H, 아릴, C1-10알킬, 아르알킬이거나; R5는 선 이 이중 결합인 경우에 =CHCH2CO2H 및 =NR로 구성된 군으로부터 선택되고;
m은 0 또는 1이고;
A는 하기 화학식(Ia)의 아릴 또는 헤테로아릴이고;
상기 식에서, 각 기호에 대하여 독립적으로:
J는 O, S, R6이 전자쌍, H, C1-10알킬, C1-10알콕시, 아릴, 또는 -NR2인 NR6 또는 CR6이고;
y는 1 또는 2이거나;
A는 하기 화학식(Ib) 또는 (Ic)의 헤테로사이클로알킬이며;
상기 식에서, 각 기호에 대하여 독립적으로:
J는 O, S, 또는 NR이고
X는 O 또는 H2이다.
화학식(I)으로 설명된 특정 화합물류는 광범위한 스펙트럼 세팔로스포린 항생제, (6R, 7R)-7-[2-(2-아미노-4-티아조릴)글리옥실아미도]-8-옥소-3-[[(1,2,5,6-테트라하이드로-2-메틸-5,6-다이옥소-아즈-트리아진-3-일)티오]메틸]-5-티아-1-아자바이사이클로[4.2.0]옥트-2-엔-2-카르복시알산, 72-(Z)-(O-메틸옥심), 다이소듐 염, 세스콰터하이드레이트인 "세프트리악손"을 포함한다. 세프트리악손은 로세핀TM의 상품명하에 로치에서 시판된다. 화학식의 화합물을 제조하는 방법을 예를 들어, 미국 특허 제 5,574,155호; 제 5,739,346호; 제 5,856,502호; 제 5,869,649호; 제 5,945,414호; 제 5,945,532호 및 제 6,090,801호에서 발견할 수 있다. 세프트리악손의 유도체는 호기성 그람 음성 로드를 사멸시킬 수 있는 제 3세대 세팔로스포린중 임의 것을 포함한다. 제 3세대 세팔로스포린의 예는 세프설로딘, 세포탁심, 세프티족심, 세프트리악손, 세포페라존, 목살락탐 및 세프타지딤이다.
노화 과정중 인지 기능을 촉진하거나 보존하는 것과 연관된 유전자(예를 들어, EAAT 유전자)의 발현을 유익하게 조절하는 소분자의 예는 하기 화학식(II)의 발프로산과 관련된 화합물을 포함한다:
상기 식에서, 각 기호에 대하여 독립적으로:
X는 -OH, C1-10알콕시, -O-알칼리 메탈, -N(R1)2, -SH, 또는 -S-C1-10알킬이고;
R은 직쇄 또는 분지형 C1-30알킬이고;
R1은 H, C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 아릴, 또는 아르알킬이며, 다만, R은 하나 이상의 -OH, C1-10알콕시, -N(R1)2, -SH, -S-C1-10알킬 또는 아릴이다.
화학식(II)으로 설명된 특정 화합물 류는 γ-아미노부티르산(GABA)의 증가된 뇌 농도와 관련될 수 있는 2-프로필펜타노에이트 항경련제인 "발프로산"을 포함한다. 발프로산의 다른 명칭 및 설명을 또한 데파코트TM, 발프로에이트TM, 발리리스TM 및 소듐 발프로에이트와 같이, 본원에서 예시하고 있다. 화학식의 화합물을 제조하는 방법을 예를 들어, 미국 특허 제 4,558,070호; 제 4,595,695호; 제 4,654,370호; 제 4,895,873호;제 4,913,906호; 제 5,017,613호; 제 5,019,398호; 제 5,049,586호; 제 5,162,573호; 제 5,440,023호; 제 5,856,569호; 제 6,131,106호; 제 6,610,326호에서 알 수 있다.
노화 과정중 인지 기능을 촉진하거나 보존하는 것과 연관된 유전자(예를 들어, EAAT 유전자)의 발현을 유익하게 조절하는 소분자의 예는 하기 화학식(III)의 (R)-(-)-5-메틸-1-니코틴오일-2-피라졸린과 관련된 화합물을 포함한다:
상기 식에서, 각 기호에 대하여 독립적으로:
R은 H, C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 아릴, 또는 아르알킬이고;
R1은 H, C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 아릴, 또는 아르알킬이고;
R2는 N, O, 또는 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로아릴 고리이고;
L은 O,S, 또는 NR이고;
X는 CR2, O, 또는 S이다.
화학식(III)의 특정 화합물은 (R)-(-)-5-메틸-1-니코틴오일-2-피라졸린(MS-153)을 포함한다.
또한 화학식(I), (II) 및 (III)의 화합물의 약제학적으로 허용되는 부가 염 및 복합체를 본 발명의 방법으로 포함한다. 이 경우에, 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 가질 수 있고, 특정하지 않는다면, 본 발명은 각 유일한 라세미 화합물을 포함할뿐만 아니라, 각 유일한 비라세미 화합물을 포함한다. 이 경우에, 화합물은 비포화 탄소-탄소 이중 결합을 가지고, 시스(Z) 및 트랜스(E) 이성질체 모두가 본 발명의 범위 내에 있다. 이 경우에, 저해제는 호변이성 형태, 예를 들어 및 와 같은 케노-에놀 호변 이성체로 존재할 수 있고, 각 호변이성형를 평형으로 존재하는지 R'로 적당한 치환으로 형성된 형태로 폐쇄되는지, 본 발명 내에서 포함되는 것으로 고려한다. 임의의 기호에서 치환체의 의미는 어떤 다른 기호이건 그 의미와 독립적이거나 다른 치환체의 의미이다.
또한 본 발명의 방법에서 화학식(I), (II) 및 (III)의 화합물의 프로드러그를 포함한다.
본 발명에서 사용된 약제학적 조성물은 이에 한정하지는 않지만, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피, 피하, 복강내, 비내, 소화관내, 국소적, 설하, 또는 직장 수단을 포함하는 임의의 경로로 투여할 수 있다.
조성물은 단독, 또는 이에 한정하지는 않지만 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하는 살균, 생리적합성 약제학적 담체로 투여될 수 있는 안정화 화합물과 같은 하나 이상의 다른 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 조성물은 환자에게 단독 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 함유된 특정 화합물은 특정 기하 또는 입체이성질체로 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 중합체는 또한 광학적으로 활성이 있을 수 있다. 본 발명은 본 발명의 범위내에 있는 시스- 및 트랜스- 이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 이의 라세미 혼합체 및 이의 다른 혼합체를 포함하는 모든 화합물을 고려한다. 추가 비대칭 탄소 원자는 알킬기와 같은 치환체로 존재할 수 있다. 모든 상기 이성질체뿐만 아니라, 이의 혼합체를 본 발명에 포함하고자 한다.
예를 들어, 본 발명의 화합물의 특정 거울상 이성질체가 요망되는 경우, 생성된 부분입체이성질체 혼합물이 분리되고 보조기가 분해되어 순수하게 요망되는 거울상이성질체를 제공하는 비대칭 합성에 의하여 또는 키랄 보조체로 유도되어 제조할 수 있다. 대안적으로, 분자가 아미노와 같은 염기성 작용기 또는 카르복실기와 같은 산성 작용기를 함유하는 경우에, 부분입체이성질체 염을 적당한 광학 활성 산 또는 염기로 형성시키고, 당해 분야에서 공지된 분별 결정화 또는 크로마토그래피 수단으로 형성시킨 부분입체이성질체를 분리시켜서 순수한 거울상이성질체의 순차적으로 회수한다.
본 발명의 목적을 위하여, 화학 원소를 표지내에 Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87, CAS 버젼, 원소의 주기율표에 따라서 확인하였다. 또한 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "탄화수소"는 하나 이상의 수소 및 한개의 탄소 원자를 가지는 모든 허용되는 화합물을 포함하는 것을 고려하였다. 광범위한 측면에서, 허용되는 탄화수소는 치환될 수 있거나 치환되지 않은 비고리형 및 고리형, 분지형 및 비분지형, 카보사이클릭 및 헤테로사이클릭, 방향족 및 비방향족 유기 화합물을 포함한다.
8.2 치료 조성물
본원에서 설명된 조성물의 고려된 동등물은 치환체 또는 성분의 하나 이상이 단순하게 변화된, 다른 방법으로 조성물과 상응하고 조성물의 동일한 일반 특성을 가지며, 관심 조성물의 특징에 불리하게 영향을 미치지 않는 조성물을 포함한다.
활성 성분, 예를 들어, 하나 이상의 치료제에 추가하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 사용될 수 있는 제조물로 활성 화합물을 가공하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합하게 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 제형 및 투여 기술에 관한 보다 세부적인 사항은 레밍톤스 파마슈티컬 사이언스(Maack Publishing Co., Easton, Pa)의 최근판에서 찾을 수 있다.
경구 투여에 대한 약제학적 조성물을 경구 투여에 적합한 용량으로 당해 분야에서 공지된 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 제형화할 수 있다. 상기 담체는 약제학적 조성물을 환자의 소화를 위하여 정제, 환제, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화시킬 수 있다.
경구 용도 약제학적 제조물은 정제 또는 드라제 중심물을 수득하기 위하여 활성 화합물을 고체 부형제와 병용시키거나 과립의 생성된 혼합물의 가공을 통하여 수득할 수 있다. 적합한 보조제를 요망되는 경우에 첨가할 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충진재, 예를 들어 젖당, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로오스, 예를 들어 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 또는 소듐 카복시메틸셀룰로오스; 아라빅 및 트라카캔트를 포함하는 검; 및 단백질 예를 들어, 젤라틴 및 콜라겐을 포함한다. 요망되는 경우, 분해제 또는 용해제, 예를 들어, 가교 결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천 및 알긴산 또는 소듐 알지네이트와 같은 이의 염을 첨가할 수 있다.
드라제 중심을 적합한 코팅, 예를 들어 검 아라빅, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 티타늄 다이옥사이드를 함유할 수 있는 농축 당 용액, 라커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물과 결합시켜서 사용할 수 있다. 염료 또는 색소를 생성물 확인을 위하여 또는 활성 화합물의 양, 즉 용량을 특정하기 위하여 정제 또는 드라제 코팅에 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약제학적 제조물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 캡슐 뿐만아니라, 젤라틴으로 제조된 봉인된 연질 캡슐 및 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 젖당 또는 전분과 같은 충전재 또는 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및 선택적으로 안정화제와 혼합한 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물을 안정화제를 사용하거나 사용하지 않고, 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜중에서 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 제형을 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충액 예를 들어 한크스 용액, 링거스 용액, 또는 생리학적 완충 염수로 제형화시킬 수 있다. 수성 주입 현탁물은 현탁물의 점성을 증가시키는 물질, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 또한 활성 화합물의 현탁물을 적당한 오일 주입 현탁물로서 제조할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반체는 지방유, 예를 들어 참기름, 또는 에틸 올리에이트, 트리글리세라이드, 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 비지질 다양이온성 아미노 중합체를 또한 전달을 위해 사용할 수 있다. 선택적으로, 현탁물을 또한 적합한 안정화제 또는 화합물의 용해성을 증가시키는 제제를 함유할 수 있고 고농축 용액의 제조를 허용하게 할 수 있다.
국소 또는 비내 투여를 위하여, 침투될 특정 경계에 적당한 침투물을 제형화하여 사용한다. 상기 침투물은 일반적으로 당해 분야에서 공지되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에서 공지된 방법으로, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 드라제 제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 포괄화 또는 동결건조 공정의 방법으로 제조할 수 있다.
약제학적 조성물을 염으로 제공할 수 있고, 이에 한정되지는 않지만 염산, 황산, 아세트산, 젖산, 타르타르산, 말산 및 숙신산를 포함하는 많은 산으로 형성시킬 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태중 보다 수성 또는 다른 양성자성 용매중에서 보다 용해성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제조물은 다음의 일부 또는 전부를 함유할 수 있는 동결건조된 분말일 수 있다: 사용하기 전에 완충액과 합쳐진 4.5 내지 5.5 pH 범위에서 1mM 내지 50mM 히스티딘, 0.1% 내지 2% 수크로오스 및 2% 내지 7% 만니톨.
약제학적 조성물이 제조된 후에, 이 조성물을 적당한 용기에 놓고 지시된 조건의 치료를 위하여 표지할 수 있다. 세프트리악손의 투여를 위하여, 예를 들어, 상기 표지는 양, 빈도 및 투여 방법을 포함할 것이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 의도하는 목적을 달성하기 위하여 활성 성분이 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 당해 분야에서 당업자의 능력내이다.
어떤 화합물에 대하여는 치료 유효량이 예를 들어, 아로니카등의 방법에 따른 세포 배양 검정법, 스프라 또는 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 돼지와 같은 동물 모델에서 초기에 측정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적당한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 동물 모델은 본원에서 설명된 행동으로 특징이 규명된 래트를 사용한다. 상기 정보는 인간에서의 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는데 사용할 수 있다.
치료 유효량은 활성 성분, 예를 들어 증상 또는 질병을 개선하는 세프트리악손, 세프트리악손 유사체, 스프트리악손 유도체, 발프로산 , 발프로산 유사체, 발프로산 유도체, MS-153, MS-153 유사체 또는 MS-153 유도체의 양이다. 치료 효능 및 독성은 예를 들어, ED50(군락의 50%에서 치료 유효 용량) 또는 LD50(군락의 50%의 치사 용량) 통계치를 측정하여 세포 배양에서 표준 약제학적 방법 또는 실험 동물을 사용하여 결정할 수 있다. 치료 효과 대 독성 효과의 용량비는 ED50/LD50로 표현될 수 있는 치료 지표이다. 큰 치료 지표치를 보이는 약제학적 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간용 용량의 범위를 제형화하는데 사용된다. 상기 조성물을 함유하는 용량은 바람직하게는 거의 독성을 가지지 않거나 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내이다. 용량은 사용된 용량형, 환자의 감수성, 및 투여 경로에 따라서 상기 범위내에서 다양하다.
정확한 용량을 치료에 필요한 피검체와 관련된 요소의 관점에서 실시자가 결정할 것이다. 용량 및 투여를 활성 부분의 충분한 수준을 공급하기 위하여 또는 요망되는 효과를 유지하기 위하여 조정한다. 고려될 수 있는 요소는 인지 상해의 정도, 피검체의 종합 건강, 연령, 체중 및 피검체의 성별, 투여 시기 및 빈도, 약물 병용, 반응 감수성 및 치료 반응을 포함한다. 장기 작용 약제학적 조성물은 반감기 및 특정 제형의 제거율에 따라서 3일 내지 4일에 1회, 일주일에 1회 또는 2주일에 1회 투여할 수 있다.
정상 용량은 투여 경로에 따라서, 약 0.1㎍ 내지 100,000㎍, 약 1 그램의 총 용량이 될 때까지 다양할 수 있다. 특정 용량 및 전달 방법에 관한 지침을 문헌에서 제공하고 일반적으로 당해 분야에 실시자에게 가용될 수 있다.
중추 신경계 표적에 관한 치료 효과를 위하여, EAAT1, 2, 3, 4, 또는 5와 같이, 본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 쉽게 말초로 투여된 경우에 혈액-뇌 경계를 투과해야만 한다. 그러나, 혈액-뇌 경계를 투과할 수 없는 화합물은 예를 들어 심실내 경로를 통하여 중추 신경계로 직접 효과적으로 투여할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 기술적인 것이고 예를 들어 본 발명의 조성물에 함유된 것을 포함하는 화합물의 상대적으로 비독성, 무기 및 유기산 부가 염을 말한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 기술적인 것이고, 한 기관 또는 신체 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체의 부분으로 이의 피검체의 조성물 또는 성분을 운반하거나 전송하는 것과 관련된 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체, 예를 들어 액체 또는 고체 충전재, 희석물, 부형체 용매 또는 캡슐화된 물질을 말한다. 각 담체는 피검체 조성물 및 이의 성분에 적합하고 환자에 유해하지 않는 의미에서 "허용되어야" 한다. 약제학적으로 허용되는 담체로 이용될 수 있는 물질의 일부 예는 (1) 젖당, 포도당 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3)소듐 카복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; (4) 분말 트라가캔트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형체; (9) 땅콩유, 목화씨유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트과 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 완충제; (15) 알진산; (16) 유리 피로젠 수; (17) 이소토닉 염수; (18)린저스 용액; (19) 에틸 알콜; (20) 인산 완충액; (21) 약제학적 제형으로 사용되는 다른 비독성 적합성 물질을 포함한다.
용어 "전신 투여", "전신으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초로 투여된"은 기술적인 것이고, 피검체 조성물, 치료 물질 또는 이와 다른 물질을 중추 신경계로 직접 투여하는 것을 말하고, 이는 환자의 시스템에 들어가서 예를 들어 피하 투여 공정과 같이 대사되기 쉽다.
용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 기술적인 것이고, 통상 주입으로 소화관 및 국소 투여와 다른 투여의 방식이고 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척추내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
9. 예시화
일반적으로 설명된 본 발명은 본 발명의 특정 측면의 예시 및 구체화 목적을 위하여 단지 포함되고 어떤 방법으로도 본 발명을 한정하지 않는 다음 실시예를 참고하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
9.1 젊은 동물, 손상 노후한(AI) 동물 및 비손상 노후한(AU) 동물의 특징규명
9.1.1 모리스 물 미로(MWM) 및 방사상 암 미로(RAM) 피검체
우리는 MWM을 가진 9마리 젊은(4 내지 6개월) 및 18마리 노후한(25 내지 27개월) 병원균이 없는 수컷 롱-에반스 래트에 관한 행동 시험을 수행하고 미소배열 분석을 위하여 동일한 동물을 사용하였다. 추가 10마리 노후한 래트를 MWM에서 시험하고 2개 작업을 통하여 인지 기능에서 개별적인 차이에 대하여 시험-재시험 신뢰성을 평가하기 위하여 RAM에서 훈련시키고 시험하였다.
9.1.2 모리스 물 미로 기구
MWM 기구는 비독성 색소 또는 일부 다른 물질을 첨가하여 혼탁해진 물(27℃)로 채운 크고 순환형 풀(직경 1.83m; 높이 0.53m)로 구성된다. 작업의 전형적인 "숨겨진 플랫폼"에서, 수면 아래 단지 1.0cm 미로의 한 사분역의 중심에 위치한 위장 백색 탈출 플랫폼(높이 34.5cm)을 찾게 하기 위하여, 래트를 훈련시켰다. 이 플랫폼은 탱크의 바닥으로 함몰시키거나 행동 시험 중에 미로 바깥으로부터 정상 위치로 상승시킬 수 있었다. 이러한 플랫폼의 위치는 시도마다 일정하게 유지시켰다. 플랫폼의 위치를 표시하는 어떠한 작은 단서도 없기 때문에 래트의 풀의 둘레에서 임의 시작 위치로부터 효과적으로 이를 찾는 능력은 미로를 둘러싼 정보를 사용하는 것에 따랐다. 미로는 공간적인 단서의 구성을 제공하기 위하여 흰 패턴으로 고정된 검은 커튼으로 둘러쌌다. 검은색 표면을 가진 제 2 플랫폼(높이 37.5cm)을 단서 훈련 동안에 물표면 2cm 초과로 상승시키고, 작업의 버전을 인지와 무관한 요소에 대하여 대조군으로 사용하였다. 풀에서 래트의 행동을 비디오 추적 시스템(HVS 이미지 어드밴스드 트랙커 VP200) 및 영국, 햄톤, HVS 이미지의 리차드 배커에 의하여 개발된 HVS 소프트웨어를 작동시키는 PC 컴퓨터에 연결된 풀의 중심의 2.5m 위에 매달린 카메라로 기록하였다.
9.1.3 모리스 물 미로 방법
우리는 인지에 관한 노화의 효과에 대한 감수성 및 성장한 롱-에반스 래트의 노후한 군락(Gallagher M, Burwell R, Burchinal M. Behav. Neurosci. 107:618-626; 1993)내에서 신뢰할 수 있는 개별적인 차이 측정에 대한 MWM프로토콜을 최적화시켰다.
래트가 60초 상호시험 간격을 사용하여, 연속된 8일 동안 매일 3회 시험을 수용하였다. 각 훈련 시험에서, 래트를 풀의 주변에서 4개 동일한 공간의 시작 위치중 하나로부터 미로에서 놓아주었다. 시작 위치는 시험마다 다양하여, 반응 전략을 사용하는 것을 방지하였다(예를 들어, 탈출 플랫폼을 찾기 위하여 시작 위치로부터 항상 왼쪽으로 바꿈). 래트가 시험상에서 90초 내에 탈출 플랫폼을 찾지 못한다면, 실험자는 30초 동안 잔류하는 플랫폼으로 래트를 안내하였다. 모든 6회 시험은 미로에서 공간 경사의 발달을 평가하기 위하여 프로브 시험으로 구성되었다. 이러한 시험중에서, 래트를 30초 동안 풀의 바닥으로 함몰시킨 플랫폼으로 헤엄치게 하고 30초에 플랫폼을 탈출 시험의 완수를 위하여 정상 위치로 상승시켰다. 숨겨진 플랫폼을 사용하는 프로토콜을 완수할 때에, 래트를 볼 수 있는 플랫폼을 사용하여 단서 학습에 대하여 평가하였다. 이러한 플랫폼의 위치는 시험마다 6회 훈련 시험의 단일 섹션에서 다양하였다.
우리는 훈련 시험 분석의 목적 및 프로브 시연에 관하여 동물의 위치의 근접성을 사용하였다. 근접성 측정을 1초 평균에서의 탈출 플랫폼으로부터 거리 기록을 제공하기 위하여 미로(10X/초)에서 동물의 위치를 샘플링하여 수득하였다. 프로브 시험 및 훈련 시험 모두에 대하여 수정된 방법을 수행하여 시연이 상대적으로 풀의 주변에서 다양한 시작 위치로부터 목표로 거리에서의 차이가 공평하게 하였다. 이러한 수정을 하는 경우에, 평균 수영 속도를 각 시험(경로길이/지연시간)에 대하여 측정하였다. 시험에서 사용된 시작 위치로부터의 속도에서 목표로 수영하는데 필요한 시간 량을 시연을 계측하기 전에 기록으로부터, 즉 훈련 시험에서 축척된 거리 및 프로브 시험에 관한 목표로부터 평균 거리를 제거하였다. 이와 같이, 근접성 측정을 사용하여 수득한 점수를 최적 조사로부터 편차, 즉 목표로의 직경로 및 프로브 시험중에서 그 위치의 즉각적인 근접에서 조사를 나타내는 조사 오차를 반영하도록 고안하였다.
9.1.4 모리스 물 미로 분석
비디오 추적 컴퓨터 기록을 미로에서 각 래트의 활동상에 데이타를 제공하기 위하여 컴파일링하였다. 훈련 시험 및 프로브 시험상의 측정을 분산 분석법으로 분석하였다.
9.1.5 모리스 물 미로 데이타 결과
숨겨진, 위장한 플랫폼으로 훈련중에 활동은 젊은 래트 및 노후한 래트 군간에 상이하였다[F(1,23)=12.69, p<.002]. 군 사이의 어떠한 차이가 볼수 있는 플랫폼으로 단서 훈련 시험에서 발생하지 않았다. 단서 훈련중에 탈출에서의 지연은 젊은 래트에 대하여는 평균 9.36초이고 노후한 래트에 대하여는 10.60초였다.
보정된 프로브 시험상의 평균 근접성 측정을 문헌[Gallagher M, Burwell R, Burchinal M. Behav. Neurosci. 107:618-626; 1993]에서 상세하게 설명하는 바와 같이 각 개별적인 피검체에 대한 공간 학습 지표를 측정하는데 사용하였다. 래트가 신속하게 위치에 가까운 플팻폼을 찾는 것을 배운 경우에, 이의 공간 학습 지표는 낮다. 전체적으로, 노후한 래트는 젊은 래트와 상이하였다[F(1,23) = 15.18, ㅔ<.01]. 노후한 래트를 젊은 래트 연구 군락의 학습 지표 프로필과 비교하여 비손상 또는 손상받은 것으로 분류하였다. 젊은 래트의 정상 범위(지표 점수<241)내에 놓인 노후한 래트를 노후한 비손상체(도 1)로 지정하였다. 젊은 래트 활동 범위 바깥의 지표 점수를 가지는 잔류 노후한 피검체를 노후한 손상체로 지정하였다.
9.1.6 방사선 암 미로 기구
상승된 8개의 팔 방사상 미로의 각 팔(7X75cm)이 팔각형 중심 플랫폼(30cm 직경, 51.5cm 높이)의 각 면으로부터 뻗쳤다. 팔상의 깨끗한 면벽을 최저로 형성하기 위하여 10cm 높이 및 65°경사지게 하였다. 풋웰(4cm 직경, 2cm 깊이)을 각 팔의 원위 단부에 위치시켰다. 플랙시글라스로 건축된 블록(30cm H x 12cm W)은 임의 팔에 진입을 방지하기 위하여 위치시켰다. 많은 여분의 미로 단서를 기구를 둘러싼 방에 제공하고 채광을 상부 장착물에 구비하였다.
9.1.7 방사상 암 미로 방법
래트를 우선 연속 4일 동안 8분 세션동안 미로에서 거주시켰다. 이러한 세션의 각각에 음식 보상을 초기에 플랫폼 및 팔상에서 RAM상에 산개시킨 후에 점진적으로 팔에 한정시켰다. 이러한 거주 단계후에, 표준 훈련 프로토콜을 음식 펠렛을 각 팔의 단부에 위치시켜서 사용하였다. 래트가 18일 동안 1일 1회를 수용하고; 모든 8개 음식 펠렛아 수득된 경우 또는 16개를 선택하거나 15분이 초과한 경우에 각 시험이 매일 종료되었다. 오차는 음식이 이미 수득된 팔(팔상에 모든 4개 발톱)로 구성되었다. 이러한 단계를 완료한 후에, 작업의 기억 요구가 시험중에 지연을 부과하여 증가하였다. 각 시험의 초기에 3개 팔을 중단하였다. 중단 팔의 확인 및 구성을 시험을 통하여 다양화하였다. 래트가 시험의 초기에 접근되는 5개 팔상의 음식을 수득하도록 하였다. 래트를 60초 동안 미로로부터 제거하고 60초 동안에 미로상의 경계를 제거하여 모든 8개 팔로 접근하게 하였다. 그리고 나서 래트를 다시 중앙 플랫폼에 놓고 잔류 음식 보상을 수득하게 하였다.
9.1.8 방사상 암 미로 분석
기억 오류는 래트가 지연전에 이미 방문한 5개의 팔중 하나로 돌아온 경우에 60초 지연을 사용한 테스트 시험 동안에 발생하였다. 각 래트의 활동은 연속적인 테스트 시험을 통하여 평균화하였다. 매개변수 통계(홀 t-테스트)를 젊은 군 및 노후한 군사이에 활동을 비교하도록 사용하였다. 상호관련성 분석(페어슨스 r)을 모리스 물 미로(학습 지표 점수) 및 방사상 암 미로(기억 오류)에서 노후한 래트(N=10)의 활동사이에서 관련성을 조사하기 위하여 사용하였다.
9.1.9 방사상 암 미로 결과
RAM의 지연 버전에서 젊은 성체 래트의 활동은 60초 내지 8시간(Chappell et al. Neuropharmacology 37:481-488, 1998) 범위의 지연 간격 함수와 같이 다양하다. MWM에서 이전에 특징이 규명된 노후한 래트는 젊은 래트(p<.025)와 비교하여 60초 지연이후에 보다 많은 기억 오류를 가졌다. 평균적으로 젊은 래트가 0.17 오류를 가진 반면, 노후한 래트는 평균 1.52 오류를 가졌다. 그러나 10마리의 노후한 래트는 RAM상에서 광범위한 범위의 활동을 보였다. 상당한 관련성을 RAM에서 초기 MWM 특징화 및 기억 활동간에서 발견하였다(r 값 = .82, 도 2에서 도시된 데이타).
9.2 젊은 동물, 연령-손상 동물(AI) 및 노후한 비손상 동물(AU)의 유전자 발현 분석
9.2.1 행동으로 특징이 규명된 동물의 RNA 제조
27마리의 행동으로 특징이 규명된 래트(도 1에서 도시된 데이타)를 소듐 펜토바르비탈(100mg/kg)의 과복용으로 도살하였다. 해마를 좌우양측에서 절개하고 냉동시켰다(-80℃). 각 동물로부터 해마의 중량을 측정하고 페놀-구아나딘 이소티오시아네이트의 적당한 부피로 균질화시켰다(트리졸 시약; 1ml의 최소 부피를 가진 조직 100mg당 1ml). 각 시료를 클로로포름(트리졸 ml당 200㎕)로 추출하고 이소프로판올로 침전시켰다. RNA 펠렛을 공기로 건조시키고 DEPC 처리수로 재현탁시켰다. 모든 시료를 -80℃로 저장하였다. RNA 부분을 제조자의 지시에 따라서 콰이젠의 RNeasy 미니 RNA 추출 키트를 사용하여 추가로 정제한 후에 -80℃로 저장하였다. 시료를 260nm로 흡광도를 정량하고 순도를 260nm 및 280nm에서 흡광도비로 결정하였다. 시료 온전성 및 농도를 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 아가로스 겔의 사진촬영을 스캔하고 픽셀을 반전시키고 NIH-이미지를 사용하여 정량하였다. 그리고 나서 농도를 필요하다면 조정하였다.
유전자 미소배열에 관한 분석을 위하여, 동일한 표현형, Y, AI 또는 AU의 3마리 래트로부터의 시료를 모아서 3개의 진칩/표현형의 시료 크기에 대한 독립적인 미소배열 분석을 수득하였다. MWM에서의 공간 학습 지표로 행동 특징규명에 관해서는 조직을 모아서 표 1에서 나타내었다.
[표 1]
젊은 동물 노후한 비손상 동물 노후한 손상 동물
Y1:143.1, 171.4, 194.6 AU1: 181.5, 202.9, 229.5 AI1:268.3, 283.2, 381
Y2:139.5, 169.4, 186.6 AU2: 183.9, 218.4, 229.3 AI2:285.5, 303.4, 337.7
Y3:169, 173.9, 196.5 AU3: 193.3, 228.2, 230.6 AI3:282.2, 307.2, 329.3
9.2.2 역전사 및 미소배열로 하이브리드화(hybridization)
하이브리드화를 위한 표지된 cRNA 프로브를 아피메트릭스 엔조 바이오어레이 고효율 RNA 전사 표지 시스템을 사용하여 제조하였다. RNA를 cDNA로 역전사시키고 바이오틴 표지 cRNA로 변환시켰다. 각 표지 시스템으로 공급된 내부 표준을 역전사전에 테스트 RNA에 첨가하였다. 그 이후에 cRNA를 역전사 및 표지가 실험 진칩상에 하이브리드화시키기 전에 최적화되는 것을 확인하기 위하여 대조군 칩상에서 시험하였다. cRNA를 U34A 아피메트릭스진칩배열에 적용시켰다. 이 배열은 7000개의 발현된 래트 유전자 및 1000 EST 클러스터에 대한 특이적인 서열을 포함하고 최근에 개발된 보다 작은 신경과학 유전자 미소배열상에 나타난 모든 유전자를 포함하였다. 진칩 플루이딕스 스태이션은 유전자 배열상으로 표지된 cRNA를 유도하는 것과 진칩 하이브리드화 오븐에서 수행된 것과 같은 하이브리드화를 자동화하였다. 진어래이 스캐너를 공초점 레이저 스캐닝상을 기초로한 각 올리고머 세트에 대한 하이브리드화 신호를 검출하고 정량하는데 사용하였다.
9.2.3 미소배열 데이타 분석
진칩 분석 슈트 및 아피메트릭스 MAS 4.0 및 보다 최근에 개발된 MAS 5.0 알고리틈을 데이타 분석에 사용하였다. 두개 알고리즘 모두가 칩당 공지된 음성 유전자 및 평규 신호 강도를 기초로한 기본 역가를 가졌다. 아피메트릭스로 정의된 미리정의된 올리고머 세트를 기초로하는 정상화 및 스캐일링 방법을 진칩간에 비교하도록 적용시켰다. 두개 모두 알고리즘은 완벽하게 매치되는 cRNA의 하이브리드화를 저해하기 위하여 계산된 변이된 염기로 고안된 미스매치된(MM) 올리고머의 세트와 비교하여, 각 발현 유전자에 상응하는 완벽하게 매치되는(PM) 올리고머의 세트당 발현 수준에 대한 값을 발생시켰다. 실험 MAS 4.0 알고리즘은 각 유전자에 대하여 대조군 MM 올리고머와 비교하여 PM 올리고머에 대한 하이브리드화 신호 강도 측정을 제공하는 평균 표시(call)를 생성시키기 위하여 미가공 데이타를 사용하였다. 현재(P), 한계(M), 또는 부재(A)의 절대 표시는 MM 올리고머에 상대적으로 양성인 PM 올리고머의 수에 기초하였다. 통계적인 MAS 5.0 알고리즘은 비교의 동일한 타입에 필수적으로 놓이지만 현재 표시가 백그라운드보다 높은 발현 수준을 반영하는 가능성을 높이는 p 값을 생성시키기 위하여 통계적인 방법을 적용시켰다. 또한, 통계적인 기준을 각 프로브 세트에서 PM 및 MM 올리고머내에서 특이값의 영향을 최소화하려는 하이브리드화 신호 강도를 계산하는 신호 알고리즘에 적용시켰다. 두개의 알고리즘으로 수득된 발현 수준을 나타내는 데이타에서 기본적인 차이는 MAS 5.0을 2개 비교군 사이의 변화된 발현 수준으로 유전자의 수를 과다측정하게 하는 음성 발현 수준을 제거하도록 고안되었다.
우리의 모델의 힘은 부분적으로 젊은 해마 및 노화된 해마사이에서 변화시키는 유전자를 확인하기 위하여 3개의 군, Y, AU 및 AI을 비교하는 능력에 놓이고, 따라서 일반적으로 노화 과정 및 AU 및 AI 래트를 구별짓는 것과 관련된다. 이러한 과정을 통하여 확인된 유전자는 특이적으로 인지 기능의 노화 인지성 손상 또는 보존과 관련된다.
본원에서 개시된 데이타를 생성시키는 경우에, 우리는 연령 및 인지성 손상의 모델에 대한 유용한 유전자 3개의 세트를 확인하는 일련의 분석 단계를 수행하였다. 세트 1은 연령 단독의 기능으로서 젊은 것과 상이한 관심 유전자로 구성되었다. 세트 2는 젊은 래트 및 노화된 비손상 래트 모두와 비교하여 손상 노화된 래트에서 상이한 관심 유전자로 구성되었다. 세트 3(노화된 비손상 유전자를 말함)은 젊은 래트 및 노화된 손상 래트 모두와 비교하여 노화된 비손상 래트에서 상이한 유전자로 구성되고 따라서 인지 기능의 연령 유도성 보존과 관련된다. 각 세트는 MAS 5.0에 따라서 완전한 미소배열 데이타 세트로부터 생성되고 효과 크기 분석에 대한 유사한 알고리즘을 사용하였다.
본원에서 우리는 글루타메이트 전송자를 포함하는 세트 3(노화된 비손상 유전자)을 생성하는 단계를 설명하였다. 제 1 단계에서 모든 프로브 세트에 대한 값은 젊은 래트에서 유전자 발현을 나타내는 칩(N=2) 및 노화된 손상 래트에 대한 칩(N=3)을 검출 기준으로 조사하였다. MAS 5.0 분석으로부터 절대 표시를 사용하는 검출 기준을 만족시키지 않는 모든 프로브 쌍 세트는 추가 고려로부터 제거시켰다. 단순한 효과 분석을 2개의 군(젊은 것과 노화된 손상체)에 대한 칩상의 값은 1.0을 초과하는 효과크기로 구별하지 않는 것을 결정하기 위하여 수행하였다. 모든 프로브 세트는 검출 기준 및 비교군에서 풀에 대한 기존 모두를 만족시킨다(젊은 것 및 노화된 손상체는 1.0이상의 효과 크기로 구별되지 않음). 그리고 나서 단순한 효과 분석을 노화된 비손상 칩으로부터 상응하는 프로브 세트와 함께 젊은 것과 노화된 손상체에 대한 풀링된 프로브 세트상에서 수행하였다. 단순한 효과 분석은 384개의 프로브 세트를 수득하였고, 1.25이상의 효과 크기를 가진 인지 기능의 노화 유도성 보존에 대한 "관심 유전자"를 나타내었다. 중요한 추론 통계 테스트에 대한 파워 분석은 미소배열 실험의 시료 크기(풀링된 비교군에서의 3개의 노화되고 손상된 칩 및 6개의 칩)가 2.5이상의 효과 크기를 가진 유전자에 대한 80% 파워를 가진 p<.05에서 차이를 검출할 것을 지시하였다. 현재 진행중인 각각의 비교군(젊은 것 및 노화된 손상체)에서의 9개의 노화된 비손상체 및 9개의 피검체의 시료 크기를 가진 추가 분석에서, 80%에서 통계적인 파워가 1.25이상의 효과 크기에 대하여 기대할 수 있었다.
9.2.4 미소배열로부터 결과
글루타메이트 전송자에 대한 상이한 전사를 인간 및 설치류 신경 시스템(도 3)에서 검출하였다. 이 전사체중 2개를 해마 형성물에서 발현시키지 않았다(EAAT 4 및 EAAT5). 3개의 잔류 전사체는 뉴런 및 아교세포에서 세포 국소화하는 상이한 패턴을 가지고, 해마에서 모두 발현시켰다. 효과 크기에서, 미소배열 데이타세트 GLT-1에서의 노화된 비손상 유전자(세트 3)에 대한 분석은 5.87의 효과 크기를 가지고(노화된 비손상 유전자에 대한 효과 크기 분석에서의 가장 큰 값), 제 2 글루타메이트 전송자, GLAST는 1.93의 효과 크기를 가졌다(도 4). 둘 모두의 경우에서, 글루타메이트 전송자 mRNA를 젊은 것과 노화된 손상체의 풀링된 비교와 관련된 비손상 노화된 래트에서 증가시켰다. 미소배열 실험 고안에 대한 파워 분석으로부터 예상하는 바와 같이, GLT1 mRNA는 젊은 비교군과 노화되고 손상된 비교군에 비하여 상당하게 증가하였다(p<.0002). 유사한 분석에서, GLAST는 또한 상당하게 증가하였다(p=.0484; 도 4).
글루타메이트가 보존된 인지 기능을 가진 노화된 래트에서 상이하게 조절되는 추가 지시를 젊은 것과 노화된 손상체에 비하여 노화된 비손상체에서 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 대한 mRNA에서의 비교로 제공되었다. 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제에 대한 프로브 세트, 세포외 글루타메이트의 불활성에 대한 주요한 기작은 서로 상이하지 않은 Y+AI 비교에 비하여 AU 래트에서의 상당한 증가르 보였다. mRNA에 대한 효과 크기는 2.58이었다.
마이크로배열상의 프로브 세트는 뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성제 폴리펩타이드(PACAP; 진뱅크 수탁 번호: AI227715; EST224410임)에 대한 확인된 유전자이고, 상기 펩타이드는 글루타메이트 전송 및 대사를 조절한다(Figiel and Engele, J. Neurosci. 15:3596-3605, 2000). PACAP mRNA는 상당하게 젊은 래트 및 노화된 손상 래트 비교에 비하여 노화된 비손상 래트에서 상승하였다(효과 크기 3.29, t=4.13, p<.005; 도 4).
PACAP 수용체가 탈감각화를 보이는 유형을 가지기 때문에, β-아레스틴 2 mRNA에서의 강한 증가가 글루타메이트 전송에서의 효과에 참여할 수 있다. 베타-아레스틴 2는 수용체 세포내이입에서 및 동일한 수용체를 통한 신호 흐름을 매개하는데 이중 역할을 가진다(Wei et al., PNAS, 100; 10782-7, 2003; Ahn et al., PNAS, 100; 1740-4, 2003; 예를 들어 진뱅크 수탁번호:XM_345084). 노화된 비손상 래트에서의 β-아레스틴 2에 대한 프로브 세트는 젊은 래트 및 노화된 손상 래트 비교군에 비하여 상당한 상승을 보였다(효과 크기 = 2.78, t=2.59, p<.05).
9.2.5 인 시튜 하이브리드화 조직화학 분석
추가 분석을 인 시튜 조직화학에 대한 가공된 해마의 섹션을 사용하여 독립된 세트의 동물(군당 3 또는 4의 N)을 사용하여 수행하였다.
9.2.6 인 시튜 하이브리드화 프로브 제조
우리는 미소배열 분석으로 해마 AU 래트에서 상승 조절된 것으로 확인되는 글루타메이트 전송자에 상응하는 특이적인 프로브를 생성시키기 위하여 역전사 효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하였다. 노화된 래트(젊은 동물 점수의 (AU)내 또는 (AI)외 학습 지수 점수를 가진 동물의 풀)의 해마로부터 제조된 시료 RNA를 올리고dT 및 역전사 효소를 사용하여 역전사시켰다. 이러한 cDNA는 하기에서 설명된 특정 글루타메이트 전송자에 상응하는 이중 가닥 cDNA를 증폭하기 위하여 제 1 라우드 PCR 반응에서의 센스 및 안티센스 올리고머 프로브(표 2)를 가진 주형으로서 사용하였다. 표준 PCR조건을 사용하였다(4분 동안 94℃에서 초기 변성, 40초 동안 72℃에서 초기 아닐링, 94℃의 35번 순환, 30초 변성, 55℃, 30초 아닐링 및 72℃ 30초 연장, 4분 동안 72℃에서 최종 연장 및 4℃로 냉각). PCR 생성물의 분주를 적당한 크기의 프로브를 생성했는지를 확인하기 위하여 에티듐 브로마이드 아가로스 겔상의 전기청공법을 하였다. 제 2 라운드 PCR 반응을 각각의 증폭된 cDNA 및 SP6 프로모터 서열에 상응하는 센스 올리고머에 추가하여 각 글루타메이트 전송자 PCR 생성물을 수득하는데 사용된 원 센스 올리고머를 포함하는 연장된 올리고머(표 II), 및 T7프로모터 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 및 각 글루타메이트 전송자에 대한 원 안티센스 올리고머를 사용하였다. 이는 개별적으로 센스 및 안티센스 가닥상에 SP6 및 T7 프로모터를 가진 특이적인 글루타메이트 전송자 cDNA를 생성시켰다. PCR 생성물은 에탄올 침전시켜 수집하고 자동 DNA 서열분석기 및 SP6 프라이머를 사용하는 뉴클레오타이드 서열분석으로 서열을 확인하였다.
SP6 및 T7 프로모터 부위를 가진 각 글루타메이트 전송자에 상응하는 서열 확인된 PCR 생성물을 각 제 2 라운드 글루타네이트 전송자 PCR 생성물로부터 센스 및 안티센스 RNA의 DNA 직접 시험관내 전사에서 사용하였다. 시험관내 전사 반응을 각 PCR 생성물, SP6 또는 T7 중합효소(각 프로브에 대한 분리된 반응에서 사용된 각 효소), 비표지된 뉴클레오타이드 트리포스페이트 및 고특이 활성35S 표지 유리딘 트리포스페이트를 사용하여 수행하였다. 이러한 반응은 염기 쌍으로 조직 단면에서의 각각의 상이한 글루타메이트 전송자 mRNA를 특이적으로 인지하는 3개의 표지된 안티센스 글루타메이트 전송 프로브를 수득하게 하였고 글루타메이트 전송 mRNA로서 동이한 서열을 구성하는 상응하는 센스 프로브가 mRNA와 염기쌍을 형성할 수 없게 하고 이를 음성 대조군으로 이용하였다. 안티센스 프로브를 전체 해마를 걸쳐 단면을 나타내는 Y, AU 및 AI 래트로부터 해마의 동결 단면과 인큐베이션시켰다. 센스 프로브를 음성 하이브리드화 신호를 확인하고 안티센스 프로브로 수득된 하이브리드화 신호의 특이성을 유효하게하기에 충분하지 않은 해마의 거의 선별되지 않은 영역으로부터의 단면과 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 및 세척이후에, 단면을 X 레이 필름에 올려놓고 표준 정량 자가방사선술(비존 2001)을 신호를 정량하는데 사용하였다.
글루타메이트 전송 센스 및 인 시튜 하이브리드화 조직화학에 대한 안티센스 RNA 프로브의 제조를 위한 주형을 수득하는데 사용된 올리고머를 표 2에서 설명하였다.
9.2.7 인 시튜 하이브리드화 조직화학에 대한 조직의 제조
11마리의 행동으로 특징이 규명된 래트(n=4는 젊은 래트 및 n=7은 늙은 래트)를 소듐 펜토바르비탈(100mg/kg)의 과복용 및 0.1M 인산 완충액, pH 7.4(PPB)중에 4% 파라포르알데히드를 사용하여 도살하였다. 모든 관류를 0700h 내지 1000h에서 수행하였다. 고정화시킨 후에, 뇌를 머리뼈로부터 제거하고 우측 및 좌측 해마 모두를 즉시 주변 조직으로부터 절개하였다. 절개된 해마를 24시간 동안 PPB중에서 첨가하고, 24시간 동안 20% 수크로오스를 함유하는 PPB중에서 동해방지시키고 "연장된" 방향으로 건조 분말된 얼음상에서 냉동시키고 추가 가공까지 -80℃에서 저장하였다.
각 동물에 대한 해마를 냉동 박절기를 사용하여 세로축에 관상으로 절개하고(25mm) 냉 PPB로 수집하였다. 조직의 유리 부유 단면을 과량 고정액을 제거하기 위하여 0.1M 포스페이트 완충액 pH 7.2(PB) 및 0.1M PB 단독중에 0.75% 글리신으로 세척하였다. 단면을 프로테인아제 K(0.05% SDS를 함유하는 0.1M 트리스 완충액중의 1mg/ml)로 37℃에서 30분 동안 처리하고, 0.1M 트리에탄놀아민, pH 8.0중의 0.25% 무수 아세트산에서 아세틸화시키고 2X 염수 소듐 시트레이트 완충액(SSC; 1XSSC = 0.15M 소듐 클로라이드 및 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 2회 세정하였다. 조직을 50% 포를아미드, 1X 덴하르드트즈 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 4XSSC, 0.25 mg/ml 효모 tRNA, 0.3mg/ml 헤링 정자 DNA, 100mm 디티오트레이톨(DTT), 및 1X107 CPM/ml의 최종 농도에서 적당한 35S-표지 cRNA를 함유하는 용액중에서 42 내지 44시간 동안 60℃에서 하이브리드화시켰다. 하이브리드화 이후에, 단면을 30분 간격으로 4XSSC중에서 2회, 60℃에서 50% 포름아미드/2XSSC중에서 1회 세척한 후에 30분 동안 37℃에서 리보뉴클레아제 A(1mM 에틸렌-다이아민테트라아세트산을 함유하는 10mM 트리스 염수 완충액 중에서 20mg/ml)로 처리하였다. 조직 단면을 0.1XSSC의 최종 세척으로 100mM DTT를 함유하는 SSC 완충액의 농도를 낮추어서 추가로 세척하고 필름 자가방사선술을 위한 젤라틴 코팅 슬리아드상으로 올려놓았다. 해마 단면의 공기 건조된 단면을 14C-표준(American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, MO)을 사용하여 24 내지 72시간 동안 β-맥스 하이퍼필름(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey)에 노출시켰다. 입쪽 관상 단면에 대한 노출 시간이 110 내지 130시간이었다. 필름을 GBX 현상기를 사용하여 현상하고 코닥 신속 고정액으로 고정시켰다.
인 시튜 하이브리드화 표지를 MCID 이미지 시스템(Imaging Research, St. Catherine's Ontario, Canada)를 사용하여 필름 자가방사선 농도계측 분석으로 정량화하였다. 막 농도를 선형화시키고 조직 단면으로 각 시트의 필름에 노출시킨 14C-라벨 표준에 상대적으로 보정하였다. 하이브리드화 신호 강도(mCi/그램 단백질)에 대한 값을 6 내지 8 조직 단면으로부터 다중 측정 평균으로서 각 래트에 대하여 측정하였다. 군내에 각 래트에 대한 평균 하이브리드화 신호 강도를 평균±표준 오차 군을 수득하기 위하여 평균화하였다. 한 방향 ANOVA를 사용하여 통계적인 비교를 하였다. 모든 통계적인 테스트에 대하여, 95% 신뢰 수준(p<0.05)를 상당한 것으로 고려하였다.
9.2.8 인 시튜 하이브리드화 조직화학의 결과
GLT1의 풍부함은 젊은 것과 노화된 손상체(p<.03)에 비하여 노화된 비손상체에서 보다 큰 반면, 보다 많은 GLAST mRNA에 대한 경향을 또한 발견하였다(p=.089; 도 5). 인 시튜 하이브리드화를 위해 사용되는 래트 세트에서의 인지 상태를 나타내는 학습 지표 점수는 미소배열 연구에서의 동물과 유사하였고; 노화된 비손상체(182, 223, 240) 젊은 것(177, 219, 200, 227) 및 노화된 비손상체(290, 285, 297, 298).
미소배열 데이타세트 및 인 시튜 데이타세트에서, 제 3의 글루타메이트 전송자 mRNA(EAAC1)에 대한 값이 비교군 젊은 래트 및 노화된 손상 래트에서 보다 비손상 노화 군에서 수치적으로 보다 높았으나, 이러한 차이는 통계적으로는 중요한 것이 아니었다. 미소배열에서의 한 프로브 세트(AF038571)에 대한 mRAN는 EAAC1을 상당하게 노화된 손상체보다 노화된 비손상체에서 상승시켰다. EAAC1에 대한 제 2 프로브 세트에서의 mRNA는 유사한 경향을 보였다(노화된 손상체보다 노화된 비손상체가 큼, p=.09).
9.3 세프트리악손을 사용한 보존된 인지 기능
9.3.1 젊은 래트에서 GLT1 mRNA상에 세프트리악손 치료의 효과
젊은 래트를 일주일 동안 매일 근육내로(N=2) 또는 운반체(N=3)로 200mg/kg으로 세프트리악손을 주입하였다. 도살이후에 해마를 절개하고 냉동시켰다.
9.3.2 GLT-1 mRNA를 정량하는 실시간 역전사 PCR 방법
9.3.2.1 실시간 RT-PCR을 위한 RNA의 제조
RNA을 트리졸 시약을 사용하여 세프트리악손 또는 염수 처리한 동물(각 조건당 3마리 젊은 동물)의 우측 해마로부터 추출하고 미소배열 실험에 사용되는 방법과 동일한 방법으로 Qiagen RNeasy 컬럼으로 정제하였다. 농축 및 온전성을 결정한 후에(미소배열 RNA에 대한 것과 동일한 방법으로), 시료를 마이크로리터당 50ng의 농도로 희석하였다. 이런 시료의 100ng을 다음 조건을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 태크만 역전사 시료를 사용하여 10㎕의 총부피로 역전사시켰다: 1x 역전사 완충액, 각 dNTP의 0.5mM, 5.5mM MgCl2, 멀티스크라이브 역전사 효소의 1.25 유닛/μL, 0.4유닛/μL RNase 저해제 및 2.5μM 올리고 dT 프라이머. 시료를 10분 동안 상온에서, 다음에 48℃에서 45분간, 95℃에서 5분동안 인큐베이션시켰다. 시료를 실시간 PCR 반응에서 사용하기 위하여 1:20 및 1:100으로 희석시켰다. 표준 RNA를 추출물과 합쳐서 생성하고 2마리의 별개 동물 및 RNA 500ng을 50㎕ 반응에서 사용하는 것을 제외하고는 상기에서 실험 시료에 대한 것과 동일한 조건에서 이 RNA를 역전사시킨 것으로부터 해마를 정제하였다. 표준 cDNA를 연속 희석범으로 1:20, 1:100, 1:500 및 1:2500으로 희석하였다. 추가로 표준 RNA 200ng을 역전사 효소를 생략한 것을 제외하고 상기에서와 같은 동일한 조건으로 20㎕ 반응물에 놓았다. 이 시료를 RT 시료 없음으로 하고 RNA 시료 자체의 백그라운드 활성을 지시하는 것을 포함하였다. 이 시료를 연속적으로 희석하여 1:20 및 1:100으로 희석하였다.
9.3.2.2 실시간 PCR
PCR 반응을 cDNA 1:20 및 1:100 희석을 사용하여 GLT1a, GLT1, 및 GAPDH에 대한 2개의 상이한 농도에서 각 cDNA 시료상에서 3회 수행하였다. PCR 반응에서 cDNA의 최종 농도는 100pg/㎕ 및 20pg/㎕이고 투입 RNA의 농도로부터 외삽법을 기초로 하였다. 표준을 100pg/㎕, 20pg/㎕, 4pg/㎕ 및 0.8pg/㎕의 외삽 최종 농도를 생성시키기 위하여 4개 희석물에서 사용하였다. 인비트로젠스 플래티늄 정량 PCR을 사용한 PCR 반응 혼합물을 각 농도에서 각 cDNA에 대한 별개 튜브로 나눈 동일한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 모든 시료에 대하여 수집하였다. cDNA를 각각의 3개 실시간 PCR 튜브에 배분시킨 혼합물에 첨가하였다. 모든 반응을 다음의 조건을 사용하여 로터진 3000(코르베트 리서치)에서 수행하였다: 50℃에서 2분 , 95℃에서 5분후에, 95℃에서 25초 45번 순환, 및 60℃에서 60초. 데이타를 GAPDH에 대한 조(Joe) 채널 및 GLT1 및 GLT1 프로브/프라이머 세트에 대한 FAM/SYBR 채널상에서 수득하였다. 스파이크 억제 및 역학적인 튜브 정상화를 모든 동작에서 사용하였다. GLT1 또는 GLT1a 및 GAPDH 실시간 PCR을 종종 별개 작동 동안에 수행하였다.
GAPDH에 대하여는 최적 반응 조건을 0.6유닛 플래티늄 택 DNA 중합효소, 20mM 트리스-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM dUTP, 0.4유닛 UDG, 4.5mM MgCl2, 200nM 정방향 프라이머, 200nM 역방향 프라이머, 5' 말단으로 표지된 50nM 프로브 및 3' 말단상의 TAMRA 켄쳐였다. 프라이머 및 프로브를 어플라이드 바이오시스템(카타로그 번호 4308313)으로 수득하고 서열은 공지되지 않았으나, 앰플리콘 길이는 177bp였다.
GLT1에 대하여는 최적 반응 조건을 0.6유닛 플래티늄 택 DNA 중합효소, 20mM 트리스-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM dUTP, 0.4유닛 UDG, 6.0mM MgCl2, 50nM 정방향 프라이머, 200nM 역방향 프라이머, 50nM 프로브였다. 앰플리콘 길이는 65bp였다. 정방향 프라이머는 5'GAG CTG GAC ACC ATT GAC TC 3'이고 역방향 프라이머는 5' GAC TGC GTC TTG GTC ATT TC 3'이었다. 프로브는 5'6-팜 및 3'탐라로 표지된 5'CAA CAC CGA ATG CAC GAA GAC ATC 3'였다.
GLT1a에 대하여는 최적 반응 조건을 0.6유닛 플래티늄 택 DNA 중합효소, 20mM 트리스-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 200μM dGTP, 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM dUTP, 0.4유닛 UDG, 6.0mM MgCl2, 200nM 정방향 프라이머, 200nM 역방향 프라이머, 200nM 프로브였다. 앰플리콘 길이는 76bp였다. 정방향 프라이머는 5'ATG AGT GCA AGG TAA CTC TGG 3'이고 역방향 프라이머는 5' TCA CGT TTC CAA GGT TCT TC 3'이었다. 프로브는 5'6-팜 및 3'BHQ1(흑 구멍 켄쳐 )로 표지된 5'CCA ATG GAA AGT CAG CTG ACT GCA 3'였다.
9.3.2.3 실시간 PCR 데이타 분석
GAPDH 및 GLT1 또는 GLT1a의 비교량은 DDCt 방법(Livak and Schmittgen, Methods 25:402-408 2001)을 사용하여 결정하였다. 모든 반응에 대한 역가를 0.05 형광 유닛에서 설정하고 각 시료에 대한 Ct를 로토르젠 소프트웨어로 결정하였다. 각 농도에서 각 GLT1 cDNA에 대한 평균 Ct 값을 결정하고 GAPDH에 대한 평균 값으로부터 감산하였다. 시료를 GAPDH 값이 평균 GAPDH값 미만 또는 초과가 15% 초과인 경우에는 이를 배제하였다. 이러한 값을 1.31 증가인 미소배열에서 AU 래트에서 관찰된 GLT1로 완전한 변화에 일치시켰다.
9.4 RAM에서의 노화된 래트의 활동에 관한 세프트리악손 치료 효과
MWM에서 인지 상태를 위한 특징화 규명후에 손상된 노화 래트를 MWM 학습 지표 점수에 관하여 동일한 2개의 치료 조건중 한개(대조군 운반체 또는 200mg/kg에서 세프트리악손)에 할당하였다. 초기에 두 치료 조건에서 래트를 RAM 작업(거주, 무연기 버전이후 60초 지연)상에서 훈련시켰다. 운반체 또는 약물의 매일 주입은 아침에(8:00-9:00 AM) 하였다. 래트를 3시간으로 연장 지연시킨 방사상 암 미로상의 매일 시험을 수용하게 하였다. 3시간 지연에서 한계 시험을 8 내지 10일에 하였다(주입 7일 후에). 운반체를 수용하는 노화된 래트에 대한 기억 오류를 동시에 시험한 젊은 군에 비하여 상당하게 증가시켰다. 운반체를 수용한 노화된 래트와 비교하여, 약물 투여를 수용한 노화된 래트는 거의 오류를 가지지 않았다(도 6). 3 마리의 약물 처리한 래트 및 4마리의 운반체로 처리한 래트를 사용하여 초기 기준 평가가 군 당 7 내지 8마리 래트에서 시료 크기를 증가시키기 위하여 추가의 행동으로 특징규명한 래트로 현재 복제된다.
9.4.1 노화된 래트에서 GLT1 mRNA상의 세프트리악손 치료 효과
RAM 시험의 완료된 시점에, 운반체 및 약물 처리하에서 노화된 래트를 도살하였다. 추가 노화된 래트를 사용하여 행동 시험의 복제를 완수하여 수행하는 GLT1 mRNA 분석을 위하여 절개된 해마를 냉동시키고 저장시켰다(-80℃).
9.4.2 MWM에서 시험-재시험상에서 세프트리악손 치료 효과
시험-재시험 신뢰도를 노화된 래트가 표준 MWM 프로토콜에서 특징이 규명되고 MWM을 사용한 신규한 공간적 환경에서 몇 주 또는 개월후에 시험하여 수득하였다. 인지 손상을 가진 노화된 래트에서 기능을 개선하기 위하여 화합물의 예비임상적 효능이 MWM을 사용한 재시험에서 평가할 수 있었다. 2개 작업(RAM 및 MWM)을 통하여 치료 효과성은 2개 작업(예를 들어, 활동당 동기적 기초)을 통하여 상이한 다른 성분의 독립적인 인지 기능상의 약물 작용에 대한 증거를 강화한다.
9.5 다른 화합물을 가진 개선되고 보존된 인지 기능
이 작업은 인지 기능을 개선하거나 보존하는 치료 요법을 구축하기 위하여 시험 화합물 또는 운반체를 젊은 래트에게 투여하는 것을 포함한다. 시험 화합물은 발프로산, 메타보트로픽 글루타메이트 수용체(mGluR) 활성을 조절하는 화합물 및 뇌하수체 아데닐 사이클라아제 활성제 폴리펩타이드(PACAP) 발현을 조절하는 화합물을 포함한다. MWM 상으로 특징이 규명된 노화된 손상 래트를 약물 또는 운반체 치료에 할당하고 RAM에서 시험하였다. 글루타메이트 전송자 발현의 분석 및 mGluR 발현 및 활성, PACAP 발현 또는 β-아레스틴 2 발현과 같은 다른 유전자 프로파일링을 행동 시험의 완수시점에서 수행하였다.
9.6 동등물
본 발명의 특정 구체예를 논의하는 동안, 상기 명세서는 예시적이고 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형이 이 명세서의 검토에 관하여 당해 분야에서의 당업자에게 자명할 것이다. 첨부된 청구범위는 상기 구체예 및 변화를 주장하려는 것이 아니고 본 발명의 완전한 범위는 동등물의 완전한 범위 및 명세서와 함께, 청구범위를 참고하여 상기 변화와 함께 결정되어야만 한다.
각 개별적인 문헌 또는 특허는 특이적으로 및 개별적으로 참고문헌에 통합된 것으로 지시된 것처럼 본원에서 언급된 모든 출판물 및 특허는 이로 인해 전체로 참고문헌으로 통합되어 있다. 분쟁의 경우에, 본원에서의 정의를 포함하는 본 출원이 조절할 것이다.
문헌, 특허 및 특허출원을 포함하는 본 출원에서 인용된 각각의 참고문헌의 내용은 본원에서 전체로 참고문헌으로 통합되어 있다.

Claims (53)

  1. (a) 요망되는 행동을 보이는 포유동물의 시험 집단을 제공하는 단계;
    (b) 요망되는 행동이 결핍된 포유동물의 대조 집단을 제공하는 단계;
    (c) 시험 집단의 신경 조직으로부터의 발현 RNA를 분리하고 푸울링(pooling)하는 단계;
    (d) 대조 집단의 신경 조직으로부터 발현 RNA를 분리하고 푸울링하는 단계;
    (e) 상기 단계 (c) 및 (d)에서 생성된 RNA 푸울 각각에서 다수의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (f) 다수의 유전자로부터 포유동물의 시험 집단 및 대조 집단 간에 발현이 상이한 유전자를 선택하는 단계를 포함하고,
    이 선택된 유전자가 상기 요망되는 행동과 관련된 유전자 후보인, 포유동물의 요망되는 행동과 관련된 유전자를 동정하는 방법.
  2. (a) 요망되는 인지능을 가지는 포유동물의 시험 집단을 제공하는 단계;
    (b) 상기 인지능이 손상된 포유동물의 대조 집단을 제공하는 단계;
    (c) 시험 집단의 신경 조직으로부터 발현 RNA를 분리하고 푸울링하는 단계;
    (d) 대조 집단의 신경 조직으로부터 발현 RNA를 분리하고 푸울링하는 단계;
    (e) 상기 단계 (c) 및 (d)에서 생성된 RNA 푸울 각각에서 다수의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (f) 다수의 유전자로부터 포유동물의 시험 집단과 대조 집단 간에 발현이 상이한 유전자를 선택하는 단계를 포함하고,
    이 선택된 유전자가 상기 인지능과 관련된 유전자 후보인, 포유동물의 인지능과 관련된 유전자를 동정하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 다수의 유전자의 발현 수준이 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 블랏(Nothern blot) 분석법, 및 닷 블랏(dot blot) 분석법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 다수의 유전자가 글루타메이트 수송에 관여하는 유전자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 글루타메이트 수송에 관여하는 유전자가 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 다수의 유전자가 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5로 구성된 군으로부터 선택된 글루타메이트 트랜스포터가 아닌 유전자를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. (a) 시험 화합물을 포유동물에 투여하는 단계;
    (b) 상기 시험 화합물을 투여한 후에 상기 포유동물의 신경 조직의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 상기 유전자의 발현 수준을 상기 시험 화합물이 투여되지 않은 포유동물의 신경 조직에서의 이의 기준 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 유전자의 발현 수준이 이들의 대응하는 기준 발현 수준과 차이가 있는지를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 차이가 시험 화합물이 인지능 향상을 위한 치료제 후보임을 나타내는, 인지능을 향상시키기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 유전자의 발현 수준을 세프트리악손이 투여된 포유동물의 신경 조직에서 이의 기준 발현 수준과 비교하는 추가의 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 유전자 발현 수준이 마이크로어레이 분석법, 인 시튜 하이브리드화 조직화학법, 정량적 PCR, SAGE 분석법, 노던 블랏(Nothern blot) 분석법, 및 닷 블랏(dot blot) 분석법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 유전자가 글루타메이트 트랜스포터임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 유전자가 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항, 제 2항 및 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 조직이 해마 조직임을 특징으로 하는 방법.
  13. (a) 시험 화합물을 포유동물에 투여하는 단계;
    (b) 시험 화합물의 투여 후에 포유동물의 신경 조직에 글루타메이트 트랜스포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 유전자의 발현 수준을 시험 화합물이 투여되지 않은 포유동물의 신경 조직에서의 이의 기준 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (d) 유전자의 발현 수준이 이의 대응하는 기준 발현 수준과 차이가 있는지를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 차이가 시험 화합물이 인지능 향상을 위한 치료제 후보임 나타내는, 인지능을 향상시키기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.
  14. (a) 도 4에 나열된 유전자를 발현하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준이 시험 화합물과 상기 세포의 접촉에 의해 변화하는지를 결정하는 단계를 포함하고, 변화가 존재하는 경우 이 변화는 상기 화합물의 인지능 향상을 필요로 하는 포유동물에서 인지능을 향상시키는 능력을 나타내는, 포유동물에서 인지능 향상을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 세포가 신경 조직에서 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 세포가 불멸화된 세포임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 세포가 신경세포주, 신경교세포주, 또는 성상세포주임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14항에 있어서, 상기 유전자가 글루타메이트 트랜스포터임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항, 제 2항, 제 7항, 제 13항, 또는 제 14항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준이 증가됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항, 제 2항, 제 7항, 제 13항, 또는 제 14항에 있어서, 상기 유전자의 발현이 감소됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 7항, 제 13항, 또는 제 14항에 있어서, 시험 화합물이 소분자임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 시험 화합물이 하기 화학식(I)의 화합물임을 특징으로 하는 방법:
    상기 식에서, 각각의 기호에 대해서 개별적으로,
    L은 O 또는 S이고;
    R은 H, C1-10알킬, C1-10알콕시, 아릴, 아르알킬, -OCH2CO2H이며;
    R1은 -(CH2)n-C(O)X이고, 여기서 X는 OH, NR2, SH, O-알칼리 금속, 또는 -OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2이고 n은 0 내지 6의 정수이며;
    R2는 H, C1-10알킬, C2-8알케닐, 또는 -(CH2)a-W-R3이고, 여기서 R3는 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)NR2, 아릴, 아르알킬, 또는 A이고;
    W는 O, S, 또는 NR4이며;
    a는 1 내지 6의 정수이고
    상기에서, R4는 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, 아릴, 아르알킬이거나 R3 및 R4는 함께 치환되지 않거나 치환된 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있으며;
    선 는 단일 또는 이중 결합을 나타내고;
    R5는 R1, H, SO3H, 아릴, C1-10알킬, 아르알킬이거나, 이 이중 결합인 경우에 R5는 =CHCH2CO2H 및 =NR로 구성된 기로부터 선택되며;
    m은 0 또는 1이고;
    A는 하기 화학식(Ia)의 아릴 또는 헤테로아릴이거나 하기 화학식(Ib) 또는 (Ic)의 헤테로시클로알킬이다:
    상기 식에서, 각 기호에 대해 독립적으로,
    J는 O, S, NR6, 또는 CR6이고,
    y는 1 또는 2이며,
    상기에서 R6는 전자쌍, H, C1-10알킬, C1-10알콕시, 아릴 또는 -NR2이고,
    상기 식에서, J는 O, S, 또는 NR이고;
    X는 O 또는 H2이다.
  23. 제 21항에 있어서, 시험 화합물이 하기 화학식(II)의 화합물임을 특징으로 하는 방법:
    상기 식에서, 각 기호에 대해 독립적으로,
    X는 -OH, C1-10알콕시, -O-알칼리 금속, -N(R1)2, -SH, 또는 -S-C1-10알킬이고;
    R은 직쇄 또는 분지형 C1-30알킬이며;
    R1은 H, C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 아릴 또는 아르알킬이고;
    다만, R은 하나 이상의 -OH, C1-10알콕시, -N(R1)2, -SH, -S-C1-10 알킬, 또는 아릴에 의해 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
  24. 포유동물에서 인지능의 보존 시에 신경 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 코딩하는 다수의 cDNA 서열을 포함하는 라이브러리.
  25. 세프트리악손으로 포유동물의 치료 시에 신경 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 코딩하는 다수의 cDNA 서열을 포함하는 라이브러리.
  26. 발프로산으로 포유동물의 치료 시에 신경 조직에서 상이하게 발현되는 유전자를 코딩하는 다수의 cDNA 서열을 포함하는 라이브러리.
  27. 제 24항, 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 다수의 cDNA 서열이 글루타메이트 트랜스포터 유전자로부터 유래된 서열을 포함함을 특징으로 하는 라이브러리.
  28. 제 27항에 있어서, 글루타메이트 트랜스포터 유전자가 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 라이브러리.
  29. 제 27항에 있어서, 다수의 cDNA 서열이 존재하는 모든 서열의 20% 이상을 포함함을 특징으로 하는 라이브러리.
  30. 제 27항에 있어서, 다수의 cDNA 서열이 존재하는 모든 서열의 50% 이상을 포함함을 특징으로 하는 라이브러리.
  31. 제 27항에 있어서, 다수의 cDNA 서열이 존재하는 모든 서열의 80% 이상을 포함함을 특징으로 하는 라이브러리.
  32. 제 24항, 제 25항 또는 제 26항의 라이브러리의 원(member)에 해당하는 cDNA 서열, 개별적으로 지정된 위치에서 부착되어 있는 고형 지지체를 포함하는 마이크로어레이.
  33. 도 4에 나열된 유전자의 신경 조직 발현을 자극할 수 있는 조성물의 치료용 용도.
  34. 제 33항에 있어서, 유전자가 글루타메이트 트랜스포터임을 특징으로 하는 용도.
  35. 제 34항에 있어서, 글루타메이트 트랜스포터가 EAAT1, EAAT2, EAAT3, EAAT4, 및 EAAT5임을 특징으로 하는 용도.
  36. 제 33항에 있어서, 화합물이 소분자임을 특징으로 하는 용도.
  37. 치료학적 유효량의 하기 화학식(I)의 화합물의 치료용 용도:
    상기 식에서, 각 기호에 대해 개별적으로,
    L은 O 또는 S이고;
    R은 H, C1-10알킬, C1-10알콕시, 아릴, 아르알킬, -OCH2CO2H이며;
    R1은 -(CH2)n-C(O)X이고, 여기서 X는 OH, NR2, SH, O-알칼리 금속, 또는 -OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2이고 n은 0 내지 6의 정수이며;
    R2는 H, C1-10알킬, C2-8알케닐, 또는 -(CH2)a-W-R3이고, 여기서 R3는 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, -C(O)NR2, 아릴, 아르알킬, 또는 A이고; W는 O, S, 또는 NR4이며; a는 1 내지 6의 정수이고(상기에서, R4는 H, C1-10알킬, -C(O)C1-10알킬, 아릴, 아르알킬이거나 R3 및 R4는 함께 치환되지 않거나 치환된 헤테로알킬 또는 헤테로아릴 고리를 형성할 수 있다);
    는 단일 또는 이중 결합을 나타내며;
    R5는 R1, H, SO3H, 아릴, C1-10알킬, 아르알킬이거나, 이 이중 결합인 경우에 R5는 =CHCH2CO2H 및 =NR로 구성된 기로부터 선택되며;
    m은 0 또는 1이고;
    A는 하기 화학식(Ia)의 아릴 또는 헤테로아릴이거나 하기 화학식(Ib) 또는 (Ic)의 헤테로시클로알킬이다:
    상기 식에서,
    J는 O, S, NR6, 또는 CR6이고,
    y는 1 또는 2이며,
    여기서 R6는 전자쌍, H, C1-10알킬, C1-10알콕시, 아릴 또는 -NR2이고,
    상기 식에서, 각 기호에 대해 독립적으로,
    J는 O, S, 또는 NR이고;
    X는 O 또는 H2이다.
  38. 치료학적 유효량의 하기 화학식(II)의 치료용 용도:
    상기 식에서, 각 기호에 대해 독립적으로,
    X는 -OH, C1-10알콕시, -O-알칼리 금속, -N(R1)2, -SH, 또는 -S-C1-10알킬이고;
    R은 직쇄 또는 분지형 C1-30알킬이며;
    R1은 H, C1-10알킬, C2-10알케닐, C2-10알키닐, 아릴 또는 아르알킬이고;
    다만, R은 하나 이상의 -OH, C1-10알콕시, -N(R1)2, -SH, -S-C1-10 알킬, 또는 아릴에 의해 치화되거나 치환되지 않을 수 있다.
  39. 제 7항, 제 13항 또는 제 14항의 방법에 따라 동정된 세프트리악손 또는 발프로산 이외의 조성물의 치료용 용도.
  40. 포유동물에서 글루타메이트 트랜스포터 유전자의 신경 조직 발현을 자극하는, 포유동물의 인지능 보존을 위한 약제를 제조하는 방법.
  41. 포유동물에서 글루타메이트 트랜스포터 유전자의 신경 조직 발현을 자극하는, 포유동물의 손상된 인지능을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법.
  42. 제 33항의 조성물을 포함하는 포유동물의 인지능 보존을 위한 약제를 제조하는 방법.
  43. 제 37항의 조성물을 포함하는 인지능의 보존을 필요로 하는 포유동물의 인지능 보존을 위한 약제를 제조하는 방법.
  44. 제 38항의 조성물을 포함하는 인지능의 보존을 필요로 하는 포유동물의 인지능 보존을 위한 약제를 제조하는 방법.
  45. 제 39항의 조성물을 인지능의 보존을 필요로 하는 포유동물에게 포함하는 인지능의 보존을 필요로 하는 포유동물의 인지능 보존을 위한 약제를 제조하는 방법.
  46. 제 43항에 있어서, 포유동물이 항생제 치료가 지시되는 감염 질환의 증상이 없음을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 33항의 조성물을 포함하는 인지능의 향상을 필요로 하는 포유동물에서 인지능을 향상시키기 위한 약제를 제조하는 방법으로서,
    인지능이 공간 기억 습득, 장기 공간 기억, 및 공간 기억 복구로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  48. 세프트리악손 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 노화된 포유동물에서 인지능을 보존하기 위한 약제를 제조하는 방법.
  49. 세프트리악손 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 포유동물의 손상된 인지능을 치료하기 위한 약제를 제조하는 방법.
  50. 제 41항 또는 제 49항에 있어서, 손상된 인지능이 경증 인지능 장애, 연령-관련 인지능 손상, 기억 상실증, 노망, 및 치매로 구성된 군으로부터 선택된 질환임을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 41항 또는 제 49항에 있어서, 손상된 인지능이 알츠하이머병임을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 41항 또는 제 49항에 있어서, 포유동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 40항, 제 42항, 제 43항, 제 44항, 제 45항, 제 46항, 제 47항 또는 제 47항에 있어서, 포유동물이 인간임을 특징으로 하는 방법.
KR1020057009285A 2002-11-22 2003-11-24 인지능 손상의 치료를 위한 표적 KR20050083971A (ko)

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