CN101249091A - 治疗认知功能障碍的靶位 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明名称是：治疗认知功能障碍的靶位。本发明涉及鉴定涉及认知功能障碍的基因的方法和用于治疗认知功能障碍的组合物。本发明还涉及能刺激谷氨酸转运蛋白基因的神经组织表达的化合物在制备用于治疗哺乳动物认知功能障碍的药物中的应用。

Description

治疗认知功能障碍的靶位
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2003年11月24日；申请号：200380109146.X(PCT/US2003/038191)；发明名称：同上。
1.对相关申请的交叉引用
本申请要求享有于2002年11月22日提交的美国申请序列号60/413,152的权益，其全文并入作为参考。
2.政府支持
本发明在政府支持下完成，获得国家衰老研究所的基金第PO1AG09973号。政府拥有本发明的某些权利。
3.发明背景
由于对认知功能障碍的认识日渐增加，开发出灵敏的方法以检测功能障碍并治疗功能障碍的需求也日渐增加。存在许多病情，如痴呆(如，雷维小体痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症以及与HIV相关的痴呆)、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏症、精神分裂症、抑郁症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、轻度认知功能障碍(MCI)以及与年龄有关的认知衰退(ARCD)，灵敏地检测出认知功能障碍能使有这些病情的患者受益。
认知功能障碍(如，雷维小体痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症与HIV相关的痴呆、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、MCI和ARCD)涉及的大量病况的主要危险因素是衰老。患有这些病况的个体具有在整个病程中严重程度增加的认知症状。在未患有这些病症的情况下，衰老本身对于认知的影响对于定义疾病和正常衰老的界线是至关重要的。同时，衰老对于认知的影响可以与神经退行性疾病、确定性易获病性的病程、疾病的进展速率或其他特性相互影响。
开发认知功能障碍的检测方法和疗法的重要手段包括使用实验室动物。以动物模型描述的认知功能障碍可能扩展到人的认知功能障碍上。在与年龄相关的认知功能障碍的上下文范围中，以远系繁殖的年老的Long-Evans鼠(Charles River Laboratories；Gallagher M，等，Behav.Neurosci.107：618-626；1993)的广泛行为特征可鉴定自然发生的认知功能障碍的形式。该认知老化模型使用了在其一生中保持无病原状态的动物。在所有衰老的鼠上进行的生理机能和尸体解剖的测试被用于排除患有会干扰衰老疾病或病症研究的病况的动物。该模型的重要特点是其反映出了老年人认知衰退的变化现象。另外，该模型中的老年鼠的认知衰退的个体差异可用行为评估的方式来观察，该评估对中颞叶中相联结构的功能灵敏，该系统对人的表述性记忆至关重要。
该模型的另一个重要特点是其指导理解了造成与年龄相关的认知功能障碍的基因多样性。该对与年龄相关的认知功能障碍的遗传影响不可能是单基因的，即由单个基因中的缺失或突变造成的。单基因病很少见而且一般影响年轻人。因为它们的严重性，单基因病经常造成不能达到平均期望寿命。在人中，大量常见且严重的病情影响成年人群，随着实足年龄的增加而增加了频率和严重程度，而且这不能够归因于单个基因(比如可参见，Hegele RA.Trends Endocrinol Metab.2003 8：371-377；Shih DQ，等Curr Diab Rep.2002 2：125-134；Barlassina C，等J Am Soc Nephrol.2002 Suppl 3：S155-S164)。不断增加的证据表明成熟期发病或与衰老相关的病情的遗传组成反应出了比由单基因病造成的绝对缺陷或极大功能增进更微妙的多基因表达的改变。确定这些与年龄相关的病情的分子基础的挑战就是要鉴定基因的多样性并确认特定基因组中表达的相对小的改变是否真与远系繁殖的诸如人群的群体中的病情相关或导致这些病情。所以，利用哺乳动物远系繁殖老化模型可帮助分析海马中的多基因表达水平间的关系和在远系繁殖的年轻或老年个体中的学习能力。
用Morris水迷宫(MWM)进行的行为评估中，在迷宫周围的空间提示结构的指导下，鼠学习并记下了逃跑平台的位置。在探测试验中，利用测定动物搜索逃跑平台位置的空间偏好来测试进行认知的基础。在研究群体中的老年鼠能毫无困难地游到可见的平台上，但当隐藏平台时需要利用空间信息了，就可检测年龄决定的功能障碍了。正如许多公开报道的那样，远系繁殖的Long-Evans品种中的老年鼠的个体表现变化极大，那些鼠中的一部分表现得和年轻成体一样，但大约40-50％的落后于年轻个体表现的范围(Gallagher等Behav.Neurosci.107：618-626，1993)。年老鼠中的这种可变性反映出可靠的个体差异。所以，在年老群体中，一些动物认知功能有障碍了并被称为年老功能障碍的(AI)。其他动物认知功能没有障碍，或年老功能无障碍的(AU)。
最初表征的几周后利用MWM在新空间环境中进行的再次评估中，AI动物一如既往的有障碍，而AU动物能再次熟练表现(Colombo等Proc.Natl.Acad.Sci.94：14195-14199，1997)。在对AI和AU鼠认知能力的MWM评估中的差异甚至在间隔3个月以上时仍是可靠的(Gallagher和Burwell，Neurobiol.Aging 10：691-708，1989)。另外，MWM中的AI和AU特征能区分在其他行为任务中同样年龄个体的表现，所述行为任务需要同样的认知功能，如Barnes圆形迷宫(Gallagher和Burwell Neurobiol.Aging 10：691-708，1989)和放射状臂形迷宫(RAM)。这种啮齿动物年老群体中自然产生的功能障碍显示认知老化是不可避免的或严格与实足年龄相联系，而且重要的是，它提供了机会用以比较造成衰退或持久记忆的大脑变化的轨迹。利用该模型的其他背景研究显示认知功能障碍的发生并不依赖于包括神经元缺失或相关回路的广泛退化的神经退行(Rapp和Gallagher Proc.Natl.Acad.Sci.93：9926-9930，1996)。所以，该模型可能是比要测定神经元缺失影响的准备工作更灵敏的认知老化测试方法。
除了可靠性之外，该模型所用的认知评估已经证明能对相关大脑系统的老化影响灵敏。在AU和AI鼠的神经回路中显示有显著的生物学差异产生了，该回路对MWM中评估的认知功能至关重要。例如，相对于AU并年轻的鼠，AI鼠中的海马神经元对某些化学递质具有减弱的应答，如乙酰胆碱和谷氨酸(Nicolle等J.Neurosci.19：9604-9610，1999)。在谷氨酸受体亚型的解剖分布研究中，利用该模型可揭示出减少了红藻氨酸盐(kainate)结合在海马的CA3区域，该区域仅限于年老无障碍的鼠中并与年轻和年老障碍的鼠有区别(Nicolle等Neuroscience 74：741-756，1996)。存在有越来越多对认知功能障碍生物和遗传基础理解的需求。
4.发明简述
在一个方面，本发明描述了一种鉴别与诸如哺乳动物的个体所预期行为相关的基因的方法，其包括提供一个具有预期行为的测试个体的群体，提供一个缺少预期行为的对照个体的群体，各自分离并合并来自测试和对照群体的神经组织如海马的表达的RNA，在每个对照和测试RNA合并库中测定大量基因的表达水平并从大量基因中选出一个基因，所述基因的表达水平在哺乳动物的测试群体和对照群体间有差异。选择的基因是与预期行为相关的候选基因。可通过任何合适的方式来检测大量基因的表达水平，如微阵列分析、原位杂交组化、定量PCR、SAGE分析、Northern印迹分析或点印迹分析，或通过合适的方法来测量蛋白质水平，包括Western印迹、蛋白质槽印迹或蛋白质阵列。大量基因可包括涉及谷氨酸转运的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸转运蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神经元间突触间隙和/或突触外空间中谷氨酸分解代谢的基因，如天冬氨酸氨基转移酶。优选地，从大量基因中选出的基因显示出增加的表达水平。可选地，选出的基因显示出减少的表达水平。
在另一方面，本发明描述了一种鉴别与个体预期认知功能相关的基因的方法，其包括提供一个具有预期认知功能的哺乳动物测试群体，提供一个缺少预期认知功能的哺乳动物对照群体，各自分离并合并来自测试和对照群体的神经组织如海马的表达的RNA，在每个对照和测试RNA合并库中测定大量基因的表达水平并从大量基因中选出一个基因，所述基因的表达水平在哺乳动物的测试群体和对照群体间有差异。选择的基因是与预期认知功能相关的候选基因。可通过任何合适的方式来检测大量基因的表达水平，如微阵列分析、原位杂交组化、定量PCR、SAGE分析、Northern印迹分析或点印迹分析，或通过合适的方法来测量蛋白质水平，包括Western印迹、蛋白质槽印迹或蛋白质阵列。大量基因可包括涉及谷氨酸转运的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同于谷氨酸转运蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神经元间突触间隙和/或突触外空间中谷氨酸分解代谢的基因，如天冬氨酸氨基转移酶。优选地，从大量基因中选出的基因显示出增加的表达水平。可选地，选出的基因显示出减少的表达水平。
本发明的另一个方面涉及一种筛选用于促进认知功能的化合物的方法，其包括向诸如哺乳动物的个体给药测试化合物，在给药所述测试化合物后测定所述个体的诸如海马的神经组织中的基因的表达水平，将所述基因的所述表达水平与个体神经组织参考表达水平进行比较，其中该个体没有给药所述测试化合物，并测定所述基因的表达水平是否与相应参考表达水平有差异，其中所述差异显示测试化合物为促进认知功能的候选治疗剂。测试化合物可以是小分子，如但不限于式I，II或III所示的那些分子。其他方法可以包括将所述基因的表达水平与个体神经组织参考表达水平进行比较，其中向该个体给药了头孢曲松。可通过任何合适的方式来检测基因的表达水平，如微阵列分析、原位杂交组化、定量PCR、SAGE分析、Northern印迹分析或点印迹分析，或通过合适的方法来测量蛋白质水平，包括Western印迹、蛋白质槽印迹或蛋白质阵列。基因可以是涉及谷氨酸转运的，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或可以是涉及神经元间突触间隙和/或突触外空间中谷氨酸分解代谢的，如天冬氨酸氨基转移酶。优选地，从大量基因中选出的基因显示出增加的表达水平。可选地，选出的基因显示出减少的表达水平。
本发明的另一个方面涉及一种筛选用于促进认知功能的化合物的方法，其包括向诸如哺乳动物的个体给药测试化合物，在给药所述测试化合物后测定所述个体的诸如海马的神经组织中的谷氨酸转运蛋白基因的表达水平，将所述基因的所述表达水平与个体神经组织参考表达水平进行比较，其中该个体没有给药所述测试化合物，并测定所述基因的表达水平是否与相应参考表达水平有差异，其中所述差异显示测试化合物为促进认知功能的候选治疗剂。测试化合物可以是小分子，如但不限于式I，II或III所示的那些分子。可通过任何合适的方式来检测基因的表达水平，如微阵列分析、原位杂交组化、定量PCR、SAGE分析、Northern印迹分析或点印迹分析，或通过合适的方法来测量蛋白质水平，包括Western印迹、蛋白质槽印迹或蛋白质阵列。优选地，从大量基因中选出的基因显示出增加的表达水平。可选地，选出的基因显示出减少的表达水平。
一种筛选用于促进诸如哺乳动物的个体的认知功能的化合物的方法，包括如下步骤：将测试化合物与表达图4所列基因的细胞接触，如，谷氨酸转运蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基转移酶或垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽(PACAP)，并测定所述基因的表达水平是否由于所述细胞接触所述测试化合物而改变，如果存在所述改变则显示所述化合物有能力促进诸如哺乳动物的个体所需的认知功能。化合物可以是小分子，如式I，II或III所示的那些分子。细胞可以来源于神经组织，如培养的神经元、培养的神经胶质或初级神经元培养基；或可以是永生化的细胞、神经元细胞系、神经胶质细胞系或星形细胞细胞系。优选地，从大量基因中选出的基因显示出增加的表达水平。可选地，选出的基因显示出减少的表达水平。
本发明上述每一个方面中所用的测试化合物可以是小分子，如任何第三代头孢菌素(头孢磺吡苄、头孢氨噻、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、拉氧头孢和头孢他啶)、丙戊酸或MS-153。另外，测试化合物可以活化基因表达，包括选自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的谷氨酸转运蛋白，或天冬氨酸氨基转移酶基因。可选地，测试化合物可以是基因表达的抑制剂。
在另一方面，本发明描述了一种文库，其包括大量编码基因的cDNA序列，所述基因由于在哺乳动物中保持认知功能而在哺乳动物神经组织中差异表达。优选地，文库包括编码基因的cDNA序列，所述基因由于用头孢曲松、丙戊酸或MS-153对哺乳动物处理而在神经组织中差异表达。文库可以包括源于谷氨酸转运蛋白基因的cDNA序列，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或源于天冬氨酸氨基转移酶的序列。文库包含的cDNA至少有20％、50％或80％的序列源于谷氨酸转运蛋白基因。
本发明的另一方面是一种包括微阵列芯片，其包括其上各个编址位置上附有cDNA序列的固相支持物，cDNA序列与上述cDNA文库的成分相对应，如那些在神经组织中由于个体认知功能的保持或由于用头孢曲松或丙戊酸处理个体而造成差异表达的cDNA序列。微阵列芯片的成分包括选自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的谷氨酸转运蛋白或天冬氨酸氨基转移酶序列。
本发明也描述了一种药物组合物，包括有效治疗量的刺激化合物，所述化合物刺激图4所列基因的神经组织中的表达，所述基因是例如谷氨酸转运蛋白基因EAAT1、2、3、4或5、天冬氨酸氨基转移酶或垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽(PACAP)。药物组合物还可以包含小分子。
在另一个方面，本发明描述了一种药物组合物，包括有效治疗量的式I、II或III化合物。可选的，药物组合物可包含除了头孢曲松或丙戊酸的有效治疗量的化合物，其由通过将化合物给药给诸如哺乳动物的个体或细胞来筛选用于促进认知功能的化合物的方法来鉴定，并在暴露或不暴露于化合物的条件下，测定在那些个体或细胞间的差异化的基因表达。这些化合物是促进认知功能的候选化合物。
本发明的另一方面描述了一种在诸如人的哺乳动物中保持认知功能或在诸如人的哺乳动物中治疗认知功能障碍的方法，该方法通过刺激涉及在神经组织中谷氨酸运输或谷氨酸分解代谢的神经组织的基因表达来进行。另外，在诸如人的哺乳动物中保持认知功能需要包括给药一种药物组合物，其能刺激图4所列基因的神经组织表达，所述基因是例如谷氨酸转运蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基转移酶或垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽(PACAP)。
本发明也描述了一种在诸如人的哺乳动物中保持认知功能的方法，需要包括给药一种药物组合物，其为下式任意一种小分子：I、II或III。对于在诸如人的哺乳动物中保持认知功能的方法，需要包括给药式I的化合物，则哺乳动物不出现作为抗生素治疗适应症的传染病的症状。
本发明也描述了在诸如人的哺乳动物中促进认知功能，需要包括向所述哺乳动物给药一定量的药物组合物，其刺激图4所列基因的神经组织的表达从而足以促进以下认知功能：空间记忆的获得，长期空间记忆或空间记忆恢复。本发明也描述了在年老的诸如人的哺乳动物中保持认知功能或治疗认知功能障碍，并治疗诸如人的哺乳动物中的有障碍的认知功能，该方法需要通过向哺乳动物给药有效治疗量的头孢曲松或其类似物或衍生物，丙戊酸或其类似物或衍生物或MS-153或其类似物或衍生物来进行。在哺乳动物表现出有障碍的认知功能的情况下，有障碍的认知功能可以与以下病情相关：轻度认知功能障碍、与年龄相关的认知衰退、记忆力衰退、衰老或痴呆。另外，在哺乳动物表现出有障碍的认知功能的情况下，有障碍的认知功能可能与阿耳茨海默症有关。
基于以下详细说明和权利要求书，本发明的其他特点和优点将是显而易见的。
5.简要附图说明
图1是描述了在MWM评估中年轻和年老的大鼠的行为特征的图。
图2是描述了10只年老的大鼠在初始MWM表征与它们在RAM中的记忆力表现之间的可靠性的图。
图3是概述了哺乳动物谷氨酸转运蛋白及其人类同源体在各种脑组织中发现的不同细胞类型中的分布的图表。
图4是概述了在年轻(Y)、年老有障碍的(AI)和年老无障碍(AU)的动物中利用微阵列反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的表达情况的图表。
图5是概述了在年轻(Y)、年老有障碍的(AI)和年老无障碍(AU)的动物中利用原位组化反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的丰度的图表。
图6是描述了在用头孢曲松治疗(每天注射200mg/kg im，持续一周)的AI大鼠中减少的记忆错误的图表。
6.发明详细说明
为了方便起见，在说明书、实施例和所附的权利要求书中所使用的某些术语集中在此。除非另有定义，此处所用的技术和科学术语具有如同本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同意义。
6.1定义
此处所用的冠词“一”和“这”指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法用语。例如，一要素指一个要素或多于一个的要素。
此处所用的″年老″指哺乳动物处在或接近其平均生命跨度的终点。例如，年老大鼠约为24-30个月大的年龄。年老的人为70岁或以上。
术语″脂肪族″为公认的表述，其指直链、支链、环状烷烃、烯烃或炔烃。在一些具体实施方式中，本发明的脂肪族基团为直链或支链并具有1至约20个碳原子。
术语″烷基″为公认的表述，其包括饱和的脂肪族基团，包括直链烷基基团，支链的烷基基团、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在一些具体实施方式中，直链或支链烷基在其主链中具有约30个或更少的碳原子(如，C1-C30直链、C3-C30支链)，并可选地，约20个或更少。同样，环烷基在其环状结构中具有约3至10个碳原子，并可选地在环状结构中有约5、6或7个碳。术语″烷基″也被定义可包括卤代的烷基。
术语″胺″和″氨基″为公认的表述，其指未取代和取代的胺，如以下通式所代表的部分：
Figure A20081008253500141
其中R50、R51和R52各自独立地代表氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R61或R50和R51和N原子结合在一起形成在环结构中具有4至8个原子的杂环；R61代表芳基、环烷基、环链烯基、杂环或多环；而且m等于零或为1-8整数。在一些具体实施方式中，R50或R51中仅有一个是羰基，如，R50、R5和氮一起并不形成亚胺。在其它具体实施方式中，R50和R51(并任选R52)各自独立地代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R61。所以，术语″烷基胺″包括胺基，如上所定义，其上附有取代的或未取代的烷基，即R50和R51中至少一个是烷基。
术语″酰氨基″为公认的表述，其指如以下通式所代表的部分：
Figure A20081008253500142
其中R50如上定义，而且R54代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定义。
术语″氨基甲酰基″为公认的表示作氨基-取代的羰基，其包括如以下通式所代表的部分：
Figure A20081008253500151
其中R50和R51如上定义。本发明中某些氨基的具体实施方式包括可能不稳定的亚胺。
术语″烷硫基″指烷基基团，如上定义，其具有附于其上的硫基。在一些具体实施方式中，″烷硫基″部分代表-S-烷基、-S-链烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R61中的一个，其中m和R61如上定义。有代表性的烷硫基基团包括甲硫基、乙基基等等。
术语″芳烷基″为公认的表述，其指用芳基基团(如，芳香族或芳香杂环基团)取代的烷基。
术语″链烯基″和″炔基″为公认的表述，其指不饱和的脂肪族基团，在长度以及可能的取代方面与如上所述的烷基类似，但各自至少包含一个双键或三键。
除非碳的数目另外指出，″低级烷基″指烷基，如上定义，只具有1至10个碳，可选地在其主链结构中有1至约6个碳原子。同样，″低级链烯基″和″低级炔基″具有相似的链长。
术语″烷氧基的″或″烷氧基″为公认的表述，其指烷基，如上定义，其上附有氧基。有代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等等。″醚″为两个碳氢化合物通过氧共价连结形成的。因此，使烷基成为醚的烷基取代基是或类似于烷氧基，如可以用-O-烷基、-O-链烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R61中之一来表示，其中m和R61如上所述。
此处所用的″类似物″指功能上与另一个化学物质相似的化合物，但其并不共有完全一样的化学结构。例如。头孢曲松类似物与头孢曲松足够相似，尽管与头孢曲松的结构有微小差异，但其能在治疗应用中替代头孢曲松。
此处所用的术语″阵列″和″矩阵″指在设备上可编址的位置或“地址”的排列。位置可以排列成两维阵列、三维阵列，或其他矩阵形式。位置的数量能从几个直至至少数十万。最重要的是，每个位置代表完全独立的反应位点。“核酸阵列”指包含核酸探针的阵列，如寡核苷酸或基因的较大部分。在阵列上的核酸可以是单链的1。探针为寡核苷酸的阵列被称为″寡核苷酸阵列″或″寡核苷酸芯片”。″微阵列″，在此也被称为“生物芯片”、“生物学芯片”或“基因阵列”，是一种具有密度至少约100/cm2离散区域的阵列，密度优选地至少约1000/cm2。微阵列中的区域具有典型的尺寸，如直径范围在约10-250μm之间，并在阵列中与其他区域以约相同距离分隔。
此处所用的″天冬氨酸氨基转移酶″指催化草酰乙酸和谷氨酸转变成天冬氨酸和2-酮戊二酸的酶(E.C.2.6.1.1)，以及编码具有天冬氨酸氨基转移酶活性的氨基酸的核酸和同源物(如可参见，GenBank登录号：BC000498或XM_062678)。天冬氨酸氨基转移酶涉及突触间隙和突触外空间中的谷氨酸催化。前述的同源物相信存在于其他哺乳动物中，包括灵长类、犬科、猫科和啮齿动物。
此处所用的″β-抑制蛋白2″指细胞内支架/适应连接蛋白质，其帮助从活化的G蛋白质-偶联受体处转送额外的信号。另外，这些蛋白质涉及穿膜受体内吞的内吞作用中。β-抑制蛋白2也指编码抑制蛋白蛋白质的核酸。前述的同源物相信存在于其他哺乳动物中，包括灵长类、犬科、猫科和啮齿动物。
术语″碳环″为公认的表述，其指芳香族或非芳香族的环，其中环上的每个原子都是碳。
术语″羰基″为公认的表述，其包括如以下通式所代表的那些部分：
Figure A20081008253500171
其中X50为键或代表氧或硫，而R55和R56代表氢、烷基、链烯基、-(CH2)m-R61或药学上可接受的盐，R56代表氢、烷基、链烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定义。当X50为氧而R55或R5不为氢，则该分子式代表“酯”。当X50为氧而R5如上定义，则该部                              1CDNA阵列可以是双链的。分在此被称为羧基，并且尤其当R55为氢时，则该分子式代表″羧酸″。当X50为氧而R56为氢，则该分子式代表″甲酸″。一般而言，当以上分子式的氧原子替换为硫，则该分子式代表″硫代羰基″基团。当X50为硫而R55或R56不为氢，则该分子式代表″硫代酯″。当X50为硫而R55为氢，则该分子式代表″硫代羧酸″。当X50为硫而R56为氢，则该分子式代表″硫代甲酸″。在另一方面，当X50为键而R55不为氢，则以上分子式代表″酮″基。当X50为键而R55为氢，则以上分子式代表″醛″基。
术语″手性″为公认的表述，其指具有镜像体不能重叠的性质的分子，而术语″非手性″指镜像体能重叠的分子。″原手性分子″指在特定过程中有转化成手性分子潜力的分子。
术语″顺式″为公认的表述，其指在一个双键边上的2个原子或基团的排列方式，使得这些原子或基团原子或基团处在双键的同一侧。顺式构型通常标示为(Z)构型。
此处所用的″认知功能″指较高层次的智力、大脑过程，其涉及学习和记忆，包括但不仅限于，注意力、掌握、短期记忆、长期记忆和记忆恢复、以及表达对周遭和自身的兴趣。在动物模型系统中，可用现有大量方式测定认知功能，包括利用以下设施：Morris水迷宫、Barnes圆形迷宫、升高的辐射臂状迷宫、T形迷宫或任何其他个体要运用空间信息的迷宫。现有已知的其他测试可用于评估认知功能，如恐惧状态、积极躲避、明亮的开放区域、黑暗活跃度计量、升高的正型迷宫、双室探险测试或强迫游泳测试。人类中，可以不受限制的测量认知功能。测量通过阿耳茨海默症评估级别-认知亚级别(ADAS-cog)；临床全球印象的变化级别(CIBIC-正级别)；阿耳茨海默症协作研究运动的每日生活级别(ADCS-ADL)；迷你精神状态检测(MMSE)；神经精神病学目录(NPI)；临床痴呆等级级别(CDR)；剑桥神经心理自动测试组(CANTAB)或Sandoz临床评估-老年病(SCAG)来进行。另外，可以利用成像技术来测量认知功能，如正电子发射断层撮影法(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、单光子发射计算断层撮影法(SPECT)或任何其他可测定大脑功能的成像技术。
″促进″认知功能指影响有障碍的认知功能从而使之更类似于与年龄相符的正常、无障碍个体的功能，其包括影响认知功能已减少的状态，如，相对于正常个体减少约10％、30％、50％、75％、90％或95％。可将认知功能促进到任何可检测的程度，但优选足以促进到使有障碍的个体能进行每日正常生活行为。
″保持″认知功能指影响正常或有障碍的认知功能从而使之不衰退或不降至个体首次表现或诊断观察值以下。
″有障碍的认知功能″指与年龄相符的正常个体所观察到状况相比，不如其强健的认知功能，其包括认知功能已减少的状态，如，相对于年龄相符的正常个体测量到的认知功能，减少约10％、30％、50％、75％、90％或95％。有障碍的认知功能可能与许多疾病或病症相关，包括痴呆(如，雷维小体痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症以及与HIV相关的痴呆)、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏症、精神分裂症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、轻度认知功能障碍(MCI)以及与年龄有关的认知衰退(ARCD)。可选地，有障碍的认知功能可以在个体中显现，但不作为可诊断的疾病或病症出现。例如，有障碍的认知功能可以由个体中的细微代谢、毒性、神经毒、因治疗而引起的、热量或化学变化而造成的。这些细微改变包括但不仅限于，局部缺血、供氧不足、脑血管意外、外伤、外科手术、压力、质量效应、出血、辐射、血管痉挛、神经变性疾病或病症。
此处所用的″对照群体″指缺少与认知功能相关的预期行为的哺乳动物，其通常包括不年轻的哺乳动物。
术语″共价键″为公认的表述，其指在2个原子间的键，其中电子静电吸附于这2个原子的核上，而且在核间增加的电子密度的净效应等于核间排斥力。当键与金属离子连在一起时，术语共价键包括等同的键。
术语″组合文库″或″文库″为公认的表述，其指大量被术语称为“成分”的化合物，在文库中它们从一种或多种起始原料通过运用相同或不同的反应物或反应条件合成或制备而来的。有大量其他术语(以及其他技术)与组合文库相关。术语″鉴定标签″为公认的表述，其指记录一系列用于合成化学文库的反应步骤的手段。术语″固定″为公认的表述，并且当用于种类物时，其指一种状态及种类物的行为，其中种类物附着于有吸附力的表面上，该吸附力大于所用环境对表面所用的吸附力。术语″固相支持物″为公认的表述，其指不能溶解的基质材料，并可以(任选)具有坚硬的或半坚硬的表面。术语″接头″为公认的表述，其指连接支持物的分子的分子或基团，包括固相支持物或聚合支持物，以及组合文库的成分。术语″聚合支持物″为公认的表述，其指可溶或不溶的聚合物，其中化学部分可通过反应与聚合支持物的功能性基团共价键合。术语″聚合支持物的功能性基团″为公认的表述，其指聚合支持物的化学部分，聚合支持物能与化学部分反应形成聚合物支持的氨基酯。
此处所用的″衍生物″指化合物如，头孢菌素或丙戊酸的化学修饰。化合物的化学修饰可包括诸如，以烷基、酰基或氨基替代氢。也可能是其他许多修饰。化合物的衍生物保持原化合物至少一个功能性质。
此处所用的″预期行为″指如正常、无障碍个体中所观察到的认知功能的行为表现。例如，动物中的预期行为反映了动物的认知功能，可用以下设施测量，如Morris水迷宫、Barnes圆形迷宫、升高的辐射臂状迷宫、T形迷宫；或通过许多测试之任一，如恐惧状态、积极躲避、明亮的开放区域、黑暗活跃度计量、升高的正型迷宫、双室探险测试或强迫游泳测试。在人类中，预期行为反映了个体的认知功能，可用个体进行每日正常生活行为的能力来测量或可以实施大量认知功能测试来测量，包括但不仅限于，ADAS-cog、CIBIC-正级数、ADCS-ADL、MMSE、NPI、CDR、CANTAB或SCAG。
术语″杂原子″为公认的表述，其指除了碳或氢之外的元素的原子。示例的杂原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。
术语″芳基″为公认的表述，其指5-、6-和7-元单环芳香族基团，其可以包括零至4个杂原子，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等等。那些在环结构中具有杂原子的芳基基团也可被称为″杂芳基”。芳环可以用如上所述的那些取代基在一个或多个环上的位置上进行取代，例如，卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、氨基甲酰基、磷酸酯、亚磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。术语″芳基″也包括具有2个或多个环的多核环系统，其中邻接的环共同拥有2个或多个碳原子(环为“稠环”)，其中至少有一个环是芳香族的，如，其他环可以是环烷基、环链烯基、环炔基、芳基和/或杂环基。
术语邻、间和对为公认的表述，其分别指1，2-、1，3-和1，4-二取代的苯。例如，称为1，2-二甲苯和邻二甲苯的就是同义词。
术语″杂环基″或″杂环基团″为公认的表述，其指3-至约10-元环结构，可选地3-至约7-元环结构，其环结构包括1至4个杂原子。杂环也可以是多环。杂环基基团包括诸如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、色烯、氧杂蒽、苯氧杂蒽、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹嗪、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、诸如氮杂环丁烷内酰胺和吡咯烷内酰胺的内酰胺、磺内酰胺、磺酸内酯等等。杂环可以用如上所述的那些取代基在一个或多个位置上进行取代，例如，卤素、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、氨基甲酰基、磷酸酯、亚磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。
此处所用的″差异表达″指组织中感兴趣的基因的有差别的表达水平，包括定量和定性的测定，所述组织有差别地处理或暴露于不同的环境因子中或改变生理环境。
此处所用的″基因″或″基因序列″指基因的部分或完整的编码序列、其互补物及其5′或3′未翻译区域。基因的″编码序列″指出现在基因mRNA转录中的那套核苷酸。″基因表达″指制备或转录基于基因DNA序列的RNA的过程。基因表达的“活化剂”指刺激基因的DNA序列转录为RNA转录体的化合物。″内源″基因为在物种中天然存在的基因，不需要人工整合，如随机插入或转染进生物体或细胞的基因组中。
此处所用的″谷氨酸转运蛋白″指穿膜蛋白质，其能从细胞外空间中，包括突触间隙和突触外空间，去除L-谷氨酸，即哺乳动物中枢神经系统(CNS)中的初级兴奋神经递质。可以在神经元和神经胶质细胞的膜中发现谷氨酸转运蛋白。在人类中已经鉴定了几种谷氨酸转运蛋白，其包括诸如，溶质载体蛋白家族1成员1(SLC1A1或EAAC1或EAAT3；例如GenBank登录号：NM_004170)、溶质载体蛋白家族1成员2(SLC1A2或EAAT2或GLT1；例如登录号：NM-_0041710)、溶质载体蛋白家族1成员3(SLC1A3或EAAT1、GLAST或GLAST1；例如登录号：NM_004172)、溶质载体蛋白家族1成员6(SLC1A6或EAAT4；例如GenBank登录号：NM_005071)和溶质载体蛋白家族1成员7(SLC1A7或EAAT5；例如GenBank登录号：NM_006671)。另外，在Rattus norvegicus和Mus musculus中已经鉴定了谷氨酸转运蛋白(Slc1a1/Eaac1/REAAC1、Slc1a2/GluT/GLT-1/GluT-R、Slc1a3/Eaat1/GLAST/GluT-1和Slc1a6/Eaat4)。上述同源物据信存在于其他哺乳动物中，包括灵长类、犬科、猫科和啮齿动物。通过给药能增加谷氨酸转运蛋白的谷氨酸转运活性的试剂，能增加谷氨酸转运蛋白的活性。已报道的能增加谷氨酸转运蛋白活性的试剂的例子包括诸如，((R)-(-)-5-甲基-1-烟酰基-2-吡唑啉(MS-153；Shimada等，EurJ Pharmacol.386：263-70，1999)；利多卡因(Do等，AnesthAnalg.95：1263-8，2002)和激酶抑制剂(如，Conradt，J Neurochem.68：1244-51，1997)。
此处所用的基因″表达水平″指基因表达的水平，可通过任何用于检测基因表达存在、极限量、定量、定性的测试方法来测定，如，通过测定mRNA水平(如，通过″Northern印迹″或″微阵列分析″)或蛋白质(如，通过检测全长或截短多肽基因产物的量(如，用抗体的免疫学方法))。
术语″内消旋化合物″为公认的表述，其指具有至少两个手性中心但由于平面或点对称而无手性的化合物。
此处所用的″促代谢谷氨酸受体″(mGluR)指G蛋白质-偶联的受体，其对神经递质谷氨酸做出反应。基于它们的基本序列相似性、信号转换联系和药理学图谱，有3组mGluR。组I由mGluRl(mGluRla、mGluRlb、mGluRlc、mGluRld；如，GenBank登录号NM_000838所示的人mGluRla剪切变体)和mGluR5(mGluR5a、mGluR5b；如，GenBank登录号NM_000842所示的人mGluR5a剪切变体)组成，其确定与磷脂酶C偶联。组II由mGluR2(如，GenBank登录号NM_000839)和mGluR3(如，GenBank登录号NM_000840)组成，其不与腺苷酸环化酶相联。组II由mGluR4(mGluR4a、mGluR4b；如，GenBank登录号NM_000841)，mGluR6(如GenBank登录号NM_000843)，mGluR7(mGluR7a、mGluR7b；如，GenBank登录号NM_000844所示的人mGluR7a剪切变体)和mGluR8(如，GenBank登录号NM_000845)组成，其不与腺苷酸环化酶相联。对于各个mGluR组，有大量可从商业渠道获得激动剂和拮抗剂。例如，组I的激动剂包括但不限于L-使君子氨酸((L)-(+)-α-氨基-3，5-二氧代-1，2，4-噁二唑烷-2-丙酸)、(S)-3，5-二羟基苯基甘氨酸((S)-3，5-DHPG)、反式氮杂环丁烷-2，4-二甲酸(tADA)、(1S，3R)-1-氨基环戊烷-1，3-二甲酸((1S，3R)-ACPD)和(RS)-2-氯-5-羟基苯基甘氨酸(CHPG)；而拮抗剂包括但不限于(S)-4-羧基-3-羟基苯基甘氨酸((S)-4C3HPG)、7-(羟基亚氨基)环丙烯并[b]苯并吡喃-1a-甲酸乙酯(CPCCOEt)、(RS)-1氨基茚满-1，5-二甲酸(AIDA；UPF523)、2-甲基-6-(苯基乙炔基)吡啶(MPE盐酸盐)、2-甲基-6-(2-苯基乙烯基)吡啶(SIB-1893)、6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡啶酚(SIB-1757)和(S)-(+)-α-氨基-4-羧基-2-甲基苯乙酸(LY367385)。组II的激动剂包括(2S，2′R，3′R)-2-(2′，3′-二羧基环丙基)甘氨酸(DCGIV)、(2S，1′S，2′S)-2-(羧基环丙基)甘氨酸(L-CCG-I；(2S，3S，4S)-CCG)、(S)-3羧基-4-羟基苯基甘氨酸((S)-3C4HPG)和(2R，4R)-4-氨基吡咯烷-2，4-二甲酸((2R，4R)-APDC)；而拮抗剂包括(2S)-α-乙基谷氨酸(EGLU)和(2S)-2-氨基-2-[(1S，2S)-2-羧基环丙-1-基]-3-(黄嘌呤-9-基)丙酸(LY341495)。组III的激动剂包括(1S，3R，4S)-1-氨基环戊烷-1，2，4-三甲酸(ACPT-I)、L(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸(L-AP4)、(R，S)-4-膦酰基苯基甘氨酸((R，S)-PPG)和O-磷酸-L-丝氨酸(L-SOP)；而拮抗剂包括(RS)-α-环丙基-4-膦酰基苯基甘氨酸(CPPG)、(S)-2-氨基-2-甲基-4-膦酰基丁酸(MAP4)和(RS)-α-甲基丝氨酸-O-磷酸酯(MSOP)。近来的证据表明与神经胶质相关的促代谢谷氨酸受体能改变谷氨酸转运蛋白的表达(Aronica等，Eur.J.Neurosci.2003；17：2106-18，2003)。
此处所用的″中年″指已经过了性成熟期的哺乳动物，即，不年轻但也不接近物种的平均寿命跨度，即，不年老。例如，中年鼠约12-18个月大。中年的人在20至70岁之间。
此处所用的″神经组织″指神经系统的组织，即包含神经元和神经胶质的组织。特别指明，神经组织可以指特定在大脑中发现的结构，包括“海马组织”。海马组织指在颞皮层发现的海马状结构，包括：内鼻层、前下托、脑下脚、原脑下脚、齿状回、以及已知为CA1、CA2、CA3和CA4的区域。海马涉及的过程如短期记忆、长期记忆的形成、记忆恢复、表述性记忆和空间导航。
此处所用的″神经保护″指组合物和治疗方法，其具有减少、阻止或改善有障碍的认知功能的作用，并保护、恢复或回复遭受有障碍的认知功能的组织。
术语″硝基″为公认的表述，其指-NO2；术语″卤素″为公认的表述，其指-F、-Cl、-Br或-I；术语″巯基″为公认的表述，其指-SH；术语″羟基″指-OH；而术语″磺酰基″为公认的表述，其指-SO2-。″卤化物″指具有相应的卤素阴离子，而“类卤化物”按照Cotton和Wilkinson的《高级无机化学》第560页中的定义。
术语″磷酰基″为公认的表述，其一般可以由以下通式表示：
Figure A20081008253500241
其中Q50表示S或O，而R59表示氢，低级烷基或芳基。当用于取代时，如烷基，则磷酰烷基的磷酰基团一般可以由以下通式表示：
Figure A20081008253500242
其中Q50和R59各自独立地如上所定义，而Q51代表O、S或N。当Q50为S时，磷酰基部分为″硫代磷酸酯″。
术语″磷酰胺酸酯″为公认的表述，其可以由以下通式表示：
Figure A20081008253500251
其中Q51、R50、R51和R59如上定义。
术语″膦胺酸酯″为公认的表述，其可以由以下通式表示：
Figure A20081008253500252
其中Q51、R50、R51和R59如上定义，而R60代表低级烷基或芳基。
可以向链烯基和炔基进行类似的取代从而产生诸如，氨基链烯基、氨基炔基、氨基甲酰基链烯基、氨基甲酰基炔基、亚氨基链烯基、亚氨基炔基、链烯硫基、炔硫基、羰基-取代的链烯基或炔基。每个表述的定义，如，烷基、m、n等等，在任何结构中出现多于一次时，其意指在同一结构中各处进行独立的定义。
术语″硒代烷基″为公认的表述，其指其上附带有取代的硒基基团的烷基。示例的″硒醚″可以在烷基进行取代，选自-Se-烷基、-Se-链烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R61，m和R61如上定义。
术语三氟甲烷磺酰基、甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁烷磺酰基为公认的表述，其分别指三氟甲烷磺酰基、对甲苯磺酰基、甲磺酰基和九氟丁烷磺酰基基团。术语三氟甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯为公认的表述，其分别指三氟甲烷磺酸酯、对甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯的功能基团及包含所述基团的分子。
缩写Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分别代表甲基、乙基、苯基、三氟甲烷磺酰磺酰基、九氟丁烷磺酰基、对甲苯磺酰基和甲磺酰基。本领域普通技术人员所用的有机化学缩写的更全面的列表参见Journal of Organic Chemistry每一卷的第一期；该列表一般出现在称为标准缩写列表的表格中。
此处所用的″垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽″(PACAP)指神经多肽，其为cAMP-依赖性信号途径的有效的活化因子。PACAP起多功能肽的作用并涉及多种过程，如调节激素分泌、能量代谢、神经元存活，而且它是神经胶质谷氨酸转运蛋白EAAT1和EAAT2的调节因子(Figiel和Engele，J.Neurosci.15：3596-3605，2000)。PACAP属于选凝素/胰高血糖素/血管活性肠肽(VIP)超家族，并存在源于相同前体的两种酰胺化形式，即PACAP38(38-氨基酸残基)和PACAP27(27-氨基酸残基)。PACAP的主要结构在被囊动物、鱼类、两栖类和哺乳动物的整个进化中高度保守，而且在果蝇中也测定出了PACAP-样神经肽。除了PACAP-38和PACAP-27，PACAP受体的第三类激动剂为Maxadilian。Maxadilan是有效的血管扩张肽，其从吸血沙地蝇的唾液腺提取物中分离而得。近来已证实，尽管maxadilan同PACAP没有明显的氨基酸序列同源性，但在哺乳动物中，maxadilan与PACAP受体1型结合(Moro和Lerner：Maxadilan，J.Biol.Chem.272(2)：966-70，1997)。PACAP及其受体主要都分布在神经和内分泌系统中，显示出高效的多效性功能。所以，激发PACAP受体的PACAP肽、Maxadilan或肽衍生物和类似物、肽-样化合物和小分子激动剂能用于增加谷氨酸转运蛋白的活性。
术语″多环″或″多环基团″为公认的表述，其指2个或多个环(如，环烷基、环链烯基、环炔基、芳基和/或杂环基)，其中2个邻接的环共同拥有2个或多个碳，如，环是″稠环″。通过非邻接的原子连接的环术语称作“桥”环。多环的每个环可用如上所述的那些取代基来取代，例如，卤素、烷基、芳烷基、链烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、氨基甲酰基、磷酸酯、亚磷酸酯、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳化合物部分、-CF3、-CN等等。
此处所用的″大量″指2或更多。
术语″前药″为公认的表述，其意为包含在生理条件下能转化为本发明抗菌剂的化合物。制备前药的普通方法是选择在生理条件下能水解成预期化合物的部分。在其它具体实施方式中，通过宿主动物的酶活性来转化前药。
术语″保护基团″为公认的表述，其指临时保护潜在反应功能基团不发生不要的化学转化的取代基。这些保护基团的实例分别包括羧酸酯、醇的甲硅烷基醚及醛和酮的乙缩醛和缩酮。化学保护基团领域可参见Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis(第2版，Wiley：纽约，1991)的综述。
术语″羟基-保护基团″为公认的表述，其指那些要保护在合成过程中羟基基团不发生不要的反应的基团，其包括诸如，现有技术中已知的苄基或其他合适的酯或醚基团。
术语″羧基-保护基团″为公认的表述，其指那些要保护在合成过程中羧酸基团不发生不要的反应的基团，如氨基酸或肽的C末端或酸性或羟基吖庚因环的取代基。羧基保护基团的实例包括诸如，苄基酯、环已基酯、4-硝基苄基酯、叔丁基酯、4-吡啶甲基酯等等。
术语″氨基-保护基团″为公认的表述，其指保护氨基基团不参与与一些其他功能基团发生的反应的基团，但其能在需要时从胺上去除。这些基团如上述Greene和Wuts著作的第7章和Barton的ProtectiveGroups in Organic Chemistry的第2章(McOmie编辑，Plenum Press，纽约，1973)中所述的。合适基团的例子包括酰基保护基团，例如，甲酰基、丹酰基、乙酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、苄基和取代的苄基，如3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基和三苯基甲基；那些分子式-COOR的基团，其中R包括诸如以下基团的基团，甲基、乙基、丙基、异丙基、2，2，2-三氯乙基、1-甲基-1-苯基乙基、异丁基、叔丁基、叔戊基、乙烯基、烯丙基、苯基、苄基、对硝基苄基、邻硝基苄基和2，4-二氯苄基；酰基和取代的酰基，如甲酰基、乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基和对甲氧基苯甲酰基；其他基团如，甲磺酰基、对甲苯磺酰基、对溴苯磺酰基、对硝基苯基乙基和对甲苯磺酰基-氨基羰基。优选的氨基-保护基团为苄基(-CH2C6H5)、酰基[C(O)R1]或SiR13，其中R1为C1-C4烷基、卤甲基或2-卤-取代的-(C2-C4烷氧基)，芳香族尿烷保护基团，例如，羰基苄氧基(Cbz)和脂肪族尿烷保护基团，如叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(FMOC)。
每种表述的定义，如低级烷基、m、n、p等等，当其在结构中出现超过一次时，其意在同一结构中不同位置各自独立定义。
术语″吸电子基″为公认的表述，其指有从相邻原子吸引价电子倾向的取代基，即取代基相对于相邻原子是电负性的。吸电子能力水平的量化由Hammett西格马(σ)常数得出。该公知的常数在许多文献中有叙述，例如，March，Advanced Organic Chemistry 251-59(McGrawHill Book Company：纽约，1977)。Hammett常数值一般以负值表示供电子基团(σ(P)＝-0.66表示NH2)而以正值表示吸电子基团(σ(P)＝0.78表示硝基)，σ(P)显示了相对替换性。示例的吸电子基包括硝基、酰基、甲酰基、磺酰基、三氟甲基、氰基、氯化物等等。示例的供电子基包括氨基、甲氧基等等。
此处所用的″RNA″指各种核糖核酸，如信使RNA、成熟RNA、多聚腺苷酸化的RNA，未多聚腺苷酸化的RNA和包含内含子和/或5′或3′未翻译区的RNA。此处所用的“表达的RNA”指通过聚合酶从基因组或线粒体DNA上转录的RNA。
术语″区域异构体″为公认的表述，其指具有相同分子式但在原子的连通性上有差异的化合物因此，″区域选择过程″为相对其它异构体偏好产生特定区域异构体的过程，如，反应产生统计学显著增加的某种区域异构体的产量。
术语″差向异构体″为公认的表述，其指具有完全相同化学构造并包含超过一种立构中心的分子，但其在这些立构中心中仅有一个的构型中有差异。
此处所用的″小分子″指一种成分，其具有小于约5kD的分子量，最优选小于约4kD。小分子可以是核酸、肽、多肽、模拟肽、碳水化合物、脂或其它有机(含碳)或无机分子。许多制药公司和供应商有许多化学和/或生物混合物的文库，通常是真菌、细菌或藻类的提取物，它们能用本发明的任何试验来筛选从而鉴定能调节生物活性的化合物，如预期行为或认知功能。
术语″立体异构体″为公认的表述，其指具有完全相同化学构造化合物，但在原子或基团的空间排列上有差异。特别地，″对映异构体″指化合物的2个立体异构体，它们的镜像影像是不能互相重叠的。另一方面，″非对映异构体″指具有2个或多个非对称中心的立体异构体，而且其分子不互为镜像影像。
另外，″立体选择过程″为相对产生其它可能的立体异构体，更偏好产生反应产物中特定立体异构体的过程。″对映选择过程″为偏向产生反应产物中2个可能的对映异构体中的一个过程。
术语″结构-活性关系″或″(SAR)″为公认的表述，其指改变药物或其它化合物分子结构的方法，该方法改变了其与受体，酶，核酸或其他靶位等的相互作用。
此处所用的″个体″指哺乳动物，如人、非人灵长类、绵羊、牛、猪、马、猫、鼠或犬。优选地，个体为人。本发明所述的“需要”治疗的个体或哺乳动物具有有障碍的认知功能，该认知功能能由在此所述的方法和组合物来改善。可以理解“取代”或”用...取代″包括隐含的限定，即这种取代符合取代原子和取代基所允许的价，而且取代形成稳定的化合物，如不会自发通过诸如重排、环化、消除或其他反应而产生变化。
术语″取代的″预期也包括有机化合物所允许的所有取代基。在一个广义的方面，允许的取代基包括有机化合物的无环的和环的、分支的或不分支的、碳环的和杂环的、芳香族和非芳香族取代基。示例的取代基包括诸如如上所示的那些。合适有机化合物的允许的取代基可以是一个或多个并可以是相同或不同的。为了本发明的目的，杂原子，如氮，可以带来有氢取代基和/或任何此处所述的有机化合物允许的取代基，其符合杂原子的价。本发明不以任何方式被有机化合物所允许的取代基限制。
术语″磺酸酯″为公认的表述，其指可由如下通式所表示的部分：
Figure A20081008253500301
其中R57为电子对、氢、烷基、环烷基或芳基。
术语″硫酸酯″为公认的表述，其包括由如下通式所表示的部分：
Figure A20081008253500302
其中R57如上定义。
术语″磺酰氨基″为公认的表述，其包括由如下通式所表示的部分：
其中R50和R56如上定义。
术语″氨磺酰基″为公认的表述，其指可由如下通式所表示的部分：
Figure A20081008253500304
其中R50和R51如上定义。
术语″磺酰基″为公认的表述，其指可由如下通式所表示的部分：
Figure A20081008253500311
其中R58为如下之一：氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
术语″亚砜基″为公认的表述，其指可由如下通式所表示的部分：
Figure A20081008253500312
其中R58如上定义。
术语″合成″为公认的表述，其指通过体外化学或酶学合成方法生产。
此处所用的″测试群体″指具有预期行为或认知功能的个体。测试群体的成员可包括年轻、中年和老年个体。
此处所用的″治疗剂″指化学化合物或组合物，当向需要的个体适量给药时，其能诱导预期的治疗或预防效果。″治疗剂″可以是任何化学部分或有生物、生理或药理活性的生物物质，其能局部或系统性地作用于需要的个体。化学治疗剂的实例也被称为“药物”，已在公知文献中描述了，如Merck索引，Physicians Desk Reference，和Pharmacological Basis of Therapeutics，而且它们包括但不限于药剂；维生素；矿物质补充剂；用于处理、诊断、治疗或缓解疾病或病症的物质；影响机体结构或功能的物质或前药，其在生理环境中被替代后能具有生物活性或更多活性。抗生素试剂和FabI/FabK抑制剂是治疗剂的实例。生物治疗剂的实例包括含有基因并能将基因递送到个体的载体。
治疗剂诱导动物的局部或系统效应，尤其是由药物活性物质造成的哺乳动物的，更特别的是人的。所以，治疗剂可在动物或人中用于诊断、治疗、缓解、治疗或预防噁性病况或增强预期的身体或精神发育和/或状态。
为了有效果，治疗剂以产生预期局部或系统效应的量或浓度以合理的利益/风险率进行递送，从而应用于任何治疗中。这种治疗剂的有效量会根据治疗的个体和病情、个体的体重和年龄、病情的严重程度、给药方式等而变化，其能由本领域普通技术人员方便的确定。例如，本发明的某些组合物可以足以产生效果的量以合理的利益/风险率来进行给药，从而应用于这种治疗中。有障碍的认知功能的上下文中，能用标准行为或现有已知评估认知功能的其他测试来评估呈现的治疗效果的程度。
术语″反式″为公认的表述，其指在一个双键边上的2个原子或基团的排列方式，使得这些原子或基团原子或基团处在双键的不同侧。反式构型通常标示为(E)构型。
此处所用的″治疗″个体有障碍的认知功能或″治疗″具有有障碍的认知功能的个体指通过合适的方法向个体提供治疗剂，如，给药药物，从而使至少一个有障碍的认知功能的症状稳定或减轻。治疗有障碍的认知功能能防止功能障碍，延缓功能障碍的进程或改善功能障碍(减轻疾病严重程度)或治疗功能障碍。
此处所用的″载体″指组合物，其用于将DNA或RNA导入进组织。所属领域技术人员公知的方法可用于构建包含核酸的表达载体，该核酸编码与合适的转录/翻译控制信号相连的感兴趣的蛋白质。如参见，Sambrook & Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)和Ausebel等Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates& Wiley Interscience，N.Y(1989)所述的技术。
将载体或质粒转化入细胞的合适方法包括脂/DNA复合物，如美国专利第5,578,475；5,627,175；5,705,308；5,744,335；5,976,567；6,020,202；6,051,429号所述的那些方法。合适的试剂包括lipofectamine，一种3∶1(w/w)的聚-阳离子脂三氟乙酸2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺羧基-氨基甲酰基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵(DOSPA)(Chemical Abstracts登记名称：N-[2-(2，5-双[(3-氨基丙基)氨基]-1-氧基戊基)氨基]乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(9-十八碳烯氧基)-1-丙铵-三氟乙酸盐)的脂质体配方，和膜过滤水中的中性脂二油烯基磷酯酰乙醇胺(DOPE)。实例有Lipofectamine 2000TM(可从Invitrogen(以前的Gibco/Life Technologies)#11668019处获得)配方。其他试剂包括：FuGENETM转染试剂(非脂质体形式中的脂和80％乙醇中的其他化合物的混合物，可从Roche Diagnostics Corp.#1814443处获得)和LipoTAXITM转染试剂(获得自Invitrogen Corp.的脂配方，其能产生预期的生物活性蛋白质。#204110)。可通过电穿孔来转染细胞，如Roach和McNeish(Methods in Mol.Biol.185：1(2002))所述的那样。用来产生稳定遗传变化的细胞的合适病毒载体系统可以是基于腺病毒、慢病毒、反转录病毒、腺相关病毒(AAV)和其他病毒的，并可以用可从商业渠道获得的病毒成分来制备。载体可通过现有技术导入到神经细胞和组织中，包括注射(如注射到大脑特定区域)、通过使用动静脉吻合流术导入血管空间或脑脊髓液中以及其他机械方法。
″年轻″指约性成熟年龄的青春期和正常成年哺乳动物，而且其时海马刚完全成熟。对于鼠来说，″年轻″鼠为6-9个月大。对人来说，″年轻″人为10-20岁。
6.2引言：认知功能的行为和遗传评估的联合研究
用Morris水迷宫和辐射臂状迷宫进行的认知功能的行为评估已经用于鉴定与年龄相关的认知功能的改变。基于其认知功能，将这些行为评估用作为表征动物的方法，这样就可以将认知功能的行为评估与遗传和生理测定结合起来，从而检测大脑衰老效应的差异。
为了获得大脑中与年龄和行为相关的变化的基因模板，应用基因表达阵列提供了同时分析成千上万表达的基因的可能性。这些方法也提出了一些挑战。首先，我们的鼠模型，类似于衰老人群，其包含遗传上远系繁殖的群体，其能增加个体可变性，从而成为基因表达谱中的干扰因子。第二，用传统定量方法来评估海马中的特定mRNA的表达水平，我们发现与年龄和行为有关的基因表达变化通常相对较小，小于已经报道的现有Genechip或微阵列方法中分辨率极限的基因表达水平的2倍差异。例如，Landfield及其同事的工作就由于不能检测小于2倍的基因表达改变而受到限制(WO03/025122 A2)。
在此我们描述了克服这些挑战的策略，证实了可靠的基因表达的小变化，我们用传统方法显示了该区分老年和年轻鼠的基因表达。分析更广泛的基因显示该方法可重复地显示了很多基因，这些基因在与年老鼠行为相关的海马中显示出表达改变。
鉴定与认知功能障碍相关的基因第一次使人们确定候选化合物是否能调节与正常认知功能相关的基因表达。能调解这些更接近于诸如人的具有预期认知功能的哺乳动物中表达水平的基因表达的化合物在用作为治疗剂时，能预见其可恢复或增强认知功能。用该方法，我们报道发现了与保持年老哺乳动物中认知功能相关的基因。不仅限于推测，我们相信这种保持代表了活性生物过程，其能用合适的治疗剂处理来引发或诱导。当然，我们在此报道一种这样的试剂为头孢曲松，一种第三代头孢菌素。另一种这样的试剂为丙戊酸和MS-153。用下述筛选方法可鉴定并优化其他这样的治疗剂。产生本发明的实验方法和本发明本身以及本发明的实践技术会在以下章节中叙述。
6.2.1分离RNA
当从个体的组织样品或细胞中分离RNA时，重要的是从个体中分离出组织或细胞后，防止基因表达的任何进一步变化。已知表达水平的改变在震动后迅速发生，如热休克或用脂多糖(LPS)或其他试剂活化。另外，组织和细胞中的RNA快速降解。因此，在优选的具体实施方式中，从个体中获得的组织或细胞尽可能的速冻住。
RNA能通过大量方法从组织样品中分离，如在实施例中所述的或用CsCl离心后的硫氰酸胍裂解(Chirgwin等，1979，Biochemistry 18：5294-5299)。在苯酚/硫氰酸胍混合物(得自Invitrogen)中使组织均一化并在异丙醇沉淀后用氯仿提取从而从冰冻组织中分离RNA。然后重悬浮RNA小颗粒并进一步过RNeasy柱(Qiagen)来纯化。所有RNA可以在缺少RNA酶抑制剂的情况下储存于-80℃，并用琼脂糖凝胶电泳来评估其完整性。能用所述从单个细胞中制备cDNA文库的方法来从单个细胞中获得RNA，如Dulac，C.(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36，245和Jena等(1996)J.Immunol.Methods 190：199所述的那样。必须小心避免RNA降解，如加入RNA酶抑制剂。
然后可以富集特定物种的RNA样品。在一个具体实施方式中，从RNA样品中分离聚(A)+RNA。一般而言，这种纯化法有在mRNA上加上聚-A的好处。尤其，如上所指出，聚-T寡核苷酸可固定在固相支持物上从而用作mRNA的亲合配体。达到该目的的试剂盒可从商业渠道获得，如，MessageMaker试剂盒(Invitrogen #10298016)。
在一个具体实施方式中，富集感兴趣序列的RNA群，如那些涉及认知功能的基因。能通过诸如引物特异性cDNA合成或基于cDNA合成的线性扩增以及体外模板直接转录来进行富集(如参见，Wang等(1989)PNAS 86，9717；以上的Dulac等，和以上的Jena等)。
富集的或不在特定物种或序列中的RNA群能进一步被扩增。该扩增在使用来自单个或一些细胞的RNA时尤其重要。许多扩增方法适用于本发明的方法中，包括诸如PCR；连接酶链式反应(LCR)(如参见，Wu和Wallace，Genomics 4,560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988))；自持序列复制(SSR)(如参见，Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990))；基于序列的核酸扩增(NASBA)和转录扩增(如参见，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))。对于PCR技术，如参见PCR Technology：Principles andApplications for DNA Amplification(H.A.Erlich著，Freeman Press，N.Y.，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods andapplications(编辑.Innis，等，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert等，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(McPherson等著，IRL Press，Oxford)和美国专利第4,683,202号。扩增方法如下所述，有Ohyama等(2000)BioTechniques 29：530；Luo等(1999)Nat.Med.5，117；Hegde等(2000)BioTechniques 29：548；Kacharmina等(1999)Meth.Enzymol.303：3；Livesey等(2000)Curr.Biol.10：301；Spirin等(1999)Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.40：3108和Sakai等(2000)Anal.Biochem.287：32。也可在细胞上原位进行RNA扩增和cDNA合成(如参见，Eberwine等(1992)PNAS 89：3010)。″定量PCR″指利用PCR规程使人能确定样品中反应产物的量或反应产物的数量。
所属领域技术人员会理解如何使用扩增方法，如果要获得定量结果，必须注意使用保持或控制相对的核酸扩增率以获得定量的扩增。“定量”扩增的方法对所属领域技术人员来说是公知的。例如，定量PCR包括用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这提供了内部可用于校正PCR反应的标准。然后，高密度阵列可包括特异性探针做内在扩增的核酸的定量标准。
一个优选的内在标准为合成的AW106 cRNA。根据所属领域技术人员已知的标准技术，AW106 cRNA与分离自样品的RNA结合。然后用反转录酶，反转录RNA产生DNA拷贝。然后(如，通过PCR)用标记的引物扩增cDNA序列。典型地通过电泳来分离扩增产物，并确定(与扩增产物成比例的)放射性的量。然后通过比较已知AW106RNA标准产生的信号来计算样品中RNA的量。具体的定量PCR规程如PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，lords等，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)所述。
在优选的具体实施方式中，用反转录酶和由寡(dT)和编码噬菌体T7启动子的序列组成的引物反转录出样品mRNA，用以提供单链DNA模板。用DNA聚合酶聚合出第二条DNA链。合成双链cDNA后，加入T7 RNA聚合酶并从cDNA模板上转录出RNA。接下来从每个单链cDNA模板上进行的转录轮次使得扩增了RNA。体外聚合的方法对所属领域技术人员来说是公知的(如参见以上的Sambrook &Russell而且该特定方法在Van Gelder，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1663-1667(1990)中有详述，他们证明了根据该方法进行的体外扩增保持了各种RNA转录体的相对率)。另外，Eberwine等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3010-3014提供了一种规程，其在体外转录中使用2轮扩增以获得大于初始材料106倍的增加，从而允许甚至在生物样品有限的情况下来检测表达。
所属领域技术人员会理解上述直接转录方法提供了反义(aRNA)库。当反义RNA用作靶核酸时，选择阵列中提供的寡核苷酸探针来互补反义核酸的亚序列。相反，当靶核酸为正义核酸库时，挑选寡核苷酸探针来互补正义核酸的亚序列。最终，当核酸库是双链时，探针可以是任意意义的靶核酸，包括正义和反义链。
6.2.2分析RNA
在一些具体实施方式中，相对于成百或成千的基因，足以确定一种或少量基因的表达。尽管微阵列能用于这些具体实施方式中，但是也可用各种其它的检测基因表达的方法。本节描述了一些检测并定量mRNA或其编码的多肽的示例方法。方法的第一步包括从细胞中分离出mRNA，该步骤可以以如上所述的方式进行。可以以如上所述的方式来标记一种或多种核酸。
在一个具体实施方式中，样品中获得的mRNA反转录出第一条cDNA链并进行PCR，如RT-PCR。内务基因或其他表达不发生变化的基因能用作内在的对照和进行试验的对照。PCR反应后，电泳分离扩增的产物并检测。通过使用定量PCR，扩增产物的水平可与样品中存在的RNA水平相关联。扩增的样品也可以在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上分离，转到滤膜上，而该滤膜杂交有感兴趣的基因的特异探针。进行平行PCR扩增，如多重PCR，能同时分析大量的样品。
使用的定量PCR技术是以TaqManTM探针的使用为基础的。在存在寡核苷酸探针的情况下，通过PE Applied Biosystems 7700序列检测系统上扩增靶序列来进行特定序列的检测，其中探针的5’和3’端各自标记有报告和淬灭荧光染(FQ探针)，其能在2个PCR引物间退火。当探针结合在引物间时，仅能检测到特定产物。PCR扩增进行中，Taq聚合酶的5′-核酸酶活性开始从探针上切下报告染料。当报告染料与淬灭染料物理分离时，用带有CCD的照相机测定信号从而检测出产生的信号。也可以使用诸如叙利亚绿的插入性染料。每个产生的信号等于一个裂解的探针，其与一个靶链的扩增相对应。根据提供的说明书，可利用PE Applied Biosystem TaqMan PCR核心试剂盒来进行PCR反应。进一步，该技术如美国专利第6,326,462号所述。可选地，能从Applied Biosystems和Qiagen处获得探针，与Invitrogen的铂定量PCR试剂盒和Rotorgene 3000一起使用。
在另一个具体实施方式中，通过点印迹分析和相关方法来确定mRNA的水平(如参见，G.A.Beltz等的Methods in Enzymology，Vol.100，Part B，R.Wu，L.Grossmam，K.Moldave，编著AcademicPress，纽约，第19章，第266-308页，1985)。在一个具体实施方式中，在滤膜上印迹(即，非共价键)特定量的从细胞中提取的RNA，而该滤膜杂交有感兴趣的基因的特异探针。由于印迹能包含多点RNA，因此能同时分析大量RNA样品。利用方法来检测杂交，该方法依赖探针标记的类型。在另一个点印迹方法中，一个或多个上或下调认知功能障碍的基因的一个或多个探针吸附于膜上，并用获得自和源自个体细胞或组织的RNA的标记核酸来温育该膜。这种点印迹本质上就是包含少于微阵列探针数的阵列。
″点印迹″杂交有着广泛的应用并开发出许多版本(如参见，M.L.M.Anderson和B.D.Young的Nucleic Acid Hybridization-APractical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins，编.，IRL Press，Washington D.C.，第4章，第73-111页，1985)。
另一种形式，即所谓的“三明治”杂交，包括将寡核苷酸探针共价结合到固相支持物上，并利用它们捕获并检测多个核酸靶位(如参见，M.Ranki等，基因，21，第77-85页，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund的英国专利申请GB 2156074A，1985年10月2日；T.M.Ranki和H.E.Soderlund的美国专利第4,563,419号，1986年1月7日；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale的PCT WO86/03782，1986年7月3日；Y.Stabinsky，的美国专利第4,751,177号，1988年1月14日；T.H.Adams等的PCT WO 90/01564，1990年2月22日；R.B.Wallace等6 Nucleic Acid Res.11，p.3543，1979；和B.J.Connor等，80 Proc.Natl.Acad.Sci.USA pp.278-282，1983)。这些形式的多个版本被称为“反点印迹”。
也能用Northern印迹来确定mRNA水平。电泳分离特定量的RNA并转移到滤膜上，该滤膜然后杂交有相应于感兴趣基因地探针。该方法，尽管在要分析大量样品和基因时更麻烦些，但它仍有非常准确的优点。
优选的高通量基因表达分析的方法是系列(″SAGE″)技术，其首次由Velculescu等(1995)Science 270，484-487提出。SAGE的优点是其具有能在特定细胞类型中检测所有基因的潜力，提供出有关这些基因相关表达的定量信息，允许迅速比较2个细胞中基因的基因表达，并产生能用于鉴定检测的基因的序列信息。所以至今，SAGE方法已证明其能可靠地在各种细胞类型中检测调节和非调节基因的表达(Velculescu等(1997)Cell 88，243-251；Zhang等(1997)Science276，1268-1272和Velculescu等(1999)Nat.Genet.23，387-388)。
产生并探测核酸的技术例如在上述的Sambrook & Russell(上文)中有进一步描述。
可选地，可通过原位杂交组化来确定一种或多种上或下调认知功能障碍的基因的表达水平。在一个具体实施方式中，按照现有已知的技术，从个体中获得组织样品，制备切片并进行原位杂交，从而检测感兴趣的基因的表达水平。
以上方法可用于评估内源基因表达的增加，所述基因可通过向哺乳动物导入新的转录单位或基因活化构建体来活化，转录单位或基因活化构建体包括内源调节序列、内源外显子和剪接位点，可操作地与内源基因的第二个外显子相连，其中细胞包含内源外显子和在内源基因中存在的外显子(如参见，美国专利第5,641,670；5,773,746；5,733,761；5,968,502；6,702,989和6,565,844号)。
在其他方法中，通过测量基因编码的蛋白质水平来检测基因的表达水平。如通过免疫沉淀、ELISA或免疫组化来进行该方法，利用的试剂如抗体，其特异检测基因编码的蛋白质。其它技术包括Western印迹分析。免疫试验常用于定量细胞样品中的蛋白质水平，并且许多其他免疫试验技术出现在现有技术中。本发明不局限于特定试验过程，并因而要包括同源的和异源的过程。本发明能进行的示例的免疫试验包括荧光极化免疫试验(FPIA)、荧光免疫试验(FIA)、酶免疫试验(EIA)、悬液抑制免疫试验(NIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫试验(RIA)。指示部分或标记基团能吸附于特定抗体上并选择从而使之达到各种方法所使用的需求，其中通常通过可用的试验设备和兼容的免疫试验过程来规范这些方法。用于进行各种上述免疫试验的常规技术对本领域普通技术人员是已知的。
对于细胞分泌的多肽，可在生物流体中测定这些多肽的表达水平。
在一些具体实施方式中，可通过以下章节所详述的微阵列分析来检测和/或测定mRNA水平。
6.3引言：微阵列
一般而言，用阵列来确定表达谱包括以下步骤：(a)从个体获得mRNA样品并制备其标记的核酸(″靶核酸”或”靶″)；(b)在足以使靶核酸与阵列上相应探针结合的条件下，将靶核酸与阵列接触，如通过杂交或特异结合；(c)可选地从阵列上去除未结合的靶；(d)检测结合的靶，和(e)分析结果。此处所用的″核酸探针探针”或”探针″为吸附在阵列上的核酸，而″靶核酸″为与阵列杂交的核酸。以下将更详细地描述这些步骤的每一步。
6.3.1标记用于微阵列分析的核酸
一般而言，要标记靶分子从而允许检测靶分子与微阵列的杂交。“标记”指探针直接或通过与一个或多个信号产生系统的成分的结合形式来包含一种信号产生系统的成分，因而其是可检测的。直接可检测标记的实例包括整合于、通常是共价结合于探针部分的同位素和荧光部分，或可检测标记的能结合于探针分子功能部分的光活化或化学活化的衍生物，探针部分如核苷酸单体，如，引物的dNMP。
在富集和/或扩增RNA期间或之后标记核酸。例如，用公知的寡dT引物或随机引物反转录法从mRNA来制备标记的cDNA(如参见，Klug和Berger，1987，Methods Enzymol.152：316-325)。在存在有结合了可检测标记的dNTP的情况下进行反转录，最优选为荧光标记的dNTP。可选地，在存在标记的dNTP的情况下，分离的mRNA可转化成由体外双链cDNA转录而合成的标记的反义RNA(Lockhart等，Nature Biotech.14：1675，1996)。在可选的具体实施方式中，在缺少可检测标记的情况下合成cDNA或RNA探针，然后进行标记，如通过结合生物素标记的dNTP或rNTP，或一些相似的方法(如光交联生物素的补骨脂素衍生物与RNA)，接着加入标记的抗生蛋白链菌素(如藻红蛋白结合的抗生蛋白链菌素)或等价物。
在一个具体实施方式中，在42℃温浴60分钟包含RNA和0.5mMdGTP，dATP和dCTP加上0.1mM dTTP和荧光脱氧核糖核苷酸(如，0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))的混合物和反转录酶(如SuperScriptTM II，LTI Inc.)来合成标记的cDNA。
感兴趣的荧光部分或标记包括香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素，bodipy染料，如Bodipy FL、瀑布兰，荧光素及其衍生物，如荧光素异硫氰酸酯、俄勒冈绿，若丹明染料，如德克萨斯红、四甲基若丹明、曙红和藻红，花青染料，如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX，大环螯合的镧系离子，如，量子染料TM，荧光能量转化染料，如噻唑橘红-溴乙非啶异质二聚体、TOTAB、丹酰基，等。个别荧光化合物具有连接设备或本发明实验中所需检测元素的功能，或能修饰取得这些功能，这样的化合物包括，如，丹酰基氯；荧光素，如3，6-二羟基-9-苯基二苯吡喃醇；若丹明异硫氰酸酯；N-苯基1-氨基-8-磺酸萘；N-苯基2-氨基-6-磺酸萘；4-乙酰氨基-4-异硫氰基-芪-2，2′-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯；N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙锭；stebrine；亚金氨基-0，2-(9′-蒽)棕榈酸酯；丹酰基磷脂酰乙醇胺；N，N′-二十八烷基噁羰花青：N，N′-二己基噁羰花青；部花青，4-(3′-芘基)硬脂酸酯；d-3-氨基脱氧马萘雌酮；1 2-(9′-蒽基)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2′(亚乙烯基对亚苯基)双苯噁唑；对双(2-甲基-5-苯基-噁唑基))苯；6-二甲基氨基-1，2-苯并吩嗪；视黄醇；双(3′-氨基吡啶)1，10-癸烷基二碘化物；hellibrienin磺酸萘腙；氯代四环素；N-(7-二甲基氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)马来酰亚胺；N-(对-(2苯并咪唑基)-苯基)马来酰亚胺；N-(4-氟萘基)马来酰亚胺；双(高香草醛酸)；刃天青；4-氯-7-硝基-2，1，3-苯甲酰噁二唑；部花青540；试卤灵；孟加拉玫瑰红和2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮(如参见，Kricka，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press San Diego，Calif.)。许多荧光标记可通过商业渠道从SIGMA-AIdrich，Amersham Biosciences，Molecular Probes，Pfizer(以前的Pharmacia)，BD Biosciences(以前的CLONTECH)，ChemGenesCorp.，Glen Research Corp.，Invitrogen，Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)，和Applied Biosystems(Foster City，Calif.)以及其他技术人员知道的商业渠道获得。
化学发光标记包括虫荧光素和2，3-二氢酞吖嗪二酮，如发光氨。
感兴趣的同位素部分或标记包括32P、33P、35P、125I、2H、14C等等(参见Zhao等，Gene 156：207，1995；Pietu等，Genome Res.6：492，1996)。
标记也可以是信号产生系统成分，其与一种或多种相同系统其他的成分一起提供可监测的标记。这些标记的示例有特异结合配对成分，如配体，如生物素、荧光素、异羟基洋地黄毒甙元、抗原、多价阳离子、鳌合基团等等，其中该成分特异结合于信号产生系统的其它成分，其中其他成分直接或间接提供可检测的信号，如结合了荧光部分或能将底物转化成发色产物的酶部分的抗体，如碱性磷酸酶结合抗体等等。
其他感兴趣的标签包括那些仅在相连探针特异结合靶分子时提供信号的标签，其中这些标签包括：“分子灯塔”，如Tyagi & Kramer，Nature Biotechnology 14：303，1996和EP 0 070 685 B1所述。其他感兴趣的标签包括那些如美国专利第5,563,037号；WO 97/17471和WO 97/17076所述的标签。
在一些情况下，在杂交后标记杂交的靶核酸。例如，当标记dNTP的生物素用于诸如扩增或转录时，抗生蛋白链菌素结合报告基团可用于标记杂交的复合物。
在其它具体实施方式中，不标记靶核酸。在这种情况下，可用胞质共振来测定杂交，如Thiel等，Anal.Chem.69：4948，1997所述。
在一个具体实施方式中，多(如2、3、4、5或更多)套靶核酸被标记并用于杂交反应(“多重”分析)中。例如，一套核酸可与一种细胞或组织样品的RNA相对应，而另一套核酸可与另一种细胞或组织样品的RNA相对应。多套核酸可用不同标记来标记，如，具有独特发色谱的不同荧光标签，因而可以区分它们。然后混合这些套核酸并将它们同时与微阵列杂交。
双色荧光标记的应用和确定基因表达改变的检测方案如Shena等，Science 270：467-470，1995所述。利用标记有2种不同荧光基团的cDNA的优点为可直接并有内在对照地比较mRNA水平，该水平与制得的2种细胞状态中的每个阵列化的基因相对应，而且由于实验条件(如杂交条件)细微差异造成的变化不会影响接下来的分析。
在杂交大量靶核酸时使用的可分辨标记的例子是公知的，其包括：2种或更多种不同发射波长的荧光染料，像Cy3和Cy5，荧光蛋白质和染料的组合，像phicoerythrin和Cy5，2种或更多种具有不同发射能量的同位素，像32P和33P，具有不同散射谱的金或银颗粒，在不同处理条件产生信号的标记，像温度、pH、用其他试剂处理等，或在处理后的不同时间点产生信号。基于不同底物特异性的酶(碱性磷酸酶/过氧化物酶)，使用一种或多种酶产生信号可以有更多种可分辨的标记。
另外，为了减少实验错误，优选在双色差异杂交实验中颠倒使用荧光标记以减少偏向个别基因或阵列位置点的偏差。换句话说，优选首先用一种来自两种测量细胞的mRNA标记(如用第一种荧光色标记来自第一种细胞的核酸并用第二种荧光色标记来自第二种细胞的核酸)来测定基因表达，然后用相反的标记(如，用第二种荧光色标记来自第一种细胞的核酸并用第一种荧光色标记来自第二种细胞的核酸)来测量来自两种细胞的基因表达。在暴露水平和震荡对照参数水平以上的多次测量提供了另外的实验错误的对照。
在杂交到阵列之前可评估标记核酸的质量。例如，标记核酸样品能与探针杂交，该探针衍生自基因的5′、中间和3′部分，该基因已知或怀疑存在于核酸样品中。这可以指示标记核酸是否是全长的核酸或它们是否降解了。在一个具体实施方式中，Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip
Figure A20081008253500431
Test3阵列可用于该目的。该阵列包含表示特定基因子集的探针，这些基因来自几种包括哺乳动物的生物体。所以，标记核酸样品的质量能通过将一小部分样品与阵列杂交来确定，如Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip
Figure A20081008253500432
Test3阵列。
6.3.2微阵列分析
用于本发明的优选的阵列，如微阵列，包括基因的一种或多种探针，所述基因为涉及认知功能的候选基因。示例的阵列包括一种或多种用来研究认知功能的感兴趣的基因，如那些GeneChip鼠表达集合230或GeneChip
Figure A20081008253500434
鼠神经U34阵列上的基因，其包含超过1,200条与神经生物学研究相关的序列(包括激酶、细胞表面的基因)。另外，通过同时跟踪分布于整个基因组的将近1,500个被称为单核苷酸多态性(SNP)的基因变体，人们可以使用GeneChipHuSNPTM阵列来研究整个人的基因组。SNP是很好的基因组搜索标记，因为它们简单、丰富、广泛并带来大多数的人群基因的变化。利用高通量技术，如基因GeneChip
Figure A20081008253500436
阵列，SNP比诸如微卫星序列的传统标记更容易跟踪。
阵列可以包括与至少10，优选至少20，至少50，至少100或至少1000个基因。阵列可以包括与约10％、20％、50％、70％、90％或95％列于图3的基因或其他微阵列上可用的基因相对应的探针。阵列可以包括与约10％、20％、50％、70％、90％或95％列于图3的基因相对应的探针，或与其他在细胞中高至少2倍、优选至少3倍、更优选至少4倍、5倍、7倍并最优选至少约10倍表达的基因相对应的探针。一个所用的示例优选阵列为实施例中所用和所述的阵列。
可有一种或多于一种探针与微阵列上的每一个基因相对应。例如，微阵列可以包括2至20个探针与一个基因相对应，并优选约5至10个。探针可与基因的全长RNA序列或其互补序列相对应，所述基因特征为疾病候选基因，或它们可与其一部分相对应，所述部分足够长足以允许特定杂交。这些探针可包括约50个核苷酸至约100、200、500或1000个核苷酸或超过1000个核苷酸。如此处进一步所述的，微阵列可进一步包含寡核苷酸探针，其由约10至50个核苷酸组成，优选约15至30个核苷酸并更优选20-25个核苷酸。探针优选为单链。探针与其靶有足够的互补性，从而提供序列特异性杂交所预期的水平(见下文)。
典型地，本发明所用的阵列具有每cm2大于100个不同探针的位点密度。优选地，阵列具有每cm2大于500个的位点密度，更优选大于约1000/cm2，最优选大于约10,000/cm2。优选地，阵列在单个片基上有大于100个不同的探针，更优选大于约1000个不同的探针，更优选大于约10,000个不同的探针并最优选在单个片基上有大于100,000个不同的探针。
如下所述，通过现有已知的方法来制备微阵列，或由公司来定制它们，如Affymetrix(Santa Clara，CA)。
一般而言，可用两种类型的微阵列。这两种类型被称为“合成”和“递送”。在合成类型中，通过用核苷酸原位合成核酸逐步制备微阵列。在每一轮合成中，加入核苷酸生成链，直至获得所期望的长度。在微阵列的递送类型中，用各种递送技术将制成的核酸放在已知位置上。大量文献描述了不同的微阵列技术，如，Shena等，Tibtech 16：301，1998；Duggan等，Nat.Genet.21：10，1999；Bowtell等，Nat.Genet.21：25，1999。
Affymetrix(Santa Clara，CA)开发了一种新的合成技术，其将照相平版印刷技术与DNA合成化学结合在一起从而能生产高密度的寡核苷酸微阵列。这些芯片在约1.6cm2面积中包括多至400,000组寡核苷酸。寡核苷酸以其3′端的锚定来最大化单链核酸杂交的有效性。这些被称为“GeneChip
Figure A20081008253500441
”的芯片一般包括特定基因的几个寡核苷酸，如，在15-20之间，如16个寡核苷酸。由于Affymetrix(Santa Clara，CA)出售定制的微阵列，所以包含能上或下调认知功能障碍的基因的微阵列能从Affymetrix(Santa Clara，CA)处订购。
也能通过机械微点样来制备微阵列，如Synteni(Fremont，CA)商业化的那些。根据这些方法，少量核酸可印在固相表面上。Synteni制备的微点样阵列在约3.6cm2面积中包含多至10,000组cDNA。
第三组微阵列技术为″按需点滴″递送方法，最先进的喷墨技术，其利用压电和其他推进形式来把核酸从小管中传送到固相表面上。有几个中心开发了喷墨技术，包括Incyte Pharmaceuticals(Palo Alto，CA)和Protogene(Palo Alto，CA)。该技术形成10,000个点/cm2的密度。也可参见Hughes等，Nat.Biotechn.19：342，2001。
阵列优选包括对照和参照核酸。对照核酸为能用于显示杂交有效的核酸。例如，所有的Affymetrix(Santa Clara，CA)表达阵列包含几种原核基因的探针集，如，E.coli生物素合成中的bioB、bioC和bioD以及P1噬菌体的cre。在这些基因或其部分的混合物存在的情况下进行与这些阵列的杂交，如Affymetrix(Santa Clara，CA)提供的有该效果的混合物(部分号900299)，其能验证杂交的有效性。包括靶核酸的对照核酸也能是用体外转录从cDNA克隆合成的mRNA。其它可包括在阵列中的对照基因为聚A对照，如dap、lys、phe、thr和trp(其包括在Affymetrix的GeneChip上)。
参照核酸能将一个实验与另一个实验的结果标准化，并在定量的水平上比较多个实验。示例的参照核酸包括已知表达水平的内务基因，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、己糖激酶和肌动蛋白。
也可为靶基因的探针、表达水平对照或标准化对照提供错配对照。除了存在一种或多种错配对照之外，错配对照可为寡核苷酸探针或其他与其相应测试或对照探针一样的核酸。
阵列也可包含能与基因的大于一个的等位基因杂交的探针。例如阵列能包含一个识别特定基因等位基因1的探针和另一个识别等位基因2的探针。
微阵列能如下制备。在一个具体实施方式中，寡核苷酸阵列在固相支持物上合成。示例的固相支持物包括玻璃、塑料、聚合物、金属、非金属、陶瓷、有机物等。利用芯片遮盖技术和光保护化学，可能产生有序的核酸探针阵列。这些阵列，其被称作诸如“DNA芯片”或非常大量的固定聚合物阵列(″VLSIPSTM″阵列)，它们能在约1cm2至几cm2面积的片基上包括数百万确定的探针区域，在其上整合了少量至数百万探针的集合(如参见，美国专利第5,631,734号)。
构建固相核酸阵列以检测靶核酸已有文献描述了。参见Fodor等，Science，251：767-777，1991；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)：718-719，1993；Kozal等，Nature Medicine 2(7)：753-759，1996和Hubbell美国专利第5,571,639号；Pinkel等PCT/US95/16155(WO96/17958)；美国专利第5,677,195；5,624,711；5,599,695；5,451,683；5,424,186；5,412,087；5,384,261；5,252,743和5,143,854号；PCT专利公开号92/10092和93/09668；和PCT WO 97/10365。简言之，组合策略允许利用最少的合成步骤来合成包含大量探针的阵列。例如，仅用32步化学合成步骤就可能合成并吸附所有可能的DNA 8聚寡核苷酸(48或65,536种可能的组合)。一般而言，VLSIPSTM过程仅利用4n步合成步骤就提供了一种在阵列上产生4n个不同寡核苷酸探针的方法(如参见，美国专利第5,631,734；5,143,854号和PCT专利公开号WO 90/15070；WO 95/11995和WO 92/10092)。
在玻璃上光指示组合合成的寡核苷酸阵列能用自动磷酯酰氨化学和芯片遮盖技术来进行，该技术与在计算机芯片产业中的光刻技术相似。典型地，玻璃表面用包含功能基团的硅烷试剂来衍生化，如由光敏保护基团保护的羟基或胺基。光分解作用通过照相平版遮盖选择性地用于暴露功能性基团，然后其迅速与引入的5′-光保护核苷磷酯酰氨来反应。磷酯酰氨只在照亮的那些位点反应(所以用去除光敏保护基团来曝光)。所以，磷酯酰氨仅加到前一步骤选择曝光的那些区域。重复这些步骤，直至在固相表面上合成出预期的序列阵列。
设计遮盖以减少合成循环次数的算法如Hubbel等，美国专利第5,571,639号和美国专利第5,593,839号所述。如美国专利第5,571,639号所述，计算机系统可用于选择在片基上的核酸探针并设计阵列排布。
另一种合成高密度阵列的方法如美国专利第6,083,697号所述。通过使用辐射起始的催化系统，该方法利用了新的化学扩增过程从而辅助合成多聚物序列。该方法包括使用光敏化合物，其用作催化剂以促进多聚物序列形成的方式来化学改变合成的中间体。该光敏化合物包括一般被称为辐射活化的催化剂(RAC)化合物，和更特异的光活化催化剂(PAC)。RAC本身能化学改变合成中间体或它们能活化自催化化合物，其能以合成中间体与后加的合成中间体或其他化合物结合的方式来化学改变合成中间体。
通过向机械限制流径的支持物上的细胞递送单体来以组合的方式合成阵列。参见Winkler等，EP 624,059。也可通过用喷墨打印机将单体试剂点样到支持物上来合成阵列。参见Pease等，EP 728,520。
根据现有技术和此处进一步描述的方法来制备cDNA探针，如用序列特异性引物来进行RNA的反转录PCR(RT-PCR)。能化学合成寡核苷酸探针。可从诸如GenBank、其他公共数据库或文献来获得制备探针的基因或cDNA的序列。
核酸探针可以是天然的核酸，化学修饰的核酸，如，包含核苷酸类似物，只要它们具有活化的符合连接化学的羟基。保护基团本身可以是对光不稳的。可选地，保护基团在某些化学条件下可以是不稳定的，如酸。在该示例中，固相支持物的表面能包含依曝光而能产生酸的组合物。所以，片基区域的曝光在该区域产生了酸，在曝光区域去除了保护基团。而且合成方法能用3′-保护的5′-0-磷酯酰氨-活化的脱氧核酸。在该情况下，以5′至3′方向合成寡核苷酸，形成了自由的5′端。
用能制造成千寡核苷酸的96孔自动多路寡核苷酸合成仪(A.M.O.S.)来合成阵列上的寡核苷酸(Lashkari等，PNAS 93：7912，1995)。
可以理解通过有目的的应用来影响寡核苷酸设计。例如，所有探针期望可具有相似的熔融温度。因此，调节探针的长度从而使阵列上所有探针的熔融温度都很近似(可以理解在不同探针具有不同GC含量的情况下，需要不同探针的不同长度来获得特定的T[m])。尽管在探针设计中熔融温度为基本要考虑的内容，但其他因素任选用于进一步调节探针的构建，如选择抗引物自互补等。
阵列，如微阵列，可以在为以后应用而制备或购买后方便地储存。在合适的条件下，特定阵列能储存至少约6个月并可以储存多至1年或更长。阵列一般储存于约-20℃至室温之间的温度下，而阵列优选封存于诸如袋的塑料容器中并避光。
6.3.3将靶核酸与微阵列杂交
下一步是在足以使靶核酸与阵列的探针结合的条件下，将靶核酸与阵列接触。在有选的具体实施方式中，在足以使靶核酸与阵列上的探针发生杂交的条件下，将靶核酸与阵列接触靶核酸，选择杂交条件从而提供与其水平的杂交特异性。
阵列与靶核酸的接触包括用包含靶核酸的水介质与阵列接触。根据特定的阵列构型以各种不同的方式来获得接触。例如，当阵列只包括“平皿状”刚性片基表面上的大小分离式探针，可通过仅仅将阵列放在含靶核酸溶液的容器里来完成接触，如聚乙烯袋等。在其它具体实施方式中，当阵列放入2个刚性平皿包围的分离介质中时，就存在通过电泳法递送靶核酸的机会。可选地，当阵列装入具有流体入口和出口端的生物芯片设备中时，能将靶核酸溶液导入到小室中，在该小室中通过入口端引入靶分子样品，可以手动或用自动设备来进行流体导入。在多孔的具体实施方式中，靶核酸溶液导入到包含阵列的反应室中，可以手动进行，如用吸液管，或用自动流体处理设备。
靶核酸溶液和探针的接触将保持足够的时间以使靶和探针发生结合。尽管要依赖探针和靶的性质，接触一般要保持从约10分钟至24小时的时间，通常约30分钟至12小时，更通常为约1小时至6小时。
当使用商品化的微阵列时，由生产商提供足够的杂交条件。当使用非商品化的微阵列时，根据以下杂交指导以及大量关于使用微阵列的公开文献所述的杂交条件来确定足够的杂交条件。
选择最优的核酸杂交和洗涤条件从而使探针“特异地结合”或“特异地杂交”于特定的阵列位点，即探针杂交、复合或结合于具有互补核酸序列的序列阵列的位点上，但不杂交于非互补核酸序列的位点上。此处所用的一个聚核苷酸序列被认为与另一个互补，这时，如果较短的聚核苷酸小于或等于25个碱基时，则利用标准碱基配对规则就可使得没有错配存在，或者如果较短的聚核苷酸大于25个碱基时，则有不超过5％的错配。优选地，聚核苷酸是完全互补的(没有错配)。能容易地证实通过进行包括阴性对照的杂交试验，能使特定杂交条件导致特定的杂交。
在允许基本特异性杂交的条件下进行杂交。探针长度和GC含量决定了杂交的Tm，所以杂交条件对要获得探针对模板核酸特异性杂交来说是必要的。这些因素对于所属领域技术人员来说是公知的，并也能在试验中测试。大量的核酸杂交指南可在Tijssen(1993)，″Laboratory Techniques in biochemistry and molecularbiology-hybridization with nucleic acid probes″中发现。一般而言，选择的严谨条件比在特定离子强度和pH下特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm指(在特定离子强度和pH下的)温度，在该温度下50％的靶序列全匹配的探针杂交。选择的高严谨条件等与特定探针的Tm点。有时术语″Td″用于定义温度，在该温度下至少一半探针从完全匹配的靶核酸上解离下来。在任何情况下，可用大量估计Tm或Td的预估技术，其一般如在前的Tijssen所述的。典型地，预计双链形式的G-C碱基对比Tm高3℃，而预计A-T碱基对高约2℃，理论上最大值至多约80-100℃。可是，有更复杂的Tm和Td模型可用，其适于解释G-C堆积作用、溶剂效应、预计试验温度等。例如，可将探针设计成具有解离温度(Td)为约60℃，可使用以下公式设计：Td＝(((((3x#GC)+(2x#AT))x37)-562)/#bp)-5；其中#GC、#AT和#bp分别为涉及探针与模板DNA退火中的鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对数、腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对数和总碱基对数。
完全匹配的二聚体和错配的二聚体之间的稳定性差异可能是相当小的，尤其在仅有一个碱基错配时，两者之间的相互差异小至0.5度(参见，Tibanyenda，N.等，Eur.J.Biochem.139：19，1984和Ebel，S.等，Biochem.31：12083，1992)。更重要的是，能理解当同源区域的长度增加时，对于整个二聚体稳定性，单个碱基错配的效应减少了。
核酸杂交的理论和实践如S.Agrawal(编)Methods in MolecularBiology，第20卷；和Tijssen(1993)″Laboratory Techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acidprobes″中所述，并如″Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，纽约的第二章第I部分提供了对核酸杂交的基础指导。
某些微阵列有“活性”性质，即，它们提供了发生在每个特定微位置上的杂交反应(或任何其他亲和性反应)所有方面的独立控制。这些设备提供了一种新的影响杂交反应的机制，其被称为电子严谨控制(ESC)。这些活性设备能在每个微位置上电子化地产生“不同的严谨条件”。所以，最好能在相同的混合溶液中进行所有杂交。这些测试如Sosnowski等，美国专利第6,051,380号所述。
在优选的具体实施方式中，在杂交期间，利用去污剂(如C-TAB)或阻断剂(如精子DNA、cot-1 DNA等)来减少背景信号从而减少非特异性结合。在特别优选的具体实施方式中，在约0.5mg/ml DNA(如青鱼精子DNA)中进行杂交。杂交中使用阻断剂对所属领域技术人员来说是公知的(如参见，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第24卷：Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，编Elsevier，N.Y.，(1993)的第8章)。
根据靶核酸上使用的特定标记，该方法在检测步骤前可再或不进一步包含未结合标记去除的步骤。例如，在某些测试形式(如″同源测试形式″)中，仅在与探针特异结合的靶上产生了可检测信号。如此，在这些测试形式中，不需要未结合标记去除的步骤就可检测杂交形式。在其它具体实施方式中，使用的标记可产生信号，而无论靶是否与其探针特异结合，在这些具体实施方式中，未结合标记的靶从支持物表面上去除。去除未结合标记的靶的一种方法是进行公知的洗涤技术，其中为去除未结合标记的靶而使用的各种洗涤溶剂和规程是所属领域技术人员公知的，并可以使用。可选地，用电泳法去除未结合标记的靶。
当用相同标记检测所有靶序列时，为每种生理来源使用不同的阵列(其中可包括在不同时间使用相同阵列)。通过为不同的靶群体(代表试验的每个不同生理来源)使用不同的和可分辨的标记，以上方法可改变以提供多重分析。按照多重方法，同时为每个不同的靶群体使用相同的阵列。
在另一个具体实施方式中，利用电荷偶联设备(CCD)成像照相机来实时监视杂交(Guschin等，Anal.Biochem.250：203，1997)。在光纤维束上合成阵列使读数变得简单和灵敏(Healy等，Anal.Biochem.251：270，1997)。在另一个具体实施方式中，利用仅激活结合在表面上的荧光基团的隐失波效应，在微阵列上进行实时杂交检测，而不需要洗涤(如参见，Stimpson等，PNAS 92：6379，1995)。
6.3.4检测杂交的核酸和分析微阵列的结果
以上步骤导致在阵列表面上产生出靶核酸的杂交形式。用基于靶核酸特定标记而选择的特定检测形式以各种方式检测或使这些形式可视化。代表性的检测方法包括闪烁计数，放射自显影，测量荧光，比色测定，测量光发射、光散射等等。
一种检测方法包括阵列扫描仪，其商品可从Affymetrix(SantaClara，CA)处获得，如417TM阵列仪、418TM阵列扫描仪或AgilentGeneArrayTM扫描仪。该扫描仪由装有WindowsR界面和易用软件工具的系统计算机来控制。输出是16-bit位的.GIF文件，其能直接输入或直接以各种应用软件来读取。优选的扫描设备如美国专利第5,143,854和5,424,186号所述。
当使用荧光标记的探针时，用扫描共聚焦激光显微镜检测转录阵列每个位点上的荧光发射。在一种具体实施方式中，使用合适的激发线路，可为所用的2个荧光基团中的每一个各自进行扫描，可选地，可用激光使得在两个特异于2个荧光基团的波长处同时使标本发光并同时分析2个荧光基团发出的光(参见Shalon等，Genome Research 6：639-645，1996)。在优选的具体实施方式中，用激光荧光扫描仪和可控制X-Y相的计算机和显微镜来扫描阵列。用多线路、混合气体激光器获得2个荧光基团的连续激发并通过波长分开发射光并用光电倍增管来检测。在一个使用了荧光靶核酸的具体实施方式中，用激光器激发荧光标记的靶来扫描阵列，其中靶与探针阵列区域杂交，然后用电荷偶联设备(″CCD″)对大范围阵列扫描成像。荧光激光扫描设备如上述Schena等所述。可选地，光纤维束如Ferguson等，Nature Biotech.14：1681-1684，1996所述，其可用于监视mRNA丰度水平。
在数据收集操作后，数据一般进行数据分析操作。为辅助样品分析操作，设备读数器读出的数据一般用数字计算器来分析。典型地，计算机会有合适的程序接受并储存设备的数据并分析和报告收集的数据，如，背景的减少，多色图像的去卷积，标记或去除人工产物，适当校验对照，标准化信号，解释荧光数据从而确定杂交靶的量，标准化背景和单碱基错配杂交，等等。在优选的具体实施方式中，系统包含了检索功能，使人们检索特定模式，如，与差异基因表达相关的模式，如在患有认知功能障碍的病人样品的表达谱和相应正常个体表达谱之间的。系统优选能使人们检索超过2个样品间的基因表达的模式。
需要分析数据的系统为可视、可处理并可分析基因表达数据的普通、灵活的系统。这种系统优选包括浏览和操作表达数据的图形用户界面，其使用户选择性地观看和突出显示感兴趣的基因。系统也优选包括排序和检索功能并优选可为普通用户所用，其可安装PC，Mac或Unix工作站。系统中也优选包括聚类算法，其在质量上比现有的更有效。优选分级调节这种算法的精度，从而使聚类的详细水平能按需有系统地精选。
可用大量算法分析基因表达谱的数据，如，进行类型比较。在一些具体实施方式中，按需把共调解的基因分组。这就能比较大量谱了。鉴定这些基因组别的优选具体实施方式包括聚类算法(对于聚类算法的综述，如参见，Fukunaga，1990，Statistical Pattern Recognition，第2版，Academic Press，San Diego；Everitt，1974，Cluster Analysis，London：Heinemann Educ.Books；Hartigan，1975，ClusteringAlgorithms，纽约：Wiley；Sneath和Sokal，1973，NumericalTaxonomy，Freeman；Anderberg，1973，Cluster Analysis forApplications，Academic Press：纽约)。
聚类分析用于帮助减少复杂的成千时间曲线模式，减少成较少的有代表性的聚类。一些系统允许基于序列的基因的聚类化和可视化。其他系统允许基于其他基因特征的聚类化，如，它们的表达水平(如参见，美国专利第6,203,987号)。其他系统允许时间曲线的聚类化(如参见，美国专利第6,263,287号)。用hclust规则进行聚类分析(如参见，软件包S-正的″hclust″规则，MathSoft，Inc.，Cambridge，Mass.)。
在一些特定的具体实施方式中，按照它们转录的共变化程度，大概为共调节，来进行基因分组，如美国专利第6,203,987号所述。具有共变化转录体的基因组别的术语称为“基因集”。聚类分析或其他统计分类方法能用于分析与各种混乱体系相对应的基因转录的共变化，如，由疾病或药物造成的。在一个特定的具体实施方式中，聚类算法应用于表达谱来构建“相似树”或”聚类树″，其与由所显示共调节量决定的基因相关。基因集定义处于聚类树的分枝上，通过了分枝层次中不同水平的聚类树。
在一些具体实施方式中，基因表达谱转变成投射状的基因表达谱。投射状的基因表达谱集中了基因集表达的值。在一些具体实施方式中，通过在每个基因集中平均化基因的表达水平来获得该转变。在另一些具体实施方式中，可使用其他线性投射过程。投射操作表示在较小和更有生物学意义的坐标集上的谱，通过在每个细胞成分集中平均化其来减少测量错误的效应并帮助谱的生物学解释。
能比较的值包括整体表达水平；平均表达水平，如，其可来自不同实验、相同个体的不同样品或不同个体的样品；以及表达水平率。
6.3.5微阵列的数据分析方法
优选用计算机系统将一种或多种能上调认知功能障碍抑制的基因的表达水平与没有认知功能障碍抑制的参考表达水平作比较，如，患有疾病或正常个体的表达水平。在一个具体实施方式中，能从2个样品中获得一种或多种表达水平，而这2个表达水平集导入计算机系统进行比较。在一个优选的具体实施方式中，一个一种或多种表达水平的集合导入计算机系统与计算机系统中已有的值进行比较，或者导入计算机可读形式中以后再导入计算机系统。
在一个具体实施方式中，本发明提供了本发明基因表达谱数据或至少一个能上调个体中认知功能障碍抑制的基因的表达水平对应值的计算机可读形式。值可以是实验中获得的mRNA表达水平，如，微阵列分析。值也可以是相对于参考基因标准化的mRNA表达水平，其表达在多种条件下的多种细胞中为恒定的，如，GAPDH。在其它具体实施方式中，计算机中的值为不同样品中标准化或未标准化mRNA水平间的比率或差异。
计算机可读介质可包含至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多个基因的值。在一个优选的具体实施方式中，计算机可读介质包含至少一个表达谱。
基因表达数据可以是表格的形式，如Excel表格。数据可以是单独的或其可以是较大数据库的一部分，如可包含其他表达谱，如公共用的数据库。计算机可读形式可以位于计算机中。在另一个具体实施方式中，本发明提供能显示基因表达谱数据的计算机。
本发明提供两种或多种细胞或组织样品中可比较单个基因表达水平的方法。在一些具体实施方式中，可比较多个基因的表达水平。例如，至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多个基因的表达水平。在具体实施方式中比较表达谱。
在一个具体实施方式中，本发明提供确定能上调认知功能障碍抑制的一种或多种基因的表达水平间相似性的方法。方法优选包括在第一个样品中获得能上调认知功能障碍抑制的一种或多种基因的表达水平，并将这些值输入计算机，所述计算机包括(i)包含记录的数据库，该记录包含未处理的对照样品中一种或多种基因表达水平的相应值，以及(ii)处理器指令，如用户界面，其能接受选择一个或多个值来与储存在计算机中的数据进行比较。计算机可进一步包含将比较数据转化成图或表或其他输出形式的工具。
在一个具体实施方式中，本发明提供一种系统，其包含接收一个或多个基因的基因表达数据的工具；将所述一个或多个基因之一的基因表达数据与普通参考框架进行比较的工具；以及呈现比较结果的工具。该系统可进一步包含聚类数据的工具。
在另一个具体实施方式中，本发明提供一种分析基因表达数据的计算机程序，其包括(i)接收多个基因的基因表达输入数据的计算机编码以及(ii)将所述多个基因之一的所述基因表达数据与普通参考框架进行比较的计算机编码。
本发明也提供了一种机器可读的或计算机可读的介质，其包括进行如下步骤的程序说明：(i)将查询细胞中能上调NMD抑制的一个或多种基因表达水平的多个相应值与包含一个或多种参考细胞的参考表达记录和细胞类型注释的数据库进行比较；以及(ii)在表达水平相似性基础上，显示与查询细胞最相似的细胞。
2个生物样品中的相对表达水平，如mRNA丰度，能被计分为混乱度(相对丰度有差异)或不混乱的(即，相对丰度是相同的)。例如，混乱度可以是2种来源的RNA间表达水平的差异因子约为25％(1种来源的RNA比另一来源的丰度高25％)，更通常约50％，更通常的因子约2(2倍丰度)，3(3倍丰度)或5(5倍丰度)。混乱度能用计算机来计算并表示比较结果。
优选地，除了将混乱度鉴定为正或负的，确定混乱度的大小是有益的。如上所述，通过计算差异标记所用的2种荧光基团的发射率，或所属领域技术人员显而易见的类似方法，来进行这个。
计算机可读介质可进一步包含表达水平或表达谱标示符的指针，如从哪个来源获得的，如从哪个病人获得的。标示符能反映疾病期、病人接受的治疗或任何其他表达水平来源的说明。
操作中，文中本发明系统的接收基因表达数据的工具、比较基因表达数据的工具、显示工具、标准化工具和聚类工具能包括一个带有此处所述各个功能的编程计算机，其带有硬件或硬件和软件；能在此进行特异性鉴定操作的逻辑电路或编程计算机的其他成分，其由计算机程序控制；或编码了可执行指令的计算机储存器，这些指令代表了计算机程序，能使计算机以此处所述的特定方式来起作用。
所属领域技术人员会理解本发明的系统和方法可应用于各种系统，包括运行MS-DOS或Microsoft Windows的IBM-兼容个人电脑。另外，个人电脑会有所有与该系统相关的硬件或软件成分从而用户会有可能的存储器、网络连接、打印能力和各种计算机语言的编程能力。有了合适的计算机系统，用户首先能往计算机系统中装载表达谱数据，美国专利第6,203,987号。基因集谱的定义装载入存储介质或远程计算机的存储器中，优选通过网络载入动态基因集数据库系统。接着用户运行投射软件，进行将表达谱转化成投射表达谱的步骤。然后显示投射表达谱。
在另一个示例的实施方案中，用户首先将投射谱导入储存器。然后用户将参考谱导入储存器。接下来，用户运行比较软件，进行客观比较谱的步骤。
7.筛选能促进或保持认知功能的化合物
通过本发明指导，利用本发明的体外和体内筛选方法能鉴定调节与认知功能相关的基因表达的试剂。
本发明提供了鉴定用于促进或保持哺乳动物认知功能的试剂的方法，如，鼠和人。在一个方面，筛选方法包括进行鉴定试剂的方法，所述试剂能调节编码谷氨酸转运蛋白的基因的表达或调解由该基因编码的谷氨酸转运蛋白的活性，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4或EAAT5。为了简化，以下所写的″EAAT″指EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5中的每一个，指包括所有基因/蛋白质的组，并指所有小组组合(如，EAAT1和EAAT2)。可选地，筛选方法包括进行鉴定试剂的试验，所述试剂能调节天冬氨酸氨基转移酶的表达。
许多不同筛选规程可用来鉴定试剂，所述试剂能调节哺乳动物细胞中的EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶的表达水平(如鼠细胞、非人灵长类细胞或人细胞)。一般而言，筛选方法包括筛选多种试剂(“测试试剂”)来鉴定能改变EAAT活性或水平的试剂，可通过诸如但不限于，结合到EAAT多肽，阻止抑制剂与EAAT多肽结合，或增加EAAT基因的表达。另外，筛选方法包括筛选多种试剂来鉴定能改变天冬氨酸氨基转移酶活性或水平的试剂，可通过诸如但不限于，结合到天冬氨酸氨基转移酶多肽，阻止抑制剂与天冬氨酸氨基转移酶多肽结合，或增加天冬氨酸氨基转移酶基因的表达。
“测试试剂”包括各种普通类型的化合物，其包括但不限于，小有机分子、已知药物、多肽；碳水化合物，如寡糖和多糖；聚核苷酸；脂或磷脂；脂肪酸；类固醇或氨基酸类似物。可从文库中得到测试试剂，如天然产物文库和组合文库。许多不同类型的文库可从商业渠道获得而且制备文库的方法如PCT公开WO 93/06121，WO 95/12608，WO 95/35503，WO 94/08051和WO 95/30642所述。另外，已知自动测试的方法能允许短期内筛选几千种化合物。
某些筛选方法包括筛选能增加细胞中EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶蛋白表达或活性的化合物。这些方法能包括进行基于细胞的测试，其中将测试化合物与一种或多种表达EAAT基因或蛋白质的细胞接触，然后检测EAAT表达(如EAAT的RNA水平)或活性的改变。另一种方法包括进行基于细胞的测试，其中将测试化合物与一种或多种表达天冬氨酸氨基转移酶基因或蛋白质的细胞接触，然后检测天冬氨酸氨基转移酶表达(如天冬氨酸氨基转移酶的RNA水平)或活性的改变。所以，在具体实施方式中，方法包括将细胞与测试试剂接触并确定在有测试试剂存在的情况下，基因的表达水平是否改变，其中表达的改变(如增加)显示测试试剂能用于促进或保持认知功能。能在体外、体内或离体接触细胞。典型地，相对于缺少测试化合物的表达，表达增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。
在具体实施方式中，本发明提供一种筛选试剂以确定其能用于减少认知功能障碍的方法，该方法通过提供能表达谷氨酸转运蛋白或哺乳动物神经细胞所表达的天冬氨酸氨基转移酶基因的细胞，将细胞与测试试剂接触；并在存在测试试剂的情况下，确定谷氨酸转运蛋白(如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5之一种或多种)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AT)的活性或表达水平是否增加了，其中该增加显示了测试试剂能用于促进或保持认知功能。通过已知技术来评估表达，包括检测EAAT或AT mRNA比率或丰度的改变。谷氨酸转运蛋白的蛋白质活性能由现有方法来评估，包括测定3H-谷氨酸摄入细胞的摄入量(Lin等，Nature 410：84-88，2001)。天冬氨酸氨基转移酶蛋白质活性能由现有方法来评估，包括在存在NADH的情况下的苹果酸脱氢酶的偶联反应(Karmen，J Clin Invest 34：131，1955；Amador和Wacker，Clin Chem 8：343，1962)。
通常该测定包括比较相对于相似细胞或没有接触测试化合物的细胞(即对照细胞)的测试细胞中的活性或表达。在相关的具体实施方式中，测试化合物给药给多细胞生物(如动物)。EAAT或天冬氨酸氨基转移酶成分可以完全是细胞或多细胞生物内源产生的，或可以是重组细胞或转基因生物的，其中包含一种或多种重组表达的EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶蛋白。利用公开的基因和蛋白质序列以及常规方法来表达重组的EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶蛋白(如参见，Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，纽约(2002年重版))。
利用表达EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶基因的细胞类型可以进行试验，在各种具体实施方式中，包括培养的细胞(如基本培养基上的细胞或建立的细胞系)和体内细胞。示例的细胞包括神经元、神经胶质细胞、混合的神经培养剂或细胞，在所述细胞中EEAT和/或天冬氨酸氨基转移酶基因的表达是由重组表达所诱导的。这些细胞(如基本培养基)可从胚胎海马中获得。许多其他合适的细胞或细胞系对从业人员来说是已知的。
试剂对细胞中或体外系统中EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶基因表达的影响能与基线值作比较，基线值一般是没有测试试剂的细胞或体外系统的表达水平。也可以为不表达EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶的细胞确定表达水平，定作阴性对照。另外，这些细胞一般与测试细胞具有实质上相同的遗传性质。
其他基于细胞的测试有报告测试，其不必用表达EAAT和/或天冬氨酸氨基转移酶的细胞来进行。这些测试中的某些用异源核酸构建体来进行，该构建体包括EAAT或天冬氨酸氨基转移酶基因启动子，该启动子可操作地与编码可检测产物的报告基因相连。EAAT基因启动子在大多数情况下位于转录起始位点上游(或5′)约300至1000 bp的区域中，例如Su等，PNAS 100：1955-1960，2003所述的。天冬氨酸氨基转移酶基因启动子在大多数情况下位于转录起始位点上游(或5′)约300至1000 bp的区域中，例如Obaru等，J Mol Biol.200：13-22，1988所述的。某些EAAT和天冬氨酸氨基转移酶基因启动子如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和科学文献所述。能用许多不同的报告基因。示例的报道基因包括绿色荧光蛋白、J-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、J-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等等。在这些测试中，带有报告构建体的的细胞与测试化合物接触。测试化合物使得可检测的报告基因表达，所述化合物是要么通过与之结合而活化启动子或引发级联反应产生活化启动子的分子。各种不同类型的细胞可用于报告测试中(如真核细胞，如酵母、COS、CHO、HepG2和HeLa细胞系)。
鉴定能增加EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质活性的试剂也可包括筛选能结合EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质的化合物，至少一些这样鉴定出的化合物可能是EAAT或冬氨酸氨基转移酶的调节因子。在这些筛选中鉴定的前导化合物能用作合成更具活性的类似物的基础。所以，在一个方面，本发明提供了一种筛选试剂以确定其用于减轻认知功能障碍的方法，该方法通过(a)将EAAT或天冬氨酸氨基转移酶基因编码的多肽或表达这种多肽的细胞与测试化合物接触，和(b)确定多肽是否与测试化合物结合。这种结合显示了测试试剂能用于减轻认知功能障碍。结合试验通常包括将EAAT或天冬氨酸氨基转移酶多肽与一种或多种测试化合物接触并给予足够的时间使蛋白质和测试化合物形成结合复合体。确定测试化合物直接结合EAAT或天冬氨酸氨基转移酶多肽的能力，可通过诸如将化合物于放射性同位素或酶标记偶联来完成，从而通过检测复合物中标记的EAAT或天冬氨酸氨基转移酶多肽来确定化合物与EAAT或天冬氨酸氨基转移酶多肽的结合。用大量已确立的任何分析技术来检测形成的任何结合复合物。蛋白质结合试验包括但不仅限于测量共沉淀、在非变性SDS聚丙烯酰胺凝胶上共转移以及Western印迹上共转移的方法(如参见，E.C.Hulme，1992，A Practical Approach/The Practical Approach Series(Series Eds D.Rickwood和BD Hames)中的″受体-配体相互作用″，IRL Press at Oxford University Press)。用于这些试验的EAAT(或天冬氨酸氨基转移酶)多肽可以是纯化的或重组的。如上所指出的，EAAT(或天冬氨酸氨基转移酶)蛋白质的重组表达和纯化能用常规方法来完成。
EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白能在体内与一种或多种细胞和细胞外分子(如，但不仅限于，肽、蛋白质、激素、协同因子和核酸)相互作用，这些分子在此被称为“结合体”。已知有方法来鉴定其天然的EAAT体内结合体，如双和三杂交试验(如参见。美国专利第5,283,31号；Zervos等，1993，Cell 72：223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 8：1693-1696；BrentW094/10300)。这些EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质结合体可涉及由EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白或EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白介导信号途径的下游元件所造成的信号传递，或可选地，发现可以是EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白的抑制剂。通过本发明的应用可设计现有测试用以鉴定能调节(如，如正向或负向影响)EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质及其结合体之间相互作用的化合物。典型地，能干扰EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质及其结合体之间相互作用的化合物的试验包括制备包含EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质及其结合体的反应混合物，在一定条件下并给予足够的时间使2种产物相互作用并结合，进而形成复合物。为了测试试剂的抑制能力，在存在和缺少测试化合物的情况下制备反应混合物。在本发明的范围内也包括直接检测的方法，该方法无需进一步样品处理就在同质或异质性试验中检测EAAT或天冬氨酸氨基转移酶蛋白质及其天然结合体和/或测试化合物之间的相互作用。例如，可用荧光能量转移技术(如参见，Lakowicz等，美国专利第5,631,169号；Stavrianopoulos等，美国专利第4,868,103号)。
在一个方面，上述试验鉴定的试剂可以给药给实验动物以测定它们认知促进和保持活性(如参见以下实施例)。
在一个方面，本发明描述了一种筛选用于促进哺乳动物认知功能的化合物的方法，通过向哺乳动物给药测试化合物，在给药所述测试化合物后，确定哺乳动物中一种或多种EAAT或AT基因的表达水平，将基因的表达水平与没有给药测试化合物的哺乳动物神经组织中的参考表达水平进行比较，并确定基因表达水平与相应参考水平的差异，其中差异显示了测试化合物为促进认知功能的候选治疗剂。方法也可进一步包括将基因表达水平与给药了头孢曲松或丙戊酸的哺乳动物神经组织中的参考水平进行比较的步骤。在一个具体实施方式中，哺乳动物为大鼠，如老年大鼠。
8.治疗方法和组合物
本发明另一个具体实施方式与具有任何上述治疗效果的药物或无菌组合物以及药学上可接受载体的给药有关。这些药物组合物可包含分子，如小分子，其能有益地调节与衰老期间保持或促进认知功能相关的基因表达。
发明人出人预料地发现了在大脑神经元和神经胶质细胞周围的细胞外空间中，包括突触间隙和突触外空间，减少L-谷氨酸水平与衰老期间保持或促进认知功能相关。在一个方面，本发明提供一种保持或促进哺乳动物认知功能(如，治疗与衰老有关的认知功能障碍)的方法，通过增加脑细胞谷氨酸转运蛋白的表达来进行。在相关的方面中，本发明提供一种减轻哺乳动物与衰老相关的认知功能障碍的方法，其通过增加脑细胞表达的谷氨酸转运蛋白的活性来进行。
在一个方面，通过向哺乳动物给药小分子来增加谷氨酸转运蛋白的表达或活性。示例的小分子包括头孢菌素及其类似物或衍生物、丙戊酸及其类似物或衍生物、MS-153及其类似物衍生物和促代谢谷氨酸受体(mGluR的；参见以上Aronica等所述)的激动剂。小分子可直接增加转运蛋白的表达或活性(如通过与转运蛋白的编码基因的启动子相互作用，或通过与蛋白质产物本身相互作用)或间接进行(如增加蛋白质的表达或活性，所述蛋白质能刺激转运蛋白的表达或活性，或者减少蛋白质的表达或活性，所述蛋白质能抑制转运蛋白的表达或活性)和PACAP(″垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽″)。
其它能增加谷氨酸转运蛋白表达或活性的示例化合物包括利多卡因(Do等，Anesth Analg.2002 95：1263-8″The effects of lidocaine onthe activity of glutamate transporter EAAT3：the role of proteinkinase C and phosphatidylinositol 3-kinase″)  和激酶抑制剂(如Conradt，J Neurochem.199768：1244-51″Inhibition of thehigh-affinity brain glutamate transporter GLAST-1 via directphosphorylation″)。
示例说明但不作为限制的示例的治疗化合物在以下章节会有更详细的描述。
8.1示例的治疗组合物
示例的小分子，其能有益地调节与衰老期间促进或保持认知功能相关的基因(如EAAT基因)表达，其包括式I与头孢菌素有关的化合物：
Figure A20081008253500611
其中，每个符号独立表示：
L为O或S；
R为H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H；
R1为-(CH2)n-C(O)X
其中
X为OH、NR2、SH、O-碱金属或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2；
和
n为0-6并且包括0和6的整数；
R2为H、C1-10烷基、C2-8链烯基或-(CH2)a-W-R3
其中R3为H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A；
W为O、S或NR4；和
a为1-6并且包括1和6的整数；
其中R4为H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的杂烷基或杂芳基环；
Figure A20081008253500612
线表示单或双键；
R5为R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或当
Figure A20081008253500613
线为双键时，R5选自＝CHCH2CO2H和＝NR；
m为0或1；和
A为式Ia的芳基或杂芳基：
Figure A20081008253500621
其中，每个符号独立表示：
J为O、S、NR6或CR6；和
y为1或2；
其中R6为电子对、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；或A为式Ib或Ic的杂环烷基：
Figure A20081008253500622
其中，每个符号独立表示：
J为O、S或NR；和
X为O或H2。
式I所述特定类型的化合物包括″头孢曲松″，其指广谱的头孢菌素抗生素，(6R，7R)-7-[2-(2-氨基-4-噻唑基)乙醛酰氨基]-8-氧代-3-[[(1，2，5，6-四氢-2-甲基-5，6-二氧代-旁-三嗪-3-基)硫基]甲基]-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，72-(Z)-(O-甲基肟)，二钠盐，倍半水合物。头孢曲松可从Roche的商业渠道获得，商品名为Rocephin。制备化合物分子式的方法可在例如，美国专利第5,574,155；5,739,346；5,856,502；5,869,649；5,945,414；5,945,532 6,090,801号中找到。头孢曲松衍生物包括任意第三代头孢菌素，其能杀死好氧的革兰氏阴性杆菌。第三代头孢菌素的例子有头孢磺吡苄、头孢氨噻、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、拉氧头孢和头孢他啶。
其他能有益地调节与衰老期间促进或保持认知功能相关的基因(如EAAT基因)表达的小分子的例子包括与丙戊酸有关的式II的化合物：
Figure A20081008253500631
其中，每个符号独立表示：
X为-OH、C1-10烷氧基、-O-碱金属、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基；
R为直链或支链C1-30烷基；和
R1为H、C1-10烷基、C2-10链烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基；
条件是：R可以是未取代的或由一个或多个-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
式II所述特定类型的化合物包括″丙戊酸″，其指抗痉挛的药物2-丙基戊酸，其与增加大脑γ-氨基丁酸(GABA)的浓度有关。在此也列出丙戊酸其他名称或说明，如DepakoteTM、ValproateTM、ValreleaseTM和丙戊酸钠。制备化合物分子式的方法可在例如，美国专利第4,558,070；4,595,695；4,654,370；4,895,873；4,913,906；5,017,613；5,019,398；5,049,586；5,162,573；5,440,023；5,856,569；6,131,106和6,610,326号中找到。
其他能有益地调节与衰老期间促进或保持认知功能相关的基因(如EAAT基因)表达的小分子的例子包括与(R)-(-)-5-甲基-1-烟酰基-2-吡唑啉有关的式III的化合物：
Figure A20081008253500641
其中，每个符号独立表示：
R为H、C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R1为H、C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R2为包含1-4个杂原子的杂环或杂芳基环，杂原子选自：N、O或S；
L为O、S或NR；和
X为CR2、O或S。
式III所述特定类型的化合物包括(R)-(-)-5-甲基-1-烟酰基-2-吡唑啉(MS-153)。
还包括在本发明方法中的有药学上可接受的加成盐和式I、II和III化合物的复合物。在化合物可有一个或多个手性中心的情况下，除非特别指明，本发明包括每个独特的外消旋化合物和每个独特的未外消旋的化合物。在化合物有不饱和碳-碳双键的情况下，顺式(Z)和反式(E)异构体都包括在本发明的范围之内。在抑制剂以互变异构体的形式存在的情况下，如酮-烯醇互变异构，如
Figure A20081008253500642
和
Figure A20081008253500643
，每种互变异构体的形式都被认为包括在本发明的范围之内，无论存在于等式或以合适R′取代来形成一种形式。任何取代基在任何一个符号位的意义是独立表义的，或任何其他取代基的意义，在任何其他符号位也是如此。
也包括在本发明的方法中的有式I、II和III化合物的前药。
本发明所用的药物组合物可以通过任何途径给药，包括但不限于，口服、静脉内、肌肉内、动脉内、脊髓内、  鞘内、心室内、经过皮肤、皮下、腹膜内、鼻内、肠道、局部、舌下或直肠给药的方法。
组合物可以单独或与至少一种其他试剂联合给药，如与稳定化合物，其可包含于任何无菌、生物相容的药物载体中给药，载体包括但不限于，盐水、缓冲盐液、葡萄糖和水。组合物可以单独或与其他试剂、药物或激素联合向患者给药。
本发明组合物所含的某些化合物可以以特定几何或立体异构体的形式存在。另外，本发明的聚合物也可以有光学活性。本发明涵盖了所有这些化合物，包括顺-和反-异构体、R-和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物和其他混合物，都落入本发明的范围之内。其他不对称的碳原子可存在于取代基中，如烷基。所有这些异构体及其混合物都要包含在本发明中。
例如，如果需要本发明化合物的特定对映异构体，可以通过非对称合成或通过手性辅助化合物衍生来制备，其中最终非对映异构体混合物被分离并裂解辅助基团从而提供纯的所需的对映异构体。可选地，当分子包含诸如氨基的碱性基团或诸如羧基的酸性基团时，用合适的光学活性酸或碱来形成非对映异构体，接着溶解非对映异构体，从而通过现有的分级结晶或层析法来处理，接着获得纯的对映异构体。
为了本发明的目的，根据CAS版，Handbook of Chemistry andPhysics，67版.，1986-87，内封面的元素周期表来鉴定化学元素。也是为了本发明的目的，术语″碳氢化合物″指包括所有具有至少一个氢和一个碳原子的所有允许的化合物。在广义的方面，允许的碳氢化合物包括无环和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族的有机化合物，其可以被取代或未被取代。
8.2治疗组合物
在此所述的组合物的预期的等价物包括相当于此处组合物的并与其具有相同共性的组合物，其中取代基或成分进行一种或多种简单的变化而又不为感兴趣的组合物的特性带来不利影响。
除了活性成分，如一种或多种治疗剂，本发明的药物组合物可以包含合适的药学上可接受的载体，其包含能帮助活性化合物制备成药学上使用的制剂的赋形剂和辅剂。更详细的配伍和给药技术可在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中找到。
用现有药学上可接受载体与口服的药物组合物配伍，以适合的剂量口服给药。这些载体能使药物组合物配成片剂、丸剂、糖锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮剂等等，由患者来摄取。
通过将活性化合物与固相赋形剂组合并最终处理成来获得口服的药物制剂并最终处理成颗粒状混合物(任选在磨碎后)从而获得片剂或糖锭的核心。如需要，可加入合适的辅剂。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填料，如糖，其包括乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨醇；淀粉，其来自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其他植物；纤维素，如甲基纤维素、羟基丙基甲基-纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白质，如明胶和胶原蛋白。如果需要，加入破碎或增溶的试剂，如交联的聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂和褐藻酸或其盐，如褐藻酸钠。
糖锭的核心可与合适的包衣联合使用，如浓缩的糖溶液，其也可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羰乙烯胶、聚乙烯基乙二醇和/或二氧化钛，紫胶漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素也可加入到片剂或糖锭包衣中从而区分产物或表征活性化合物的量，即剂量。
能口服使用的药物制剂包括由明胶制成的适合推送的胶囊，以及由明胶和包衣制成的密封软胶囊，如甘油或山梨醇。适合推送的胶囊能包含与填料或粘合剂混合在一起的活性成分，如与乳糖或淀粉，润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，并任选有稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可溶于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油，液体，或液体的聚乙烯基乙二醇，并混有或没有稳定剂。
适合胃肠外给药的药物配方可以以水溶液配伍，优选以生理相容的缓冲液，如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理盐水。注射悬浮水剂可包含增加悬浮液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成合适的注射悬浮油剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油或合成脂肪酸酯，如乙基油酸，甘油三酯或脂质体。非脂聚阳离子氨基聚合物也可用于递送。任选地，悬浮液液可包含合适的稳定剂或试剂以增加化合物的溶解性并能制备高浓度溶液。
对于局部或鼻部给药，适合穿过特定屏障的渗透剂用于配方中。这些渗透剂一般是公知的。
本发明药物组合物可以现有已知的方式来制备，如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖锭、细磨、乳化、制胶囊、包埋或冻干过程的方式。
药物组合物可制成盐并与许多酸一起形成，包括但不限于，盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸和琥珀酸。相对于那些相应的游离碱的形式。盐倾向于更易溶于水或其他质子化溶剂中。在其他情况下，优选的制剂可以是冻干粉，其可包含以下之任意或全部：1mM至50mM的组氨酸，0.1％至2％蔗糖和2％至7％甘露糖，其pH范围为4.5至5.5，其与前面的缓冲液组合使用。
制备出药物组合物之后，可将它们置于合适的容器中并标记能用于明确病情的治疗。对于头孢曲松的给药，例如，这样的标记将包括用量、频率和给药方法。
适用于本发明的药物组合物包括组合物，其中包含有效量的活性成分以获得要求的目的。确定有效剂量完全在所属领域技术人员的能力范围中。
对于任何化合物，最初可在细胞培养试验中估算有效治疗剂量，如根据上述的Aronica等的方法，或在动物模型中估算，如在小鼠、大鼠、兔、狗或猪中。动物模型也可用于确定给药的和时浓度范围和途径。如此述所述，尤其优选的动物模型使用有行为特点的鼠。然后可用这些信息确定人中的有用剂量和给药途径。
有效治疗剂量指活性成分的量，例如头孢曲松、头孢曲松类似物、头孢曲松衍生物、丙戊酸、丙戊酸类似物、丙戊酸衍生物、MS-153、MS-153类似物或MS-153衍生物，其能改善症状或病情。可通过标准药学流程在细胞培养中或用实验动物来确定疗效和毒性，如通过计算ED50(在群体的50％中有效治疗的剂量)或LD50(使群体的50％致死的剂量)统计值。疗效比毒效的剂量比率为治疗参数，其能以LD50/ED50来表示。优选显示大的治疗参数的药物组合物。细胞培养试验和动物研究中获得的数据用于阐明人所用的剂量范围。这些组合物中所含的剂量优选处于循环浓度的范围内，其包括很小的ED50或没有毒性。根据所用的剂量形式、患者的敏感性和给药途径，剂量可在该范围内变化。
由从业人员根据与需要治疗的个体相关的因素来确定精确的剂量。调节剂量和给药以提供足够的活性部分的水平或保持预期的效果。要考虑的因素包括认知功能障碍的程度、个体的健康概况、年龄、体重、个体的性别、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性、以及对治疗的反应。根据特定配方的半衰期和清除率，长效的药物组合物的给药可以每3至4天，每周，或每两周一次。
根据给药途径，普通剂量可在约0.1μg至100,000μg间变化，总剂量至多约1克。特定剂量和递送方法的指导已在文献中提供了并一般可供所属领域从业人员使用。
为了在中枢神经系统的靶上取得治疗效果，所述靶如EAAT1、2、3、4或5，本发明方法中所用的化合物在外周给药时应当能容易地穿过血脑屏障。可是，不能穿过血脑屏障的化合物人能通过诸如心室内给药途径直接有效地进入中枢神经系统。
术语″药学上可接受的盐″为公认的表述，其指化合物的相对无毒的、无机和有机酸加成盐，包括例如，本发明组合物所包含的那些。
术语″药学上可接受的载体″为公认的表述，其指药学上可接受的的材料、组合物或载体，如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包装胶囊的材料，它们涉及运载或运输任何特定组合物或其成分，从身体的一个器官或部分运至身体的另一个器官或部分。每种载体必须是“可接受的”，其意义为能与特定组合物及其成分相容并对患者无害。一些可用作药学上可接受载体的材料的例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可油和栓剂的蜡；(9)油，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)乙二醇，如丙烯基乙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙烯基乙二醇；(12)酯，如乙基油酸和乙基月桂酸；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)Ringer溶液；(19)乙基乙醇；(20)磷酸缓冲液；和(21)其他用于药物配方中的无毒相容的物质。
术语″系统给药″、″系统地给药″、″外周给药″和″外周性给药的″为公认的表述，其指除了直接向中枢神经系统给药外，向个体给药组合物、治疗或其他材料，从而使之能进入患者的系统，并由此影响代谢和其它类似过程，例如，皮下给药。
术语″肠胃外给药″和″肠胃外给药的″为公认的表述，其指除了肠道和局部给药之外的给药模式，通常通过注射进行，其包括但不仅限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、被膜内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经过气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输液。
9.实施例
本发明，如一般所述的那样，可以容易地通过参考以下实施例来理解，包括的实施例仅仅为了说明本发明的某些方面和具体实施方式，其并不以任何方式来限制本发明。
9.1表征年轻、年老有障碍的(AI)和年老无障碍的(AU)动物
9.1.1 Morris水迷宫(MWM)和辐射臂状迷宫(RAM)的受试者
我们用MWM对9只年轻(4-6个月)和18只年老(25-27个月)无病的雄性Long-Evans鼠进行行为测试并用相同的动物进行微阵列分析。另外10只年老的鼠在MWM中测试，然后在RAM中进行训练和测试，经过两项任务用以评估对认知功能中个体差异的测试-再测试的可靠性。
9.1.2 Morris水迷宫的设备
MWM的设备由注水(27℃)的大圆形池(直径1.83m；高度0.58m)组成，其中通过添加无毒色素或一些其他物质来使之不透明。在典型的“隐藏平台”版任务中，训练鼠寻找伪装的白色逃跑平台(高度34.5cm)，该平台位于迷宫一个四分之一部分的中心，低于水平面仅1.0cm。该平台能缩进桶的底部或在行为测试期间从迷宫外面升至其正常位置。该平台的位置在一个实验至另一个实验中保持恒定。因为没有位置线索来标记平台的位置，所以鼠从池子周边任何起始位置上有效定位的能力依赖于使用迷宫周围的信息。迷宫用缀有白色图案的黑色帘布来包围以提供空间线索构造。第二个平台(高37.5cm)，其表面为黑色，在线索训练期间将其升至高于水面2cm，使用人物版本来控制不与认知相关的因素。鼠在池中的行为用悬挂在池中央2.5m上面的照相机来记录，照相机与视频跟踪系统(HVS高级图像跟踪器VP200)和运行HVS软件的PC计算机相连，它们由Richard Baker的HVSImage，Hampton，英国开发。
9.1.3 Morris水迷宫过程
针对认知的衰老效应的灵敏度并针对远系繁殖的Long-Evans鼠的年老群体中个体差异的可靠测量，我们优化了MWM规程(GallagherM，Burwell R，Burchinal M.Behav.Neurosci.107：618-626；1993)。
鼠每天接受3项试验，试验之间间隔60秒，连续进行8天。在每个训练试验中，鼠从池周边四个空间等分的起始位点之一释放入迷宫。起始位点在试验之间发生变化，因此防止使用响应策略(如，总是从起始位置左拐来定位逃离平台)。如果鼠在任何试验中在90秒内没有定位出逃离平台，则实验人员向鼠指示平台，其中保持30秒。每6次试验包括一个探测试验以评估迷宫中空间偏好的发展。在这些试验中，鼠在平台缩回池底时游30秒，到时平台升至其普通位置来完成逃离试验。在用隐藏平台来完成规程中，用可视的平台来评估鼠的线索学习。在一个6个训练试验期中，该平台的位置在各个试验之间发生改变。
按照分析训练试验和探测试验成绩的目的，我们用接近的动物位置。通过取样迷宫中动物的位置(10X/秒)来获得接近测定值从而提供在平均1秒内逃离平台的距离记录。对于探测试验和训练试验，执行纠正过程从而使试验成绩相对无偏差，该偏差由池周边各个起始位置到目标的差异而造成的。在进行该纠正中，为每此试验计算平均游速(路径长度/潜伏期)。然后在计算试验成绩前，从记录中减去以该速度从试验中所用的起始位置游到目标所需的时间，即在训练试验中的累积距离和探测试验中目标的平均距离。所以，设计用接近测量获得的得分来反映搜索错误，代表了最佳搜索的偏差，即至目标的直接路径并在探测试验期间在该位置紧邻处搜索。
9.1.4 Morris水迷宫分析
编译视频追踪的计算机记录以提供迷宫中每个鼠成绩数据。用变化分析来分析对训练试验和探测试验的测定值。
9.1.5 Morris水迷宫的数据结果
隐藏、伪装平台中的训练成绩在年轻和年老组的鼠之间有差异[F(1，23)＝12.69，p＜.002]。对于可视平台中的线索训练试验，组之间没有产生差异。在线索训练中逃离的潜伏期为年轻的平均是9.36秒，而年老鼠是10.60秒。
以内插值替换的探测试验中的平均接近测量值用于对每个单个受试者计算空间学习指数，其具体如Gallagher M，Burwell R，BurchinalM.Behav.Neurosci.107：618-626；1993所述。当鼠快速学会搜索接近其位置的平台时，其空间指数低。总体来说，年老的鼠与年轻的有差异[F(1，23)＝15.18，p＜.001]。相对于年轻学习群体的学习指数谱，年老的鼠分成无障碍或有障碍的。处在年轻鼠的标准范围内(指数得分＜241)的年老的鼠定为年老无障碍的(图1)。指数得分处于年轻成绩范围之外的余下的年老个体定为年老有障碍的。
9.1.6辐射臂状迷宫的设备
升高的八臂状辐射迷宫的每个臂(7×75cm)从八边形中心平台(30cm直径，51.5cm高)的每个面上突出来。臂上的清晰侧面墙有10cm高并以65°夹角形成槽。食物孔(4cm直径，2cm深)位于每个臂的末端。树脂玻璃构建的块(30cmH×12cmW)安置以阻挡任何臂的入口。在围绕设备的室中提供了许多其它的迷宫线索并通过高过头的固定设备来照明。
9.1.7辐射臂状迷宫流程
首先让鼠在8分钟期间习惯于迷宫，连续进行4天。在这些期间的每一个中，在RAM上散布着奖励食物，最初放在平台中心和臂上，然后渐进地就放到臂上了。在该习惯阶段后，使用标准训练规程，其中食物小球位于每个臂的末端。鼠每天接受一次试验，进行18天；当所有8个食物小球都被获取了或已进行了16个选择或过去了15分钟，则终止每天的试验。错误包括回到已经取掉食物的臂上(所有4个爪子都抓在臂上)。该阶段结束后，通过在试验期间加入延迟来增加要求记忆力的任务。堵住每个试验中3个臂的开口。封闭的臂的特性和构造在试验之间发生改变。使鼠在5个臂上获取食物，所述的臂在试验一开始就允许进入。然后从迷宫中去除鼠60秒，在此时间中去除迷宫上的障碍，由此允许进入所有8个臂。然后将鼠放回平台中心，使其获取剩下的奖励食物。
9.1.8辐射臂状迷宫分析
在测试试验中用60秒使记忆力发生错误，这时鼠回到5个在延迟前已访问过的臂中的一个。在4个连续的测试试验中计算每只鼠的成绩的平均值。利用参数统计(非配对的t-测验)来比较年轻和年老组之间的成绩。利用相关性分析(Pearson氏r)来检测年老鼠(N＝10)在Morris水迷宫(学习指数得分)和辐射臂状迷宫(记忆力错误)间成绩的关系。
9.1.9辐射臂状迷宫的结果
在RAM的延迟版中的年轻成年鼠的成绩以延迟间隔的函数变化，变化范围在60秒至8小时(Chappell等Neuropharmacology 37：481-488，1998)。以前在MWM中表征的年老鼠相对于年轻鼠，在60秒延迟后发生了更多的记忆力错误(p＜.025)。平均年轻鼠发生0.17个错误，而年老的鼠平均发生1.52个错误。可是，10只年老的鼠在RAM中显示出广泛范围的成绩。发现在最初的MWM表征和在RAM中记忆力成绩显著相关(r值＝.82，数据如图2所示)。
9.2年轻、年老有障碍(AI)和年老无障碍(AU)动物中的基因表达分析
9.2.1从有行为特征的动物中制备RNA
27只有行为特征的鼠(数据如图1所示)用过量的戊巴比妥钠(100mg/kg)杀死。从两侧分离海马并冻存(-80℃)。称重每个动物的海马并在合适体积的苯酚-鸟粪胺异硫氰酸(Trizol试剂；1ml每100mg的组织中最少用1ml体积)中均浆。用氯仿(每ml的Trizol用200μl)抽提每个样品并用异丙醇沉淀。空气干燥RNA小球并重悬于DEPC处理水溶液中。所有样品储存于-80℃。根据厂商说明，用Qiagen′s Rneasy少量RNA提取试剂盒来进一步纯化一部分RNA并接着储存于-80℃。通过测定260nm处的吸收光来定量样品并用260nm和280nm处的吸收比率来确定纯度。通过琼脂糖凝胶电泳来确证样品的完整性和浓度。扫描琼脂糖凝胶的照片，利用NIH-成像来转化并定量像素。然后如果需要，可调节浓度。
对于基因微阵列分析，汇总同一表型的3种(为Y，AI或AU)鼠的样品来对3种GeneChip
Figure A20081008253500721
/表型的样品大小产生独立的微阵列分析。根据MWM中空间学习指数获得的行为特征，汇总组织到表I中。
表I
年青  年老无障碍  年老有障碍
Y1：143.1，171.4，194.6  AU1：181.5，202.9，229.5  AI1：268.3，283.2，381
Y2：139.5，169.4，186.6  AU2：183.9，218.4，229.3  AI2：285.5，303.4，337.7
Y3：169，173.9，196.5  AU3：193.3，228.2，230.6  AI3：282.2，307.2，329.3
9.2.2反转录和与微阵列的杂交
用Affymetrix Enzo生物阵列高产RNA转录标记系统制备用于杂交的cRNA标记探针。将RNA反转录成cDNA并转化成生物素标记的cRNA。反转录之前，加入每种标记系统所提供的内在标准以测试RNA。然后在进行实验性GeneChip
Figure A20081008253500731
杂交前，在对照芯片上测试cRNA以保证反转录和标记是最优的。将cRNA应用于U34A AffymetrixGeneChip
Figure A20081008253500732
阵列中。这些阵列包括7000个鼠的表达基因和1000个EST的特异序列，并包括最近开发的、较小的神经科学基因微阵列上的所有基因。基因芯片应用流体仪自动将标记的导入到基因阵列上并在基因芯片杂交箱中进行杂交。用以共聚焦激光扫描为基础的基因阵列扫描仪来检测并定量每个寡聚体集合的杂交信号。
9.2.3微阵列的数据分析
基因芯片分析套件和Affymetrix MAS4.0以及更近开发出的MAS5.0算法用于我们的数据分析。两个算法都有默认的初始值，其基于已知的阴性基因和每个芯片的平均信号强度。基于由Affymetrix预先确定的寡核苷酸集合的标准化和计数方法被用于基因芯片间的比较。两个算法都产生与每个表达基因相对应的完全匹配(PM)的寡聚物的每个集合的表达水平值，该值是相对于不匹配(MM)的寡聚物的集合的，设计用来计算抑制完全匹配的cRNA杂交所需改变的碱基。MAS4.0经验算法用原始数据来产生平均差异调用，其提供了每个基因的PM寡聚物相对于对照MM寡聚物的杂交信号强度的测量方法。存在(P)，边际(M)，或缺少(A)的绝对调用是以PM寡聚物的数量为基础的，其与MM寡聚物正相关。MAS5.0统计算法基本根据相同类型的比较但应用统计方法来产生p值以增强当前反映的表达水平高于背景的调用可能性。另外，将统计学标准应用于信号算法以计算杂交信号强度，其要能最小化每个探针的PM和MM寡聚物内逸出值的影响。体现表达水平的数据中的基本差异由2个算法来生成，其就是设计MAS5.0来减少阴性表达水平，该阴性表达水平会导致高估2个比较组间改变了表达水平的基因数量。总的来说，从每个寡聚物集合用MAS5.0得来的信号小于用MAS4.0的。
我们的模型的能力部分在于比较Y，AU和AI这3组的能力，从而鉴定那些基因，所述基因会在年轻和年老的海马之间产生改变并由此一般与衰老过程相关，并鉴定那些区分AU和AI鼠的基因。通过该过程鉴定出的基因特异地与衰老-认知功能障碍或保持认知功能相关。
在此处产生的公开数据中，我们进行了一系列分析步骤以鉴定3个年老和认知功能障碍模型的信息基因集。集合1包括感兴趣的基因，其不同于年轻的而只有年老的功能。集合2包括感兴趣的基因，其在有障碍的年老鼠中相对于年轻和年老无障碍的产生了改变。集合3(被称为年老无障碍的基因)由基因组成，所述基因在年老无障碍的中相对于年轻和年老有障碍的产生了改变，并因此可以与衰老诱导的认知功能保持有关。在MAS5.0分析前从完整微阵列数据集中产生出每种集合，然后用相似的算法进行效果大小分析。
在此处我们描述了产生集合3(年老无障碍的基因)的步骤，其中包括了谷氨酸转运蛋白。在第一步中，芯片上所有探针集合的值代表年轻鼠(N＝3)中的基因表达并检测年老有障碍(N＝3)的检测标准。从进一步考察中去掉所有用MAS5.0分析的绝对调用中未达到检测标准的探针对的集合。然后行简单的效果分析以确定芯片上2组(年轻和年老有障碍的)的值的效果大小相差不超过1.0。所有探针集达到所有检测标准和汇总在比较组中的标准(年轻和年老有障碍的效果大小相差不超过1.0或更大)。对这些汇总的年轻和年老有障碍的集合与年老无障碍芯片的相应探针集进行简单的效果分析。简单效果分析产生384个探针集，代表能保持衰老诱导的认知功能的“感兴趣的基因”，效果大小为1.25或更大。显著性推论统计测试的有力分析表明微阵列试验的样品大小(3个年老无障碍的芯片和6个汇总比较组的芯片)能以p＜.05检测到80％强的基因有2.5或更大的效果大小差异。现在接下来用9个年老无障碍的和每个比较组(年轻和年老有障碍)中有9个受试者的样品大小进行的分析中，预计效果大小为1.25及以上的会有80％的统计学可能。
9.2.4微阵列的结果
在人和啮齿动物神经系统中检测到了谷氨酸转运蛋白的差异表达(图3)。这些转录子中的2个没有在海马结构中表达(EAAT4和EAAT5)。剩下的3个转录子在神经元和神经胶质细胞中有不同的细胞位置模式，其都在海马中表达。在GLT-1具有5.87(年老无障碍基因的效果大小分析中的最大值)效果大小的微阵列数据集和GLAST中年老无障碍基因(集合3)的效果大小分析中，第二个谷氨酸转运蛋白具有1.93的效果大小(图4)。在两种情况下，相对于汇总比较的年轻和年老有障碍的，谷氨酸转运蛋白mRNA都在无障碍年老的鼠中增量。如微阵列实验设计有力分析所预期的，相对于比较年轻和年老有障碍的，GLT1 mRNA显著增加了(p＜.0002)。在相似的分析中，GLAST也显著增加了(p＝.0484；图4)。
相对于年轻和年老有障碍的，年老无障碍的天冬氨酸氨基转移酶mRNA的差异也显示了谷氨酸在年老并保持认知功能的鼠中也受差异调节。天冬氨酸氨基转移酶是一种细胞外谷氨酸失活的主要机制，其探针集显示相对于不互相有差异的Y+AI，在AU鼠中有显著的增长。mRNA的效果大小为2.58。
微阵列上的探针集为鉴定了的垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽的基因(PACAP；GenBank登录号：AI227715；EST224410)，其调节谷氨酸转运和代谢(Figiel和Engele，J.Neurosci.15：3596-3605，2000)。相对于比较年轻和年老有障碍的鼠，PACAP mRNA在年老无障碍的中显著升高了(效果大小为3.29，t＝4.13，p＜.005；图4)。
因为PACAP受体是显示脱敏作用的类型，所以β-抑制蛋白2mRNA的强烈增加可对谷氨酸转运蛋白起作用。β-抑制蛋白2具有双重功能，即受体内吞作用和通过同一受体来介导信号级联反应(Wei等，PNAS，100；10782-7，2003；Aha等，PNAS，100；1740-4，2003；如，GenBank登录号：XM_345084)。相对于比较年轻和年老有障碍的，年老无障碍鼠中β-抑制蛋白2的探针集显示出显著的升高(效果大小＝2.78，t＝2.59，p＜.05)。
9.2.5原位杂交组化分析
接下来用独立的动物集合(每组N为3或4)利用海马切片进行原位杂交组化分析。
9.2.6原位杂交探针的制备
我们有反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来产生与谷氨酸转运蛋白相对应的特异探针，其中通过微阵列分析已鉴定了该蛋白在AU鼠海马中起上调作用。年老鼠(具有(AU)得分或不在(AT)年轻动物得分内的动物集)海马中制得的RNA用寡聚T和反转录酶来进行反转录。然后将该cDNA用作正义和反义寡聚物探针(表II)在第一轮PCR反应中的模版来扩增双链与下述特定谷氨酸转运蛋白对应的cDNA。使用标准PCR条件(94℃初始变性4分钟，72℃退火40秒，35个循环为94℃变性30秒，55℃退火30秒并72℃延伸30秒，72℃最后延伸4分钟并降温至4℃)。PCR的整个产物在溴化乙锭-琼脂糖凝胶上进行电泳以确证产生了合适大小的探针。用每个扩增出的cDNA和延长的寡聚物(表II)进行第二轮PCR反应，所述寡聚物包括与SP6启动子序列相应的正义寡聚物加上最初用于延伸每种谷氨酸转运蛋白PCR产物的正义寡聚物，以及包括T7启动子序列和最初每种谷氨酸转运蛋白反义寡聚物的反义寡聚物。这分别用正义和反义链上的SP6和T7启动子产生出特异性谷氨酸转运蛋白cDNA。用乙醇沉淀收集PCR产物并用自动DNA测序仪和SP6引物来确证核苷酸序列。
确证了序列的与每种谷氨酸转运蛋白相对应的带有SP6和T7启动子位点的PCR产物用于体外DNA直接转录出每种第二轮谷氨酸转运蛋白PCR产物的正义和反义RNA。进行体外转录反应，使用了每种PCR产物，SP6或T7聚合酶(每种探针的分别反应中所用的每个酶)，未标记的核苷三磷酸和高度特异活性的35S标记的尿苷三磷酸。这些反应产生了3种放射性标记的反义谷氨酸转运蛋白探针，其通过碱基配对特异识别组织切片中每种不同的谷氨酸转运蛋白mRNA，并产生了相应的正义探针，其包含与谷氨酸转运蛋白mRNA相同的序列，其不能与mRNA进行碱基配对并用作阴性对照。反义探针与Y，AU和AI鼠中能代表整个海马部分的海马冷冻切片一起温浴。正义探针与海马较少选择的区域一起杂交，但足以确证均一的阴性杂交信号并确认用反义探针所得的杂交信号的特异性。在杂交并洗涤后，将切片放到X射线胶片上并进行标准定量自动射线照相(Bizon 2001)来定量信号。
用于衍生模板来制备谷氨酸转运蛋白原位杂交组化的正义和反义RNA探针的寡聚物如表II所述。
表II
GLT-1 EAAC1   GLAST
 PCR产物 405bp 409bp   441bp
 正义链 5’-GAGCATTGGTGCAGCCAGTA-3’ 5’-GTCTGAGAACAAGACAAAGG-3’   5’-GGTAGAAGCCTGCTTTAAAC-3’
 反义链 5’-CCAAGGTTCTTCCTCAACAC-3’ 5’-TGAGAGCTGTCAGGAGAGC-3’   5’-GGCATGAATGAGGAGGCCGAC-3’
 延长的SP6正义链 5’-tatttaggtgacactatagGAGCATTGGTGCAGCCAGTA-3’ 5’-tatttaggtgacactatagGTCTGAGAACAAGACAAAGG-3’   5’-tatttaggtgacactatag GGTAGAAGCCTGCTTTAAAC-3’
 延长的T7正义链 5’taatacgactcactataggggCCAAGGTTCTTCCTCAAC-3’ 5’taatacgactcactataggggTGAGAGCTGTCAGGAGAGC-3’   5’-taatacgactcactataggggGGCATGAATGAGGAGGCCGAC-3’
9.2.7制备用于原位杂交组化的组织
11只有行为特征的鼠(n＝4年轻的和n＝7年老的)用过量戊巴比妥钠(100mg/kg)并用4％溶于0.1M pH 7.4磷酸缓冲液(PPB)的多聚甲醛心脏灌输杀死。在7点至10点间进行所有的灌输。固定后，从头盖骨中取出大脑并立即从周围组织中切出左右测海马体。切出的海马体在PPB中固定24小时，溶于包含20％蔗糖的PPB防冻液中24小时，在粉状干冰上以“伸展的”方向冷冻，并储存于-80℃，直至进一步处理。
每个动物海的马状突起用冷冻显微切片机进行切片，按经度轴切成冠状(25mm)，并收集进冰冷的PPB中。自由流动的组织切片用含0.75％甘氨酸的0.1M pH，7.2的磷酸缓冲液(PB)洗涤，并用0.1M PB单独洗涤以除去多余的固定剂。切片在37℃以蛋白质酶K(在含0.05％SDS的0.1M Tris缓冲液中有1mg/ml)处理30分钟，在含0.25％乙酸酐的0.1M pH 8.0三乙醇胺中乙酰化，并用2X柠檬酸钠缓冲液(SSC；1XSSC＝0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)冲洗。然后在60℃杂交组织42-44小时，杂交液包含50％甲酰胺，1X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯，4XSSC，0.25mg/ml酵母tRNA，0.3mg/ml青鱼精子DNA，100mm二硫苏糖醇(DTT)，以及合适的35S-标记的cRNA，其终浓度为1X107 CPM/ml。杂交后，用4XSSC以30分钟间隔洗涤切片2次，在50％甲酰胺/2XSSC于60℃洗涤一次，然后于37℃用核酶(在含1mM乙烯基-二氨基四乙酸的10mM Tris缓冲液中有20mg/ml)处理30分钟。进一步洗涤组织切片，用递减的SSC缓冲液洗涤，其中含100mM DTT，直至最终用0.1XSSC洗涤，并将其放于明胶包被的载波片上进行胶片放射自显影。空气干燥的海马体切片用14C-标准(American RadiolabeledChemicals，Inc.，St.Louis，MO)至β-max超胶片(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey)曝光24-72小时。喙冠状切片的曝光时间为110-130小时。用GBX显象剂处理胶片并用Kodak快速定影剂定影。
通过胶片放射自显影光密度分析用MCID成像系统(ImagingResearch，St.Catherine′s，Ontario，加拿大)来定量原位杂交标记。对于每张曝光的组织切片胶片，线性化胶片密度并将其校正到相对14C-标准。计算值(mCi/克蛋白质)，取6-8个组织切片的多次测量的平均值。每组中每只鼠平均的杂交信号强度取平均值以获得组平均值±标准差。用一路ANOVA进行统计比较。对于所有的统计测验，95％的置信水平(p＜0.05)被认为是显著的。
9.2.8原位杂交组化的结果
相对于年轻和年老有障碍的，GLT1的丰度在年老无障碍的中显著较大(p＜.03)，而且也发现了有较大的GLAST mRNA的趋势(p＝.089；图5)。表示用于原位杂交的鼠的认知状态的学习指数得分与微阵列研究中的动物的相似；年老无障碍(182，223，240)、年轻(177，219，200，227)和年老有障碍(290，285，297，298)。
在微阵列数据集和原位数据集中，第三个谷氨酸转运蛋白mRNA(EAAC1)的值对于无障碍年老的组在数量上高于比较年轻和年老有障碍的鼠，但那些差异并不在统计学上显著。微阵列中一个探针集(AF038571)的mRNA显示相对于年老有障碍的，在年老无障碍中EAAC1显著升高。在EAAC1的第二个探针集中的mRNA显示有相同的趋势(年老无障碍的大于年老有障碍，p＝.09)。
9.3用头孢曲松保持认知功能
9.3.1头孢曲松对年轻鼠GLTI mRNA的处理效果
年轻鼠每天肌肉注射200mg/kg的头孢曲松(N＝2)或其载体(N＝3)，持续一周。杀死后，切下海马并冷冻。
9.3.2实时反转录-PCR法来定量GLT-1 mRNA
9.3.2.1制备用于实时RT-PCR的RNA
从用头孢曲松或盐水处理的动物(每种条件3只年轻动物)的右侧海马处用Trizol试剂提取RNA并通过Qiagen Rneasy柱纯化，其方式与微阵列实验中所用的过程完全一样。在确定浓度和完整性后(用微阵列RNA相同的方式)，样品稀释到每微升50ng的浓度。在总体积10μl中用Applied Biosysten′s Taqman反转录试剂以以下条件反转录100ng的该样品：lx反转录缓冲液，0.5mM每种dNTP，5.5mMMgCl2，1.25单位/μL的Multiscribe反转录酶，0.4单位/μL的Rnase抑制剂，和2.5μM寡聚dT引物。在室温温浴样品10分钟，接着于48℃45分钟，然后于95℃5分钟。样品稀释到1∶20和1∶100以用于实时PCR反应。通过合并从2个分别的动物的海马体中提取纯化的RNA来产生标准RNA并反转录该RNA，条件与上述实验样品的完全一样，除了500ng RNA用于50μl的反应中。通过连续稀释将标准cDNA稀释到1∶20，1∶100，1∶500和1∶2500。另外，200ng标准RNA置于20μl反应中，使用以上相同的条件除了省略反转录酶。该样品被称为非RT样品，包括其是要显示RNA样品本身背景活性。该样品连续稀释至1∶20和1∶100。
9.3.2.2实时PCR
PCR反应在三温容器中进行，每个GLTla，GLT1和GAPDH的cDNA样品使用2种不同的浓度，即cDNA稀释度为1∶20和1∶100。PCR反应中的cDNA最终浓度为100pg/μl和20pg/μl，而且其是由RNA输入浓度外推得来的。在所有4个稀释度应用标准来获得外推为100pg/μl、20pg/μl、4pg/μl和0.8pg/μl的终浓度。PCR反应混合物利用Invitrogen的Platinum定量PCR试剂盒来以相同的引物和探针集组装所有样品，然后为每个cDNA以每种浓度装在分开的管里。然后将cDNA加入混合物中，然后将其分装于3个实时PCR管中的每一个中。在RotorGene 3000(Corbett Research)中以以下条件进行所有反应：50℃ 2分钟，95℃ 5分钟，然后进行95℃ 25秒和60℃60秒的45个循环。在GAPDH的Joe频道和GLT1和GLT1a探针/引物集的FAM/SYBR频道上获得数据。对所有的运行都使用尖峰抑制和动态管标标准化。GLT1或GLTla和GAPDH的实时PCR偶尔在分开的运行中进行。
对于GAPDH，优化的反应条件是0.6单位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4单位UDG，4.5mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，50nM用5′端的Vic和3′端的TAMRA淬灭基团标记的探针。引物和探针可从Applied Biosystems(Cat#4308313)处获得；序列未知，但扩增长度为177bp。
对于GLT1，优化的反应条件是0.6单位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4单位UDG，6.0mM MgCl2，50nM正向引物，200nM反向引物，50nM探针。扩增长度为65bp。正向引物为5′GAG CTG GAC ACC ATT GAC TC 3′而且反向引物为5′GAC TGC GTC TTG GTC ATT TC 3′。探针为5′CAA CAC CGAATG CAC GAA GAC ATC 3′，标记有5′6-fam和3′tamra。
对于GLT 1a，优化的反应条件是0.6单位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2000M dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400 uM dUTP，0.4单位UDG，6.0mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，100nM探针。扩增长度为76bp。正向引物为5′ATG AGT GCA AGG TAA CTC TGG 3′而且反向引物为5′TCA CGT TTC CAA GGT TCT TC 3′。探针为5′CCA ATG GAAAGT CAG CTG ACT GCA 3′，标记有5′6-fam和3′BHQ1(黑洞淬灭基团1)。
9.3.2.3实时PCR的数据分析
用DDCt法确定GAPDH和GLT1或GLTla的比较量(Livak和Schmittgen，Methods 25：402-408 2001)。所有反应的初始值设在0.05荧光单位上并用Rotorgene软件来确定每个样品的Ct。确定每个GLT1cDNA在每个浓度的平均Ct值并扣除GAPDH的平均值。如果GAPDH值大于15％或低于平均GAPDH值，则弃去样品。在用药物处理的动物中，GLT1 mRNA平均增加1.34倍，而在用药物处理的动物中，GLTla mRNA平均增加1.27。这些值与微阵列中观察到的AU鼠GLT1的完全改变一致，其增加了1.31。
9.4头孢曲松处理对年老鼠的RAM成绩的影响
在MWM中表征认知状态之后，将无障碍的年老鼠分配到2种处理条件之一中(200mg/kg的对照载体或头孢曲松)，条件根据它们MWM鼠学习值得分来定。最初在两种处理条件下的鼠用RAM任务来训练(适应、无延迟版、然后60秒延迟)。然后每日在早上(8:00-9:00AM)注射载体或药物。每日，鼠接受辐射臂状迷宫的测试，其中延迟扩大到3小时。在第8-10天(注射7天之后)，在3小时延迟时进行关键的测试。相对于同时测试的年轻组，接受载体的年老鼠的记忆力错误显著升高。相对于接受载体的年老鼠，接受药物给药的年老鼠只有较少的错误(图6)。该初始飞行评估使用了3只用药物处理的鼠和4只载体处理的年老鼠，该评估用其他有行为特征的鼠来重复进行以将样本大小增加到每组7-8只鼠。
9.4.1头孢曲松处理对年老鼠的GLTI mRNA的影响
完成RAM测试时，处死接受了载体和药物处理的年老鼠。冷冻切下的海马并储存(-80℃)来分析GLT1 mRNA，这在用其他年老鼠重复完成行为测试时进行。如果药物处理增加了GLT1 mRNA，如预期的以相同剂量对年轻鼠进行药物处理的效果那样，则进行微阵列分析用以比较用头孢曲松处理的年老有障碍鼠和对照年老有障碍个体的基因表达谱。
9.4.2头孢曲松处理对MWM测试-再测试的影响
在标准MWM规程中表征年老鼠并在几周或几月后在新的空间环境中用MWM进行测试，就获得了测试-再测试的可靠性。用MWM可在再测试中评估化合物改善患认知功能障碍的年老鼠功能的临床前效果。通过2个任务(RAM和MWM)处理的有效性强化了药物对认知功能作用的证据，该作用不依赖于2个任务间有区别的其他成分(如，成绩的运动基础)。
9.5用其他化合物改善并保持认知功能
该工作包括向年轻鼠给药测试化合物或载体，从而建立一种疗法以改善或保持认知功能。测试化合物包括丙戊酸，调节促代谢谷氨酸受体(mGluR)活性的化合物以及调节垂体腺苷酸环化酶活化因子多肽(PACAP)表达的化合物。MWM中表征的年老有障碍鼠分配接受药物或载体治疗并在RAM中测试。谷氨酸转运蛋白表达和其他基因谱的分析，如mGluR表达和活性，PACAP表达或β抑制蛋白2表达，它们之后在完成行为测试时进行。
9.6等价物
尽管描述了个别发明特定的具体实施方式的时候，但以上说明是示例性的而不是限制性的。依据本说明书的论述，本发明的许多变体对所属领域技术人员来说变得显而易见了。所附的权利要求不是要要求保护所有这些具体实施方式和变体，而是通过参考权利要求以来确定本发明的全部范围，以及等价体和说明书以及这些变体的全部范围。
在此所提及的所用公开文献和专利其全文都纳入本文参考，如同每一个公开文献或专利都明确并各自纳入参考。在发生冲突的情况下，以本申请，包括在此的任何定义为准。
本申请引用的每篇参考文献的内容全文，包括公开文本、专利和专利申请，在此都纳入参考。

Claims (14)

1. 能刺激谷氨酸转运蛋白基因的神经组织表达的化合物在制备用于治疗哺乳动物认知功能障碍的药物中的应用。
2. 权利要求1的应用，其中所述谷氨酸转运蛋白基因是EAAT2/GLT1或EAAT1/GLAST。
3. 权利要求1的应用，其中所述化合物具有下式：
Figure A2008100825350002C1
其中，每个符号独立表示：
R为H、C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R1为H、C1-C10烷基、C2-C10链烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R2为包含1-4个杂原子的杂环或杂芳基环，杂原子选自：N、O或S；
L为O、S或NR；和
X为CR2、O或S。
4. 权利要求3的应用，其中所述化合物是(R)-(-)-5-甲基-1-烟酰基-2-吡唑啉。
5. 权利要求1的应用，其中所述化合物具有下式：
Figure A2008100825350002C2
其中，每个符号独立表示：
L为O或S；
R为H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H；
R1为-(CH2)n-C(O)X
其中
X为OH、NR2、SH、O-碱金属或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2；和
n为0至6并且包括0和6的整数；
R2为H、C1-10烷基、C2-8链烯基或-(CH2)a-W-R3
其中
R3为H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A；
W为O、S或NR4；和
a为1-6并且包括1和6的整数；
其中
R4为H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的杂烷基或杂芳基环；
Figure A2008100825350003C1
线表示单或双键；
R5为R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或当
Figure A2008100825350003C2
线为双键时，R5选自＝CHCH2CO2H和＝NR；
m为0或1；和
A为式Ia的芳基或杂芳基：
Figure A2008100825350003C3
其中，每个符号独立表示：
J为O、S、NR6或CR6；和
y为1或2；
其中R6为电子对、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；
或A为式Ib或Ic的杂环烷基：
Figure A2008100825350004C1
其中，每个符号独立表示：
J为O、S或NR；和
X为O或H2。
6. 权利要求5的应用，其中所述化合物不是头孢曲松。
7. 权利要求1的应用，其中所述化合物具有下式：
其中，每个符号独立表示：
X为-OH、C1-10烷氧基、-O-碱金属、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基；
R为直链或支链C1-30烷基；和
R1为H、C1-10烷基、C2-10链烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基；
条件是：R可以是未取代的或被一个或多个-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
8. 权利要求7的应用，其中所述化合物不是丙戊酸。
9. 权利要求1-8任一项的应用，其中所述哺乳动物是人。
10. 权利要求1-8任一项的应用，其中所述认知功能障碍是轻度认知功能障碍、年龄相关的认知衰退或记忆力丧失。
11. 权利要求1-8任一项的应用，其中所述认知功能障碍是阿耳茨海默症。
12. 权利要求1-11任一项的应用，其中所述化合物是通过一种筛选用于保持或促进认知功能的化合物的方法而鉴定的，所述方法包括以下步骤：(a)向哺乳动物给药测试化合物；(b)在给药所述测试化合物后，确定所述哺乳动物神经组织中谷氨酸转运蛋白基因的表达水平；(c)将所述基因的所述表达水平与其在没有给药所述测试化合物的哺乳动物神经组织中的参考表达水平相比较；和，(d)确定所述基因的表达水平是否与其相应的参考表达水平不同。
13. 一种筛选用于促进认知功能的化合物的方法，其包括以下步骤：
(a)向哺乳动物给药测试化合物；
(b)在给药所述测试化合物后，确定所述哺乳动物神经组织中谷氨酸转运蛋白基因的表达水平；
(c)将所述基因的所述表达水平与其在没有给药所述测试化合物的哺乳动物神经组织中的参考表达水平相比较；和，
(d)确定所述基因的表达水平是否与其相应的参考表达水平不同，其中所述差异显示测试化合物是促进认知功能的候选治疗剂。
14. 一种筛选用于促进哺乳动物认知功能的化合物的方法，其包括以下步骤：
(a)将测试化合物与表达谷氨酸转运蛋白基因的细胞接触；和
(b)确定所述基因的表达水平是否通过将所述细胞与所述测试化合物接触而改变，所述改变如果存在则显示所述化合物有促进哺乳动物所需认知功能的能力。
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