KR20050010509A - 항원-항체 반응에 기초한 바이오칩을 포함하는 바이오칩 키트 - Google Patents

Abstract

생물학적 시료를 검출하기 위한 프로브 플레이트로서, 이는 하나 이상의 반응기를 포함하며, 상기 반응기 안에는 상기 프로브가 직접 또는 간접적 방식으로 고정되어 있고 그 프로브는 하기와 같은 프로브 군 중 하나 이상이다: A) 프로브 항체 및 프로브 항원; B) 다양한 구조 특이적 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체 및 C) 프로브 항-항체 및 프로브 항원 및/또는 다양한 구조 특이적 면역글로불린에 대한 프로브 항체. 이러한 프로브 플레이트를 포함하는 시약 키트 및 이러한 프로브 플레이트를 사용하는 방법 또한 제공된다. 한 그룹의 다양한 타겟 분자들이 검출될 필요가 있는 경우, 상기 프로브 플레이트를 사용함으로써, 필요한 반응기 수 및 검출 시간을 절감하고 검출 경쟁력이 증가한다.

Description

항원-항체 반응에 기초한 신규 프로브 플레이트 및 그 프로브 플레이트를 이용하는 시약 키트 및 방법{New Probe Plate Based on Antigen-Antibody Reaction and Reagent Kit and Method Using the Probe Plate}

현재, 항체 또는 항원이 기재 상에 고정화된 항체 또는 항원 프로브-플레이트가, 그에 대응되는 항체 또는 항원을, 그 특이적 반응성에 기초하여, 검출하기 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 사용을 위한 세 종류의 대표적 키트는, 래피트(rapid) 테스트 키트, 루틴(routine) 테스트 키트 및 바이오칩 키트이다.

항체-항원 반응에 기초한 현재의 래피드(rapid) 테스트 키트는 육안으로 인식할 수 있는 검출 결과를 제공할 수 있다. 그 반응기는 통상 한 스트립의 멤브레인성 매트릭스 및 그 스트립 상에 고정된 물질들, 예컨대 항체 프로브 또는 항원 프로브, 콘트롤 라인 및 마커로 구성된다. 대부분의 검출에서, 이 키트는 면역-친화도 크로마토그래피 원리에 근거하여 작용한다. 그리고, 이것은 고정화된 항체 프로브 또는 항원 프로브에 대응하는 타겟 항원 또는 타겟 항체를 검출하기 위해 사용된다. 일부 경우에는 여러 반응기들이 한 프로브-플레이트로 조합되는데, 상기 반응기들 각각은 항원 또는 항체를 검출하는 테스트 스트립을 각각 포함한다. 중국 특허 출원 제00226807.8(간염 바이러스의 진단 및 동정을 위한 바이오칩)에는, 상기와 같이 다중-반응기들이 조합된 프로브-플레이트의 한 예를 포함하는 키트가 개시되어 있다. 상기 다중-래피드 검출 장치의 조합 또는 다중-반응기들이 조합된 프로브-플레이트는 타겟 간염 항원 및 항체 각각을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 그것은 현재의 래피드 테스트 키트와는 다르다. 그것을 가지고는 하나의 스트립(단일 장치), 소위 상기 래피트 테스트 키트 내의 하나의 반응기로는 단지 타겟인 간염 항원만을 또는 항체만을 검출하는 것이지, 타겟인 간염 항원 및 항체를 모두 검출할 수 있는 것이 아니다.

현재의 항체-항원 반응에 기초한 현재의 루틴 테스트 키트는 하기의 특징을 갖는다. 그 프로브는 그 프로브-플레이트의 한 반응기 내에 무작위적으로 고정화된다. 이러한 키트들은 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA) 키트, 비오틴-아비딘 분석 키트(예컨대, 비오틴-아비딘 기재(BAS) 고상 표지 키트), 방사선-면역분석법(RIA)키트, 면역-형광 키트, 화학발광 키트, 전기화학발광 키트 등을 포함한다. 예컨대, ELISA 키트는 프로브-플레이트 및 마킹 시스템으로 구성된다. 상기 ELISA 프로브-플레이트는 통상 수개의 반응기들을 갖는 플라스틱 또는 유리 플레이트이고, 상기 반응기 각각은 마이크로웰, 마이크로웰의 내부 표면에 무작위적으로 고정된 항체 또는 항원을 포함한다. ELISA 마킹 시스템은 효소-표지된 항원 또는 효소-표지된 항체 또는 효소-표지된 항-항체 및 기질을 포함한다. 상기 키트는 고정화된 프로브 항체 또는 항원에 대응하는 시료 내 타겟 항체 또는 타겟 항원을 검출하는 데에 이용된다.

상기 루틴 테스트 키트를 이용하면, 한 반응기 내에서의 시약들(프로브 분자들, 타겟 분자들, 마커들 등) 간의 반응이 다양한 반응 패턴들, 예컨대, 간접적 검출 패턴, 포획 방법, 경쟁적 저해 방법, 양-항체 샌드위치 검출 패턴 및 양-항원 샌드위치 검출 패턴 등으로 수행될 수 있다. 프로브-플레이트는 통상 다양한 검출 패턴에 사용될 수 있다.

예컨대, ELISA 키트 내의 프로브-플레이트는 마킹 시스템 내의 다양한 마커들에 따라 다양한 검출 패턴으로 사용될 수 있다. 시료 내의 타겟 항체와 반응할 특이적 항원이 항원-코팅된 플레이트 상에 고정되면, 마커가 효소-표지된 특이적 항원인 경우에는 양-항원 샌드위치 검출 패턴이 적용되어야 하고, 마커가 효소-표지된 항-항체인 경우에는 간접적 검출패턴이 사용되어야 한다. 반면에, 항체-코팅된 플레이트, 즉 시료 내의 타겟 항원과 반응하는 고정된 특이적 항체를 갖는 항체-코팅 플레이트의 경우에는, 마커가 효소-표지된 특이적 항체인 경우에는 양-항체샌드위치 검출 패턴이 사용될 수 있다. 어떠한 검출 패턴이 사용되던지 간에, 결합되지 않은 효소-표지된 물질을 세척하고 착색을 위한 기질을 첨가한 후 OD 값을 검출하면 타겟 항체 또는 항원은 질적 또는 양적으로 검출될 수 있다. 따라서, 현재의 ELISA 키트 및 다른 루틴 테스트 키트는 하나의 반응기를 사용하여 항체 또는 항원 중 하나만을 검출할 수 있다. BioMerieux(France)는 항원과 항체를 동시에 검출할 수 있는 키트를 제공하지만(예컨대, VIDAS HIV DUO), 그 반응은 하나의 반응기가 아니라 두개의 반응기에서 각각 수행되는 것이다.

본 발명에 있어서, "폴리펩티드 칩"이라 함은 "펩티드 어레이", "펩티드 마이크로어레이", "펩티드 칩", "단백질 어레이" 또는 "단백질 칩"을 의미한다. 현재 항체-항원 반응에 기초한 폴리펩티드 칩은 하나 이상의 반응기를 포함하며, 상기 반응기 내에는 다수개의 항원 또는 다수개의 항체가 무작위가 아닌 형태(예컨대, 어드레스-타겟화된 형태로)로 프로브로서 고정화되어 있다. 그래서, 그것들은 프로브로서 사용되는 다수개의 항원 또는 다수개의 항체에 대응하는 한 시료내의 다수개의 항체만 또는 항원만을 검출하기 위해 사용된다. 상기 항체-항원 반응에 기초한 바이오칩 키트는 광범위한 응용이 가능한데, 특히, 임상적 면역학 진단에 유용하다. 비록 십년 이상 연구가 진행되어 오고 있기는 하지만, 그것을 대규모 스케일로 적용하기에는 여전히 심각한 문제점들이 존재한다. 바이오칩 반응기 내의 프로브, 타겟들 및 마커들 간의 반응 패턴은 ELISA 반응기의 그것들, 즉, 간접적 검출 패턴, 포획 방법, 경쟁적 저해 방법, 양-항체 샌드위치 검출 패턴 및 양-항원 샌드위치 검출 패턴 등과 거의 동일하다.

요컨대, 항체-항원에 기초한 현재의 테스트 키트는 프로브-플레이트로 구성되어 있으며, 그 프로브-플레이트 상에는 항체만 또는 항원만이 반응기에 고정화되어 있다. 따라서, 반응기가 타겟 항원 또는 타겟 항체 중 어느 하나를 검출하는 데에만 사용될 수 있다.

본 발명은 일반적으로 생물학적 시료에 대한 질적 및/또는 양적 분석을 위한 프로브-플레이트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상이한 타겟 분자들, 예컨대, 한 시료 내의 타겟 항체 및 타겟 항원과 같은 다른 타겟 분자들의 질적 및/또는 양적인 조합 분석을 위해 사용된 반응기를 포함하는 프로브-플레이트에 관한 것이다. 다른 타겟 분자들을 포획하기 위해 상이한 프로브들이 상기 반응기에 고정화된다. 마킹이 필요하면 다른 마커들이 포획된 타겟 분자에 결합될 수 있고, 이로써 상기 반응 결과가 표현될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 언급된 프로브-플레이트를 포함하는 테스트 키트, 및 생물학적 시료 분석을 위해 본 프로브-플레이트를 사용하는 방법에 관한 것이다.

발명의 내용

본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 생물학적 시료 분석을 위한 프로브-플레이트를 제공한다. 상기 프로브-플레이트는 직접 또는 간접적으로 고정되어 있는 하기 프로브 조합 중 적어도 하나를 갖는 적어도 한 반응기를 포함한다:

A. 프로브 항체 및 프로브 항원의 조합;

B. 다양한 구조-특이적 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체의 조합;

C. 다양한 구조-특이성을 갖는 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체 및 항원 및/또는 항체의 조합.

상기 프로브-플레이트에서, 상기 프로브 조합은 프로브 어레이 및/또는 프로브 패턴으로 상기 반응기 내에 비-무작위적으로 고정화된다.

상기 프로브-플레이트는 바이오칩 또는 테스트 스트립의 형태이며, 이는 육안으로 식별가능한 검출 결과를 제공할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 생물학적 시료 분석을 위한 키트를 또한 제공한다. 상기 키트는 상기 언급된 프로브-플레이트, 상기 프로브 조합에 대응하는리간드들을 포함하는 마커들, 및 상기 리간드들에 결합되는 표지 시약들을 포함한다.

상기 키트에서, 상기 리간드들은 각각 항원 및/또는 항체와의 특이적인 항체-항원 반응성, 또는 친화도를 보인다.

상기 키트에서, 상기 마커들은 하기 마커 조합 들 중 하나이다:

A. 표지된 특이적 항체 및 표지된 특이적 항원의 조합;

B. 표지된 구조-특이적 항-항체들의 조합;

C. 표지된 종-특이적 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

D. 표지된 구조-특이적 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

E. 상기 언급된 조합으로부터 유도된 어떤 조합.

본 발명의 키트는, 하기 분석법: 효소 결합 면역흡착 분석법, 방사선면역분석법, 면역형광 분석, 화학발광 분석 또는 전기화학발광 분석 중 어느 하나에 기초한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 생물학적 시료를 검출하는 방법을 제공한다. 그 방법은 다음을 포함한다:

(1) 생물학적 시료를 하기 특허청구범위 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프로브-플레이트에 적용시켜 그들을 반응시키는 단계;

(2) 선택적으로 마킹 시약들을 개별 기질, 부분적 혼합물 또는 완전 혼합물의 형태로 상기 반응기에 적용시키는 단계; 및

(3) 상기 반응 후 반응기 내의 결과를 분석하는 단계.

발명의 상세한 설명

하기 항원-항체 반응성: 항원 및 그 짝인 항체 간의 특이적 반응성; 한 항체와, 다른 종의 동물로부터 제조된 다른 항-항체와의 다른 반응성에 기초한 종-특이적 반응성; 그리고, 한 타입 또는 한 서브타입의 면역글로불린과, 다른 타입 또는 서브타입의 면역글로불린 또는 그 특징적 절편들을 사용하여 제조된 다른 항-항체들과의 다양한 반응성에 기초한 구조-특이적 반응성을, 과학자들은 오랜 시간 동안 인식해 왔다. 그러나, 이러한 과학적 지식은 하나의 바이오칩 반응기 내의 다양한 타겟 분자들의 조합 분석(예컨대, 항원 및 항체 조합 분석)에 적용되어 오지 못하였다. 항원/항체/항-항체 간의 상호작용을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 상기와 같은 지식을 실행화하여 본 발명에 의한 상기 프로브-플레이트 및 테스트 키트를 발명하기에 이르렀다. 본 연구의 일부 결과들을 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1은 항원/항체/항-항체 간의 교차-오염에 관한 실험 결과이다.

반응기 번호	프로브	형광 마커	교차-오염 결과*
1	HBsAg에 대한 토끼의 항체	HBsAg에 대한 마우스의 mAbs	-
	HBsAg에 대한 마우스의 mAbs		-
2	HBsAg에 대한 토끼의 항체	인간 항체에 대한 염소의 항-Ab	-
	HBsAg에 대한 마우스의 mAbs		-
3	인간의 IgM에 대한 항-Ab	HBV에 대한 정제된 인간의 항체	+
	인간의 IgG에 대한 항-Ab		+
4	인간의 IgM에 대한 항-Ab	HBV에 대한 정제된 인간의 IgG	-
	인간의 IgG에 대한 항-Ab		+
5	인간의 IgM에 대한 항-Ab	HBV에 대한 정제된 인간의 IgG	-
	HBsAg		+

*: -는 음성을 +는 양성을 의미함.

본 발명에 의한 프로브-플레이트는 하기 프로브 조합 중 적어도 하나 이상이 직접 또는 간적접으로 고정화되어 있는 하나 이상의 반응기인 점에 특징이 있다:

A. 짝형성된 또는 짝형성되지않은 프로브 항체 및 프로브 항원의 조합:

B. 다양한 구조-특이적 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체의 조합:

C. 다양한 구조-특이성을 갖는 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체 및 항원 및/또는 항체의 조합.

상기 "프로브-플레이트"는 ELISA 멀티-코팅된 웰 플레이트, 래피드 테스트 키트의 테스트 스트립 및 모노-반응기 또는 멀티-반응기 바이오칩과 같은 것으로서, 키트의 주요한 구성요소이며, 하나 이상의 반응기를 포함한다.

상기 "반응기"는 모노-반응기 칩의 칩-플레이트, 멀티-반응기 바이오칩의 반응 웰, ELISA 코팅된 플레이트의 코팅된 웰 및 래피드 테스트 키트의 테스트 스트립과 같은 것으로서, 경계가 한정된 계속적 표면 또는 용기를 의미하며, 그 안에는 프로브가 직접 또는 간접적으로 고정화되어 있고, 식별가능한 반응 결과를 갖는 도입된 시료의 타겟 분자들과 반응할 수 있다.

본 발명에서 "항체(Ab)"는, 천연 항체, 특이적 항체, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 유전공학 항체 및 항체 단편을 포함한다. "면역글로불린(IG)"는 다양한 타입의 면역글로불린들(IgA, IgG, IgM, IgE, IgD), 다양한 서브타입의 면역글로불린들(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)을 포함한다. "항원(Ag)"은 면역분석법에서 중요한 기질을 의미하는데, 이것은 직접적 또는 간접적으로 면역 반응을 자극하여 항체 및/또는 초회항원자극을 받은 림프구를 생산하고 동시에 면역성-반응하는 산물들(즉, 항체 및/또는 초회항원자극을 받은 림프구)에 특이적으로 결합함으로써 면역학적 반응을 발전시킨다.

본 발명에 있어서 항원은, 완전 항원, 햅틴 및 다른 면역 반응성을 지닌 기질을 포함한다. 항원의 몇몇 예로서 하기를 들 수 있다.

A. 면역원성 및 면역 반응성을 갖는 식물, 동물 및 미생물의 구성성분(예컨대, 단백질, 펩티드, 리피드, 다당류, 당류 및 다른 유기 성분들과 그 조합);

B. 식물, 동물 및 미생물의 대사산물;

C. 인공 항원;

D. 합성 항원;

E. 유전공학 재조합 항원;

F. 의약 또는 의약의 성분;

G. 항-항체를 제조하기 위해 사용되는 항체 또는 항-항-항체를 제조하기 위해 사용되는 항-항체.

본 발명에 있어서, "마크될 기질"이라 함은 마커와 반응시킬 분자를 의미한다. 상기 마크될 기질은 타겟 항원, 타겟 항체 또는 타겟 항원 또는 타겟 항체를 마커와 연결하는 중간체가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, "항-항체(항-Ab)"는 항원으로서 또 다른 항체 또는 또 다른 항-항체를 사용함으로써 동물 면역화로부터 제조된 항체를 의미한다. 항-항체는 항체에 대한 항체, 항-항체에 대한 항체 또는 항-항-항체에 대한 항체 등을 포함한다. "다양한 구조적 특이성을 갖는 면역글로불린에 대한 항체의 프로브"는 항원으로서 다양한 구조적 면역글로불린을 사용함으로써 동물 면역화로부터 제조된 항체를 의미하는데, 이는 프로브로서 사용된다.

본 발명에서 프로브 조합의 몇몇 예들은 하기에 나타난 바와 같다: HBsAg에 대한 항체/HCV 항원/HIV₁₊₂항원/HTLV 항원/매독 항원를 포함하는 조합(프로브 조합 A를 위한); IgM에 대한 항-항체/IgG에 대한 항-항체를 포함하는 조합(프로브 조합 B를 위한); 인간의 IgM에 대한 염소의 항-항체/HBsAg에 대한 토끼의 항체/HCV 항원를 포함하는 조합(프로브 조합 C를 위한). 더 많은 예들은 하기 "실시예"에 나타나 있다.

상기 프로브-플레이트의 반응기에 있어서, 상기 프로브 조합은 직접 또는 간접적으로 고정화된다. "간접적 형태"로의 프로브의 고정화는 프로브의 고정화가중간체, 예컨대 기재상에 결합된 활성 분자 또는 기재 상에 결합된 활성화된 입자와 같은 중간체를 통해 반응기 상에서 수행되는 것을 말한다. 반응기 기재에서의 프로브 분포는 무작위적이거나 비-무작위적일 수 있다. 무작위적 분포에서는 고정화된 다른 프로브가 기하학적으로 인식될 수 없다. 반면 "비-무작위적 분포"는 고정화된 다른 프로브들이 기하학적으로 인식될 수 있는 분포를 의미한다. 비-무작위적 분포는 어드레스-추적가능한 어레이(address-traceable array) 또는 인식가능한 프로브 패턴(recognizable probe pattern)을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 프로브-플레이트는 하나 이상의 반응기를 포함하는 바이오칩인데, 그 안에는 하기 프로브 조합들 중 어느 하나가 어드레스-추적가능한 어레이 또는 인식가능한 프로브 패턴의 형태로 고정화되어 있다:

A. 프로브 항체 및 항원의 조함;

B. 다른 구조-특이적 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체의 조합; 및

C. 다른 구조-특이성을 갖는 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체 및 프로브 항원 및/또는 프로브 항체의 조합.

본 발명에 있어서, 바이오칩은 프로브 항체/항원 조합 또는 프로브 항-항체 조합이 고정화된 반응기를 포함한다. 전자의 예로는 M 타입의 항원(M≥1) 및 N 타입의 항원(N≥1)이 프로브 어레이의 형태로 고정화된 반응기를 포함하는 바이오칩, 예컨대 실시예1의 수혈 스캐닝 바이오칩을 들 수 있다. 후자의 예로는 인간의 면역 글로불린의 서브타입을 동정하기 위한 바이오칩이다. 이 바이오칩은 인간의 IgG1/IgG2/IgG3/IgG4에 대한 토끼의 항-항체의 한 프로브 조합을 프로브 어레이의형태로 갖는 반응기를 포함한다. 상기 토끼의 항-항체들은 토끼를 각각 면역화시키기 위하여 인간의 IgG1/IgG2/IgG3/IgG4 특징적 단편들을 사용하여 제조한다. 이 바이오칩은, 마커로서 형광 표지된 염소의 항-인간 IgG를 이용하여, 한 환자의 인간 면역글로불린 서브타입의 질적 또는 양적 결손 분석을 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 바이오칩에서, 상기 프로브는 상기 반응기 표면 상에 직접 또는 간접적으로 고정화될 수 있다. 상기 프로브의 간접적 고정화는 하기와 같이 수행될 수 있다: 먼저, 다양한 종류의 프로브들을 활성화된 입자들 상에 개별적으로 고정화시킨 다음, 그 프로브가 결합된 활성화된 입자들을 바이오칩 반응기의 매트릭스 상에 고정화시킨다. 프로브가 직접적으로 고정화되느냐 간접적으로 고정화되느냐 하는 것은 본 발명에서 기술한 다양한 타겟 분자들 조합들에 대한 본 프로브-플레이트의 검출 결과에 영향을 미치지 아니할 것이다.

또 다른 구체예에서, 상기 프로브 플레이트는 래피드 검출을 위한 테스트 스트립으로써, 예컨대, 항원/항체 래피드 검출을 위한 테스트 스트립, IgG/IgM 래피드 검출을 위한 테스트 스트립, IgG/IgA 래피드 검출을 위한 테스트 스트립 및 항원/IgG/IgM 래피드 검출을 위한 테스트 스트립 등을 들 수 있다.

상기 프로브-플레이트는 항원-항체 반응에 기초하는데, 이는 한 반응기에서 하기와 같은 6개의 다른 타겟 분자 조합들 중에서 하나 이상을 검출하는 데에 이용될 수 있다: A. 항원 및 항체의 조합; B. 다른 구조-특이적 면역글로불린(예컨대, 다른 유형의 면역글로불린들 IgG, IgA, IgM 및 다른 서브타입의 면역글로불린들 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4); C. 다른 종-특이적 항체들의 조합; D. 구조-특이적 면역글로불린에 대한 항-항체들의 조합; E. 다른 구조-특이적 면역글로불린 및 항원 및/또는 항체의 조합; F. 상기 조합들로부터 유래된 조합. 본 발명에서 "타겟 분자 조합"이라 함은, 상기 언급된 6개의 다른 타겟 분자 조합들 중 하나를 의미한다.

본 발명에 의한 테스트 키트(또는 키트)는 본 발명에 의한 프로브-플레이트를 포함하며, 이는 마킹 시스템을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 키트가 마킹 시스템을 포함하는 경우 프로브-플레이트 반응기 내의 반응 결과는 육안으로 또는 광전기 비색계(colorimeter), 광전기 이미징 디텍터, 형광 디텍터, 방사선-면역 디텍터, 마이크로-마그네틱 디텍터 등으로 시스템 내 "마크"를 검출함으로써 식별가능하다. 적절한 예는 수혈 래피드 검출(ELISA 키트)에서의 "효소-표지된 시스템"이다. 키트가 마킹 시스템을 포함하지 않는 경우, 그 반응 결과는 마이크로-포텐셜 디텍터와 다른 디텍터 들을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명에서 "테스트 키트" 또는 "키트"라 함은, 몇몇 양적 및/또는 질적 분석에서 필수불가결하게 소비될 수 있는 것을 의미하며, 하나 이상의 반응기를 갖는 하나 이상의 프로브-플레이트를 포함한다. 시료 타겟 분자들을 포획하기 위해 사용되는 프로브들이 고정화되어 있는 상기 반응기는 키트의 핵심이다.

본 발명에 있어서 마킹 시스템은 키트의 중요한 구성요소이다. 이는 프로브와 타겟 분자들 간의 반응 결과를 양적 및/또는 질적 분석으로 '마크'하기 위해 사용되는 물질들의 집합이다. 이는 리간드 및 표지 시약, 및 선택적으로 중간체들, 표지 증폭 시스템 등을 포함한다. 본 발명에 있어서 리간드는 타겟 분자들에 친화도를 나타내는 하나 이상의 분자들을 의미한다. 상기 마킹 시스템의 예로는 직접검출 패턴인 항원-코팅된 멀티-웰-플레이트를 포함하는 ELISA 키트의 그것이며, 이는 효소 및 기질로 표지된 항-항체를 포함한다.

상기 키트에서 마킹 시스템은 타겟 분자들의 리간드들, 표지 시약, 및 또한 일부 검출에서는 중간체들 및 표지 증폭 시스템을 포함한다. 상기 표지 증폭 시스템의 예로는, 증폭하는 실버-염을 갖는 콜로이달 골드 마킹 시스템, 비오틴 및/또는 아비딘을 갖는 마킹 시스템 등을 들 수 있다.

상기 키트에서 마커는 타겟 분자들의 리간드들 및 그것에 부착하는 표지 시약을 포함하며, 그 예로는, 상기 언급된 ELISA 키트의 효소로 표지된 항-항체들을 들 수 있다. 마커의 또 다른 예로는 형광-표지된 항체를 들 수 있다. 예컨대, 실시예 12의 ELISA 키트의 마커들의 리간드들은 특이적 항체 및 특이적 항-항체로서, 이들은 효소만이 표지 시약으로서 사용된다. 예컨대, 형광-표지된 키트에서, 마커는 형광-표지된 항원, 형광-표지된 항체 또는 형광-표지된 항-항체이고, 리간드는 항체, 항원 또는 항-항체이고, 표지 시약은 형광 시약이다.

상기 키트에서 마킹 시스템은 다른 마킹 방법들을 사용하거나 동일한 마킹 방법 내에서 다른 표지 시약들을 사용할 수 있다. 예컨대, 다른 여기 및 방출 파장을 갖는 두개의 형광 시약들을 IgG 및 IgM 각각을 검출하기 위해 사용할 수 있다.

상기 키트의 각 마커는 항원 및/또는 항체에 대해 특이적 항체-항원 반응성 또는 친화도를 갖는 리간드를 포함한다. 본 발명에서 항원 및/또는 항체에 대한 리간드의 친화도는 항원 및/또는 항체에 대한 리간드의 특이적 반응성으로 정의된다. 상기 친화도 반응성은 항원-항체 반응 메커니즘보다는 친화도 메커니즘에 기초한다. 예컨대, 비오틴, 아비딘, SPA, SPG, 소라렌(psoralen), 딕옥신(digoxin)과 항원 및/또는 항체와의 각 친화도를 들 수 있다.

본 발명에서 항원 및 항원 간의 "항원-항체 특이적 반응성"이라 함은, 단지 항원 및 그 쌍인 항체 간의 특이적 반응성 뿐만 아니라, 종-특이적 반응성 및 구조-특이적 반응성을 포함한다. 여기서 "종-특이성 반응성"이란, 다른 종의 동물로부터 제조된 다양한 항-항체들과 한 항체와의 다른 반응성들에 기초한 항원-항체 반응성을 의미한다. "구조-특이적 반응성"이란 다양한 타입 또는 서브타입의 면역글로불린 또는 그 특징적 절편들을 사용하여 제조된 다양한 항-항체들과 한 타입 또는 한 서브타입의 면역글로불린과의 다양한 반응성들에 기초한 항원-항체 반응성을 의미한다. 항체와 그 쌍인 항원과의 특이적 반응성의 한 예는, 인간의 HCV 항원과 그 쌍인 인간의 HCV 항체 간의 반응성이다. 종-특이적 반응성의 예로는, HBsAg에 대한 인간 항체에 대해서는 특이적으로 반응하지만 HBsAg에 대한 마우스의 mAb와는 현저하게 반응하지 않는 염소 항-항체를 들 수 있다. 구조-특이적 반응성의 예로서는, 인간의 항-HBV IgG가 인간의 IgG에 대한 항-항체와는 현저한 반응을 나타내지만, 인간 IgM에 대한 항-항체에 대해서는 현저한 반응을 나타내지 않는 것을 들 수 있다.

상기 키트에서 마커의 리간드는 표지된 특이적 항체, 표지된 특이적 항원 및 표지된 항-항체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있을 뿐 아니라, 종 특이성을 갖는 표지된 항-항체들의 군 및 구조적 특이성을 갖는 표지된 항-항체들의 군으로부터 선택될 수도 있다. 마커는 하기 마커 조합들 중 어느 하나일 수 있다:

A. 표지된 특이적 항체 및 표지된 특이적 항원의 조합;

B. 다른 구조-특이성들을 갖는 표지된 항-항체들의 조합;

C. 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

D. 구조-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

E. 상기 조합들로부터 유래된 어느 한 조합.

마커 조합들의 선택(표지된 리간드의 종류 및 수)은 검출된 타겟 분자들의 종류 및 수, 선택된 검출 패턴에 따라 달라진다.

테스트 키트가 사용되면, 마커 조합 내의 표지된 특이적 항체 및 항원, 표지된 종-특이적 항-항체 및 표지된 구조-특이적 항-항체가 반응기에 개별적으로 또는 부분적으로 혼합되어 또는 전체가 혼합되어 첨가될 수 있다. 상기 조합 A의 예는 하기 조합을 들 수 있다: 로다민(Rhodamine) 표지된 특이적 항원들(예컨대, HCV, HIV, HTLV, 매독 특이적 항원) 및 로다민 표지된 특이적 항체(예컨대, HBs에 대한 항체). 상기 조합 B의 예로는 하기 조합을 들 수 있다: IgM에 대한 로다민 표지된 항-항체, IgG에 대한 로다민 표지된 항-항체. 상기 조합 C의 예로는 하기 조합을 들 수 있다: 로다민 표지된 염소의 항-인간 항-항체 및 HBsAg에 대한 로다민 표지된 마우스 mAbs. 조합 D의 예로는 하기 조합을 들 수 있다: IgM에 대한 로다민 표지된 항-항체 및 로다민 표지된 HBsAg.

본 폴리펩티드-칩 키트의 마킹 시스템은 특이적 반응들을 마크하기 위해서하기 표지 방법들 또는 그 조합들을 채택한다: 골드(실버) 표지 방법, 효소 표지 방법, 형광 표지 방법, 화학발광 표지 방법, 전기화학발광 표지 방법, 방사선활성 표지 방법 또는 마그네틱 표지 방법. 상기 마킹 시스템에서, 다른 표지 시약들이 한 표지 방법들에서 사용될 수 있다. 예컨대, 다른 파장을 갖는 다른 형광 시약들이 다른 리간드에 결합되어 구별되는 마커를 형성할 수 있다.

본 발명에 의한 키트의 몇몇 예들은 하기에 나타낸 바와 같다. 이러한 키트는 프로브-플레이트를 포함하는데, 그 안에는 상기 언급된 하나 이상의 프로브 조합이 하나 이상의 반응기 내에 무작위적으로 고정화되어 있다.

1) 항원 및 항체를 위한 ELISA 키트: 이것은 특이적 항원 및 항체 프로브들로 무작위적으로 코팅된 멀티-웰 플레이트, 효소-표지된 특이적 항원들 및 항체들 또는 효소-표지된 특이적 항원들 및 종-특이적 항-항체들, 기질 용액, 버퍼 용액 및 다른 보충 물질들을 포함한다.

2) RIA 키트: 이는 특이적 항원 및 항체 프로브들로 무작위적으로 코팅된 멀티-웰 플레이트, 방사선활성 물질로 표지된 특이적 항원 및 항체들 또는 방사선 활성 물질로 표지된 특이적 항원 및 종-특이적 항-항체들, 버퍼 용액 및 다른 보충 물질들로 구성된다.

3) RIA 키트: 이는 특이적 항원 및 항체 프로브들로 무작위적으로 코팅된 멀티-웰 플레이트, 방사선 활성 물질(방사선조사)로 표지된 특이적 항원 및 항체들 또는 방사선활성 물질로 표지된 특이적 항원 및 종-특이적 항-항체들, 버퍼 용액 및 다른 보충 물질들로 구성된다.

4) 전기화학발광 분석 키트: 이는 특이적 항원 및 항체들 프로브들로 무작위적으로 코팅된 멀티-웰 플레이트, 전기화학발광물질로 표지된 특이적 항원 및 항체들 또는 전기화학발광물질으로 표지된 종-특이적 항-항체들, 버퍼 용액 및 다른 보충 물질들로 구성된다.

5) 화학발광 분석 키트: 이는 특이적 항원 및 항체 프로브로 무작위적으로 코팅된 멀티-웰 플레이트, 화학발광물질로 표지된 특이적 항원 및 항체들 또는 특이적 항원 및 종-특이적 항-항체들, 버퍼 용액 및 다른 보충 물질들로 구성된다.

상기 언급한 키트들은 한 검출 결과가 양성인 경우 그 결과가 부적격인 것으로 판단될 테스트에서 선호된다. 수혈 테스트 키트를 예로 들면, HBV, HCV, HIV, 매독 검출 결과 중 하나가 양성일 때 그 혈액 제공자 및 그 혈액 또는 혈장 백은 부적격인 것으로 판정될 것이다.

상기 발명의 종래 테스트 키트에서는, 특이적 반응을 마크하기 위해서 하기 표지 물질들 또는 그 조합들 중 하나가 사용될 수 있다: 골드(실버), 효소, 형광, 화학발광, 전기화학발광, 방사선 조사 및 자석. 동일한 표지 방법을 이용할 때, 표지된 물질들의 리간드는 동일한 표지 시약 또는 다른 표지 시약과 짝지어질 수 있다. 표지 시약은, 방사선활성 물질, 효소, 착색 기질, 비오틴-아비딘, SPA, SPG, 소라렌, 딕옥신, 형광 염료, 콜로이달 골드(실버), 희토류 화합물 착색제, 화학발광 시약, 전기화학발광 시약, 생물발광 시약, 마그네틱 입자 등을 포함한다.

본 발명에 의한 모든 키트는 하기 6개의 다른 타겟 분자 조합들 중 어느 하나를 검출하기 위해 사용될 수 있다:

A. 항원 및 항체의 조합;

B. 다양한 타입의 면역글로불린의 조합;

C. 다양한 서브타입의 면역글로불린의 조합;

D. 항원 및 다양한 타입의 면역글로불린 및/또는 다양한 타입의 면역글로불린들의 혼합물의 조합;

E. 항원 및 다양한 서브타입의 면역글로불린 및/또는 다양한 타입의 면역글로불린의 혼합물의 조합;

F. 상기 조합들로부터 유래된 어느 조합.

본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 프로브는 프로브-플레이트의 반응기의 고상 기재 상에 고정화되어 있다. 본 발명에 있어서 상기 고상 기재는 다양한 유기, 무기, 투명 또는 불투명, 수용성 또는 수불용성, 강성 또는 연성 물질을 포함한다. 예컨대, 하기 물질 중 하나 이상의 종류일 수 있다: 유리, 플라스틱, 고무, 금속, 셀룰로오스 멤브레인, 슬라이스, 플레이트 등. 본 발명에 따른 프로브-플레이트의 형상은 다양할 수 있다. 예컨대, 다양한 형상을 갖는 스트립스들, 편평한 플레이트 및 다공성 플레이트 등일 수 있다. 본 발명의 프로브-플레이트는 하나 이상의 선택적 반응기들을 포함할 수 있다. 각 반응기에는, 특이적 반응을 검출하기 위한 항원 및 항체가 무작위적으로 또는 비무작위적으로 고정될 수 있다. 본 발명의 프로브-플레이트 상에 고정된 특이적 항체 또는 항원은 천연 또는 합성 물질일 수 있으며, 이는 폴리펩티드, 단백질 및 항원 또는 항체의 특성을 갖는 다른 모든 물질일 수 있다. 그 제조시, 다양한 프로브들(특이적 항원 또는 특이적 항체들)이프로브-플레이트에 동시에 또는 연속적으로 고정화될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 하기 절차들을 포함하는, 생물학적 시료를 검출하는 방법에 관한 것이다:

(1) 생물학적 시료를 프로브-플레이트 상의 반응기에 첨가하고 반응을 유발하는 단계(예컨대, 37℃에서 1시간 동안);

(2) 선택적으로 표지 시약들을 상기 반응기에 개별적으로, 부분 혼합하여 또는 전체를 혼합하여 첨가하는 단계; 및

(3) 반응 후 상기 반응기를 측량하는 단계.

본 발명에 의한 키트 및 방법의 잇점은, 항원 및 항체, 다양한 타입의 면역글로불린들, 다양한 서브타입들의 면역글로불린 등과 같은 다양한 타겟 분자들을 테스트 하는 데에 동일한 반응기가 사용될 수 있다는 점이다. 이와 같이 조합을 테스트함으로써 반응기 개수와 필요 시간을 감소시킬 수 있고, 분석 경쟁력을 향상시킬 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 경제적이며, 시간을 절약할 수 있으며 효율적이다.

하기에서는 본 발명의 실시예들을 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예 1 내지 8에서 사용되는 바이오칩을 위한 모든 활성화된 물질들은 프랑스의 SEDAC Corp.이 제조하고 공급하는 국내 시장에서 구입할 수 있다.

실시예1 :

수혈을 위한 바이오칩 스크리닝(1)

본 실시예에 따른 키트는, 수혈을 위한 스크리닝 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군, 세정용 버퍼 등으로 구성된다. 상기 키트는 인간 혈청에서 B형 간염 표면 항원(HbsAg), C형 간염 바이러스(HCV) 항체들, HIV₁₊₂항체들 및 매독 항체들을 검출하기 위해 사용하였다.

법에서 요구하는 혈액 스크리닝 항목들에 따라 고안된 상기 키트 내에서 사용되는 프로브 조합은 한개의 항체 및 3개의 항원들의 조합이다. 선택된 프로브 항체는 인간 HBsAg에 대한 토끼의 항체이다. 선택된 프로브 항원들은 각각 다중-에피토프-융합 HCV 항원, 다중-에피토프-믹싱 HIV₁₊₂항원 및 다중-에피토프-믹싱 매독 항원이다. 최적 농도의 상기 프로브들은 각각 4X3 마이크로-어레이 형태로 기재 상에 각각 스팟된 다음(각 프로브는 3 스팟씩 스팟됨), 상기 기재의 잔류 표면을 불활성화시키기 위하여 소 알부민을 사용하였다. 그 후, 상기 바이오칩 프로브-플레이트를 건조시키고 사용을 위해 준비하였다.

상기 키트에 사용되는 검출 방법은 간접적 검출 방법 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합 방법이다. 상기 키트에서 사용되는 마커 조합은 하나의 표지된 특이적 항체 및 하나의 표지된 종-특이적 항-항체의 조합이다. 상기 마커 조합에서 리간드로서 사용되는 특이적 항체는 HBsAg에 대한 마우스의 mAb이며, 이것은 HBsAg에 대한 고정화된 토끼의 항체와 그 고정화된 항체에 의해 포획된 인간의 HBsAg와 함께 특이적으로 양-항체 샌드위치를 형성한다. 항-항체에서 리간드로서 사용되는 항-항체는 인간 항체에 대한 염소의 항-항체인데, 이것은, 각각 고정화된 프로브 항원들(HCV, Ag, HIV₁₊₂Ag 및 매독 Ag)에 의해 포획된 그 쌍인 인간의 HCV Ab, HIV₁₊₂Ab 및 매독 Ab와 결합할 수 있지만, 상기 프로브 항체(인간의 HBsAg에 대한 토끼의 항체) 및 상기 표지된 항체(HBsAg에 대한 마우스의 mAb)와는 결합할 수 없다. 본 실시예에서 로다민을 표지 시약으로 사용하였으며, 이것은 리간드에 결합한다. 상기 리간드들은 각각 최적화된 조건 하에서 로다민으로 표지된다. 준비된 마커들은 즉시 사용을 위해 두개의 분리된 마커 또는 혼합물의 형태이다.

본 칩 키트의 음성 대조군은 ELISA 키트에 의해 선별된 HBsAg, HCV 항체, HIV₁₊₂항체 및 매독 항체에 음성인 인간 혈청이다. ELISA 키트에서 사용된 ELISA 프로브-플레이트는 각각 HBsAg에 대한 토끼 항체, 다중-에피토프-융합 HCV 항원, 다중-에피토프-믹싱 HIV₁₊₂항원 또는 매독 항원으로 코팅된 마이크로-웰 플레이트이다. 본 칩 키트의 양성 대조군은 ELISA 키트를 사용함에 의해 선택된 HBsAg 양성 혈청, HCV 항체 양성 혈청, HIV₁₊₂항체 양성 혈청 및 매독 항체 양성 혈청의 혼합물이다.

수혈을 위한 바이오칩 스크리닝 키트는 인간의 혈청 시료에서 HBsAg, HCV Ab, HIV₁₊₂Ab 및 매독 Ab의 가능한 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 실험에서 인간 혈청 시료는 1. HbsAg 양성 인간 혈청, 2. HCV 항체 양성 인간 혈청, 3. HIV₁₊₂항체 양성 인간 혈청, 4. 매독 항체 양성 인간 혈청, 5. HbsAg 양성 및 매독 양성 인간 혈청, 6. 음성 대조군 및 7. 양성 대조군이다. 이러한 인간 혈청 시료들은 ELISA 키트를 이용하여 사전에 검출하였다.

시료들은 하기와 같이 검출하였다: 인간 혈청 시료 중 하나를 희석하고 본 칩의 한 반응기에 넣었다. 그 반응기에서의 항원-항체 반응을 37℃에서 1시간동안 수행하였다. 그 다음에, 결합되지 않은 혈청 성분들을 반응기로부터 제거하고 세척 버퍼로 반응기를 세척하였다. 그러고 나서, 마커 조합(로다민으로 표지된 인간 HBsAg에 대한 마우스의 mAb 및 염소의 항-인간 항-항체)를 반응기에 도입시켰다. 마킹 반응을 37℃에서 1시간동안 수행하였다. 그 다음, 상기 반응기를 버퍼 용액으로 1회 세척하여 결합되지 않은 마커들을 제거하고 무수 알코올로 세척하였다. 마지막으로, 건조된 바이오칩 프로브-플레이트를 칩 스캐너(GMS 418 ARRAY SCANNER)로 스캔하고 분석하였다. 본 칩 키트를 이용한 그 검출 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표 2는 수혈을 위한 바이오칩 스크리닝 키트의 검출 결과이다.

시료	4개의 ELISA 키트를 이용한 결과	1개의 바이오칩을 이용한 결과
	HbsAg	HCV	HIV	매독	HbsAg	HCV	HIV	매독
1	+*	-*	-	-	+	-	-	-
2	+	+	-	-	-	+	-	-
3	-	-	+	-	-	-	+	-
4	-	-	-	+	-	-	-	+
5	+	-	-	+	+	-	-	+
음성 대조군	-	-	-	-	-	-	-	-
양성 대조군	+	+	+	+	+	+	+	+
블랭크	-	-	-	-	-	-	-	-

*: 표 1에서 설명한 바와 같음.

실시예2:

수혈을 위한 바이오칩 스크리닝 키트(2)

본 실시예에 따른 키트는, 수혈을 위한 스크리닝 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군, 세척 용액 등으로 구성된다. 본 바이오칩 키트에 있어서 바이오칩 프로브-플레이트는 상기 실시예1에서 언급한 것과 동일한 제조방법으로 준비하였다.

본 키트에서 사용한 검출 방법 조합은 양-항원 샌드위치 검출 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합이었다. 본 키트에서 사용한 마커 조합은 세개의 표지된 특이적 항원 및 한개의 표지된 특이적 항체들의 조합이었다. 마커 조합에서 리간드로서 사용한 특이적 항체는 HBsAg에 대한 마우스의 mAb이고 이것은 고정화된 HBsAg에 대한 토끼의 항체 및 상기 고정화된 항체에 의해 포획된 인간의 HBsAg와 함께 양-항체 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. 마커 조성물의 리간드로서 사용되는 상기 3개의 특이적 항원들은, 각각 HCV 항원, HIV₁₊₂항원 및 매독 항원이다. HCV Ag는 고정화된 프로브 HCV Ag 및 그 프로브 HCV Ag에 의해 포획된 인간의 HCV Ab와 함께 양-항원 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. HIV₁₊₂Ag는 고정화된 프로브 HIV₁₊₂Ag 및 그 프로브 HIV₁₊₂Ag에 의해 포획된 인간의 HIV₁₊₂Ab와 함께 양-항원 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. 매독 Ag는 고정화된 프로브 매독 Ag 및 그 프로브 매독 Ag에 의해 포획된 인간의 매독 Ab의 양-항원 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. 본 실시예에서, 표지 시약으로서 로다민을 사용하였고, 이는 리간드에 결합된다. 리간드는 각각 최적화된 조건 하에서 로다민으로 표지된다. 준비된 마커는 두개의 분리된 마커 또는 혼합물의 형태로 즉시 사용하도록 준비하였다.

본 칩 키트의 음성 대조군 및 양성 대조군은 상기 실시예1과 동일하였다.

상기 수혈을 위한 바이오칩 스크리닝 키트는 인간 혈청 시료에서 HBsAg, HCV 항체, HIV₁₊₂항체 및 매독 항체의 가능한 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 실험에서 인간 혈청 시료는 상기 실시예1의 것과 동일하다. 본 실시예에서 시료의 검출은 상기 실시예1과 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 검출로 얻어진 결과는 상기 실시예 1의 표 2의 것과 유사하였다.

실시예 3:

HIV 항원/항체를 검출하는 바이오칩 키트(1)

본 실시예에서 준비된 키트는 HIV 항원 및 HIV 항체를 검출하는 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군 및 세척 버퍼 등으로 구성된다. 상기 키트는 인간 혈청 시료에서 HIV 항원 및 HIV 항체의 가능한 존재를 검출하는 데에 이용될 수 있다.

본 키트의 프로브 조합은 한개의 항체 및 한개의 항원의 조합이다. 선택된 상기 프로브 항체는 HIV p24에 대한 마우스의 mAb이고, 선택된 프로브 항원은 HIV gp160, gp41, gp36을 포함하는 마우스의 다중-에피토프-믹싱 항원이다. 상기 프로브들은 그것의 최적 농도로 각각 2X3 마이크로-어레이 형태로 기재 상에 스팟하고(각 프로브를 3스팟씩 스팟함), 소 알부민을 사용하여 기재의 잔류 표면을 블로킹하였다. 그 후 상기 바이오칩 프로브-플레이트를 건조하고 즉시 사용할 수 있도록 준비하였다.

본 키트에서 사용된 검출 방법 조합은 양-항원 샌드위치 검출 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합이다. 본 키트에서 사용된 마커 조합은 하나의 표지된 특이적 항체 및 하나의 표지된 특이적 항원의 조합이다. 표지된 특이적 항체에서 리간드로서 사용된 특이적 항체는 항-HIV p24 mAb이다. 이 항-HIV p24 mAb는 프로브 HIV Ag 에피토프에 대한 것이 아니라, 양-항체 샌드위치의 형태로, 프로브 HIV Ab에 의해 포획된 시료의 HIV Ag에 대한 것이다. 표지된 특이적 항원에서 리간드로서 사용된 특이적 항원은 특이적 HIV 항원이다. 이 리간드 HIV 항원은 프로브 HIV Ab와 반응하지 않지만 프로브 HIV Ag에 의해 포획된 시료의 HIV Ab와는 양-항원 샌드위치의 형태로 반응한다. 본 실시예에서 표지 시약으로서 로다민을 사용하였고, 이는 리간드에 결합된다. 리간드들은 최적화된 조건 하에서 각각 로다민으로 표지된다. 준비된 마커들은 두개의 개별적 마커 또는 혼합물의 형태로 즉시 사용할 수 있도록 준비해놓았다.

본 칩 키트에서 음성 대조군은 ELISA 키트를 사용함에 의해 선별된 HIV 항체및 항원 음성 인간 혈청이다. ELISA 키트에서 사용된 ELISA 프로프-플레이트는 각각 항-HIV p24 mAb 및 HIV gp160, gp41, gp36을 포함하는 마우스의 다중-에피토프-믹싱 항원으로 코팅된 마이크로-웰 플레이트이다. 본 칩 키트에서 양성 대조군은 ELISA 키트를 이용하여 선별된 HIV 항체 및 항원 양성 인간 혈청이다.

본 바이오칩 키트는 인간의 혈청 시료 중의 HIV 항체 및 HIV 항원의 가능한 존재를 테스트하기 위해 사용될 수 있다. 본 실험에서 인간 혈청 시료는: A. HIV p24 항원 양성 인간 혈청, B. HIV gp160, gp41, gp36 항체 양성 인간 혈청, C. HIV 항원 및 항체 양성 인간 혈청, D. 음성 대조군, E. 양성 대조군. 이러한 인간 혈청 시료들은 상기 언급된 ELISA 키트를 이용하여 미리 검출해 놓았다.

시료들은 하기와 같이 하여 검출하였다: 인간 혈청 시료들 중 하나를 희석하고 본 칩의 한 반응기로 넣었다. 반응기 내에서의 항원-항체 반응을 37℃에서 1시간동안 수행하였다. 그러고 나서, 결합되지 아니한 혈청 구성성분들을 반응기로부터 제거하고 반응기를 세척 버퍼로 세척하였다. 그 다음에 마커 조합을 반응기에 넣었다. 마킹 반응을 37℃에서 한시간 동안 수행하였다. 그 다음에 반응기를 버퍼 용액으로 먼저 세척하여 결합되지 않은 마커들을 제거한 다음, 무수 알코올로 세척하였다. 마지막으로, 건조된 바이오칩 프로프-플레이트를 칩 스캐너(GMS 418 ARRAY SCANNER)로 스캔하고 분석하였다. 그 검출 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3은 HIV 항원/항체 검출 바이오칩 키트의 결과이다.

시료	2개의 ELISA 키트를 이용한 결과	바이오칩 키트를 이용한 결과
	Ab 코팅된 웰	Ab 코팅된 웰	프로브 Ab 스팟	프로브 Ab 스팟
A	+*	-*	+	-
B	-	+	-	+
C	+	+	+	+
음성 대조군	-	-	-	-
양성 대조군	++++	++++	++++	++++
블랭크	-	-	-	-

*: 표 1에서 설명한 바와 같음.

실시예4:

HIV 항원/항체를 검출하는 바이오칩 키트(2)

본 실시예에서 준비된 키트는 HIV 항원 및 HIV 항체를 검출하는 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군 및 세척 버퍼 등으로 구성된다. 상기 키트는 인간 혈청 시료 중의 HIV 항원 및 HIV 항체의 가능한 존재를 검출하기 위해 사용된다.

본 바이오칩 키트에서 바이오칩 프로브-플레이트는 상기 실시예1에서와 같은 제조방법에 의해 준비된다.

본 키트에서 사용된 검출 방법은 간접적 검출 방법 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합 방법이다. 본 키트에서 사용된 마커 조합은 하나의 표지된 특이적 항체 및 하나의 표지된 종-특이적 항-항체의 조합이다. 마커 조합에서 리간드로서 사용되는 특이적 항체는 HIV p24에 대한 마우스의 mAb인데, 이것은 HIV P24에 대한 고정화된 항체 및 그 고정화된 항체에 의해 포획된 인간의 HIV Ag와 함께 양-항체 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. 항-항체에서 리간드로 사용되는 항-항체는, 인간 항체에 대한 염소의 항-항체인데, 이는 고정화된 HIV Ag에 의해 포획된 인간의 HIV Ab와 결합할 수 있으나, 프로브 항체(프로브로서 사용되는 HIV p24에 대한 마우스의 mAb) 및 표지된 항체(마커 리간드로서 사용되는 HBsAg에 대한 마우스의 mAb)와는 결합할 수 없다. 본 실시예에서 표지 시약으로서 로다민을 사용하였고, 이는 상기 리간드들에 결합되어 있다. 상기 리간드들은 각각 최적화된 조건 하에서 로다민으로 표지되었다. 제조된 마커들은 두개의 분리된 마커 또는 혼합물의 형태로 즉시 사용될 수 있도록 준비하였다.

본 칩 키트의 음성 대조군 및 양성 대조군은 상기 실시예 3에서의 것과 동일하였다.

본 실험에서 인간의 혈청 시료는 상기 실시예3의 것과 동일하였다. 본 실시예에서 시료의 검출은 상기 실시예1의 것과 동일하게 수행하였고, 그 검출에서 얻어진 결과들은 상기 실시예3의 표 3의 것과 유사하였다.

실시예 5:

종양 관련 항원/항체를 테스트하기 위한 바이오칩 키트

본 실시예에서 준비된 바이오칩 키트는, 바이오칩 프로브-플레이트, 표지된 물질, 음성 대조군, 양성 대조군, 참조 물질, 세척 용액 등으로 구성된다. 본 실시예의 바이오칩은 인간 혈청 시료 중에서 종양 관련 항원 및 항체의 가능한 존재를 검출하기 위해 사용한다.

본 바이오칩 키트의 바이오칩 프로브-플레이트의 프로브 조합은 검출 요건 및 접근가능한 종양 관련 항원/항체들에 따라 결정하였다. 본 실시예에서 프로브 조합은 항체 및 항원 조합이다. 프로브 조합에서 항원 프로브는 합성 폴리펩티드인 EBV 항원이다. 상기 프로브 조합에서 항체 프로브는 각각 HCG 트로픽 호르몬, 종양 마커 항원 50(CA50), 사카라이드 항원 242(CA242), 유방암 특이적 항원(CA153), 암배아성(carcinoembryonic) 항원(CEA) 및 난소종 특이적 항원(CA125)에 대한 여섯개의 마우스 항체들이다. 항원 및 항체 프로브는 최적 농도로 각각 메뉴얼 스팟터(mannual spotter)를 사용하여 7 X 3 어레이의 형태로 활성화된 기재 상에 각각 고정화된다(각 타입의 프로브 당 3 스팟씩). 스팟팅한 후 소 알부민을 사용하여 매트릭스의 활성화된 표면을 블로킹시켰다. 그 다음에 바이오칩 프로브-플레이트를 건조시키고 즉시 사용할 수 있도록 준비하였다.

본 키트에서 사용된 검출 방법 조합은 간접적 검출 방법 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합이다. 본 키트에서 사용된 마커 조합은 표지된 종-특이적 항-항체 및 표지된 특이적 항체의 조합이다. 첫번째 마커는 간접적 검출 방법을 위해 사용하였고, 두번째 마커는 양-항체 샌드위치 검출 방법을 위해 사용하였다. 마커 조합에서 특이적 항체들은, 각각 HCG, CA50, CA242, CA153, CEA 및 CA125에 대한 여섯개의 마우스 mMbs이고, 그들 각각은 고정화된 항체 및 시료 내의 그 포획 항원과 양-항체 샌드위치를 형성할 수 있다. 마커 조합 내의 상기 종-특이적 항-항체는 인간의 IgA에 대한 항-항체로서, 이는 고정화된 EBV 항원에 의해 포획된 EBV 항체에 결합할 수 있다. 본 실시예에서 표지 시약으로서 로다민을 사용하였고 이는 리간드 상에서 짝형성되었다. 상기 리간드의 로다민화는 각각 최적화된 조건 하에서 수행하였다. 그 다음에 마커들을 혼합 또는 분리된 형태로 사용하였다.

본 키트에서 음성 대조군은 7개의 ELISA 키트를 통해 선택된 음성 인간 혈청으로서, 그 각각은 하기 프로브 들 중 어느 하나로 코팅된 마이크로웰 프로브-플레이트를 포함한다: 합성 폴리펩티드 EBV, VCA 항원, HCG에 대한 항체, 종양 마커 항원 50(CA50)에 대한 항체, 사카라이드 항원 242(CA242)와 같은 다당류 및 당단백질에 대한 항체들, 유방암 특이적 항원(CA153)에 대한 항체, 암배아성 항원(CEA)에 대한 항체 및 난소종 특이적 항원(CA125)에 대한 항체. 본 키트에서 콸러티 콘트롤은 다른 정량적 테스트를 통해 선별된 종양 참조물질들이다.

본 바이오칩 키트를 사용하면, 한 시료 내에서 종양과 관련된 하나의 항체 및 여섯개의 항원을 한 반응기 내에서 정량적으로 검출할 수 있다. 따라서 본 키트는 시간과 비용을 절감할 수 있는 효과가 있다.

실시예 6:

HBV 항체/항원을 검출하는 바이오칩 키트

본 실시예에서 준비된 바이오칩 키트는 B형 간염 바이러스(HBV)와 관련된 항원 및 항체를 검출하는 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군 및 세척 버퍼 등으로 구성된다. 상기 키트는 인간 혈청 시료에서 B형 간염 바이러스(HBV) 항원 및 항체를 검출하는 데에 이용될 수 있다.

검출 목적 및 입수가능한 HBV 관련 항원/항체에 따라 고안된 본 키트의 프로브 조합은, 두 개의 항체 및 3 개의 항원을 포함한다. 선택된 상기 2개의 프로브 항체는, 각각 인간 HBsAg (B형 간염 표면 항원)에 대한 분리된 마우스의 mAb 및 인간 HBeAb(B형 간염 e 항원)에 대한 분리된 마우스의 mAb이다. 상기 프로브 조합을 위해 선택된 세 개의 프로브 항원은 분리된 HBsAg (B형 간염 표면 항원), 분리된 HBcAg(B형 간염 코어 항원) 및 분리된 HBeAg(B형 간염 e 항원)이다. 상기 프로브들은, 각각 그것의 최적화된 농도로 5X3 마이크로-어레이의 형태로 기재 상에 스팟팅하였다(각 프로브는 3 스팟 씩 스팟팅함). 그 후 소 알부민을 사용하여 기재의 잔류 표면을 불활성화시켰다. 그 다음 바이오칩 프로브-플레이트를 건조하고 즉시 사용가능하도록 준비하였다.

본 실시예에서 준비된 키트는, 하나의 인간 혈청 시료 내에서, B형 간염 표면 항원, B형 간염 e 항원, B형 간염 표면 항체의 IgG, B형 간염 표면 항체의 IgM, B형 간염 e 항체의 IgG, B형 간염 e 항체의 IgM, B형 간염 c 항체의 IgG, B형 간염 c 항체의 IgM을 검출하기 위해 사용하였다.

상기 키트에서 사용된 검출 방법 조합은, 간접적 검출 방법 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합이었다. 본 키트에서 사용된 마커 조합은 두개의 표지된 특이적 항체들, 한개의 표지된 종-특이적 항-IgG 및 한개의 표지된 종-특이적 항-IgM을 포함하는 조합이었다. 마커 조합에서 리간드로서 사용된 두 개의 특이적 항체들은HBsAg에 대한 분리된 마우스의 mAb이고 HBeAb에 대한 분리된 마우스의 mAb이었다. 리간드 HBsAb는 프로브 HBsAg 에피토프에 대한 것이 아니라 양-항체 샌드위치의 형태로 프로브 HBsAb에 의해 포획된 시료의 HBsAg에 대한 것이다. 리간드 HBeAb는 프로브 HBeAg 에피토프에 대한 것이 아니라 양-항체 샌드위치의 형태로 프로브 HBeAb에 의해 포획된 시료의 HBeAg에 관한 것이다. 마커 조합에서 리간드로서 사용된 종-특이적 항-IgG는 인간의 IgG에 대한 염소의 항체이다. 마커 조성물에서 리간드로서 사용된 종-특이적 항-IgM은 인간의 IgM에 대한 염소의 항체이다. 이러한 염소의 항-항체들은 각각 고정화된 항원 프로브들에 의해 포획된 인간의 IgG 및 IgM 항체들과 반응하지만, 프로브 조합 내에서 프로브로서 사용된 어떤 마우스 항체 또는 마커 조성물에서 리간드로 사용된 어떤 마우스 항체와는 결합하지 않는다. 본 실시예에서 로다민(여기 파장 λex=546nm 및 방출 파장 λem=575nm)을 두개의 특이적 항체들 및 염소의 항-인간 IgG를 표지하기 위한 표지 시약으로 사용하였다. 그러나, Cy5(여기 파장 λex=649nm 및 방출 파장 λem=670nm)을 염소의 항-인간 IgM을 표지하기 위한 표지 시약으로 사용하였다. 리간드들은 각각 로다민 및 Cy5으로 최적의 조건하에서 각각 표지하였다.

본 키트에서 음성 대조군은 ELISA 방법을 통해 선별된 음성 인간 혈청이다. 본 실시예에서 양성 대조군은 ELISA 검출을 통해 선별된 양성 인간 혈청의 혼합물이다. 본 실시예에서 양성 시료들은 각각, 1#. B형 간염 표면 항원 양성 시료, 2#. B형 간염 e 항원 양성 시료, 3#. B형 간염 항체의 IgG 양성 시료, 4#. B형 간염 표면 항체 IgM 양성 시료, 5#. B형 간염 e 항체의 IgG 양성 시료, 6#. B형 간염 e 항체의 IgM 양성 시료, 7#. B형 간염 c 항체의 IgG 양성 시료, 8#. B형 간염 c 항체의 IgM 양성 시료이다. 이러한 모든 선별된 인간 혈청 시료들의 음성 및 양성 결과들은 ELISA를 통해 미리 실험하였다.

시료들은 하기와 같이 검출하였다: 인간의 혈청 시료들 중 하나를 희석하고 본 칩의 한 반응기에 넣었다. 반응기 내의 항원-항체 반응을 37℃에서 1시간동안 수행하였다. 그러고 나서 결합되지 않은 혈청 성분들을 반응기로부터 제거하고 반응기를 세척 버퍼로 세척하였다. 마커 조합(로다민으로 표지된 HBsAg에 대한 마우스의 항체, 로다민으로 표지된 HBeAg에 대한 마우스의 항체, 로다민으로 표지된 염소의 항-인간 IgG, Cy5로 표지된 염소의 항-인간 IgM)을 반응기에 도입시켰다. 마킹 반응은 37℃에서 1시간동안 수행하였다. 그 다음 반응기를 먼저 버퍼 용액으로 세척하여 결합되지 않은 마커들을 제거하고 나서, 무수 알코올로 세척하였다. 최종적으로, 건조된 바이오칩 프로브-플레이트를 멀티-파장 레이저 공촛점 현미경검사(GMS 418 ARRAY SCANNER)로 스캔하고 분석하였다. 540nm의 여기 파장을 사용하여 B형 간염 표면 항원, B형 간염 e 항원, B형 간연 표면 항체 IgG, B형 간염 e 항체 IgG, B형 간염 c 항체 IgG의 검출 결과를 얻었다. 650nm의 여기 파장을 사용하여, B형 간염 표면 항체 IgM, B형 간염 e 항체 IgM, B형 간염 c 항체 IgM을 검출하였다(표 4). 하기 표 4는 인간 혈청 시료 내에서 B형 간염을 검출하기 위한 바이오칩의 결과이다.

시료

8개의 ELISA 키트를 이용한 결과

하나의 바이오칩 키트를 이용한 결과

A

B

C

D

E

F

G

H

A

B

C

D

E

F

G

H

1#

+*

-*

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+

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2#

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3#

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+

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4#

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5#

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6#

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7#

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8#

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음성 대조군

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양성 대조군

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블랭크

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*: 상기 표 1에서의 언급과 같다.

주의: A:HbsAg; B:HBeAg; C:HbsIgG; D:HbsIgM; E:HbeIgG; F:HbeIgM; G:HbcIgG; H:HBcIgM

실시예7:

HBV 및 HCV 항원/항체를 검출하는 바이오칩 키트

본 키트는 인간 혈청 중에서 B형 간염 바이러스(HBV) 및 C형 간염 바이러스(HCV)의 항원/항체를 검출하기 위한 것이다.

본 실시예에서 상기 키트는 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군, 세척 용액 등으로 구성된다.

바이오칩 프로브-플레이트의 프로브 조합의 선택은 검출 요건 및 입수 가능한 관련 항원/항체에 따라 달라진다. 본 실시예에서는 항원/항체 조합이 프로브 조합으로서 선택되었다. 프로브 조합에서 항체 프로브는 HBsAg에 대한 토끼의 항체이고, 프로브 조합에서 항원 프로브는 C형 간염 융합 항원이다. 항체 프로브는 인간 혈청 시료중의 B형 간염 표면 항원을 검출하기 위해서 사용하고, 항원 프로브는 C형 간염 항체를 검출하기 위해서 사용하였다. 상기 항원 및 항체 프로브는 최적 농도로 각각 2X3 어레이의 형태로 활성화된 기재 상에 메뉴얼 스팟터를 이용하여 고정화시켰다(각 타입의 프로브 당 3 스팟씩). 그러고 나서 소 알부민을 사용하여 매트릭스의 표면을 블로킹시켰다. 그러고 나서 바이오칩 프로브-플레이트를 건조시키고 즉시 사용할 수 있도록 준비하였다.

본 키트에서 마커 조합의 선택은 사용되는 프로브 조합 및 검출 방법에 따라 달라지는데, 검출방법은 항원 검출을 위해서는 양-항체 샌드위치 검출 방법의 조합을 선택하고, 항체 검출을 위해서는 간접적인 검출 방법을 선택하였다. 따라서, 마커 조합으로서는 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체를 선택하였다. 마커 조합에서 첫번째 마커는 포획된 항체의 간접적인 검출을 위해 사용하였고, 두번째 마커는 포획된 항원의 양-항체 샌드위치 검출을 위해 사용하였다. 마커 조성물에서 항체 리간드는 HBsAg에 대한 마우스의 mAb이고 이는 고정화된 항체 프로브(HBsAg에 대한 마우스의 mAb) 및 그것의 포획 HBsAg와의 양-항체 샌드위치를 형성할 수 있다. 종-특이성을 갖는 항-항체 리간드는 인간의 면역글로불린에 대한 염소의 항-항체이고 이것은 항원 프로브에 의해 포획된 인간의 HCV 항체와 결합할 수 있다. 표지 리간드에 짝지어진 표지 시약은 로다민이었다.

본 실시예에서 준비된 키트의 다른 부수적 부분은 음성 대조군, 양성 대조군 및 세척 용액 등이었다.

실시예 8:

간염 바이러스 항원/항체를 검출하기 위한 바이오칩 키트

본 실시예에서 준비된 키트는 바이오칩 프로브-플레이트, 마커, 음성 대조군, 양성 대조군, 세척 용액 등으로 구성된다. 본 키트는 다양한 간염 바이러스에 관련된 항체 및 항원을 검출하기 위한 것이다.

검출 목적 및 다양한 간염 바이러스에 관련된 입수가능한 의미있는 항원 및 항체들에 따라 고안된 본 키트에서 사용되는 프로브 조합은, 1개의 항체 및 5개의 항원을 포함한다. 상기 프로브 조합을 위해 선별된 프로브 항체는 인간의 HBsAg(B형 간염 표면 항원)에 대한 분리된 토끼의 mAb이다. 상기 프로브 조합을 위해 선별된 다섯개의 프로브 항원은 HAV Ag(A형 간염 항원), 다중-에피토프-융합 HCV Ag(C형 간염 바이러스 항원), 다중-에피토프-융항 HDV Ag(D형 간염 바이러스 항원), 다중-에피토프-융합 HGV Ag(G형 간염 바이러스 항원), 다중-에피토프-융합 HEV Ag(E형 간염 바이러스 항원)이다. 프로브들을 최적화된 농도로 각각 6X3 마이크로-어레이의 형태로 기재 상에 스팟팅하였다(각 프로브당 3 스팟씩). 그런 다음에 소 알부민을 사용하여 기재의 잔류 표면을 불활성화시켰다. 바이오칩 프로브-플레이트를 건조하고 즉시 사용할 수 있는 형태로 준비하였다.

본 실시예에서 준비된 키트를, 인간 혈청 시료 중의 HAV 항체, HBs 항원, HCV 항체, HDV 항체 및 HEV 항체를 검출하기 위해 사용하였다.

본 키트에서 사용한 검출 방법 조합은 간접적 검출 방법 및 양-항체 샌드위치 검출의 조합이다. 본 키트에서 사용한 마커 조합은 하나의 표지된 특이적 항체 및 하나의 표지된 종-특이적 항-항체를 포함하는 조합이다. 마커 조합에서 리간드로서 사용되는 특이적 항체는 HBsAg에 대한 토끼의 mAb이고, 이는 HBsAg에 대한 고정화된 토끼 항체 및 상기 고정화된 항체에 의해 포획된 인간의 HBsAg와 함께 양-항체 샌드위치를 특이적으로 형성할 수 있다. 항-항체에서 리간드로서 사용된 항-항체는 인간 항체에 대한 염소의 항-항체로서, 이는 고정화된 프로브 항원들(HAV Ag, HCV Ag, HDV Ag, HGV Ag 및 HEV Ag)에 의해 각각 포획된 그 쌍들인 인간 항체와 결합할 수 있지만, 토끼 프로브 항체 및 표지된 토끼 항체와는 결합할 수 없다. 본 실시예에서 로다민(여기 파장 λem=546nm 및 방출 파장 λem=575nm)을 표지 시약으로서 사용하고 이는 리간드에 결합되어 있다. 리간드들은 최적 조건 하에서 각각 로다민으로 표지하였다. 준비된 마커들은 두개의 분리된 마커들 또는 혼합물의 형태로 즉시 사용할 수 있도록 준비하였다.

본 실시예에서 준비된 키트의 다른 부수적 부분들은 음성 대조군, 양성 대조군 및 세척 용액 등이다.

실시예 9:

수혈 스크리닝을 위한 래피드 검출 키트

본 실시예에서 제작한 키트는, 인간 혈청 시료 중 HBsAg, HCV에 대한 항체,HIV₁₊₂에 대한 항체 및 매독에 대한 항체의 존재에 대한 래피드 검출을 위한 것이다. 즉, 이것은 헌혈자의 래피드 스크리닝에 적용할 수 있다.

본 키트는 테스트 스트립, 세척 용액 등으로 구성되어 있다. 본 키트의 테스트 스트립은 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립 및 시료-로딩 파트, 마커 파트, 프로브 파트 및 콸러티 콘트롤 파트로 구성되어 있다. 이러한 모든 파트들은 멤브레인 스트립 상에 존재한다. 시료-로딩 영역에는 유리 섬유 멤브레인이 있다.

상기 프로브-플레이트의 프로브 조합의 선별은 검출 요건, 예컨대 중국 당국의 수혈에 관한 법에서 규정하는 요건들에 따라 결정된다. 본 실시예에서는 항체/항원 조합을 프로브 조합으로서 선별하였는데, 이를 프로브 파트에 고정하였다. 프로브 조합에서, 항체 프로브는 HBsAg에 대한 토끼 항체이고, 항원 프로브는, 각각 마우스 공급원으로부터 얻어진 HCV 융합 항원, 마우스 공급원으로부터 얻어진 HIV₁₊₂혼합 항원 및 마우스 공급원으로부터 얻어진 매독 항원이다. 각 타입의 프로브를 검출 라인의 형태로 프로브 파트 상에 고정하였다.

본 실시예에서 사용된 검출 패턴을 항원 검출을 위한 양-항체 샌드위치 검출 패턴과 항체 검출을 위한 간접적 검출 패턴의 조합으로서 선별하였다. 따라서, 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체를 마커 조합으로서 선별하였다. 마커 조합에서 항체 리간드는 HBsAg에 대한 토끼 항체이고 항-항체 리간드는 인간 면역글로불린에 대한 염소의 항-항체이다. 리간드들은 각각 콜로이달 골드로 표지하였고 그 다음에 혼합한 후 마지막으로 라인의 형태로 멤브레인 스트립 상에고정하였다. 마커 파트를 시료-로딩 파트 및 프로브 파트 사이에 위치시켰다. 본 실시예에서 인간의 IgG의 콸러티 콘트롤 라인을 테스트 스트립 영역에 고정화시켰다.

본 실시예에서 인간 혈청 시료는 상기 실시예1에서와 동일하였다. 헌혈자의 래피드 선별은 환자를 위한 임상적 진단과는 다르다. 본 키트는, 수 분 이내에 헌혈자의 일차적 선별을 하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 시료의 어떠한 양성 결과가 관찰되면, 헌혈자는 헌혈이 거부될 것이다. 그 다음에 자격을 갖춘 헌혈자는 그 다음의 심사를 거치게 될 것이다. 이 선별 방법은 시간과 비용을 절감할 수 있다.

실시예 10:

HIV 항원/항체를 위한 래피트 검출 키트

본 실시예에서 제작된 키트는 인간 혈청 시료에서 HIV 항원 및 항체의 래피드 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 키트는 HIV 항원 및 항체의 래피드 검출을 위한 테스트 스트립, 세척 용액 등으로 구성된다.

본 키트의 테스트 스트립은 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립 및 시료-로딩 파트, 마커 파트, 프로브 파트 및 콸러티 콘트롤 파트로 구성되며, 이들 파트 모두는 멤브레인 스트립 상에 존재한다. 시료-로딩 영역에는 유리 섬유 멤브레인이 있다.

본 실시예에서 항체/항원 조합은 프로브 조합으로서 선택되는데, 이는 프로브 파트에 고정화된다. 프로브 조합에서 항체 프로브는 HIV p24에 대한 마우스의 mAb이고 항원 프로브는 마우스 공급원 유래의 HIV gp160, gp41 및 gp36의 융합 단백질이다. 각 타입의 프로브를 검출 라인의 형태로 프로브 파트 상에 고정시켰다.

본 실시예에서 사용된 검출 패턴은 항원 검출을 위한 양-항체 샌드위치 검출 패턴 및 항체 검출을 위한 양-항원 샌드위치 검출 패턴의 조합을 선택하였다. 따라서, 표지된 특이적 항원 및 표지된 특이적 항체를 마커 조합으로 선택하였다. 마커 조합에서 항체 리간드는 HIV p24에 대한 마우스의 mAb이고 항원 리간드는 HIV gp160, gp41 및 gp36의 융합 항원이다. 리간드들을 각각 콜로이달 골드로 각각 표지하고 혼합한 후 라인의 형태로 멤브레인 스트립 상에 고정하였다. 마커 파트를 시료-로딩 파트 및 프로브 파트 사이에 위치시켰다. 본 실시예에서 인간 면역글로불린에 대한 항-항체의 콸러티 콘트롤 라인을 테스트 스트립 영역에 고정시켰다.

본 실시예에서 인간 혈청 시료는 상기 실시예3과 동일하였다.

본 래피트 검출 키트는 검출 결과를 수분 이내에 얻고 눈으로 확인할 수 있으므로 시간 및 비용을 절감할 수 있다.

실시예11:

간염을 위한 래피드 검출 키트

본 실시예에서 제작된 키트를 간염 의심 환자의 시료 중 간염의 신속한 확인을 위하여 사용할 수 있다.

본 키트는 래피드 검출을 위한 테스트 스트립, 세척 용액 등으로 구성된다. 본 키트에서 테스트 스트립은 니트로셀룰로오스 멤브레인 스트립 및 시료-로딩 파트, 마커 파트, 프로브 파트 및 콸러티 콘트롤 파트로 구성되며, 이들 모든 파트들은 멤브레인 스트립 상에 존재한다. 시료-로딩 영역에는 유리 섬유 멤브레인이 있다.

본 실시예에서 항체/항원 조합을 프로브 조합으로 선택했는데, 이를 프로브 파트에 고정시켰다. 프로브 조합에서 항체 프로브는 인간의 HBsAg에 대한 마우스의 항체이고, 항원 프로브는 각각 HAV 항원, HCV 융합 항원, HDV 융합 항원, HEV 융합 항원 및 HGV 융합 항원이다. 각 타입의 프로브를 최적 농도로 검출 라인의 형태로 프로브 파트에 고정시켰다(6개의 검출 라인을 형성함). 상기 키트는 또한 인간의 IgG의 콸러티 콘트롤 라인을 포함한다.

본 실시예에서 사용되는 검출 패턴은 항원 검출을 위한 양-항체 샌드위치 검출 패턴과 항체 검출을 위한 간접적인 검출 패턴의 조합으로 선택하였다. 또한 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체들을 마커 조합으로 선별하였다. 마커 조합에서 항체 리간드는 HBsAg에 대한 정제된 마우스의 mAb, 종-특이적 항-항체 리간드, 염소의 항-인간 항-Ab이다. 리간드는 콜로이달 골드로 각각 표지한 후 혼합하고 마지막으로 라인의 형태로 멤브레인 스트립 상에 고정시켰다.

마커 파트를 상기 프로브 파트 위에 위치시켰다.

본 키트는 HAV 항체, B형 간염 표면 항원, HCV 항체, HDV 항체, HEV 항체 및 HGV 항체를 신속하게 검출할 수 있다. 그 결과들은 눈으로 확인할 수 있다. 따라서상기 키트는 시간과 비용을 절감할 수 있다.

실시예 12:

수혈의 래피드 스크리닝을 위한 ELISA 키트의 제조

본 실시예의 키트는 수혈과 관련된 몇몇 항원/항체들로 코팅된 마이크로-웰 플레이트, 마커 및 기질, 음성 대조군, 양성 대조군, 세척 용액 등으로 구성된다.

코팅된 마이크로-웰 플레이트는 96-웰 플레이트 및 그 웰 내부 표면 상에 코팅된 프로브를 포함한다. 프로브-플레이트의 프로브 조합은 검출 요건 에컨대, 중국 당국의 수혈을 위한 법에서 규정하는 요건들에 따라 선택하였다. 본 실시예에서 항체/항원 조합을 프로브 조합으로서 선별하였고 이들을 프로브 파트에 고정화시켰다. 프로브 조합에서 항체 프로브는 HBsAg에 대한 토끼의 항체이고 항원 프로브는 마우스 공급원 유래의 HCV 융합 항원, 마우스 유래의 HIV₁₊₂혼합 항원 및 마우스 유래의 매독 항원이다. 이들 프로브들을 최적 농도 및 최적 비율로 혼합한 후, 마이크로웰의 내부 표면을 프로브 로 코팅한 후, 소 알부민으로 블로킹하고 최종적으로 건조하여 사용하였다.

본 칩 키트의 표지 시스템은 마커 및 기질(기질 착색 용액 A 및 B)로 구성된다. 본 실시예에서 사용되는 검출 패턴은 항원 검출을 위한 양-항체 샌드위치 검출 패턴과 항체 검출을 위한 간접적 검출 패턴의 조합을 선택하였다. 따라서 종 특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체를 마커 조합으로 선별하였다. 마커 조합에서 항체 리간드는 HBsAg에 대한 토끼의 항체인데, 이는 HbsAg를 포획하기 위해 고정화된 토끼의 항체 프로브와 양-항체 샌드위치를 형성할 수 있다. 항-항체 리간드는 인간의 면역글로불린에 대한 염소의 항-항체인데, 이는 고정화된 항원 프로브에 의해 포획된 인간 항체에 결합할 수 있지만, HBsAg에 대한 토끼 항체 프로브 및 HBsAg에 대한 표지된 마우스의 mAb에는 결합할 수 없다. 포획된 항체들은 HCV에 대한 인간 항체, HIV₁₊₂에 대한 인간 항체 및 매독에 대한 인간 항체이며, 이들은 각각 HCV 항원 프로브, HIV₁₊₂항원 프로브, 매독 항원 프로브에 의해 포획된다. 리간드들은 효소로 각각 표지하였고 그 후 최적 농도 및 비율로 혼합하였다.

본 키트의 음성 및 양성 대조군은 실시예1과 동일하였다.

본 키트는 인간 혈청 시료가 모든 타겟 분자들에 대해 음성인지, 아니면 타겟 분자들 중 어느 하나에 대해 양성인지의 여부를 검사하기 위해 사용할 수 있다. 상기 타겟 분자들은 HBsAg, HCV 항체, HIV₁₊₂항체 및 매독 항체이다. 헌혈자의 래피드 선별은 환자의 임상적 진단과는 다르다. 본 키트는 수분 이내에 헌혈자의 일차적 선별을 하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 시료의 어떤 양성 결과가 관찰되면, 헌혈자는 헌혈이 거부될 것이다. 본 칩 키트가 타겟 분자들 중 어느 하나를 확인하기 위해 사용될 수는 없지만, 신속하고 경제적으로 헌혈자들을 스크린할 수 있으므로, 임상적으로는 여전히 잇점이 많다.

본 실시예에서 하기 시료들에 대해 본 키트를 이용하여 검출을 하였다: 3개의 음성 대조군, 3개의 양성 대조군, 1개의 블랭크 및 8개의 시료들. 시료들을 희석한 후 블랭크를 제외한 시료들을 각각 14웰에 첨가하고 웰 상에 코팅된 프로브 조합과 반응시켰다. 반응 후 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체를 모든 웰에 첨가한 다음, 기질 용액 및 반응 중지 용액을 첨가하였다. 그 결과는 ELISA 판독기로 판독하여 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5는 헌혈자의 래피드 선별의 결과를 나타낸다.

시료	본 ELISA 키트를 이용한 결과	실시예의 키트의 결과**
	HBsAg		HCV	HIV	매독
1	+	-	-	-	+
2	-	+	-	-	+
3	-	-	+	-	+
4	-	-		+	+
5	-	-			+
6	+	+	-	-	++
7	-	-	+	+	++
8	+	-	-	-	++
음성 대조군	-	-	-	-	-
양성 대조군	+	+	+	+	+++
블랭크	-	-	-	-	-

Claims (10)

1. 생물학적 시료 분석을 위한 프로브-플레이트로서, 하기 프로브 조합들 중 하나 이상이 직접 또는 간접적으로 고정화되어 있는 하나 이상의 반응기를 포함하는 생물학적 시료 분석을 위한 프로브-플레이트:

   A. 프로브 항체 및 프로브 항원의 조합;

   B. 다양한 구조-특이적 면역글로불린들에 대한 프로브 항-항체들의 조합; 및

   C. 다른 구조-특이성을 갖는 면역글로불린에 대한 프로브 항-항체 및 프로브 항원 및/또는 프로브 항체의 조합.
2. 제1항에 있어서, 상기 프로브 조합은 프로브 어레이 및/또는 프로브 패턴의 형태로 반응기에 비-무작위적으로 고정화된 것을 특징으로 하는 프로브-플레이트.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이오칩의 형태인 것을 특징으로 하는 프로브-플레이트.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 테스트 스트립의 형태이며, 상기 테스트 스트립은 육안으로 식별가능한 검출 결과를 제공하는 것을 특징으로 하는 프로브-플레이트.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로브-플레이트를 포함하는 생물학적 시료 테스트를 위한 키트.
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 마커를 더 포함하며, 상기 마커는 상기 프로브 조합에 대응하는 리간드 및 상기 리간드에 결합된 표지 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 리간드는 항원 및/또는 항체와 특이적 항원-항체 반응성 또는 친화도를 보이는 것을 특징으로 하는 키트.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 마커는 하기 마커 조합들 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트:

   A. 표지된 특이적 항체 및 표지된 특이적 항원의 조합:

   B. 다른 구조 특이성을 갖는 표지된 항-항체의 조합;

   C. 종-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

   D. 구조-특이성을 갖는 표지된 항-항체 및 표지된 특이적 항체 및/또는 표지된 특이적 항원의 조합;

   E. 상기 A 내지 D의 조합들로부터 유래된 조합.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사선면역분석(RIA), 면역형광 분석(IFA), 화학발광 분석 또는 전기화학발광 분석의 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
10. 생물학적 시료 분석을 위한 방법으로서,

    (1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프로브-플레이트 내의 반응기에 생물학적 시료를 투입하고 반응시키는 단계;

    (2) 선택적으로, 마킹 시약을 개별적 물질, 부분적 혼합물 또는 완전 혼합물의 형태로 상기 반응기에 투입하는 단계. 및

    (3) 반응 후 반응기 내의 결과를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료 분석을 위한 방법.