KR20050025831A - 유전자 변형 농작물의 검출 키트 - Google Patents

유전자 변형 농작물의 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 변형 농작물의 검출 키트에 관한 것으로, 구체적으로 유전자 변형 농작물 또는 그를 포함하는 식품 속에 존재하는 유전자 변형 단백질과 그에 대한 항체의 결합 반응으로 농작물의 유전자 변형 여부를 판정하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 검출 키트는 농작물이나 이를 포함하는 식품에 존재하는 변형된 단백질의 함유 여부를 손쉽고 간단하게 측정할 수 있다.

Description

유전자 변형 농작물의 검출 키트{Diagnostic kit for detecting GMO}
본 발명은 유전자 변형 농작물의 검출 키트에 관한 것으로, 구체적으로 유전자 변형 농작물 또는 그를 포함하는 식품 속에 존재하는 유전자 변형 단백질과 그에 대한 항체의 결합 반응으로 농작물의 유전자 변형 여부를 판정하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
유전자 재조합에 의한 "유전자 변형 농작물(genetically modifed organism 또는 living modified organism; GMO, LMO)"이란 유전자 재조합 기술로 특정한 유용한 외래 유전자를 다른 식물체에 도입함으로써 유전 형질이 변형된 식물체를 가리키는 것이다. 이때, 통상적으로 유용한 외래 유전자를 벡터에 삽입하여 식물 세포 내로 도입하는 방법으로 재조합 식물체를 제작하며, 상기 유용한 유전자는 제초제 또는 해충에 대한 내성, 저온에 대한 저항력 등을 제공함으로써 소출량의 증대를 이룰 수 있다.
오늘날, 유전자 변형 농작물의 개발은 식량 문제를 해결하는 한 방안으로 선진국을 중심으로 광범위한 연구가 진행되고 있으며, 이에 더 나아가 옥수수, 콩, 감자, 담배 및 토마토 등에서는 상업적으로 널리 시판되고 있는 실정이다. 그러나, 생물체나 환경에 대한 GMO 농작물의 안전성은 아직 논란의 대상으로, 외래 유전자의 이종 생물로의 전파, 새로운 해충의 출현, 생태계의 혼란을 야기할 것이라는 주장도 제기되고 있다. 현재 우리나라에서도 GMO 식품의 경우 이를 표기하도록 '유전자재조합식품표시제'를 2001년 7월부터 시행하도록 정부에서 규제하고 있으나, GMO 농작물이나 식품을 손쉽게 판별할 수 있는 장치는 미비한 실정이다.
현재 우리나라에서 재배되어 시판되고 있는 GMO 작물 중 가장 직접적으로 우리 식생활에 영향을 주는 작물은 콩으로서, 국내에서 유통되는 두부의 82%는 유전자가 변형된 콩으로 만들어진다는 발표도 있었다. 이러한 유전자 변형 농작물을 생산하는데 있어서, 제초제 저항성 유전자인 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase; EPSPS) 또는 3-포스포시키메이트 1-카복시비닐 전이효소(3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase)를 시노히조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)에서 클로닝한 것을 가장 광범위하게 사용하고 있다. 최근에는 이외에도 병충해 저항성 작물을 만들기 위하여 BT 독소를 이용하기도 하는데 국내에서도 시험재배가 진행 중에 있다(Stalker, D.M. et al., A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. J. Biol. Chem., 260, 4724-4728, 1985; Halford, N.G. and Shewry, P.R., Genetically modified crops: methodology, benifits, regulation and public concerns. Br. Med. Bull., 56, 62-63, 2000).
이러한 유전자 변형 농작물을 검출하기 위하여 현재 사용 중에 있는 유전자 변형 농작물의 검출 키트는, 주로 PCR을 이용한 방법으로 유전자 변형 작물을 만드는데 이용된 외래 도입 DNA의 특정 부위를 검출하는 방법을 쓰고 있다.
또 다른 유전자 변형 농작물의 검출 방법은, 실제로 유전자 변형 농작물에서 발현되는 외부에서 도입된 특이 유전자의 발현 산물인 특이 단백질을 검출하는 방법이며, 이중에서도 항원??항체 반응을 이용한 면역 진단법인 ELISA 법이 제안되고 있다.
ELISA 법은 PCR 기법과 비교하였을 때, 비 가공 검체에서 빠른 시간 안에 정량적인 확인이 가능하다는 장점이 있으나, 1) 도입 유전자의 특성상 도입된 단백질의 합성이 없는 경우(예를 들어, 야생형 생물체에서 발현되는 원하지 않는 단백질의 발현을 안티센스(antisense) 기법을 이용하여 차단함으로써 유전자를 변형시키는 경우)나 합성이 되더라도 미량인 경우는 검출이 불가능하다는 점, 2) 가공식품의 가공과정에서 단백질은 DNA에 비해 훨씬 쉽게 파괴되므로 가공식품에서의 검출이 힘들다는 점, 및 3) PCR 기법 보다는 간단하지만 여전히 여러 절차를 진행해야 하는 프로토콜(예를 들어, 1차 항원??항체 반응, 2차 항원??항체 반응이 각각 일어나도록 반응을 진행시키고, 또한 각 반응 후에는 세척을 하여야 하는 점 등)이 요구되어 일반 소비자가 사용하기 곤란하다는 등의 단점 때문에, 현재 이를 실제적으로 이용한 유전자 변형 농작물을 검출하는 방법이나 장치는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 정성 분석이 가능하고, 신속하면서도 전문가가 아니더라도 검사를 시행할 수 있으며 특별한 기기를 필요로 하지 않고, 또한 PCR 기법에 비해서 오염에 덜 민감하고 도입된 유전자의 최종 산물을 검출한다는 장점을 갖춰서 상업성 면에서 유용한 새로운 ELISA 법을 응용한 유전자 변형 농작물 검출 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 식물이나 곡물과 같은 1차 농작물 및 이를 포함하는 2차 가공식품에 외래 도입 유전자에 의한 특이 단백질이 존재하는지 여부를 검출하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 다공성 박막형 페이퍼 및 상기 페이퍼 양면의 적어도 한 면에 EPSPS가 결합된 항원층이 고정화된 검출 스트립; 및 2) 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액이 담긴 시험용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출 키트를 이용한 유전자 변형 농작물의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 다공성 박막형 페이퍼 및 상기 페이퍼 양면의 적어도 한 면에 EPSPS가 결합된 항원층이 고정화된 검출 스트립; 및 2) 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액이 담긴 시험용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트를 제공한다.
본 발명의 유전자 변형 농작물의 검출 키트는, 다공성 박막형 페이퍼 및 상기 페이퍼 양면의 적어도 한 면에 EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)가 결합된 항원층이 고정화된 검출 스트립(도 1 참조); 및 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액이 담긴 시험용기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 다공성 박막형 페이퍼란 시료 및 표준용액이 항원층까지 흡수될 수 있도록 많은 수의 공극이 형성된 얇은 두께의 페이퍼를 가리키며, 시료액이 흡수될 수 있는 재질이라면 특별히 재질의 종류가 한정되지는 않으나, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 통상의 나이트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane)을 사용하였다. 또한, 상기 페이퍼의 다공의 크기는 모세관 현상에 의해 시료의 이동이 가능하도록 5 내지 20 ㎛로 이루어지는 것이 바람직하고, 8 내지 12 ㎛로 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 EPSPS가 결합된 항원층은 소혈청 알부민이 EPSPS에 결합된 항원층(EPSPS-소혈청 알부민 접합체)인 것이 바람직하나 반드시 여기에 한정되는 것은 아니며, 검출 스트립은 상기 페이퍼 및 그 위에 고정되는 EPSPS 항원층을 포함하도록 정의된다.
항EPSPS 단일클론 항체는 통상의 기법에 따라 제작될 수 있으며, 단일클론 항체와 콜로이드는 통상의 수단으로 결합시킬 수 있으나, 단순 흡착방법에 의한 24시간 흡착방법으로 결합시키는 것이 바람직하고, 상기 콜로이드는 금(gold) 또는 은(silver) 콜로이드인 것이 바람직하고, 금 콜로이드인 것이 더욱 바람직하다.
아울러, 상기 검출 키트는 검출하고자 하는 시료액과 상기 항EPSPS(단일클론 항체) 콜로이드 결합체를 함유하는 표준용액을 혼합시킬 수 있는 도구를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.
검출원리를 첨부된 도면을 기초로 설명하면 다음과 같다:
상기 항원층(2)의 표면 일부에 항EPSPS 단일클론 항체(monoclonal anti-EPSPS antibody)가 내재된 콜로이드 라벨층(3)이 결합되어 발색이 이루어지며, 항EPSPS 단일클론 항체에 대하여 시료에 존재하는 항원(EPSPS) 및 박막형 페이퍼에 고정화된 항원층(2) 간에 경쟁적으로 반응함으로써, 시료내의 EPSPS 단백질인 항원 농도와 반비례하여 발색된다. 시료와 표준용액의 반응을 통해 시료에 존재하는 항원에 의해 항체가 결합하면 표준시료내의 항체 금 콜로이드가 소진되어 검출키트에 발색이 되지 않고, 시료내 항원이 존재하지 않으면 항체 금 콜로이드가 그대로 키트 표면의 항원과 결합하여 발색이 이루어지게 된다(도 2 및 도 3 참조).
또한, 상기 다공(1a)의 직경이 8 내지 12 ㎛가 바람직한 이유는 용액이 페이퍼(1)의 표면에 묻어 그 내부로 점차적으로 흡수될 때, 모세관 현상에 의해 흡수 및 이동속도를 조절하기 위함이다. 다시 말하면, 농작물이나 가공식품과 같은 시료의 분쇄액의 성분 중에서 항원??항체반응에 필요한 성분인 EPSPS 단백질을 반응선인 항원층(2)까지 통과시키는 속도를 조절함으로써 검사의 반응시간을 조절하기 위함이다.
또한, 본 발명은 상기 검출 키트를 이용한 유전자 변형 농작물의 검출방법을 제공한다.
이때, 상기 검출방법은 ⅰ) 시료 용액과 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액을 혼합하는 단계; ⅱ) 상기 혼합 용액에 검출 스트립을 담금하는 단계; ⅲ) 시료 내의 유전자 도입 EPSPS와 검출 스트립에 고정화된 EPSPS 항원층이 표준용액 내의 단일클론 항체(항EPSPS)와 경쟁적으로 반응하는 단계; 및 ⅳ) EPSPS 항원층과 항체 콜로이드 결합체의 결합으로 발색되는 단계로 이루어진다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 검출 키트의 구성 및 작동 원리
도 1은 본 발명에 의한 유전자 변형 농작물 검출 키트의 검출 스트립 구성의 단면도이다.
상기 검출 키트의 구성은 직경이 대략 8 내지 12 ㎛인 다공(1a)이 내부에 형성되고, 길이 약 10 ㎝, 넓이 약 5 ㎜로 이루어진 박막형 페이퍼(1) 및 EPSPS-BSA 접합체(EPSPS-BSA conjugate)를 상기 박막형 페이퍼의 한쪽 면 또는 양쪽 면 모두에 200 ng/㎖로 결합시킨 항원층(2)을 페이퍼 최종 하단부에 1 ㎝ 길이와 4 ㎜ 넓이 영역으로 코팅한 검출 스트립; 항EPSPS 단일클론 항체와 금 콜로이드 결합체 40 ng/㎖을 함유하는 표준용액이 담긴 시험관; 및 시료액과 항EPSPS 금 콜로이드 결합체를 함유하는 액체를 혼합하기 위한 스포이드로 이루어진다. 이때, 상기 박막형 페이퍼는 시료액이 흡수될 수 있는 통상의 나이트로셀룰로스 멤브레인으로 제조하였다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 유전자 변형 농작물의 검출 키트의 작용 및 유전자 변형 농작물이 검출되는 과정을 설명하면 다음과 같다:
먼저, 1차 농산물이나 2차 가공식품을 분쇄하여 고형물을 가라앉힌 후 채취된 시료용액 한 방울(0.04 ㎖)과 항EPSPS 금 콜로이드 결합체 한 방울(0.04 ㎖)을 시험관에서 혼합한 후, 박막형 페이퍼(1) 및 항원층(2)을 포함하는 검출 스트립의 일부분을 상기 혼합액에 30초 동안 담금하면, 시료용액 및 항EPSPS 금 콜로이드 결합체가 상기 검출 스트립 내부로 유입되어 흡수되면서, 페이퍼(1)의 내부에 형성된 다공(1a)을 통해서 시료용액 내의 항원(EPSPS)과 항EPSPS 금 콜로이드 결합체가 유입된다.
이후, 시료 용액내의 항원(EPSPS)은 항EPSPS 금 콜로이드 결합체와 결합하게 되고, 점차적으로 항원이 고정된 위치인 항원층(2)에 도달되면, 시료 용액 내에 함유되어 있는 항원(EPSPS)과 박막형 페이퍼에 고정된 항원층(2)이 경쟁적으로 항EPSPS 금 콜로이드 결합체와 결합하게 되므로, 결과적으로 항EPSPS 금 콜로이드 결합체가 결합된 항원층(2) 부분이 120초 후부터 점차 선홍색으로 발색이 된다. 이때, 시료 용액에 함유되어 있는 항원(EPSPS)의 함량에 반비례하여 항원층(2)의 선홍색의 발색 정도는 감소되어 나타난다. 따라서, 사용자는 시료 용액이 포함되지 않은 표준용액(항EPSPS 금 콜로이드 결합체만을 함유한 액체)을 사용한 스트립의 선홍색의 발색 정도와 시료 용액을 사용한 스트립의 발색 정도를 상대적으로 비교하여 유전자 변형 농작물인지 여부를 판단할 수 있다(도 2 및 도 3).
<실시예 2> 검출 키트를 이용한 GMO 식품의 검출
도 4는 본 발명에 의한 유전자 변형 농작물 검출 키트를 이용하여 nonGMO 식품과 GMO 식품을 검출한 검출 스트립의 밴드 형태를 나타낸 것이다.
도 4의 상ㆍ하단 좌측 밴드는 항EPSPS 금 콜로이드 결합체 용액의 처리 없이 알부민(albumin) 단백질을 단독으로 상기 검출 키트에 처리한 대조군이고, nonGMO 식품(재래종 콩; 상단 우측) 및 GMO 식품(유전자 변형 콩; 하단 우측) 50 g을 각각 생리적 식염수에 넣고 믹서로 간 후에, 상기 실시예 1에서와 동일한 절차에 의하여 항EPSPS 금 콜로이드 결합체 용액을 처리한 결과이다. 상기 사진에 나타난 바와 같이, nonGMO 식품은 항원(EPSPS)층과 항EPSPS 금 콜로이드 결합체의 결합으로 선홍색이 명확히 형성되는데 반하여, GMO 식품은 색의 변화가 없어 어떠한 결합도 형성되지 아니한 것으로 판단된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유전자 변형 농작물의 검출 키트는 유전자 변형에 의해서 새로이 도입된 단백질을 검출하는 방법으로 생체내의 면역체계에서 볼 수 있는 항원??항체 반응을 이용한 분석법인 ELISA 법을 응용하여 1차 농산물이나 2차 가공식품 속에 존재하는 EPSPS 농도를 이용하여 유전자 변형 농작물인지 여부를 손쉽고 빠르고 정확하게 판정할 수 있으며, 또한 본 발명의 검출 키트는 유전자 변형 농작물인지 여부를 판별하는데 기존의 PCR 방법이 10 시간 이상 걸리는 것을 5분 이내로 단축하여 신속하게 그리고 산업 생산 현장이나 실생활에서 특별한 기술이나 설비 없이 누구나 쉽게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 유전자 변형 농작물의 검출 키트 중에서 검출 스트립의 구성을 도시한 단면도이고,
1 : 멤브레인(membrane) 페이퍼,
2 : EPSPS 항원층
도 2는 도 1의 검출 스트립의 EPSPS 항원층과 표준용액에 함유된 '항EPSPS층 콜로이드'가 결합하여 발색이 이루어지는 '항EPSPS 콜로이드 금 라벨층'을 함께 도시한 단면도이고,
1 : 멤브레인(membrane) 페이퍼,
2 : EPSPS 항원층,
3 : 항원ㆍ항체 반응으로 생성된 항EPSPS 콜로이드 금 라벨층
도 3은 도 2의 상기 검출 스트립을 보다 명확하게 표현하기 위한 사시도이고,
1 : 멤브레인(membrane) 페이퍼,
1a: 다공,
2 : EPSPS 항원층,
3 : 항EPSPS 콜로이드 금 라벨층
도 4는 nonGMO 식품과 GMO 식품을 상기 검출 키트를 이용하여 검사한 결과를 나타낸 사진이다.
상단 및 하단 좌측 스트립: 대조군,
상단 우측 스트립: nonGMO 콩,
하단 우측 스트립: GMO 콩

Claims (7)

1) 다공성 박막형 페이퍼 및 상기 페이퍼 양면의 적어도 한 면에 EPSPS가 결합된 항원층이 고정화된 검출 스트립; 및
2) 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액이 담긴 시험용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 농작물의 검출 키트.
제 1항에 있어서, 상기 박막형 페이퍼의 다공의 크기는 8 내지 12 ㎛인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 1항에 있어서, 상기 콜로이드는 금(gold) 콜로이드인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 1항에 있어서, 상기 EPSPS가 결합된 항원층은 소혈청 알부민이 EPSPS에 결합된 항원층(EPSPS-소혈청 알부민 접합체)인 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 1항에 있어서, 상기 검출 키트는 검출하고자 하는 시료액과 상기 항EPSPS와 콜로이드 결합체를 함유하는 표준용액을 혼합시킬 수 있는 도구를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 키트.
제 1항의 검출 키트를 이용한 유전자 변형 농작물의 검출방법.
제 6항에 있어서,
ⅰ) 시료 용액과 단일클론 항체(항EPSPS)와 콜로이드의 결합체를 함유하는 표준용액을 혼합하는 단계;
ⅱ) 상기 혼합 용액에 검출 스트립을 담금하는 단계;
ⅲ) 시료 내의 유전자 도입 EPSPS와 검출 스트립에 고정화된 EPSPS 항원층이 표준용액 내의 단일클론 항체(항EPSPS)와 경쟁적으로 반응하는 단계; 및
ⅳ) EPSPS 항원층과 항체 콜로이드 결합체의 결합으로 발색되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103792371A (zh) * 2014-02-13 2014-05-14 中国检验检疫科学研究院 利用表面等离子共振传感器检测抗草甘膦cp4-epsps蛋白的方法
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