KR20040089454A - 소 상피세포 성장촉진 인자의 핵산 및 단백질 서열 - Google Patents
소 상피세포 성장촉진 인자의 핵산 및 단백질 서열 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소 상피세포 성장촉진 인자의 핵산서열 및 코드화된 단백질의 얻어진 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 성숙 bEGF 및 얻어진 성숙 bEGF 단백질의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명은 상동 핵산, 단백질 및 bEGF 유전자 및 bEGF 단백질의 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 동등한 절편 각각에 확장된다. 소 EGF는 미생물, 예를 들어 E. coli 또는 P. 파스토리스 및 감자와 같은 식물 숙주에 발현될 수 있다. 재조합 bEGF의 활성은 세포증식/DNA합성분석을 이용하여 확인할 수 있다. 소 EGF는 성장촉진, 장내감염예방 또는 치료, 장세포의 조기성숙촉진 및 적절한 스펙트럼의 분해효소의 분비 촉진, 및 영향흡수증가를 위한 가축동물사료 내의 보충물로서 가축 및 낙농분야에서 활용도를 보인다.
Description
최근, 경쟁력있는 시장 및 환경적 관심은 가축 및 낙농 분야에서 생산성을 향상시키기 위한 기술을 개발하도록 유도하고 있다. 그러나, 가축보호문제 및 생산에 관한 일반인들의 인식은 동물의 건강 및 보호에 대한 고려 없이 추가적인 생산성 향상이 이루어 질 수 있다는 점을 보여 준다. 다수의 동물계에 대한 최근의 발견은 상피성장촉진인자 (EGF)가 장세포의 조기성숙촉진 및 적절한 스펙트럼의 분해효소의 분비의 촉진, 영향흡수증가, 및 장내감염의 예방 및 치료를 위한 가축동물 사료첨구물로서 가축 및 낙농분야에서 사용될 수 있음을 암시한다.
약 1,200개의 아미노산의 전구체 단백질로부터 유래한, EGF는 53 아미노산을 포함하는 6 kDa폴리펩티드이다 (Carpenter and Cohen, 2979). 이는 타액, 장분비액, 및 다른 체액에 자연적으로 존재하며, 초유 및 우유에서 다량 생상된다(Donovan and Odle, 1994). EGF는 인간 태아의 위의 성장 및 성석을 자극한다. 대부분 종의 초유에 EGF가 다량 함유되어 있으며, 장내에 EGF 수용제가 존재하기 때문에, EGF (및 다른 성장 인자)는 생후 초기의 위장 발달에 기여하는 것으로 보고되어왔다 (Donovan and Odle, 1994).
EGF는 영양분흡수를 조절하는데 관여할 수 있다. 설치류에서, EGF는 공장 쇄자연막 (jejunal brush-border membrane)을 관통하여 전해질, 글루코스 및 프롤린의 투과를 증가시킨다. 새끼돼지에 있어서, EGF는 락타아제 및 알칼린 포스파타제 활성에 별다른 영향 없이 수크라제 및 말타아제 모두의 활성을 증가함으로써 장세포기능의 성숙을 촉진한다 (국제공개 WO 88/04180) EGF를 성장촉진용 사료첨가제로 사용하는 것은 그러므로 유용하다.
대장균염 또는 백리변 (Enteric colibacillosis or scour)는 비정형균Escherichia coli에 의해 유발되는 박테리아 감염이다. 신생 또는 어린 가축에 흔한 백리변은 농가의 경제에 심각한 영향을 미친다. 제한된 지역에 어린 가축들이 밀집되어 있으면 백리변이 보통 발생하게되는데, 설사, 탈수로 인해서 결국 죽을 수도 있는 특징이 있다. 대용유를 먹는 어린소들은 우유를 먹는 소들에 비해서 백리변에 감염될 확률이 높으며, 감염으로 인한 사망율은 75%에 이른다.
백리변에 대한 백신이 현재 없기때문에 EGF와 같은 효과적인 치료가 바람직하다. EGF가 함유된 첨가물은 로타바이러스에 감염된 새끼되지의 장내 기능을 촉진한다 (Zijlstra 등, 1994). 또한 EGF의 경구투여는 토끼에 있어서 장내 감염율을 낮추고 감염으로 인한 체중감소를 막아준다 (Buret 등, 1997). 미국특허 제5,753,622호는 백리변 및 다른 비정형 감염의 치료방법 및 EGF를 경구투여하거나 또는 가축사료 내에 첨가하여 간접적으로 제공함으로써 체중을 증가시키는 방법을 개시하고 있다. 종래의 대부분의 연구에서, 수용체(recipient)와는 상이한 종으로부터 유래한 EGF가 사용되었으나, 원칙적으로 동일한 종의 EGF가 좋지않은 부작용을 억제하는데 바람직하다. 낙농 또는 축산 분야에서는 따라서 소 EGF (bEGF)를 사용하는 것이 바람직하다.
사료첨가제 또는 보충물은 생산제에 의해 널리 사용될 수 있기 위해서는 경제적이어야 한다. 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 발전으로 인해, 연구, 치료 및 산업적 활용을 위한 다량의 외부 단백질이 효과적으로 생산딘다. 원하는 단백질의 유전자 코드화는 생산이 불가능한 생물체로부터 성장 및 유전자조작이 용이하여 이종 단백질의 발현에 널리 사용되는 미생이 포함된, 미생물, 식물 또는 동물 발현시스템으로 옮겨졌다. 인간 EGF는 효모에서 40ng/mg단백질의 속도로 발현되는데 반해 (미국특허 제5,096,825호), 쥐의 EGF는 효모Pichia pastoris에서 450㎍/ml 배양액의 속도로 생산되었다 (Clare 등, 1991).
성숙 EGF 단백질을 코드화하는 상보 DNA 서열은 생쥐, 쥐, 되재, 소 및 인간으로부터 유래하여 종래에 복제되었다 (Gray 등, 1983; Simpson 등, 1985; Kim 등, 2001; Stewart 등, 1994; Bell 등, 1986). 얻어진 아미노산 서열은 각각 55 ~ 85 %의 일치를 보이며, 중요한 구조적 잔기, 특히 3개의 글리신 (18, 36 및 39 잔기), 6개의 시스테인 (6, 14, 20, 31, 33 및 42 잔기) 및 티로신 37이 놀랍게 보존되고 있음을 보여준다. 다른 잔기에 있어서의 변이는 안티세라 및 핵산탐식자(nucleic acid probes)로 의해 종간에 관찰된 매우 낮은 상호활성에 대한 설명이 될 수 있다. 전구체 단백질을 코드화하는 cDNA 서열은 인간, 돼지 및 생쥐로부터 유래하여 복제되었다.
성숙 EGF 단백질을 코드화하는 cDNA이 앞서 언급한 다양한 유래에서 복제되었지만, 성숙 EGF 단백질을 코드화하는 DNA 서열은 소로부터 유래해서는 수득된 바가 없다. 그러나, bEGF는 성장촉진, 장내감염의 예방 또는 치료, 영양흡수의 증가, 미성숙 장세포의 발달촉진을 통해서 낙농 및 축산에 도움을 줄 수 있다. 그러한 잠재적인 상업적 활용을 위해서, 소로부터 유래한 EGF 그 자체의 사용은 가축의 건강 및 보호를 포함할 수 있는 좋지 않은 부작용을 피하기 위해서 바람직하다. 따라서 성숙 bEGF 단백질을 코드화하는 DNA 서열을 수득하고, 또한 bEGF를 재조합 시스템에서 성공적으로 생산할 필요성이 있다.
일반적으로, 인간과 소 서열 간에 상동성은 인간의 탐식자 또는 프라이머를 사용하여 그에 해당하는 bEGF DNA 서열을 얻는 것을 가능하게 한다. 그러나, bEGF DNA 및 단백질의 서열은 다른 종의 것과는 매우 다르다는 것이 확인되었으며, 이는 bEGF 서열을 복제하려는 시도가 초기에 어려움이 따랐다는 것을 설명해주고 있으며, 또한 그러한 발명의 많은 상업적 활용성이 높음에도 불구하고 이러한 서열이 아직 성공적으로 복제되지 않았다는 것을 설명해 준다.
발명의 요약
본 발명은 소상피성장촉진인자 (bEGF)를 코드화하는 DNA 서열 및 코드화된단백질의 서열을 제공한다. bEGF 유전자의 일부분의 DNA 서열 및 코드화도니 bEGF 단백질의 얻어진 아미노산 서열은 각각 서열번호 8 및 9에 나타내었다. 성숙 bEGF 단백질에 대한 DNA 서열 및 성숙 bEGF 단백질의 얻어진 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 및 11에 나타내었다.
따라서 본 발명은 bEGF를 위한 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산을 제공하는데, 여기서 코드화된 폴리펩티드는 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다
a) 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열
b) 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열; 및
c) 서열번호 9에 나타낸 아미노산 서열 또는 서열번호 11에 나타낸 아미노산 서열에 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 65%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99%의 상동성을 가지는 기능적으로 동등한 아미노산 서열. 본 발명은 소상피성장촉진인자를 위한 분리된 폴리펩티드의 절편에도 확장되며, 여기서 절편은 서열번호 11번에 나타낸 아미노산서열과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 bEGF를 위한 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산을 제공하는데, 여기서 핵산은 다음에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다
a) 서열번호 8 나타낸 뉴클레오티드 서열
b) 서열번호 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열; 및
c) 서열번호 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 10에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99%의 상동성을 가지는 기능적으로 동등한 뉴클레오티드 서열. 본 발명은 bEGF를 위해 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산의 절편에도 확장되며, 여기서 절편은 서열번호 10번에 나타낸 핵산 서열과 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 bEGF 폴리펩티드를 코드화하는 핵산분자를 포함하는 벡터 및 세포를 제공하며, 또한 코드화된 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 bEGF를 코드화하는 핵산이 적절한 숙주내에서 bEGF를 발현시킬 수 있는 콘트롤 서열에 작용가능하게 결합될 수 있도록 하는 발현구성체에도 확장된다.
본 발명은 또한 변형된 숙주세포, bEGF 폴리펩티드를 코드화하는 발현 DNA, 및 변형된 숙주세포를 생산하는 방법에도 확장된다.
본 발명은 또한 bEGF 폴리펩티드 또는 그 절편에 대한 단일클론성 또는 폴리클론성 항체에도 확장된다.
bEGF 폴리펩티드 또는 그와 기능적으로 동등한 절편이 가축사료의 보충물로서 가축 및 낙농 분야에서 성장촉진, 장내감염, 특히 대장균 감염, 예를 들어 대장균증, 지알디아증 및 백리변의 예방 또는 치료, 적절한 스펙트럼의 분해효소를 분비시키기 위한 장세포의 조기 성숙을 촉진하기 위해서 사용될 수 있다.
또 다른 광범위한 측면에 있어, 본 발명은 bEGF 폴레펩티드를 투여함으로써 가축의 성장을 증진하는 방법 및 가축의 장내 감염을 예방 또는 ㅣㅊ료하는 방법을 제공하고 있다. 본 발명은 따라서 다음에서 선택된 것을 포함하는 사료첨가제를 제공한다
a) 핵산에 의해서 코드화된 bEGF를 위한 폴리펩티드;
b) 핵산에 의해서 코드화된 bEGF를 위한 폴리펩티드, 여기서 bEGF를 위한 폴리펩티드는 비활성 또는 활성 성분과 결합되어 있음;
c) 미생물 또는 식물조직, 여기서 미생물 또는 식물조지근 핵산에 의해서 코드화되는 bEGF를 위한 폴리펩티드를 발현시킴; 및
d) 미생물 또는 식물조직으로부터 수득한 배양액 또느 추출물, 여기서 배양액 또는 추출물은 핵산에 의해서 코드화된 bEGF를 위한 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 bEGF를 위한 핵산에 의해서 코드화된 bEGF 폴리펩티드와 결합되거나 또는 이에 의해서 처리된 사료를 포함하는 사료조성물을 제공한다.
본원에서 사용된 다음의 용어돠 구절은 하기의 의미를 가진다.
"항체"는 단일클론성 및 폴리클론성 항체를 포함한다.
"소"란 아과(subfamily) Bovinae를 의미하며,Bison bison(Bison, Buffalo),Bison bonasus(European Bison 또는 Wisent),Bos frontalis(Gayal),Bos indicus(Zebu),Bos taurus(Domestic Cow),Boselaphus tragocamelus,Bubalus bubalis(Water Buffalo),Syncerus caffer(African Buffalo, Cape Buffalo),Taurotragus derbianus,Taurotragus oryx(Common Eland),Tragelaphus angasii(Nyala),Tragelaphus eurycerus,Tragelaphus imberbis(Lesser Kudu),Tragelaphus scriptus(Bushbuck),Tragelaphus spekii(Sitatunga),Tragelaphus strepsiceros(Greater Dudu)를 포함한다.
"연결(Circularization)"이란 선형 DNA 말단의 정렬 및 공유결합에 의해서 폐쇄 환형 분자 또는 "환형 DNA"를 형성하는 결합을 의미한다.
"코드화 서열"이란 단백질의 아미노산 서열 또는 기능성 RNA, 예를 들어 tRNA 또는 rRNA를 코드화하는 유전자 부분을 의미한다.
"상보" 또는 "상보적 서열"이란 Watson-Crick 염기쌍 규칙에 의해서 다른 서열의 뉴클레오티드와 수소결합된 이중체를 형성하는 뉴클레오티드서열을 의미한다. 예를 들어, 5'-AAGGCT-3''의 상보적 염기서열은 3'-TTCCGA-5'이다.
"종래의 폴리머라제 사슬반응"이란 타겟 DNA 절편이 기하급수적으로 증폭시켜 프라이머가 DNA의 반대편 스트렌드에 하이브리드화되고, 두 프라이머를 관통하여 내부적으로 확장될 수 있는 기술을 의미한다.
"축중" 또는 "축중성"이란 하나 이상의 코돈이 특정 아미노산을 특정할 수 있는 유전자 코드의 특성을 의미한다.
"다운스트림"이란 DNA 또는 RNA 내의 임의 부위의 3' 측면을 의미한다.
"대장균증"이란 독성 E. coli 스트레인에 의한 감염을 의미한다. E. coli 스트레인은 소장의 표면에 부착하고 다수로 증폭되며, 만성 설사, 탈수 및 높은 사망율에 이르는 심각한 소화질병을 유발하는 독성물질을 분비한다.
"장병원성 (enteropathogenic)"이란 장 내에 질병을 유발하는 경향을 의미한다.
"엑슨 (Exon)"이란 단백질의 특정 부위를 크드화하는 유카리오틱 유전자의 절편을 의미한다.
"발현"이란 구조적 RNA (rRNA, tRNA) 또는 메신저 RNA (mRNA) 내로 유전자가 전사되고 이어서 단백질로 번역되는 과정을 의미한다.
bEGF에 "기능적으로 동등한" 아미노산 서열이란 아미노산을 첨가 및/또는 제거함으로써 하나 또는 다수의 아미노산 치환체에 의해 개질되거나, 하나 이상ㅇ의 아미노산이 화학적으로 개질되었지만, bEGF의 활성을 유지하는 아미노산 서열을 의미한다. "기능적으로 동등한" 뉴클레오티드 서열은 bEGF와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"지알디아증"이란 플라겔레이트 프로토조안 (flagellate protozoan; genus Giardia)의 침입 또는 이에 의한 감염으로서 종종 설사의 증상을 보이는 것을 의미한다.
두개의 핵산 서열이 자연적으로 동일한 생물체에서 동일한 배열이 되지 않는 한, 그러한 생물체가 동종인지 여부를 불문하고, 두개의 핵산 서열이 상이한 생물체에서 생물체에서 유래된 것이면, 두개의 핵산 서열은 서로 "이종"이다.
만일 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 서열이 최고 일치를 위해 배열되었을 때 각각 일치한다면, 두개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "상동" 또는 "일치"이다. 두개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대한 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국부 부위를 확인하고 비교하기 위하여 두개의 서열의 부분을 비교창을 통해서 비교함으로써 수행된다. 비교창은 일반적으로 약 20~200개의 인접한 뉴클레오티드 또는 인접한 아미노산 잔기이다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 "서열일치의 퍼센트" 또는 "서열상동의 퍼센트"는 비교창을 통해서 최적으로 배열된 두개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 두개 서열의 최적의 배열을 위해 기준서열 (추가 또는 제거가 포함되지 않음)과 비교하여 추가 또는 삭제 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 퍼센티지는 다음에 의해서 계산된다: (a) 두개의 서열 모두에 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기에 의해 일치하는 부분의 수를 결정하고; (b) 비교창 내에서 부분의 총수로 일치하는 부분을 나누고; (c) 결과에 100을 곱하여 서열 일치의 퍼센티지를 구한다.
비교를 위한 최적의 서열 배열은 알려진 알고리듬의 컴퓨터화된 도구 또는 조사에 의해서 수행된다. 상업적으로 얻을 수 있는 무료 소프트웨어의 소스의 리스트는 Ausubel 등 (1990)에서 찾을 수 있다. 즉시 얻을 수 있는 서열 비교 및 다중 서열 배치 알고리듬은 각각 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul 등, 1997) 및 ClustalW 프로그램이다. 다른 적절한 프로그램은 위스콘신 유전자 소프트웨어 팩키지 (Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) 내에 있는 GAP, BESTFIT, GASTA 및 TFASTA이 있다. 좀 더정확하게는, 본원 명세서 및 청구의 범위에 사용된 바와 같이 아미노산 서열의 "서열일치의 퍼센트" 또는 "서열상동의 퍼센트"는 위에서 언급한 대로 얻을 수 있는 BLASTP 프로그램의 디폴트 값에 따라서 결정된 최적의 서열밸열에 기초하여 결정된다.
다음에서 좀 더 상세히 설명하는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성은 DNA 하이브리디제이션 분석법에 의해서도 결정되는데, 여기서 이중 스트렌드의 DNA의 안정성은 염기쌍의 발생정도에 의존한다. 고온 조건 및/또는 낮은 염분함량은 하이브리드의 안정성을 저하시키며, 선택된 정도의 상동성 이하를 가지는 서열의 결합을 막기위해서 변화시킬 수 있다.
"숙주"는 동물, 식물, 효모, 균, 프로토조안 및 프로카리오틱 숙주를 포함한다.
"장내 감염"은 장병원성 대장균 감염, 예를 들어 대장균증, 지알디아증 및 백리변을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
"인트론"이란 유전자의 내부서열(intervening sequence)를 의미한다. mRNA가 번역되기 전에 전사되고 절단된다.
"역 폴리머라제 사슬반응"이란 알려진 서열의 중심부의 서열의 측면을 접촉하면서 (flanking) 알려지지 않은 DNA 서열를 증폭하기 위한 기술로서, DNA는 적절한 제한 효소에 의해서 소화되며 환형화되고, 프라이머는 확장은 외부로 진행되고 생산물은 알려진 서열의 업스트림 및 다운스트림의 서열을 포함할 수 있도록 설계된다.
"분리된"이란 자연상테로부터 "인간의 손에 의해서" 변형된 것을 의미한다. 만일 "분리된" 조성물 또는 물질이 자연에 있다면, 그 최초의 환경으로부터 변화되었거나 제거되거나 또는 이 모두라는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 생동물 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리된" 것이 아니며, 자연 상태에 공존하는 물질로부터 분리되 것이라면 "분리된" 것이며, 본원에서 사용된 바도 이와 같다.
"가축"은 예를 들어 젖소, 육용우, 돼지, 염소 및 양을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 용어는 어린 동물 및 성장한 동물을 포함한다.
"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 뉴클레오티드 5탄당의 3'탄소가 인접한 뉴클레오티드 5탄당의 5'탄소에 포스페이트 그룹으로 결합한 (DNA 내의) 데옥시리보뉴클레오티드 또는 (RNA 내의) 리보뉴클레오티드의 선형 서열을 의미한다. "폴리펩티드" 또는 "핵산"은 DNA, 예를 들어 cDNA, 게놈믹 DNA, 합성 DNA, 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 이는 이중 스트렌드일 수도 단일 스트렌드일 수도 있으며, 단일인 경우에는 코딩 스트렌드일 수도 있으며, 비코딩 (안티센스) 스트렌드일 수도 있다.
"폴리뉴클레오티드 구성체"란 자연발생 유전자에서 분리되거나 또는 자연상태로 존재할 수 없도록 결합되거나 변형된 핵산 절편을 포함하는 핵산 분자를 의미한다.
만일 두개의 DNA 서열의 결합의 특성이 서로 각자 정상적인 작용을 할 수 있도록 서열의 작용에 간섭하지 않는 것이라면, 두개의 DNA 서열은 "작용가능하게 결합 (operably linked)"ehls rjtdlek. 예를 들어, 만일 프로모터가 그 코딩 서열의 전사를 가능하도록 할 수 있다면 프로모터 부분은 코딩 서열과 작용가능하게 결합한 것이다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해서 결합한 아미노산의 선형 고분자를 의미한다.
"프로모터"란 RNA 폴리머라제가 결합할 수 있고 정확한 건사를 개시할 수 있는, 일반적으로 80~120개의 염기쌍으로 이루어져 있고 유전자의 개시부위의 업스트림에 위치한 시스-작용 DNA 서열을 의미한다.
"재조합" 핵산 분자, 예를 들어 재조합 DNA 분자란 두개 이상의 비상동적 DNA 분자 (예를 들어 그 클로닝 사이트 또는 그 폴리링커 내에 복제된 외부 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드)의 결합을 통해서 시험관내에서 (in vitro) 형성된 신규한 핵산 서열을 의미한다.
"백리변"이란 동물 내에서 지속되는 설사를 의미한다.
"사일런트 체인지"란 예를 들어 폴리뉴클레오티드에 의해서 코드화되는 아미노산 서열을 변화시키지 않는 변화의 포함을 의미한다.
"유전자 이식"이란 배선 (germ line)내에 외부 DNA가 도입된 생물체를 의미한다.
"업스트림"이란 DNA 또는 RNA 내의 임의 사이트의 5' 측면을 의미한다.
유전자의 "변형체" 또는"변형"이란 동일한 단백질을 코드화하거나 bEGF 활성을 가진 동등한 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
단백질의 "변형체" 또는"변형"이란 bEGF 단백질 또는 그 절편의 변형체 (그 유도체 또는 유사물을 포함)을 의미한다. 그러한 변형체는 bEGF 단백질과 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 치환, 추가, 삭제, 융합 및 절단에 의해서 차이날 수 있다.
"벡터"란 숙주안에서 자발적으로 복제할 수 있고 외부 DNA를 받아들일 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 복제의 그 자신의 유래를 가지고 있으며, 외부 DNA를 삽입하는데 사용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 위한 하나 이상의 독특한 인식부위를 가지고 있으며, 또한 통상적으로 선택가능한 마커 예를 들어 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 또한 종종 삽입된 DNA의 발현을 위한 인식 서열 (예를 들어 프로모터)를 가지고 있다. 보통의 벡터는 파지, 코스미드, 바쿨로바이러스, 리트로바이러스, 및 플라스미드 벡터를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 소 상피세포 성장촉진 인자의 핵산 및 단백질 서열에 관한 것이다.
도 1A 및 1B는 소 EGF (서열번호 8)의 DNA 코딩 서열의 부분을 생쥐, 돼지 및 인간의 해당 EGF 서열에 대해 서열 배치한 것을 나타낸 것이다. EGF 서열의 소스는 다음과 같다:
1) 생쥐 (Gray 등, 1983; GenBank 기탁번호 J00380) 뉴클레오티드 3108-3539 서열번호 24;
2) 돼지 (Kim 등, 2001; GenBank 기탁번호 AF336151) 뉴클레오티드 3171-3606 서열번호 25;
3) 인간 (Bell 등, 1986; GenBank 기탁번호 X04571) 뉴클레오티드 3170-3607 서열번호 26.
도 2는 성숙 bEGF 단백질 (서열번호 10)을 위한 DNA 코딩 서열을 생쥐 (뉴클레오티드 3282-3440, 서열번호 27), 돼지 (뉴클레오티드 3346-3504, 서열번호 28) 및 인간 (뉴클레오티드 3347-3505, 서열번호 28)의 해당 서열에 대해 서열 배치한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 얻어진 bEGF 단백질서열 (서열번호 9)을 생쥐 (잔기 919-1063, 서열번호 30), 돼지 (잔기 912-1056, 서열번호 31) 및 인간 (잔기 912-1057, 서열번호 32)의 해당 EGF 단백질 서열에 대해 서열 배치한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 얻어진 성숙 bEGF 단백질서열 (서열번호 11)을 생쥐 (잔기 977-1029, 서열번호 33), 돼지 (잔기 970-1022, 서열번호 34) 및 인간 (잔기 970-1022, 서열번호 35)의 해당 성숙 EGF 단백질 서열에 대해 서열 배치한 것을 나타낸 것이다.
EGF는 훨씬 큰 선구 단백질(precusor protein)으로부터 생산된 53 아미노 산의 작은 폴리펩티드이다. 상기 선구 단백질은 DNA의 유전자 스패닝 110kb(a gene spanning 110kb)에 의하여 인코딩되며 상기에서 24 짧은 엑손은 다양한 크기의 인트론에 의하여 분리된다. 인트론의 절단(excision)에 의하여, 약 4700 염기 쌍의 mRNA가 생산되고 약 1,200 아미노 산의 선구 단백질을 인코드한다. 성숙한 인간의 EGF 단백질은 선구 단백질의 아미노 산 잔여기(amino acid residues) 977부터 1029까지의 절단에 의하여 생산되고 이는 엑손 20의 3' 끝부분(end)에 있는 마지막 95뉴클레오티드에 의하여 인코드되며 이는 mRNA의 핵산(nucleic acids) 3347-3505에 해당한다.
I. bEGF를 위한 핵산 및 폴리펩티드 서열(Nueleic acid and polypeptide sequences for bEGF)
게놈 DNA는 보바인 혈액(실시 예 1)으로부터 초기에 분리된다. 서열 인코딩 bEGF의 복제를 진행하기 위하여, 보바인 전체 게놈 DNA의 존재하에서 SEQ ID NOS 1및 2의 프리머가 폴리머라아제 체인 반응(PCR)에서 사용된다(실시 예2). SEQ ID NO:1의 프라이머는 인간의 EGF cDNA 서열의 뉴클레오티드 3215-3237을 포함하고 이로서 성숙한 EFG 단백질을 인코딩하는 서열의 업스트림에 위치한다. 이러한 프라이머는 잠재적인 퇴화(potential degeneracies)가 뉴클레오티드 염기를 혼합하는 것에 의하여 이익을 얻는 것과 같은 그런 방식으로 설계된다. 또한 퇴화된, SEQ ID NO:2의 플라이머는 인간 EFG cDNA의 뉴클레오티드 3377-3400을 포함하고 이로 인하여 성숙한 영역 내에 존재하게 된다. 이러한 두 개의 플라이머를 이용하여, 1456 염기 쌍 단편(base pair fragment)(SEQ ID NO:3)이 얻어지고 복제되고 서열화된다. 상기 단편(fragment)은 쥐(mouse)와 인간 EGF DNA 서열에게 현저한 호몰로지(homology)를 가지고, 엑손 19의 56 염기 쌍, 1320 염기 쌍 인트론 및 엑손 20의 80 염기쌍을 포함하고, 성숙한 EGF의 NH2의 말단(terminus)에 있는 첫 번째 열개 아미노 산을 인코팅하는 30 염기 쌍을 포함하며,이러한 것은 BLAST 알고리듬의 버젼 2.0을 사용하여 유사성을 위한 DNA 및 단백질 데이터베이스 연구에 의하여 제시되어 있다(Altschul et al., 1997).
성숙한 EGF 단백질의 잔여기(remainder)를 인코딩하는 DNA 서열을 복제하기 위한 발명자의 초기 전략은 상기에서 얻어진 서열로부터 설계된 보바인 특정 5' 프라이머를 사용하고 성숙한 영역의 다른 종 다운스트림(other species downstream)의 서열로부터 설계된 3' 프라이머를 사용하는 것이다; 그러나, 이러한 전략은 성공하지 못하였고 이는 많은 시험된 플라이머 조합체(combinations)가 bEGF 서열을 단련할 수(anneal)없고 증폭할 수 없기 때문이다. 이리하여 성숙한 영역으로부터 bEGF 서열 다운스트림이 다른 종의 서열로부터 설계된 프라이머를 사용할 때 성공적으로 증폭될 수 없는 것이 아닌가 의심스러워졌다. 역 PCR(inverse PCR)은 미지의 플랭킹 서열을 증폭하고 이러한 역 PCR이 이후 단계에서 사용되었다. 공지의 PCR에서, 프라이머는 반대편 DNA 스트랜드를 교배시키도록 설계되고 연장(extension)이 두 개의 프라이머에 걸쳐서 안쪽으로 진행된다. 역 PCR에서, DNA는 순환되고 프라이머는 연장이 바깥쪽으로 진행되고 산출물이 공지의 서열으 서열 업스트림 및 다운스트림을 포함하도록 설계된다(Ochman et al., 1998; Benkel and Fong, 1996).
상기에서 얻어진 bEGF의 DNA 서열 업스트림 및 다운 스트림을 증폭하기 위하여, 보바인 게놈 DNA는 분리된 반응에서 특정 제한 효소를 이용하여 소화되고(digested), 그 다음 단계로 낮은 농도로 묽게되고 리게이트 된다(ligated)(실시 예 3). 낮은 농도에서, 인트라-몰리쿨러 리게이션이 선호되고DNA 서클을 생성한다. 제한 효소 BamH I, EcoR I, Hind III 및 Sac I이 선택되며 이는 그들이 여섯 개의 염기쌍 서열로 인식되기 때문이며; 이로 인하여 다이제스쳔(digestion)에 의하여 생성된 평균 단편 크기는 4kb가 되고 이는 긴 영역 폴리머라제 효소에 의하여 쉽게 증폭될 수 있다. 더욱이, 미리 얻어진 서열에 따라서, BamH I 사이트(site)는 엑손 19와 20 사이의 인트론 5' 끝(extremity)에 위치한다; 이로 인하여, 만약 게놈 DNA가 BamH I을 이용하여 다이제스트되고, 순환되고, BamH I 사이트의 서열 다운스트림으로부터 디자인된 프라이머를 이용하여 증폭된다면, 결과로서 얻어지는 단편(fragment)은 BamH I으로부터 그 다음(next) BamH I 사이트 다운 스트림 옆에 우치하는 인트로 내부로 서열을 포함한다(도 4). 미리 얻어진 서열에서 세 개의 다른 제한 효소를 위한 인식 장소는 없다; 이리하여, 증폭 산출물(the amplification products)는 마주친((encountered) 첫 번째 인식 사이트까지 공지 서열의 서열 업스트림 및 마주친 인식 사이트 다음의 공지 서열의 서열 다운 스트림을 포함한다.
SEQ ID NOS: 4 및 5(뉴클레오티드 1184부터 1204까지; 및 SEQ ID NO: 3의 1070부터 1090까지, 각각) 상기에서 언급된 효소를 이용하여 다이제스트된 DNA 증폭을 위하여 사용된다. SEQ ID NOS: 6 및 7(뉴클레오티드 1413-1434; 및 SEQ ID NO:3의 375-394)가 다음 단계로 템플리트로서 첫 번째 반응의 알리쿼츠(aliquots) 상에서 사용된다. 이러한 프라이머는 SEQ ID NOS: 4 및 5의 프라이머에 의하여 증폭된 것들에 대하여 내부적인 단편을 증폭시키기 위하여 설계되고 상기 끼워진 반응은 첫 번째 반응에서 증폭된 서열이 EGF 서열을 포함하는 것을 확신시킨다. SacI을 이용한 DNA의 증폭은 아가로즈 젤(agarose gel)상에서 약 7,500 bp의 단일 밴드를 생산하고 상기 물질의 끼워진(nested) 증폭은 예상한 것처럼 보다 작은 크기의 매우 강한 밴드를 생산한다. 상기 생산물은 그 다음 단계로 복제되고 서열화된다(SEQ ID NO: 8; 실시 예 3). 상기 DNA 단편(fragment)은 다른 종으로부터 EGF 서열을 이용하여 현저한 호몰로지를 가지며 이는 BLAST 알고리즘의 버젼 2.0을 사용하여 유사성을 위한 DNA 및 단백질 데이터베이스 연구에 의하여 지적되었다(Altschul et al., 1997). 상기 단편은 인트론의 483 뉴클레오티드, 엑손 20, 앞에서 확인된 1,320 염기 쌍 인트론, 엑손 20, 4.8 킬로베이스 인트론 및 엑손 21의 158 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 단편은 이러한 방식으로 앞서에서 확인된 것들에게 균일한(homologous) 서열을 포함하고, 이에 더하여 추가적인 서열과 보바인 성숙 EGF 단백질의 나머지(rest)를 인코딩하는 것들을 포함한다.
인간은 엑손 19부터 21까지 EGF 유전자의 게놈 서열(인트론을 포함하여)을 이용할 수 있는 유일한 종(species)이며, 인간 크로모좀 4(chromosome 4)로부터 유도된 127 kb 클론에 포함된다(Stone et all, 1998; Genbank accession number AC004050). 엑손 19는 보바인과 인간 내에 있는 124 염기 쌍이다; 그리고 엑손 20은 보바인 내에 있는 145 염기쌍과 인간 내에 있는 149 염기쌍이다. 본 발명에 따른 보바인 클론은 엑손 21의 충분한 서열을 포함하지 않기 때문에, 그것의 크기는 인간 엑손 21과 비교될 수 없다. 인트론의 크기에는 여러가지 다양성이 있으며, 엑손 19 및 20 사이에 있는 인트론은 인간 내에 있는 4799 염기 쌍이고 보바인 내에 있는 5171 염기 쌍이다. 보바인 인트론 내에서 SINE 서열의 삽입이 있는 것으로 나타난다; 그러나, 인트론 서열의 나머지는 인간 인트론에 대하여 현저한 호몰로지를 보여준다.
도 1은 인간, 포신(porcine) 및 뮤린(murine)EGF 서열을 이용한 보바인 정렬(alignment)을 보여준다. 보바인 및 인간, 포신 및 뮤린 핵산 서열 사이에 전체적인 호몰로지는 각각 70%, 73% 및 64%이며, 이는 쌍으로 서열을 비교하는 BLAST 알고리즘의 2.0 버전을 사용하여 밝혀졌다. 호몰로지 레벨은 서열의 다른 영역 사이에서 다양하다; 예를 들어, 성숙한 단백질의 핵산 서열만이 비교될 때(도 2), 보바인(SEQ ID NO:9) 및 인간, 포신 및 뮤린 서열 사이에 호몰로지는 각각 64%, 66% 및 59%를 나타낸다. 그러나, 단지 성숙 단백질을 인코딩하는 서열의 핵산 서열 업스트림만이 비교될 때, 보바인, 인간, 포신 및 뮤린 서열 사이의 호몰로지는 82%, 85% 및 72%를 각각 나타낸다.
상기에서 얻어진 bEGF 유전자의 엑손 서열은 SEQ ID NO:10의 유도된(deduced) 단백질을 인코드한다. 인간, 포신 및 뮤린 EGF 서열을 이용하여 유도된 bEGF 단백질 서열의 정열은 도 3에 도시되어 있다. 보바인 및 인간, 포신 및 뮤린 유도된 단백질 서열의 전체적인 호몰로지(homology)는 상기 서열이 BLAST 알고리즘 버젼 2를 사용하여 쌍으로 비교될 때 49%, 51% 및 46%를 나타낸다. 유사한 특징(또는 동일한 그룹으로부터)을 가진 아미노 산이 고려될 때, 호몰로지는 인간, 포신 및 뮤린에 대하여 각각 66%, 69% 및 62%를 나타낸다. 핵산 서열에 대하여 나타나는 것처럼, 호몰로지의 레벨은 서열의 다른 영역 사이에 다양하다; 예를 들어, 단지 성숙한 단백질만이 비교될 때(보바인 서열을 위하여 SEQ ID NO:11; 도4), 보바인 및 인간, 포신, 및 뮤린 단백질 사이의 호몰로지는 각각 39%, 36% 및 36%가 된다(유사한 아미로 산이 고려될 때 65%, 62% 및 60%). 그러나, 성숙 단백질의 서열 업스트림만이 비교될 때, 보바인 및 인간, 포신, 및 뮤린 사이의 호몰로지는 66%, 73% 및 61%를 각각 나타낸다(유사한 아미노산이 고려될 때 78%, 84% 및 73%).
유도된 성숙한 bEGF 단백질(the deduced mature bEGF protein)은 6112.10 Da의 계산된 분자량을 가지고, 다른 종에서 단백질 구조를 위하여 현저하게 나타나는 특정 아미노 산을 포함하고, 즉 포지션 17, 36 및 39(다른 종에서 포지션 18, 36 및 39)에 있는 글리신 및 티로신 37. 인간 EGF에서, 티로신 13, 22 및 29는 다른 종에게 밀접한 근접성(proximity)을 가진다(Cooke et al., 1987). 유도된 bEGF 단백질에서, 티로신 13 및 22가 존재하고 마찬가지로 또한 아로매틱 아미노 산인 페닐알라닌 29, 및 다른 공지된 EGFs에 6에게 반대되는 것으로 5 시스타인이 존재한다. 단백질에 있는 이황화물 결합은 단백질 사슬의 특정한 폴딩(folding)을 위한 주요한 이유가 아니지만, 그러나 오히려 이미 안정된 형태(conformation)의 안정성을 증가시키기 위한 장치(device)가 된다(Watson et al.,1985). 유도된 bEGF 단백질은 또한 쥐(mouse) EGF의 호몰로그(a homologue)가 되고, 이는 44.8의 컨센서스 스코어(a consensus score)에 의하여 지시된 폴딩 인식에 위하여 예시되어 있다. 12보다 큰 스코어는 시간의 80%보다 더 큰 것으로 정확하게 예상된다(Fisher, 2000).
SEQ ID NO:8의 서열 분석은 엑손 19에서 인-프레임 TGA 코돈을 밝혀준다(성숙 영역의 업스트림). 유전자 코드의 세 개의 사슬 종결 코돈 중의 하나, TGA는 또한 세레노시스테인(selenocysteine), 21번째 아미노산을 위한 코드가 될 수 있다(Nasim et al., 2000; Tate et al., 1999). 다른 종으로부터 EGF 유전자에서, 해당하는 코돈은 시스테인을 위하여 인코드하는 TGC이다; 이리하여, 셀레노시스테인의 존재는 보존적인 대체성(a conservative substitution)을 구성한다. 본 발명에 있어서, 보바인 게놈 DNA의 서던 브로트 분석(southern blot analysis)는 보바인 게놈에 있어서 EGF의 복사(copies)의 수를 결정하기 위하여 수행된다(실시 예 4) 만약 단지 하나의 복사(one copy)만이 존재하는 것으로 나타난다면, 얻어진 서열은 기능성 EGF 유전자(the functional EGF gene)으로 얻어지고 선구 단백질은 셀레노프로테인인 것으로 가정하는 것이 합리적이다. 보바인 게놈 DNA는 제한 효소 BamH I, EcoR I, Hind III, Sac I 및 Xba I를 이용하여 분리된 반응에서 다이제스트가 된다. 각각 다이제스트(digest)의 35 ㎍이 아가로스 겔의 분리된 레인(separate lanes)에서 행해진다. 상기 DNA는32P-dCTP로 표시된 SEQ ID NO:3의 단편을 이용하여 잡종화된(hybridized) 나일론 멤버레인(nylon membrane)으로 전이되고, 세척되고 3일동안 X-레이 필름에 노출된다. 검증(the probe)은 다이제스트 각각을 위한 단일 밴드에게 하이브리드된다(hybridize), 보바인 게놈에는 단지 EGF의 단일복사(a single copy)만이 존재한다는 것을 강하게 암시한다.
그러므로, 본 발명에 따른 한 가지 특징은 격리된, 정제된, 풍부화된 핵산이 존재하고 이 핵산은 SEQ ID NO:9 서열 및 그들의 보조적인 서열을 포함한다는 것이다. 분리되고, 정제되고, 풍부화된 핵산은 cDNA를 포함하는 DNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함한다. 상기 DNA는 이중 가닥(double-stranded) 또는 단일 가닥(single stranded)가 될 수 있고, 단일 가닥이 코딩 가닥 또는 비-코딩(반대적인 의미로) 가닥이 될 수도 있다. 대안으로서, 격리된, 정제화된 또는 풍부화된 핵산은 RNA를 포함할 수 있다.
SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는 게놈 DNA는 여러가지 방법을 사용하여 격리될 수 있고, 예를 들어 SEQ ID NOS:4 및 5 프라이머를 이용한 Sac I으로 다이제스트된 보바인 게놈 DNA의 역 PCR에 의하여, SEQ ID NOS:6 및 7의 프라이머를 이용하는 것이 기술되어 있다. 다른 프라이머 조합은 또한 Sac I 또는 제한 효소를 이용하여 다이제스트된 게놈 DNA의 역 PCR에 의하여 SEQ ID NO:9의 DNA를 격리하기 위하여 보바인 서열 상에서 염기화되도록 설계될 수 있다. SEQ ID NO:9의 게놈 서열은 또한 예를 들어 각각 전방 또는 역방향으로 SEQ ID NOS:6의 프라이머를 사용하는 공지의 PCR에 의하여 얻어질 수 있다.
두번째로, SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는 게놈 DNA는 격리된 반응에서 공지의 PCR에 의하여 엑손 20 및 21로부터 서열을 증폭시키는 것에 의하여 격리될 수 있고, 예를 들어 엑손 20은 전 또는 역 프라이머로서 SEQ ID NOS:6 및 12의 프라이머를 사용하여 증폭된다. 엑손 21은 리게이트된 두 개의 결과로서 발생하는 단편을 이용하여 각각 전 또는 역 프라이머로서 SEQ ID NOS:13 및 14를 이용하여 증폭된다.
세번째로, SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는 게놈 DNA는 게놈 라이브러리와 접촉하는 것에 의하여 분리될 수 있고 상기 게놈 라이브러리는 특별히 관련된 서열에게 하이브리드하는 프로브(probe)를 허용하는 조건 하에서 SEQ ID NO:8의 서열 단편으로 만들어진 프로브를 가진다. 관련된 서열의 핵산에 대한 하이브리제이션 검증(hybridization of the probe)은 방사성 동위원소, 형광성 염색(a fluorescent dye), 또는 탐지할 수 있는 산출물의 형성을 촉매화할 수 있는 효소를 이용하여 프로브를 표시하는 것에 의하여 탐지된다. 게놈 라이브러리의 차단 스크리닝의 절차는 Ausubel et al.(1990) 및 Sambrook et al.(1989)에 의하여기술되어 있다.
bEGF를 인코딩하는 보조 DNA(complementary DNA)는 역전사 PCR에 의하여 분리될 수 있다. 본 발명에 있어서, 성숙한 bEGF 단백질과 이에 더하여 서열 업스트림 및 다운스트림을 인코딩하는 cDNA 단편은 얻어진 게놈 서열이 전사된다는 것(transcribed)을 보장하기 위하여 분리된다(실시 예 5). 보바인 키드니 mRNA(bovine kidney mRNA)는 SEQ ID NO:14의 프라이머를 이용하여 역전사된다. 역전사에 후속하여, cDNA는 각각 전 및 역 프라이머(forward and reverse primers)로서 SEQ ID NO:16 및 14의 프라이머를 이용하여 PCR 반응에서 사용된다. 여러가지 산출물이 아가로스 겔 상에서 관찰된다. 400염기 쌍보다 약간 더 많은 밴드가 겔로부터 절단되고, 정제화되고, 상기 DNA는 두 개의 분리된 PCR반응을 위하여 템플리트(a template)로서 사용되며, 상기 두 개의 반응은 각각 전 및 역 프라이머로서 SEQ ID NO: 16 및 12의 프라이머를 가진 것을 말한다. 얻어진 단편은 복제되고 서열화된다. 조합된 서열(SEQ ID NO:17)은 해당 게놈 서열에 대하여 98%로 균일화된 것(homologous)으로 나타났다. 차이(411개의 뉴클레오티드 중 6개)는 다른 동물로부터의 조직(tissues)이 게놈 DNA 및 RNA를 분리시키기 위하여 사용된다는 사실에 기인할 수 있다. 게놈 서열로부터 유도된 단백질(the deduced protenin)과 비교할 때, cDNA로부터 유도된 성숙한 단백질 서열에서의 두 개의 아미노 산의 변화는 명백하다, 즉 포지션 18에서 아르기닌 대신 글루타민, 포지션 32에서 히스티딘 대신 글루타민.
대안으로, bEGF를 인코딩하는 보조 DNA 서열은 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의하여 또한 분리될 수 있고, 이는 EGF 유전자를 발현하는 보바인 조직으로부터 만들어진다. cDNA 라이브러리는 그 다음 단계로 EGF 코딩 서열 또는 EGF 코딩 서열의 단편을 포함하는 프로브와 접촉되며, 이러한 접촉은 특별히 보조 서열에게 상기 프로브가 하이브리드하는 것을 허용하는 조건에서 이루어진다. 프로브에게 하이브리드하는 보조 DNA(complementary DNA)는 그 다음 단계에서 탐지되고 격리된다. EGF를 발현하는 보바인 조직은 그 다음 단계에서 노던 브로트(northern blot) 또는 PCR 분석에 의하여 확인된다. 성숙한 bEGF 단백질(SEQ ID NO:9)을 인코딩하는 서열은 공지의 DNA 합성제(synthesizers)에 의하여 인공적으로 생산될 수 있고, 이러한 인공적인 생산에서 SEQ ID NO:9의 단편 또는 부분은 해당하는 충분한 길이 서열(full-length sequence)을 생산하기 위한 중간체(intermediates)로서 사용될 수 있다. 분리된, 정제화된 또는 풍부화된 SEQ ID NO:9의 핵산은 그러한 방법으로 SEQ ID NO:11의 펩타이드를 마련하기 위하여 사용될 수 있다.
충분히-길이 단백질보다 더 작은 것은 종종 완전한 단백질 기능을 가진다는 것은 공지의 사실이다. 잘려진 단백질, N-터미날, 내부, 또는 C-터미날 부분이 부족한 잘려진 단백질은 충분한-길이 단백질의 충분한 또는 부분적인 생물학적 및/또는 효소 활동을 유지할 수 있다; 예를 들어, COOH 끝 부분에서 마지막 다섯 개의 아미노 산이 부족한 인간 EGF는 개스트릭 산 세크레틴(gastric acid secretion)을 억제할 능력을 유지하는 한편, 세 개의 N-터미날 레지듀(residues)가 상실된 쥐 EGF는 자연 단백질과 동일한 활성을 가진다(Hellen and Gregory 1980; Simpson et al., 1985). 그리하여, 완전한 bEGF 단백질 활성을 유지하는 내부적으로-삭제된(internally-deleted) 및 잘려진 bEGF 단백질을 인코딩하는 SEQ ID NO:9의 단편은 본 발명의 범위에 포함된다. 잘려진 단백질 또는 내부적으로 삭제된 부분(deletions)을 가진 단백질을 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 잘려진 또는 내부적으로-삭제된 bEGF의 활성은 예를 들어 DNA 합성/셀 증식 에세이(synthesis/cell proliferation assay)를 사용하여 검증될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 특징은 분리되고, 정제되고, 또한 풍부화된 핵산이며 이 핵산은 성숙한 bEGF 단백질의 적어도 7, 보다 적절하게는 적어도 10, 보다 더 적절하게는 적어도 15,보다 더욱 적절하게는 적어도 51, 가장 적절하게는 적어도 52 구성적인(consecutive) 아미노 산을 포함하는 bEGF 단백질 또는 단편을 인코드한다. 이러한 핵산의 코딩 서열은 bEGF 단백질의 코딩 서열과 동일할 수 있고 또는 유전적 코드의 중복(redundancy) 또는 퇴화(degeneracy)의 결과로서 bEGF 단백질의 적어도 7, 적절하게는 적어도 10, 보다 적절하게는 적어도 15, 보다 더 적절하게는 적어도 20, 보다 더욱 적절하게는 적어도 25, 보다 더욱 더 적절하게는 적어도 30, 보다 더 적절하게는 적어도 35, 더욱 더 적절하게는 적어도 40, 한층 더 적절하게는 적어도 45, 더욱 더 적절하게는 적어도 50, 한층 더 적절하게는 적어도 51, 가장 적절하게는 적어도 52의 구성적인 아미노 산을 포함하는 bEGF 단백질 또는 단편을 인코딩하는 코딩 서열과 다를 수 있고, 이러한 것은 당업계에 공지되어 있다(Lewin 1997).
성숙한 bEGF 단백질을 인코드하는 분리된, 정제화된, 또는 풍부화된 핵산은 이에 제한되지는 않지만 단지 성숙한 bEGF 단백질 코딩 서열만을 포함할 수 있다; bEGF 단백질 코딩 서열 똔느 리더 서열(leader sequence) 또는 선구 단백질 서열과 같은 추가적인 코딩 서열; 또는 예를 들어 코딩 서열의 인트론 또는 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'와 같은 성숙한 bEGF 단백질 코딩 서열 및 비-코딩 서열.
대안으로, bEGF의 핵산 서열은 성숙한 bEGF 단백질 내부로 조용한 변화를 유도하기 위하여 사이트 유도된(site directed) 뮤타게네시스(mutagenesis) 또는 다른 공지된 기술(Ausubel et al., 1990)을 사용하여 뮤타게나이즈(mutagenized)될 수 있고, 즉 폴리뉴클레오티드에 의하여 인코드된 아미노 산 서열을 변경시키지 않는 변화와 같은 것을 의미한다. 그러한 변화는 숙주 유기체에 의하여 선호되는 코돈을 도입하기 위하여 바람직하며, 그에 의하여 폴리펩티드와 같은 것을 인코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 의하여 생산된 폴리펩티드의 레벨을 증가시킨다.
어떤 아미노산 치환은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않고 단백질 서열 내부에 만들어 질 수 있다. 그리하여 본 발명은 성숙한 bEGF 단백질엣 아미노 치환, 추가, 삭제(deletions), 융합(fusion), 및 절단이라는 결과를 발생시키는 뉴클레오티드를 가지는 폴리뉴클레오티드와 또한 관련된다. 이러한 뉴클레오티드 변화는 사이트 지향된 뮤타게네시스(site directed mutagenesis), 랜덤 화학적 뮤타게네시스, 엑소뉴클레아제 III 삭제(exonuclease III deletion), 및 다른 재조합 DNA 기술을 사용하여 도입될 수 있다(Ausubel et al.,1990). 결과로서 나타나는 변형체는 bEGF의 생물학적 성질을 나타낼 수 있고; 예를 들어, 포지션 13에서 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 EGF의 수용체에게 인간 EGF의 결합에 거의 영향을 미치지 않는다(Tadaki and Niyogi, 1993). 대안으로, 그러한 뉴크레오티드 변화는 아레릭 변형체(allelic variants)를 자연적으로 발생시킬 수 있고, 이는 특별히 프로브에게 하이브리드하는 보바인 오리진(origin)의 핵산을 확인하는 것에 의하여 분리되며, 상기 프로브는 SEQ ID NO:9의 적어도 20, 적절하게는 적어도 30, 보다 적절하게는 적어도 40, 보다 더 적절하게는 적어도 50, 보다 더 적절하게는 적어도 60, 보다 더 적절하게는 적어도 70, 보다 더 적절하게는 적어도 80, 보다 더 적절하게는 적어도 90, 보다 더 적절하게는 적어도 100, 보다 더 적절하게는 적어도 110, 보다 더 적절하게는 적어도 120, 보다 더 적절하게는 적어도 130, 보다 더 적절하게는 적어도 140, 보다 더 적절하게는 적어도 150, 가장 적절하게는 적어도 159 구성 염기, 또는 그들의 보조 서열을 포함한다.
하이브리제이션(hybridization)은 낮은, 중간 정도의, 높은 스티링겐시 (stringency) 조건 하에서 유도될 수 있다. 요약하면, 유동성을 가지지 않은 변성된 산을 포함하는 폴리머 멤브레인은 0.9M NaCl, 50mM NaH2PO4,pH 7.0, 5.0 mM Na2EDTA, 0.5% SDS, 10X Denhardt's, 및 0.5mg/ml 폴리리보아데니실 산(polyriboadenylic acid)을 포함하는 용액에서 45℃에서 30분동안 먼저 프리하이브리드화(prehybridized) 된다.32P 끝-표시된(end-labelled) 올리고뉴클레오티드 프로브의 약 2×107cmp(특정 활성 4-9 ×108cmp/㎍)가 그 다음 단계로 상기 용액에 첨가된다. 12-16시간의 배양후에, 멤브레인이 0.5% DSD를 포함하는 1XSET(150mM NaCl, 20mM 트리스 하이드로크로라이드, pH 7.8, 1mM Na2EDTA)에서 실온에서 30분 동안 세척되고, 이어서 올리고뉴클레오티드 프로브를 위하여 Tm-10℃에서 신선한 1XSET 내에서 30분 동안 세척된다. 그 다음 단계로 상기 멤버레인은 하이브리제이션 신호를 검출하기 위하여 오토래디오그래픽 필름에 노출된다.
하이브리제이션 조건의 결핍(stringency)을 다양화하는 것에 의하여, 프로브에게 서로 다른 호모로지의 레벨을 가지는 핵산이 확인되고 분리될 수 있다. 스트링겐시는 프로브의 녹는점(Tm)보다 낮은 온도에서 여러가지 온도에서 하이브리제애션을 유도하는 것에 의하여 다양화될 수 있으며,이는 다음의 공식을 사용하여 계산될 수 있다:
길이 100 뉴클레오티드보다 더 큰 프로브에 대하여, Tm은 아래의 공식을 사용하여 계산된다; Tm=81.5-16.6(log[Na+] +0.41(%G+C)-(600/N) 상기에서 N은 프로브의 길이를 나타낸다. 만약 하이브리제이션이 폼아미드(formamide)를 포함하는 용액 내에서 행해졌다면 Tm=81.5-16.6( log[Na+] +0.41(프랙션(fraction) G+C)-0.63(%폼아미드)-(600/N)에 의하여 Tm을 계산하고 상기에서 N은 프로브의 길이를 나타낸다.
프리하이브리제이션은 6X SSC, 5X Denhardt 시약, 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성되고 단편된 살몬 스펌(salmon sperm) DNA, 50%포마이드 내에서 행해질 수 있다. SSC와 Denhardt 용액을 위한 공식은 Sambrook et al(1989)에 열거되어 있다.
하이브리디제이션은 상기 프리하이브리디제이션 용액에 탐지할 수 있는 프로브를 첨가하는 것에 의하여 유도된다. 상기 프로브가 이중 가닥 DNA를 포함할 때, 프리하이브리디제이션 용액을 첨가하기 전에 변성된다. 멤버레인은 보조적인 또는 균일한 서열을 포함하는 cDNAs 또는 게놈 DNAs에게 상기 프로브가 하이브리드되는 것을 허용하도록 충분한 시간 동안 하이브리디제이션 용액과 접촉시킨다. 길이 200 뉴클레오티드가 넘는 프로브를 위하여, 하이브리디제이션은 Tm 아래에서 15-20℃에서 행해질 수 있다. 적절하게, 6X SSC에서 하이브리디제이션을 위하여, 상기 하이브리디제이션은 약 68℃에서 유도된다. 적절하게, 50% 포마이드-포함 용액에서 하이브리디제이션을 위하여, 하이브리디제이션은 약 42℃에서 유도된다. 모든 앞에서 기술된 하이브리디제이션 조건은 높은 스트링겐시 상태인 것으로 취급된다.
하이브리디제이션에 이어서, 멤버레인은 먼저 15분 동안 실온에서 2X SSC, 0.1% SDS 에서 먼저 세척된다; 그 다음 단계로 30분 내지 1시간 동안 실온에서 0.1X SSC, 0.5% SDS로 세척되고; 그 다음 단계로 하이브리디제이션 온도에서 0.1X SSC, 0.5% SDS에서 세척되고; 마지막으로 실온에서 0.1X SSC로 세척된다. 올리고뉴클레오티드 프로브를 위하여, 보다 짧은 세척이 유리하다. 프로브에게 하이브리드된 핵 산은 오토래디오그래피 또는 다른 공지된 기술을 이용하여 확인된다.
탐지할 수 있는 프로브에 대한 호모로지를 감소시키는 핵산을 얻기 위하여,보다 적은 결핍 조건(stringent conditions)가 사용될 수 있다; 예를 들어, 하이브리디제이션 온도는 약 1M의 Na+농도를 가지는 하이브리디제이션 버퍼 내에서 68 ℃로부터 42℃로 약 5℃의 증가량으로 감소될 수 있다. 하이브리디제이션에 이어서, 멤버레인은 하이브리디제이션 온도에서 2X SSC, 0.5% SDS를 이용하여 세척될 수 있다. 상기와 같은 조건은 50℃이상에서는 "중간 정도의" 스트링겐시로서 50℃보다 낮은 온도에서는 "낮은" 스트링겐시로 취급된다.
대안으로, 상기 하이브리디제이션은 42℃온도에서 포마이드를 포함하는 6X SSC와 같은 버퍼에서 행해질 수 있다. 이러한 경우에, 하이브리디제이션 버퍼 내에서 포마이드 용액은 프로브에 대한 감소되는 호모로지의 수준을 가지는 클론을 확인하기 위하여 50%로부터 0%까지 5%의 증가량으로 감소될 수 있다. 그러한 조건은 25% 이상의 포마이드에서는 "중간 정도의" 스트링겐시로 취급되고 25%보다 낮은 포마이드에서는 "낮은" 스트링겐시로 취급된다.
그러한 방법은 이리하여 bEGF 서열 또는 단편에 대하여 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 호몰로지를 가지며, 상기 bEGF 서열 또는 단편은 적어도 20, 적절하게는 적어도 30, 보다 적절하게는 적어도 40, 보다 더 적절하게는 적어도 50, 보다 더 적절하게는 적어도 60, 보다 더 적절하게는 적어도 70, 보다 더 적절하게는 적어도 80, 보다 더 적절하게는 적어도 90, 보다 더 적절하게는 적어도 100, 보다 더 적절하게는 적어도 110, 보다 더 적절하게는 적어도 120, 보다 더 적절하게는 적어도 130, 보다 더 적절하게는 적어도140, 보다 더 적절하게는 적어도 150, 가장 적절하게는 적어도 159의 그들의 구성 염기(consecutive bases) 및 그들의 보조 서열을 포함한다. 호몰로지는 디폴트 파라미트를 이용하여 BLASE 버전 2를 사용하여 측정될 수 있다(Altschul et al., 1990). 추가적으로, 기술된 절차는 bEGF 단백질 또는 bEGF 단백질의 단편에 대하여 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 호몰로지를 가지는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 분리시키기 위하여 사용될 수 있고, 상기에서 bEGF 단백질 또는 bEGF 단백질의 단편은 적어도 7, 적절하게는 적어도 10, 보다 적절하게는 15, 보다 더 적절하게는 적어도 20, 보다 더 적절하게는 적어도 25, 보다 더 적절하게는 적어도 30, 보다 더 적절하게는 적어도 35, 보다 더 적절하게는 적어도 40, 보다 더 적절하게는 적어도 45, 보다 더 적절하게는 적어도 50, 보다 더 적절하게는 적어도 51, 가장 적절하게는 적어도 51 구성 아미노 산을 포함하고 이는 BLASTX 버전 2를 사용하여 결정된다.
EGF의 첨가는 장 기능을 향상시켜 새끼돼지가 로타바이러스(1994년, 질스트라 등)에 감염되는 것을 막아준다. 또한, 오랄 EGF를 토끼에게 투약하면 장 감염율도 감소하고 감염으로 인한 체중 감소도 방지한다(1997년, 뷰렛 등). 뷰렛 등의 미국 특허 번호 5,753,622에서는 관장 치료 및 기타 병원성 감염 치료 방법과 EGF를 구강 투약하거나 동물의 사료에 투여함으로써 체중을 증가시키는 방법을 발표했다.송아지의 경우에는 관장 치료 및 기타 병원성 감염을 방지하기 위해 하루에 10~10,000 ㎎/㎏ 정도의 복용량을 구강 투약할 수 있다.
상기 출원에 있어서, bEGF는 원형 bEGF, 정제된 bEGF, 또는 변형 미생물, 변형 식물 조직이나 배양균, 변형 미생물에 의해 bEGF가 숨겨질 수 있는 영양 매질 등으로부터 얻어진 추출물의 형태로 준비될 수 있다. 그러므로 새끼나 성장한 동물(소, 닭, 돼지, 양, 염소, 기타 위가 하나이거나 반추동물인 가축 등)의 성장과 건강을 증진시키는 다양한 형태의 bEGF가 준비될 수 있다. bEGF는 다음과 같이 고체, 액체, 부유물, 사료 첨가제, 혼합물, 또는 사료 배합물의 형태가 있을 수 있다.
ⅰ)고체- bEGF는 고체, 무기질 덩어리, 염류, 미립, 알약, 환약 또는 가루의 형태일 수 있다. 가루일 경우, bEGF는 사료 벙크에 뿌려두거나 사료와 혼합하거나 또는 기존의 과정을 통해 기타 사료 성분과 함께 환약으로 만들 수 있다.
ⅱ)액체 또는 부유물- bEGF는 적당한 액체에 동결 건조되거나 분말로 된 bEGF를 첨가함으로써 용액 또는 부유물의 형태로 액체에 혼합될 수 있다. bEGF는 동물이 마시는 물이나 기타 액체의 형태로 혼합될 수 있다. bEGF는 액체 사료, 예를 들어 종래의 기술에 잘 알려진 송아지에게 면역 보호와 영양을 제공하기 위해 사용된 액체 사료 형태인 초유, 병원 우유, 모든 우유 및 우유 대체품과 혼합된다. 활성 원료를 첨가하는 방식은 종래의 기술에 잘 알려진 것이다. 랑그레르(Langrehr)의 미국 특허 번호 5,785,990 참조.
ⅲ)사료 첨가제- bEGF는 bEGF로 변형된 식물 조직 또는 동결 건조된 미생물의 조제를 포함하는 사료 첨가제의 형태로 투약될 수 있다. 사료 첨가제는 동물의 사료에 규칙적으로 포함될 수 있다.
ⅳ)혼합물-동물의 사료에 활성 원료는 대개 활성 원료를 미리 섞어 놓거나 비타민과 미네랄을 미리 섞어 놓은 원료에 혼합한 후 사료에 혼합물 또는 사료 첨가제를 첨가함으로써 혼합할 수 있다. bEGF는 효소, 항생물질, 프로바이오틱, 비피도균 및 유산균의 살아 있는 조제물과 같은 종래 기술의 기타 활성 원료에 혼합될 수 있다. bEGF만 또는 기타 활성 원료와 혼합된 bEGF까지를 포함하는 활성 원료는 미리 혼합된 첨가물을 제공하기 위해 영양소들과 혼합될 수 있다. 영양소는 비타민(비타민 A, D, E 및 K, 티아민, 리보플라빈 등)과 같은 미세 영양소와 미네랄(주석, 코발트, 마그네슘, 요오드, 황산철 등) 및 거대 영양소(곡물, 열매, 풀, 지방질 및 기름)을 모두 포함한다. 그런 다음 미리 혼합해 놓은 것은 곡물(밀, 귀리, 보리, 옥수수), 식물성 단백질 사료, 동물성 단백질 사료 및 유제품(분유 및 유장(whey)분)을 포함하는 건조 사료 원료에 첨가될 수 있다.
ⅴ)사료 혼합물- bEGF는 bEGF를 혼합 또는 처리한 사료를 포함하는 사료 혼합물의 형태로 제공될 수 있다. bEGF는 물약 또는 분무로 사용되는 액체 또는 분말과 같은 건조된 형태의 사료와 혼합될 수 있다. 옥수수, 사탕수수, 밀, 보리, 귀리, 식물성 단백질 가루, 풀, 건초, 목초 및 옥수수 목초와 같은 곡물을 포함하는 기존의 사료도 사용될 수 있다.
bEGF의 형태는 기타 단백질(젤라틴, 우유 더껑이(skim) 분말 등) 또는 화학 약품(글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 환원제 및 알데히드)의 첨가를 통해 고정될 수있다. 약학적으로 적합한 기제(carrier), 희석액 및 첨가제는 또한 설탕, 분유 또는 유제품 및 섬유소 유도제 등과 같은 형태로 혼합될 수 있다. 동물이 충분한 양을 섭취할 수 있도록 동물에게 친숙하고 맛이 좋게 만든 bEGF를 제공하기 위해 조미(flavoring)가 가해질 수 있다 성장한 동물에게 필요한 양에 비해 조절된 양의 bEGF가 들어있는 bEGF 혼합물을 성장기의 새끼 동물들에 제공할 수 있다.
bEGF는 주입 또는 장관외(parenteral)의 경로에 의해 여러 방식으로 투약될 수 있다. 그러나, 동물의 사료 또는 마시는 물에 의한 구강 투여가 편리하다. 선택적으로, 적합한 프로모터 강화제 서열로 된 bEGF 유전자가 동물의 게놈(genome)에 통합되거나 위장 내의 관으로 bEGF를 숨김으로써 첨가 bEGF의 필요성을 없애는 기관 또는 조직을 발현시킬 수 있다.
bEGF의 적량(dosage)은 종래의 기술에 숙련된 자에게 잘 알려진 많은 요인들, 예를 들어 bEGF가 사용되는 것에 대한 조건(성장 촉진 또는 장 감염 치료 등); 동물의 형태, 나이, 무게; 등과 같은 bEGF의 특정 형태에 따라 달라진다. 예를 들어 송아지의 경우에는 하루에 10 ∼ 10,000 ㎍/㎏까지 다양한 양의 bEGF를 구강을 통해 투약할 수 있다. 그보다 많은 양은 성장한 동물에게 적합하다ㅏ.
여기에 있는 예들은 예시의 방법으로 제공되며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 사용된 수치(온도, Ph, 양 등)에 대한 정확성을 기하기 위해 노력했지만 여기에는 약간의 실험상의 차이나 변형이 있을 수도 있다.
실시예 1 - 보스 타우루스(Bos Taurus)로부터의 DNA 염색체의 분리
DNA 염색체는 염분 추출 방식(1988년, 밀러 등)을 이용해서 소의 혈액(보스 타우루스)으로부터 분리된다. 간단하게, 응고 방해 물질이 첨가된 혈액으로부터 얻어진 응집 세포는 15 ml의 원심 분리 튜브에서 세포핵 용해 버퍼 3 ml(10 Mm Tris-HCL, 400 Mm NaCl, 2 Mm Na2EDTA, pH 8.2)에 다시 넣는다. 용해액은 10%의 SDS 200㎕와 프로테아제 K 용액 0.5㎖(1%의 SDS와 2mM Na2EDTA에 프로테아제 1㎎)에 밤새 배양한다. 침지(digestion)된 후 포화된 NaCl(약 6 M) 1㎖은 15초 동안 강하게 흔들어준 각 튜브에 첨가되고 15분 동안 2500 rpm으로 원심 분리된다. 상청액은 다른 15 ml 튜브로 옮겨지고 순수 에탄올 2 볼륨(volume)(실온)은 첨가되며, 튜브는 DNA가 침전될 때까지 여러 번 뒤집어준다. DNA 스탠드는 피펫(pipette)을 이용해 제거하고 300 ㎕ Tris 버퍼를 포함하는 원심 분리 튜브로 옮긴다.
실시예 2 - 1.5 kb bEGF 유전자 조각의 확대, 클론화 및 서열화
ⅰ)bEGF 유전자 조각의 PCR 확대를 위한 초기 설계
다음과 같은 포유류로부터 상동(homology) 부위를 규명하기 위해 EGF cDNA가 분석된다.
사람 (1986년, 벨 등; 유전자 은행 접근 번호 X04571);
생쥐 (1983년, 그레이 등; 유전자 은행 접근 번호 J00380);
쥐 (1992년, 사기 등; 유전자 은행 접근 번호 U04842);
돼지 (2001, 김 등; 유전자 은행 접근 번호 AF336151); 및
말 (스튜어트 등; 유전자 은행 접근 번호 S73527).
성숙한 EGF단백질의 83 아미노산 위에 위치한 잘 보존된 부분을 확인하고, 아미노산 서열 "CTNTEGGY"을 기호화한다. 이 서열은 서열 ID 번호 1을 프리머(primer) 설계하는데 사용되어 잠재적 퇴화가 이 위치: 5' GAC ACA/C/G/T TGC/T ACA AAT ACA/C/G/T GAG GG 3'에서 뉴클레오티드 베이스를 혼합함으로써 조정된다. 서열 ID 번호 2는 사람의 EGF에서 서열 "DGYCLHDG"의 성숙한 단백질의 매우 잘 보존된 부분으로부터 프리머가 설계된다. 잠재적 퇴화는 또한 이 위치: 5' GAC/T GGG TAC TGC CTC CAC/T GG/AT GG 3'에서 뉴클레오티드 베이스를 혼합함으로써 조정된다. 프리머는 DNA/RNA 합성기에서 생성된다(응용 바이오시스템, 미국 94404, 캘리포니아 포스터 씨티, 링컨 센터 드라이브 850, 모델 번호 392).
ⅱ)1.5 kb bEGF 유전자 조각의 PCR 확대 및 클론화
확대는 50㎕에서 (예시 1에서 분리된 것과 같이) 300 ng 소 유전자 DNA, 서열 ID 번호 1과 2의 각 프리머 200 nM, 100㎛ dNTPs(로시 분자 생화학, 캐나다, 퀘벡 H7V 4A2, 라발, 불러버드 알만드-프래피어 201, 카탈로그 # 581 295), 1.5 U Taq DNA 폴리메라아제(라이프 테크널로지, 미국, MD 20850, 락빌, 메디컬 센터 드라이브 9800, P.O.Box 6482, 카탈로그 #1 0342-053), 1X 반동 버퍼(효소에 공급된) 및 1.5 mM MgCl2로 실행된다.96°C에서 3분간의 초기 변성 단계 후, 서른 다섯 번을 반복한 PCR 싸이클은: (1) 94°C에서 30초간 변성 단계; (2) 57°C에서 15초간 가열 냉각 단계, 및 (3) 72°C에서 2분간 확장 단계; 72°C에서 5분간 마지막 연장 단계를 포함한다.
15㎕의 PCR 반동은 1% 아가로우스 젤에 대해 이루어지고, 에티듐 브롬화물로 착색되며 자외선에서는 보인다. 대략 1.5 kb의 밴드는 젤로부터 떼내어져 글래스울(glasswool)을 통과함으로써 정제된다. 간단하게, 소량의 글래울은 0.5㎖의 튜브의 아래 작은 구멍에 놓인다. 젤 조각은 글래스울의 위에 놓이고 튜브는 1.5㎖ 튜브 안에 놓인다. 이 튜브들은 10분간 10,000 rpm으로 원심 분리된다. 엘류언트(eluent) 2㎕는 클론하기 충분한 주형을 만들기 위해 100㎕ PCR 반동(상기와 동일한 조건)에서 주형으로 사용된다. 모든 확대 반동은 1%의 아가로우스 젤에 대해 이루어지고, 에티듐 브롬화물로 착색되어 자외선에서는 볼 수 있다. 1.5 kb 밴드는 젤로부터 떼내어져 QIA퀵 젤 추출 키트로 정제된다(미국, 캘리포니아 91355, 발렌시아, 애버뉴 스탠포드 28159, 키아겐 인코퍼레이티드, 카탈로그 #28704). 대략 50 ng의 DNA는 pGEMT-EASY TA 클론 벡터(프로메가 코퍼레이션, 미국, WI53711-5399, 메디슨, 우드 할로우 로드 2800, 카탈로그 #A1360) 12.5 ng에 대해 4°C에서 16 시간동안 10㎕의 양으로 T3 DNA 리가제(프로메가 코퍼레이션, 카탈로그 #M1801)의 3단위로 결합된다. 리게이션 혼합물 2㎕는 E. coli MAZ Efficiency DH5αTMCompetent Cells(라이프 테크널로지, 카탈로그 #18258-012)으로 변형된다.
ⅲ)1.5 kb 소 EGF 유전자 조각의 서열화
1.5 kb 삽입(서열 ID 번호 3)의 완전한 서열은 다음 방식으로 결정된다. 템플레이트 DNA는 QIAprep Spin Miniprep Kit(키아겐 인코퍼레이티드, 카탈로그 #27104)로 밤새 E. coli(bEGF를 운반하는 플라스미드로 변형된)로부터 추출된다. 예시들은 DNA 서열 시스템(어플라이드 바이오시스템즈, 모델 #373A)에 대한 분석을 위해 BIGDYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT(어플라이드 바이오시스템즈, 카탈로그 #403051)을 이용해 준비된다. 겹치는 서열은 프리머 워킹(walking)에 의해 만들어진다. DNA 서열 자료는 SEQUENCHERTM소프트웨어(진 코즈 코퍼레이션, 미시간 48108, 앤 아버, 수트 300, 에이비스 드라이브 640, 카탈로그 #SQA3.1)을 이용해 분석된다.
실시예 3 - DNA 서열의 확대에 대한 역 PCR
ⅰ)역 PCR을 위한 1.5 kb bEGF 조각의 서열로부터의 프리머 설계
프리머는 예시 2에서 얻어진 1.5 kb bEGF 유전자 조각의 서열로부터 설계된다. 서열 ID 번호 4(서열 ID 번호 3의 뉴클레오티드 1184에서 1204)와 5(서열 ID 번호 3의 뉴클레오티드 1070에서 1090)는 제1확대에 사용되고; 서열 ID 번호 6(서열 ID 번호 3의 뉴클레오티드 1413에서 1434)와 7(서열 ID 번호 3의 뉴클레오티드 375)의 프리머는 내부 조각을 서열 ID 번호 4와 5의 프리머로 만들어진 조각으로 확대하기 위해 설계된다.
ⅱ) 템플레이트 조제
템플레이트는 밤새 37°C에서 분리된 100㎕ 반동에서 1㎍의 소 유전자 DNA를40 U EcoR I, BamH I, Hind Ⅲ와 Sac I(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코퍼레이티드, 미국, MA 01915, 비벌리, 토저 로드 32, 카탈로그 #s R0101S, R0136S, R0104S, R0156S)로 침지시킴으로써 제조된다. 침지 후, 10분간 80°C에서 배양에 의해 비활성화된다. DNA는 물에서 1㎍/㎖의 농도로 희석된 후 16°C에서 16시간 동안 1ml의 양으로 1X 리가제 버퍼와 30 U T4 DNA 리가제(프로메타 코퍼레이션, 카탈로그 #M1801)으로 배양된다. 이런 낮은 농도에서, DNA 서클을 만들면서 분자내 리게이션이 발생한다. 리게이션 후, DNA는 QIA퀵 PCR 정제 키트(키아겐 인코퍼레이티드, 카탈로그 #28104)로 제거하고 30㎕ 10 mM 트리스의 최종 볼륨으로 녹아 분리된다. 이 볼륨은 증발에 의해 10㎕로 감소한다.
ⅲ)폴리머라제 연쇄 반응
각 침지로부터 리게이트된 DNA의 5㎕ 약수는 PCR에서 템플레이트로 사용된다. 작용 혼합물은 물에서 25㎕까지 1X LA PCR BUFFER Ⅱ(판베라 코퍼레이션, 미국 WI 53711, 메디슨, 싸이언스 드라이브 545, 카탈로그 #PR002M), 2.5 mM MgCl2, 1.6 mM dNTPs (판베라 코퍼레이션, 카탈로그 #RR002M), 서열ID번호 4의 0.2㎛ 프리머, 서열 ID 번호 5의 0.2㎛ 프리머, 1.25 U TAKARA LA TAQ POLYMERASE(팬베라 코퍼레이션, 카탈로그 #RR002M)를 포함한다. 96°C에서 3분간의 최초 변성 단계 후, 서른 다섯번 반복하는 PCR 싸이클은: 1) 94°C에서 30초간 변성 단계; (2) 61°C에서 15초간 가열 냉각 단계; (3) 68°C에서 7분간 확장 단계; 72°C에서 5분간 최종 확장 단계를 포함한다. 확대 제품 1㎕는 반응 볼륨이 50㎕인 때를 제외하고 설명된 것과 동일한 조건에서 서열 ID 번호 6과 7의 프리머로 더블 네스트 확대의 30 싸이클에직접 사용된다.
제1 및 더블 네스트 확대 모두로부터 얻어진 제품 15㎕는 0.7% 아가로우스 젤에 대해 만들어지며 에티듐 브롬화물에 의해 착색되고 자외선에서 볼 수 있다. 제1확대 반응은 약 7.5 kb의 단일 페인트 밴드로 나타나고 네스트된 확대는 예상보다 약간 작은 크기의 더 큰 DNA로 나타났기 때문에 Sac I로 침지된 DNA의 확대로부터 얻어진 제품은 분석을 위해 선택된다. 네스트된 확대로부터 얻어진 제품은 클론화되고 상기 설명과 같이 서열화된다. 얻어진 DNA 조각(서열 ID 번호 8)은 BLAST 알고리즘(1990년, 알트슐 등)의 2.0 버전을 사용해서 그 유사성의 단백질 데이터베이스와 DNA의 연구에 의해 나타난 것과 같이인간의 EGF(1986년, 벨 등; 유전자 은행 접근 번호 X04571)와 매우 동질의 것이다. 조각은 인트론의 483 뉴클레오티드, 엑손 19, 앞에 확인된 1,320 베이스 페어 인트론, 엑손 20, 5 kb 인트론, 엑손 21의 158 뉴클레오티드를 포함하므로; 이 조각은 앞에서 확인된 서열와 동질의 서열과 성숙한 bEGF 단백질의 나머지를 기호화하는 것을 포함하는 추가 서열을 포함한다.
실시예 4 - 소 유전자에서 EGF 유전자 복제의 수를 결정하기 위한 서던 법(Southern blot)
ⅰ)나일론 세포막으로의 DNA 이동
소 유전자에서 EGF 유전자 복제의 수를 결정하기 위해, 소 유전자 DNA의 서던 법이 서열 ID 번호 3의 조각과 교배한다. 간단하게, 소 유전자 DNA 35㎍은 각 반응에 있어서 금지 효소 BamH I, EcoR I, Hind Ⅲ, Sac I와 Xba I(뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코퍼레이티드, 카탈로그 #s R0136S, R0101S, R0104S, R0156S, R0145S)로 밤새 침지된다. 침지 DNA는 16시간동안 30V로 0.7% 아가로우스 젤로 분리되고 젤은 착색된다. 젤이 착색된 후, DNA는 10분간 0.2 N HCl에서 젤을 물에 담금으로써 디퓨리네이트(depurinate)한 후 가볍게 흔들면서 15분씩 세번 워시 해주고 1.5 M NaCl/0.5 N NaOH로 변셩시킨다. 젤은 10분씩 세 번의 워시로 1.5 M NaCl/1 M Tris-HCl(Ph 7.5)로 중성화된다. DNA는 이동 버퍼와 같이 10X SSC로 상방 모세관 현상으로 인해 양전기로 충전된 나일론 세포막(로쉬 분자 바이오케미컬스, 카탈로그 #1 417 240)으로 이동된다. 24 시간 후, 세포막은 블라팅 페이퍼(blotting paper)사이에 위치하고 3시간 동안 80°C에서 구워진다.
ⅱ)프로브(probe) 제조
서열 ID 번호 3의 조각 25 ng는 랜덤 라벨링 키트(로쉬 분자 바이오케미컬스, 카탈로그 #1 004 760)을 이용해서 50 mCi α32PdCTP(아머샴 파마시아 바이오테크, 캐나다, 퀘벡 H9X-3V1, 바이 뒤르페, 모간 불러버드 500, 카탈로그 #PB 10205-250 mCi)로 라벨 붙여진다. 프로브는 NUC-TRAP column(스트라타진, 미국, 캘리포니아 92037, 라 졸라, 노스 토리 파인스 로드 11011, 카탈로그 #400 701)을 사용해 정제도니다.
ⅲ)이전(pre) 교배, 교배, 워시, 오토라디오그래시(autoradiography)
세포막은 15분간 2X SSC로 미리 적셔둔다. 이전 교배는 1시간 동안 42°C에서 50% 비이온화 포머마이드(formamide) 10 ml, 1% SDS, 1M NaCl, 10% 덱스트란 황산, 및 변성된 연어 정액 DNA 1mg으로 회전 교배 오븐에서 수행된다. 그런 다음 프로브는 이전 교배 버퍼에 첨가되고 교배는 42°C에서 12시간 동안 수행된다. 세포막은 30분간 실온에서 100ml 2X SSC/1% SDS로 두번; 1시간 동안 60°C에서 200ml 0.2X SSC/0.1% SDS로 두번; 30분간 60°C에서 200ml 0.1X SSC/0.1% SDS로 두번 워시된다.
실시예 5 - cDNA 분리
얻어진 게놈 서열이 전사되었다는 것을 확신하기 위하여, 해당하는 cDNA가 클론되었다. 1 마이크로 그램이 보바인 키드니 mRNA(Clontech, 1020 East Meadow Circle, Palo alto, CA 94303-4230, USA, 카달로그 번호 6824-1)가 1X 역전사 버퍼, 10mM DTT, 1mM dNTP mix, 40U RNAse 억제제 및 15U의 서모스크립트 역전사아제(transcriptase)(Life 테크날러지, 카탈로그 넘버11146-024)를 포함하는 반응 내에서 55℃에서 1시간동안 SEQ ID NO: 14의 프라이머 1 pmol를 이용하여 역전사되었다. 트랜스크립타제는 5분동안 85℃에서 비활성화되고, 100U ,RNAse H가 첨가되고, 반응은 20분동안 37℃에서 배양되고 그 다음 단계로 10분동안 70℃에서 가열된다. cDNA가 QIA퀵 PCR 정제 키트(Qiagen Inc., 카탈로그 넘버28104)를 이용하여 크리닝되었다.
5 마이크로리터의 역전사 반응이 1X PCR 버퍼(1.5mM MgCl2를 포함하는), 0.2 mM의 각각의 dNTP, 0.4마이크로 몰(M) SEQ ID NO: 16 프라이머, 0.4 마이크로 몰(M) SEQ ID NO:14의 프라이머, 및 0.625 U TAKARA Taq DNA 폴리머라아제(PanVera Corporation, 카탈로그 넘버TAKP001B) 및 물 25 마이크로리터를 포함하는 PCR 반응에서 탬플리트로서 사용되었다. 4분동안 94℃에서 초기 변성 단계 후에, 30번 동안 반복되는 PCR 사이클은은 (1) 94℃에서 30초 동안의 변성 단계; (2) 59℃에서 30초 동안의 애널링 단계; 및 (3) 72℃에서 30초 동안의 확장단계; 10분동안의 72℃에서 10분간의 마지막 확장 단계가 이어지는 단계로 구성된다.
15 마이크로리터가 1.8%의 아카로스 겔 상에 로드되고, 이는 그 다음 단계로 에티디움 브로마이드로서 스테인되며, 자외선 아래에서 가시화된다. 400bp가 약간 넘는 밴드가 겔로부터 절단되고, 정제화되고, 상기 DNA는 두 개의 분리된 PCR 반응을 위한 템플리트로서 사용된다: 각각 전방 및 역 방향 프라이머로서 SEQ ID NOS:16 및 12의 프라이머를 가진 하나. 상기 조건은 단지 35 사이클로 수행된다는 점을 제외하고는 상기와 동일하다. 얻어진 단편은 클론되고 서열화되고(SEQ ID NOS: 17 및 18), 상기 서열은 BLAST 알고리즘(Altschul et al., 1997) 버전 2를 사용하여 해당하는 게놈 서열에게 98%까지 호모로러지한 것으로 밝혀졌다.
실시예 6 - E. coli 및 P.pastoris.에서 보바인 EGF 성숙 단백질의 과도 발현
i) 인트론이 없이 성숙한 보바인 EGF 단백질을 위하여 코딩하는 서열의 증폭 (Amplification of the sequences coding for the mature bovine EGF protein without the intron)
성숙한 보바인 EGF 단백질의 과도 발현(overexpression)을 위한 서열을 생성하기 위하여, 이러한 서열을 분리하는 5kb 인트론이 제거되어야 했다. 단백질의 N-터미너스를 인코딩하는 서열은 SEQ ID NOS: 6 및 12의 프라이머를 이용하여 증폭되는 한편, 단백질의 카르복시 터미너스를 인코딩하는 서열은 분리된 반응에서 SEQ ID NOS: 13 및 14의 프라이머를 이용하여 증폭되었다. Pfu DNA 폴리머라제의 다섯개의 유니트(Stratagene, catalog #600153)이 94℃에서 4분의 초기 변성단계를 위하여 1.5mM MgCl2의 존재하에서 사용되었고, PCR 사이클이 이어지고, 이러한 과정이 30번 반복되고 이러한 과정은 (1) 94℃에서 30초 변성 단계; (2) 57℃에서 30초 동안 애널링 단계(an annealing step); 및 (3) 72℃에서 30초 동안 확장 단계; 마지막으로 72℃에서 10분동안 확장하는(extension) 단계로 구성된다.
상기 PCR 반응은 1.8% 아가로스 겔 상에서 행해졌고, 에디디움 브로마이드로 표시되고(stained), 생산물은 QIA퀵 겔 추출 키드(Qiagen Inc, catalog #28704)를 사용하여 정제되었고 각각 산출물의 1 ㎕가 두 개의 단편을 결합하하는 단일 가닥의 합성을 위한 템플리트로서 사용되었다. 이러한 과정은 SEQ ID NOS:6 및 15의 프라이머로 증폭하는 것에 의하여 행해졌고 (N-터미날 단편의 3' 말단과 카르복시 단편의 5' 말단이 겹쳐진다)전방 방향으로 이루어졌다. 상기 단일 가닥 생산물은 QIA퀵 PCR 정제 키트(Qiagen Inc., catalog #28104)를 사용하여 살균되고(cleaned) 50㎕에서 녹여서 분리(eluted)되었다. 일루트 용액(the eluent) 1㎕가 SEQ ID NOS: 6 및 14의 프라이머를 이용하여 증폭을 위한 템플리트로 사용되었다. 292 bp 생산물은 1.5%. 아가로스 겔로부터 정제되고 실시 예 2에서 기술된 것처럼 pGEMT-EASY TA 클로닝 벡터 내부로 클론되었다(Promega Corporation, catalog #A1360).
ii) E.coli 발현 벡터의 구성(Construction of the E.coli expression vector)
수 많은 E.coli 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하고, 재조합 bEGF를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 구성(construct)은 벡터 pQE40(Qiagen Inc., catalog #32915)를 이용하여 준비되었고, 상기 벡터는 T5 프로모우터 전사-번역(promoter transcription-translation) 시스템 상에서 염기화되고 프로데오리시스로부터 EGF와 같은 짧은 펩티드를 방지하는 뮤린 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-융합 단백질의 발현을 위하여 설계되었다. 락-억제제(the lac repressor)는 T5 프로모우터를 억제한다; 그러나, 이소프로필-베타-D-시오갈락토시드(IPTG)의 첨가는 락 억제제를 비활성화시키고, 결과적으로 재조합 단백질으 ㅣ발현을 유도한다. 성숙한 EGF 단백질을 인코딩하고 pGEMT-EASY TA 클로닝 벡터(Promega Corporation, catalog #A1360) 내부로 클론된 서열은 SEQ ID NOS:18 및 19의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭된다. 그러한 프라이머는 적당한 제한 사이트(SEQ ID NO:18의 프라이머를 위한 Sph I 및 SEQ ID NO:19의 프라이머를 위한 힌드 III(Hind III))를 포함하도록 설계되었고 이는 pQE40 내부로 결과로서 생기는 생산물의 복제를 촉진하기 위함이다. SEQ ID NO 18의 프라이머 또한 팩터 Xa를 위한 인식 사이트를 위한 코딩 서열을 포함했다. 증폭된 생산물은 Sph I 및 힌드 III을 이용하여 다이제스트화 되었고 유사하게 쪼개진 pQE40 내부로 리게이트되었다(ligated).
iii) E.coli의 전이 및 bEGF의 발현(Transformation of E.coli and expression of bEGF)
구성 pQE40::bEGF는 열 충격 방식(Sambrook et al.,1989)에 의하여 성분 E. coli M15[pRep4] 세포(Qiagen Inc., catalog #34210)를 전이하기(transform)위하여 사용된다. 세포는 그 다음 단계로 25㎍/㎖ 카나마신 및 100 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB-아가(agar) 상에서 플레이트화되고 37℃에서 하루밤동안(overnight) 성장시킨다. 높은 발현 레벨을 가지는 클론을 확인하기 위하여, 전이체의 단일 콜로니(single colonies of transformants)가 상기에서 기술한 것처럼 항생제를 사용하여 LB 매개체의 1.5 ㎖ 내로 잡혀진다(picked). 이러한 작은 배지(cultures)는 하루밤동안 성장되고 항생제를 사용하여 10㎖의 LB 매개체를 접종하기(inoculate) 위하여 사용된다. 이러한 배지는 그 다음 단계로 심한 세이킹(shaking)으로 30분 동안 37℃에서 성장되고 이러한 세이킹은 OD600이 0.5-0.7에 도달할때 까지 행해진다. IPTG가 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 1mM의 마지막 농도에게 첨가되고 배지는 추가적으로 4-5시간동안 성장된다. 세포들은 10분동안 1500RPM의 속도로 원심분리(centrifugation)에 의하여 배양되고, 400 ㎕의 세포 리시스 버퍼에서 리서스펜드되고, Ni-NTA(Qiagen Inc., catalog #30210)을 이용하여 정제된다. 재조합 히스-태그된 단백질은 Ni-NTA(Qiagen Inc., catalog #30210)를 이용하여 정제되고 생산된 단백질의 양은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의하여 측정된다. 높은 발현 클론은 이와 같은 방식으로 발현 매개 변수를 만들고, 정제 프로토콜을 시험하고 대규모로 재조합 단백질을 생산하기 위하여 사용된다.
iv)P.pastoris 발현 벡터의 구성(Construction of the P.pastoris expressionvector)
성숙한 보바인 EGF 단백질을 인코딩하고 P.pastoris 발현 벡터 내부로 삽입하기에 적당한 서열은 PCR에 의하여 생산되었다. 외부 세부적 발현(extracellular expression)을 위한 두 개의 구성은 "엑스트라스톱(ExtraStop)" 및 "엑스트라태그(ExtraTag)"로 표시되어 준비되었다. 엑스트라스톱 구성은 전방으로 프라이머 알파A bEGF(SEQ ID NO:20) 및 역방향으로 알파A bEGF(SEQ ID NO:21)을 이용하여 생산되었다. 엑스트라태그 구성은 알파A bEGF 전방 프라이머 및 알파 AFXa&mycHIS 역방향 프라이머(SEQ ID NO:22)를 사용하여 생산되었다. 이러한 프라이머는 P.pastoris 발현 벡터(전방 프라이머에 있는 Xha I 사이트 및 역 방향 프라이머에 있는 Xba I 사이트) 내부로 결과로서 발생하는 PCR 생산물의 클로닝을 제한 요소가 이용하기 위한 인식 사이트를 포함한다. 이러한 프라이머는 이러한 상기에서 기술된 것 방식으로 준비된 서열을 코딩하는 성숙한 보바인 EGF 단백질을 증폭하기 위하여 사용된다. AmpliTaq DNA 폴리머라제(Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City CA, 94404, USA, catalog #N808-0160)이 PCR 사이클에서 사용되었고, 이는 30번동안 반복되었으며, 다음과 같이 (1) 94℃에서 1분동안 변성단계; (2) 65℃에서 1분동안 애닐링 단계; (3) 72℃에서 4분동안 마지막 확장 단계로 이루어진다.
PCR 생산물은 1.5% 아가로스 겔로부터 정제되고 pGEMT-EASY 클로닝 벡터(Promega Corporation, catalog #A1360)내부에서 E. coli 내부로의 구성의 확산(propagation of the construct)을 위하여 클론된다. bEGF 코딩 서열을P.pastoris 발현 벡터 내부로 전이하기 위하여, 사기 구성은 Xho I 및 Xha I(New England BioLabs Inc., catalog #R0146S, R0145S)를 이용하여 pGEMT로부터 다이제스트되고, 겔 저제화되고 유사하게 다이제스트된 pPICZ알파A 벡터(Invitrogen Corporation, 3985 B Sorrento Valley Blvd. 산디에고, CA 92121, USA, 카탈로그 번호 V195-20) 내부로 리게이트된다. 리게이트된 DNA는 성분 E.coli MAX Efficiency(등록상표)DH5알파(상표) 컴피턴드 셀(Life Technologies, 카달로그 번호 18258-012)를 전이하기 위하여 사용되고 결과로서 발생하는 전이체는 필요한 구성의 존재를 위하여 PCR에 의하여 스크린된다. 플라스미드 DNA는 정제화되고 P.pastoris를 전이하기 위하여 사용된다.
v)P.pastoris의 전이 및 bEGF 발현(Transformation of P.pastoris and bEGF expression)
P.pastoris 세포는 스트레인 GS115(Invitrogen Corporation, catalog#K1710-01)의 하루밤동안 배양의 1 내지 5ml를 이용하여 신선한 YPD 매개체(50ml)의 50ml이노규레이팅(inoculating)에 의하여 준비된다, 배양이 OD600의 1.2-1.5(약 6시간)에 도달할때까지 세이킹으로 28℃에서 성장된다. 1.5와 동일한 OD600을 이용하여 20ml로부터 세포가 원심분리에 의하여 배양되고 10mM 트리스, 1mM EDTA, 0.1M 디티오스레이톨 버퍼(pH 7.4)를 이용하여 세척되고, TE/LiCl/DTT 버퍼 1ml 내에서 리서스펜드된다. 상기 서스펜션은 1시간동안 30℃에서 배양되고; 아이스-냉각된 물 1ml로 한번 세척되고 다시 1ml의 아이스-냉각된 1M 소비톨을 이용하여 세척되고;약1010cells/ml의 세포 농도를 얻기위하여 아이스-냉각된 소비돌 160마이크로리터 내에서 리서스펜드된다. 발현 구성 pPICZ알파::bEGF(5 내지 10 마이크로 그램)이 위에서 기술된 것처럼 BstX I(뉴 잉글랜드 바이오랩 Inc., 카탈로그 넘버R0113S)로 선형화되고(linearized), 80마이크로리터의 세포와 혼합되고 냉각된 일렉트로포레이션 커베트스(0.2cm 인터일렉트로드 거리) 상에서 5분동안 얼음을 이용하여 위치된다. 상기 세포는 GENE PULSER(바이오-래드 실험실,Ltd., 5671 맥아담 로드, 미시사구아, ON L4Z 1N9, 카나다, 카달로그 넘버 165 2105)를 이용하여 1.5kV, 20uF, 200 오옴에서 펄스화된다. 1 ml의 아이스 냉각된 1M 소비톨이 그 다음 단계로 커베토에게 첨가되고 결과로서 발생하는 혼합물은 30℃에서 1시간 내지 2시간 동안 배양된다. 제오신 저항성 전이체(Zeocin resistant transformants)가 100 마이크로그램/마이크로리터 제오신 및 1M 소비톨을 포함하는 YPD 상에서 선택된다. 바이오매스가 24시간동안 300rpm, 30℃에서 BMGY 브로스에서 분리되어 성장되는 것에 의하여 제오신 저항성 클론으로부터 생산된다. 세포들이 원심분리에 의하여 배양되고, 인덕션 매개체(BMMY)내에서 리서스펜드되고, 6 내지 12일 동안 추가적으로 배양되고, 매 24시간마다 0.5%의 마지막 농도에게 절대 메탄올(absolute)이 첨가된다. 배양 알리쿼츠가 수집되고 분석이 필요할때까지 -20℃에서 저장된다.
vi) Ni-NTA 친화 레진을 이용한 발현된 단백질의 정제
태그된 단백질은 Ni-NTA 아가로스(Qiagen Inc., catalog #30210)을 사용하여 정제된다. NTA 마그네틱 아가로스 비어즈(beads) 상에서 이동성을 가지지 않은 니겔 이온은 폴리히스티딘을 위한 높은 친화성을 가진다. E.coli 및 P.pastoris 내부에서 bEGF 서열을 클로닝하기 위해 사용된 벡터는 6 연속적인 히스티딘 레지듀(6 consecutive histidine residues)(6X 태그)를 위하여 제조합 단백질(E.coli 벡터를 위한 N-터미너스에서)의 카르복시 터미너스에서 인코드한다. Ni-NTA 레진의 3밀리리터 알리쿼트(에탄올에서 50% 슬러리)가 5 볼륨(15ml)의 세포 리시스 버퍼(50mM NaH2PO450mM, pH 8.0내에서 300 mM NaCl 및 10mM 이미다졸)를 이용하여 4번 세척된다. 레진은 3 ml의 세포 리시스 버퍼 및 pH가 8.0으로 조정된 0.2M NaOH 내에서 리서스펜드된다. 정제된 단백질인 1ml의 서스펜드된 E.coli 또는 P.pastoris 세포를 세척된 100마이크로리터 레진과 혼합하는 것에 의하여 얻어진다. 샘플들은 온건환 혼합으로 4℃에서 30분동안 배양되고, 그리고 그 다음 단계로 500 마이크로리터의 워시 버퍼(50mM NaH2PO450mM, pH 8.0내에서 300mM NaCl 및 20 mM 이미다졸)를 이용하여 두번 세척된다. 정제된 단백질은 일루션 버퍼( 50mM NaH2PO450mM, pH 8.0내에서 300mM NaCl, 250 mM 이미다졸)를 이용하여 슬러리로부터 일루트된다. E.coli 또는 P.pastoris 내에서 생산된 bEGF로부터 그의 태그가 팩터 Xa(뉴잉글랜드 바이오랩 카달로그 넘버P8010S)를 이용하여 쪼개짐에 의하여 제거되고 bEGF 단백질은 다시 Ni-NTA 친화 레진(단지 그의 태그만이 레진을 결합할 것이다)을 이용하여 크리닝된다. 재조합 단백질의 생물학적 활성이 그 이후에 세포 증식/DNA 합성 에세이 내에서 시험된다.
실시예 7 - 세포 증식/DNA 합성 에세이(assay)
보바인 피브로블라스트가 스켈리탈 근육 연결 조직으로부터 분리되고, 1ml의 MEM(라이프 테크날로지, 카탈로그 넘버 #23700) 내에서 필요한 컨플루언스의 수준까지 24-웰 플레이트 내에서 성장되고 상기 물질은 10%의 말 혈청(serum)(HyClone 래브러토리, Inc., 1725 S. Hyclone 로드, 로간, UT 84321, USA, 카탈로그 넘버 SH30074.03) 및 소디움 바이카보네이트를 포함한다. 재조합 bEGF 또는 bEGF를 포함하는 단백질 부분이 매개체에게 첨가되고 세포는 39℃에서 18시간 동안 배양된다. 재조합 인간 EGF(시그마, 3050 스프루스 스트리트, St-Louis, MO, USA, 카탈로그 넘버 #E9644)가 양성 제어(a positive control)로서 사용되고 음성 제어로서는 첨가가 없었다. 1 마이크로 Ci/ml의 트리티아티드된 티미딘(Amersham Pharmacia Biotech, 카탈로그 번호 #TRA310-250 마이크로Ci)가 각각의 웰에게 첨가되고 39℃에서 다시 18시간동안 배양되엇다. 매개체를 제거한 후에, 상기 세포는 200마이크로리터 PBS를 이용하여 두번 세척되고 그 다음 단계로 39℃에서 약 30분동안 200마이크로리터의 볼륨 내에서 0.1% 트립신으로 분리되었다. 피페트 팁(pipette tips)의 안쪽 및 바깥 통로(passage)에 의하여 세포를 방해한 후에(disrupting), 125 마리크로 리터가 헤마시토미터를 이용하여 세포를 카운트하기 위하여 나머지로부터 분리되고, 375 마이크로리터의 차가운 20% TCA가 20분동안 침전되었다. 세포는 그 다음 단계로 1.5ml의 원심분리 튜브로 이동되고 각각의 웰은 적당한 튜브에게 첨가된 200마이크로리터의 PBS를 이용하여 세척되었다. 상기 튜브는 14000rpm으로 20분동안 원심분리되었고, 슈퍼너턴트(supernatant)가 신틸레이션 바이얼(vial)로 이동되었다. 펠레트(pellet)가 200마이크로 리터의 10% TCA로 세척되고 다시 원심분리되었다. 상기 슈퍼너턴트가 동일한 신틸레이션 바이얼로 이동되고, 이러하여 세포로부터 얻어지고 그러나 DNA 내부로 결합되지 않은 표시된 티미딘을 포함한다. 펠레트는 10분동안 1N의 NaOH 40마이크로리터를 이용하여 용해되고 75 마이크로 리터의 1N NaOH를 포함한느 실틸레이션 바이얼로 이동된다. 실틸런터(scintillant)가 신틸레이션 카운터(Beckman Coulter Inc., 4300 N. Harbor Boulevard, P.O. Box 3100, Fullerton, CA 92834, USA, 모텔 넘버#LS 6001C) 내에서 1min/sample 동안 카운트 되는 모든 바이얼에 첨가된다.
참고문헌
본 발명은 소 EGF는 성장촉진, 장내감염예방 또는 치료, 장세포의 조기성숙촉진 및 적절한 스펙트럼의 분해효소의 분비 촉진, 및 영향흡수증가를 위한 가축동물사료 내의 보충물로서 가축 및 낙농분야에서 활용도를 보인다.
SEQUENCE LISTING
<110> Her Majesty the Queen in Right of Canada as Represented by the
Minister of Agriculture and Agri-Food
<120> Nucleic acid and protein sequences of bovine epidermal growth
factor
<130> 24012WO0
<140> not yet assigned
<141> not yet assigned
<150> United States Provisional Patent Application No. 60/292,136
<151> 05/18/2001
<160> 23
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> degenerate
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, t, or g
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a, c, t, or g
<400> 1
gacacntgya caaatacnga ggg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> degenerate
<400> 2
gaygggtact gcctccaygr tgg 23
<210> 3
<211> 1456
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> exon
<222> (2)..(56)
<223>
<220>
<221> Intron
<222> (57)..(1376)
<223>
<220>
<221> exon
<222> (1377)..(1456)
<223>
<400> 3
a aac cac act tgc acg tgt gct ggc gac ttg tct gag cct gga cag att 49
Asn His Thr Cys Thr Cys Ala Gly Asp Leu Ser Glu Pro Gly Gln Ile
1 5 10 15
tgc cct g gtaggttggt gggtggtttg gatccaaggg gagggacttg attcccaaaa 106
Cys Pro
aatctctact taagtgtgtt ttcattagag cttcaagaaa tcatttggtt caatcaggct 166
ggtgagtttc ctctcctgat tagattgatg ataaggtcga gaatgaaatg gtccaagttt 226
tcttaattta atagcatctg gaataaatcc ttttttatta ttcacaatgc aatataggtg 286
agaacacagg tggttctctt taactattca gttaatgtcc tgatttgtaa tgttgatttk 346
gggggccgct gggagaactt ggcagggcta gacaggttgg ggaggatgtc tggtctgctg 406
gcattttgaa tcactttcaa ggattttaaa gtattacttt aaaaagtcag tatttcttga 466
gctgaatgag aactttttaa attgttaatt atacccattt ctgcttcctg aaacctcccc 526
ctgcaaaagc agtatcttct caccatcagc actccagaat ggggaggggt ggtcagaggg 586
tggcgggggg ttggcttcaa agacaccaga agccagaatc agcttagtca ctgacagcca 646
tttacccatc tcagccctgc aagcagaaaa catcctgaaa aaggaaaatt cggcacttgt 706
ttggggctct ggtttttcag tatattattt tctcaaataa tttgctcttc ttagaggtat 766
tgaaaaactc ctaatactta tgtagtcagc tacacaccct aatgtttttc ttttaaagag 826
cagcgaacca ttaataaaaa gggacttttc cacttgggca tcccctctgt tatggtaaca 886
tttcctctct gtcaaagttg ctagtcctgt ctttgagggc tcccctgaaa gttaaatgcg 946
tttagaagca agtatcctgt gggataaaat tttgagactc cagggaactg ggggtaattg 1006
actggatagt ggtgggtggt tacaagccat gaagagagac ggttgttcag tgagaccctc 1066
ttaagctaac tgttgtttta catggtgtgt ttttatagat gacagatggc ttttataaga 1126
gatctgtact cagggttcat atggtcttag gattgaccat tctcttactt gcctccaata 1186
tactttatgt caaatagtgc tgaacctcaa gcaaaatggg tgactccata gcaaattcat 1246
aaggtctggt taagaaagtg aaattattgt tccatatgac aaattgttca cagaaactag 1306
ttcctgatgt tgatatctga aagactccag tcacttcaga aagtaaaaga aatgcctttg 1366
attcttctag ac tct act ctg ctg tct cac ctt ggg aag aat gga cac 1414
Asp Ser Thr Leu Leu Ser His Leu Gly Lys Asn Gly His
20 25 30
aat ttt ttg aaa aaa tgt ttc cct gaa tat acc ccg aat ttt 1456
Asn Phe Leu Lys Lys Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Asn Phe
35 40 45
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> bos taurus
<400> 4
gaccattctc ttacttgcct c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 5
agagggtctc actgaacaac c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 6
tgtctcacct tgggaagaat gg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 7
ccgctgggag aacttggcag 20
<210> 8
<211> 7387
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> Intron
<222> (1)..(485)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (486)..(609)
<223>
<220>
<221> Intron
<222> (610)..(1930)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1931)..(2075)
<223>
<220>
<221> Intron
<222> (2076)..(7227)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (7228)..(7387)
<223>
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1981)..()
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..()
<223> TGN is Xaa, Xaa is probably selenocysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..()
<223> N is a, Xaa is probably selenocysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7228)..()
<223> mature protein ends at residue 7228
<400> 8
cagcgatgga aaattaaaga aggaaggacc taaaggttat ggtggtgata ctaagaaaag 60
aaaaagatgg gtagttggga aagaaagaga tgatttcatt tatatctgtg ttaaaagggc 120
aaaatgtttt atttaatagg atctgaactt ctaaatgttt acctagagat agttwaccat 180
ctccaacttt cccacggagc tatttgtgct gggaagtttc ctttccttcc aagcagtagg 240
gaagcttcca gcctgacatc aggagtttac ctgcatgggt atgcacccca gggacccagt 300
tcatctctct ttccaacatg gataatagaa tttttgaatc taaaaatgta cagagctctg 360
agaacatgta tcatgacaca aattgaagat gcttcttttc cagaatattg ggtttttcaa 420
ttactatatg agcctctgat ctcctctgca cctcactttt ctctttccta ctcctttttc 480
ctgga gat att gat gag tgc cga cgg ggc gtg cac agc tgt ggg gaa aat 530
Asp Ile Asp Glu Cys Arg Arg Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn
-55 -50 -45
gcc acc tgn aca aat atg gag gga aac cac act tgc acg tgt gct ggc 578
Ala Thr Xaa Thr Asn Met Glu Gly Asn His Thr Cys Thr Cys Ala Gly
-40 -35 -30
gac ttg tct gag cct gga cag att tgc cct g gtaggttggt gggtggtttg 629
Asp Leu Ser Glu Pro Gly Gln Ile Cys Pro
-25 -20
gatccaaggg gagggacttg attcccaaaa aatctctact taagtgtgtt ttcattagag 689
cttcaagaaa tcatttggtt caatcaggct ggtgagtttc ctctcctgat tagattgatg 749
ataaggtcga gaatgaaatg gtccaagttt tcttaattta atagcatctg gaataaatcc 809
ttttttatta ttcacaatgc aatataggtg agaacacagg tggttctctt taactattca 869
gttaatgtcc tgatttgtaa tgttgatttk gggggccgct gggagaactt ggcagggcta 929
gacaggttgg ggaggatgtc tggtctgctg gcattttgaa tcactttcaa ggattttaaa 989
gtattacttt aaaaagtcag tatttcttga gctgaatgag aactttttaa attgttaatt 1049
atacccattt ctgcttcctg aaacctcccc ctgcaaaagc agtatcttct caccatcagc 1109
actccagaat ggggaggggt ggtcagaggg tggcgggggg ttggcttcaa agacaccaga 1169
agccagaatc agcttagtca ctgacagcca tttacccatc tcagccctgc aagcagaaaa 1229
catcctgaaa aaggaaaatt cggcacttgt ttggggctct ggtttttcag tatattattt 1289
tctcaaataa tttgctcttc ttagaggtat tgaaaaactc ctaatactta tgtagtcagc 1349
tacacaccct aatgtttttc ttttaaagag cagcgaacca ttaataaaaa gggacttttc 1409
cacttgggca tcccctctgt tatggtaaca tttcctctct gtcaaagttg ctagtcctgt 1469
ctttgagggc tcccctgaaa gttaaatgcg tttagaagca agtatcctgt gggataaaat 1529
tttgagactc cagggaactg ggggtaattg actggatagt ggtgggtggt tacaagccat 1589
gaagagagac ggttgttcag tgagaccctc ttaagctaac tgttgtttta catggtgtgt 1649
ttttatagat gacagatggc ttttataaga gatctgtact cagggttcat atggtcttag 1709
gattgaccat tctcttactt gcctccaata tactttatgt caaatagtgc tgaacctcaa 1769
gcaaaatggg tgactccata gcaaattcca taaggtctgg ttaagaaagt gaaattattg 1829
ttccatatga caaattgttc acagaaacta gttcctgatg ttgatatctg aaagactcca 1889
gtcacttcag aaagtaaaag aaatgccttt gattcttcta g ac tct act ctg ctg 1944
Asp Ser Thr Leu Leu
-15
tct cac ctt ggg aag aat gga cac aat ttt ttg aaa aaa tgt ttc cct 1992
Ser His Leu Gly Lys Asn Gly His Asn Phe Leu Lys Lys Cys Phe Pro
-10 -5 -1 1
gaa tat acc ccg aat ttt gaa ggg tac tgc ctc aat ggt cgt gtc tgt 2040
Glu Tyr Thr Pro Asn Phe Glu Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Arg Val Cys
5 10 15 20
ata tat ttt ggc att gcc aac ctg ttc tcc tgc ca gtaagtcaaa 2085
Ile Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Leu Phe Ser Cys His
25 30
ctatttttct gtagagatat gatattgcag cccataagtt ttagtgaatt caaaaaattt 2145
atattgagat ttttctataa ttaaactttt ccatagtgaa aaatatatgt aatttatata 2205
tgtaaatctg ggcttcccac atggtgcagc aataaagaat ctgcctgccc gtgcaggaga 2265
ggcaggaaac tcggattccg tgcctgggtc agggaagagc ctctggagga ggaagtasca 2325
acccattcca gtattctttc ctggaggtgg agagaggagc ctagtgggct tacagtccat 2385
ggggtcgcag agtctgacat gactgagcac acacacacac gtaaatctgt tatttacata 2445
tatatatata tatatatata tataaaatgt gtgtattaca ctctttctga atatttcaca 2505
cacaccccag gtgtcagtgg caaatatgaa atttaaggaa ttgggtgatt tcccctctga 2565
cttaaataac ttgctgttac tactggtaca gtctgggaag taaactgaga gaatttctta 2625
aaacttctat tttatgccaa atagatgggg agcatcagtg ctgcgtttct aaattttaaa 2685
aagtgttaca tacagtcaca ctgggcctcc atttttctcc ctgtacatcc taatagttgg 2745
cgtttgcatt tttgttgtta acaactgata aatgcagcca cggctgcctt tgytctgcct 2805
tggtcaccgt gatggctttg gtgggttatg tgtcagcctg ctcccaccat actccctcaa 2865
aaccgtgccc ctcagtcttt agtaaaacca cacccagaag atctagttct gtatcaaatc 2925
ttacttttag taactttcat aatctgaagg caatctgagg gaatggatag atactgaaaa 2985
ataaataggt ctcttctggc yggcctcctg actcagtgat aattttctct gtgcctaatg 3045
atggagtgag agagtacgtt gatcctcata agtaggtgct ataagcttaa aagctttgat 3105
tattaatcat aattagtaga aacatagtct aaattactag aataaattat attctgtgat 3165
gaagactatg gccttgcatt agaaatcaca tcatcctgac aaaaatagtg ggaaatgttt 3225
gtaaatatta gaaaaaataa ctcagtccta atagaaatct gttttcatat tcatatttca 3285
tgccatggtt ttctaaccta agataaattt agtacttgat gataatcatt gttgattttg 3345
ataataagga tcaaattgtt ttcatctgtt catggctttt tattattccc agtaatgaaa 3405
ttatgaaaac aagtatccta gcaatggttt atgtttctct ctgacacttt aacttcggat 3465
tattaaaggc attataagaa gaagaagggt actgcagagt tatgtattgt agttagcaca 3525
tcaatttcac ttggaactga tagcaccaat cattaaatgt cttgtgaaca ctctttagca 3585
cactgctttc gtttctgtca ttaaaaccca atgaaaatat catattcctc taataatatt 3645
ttaaatatga gttgctacaa aatgacaatt aaactggatc taacacttaa atttaagcac 3705
ctttaatggc accccactcc agtactctta cccggaaaat cccatgcaca gaggagcctg 3765
gtagactgaa atccatgggg tcacaaagag tcagacatga ctgagcgact tcactttcac 3825
ttttcacttt catgcattgg aggaggaaat ggcaacccac tccagtgttc ctgcctggag 3885
aatcccaggg acgggggagc ctggtgggct gccgtctatg gggttgcaca gagtcggacr 3945
cgactgaagc gacttagcag cagcagcagc agcaatcaaa agcaatattt aaaatatcac 4005
ctgagttctc attaatctgg atcataattt gtttttgaat tctatatcta ataaaaacat 4065
ggatttgtca gatatccaac ccttccatgc cccagtgacc tcaccttgta tttttttaat 4125
tccataaaaa gaaaacatct ctagggagtg cttctcagtc caacggttat tagaaacatc 4185
tcacaggcat cattctgcac atgtatacat gagtgctaag ttacttcagt catgttcaac 4245
tctgtgcgac cctgtggacc aygcccacca agctcctctg tccatgggat tcttcaagca 4305
agaatactag agtggttgca tgccttcctc caggggatct tcccaaycca gggactgaac 4365
ccaggtcgtc tgcatctcct gcattggcag gtgggttctc taccactagc gccacctggg 4425
aagcccagag actgttcacg atgttgtgag caggttagta aaggaacttt cttccttcct 4485
tgcttggagg caatggaagc tcccctccca gatgtaggaa atcccagctg ccctggggat 4545
gcagaggata tgagaaccgg aagtctctac accacaggcc tcctcagagg gcccctgctc 4605
gggggttctc agaggattcc aaacctcttg agcacagaag aggtcctcat ttattctggt 4665
ttggctctga accaacccac agcctctagg gcaggtcttc ttcagcccaa gttgcccaaa 4725
ctatggtgct gtgaaatgtt tcatgagaaa aggatcatgt ggcacagttt aagaaatgct 4785
gcttacgcta gccttcaatt cttgattcat ggtcaccaca acgtgtgaaa aagtcttgtt 4845
gacctttgtt tagtccagaa cttgaaattg tttgaccatg gaaccaagct tattcggcta 4905
ggaaactttc tgtttaatgt aggagaagaa ttaatcaaaa cccaaaaaat tagtgatgtg 4965
tggcctgccc ttgtgaaatg ctggctgatt gctctgggcc ttataaggct gaaaggcttt 5025
gatatcgcag cctgcttaac tctccagact cttatcatgt gcttgactta ttacttgaga 5085
ctttatgatc tctgagagga tcggaggtgt ggcctgttaa tatccaccag tttaaaaatg 5145
gctgctaggt gttaataatg gatgtgtata accaatgggt tgttgttaaa acatgtgttg 5205
ttgttaaatg gatgtgttaa aacagcatca gcaaagccag gaataactgg atggtcctcc 5265
atggtgctat actcagatcg tgcatgctct tgcagagtca gaacagtttt tcagaggtgc 5325
atggaactga aaactctttt tggatgtggc ccaacgtagt agaaagaata cagactttga 5385
aatcagagaa ccatttgaat caaaactacc attcactagg cgtgtgacct ggtacaaatt 5445
atgtaactcc tttgcatctc actttcctca tctataaaat ggaaatctac cattgagaac 5505
aaaacaaaag tgcccagcgt tcagctgctg agtcatgtct gactctttgc aaccccgtgg 5565
attgtagcat gccaggcccc cctgtcctac actatctcct ggagtttgct cagattcatg 5625
tcccttgagt cggtgatgct atctaactat cccagtatca gaaacataat gtgtatagca 5685
aacgctggtt tctttccctt ctgtctctga aagtgacttg ccaaaagctc ctatgactaa 5745
ctcaaggtac aactaggact agacttgaga tctcttctgg ggcttgatcc atgcaggaga 5805
tgcatgattc atctaaagct tgtcccttgc tgcctcttcc catcatgggg actgatgtcc 5865
attctctgtg tattcatacc ttcatctcct tctggaataa agtgggggca tgggtatata 5925
gttagtggat ccagggccaa ggggaagaaa ttcctaacaa gtgagcatca caaaatgctt 5985
agtagactat ttctaaagtt tatgctcttt caaagaataa ttaattctac tcaagatcct 6045
gagaggctct ggaagcatgc attcccagta gatggcagca tggtttcatt tactttcaca 6105
caaaagttca cagcctgtgt tggttgctaa tagtgttagt cactccgtcc catcttgtgt 6165
cttggacttc ttgagacccc atggactgta gcccaccagg cttctctgtc catgggattc 6225
cccaggcaag aatactggag taggtagcca ttcccttctt caacgtgtat cttcccaacc 6285
cagggatcga acccaggtct ccattacagg cagatacttt atctacatat ctaagccacc 6345
agggaggccc catatgaaca acaataattc cagtaacagt ttcaccaatg aacagcggga 6405
tgttggtgaa tgccgctttt ccctccactt agtttttctc tcttgaagaa agtaagtgtg 6465
tgcttattgt taccactgag accttttgga tctatgacct ttaagaaaaa agtaagaaaa 6525
atggtttcct ctgcttcctg ttcagaggct actcacattc ttttataacc tggtctcaag 6585
taaaagactc tgctttcaaa ttcttccttc ctttgactta tattgattgc aatctggcca 6645
aacatttgtt tgtaaactcc ctttgctcct agggcagggt tgctttgtgt tggtcttaga 6705
gagaggcagt tcttctttta acagaaattg attcttaatc agtgttctgc agtgccttat 6765
agaggtggta tgcaaataac cctgaatcaa tccctgggct cagtcatgtc agactaagtt 6825
tatgctgcag taacttgtag atcagagtgc tttcaacttg acccgtttgg cttcctgggg 6885
tgtcagcggt aaagagactt gcctgccagt acaggagaca cggttcgatc cttgggtcgg 6945
gcagatccct tgaagaaaga aatggccaac ccattccagt attttcttgc ctggaaaatc 7005
ccatggacag aggagcctgg tgggctacag tccatggggt tgcaagagtg ggacacagct 7065
gagtgactga acaacagcag caactgagcc ctgatggatt ttccatattc ttcacaaagt 7125
atgaggctga agtgtagagg ctgagagatg actggctagt acaagaatgt aagtgtttct 7185
ggccatggct cactgctgac ttctgtctgt gtgttgccgc ag c tgt ccc att ggc 7240
Cys Pro Ile Gly
35
tac cct ggg aag cga ggt gag tac ata gac ttc gat ggg tgg gat ccg 7288
Tyr Pro Gly Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Asp Phe Asp Gly Trp Asp Pro
40 45 50
cac agt gca ggc cgt ggg cat cag tgg aac acc agc ccg gtg gct gtc 7336
His Ser Ala Gly Arg Gly His Gln Trp Asn Thr Ser Pro Val Ala Val
55 60 65
cgt gcg ctg gtg ctg gct ttc ctg ctg ctc ctc ggg ctg tgc aga gct 7384
Arg Ala Leu Val Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Arg Ala
70 75 80
cac 7387
His
85
<210> 9
<211> 143
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<221> misc_feature
<222> (-41)..(-41)
<223> The 'Xaa' at location -41 stands for a stop codon, Trp, or Cys.
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..()
<223> TGN is Xaa, Xaa is probably selenocysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (537)..()
<223> N is a, Xaa is probably selenocysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7228)..()
<223> mature protein ends at residue 7228
<400> 9
Asp Ile Asp Glu Cys Arg Arg Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn Ala
-55 -50 -45
Thr Xaa Thr Asn Met Glu Gly Asn His Thr Cys Thr Cys Ala Gly Asp
-40 -35 -30
Leu Ser Glu Pro Gly Gln Ile Cys Pro Asp Ser Thr Leu Leu Ser His
-25 -20 -15
Leu Gly Lys Asn Gly His Asn Phe Leu Lys Lys Cys Phe Pro Glu Tyr
-10 -5 -1 1 5
Thr Pro Asn Phe Glu Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Arg Val Cys Ile Tyr
10 15 20
Phe Gly Ile Ala Asn Leu Phe Ser Cys His Cys Pro Ile Gly Tyr Pro
25 30 35
Gly Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Asp Phe Asp Gly Trp Asp Pro His Ser
40 45 50
Ala Gly Arg Gly His Gln Trp Asn Thr Ser Pro Val Ala Val Arg Ala
55 60 65 70
Leu Val Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Gly Leu Cys Arg Ala His
75 80 85
<210> 10
<211> 159
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> mat_peptide
<222> (1)..()
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(159)
<223>
<400> 10
aaa tgt ttc cct gaa tat acc ccg aat ttt gaa ggg tac tgc ctc aat 48
Lys Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Asn Phe Glu Gly Tyr Cys Leu Asn
1 5 10 15
ggt cgt gtc tgt ata tat ttt ggc att gcc aac ctg ttc tcc tgc cac 96
Gly Arg Val Cys Ile Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Leu Phe Ser Cys His
20 25 30
tgt ccc att ggc tac cct ggg aag cga ggt gag tac ata gac ttc gat 144
Cys Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Asp Phe Asp
35 40 45
ggg tgg gat ccg cac 159
Gly Trp Asp Pro His
50
<210> 11
<211> 53
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 11
Lys Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Asn Phe Glu Gly Tyr Cys Leu Asn
1 5 10 15
Gly Arg Val Cys Ile Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Leu Phe Ser Cys His
20 25 30
Cys Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Gly Glu Tyr Ile Asp Phe Asp
35 40 45
Gly Trp Asp Pro His
50
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 12
tggcaggaga acaggttgg 19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 13
ctgtcccatt ggctaccc 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 14
gagctctgca cagcccga 18
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 15
gccaacctgt tctcctgcca ctgtcccatt ggcta 35
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 16
gacggggcgt gcacagc 17
<210> 17
<211> 408
<212> DNA
<213> Bos taurus
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is A, tga probably codes for selenocysteine
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(408)
<223>
<220>
<221> mat_peptide
<222> (157)..()
<223>
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..()
<223> Mature peptide ends at position 331
<400> 17
cgg ggc gtg cac agc tgt ggg gaa aat gcc acc tgn aca aat atg gag 48
Arg Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn Ala Thr Xaa Thr Asn Met Glu
-50 -45 -40
gga aac cac act tgc acg tgt gct ggc gac ttg tct gag cct gga cag 96
Gly Asn His Thr Cys Thr Cys Ala Gly Asp Leu Ser Glu Pro Gly Gln
-35 -30 -25
att tgc cct gac tct act ctg ctg tct cac ctt ggg aag aat gga cac 144
Ile Cys Pro Asp Ser Thr Leu Leu Ser His Leu Gly Lys Asn Gly His
-20 -15 -10 -5
aat ttt ttg aaa aaa tgt ttc cct gaa tat acc ccg aat ttt gaa ggg 192
Asn Phe Leu Lys Lys Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Asn Phe Glu Gly
-1 1 5 10
tac tgc ctc aat ggt cag gtc tgt ata tat ttt ggc att gcc aac ctg 240
Tyr Cys Leu Asn Gly Gln Val Cys Ile Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Leu
15 20 25
ttc tcc tgc caa tgt ccc att ggc tac cct ggg aag cga ggt gag tac 288
Phe Ser Cys Gln Cys Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Gly Glu Tyr
30 35 40
ata gac ttc gat ggg tgg gat ccg cac agt gca ggc cgt ggg cat cag 336
Ile Asp Phe Asp Gly Trp Asp Pro His Ser Ala Gly Arg Gly His Gln
45 50 55 60
tgg aac acc agc ccg gtg gct gtc cgt gcg ctg gtg ctg gct ttc ctg 384
Trp Asn Thr Ser Pro Val Ala Val Arg Ala Leu Val Leu Ala Phe Leu
65 70 75
ctg ctc ctc ggg ctg tgc aga gct 408
Leu Leu Leu Gly Leu Cys Arg Ala
80
<210> 18
<211> 136
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<221> misc_feature
<222> (-41)..(-41)
<223> The 'Xaa' at location -41 stands for a stop codon, Trp, or Cys.
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> n is A, tga probably codes for selenocysteine
<220>
<221> misc_feature
<222> (331)..()
<223> Mature peptide ends at position 331
<400> 18
Arg Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn Ala Thr Xaa Thr Asn Met Glu
-50 -45 -40
Gly Asn His Thr Cys Thr Cys Ala Gly Asp Leu Ser Glu Pro Gly Gln
-35 -30 -25
Ile Cys Pro Asp Ser Thr Leu Leu Ser His Leu Gly Lys Asn Gly His
-20 -15 -10 -5
Asn Phe Leu Lys Lys Cys Phe Pro Glu Tyr Thr Pro Asn Phe Glu Gly
-1 1 5 10
Tyr Cys Leu Asn Gly Gln Val Cys Ile Tyr Phe Gly Ile Ala Asn Leu
15 20 25
Phe Ser Cys Gln Cys Pro Ile Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Gly Glu Tyr
30 35 40
Ile Asp Phe Asp Gly Trp Asp Pro His Ser Ala Gly Arg Gly His Gln
45 50 55 60
Trp Asn Thr Ser Pro Val Ala Val Arg Ala Leu Val Leu Ala Phe Leu
65 70 75
Leu Leu Leu Gly Leu Cys Arg Ala
80
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 19
ggcatgcata gaaggaagaa aatgtttccc tgaatatacc ccg 43
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 20
caagcttagt gcggatccca cccatcg 27
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 21
gctcgagaaa agaaaatgtt tccctgaata taccccg 37
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 22
gctcgaggcc gccatggcca aatgtttccc tgaatatacc ccg 43
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 23
cctctagatt tcgcccttct atgtgcggat cccacccatc gaagtc 46
<210> 24
<211> 435
<212> DNA
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<304> 303
<306> 722-725
<307> 1983
<308> GenBank Accession No. J00380
<313> Relevant residues FROM 3108 TO 3539
<400> 24
gatattgacg agtgccagcg gggggcgcac aactgcgctg agaatgccgc ctgcaccaac 60
acggagggag gctacaactg cacctgcgca ggccgcccat cctcgcccgg acggagttgc 120
cctgactcta ccgcaccctc tctccttggg gaagatggcc accatttgga ccgaaatagt 180
tatccaggat gcccatcctc atatgatgga tactgcctca atggtggcgt gtgcatgcat 240
attgaatcac tggacagcta cacatgcaac tgtgttattg gctattctgg ggatcgatgt 300
cagactcgag acctacgatg gtgggagctg cgtcatgctg gctacgggca gaagcatgac 360
atcatggtgg tggctgtctg catggtgtca ctggtcctgc tgctcctctt ggggatgtgg 420
gggacttact actac 435
<210> 25
<211> 435
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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<307> 2001
<308> GenBank Accession No. AF336151
<313> Relevant residues FROM 3172 TO 3606
<400> 25
gatattgatg agtgccaact aggtgtgcac acctgtgggg aaaatgccac ctgtacaaat 60
acggagggaa actacacctg cacatgtgct ggccgcccct ctgaacccgg acggatttgc 120
cctgacccta ctccaccctc tcacctcggg gaggatggcc gctattctgt gagaaatagt 180
tactctgaat gcccgccgtc ccacgacggg tactgcctcc acggtggtgt gtgtatgtat 240
attgaagccg tcgacagcta tgcctgcaac tgtgtttttg gctacgttgg cgagcgatgt 300
cagcacagag acttgaaatg gtgggagctg cgccacgctg gcctcgggcg acagtggaac 360
gtcacggtgg tggccgtctg cgtggtggtg ctggtcctgc tgctgctcct ggggctgtgg 420
ggggctcact actac 435
<210> 26
<211> 438
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<301> Bell, G.I., Fong, N.M., Stempien, M.M., Wormsted, M.A.,
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<304> 14
<305> 21
<306> 8427-8446
<307> 1986
<308> GenBank Accession No. X04571
<313> Relevant residues FROM 3170 TO 3607
<400> 26
gatattgatg agtgccaact gggggtgcac agctgtggag agaatgccag ctgcacaaat 60
acagagggag gctatacctg catgtgtgct ggacgcctgt ctgaaccagg actgatttgc 120
cctgactcta ctccaccccc tcacctcagg gaagatgacc accactattc cgtaagaaat 180
agtgactctg aatgtcccct gtcccacgat gggtactgcc tccatgatgg tgtgtgcatg 240
tatattgaag cattggacaa gtatgcatgc aactgtgttg ttggctacat cggggagcga 300
tgtcagtacc gagacctgaa gtggtgggaa ctgcgccacg ctggccacgg gcagcagcag 360
aaggtcatcg tggtggctgt ctgcgtggtg gtgcttgtca tgctgctcct cctgagcctg 420
tggggggccc actactac 438
<210> 27
<211> 159
<212> DNA
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<308> GenBank Accession No. J00380
<313> Relevant residues FROM 3282 TO 3440
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aatagttatc caggatgccc atcctcatat gatggatact gcctcaatgg tggcgtgtgc 60
atgcatattg aatcactgga cagctacaca tgcaactgtg ttattggcta ttctggggat 120
cgatgtcaga ctcgagacct acgatggtgg gagctgcgt 159
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<313> Relevant residues FROM 3346 TO 3504
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aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60
atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120
cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159
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aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60
atgtatattg aagcattgga caagtatgca tgcaactgtg ttgttggcta catcggggag 120
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Asp Ile Asp Glu Cys Gln Arg Gly Ala His Asn Cys Ala Glu Asn Ala
1 5 10 15
Ala Cys Thr Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Asn Cys Thr Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Pro Ser Ser Pro Gly Arg Ser Cys Pro Asp Ser Thr Ala Pro Ser Leu
35 40 45
Leu Gly Glu Asp Gly His His Leu Asp Arg Asn Ser Tyr Pro Gly Cys
50 55 60
Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Gly Val Cys Met His
65 70 75 80
Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn Cys Val Ile Gly Tyr Ser
85 90 95
Gly Asp Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu Arg Trp Trp Glu Leu Arg His
100 105 110
Ala Gly Tyr Gly Gln Lys His Asp Ile Met Val Val Ala Val Cys Met
115 120 125
Val Ser Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Met Trp Gly Thr Tyr Tyr
130 135 140
Tyr
145
<210> 31
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<313> Relevant residues FROM 912 TO 1056
<400> 31
Asp Ile Asp Glu Cys Gln Leu Gly Val His Thr Cys Gly Glu Asn Ala
1 5 10 15
Thr Cys Thr Asn Thr Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Thr Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Pro Ser Glu Pro Gly Arg Ile Cys Pro Asp Pro Thr Pro Pro Ser His
35 40 45
Leu Gly Glu Asp Gly Arg Tyr Ser Val Arg Asn Ser Tyr Ser Glu Cys
50 55 60
Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Gly Val Cys Met Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn Cys Val Phe Gly Tyr Val
85 90 95
Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg His
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Arg Gln Trp Asn Val Thr Val Val Ala Val Cys Val
115 120 125
Val Val Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Trp Gly Ala His Tyr
130 135 140
Tyr
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<313> Relevant residues FROM 912 TO 1057
<400> 32
Asp Ile Asp Glu Cys Gln Leu Gly Val His Ser Cys Gly Glu Asn Ala
1 5 10 15
Ser Cys Thr Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Met Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Leu Ser Glu Pro Gly Leu Ile Cys Pro Asp Ser Thr Pro Pro Pro His
35 40 45
Leu Arg Glu Asp Asp His His Tyr Ser Val Arg Asn Ser Asp Ser Glu
50 55 60
Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met
65 70 75 80
Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr
85 90 95
Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg
100 105 110
His Ala Gly His Gly Gln Gln Gln Lys Val Ile Val Val Ala Val Cys
115 120 125
Val Val Val Leu Val Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Trp Gly Ala His
130 135 140
Tyr Tyr
145
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<313> Relevant residues FROM 977 TO 1029
<400> 33
Asn Ser Tyr Pro Gly Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn
20 25 30
Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu Arg
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
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<313> Relevant residues FROM 970 TO 1022
<400> 34
Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys
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<313> Relevant residues FROM 970 TO 1022
<400> 35
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
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Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
Claims (49)
- 소과 동물의 상피 성장인자의 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 핵산.
- 제 1 항에 있어서, 상기에서 암호화된 폴리펩타이드는 하기의 것들도 구성된 그룹으로부터 선택된 염기 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산a)SEQ ID NO: 9:에 표현된 염기서열b)SEQ ID NO: 11:로 표현된 염기서열c)SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산 서열과 최소한 55%이상 상동하는(상동체를 가진)서열을 가진 기능적으로 동등한 아미노산 서열.
- 제 2 항에 있어서, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 60%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제 3 항에 있어서, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 서열과 최소한 65%이상 상동하는 기능적으로 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제 4 항에 있어서, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산 서열과 최소한 70%이상 상동하는 기능적으로 동등한 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 5에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 75%이상 상동하는 기능적을 등가인 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 6에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 80%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 7에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 85%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 8에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 90%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 9에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 95%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 청구항 10에 설명한 분리된 핵산, 상기의 암호화된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 최소한 99%이상 상동하는 기능적을 동등한 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제 1 항에 있어서, 상기의 핵산은 하기의 것들도 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산a) SEQ ID NO: 8로 표현된 뉴클레오티드b) SEQ ID NO: 10으로 표현된 뉴클레오티드 그리고c) SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10으로 표현된 뉴클레오티드와 최소한 75%이상 상동하는 기능적으로 동등한 뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 상기의 핵산은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 표현된 뉴클레오티드서열과 최소한 80%이상 상동하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제13항에 있어서, 상기의 핵산은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 표현된 뉴클레오티드서열과 최소한 85%이상 상동하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제14항에 있어서, 상기의 핵산은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 표현된 뉴클레오티드서열과 최소한 90%이상 상동하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제15항에 있어서, 상기의 핵산은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 표현된 뉴클레오티드서열과 최소한 95%이상 상동하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 제16항에 있어서, 상기의 핵산은 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 10에 표현된 뉴클레오티드서열과 최소한 99%이상 상동하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
- 소과 동물의 상피(표피) 성장 인자의 폴리펩타이드를 암호화하고 있는 분리된 핵산의 조각, 상기의 조각은 SEQ ID NO: 10로 표현된 뉴클레오티드서열과 기능적으로 동등한 뉴클레오티드서열로 구성된다.
- 소과 동물의 상피(표피) 성장 인자의 분리된 폴리펩타이드의 조각, 상기의 조각은 SEQ ID NO: 11로 표현된 아미노산서열과 기능적으로 동등힌 뉴클레오티드서열로 구성된다.
- 적합한 숙주세포에서 소과 동물의 상피 성장인자의 발현을 지시하는 것이 가능한 발현 구조, 상기의 발현 구조는 숙주세포와 양립가능한 조절 서열과 작용적으로 연결된 청구항 1-17중 어느 하나에서 설명된 핵산으로 구성된다.
- 청구항 1-17중 어느하나에서 설명된 핵산으로 구성되는 VECTOR(매개체).
- 세포가 핵산에 의해 암호화된 소과 상피 성장인자의 폴리펩타이드를 발현할수 있도록 성장인자 청구항 1-17의 어느하나에서 설명된 핵산으로 구성된 숙주세포.
- 제 22 항에 있어서, 상기의 세포는 Aspergillus,niger,Aspergillus ficuum,Aspergillus awamori,Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei.Mucor miehei,Kluyverromyces lactic,Pichia pastoris,Saccharomyces cerevisiae,Escherichia coli, Bacillus subtillus,Bacillus licheniformis, 또는 식물 세포로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제23항에 있어서, 상기의 세포는 Escherichia coli인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제23항에 있어서, 상기의 세포는 Pichia pastoris인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 하기의 것들로 구성된 집합으로부터 선택된 조합물을 함유하는 사료 첨가물a) 청구항 1-17중 어느 하나에서 설명된 핵산에의해 암호화된 소과 동물의 상피 성장 인자의 폴리펩타이드b) 청구항 1-17의 어느 하나에서 설명된 핵산에의해 암호화된 소과상피성장인자의 폴리펩타이드, 상기의 폴리펩티이드는 불활성 또는 활성의 성분으로 조합되어있다.c) 미생물 또는 식물 조직, 상기의 미생물 또는 식물 조직은 청구항 1-17중 어느하나에서 설명된 핵산에의해 암호화된 소과 상피 성장인지의 폴리펩타이드를 발현한다.d) 미생물 또는 식물조직으로부터 얻어진 배양매체 또는 추출물, 상기의 배양매체 또는 추출물은 청구항 1-17중 어느하나에서 설명된 핵산에의해 암호화된 소과 상피 성장인지의 폴리펩타이드를 포함한다.
- 제26항에 있어서, 상기의 미생물은 Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei. Mucor miehei, Kluyverromyces lactic, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtillus,Bacillus licheniformis로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료 첨가물.
- 제27항에 있어서, 상기의 미생물은 Escherichia coli인 것을 특징으로 하는 사료 첨가물.
- 제27항에 있어서, 상기의 미생물은 Pichia pastoris인 것을 특징으로 하는 사료 첨가물.
- 소과 동물의 표피 성장인자의 폴리펩티이드로 조합된 사료 또는 청구항 1-11의 어느하나에서 설명된 소과 상피 성장인자의 폴리펩타이드로 처리된 사료로 구성된 사료 합성물(구조).
- 제30항에 있어서, 상기의 소과 상피 성장인자의 폴리펩타이드는분말 또는 액체인 것을 특징으로 하는 사료 합성물.
- 제31항에 있어서, 사료는 옥수수,곡물류,수수류,밀,보리,귀리,식물단백질 분말,풀,건초,grass filage, Maize(신선하게보존된사료)로 구성된 집단으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 사료 합성물.
- 하기의 단계를 포함하는 소과 상피 성장인자를 가진 폴리펩타이드를 생산하는 방법a) 핵산에의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 촉진하는 조건하에서 청구항1-17의 어느하나에서 설명된 핵산을 함유하고 있는 숙주세포의 배양b) 숙주세포 또는 숙주세포로부터 얻은 추출액으로 구성된 배양 매체,숙주세포로부터 암화화된 폴리펩타이드의 회복(복구).
- 제33항에 있어서, 상기의 숙주세포는 Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei. Mucor miehei, Kluyverromyces lactic, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtillus,Bacillus licheniformis 또는 식물세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기의 숙주세포는 Escherichia coli인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기의 숙주세포는 Pichia pastoris인 것을 특징으로 하는 방법.
- 핵산의 식물세포의 게놈안으로 합체되게하기위하여 식물세포 안으로 핵산을 도입하는 것에의한, 청구항 1-17의 어느 하나에서 설명된 핵산을 발현하는 식물을 생산하는 방법
- 청구항 37에서 설명된 방법, 상기의 식물은 canola,콩, 옥수수, 감자로부터 선택된다.
- 동물의 성장을 증진시키기위하여 동물에의 투약을 위한 소과 상피 성장인자를 사용하는 방법
- 청구항 39에서 설명된 사용,상기의 폴리펩타이든 scjdrngkd 1-11중 어느 하나의 폴리펩티드로부터 선택된다.
- 청구항 40에서 설명된 사용방법, 상기의 동물은 돼지,새끼돼지,암소,송아지,어린이,양,새끼양으로부터 선택된다.
- 청구항 41에서 설명된 사용,상기의 동물은 암소 또는송아지이다.
- 동물의 장의 감염을 막거나 치료하기 위한 투여하기위해 소과 상피 성장인지의 폴리펩타이드를 사용하는 방법
- 청구항 43에 설명된 사용방법, 상기의 폴리펩타이드는 청구항 1-11중 어느 하나에서 선택된 폴리펩타이드로부터 선택된다.
- 청구항 44에 설명된 사용방법, 상기의 동물은 돼지,새끼돼지,암소,송아지,어린이,양,새끼양으로부터 선택된다.
- 청구항 45에서 설명된 사용방법,상기의 동물은 암소 또는송아지이다.
- 청구항 45에서 설명된 사용방법,상기의 감염은 가축의 설사,장 감염성의 대장균 감염,giardiasis로부터 선택된다.
- 청구항 47에서 설명된 사용방법,감염성의 대장균 감염은 장의 Colibacillosis이다.
- 청구항 48에서 설명된 사용방법,상기의 동물은 송아지이다.
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