MXPA03010572A

MXPA03010572A - Acido nucleico y secuencias de proteinas del factor de crecimiento epidermico bovino.

Info

Publication number: MXPA03010572A
Application number: MXPA03010572A
Authority: MX
Inventors: F Benkel Bernhard
Original assignee: Minister Agriculture & Food
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2005-03-07
Also published as: US20030059802A1; KR20040089454A; CA2446398A1; WO2002095029A3; NZ529806A; US6967090B2; WO2002095029A2; JP2004536589A; BR0209911A; CN1527879A; EP1395658A2

Abstract

La invencion proporciona una secuencia de nucleotidos de factor de crecimiento epidermal de bovinos (FCEb) y la secuencia deducida de aminoacidos de la proteina codificada. La invencion proporciona ademas la secuencia de nucleotidos de FCEb maduro y la proteina de FCEb madura deducida. La invencion se extiende a los acidos nucleicos homologos, proteinas y fragmentos funcionalmente homologos equivalentes a la secuencia de nucleotidos del gen FCEb y la proteina FCEb, respectivamente. El FCE de bovino se puede expresar en microorganismos tales como E. coli y P. pastoris, y hospedadores de plantas tales como la papa. La actividad del FCEb recombinante se puede confirmar usando un ensayo de sintesis de ADN/proliferacion celular. El FCE de bovino demuestra la utilidad en producciones de ganado y lacteos como un complemento en el alimento para animales de granja para promover el crecimiento; para prevenir o tratar infecciones intestinales, para estimular la maduracion precoz de las celulas intestinales para secretar un espectro apropiado de enzimas digestivas, y para incrementar la absorcion de nutrientes.

Description

SECUENCIAS DE ACIDOS NUCLEICOS Y PROTEINAS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO DE BOVINOS CAMPO DE LA INVENCION La invención está relacionada a secuencias de ácido nucleico y proteína de factor de crecimiento epidérmico de bovinos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION En años recientes, un mercado altamente competitivo tuvo lugar y un ambiente de preocupación promovió a los investigadores a desarrollar tecnologías para mejorar la eficiencia de las producciones de ganado y lechera. Sin embargo, un mayor conocimiento público de asuntos de bienestar animal y de producción de alimentos indica que el mejoramiento adicional en la eficiencia podría ser lograda sin involucrar la salud y el bienestar del animal. Hallazgos recientes en un número de sistemas animales sugieren que el factor de crecimiento epidérmico (FCE) puede ser usado en producciones de ganado y leche como un aditivo de alimentos para estimular la maduración precoz de células intestinales para secretar un espectro apropiado de enzimas digestivas; incremento de absorción de nutrientes; y prevenir o tratar infección intestinal . Derivado de una proteína precursora de alrededor de Ref: 152187 1,200 aminoácidos, el FCE es un polípéptido de 6 kDa compuesto de 53 aminoácidos (Carpenter y Cohén, 1979) . Este está naturalmente presente en saliva, secreciones intestinales, y otros fluidos del cuerpo, y es producida en grandes cantidades en calostro y leche (Donovan y Odie, 1994) . El FCE estimula el crecimiento y maduración del estómago fetal humano. Debido a las altas concentraciones de FCE en el calostro de la mayoría de las especies y la presencia de receptores de FCE dentro del intestino, el FCE (y otros factores de crecimiento) ha sido propuesto para contribuir también para el desarrollo gastrointestinal postnatal temprano (Donovan and Odie, 1994) . El FCE puede ser involucrado en la regulación de captación de nutrientes. En el roedor, el FCE incrementa el transporte de electrolitos, glucosa y prolina a través de las membranas de borde del cepillo del yeyuno. En el lechón, el FCE promueve la maduración de la función de células intestinales por mejoramiento de la actividad de sacarosa y melaza sin ningún efecto marcado en las actividades de lactasa y fosfatasa alcalina (Publicación Internacional No. WO 88/04180 para Wilson y colaboradores). El uso de FCE como un aditivo de alimento para promoción del crecimiento es así ventajoso . La colibacilosis Entérica o diarrea animal es una infección bacterial causada por el patógeno Escherichia coli.

Común en animales de granja jóvenes o recién nacidos, la diarrea animal tiene impacto considerable sobre la economía agrícola. La sobrepoblación de animales jóvenes en áreas confinadas es comúnmente seguida por brotes de diarrea animal, la cual es caracterizada por diarrea, deshidratación y muerte eventual. Los becerros lactantes recibiendo substituto de leche son más susceptibles a la diarrea animal que aquellos alimentados con leche de vaca, con una tasa de morbilidad debida a la infección de hasta 75%. Puesto que se carece actualmente de una vacuna para la diarrea animal, es deseable un tratamiento efectivo como el del FCE. El suplemento con FCE mejora las funciones intestinales de lechones infectados con rotavirus (Zijlstra y colaboradores, 1994) . Además, la administración oral de FCE reduce la velocidad de infecciones entéricas en conejos o previene la reducción en el peso ganado provocado por la infección (Bureo y colaboradores, 1997) . La Patente de EUA No. 5,753,622 para Buret y colaboradores, desglosa los métodos para tratamiento de diarrea animal y otras infecciones patogénicas, y para incremento de peso ganado por administración de FCE oralmente o indirectamente en alimento animal. En la mayoría de estos estudios previos, fue usado el FCE de unas especies diferentes de la receptora; sin embargo, en principio, el FCE de las mismas especies podrían ser preferibles para evitar efectos colaterales indeseables. Para uso en la producción lechera o de ganado de carne de vaca, es preferible usar el FCE bovino (FCEb) . Un aditivo o suplemento del alimento debe ser económico para ser ampliamente adoptado por los productores . Debido a los avances en biología molecular y tecnología de ADN recombinante, grandes cantidades de proteínas externas para investigación, aplicaciones terapéuticas e industriales son producidas eficientemente. La codificación de genes para proteínas deseadas puede ser transferida de organismos imprácticos para producción sobre sistemas de expresión microbial, plantas o animales, con los microbios más comúnmente usados para expresión de proteínas heterólogas debido a su facilidad de manipulación de crecimiento y genética. El FCE humano ha sido expresado en levadura en un nivel de 40 ng/mg de proteína (Patente de EUA No. 5,096,825 para Barr y colaboradores) , mientras que el FCE de ratón ha sido producido por la Pichia Pastoris de levadura en un nivel de 450 g/ml de medio (Clare y colaboradores, 1991) . Complementariamente las secuencias de ADN que codifican la proteína de FCE madura han sido previamente clonadas de ratón, rata, cerdo, caballo y humano. (Gray y colaboradores, 1983; Simpson y colaboradores, 1985; Kim y colaboradores, 2001; Stewart y colaboradores, 1994; Bell y colaboradores, 1986) . Las secuencias de aminoácidos deducidas muestran 55% a 85% de identidad para cada uno del otro, con la conservación notable de los residuos estructurales claves, particularmente tres glicinas (residuos 18, 36 y 39) , seis cisteínas (residuos 6, 14, 20, 31, 33 y 42), y tripsina 37. La variación en otros residuos presumiblemente da cuenta del muy bajo cruce de reactividad entre especies observadas con sondas de ácido nucleico y antisueros. La secuencia de ADNc que codifica la proteína precursora ha sido clonada de humano, cerdo y ratón. Aunque las secuencias de ADNc que codifican la proteína de FCE madura han sido previamente clonadas de varias fuentes como se describió previamente, las secuencias de ADN que codifican la proteína de FCE madura no ha sido obtenida previamente de una fuente bovina. Sin embargo, el FCEb puede beneficiar la producción lechera y de ganado de carne de vaca mediante la promoción del crecimiento; la prevención o tratamiento de infecciones intestinales; incremento de absorción de nutrientes; y aceleración del desarrollo de células intestinales inmaduras. Para tales aplicaciones comerciales potenciales, el uso de FCE de una fuente bovina por sí misma es deseado para evitar efectos colaterales indeseables los cuales pueden involucrar la salud y el bienestar animal. Existe así, una necesidad de obtener secuencias de ADN que codifica la proteína de FCEb madura y para producir FCEb exitosamente en un sistema recombinante . En general, la homología entre las secuencias humana y bovina permite el uso de sondas o cebadores humanos para obtener la secuencia de ADN de FCEb correspondiente. Sin embargo, se encontró que las secuencias para las secuencias de proteína y ADN de FCEb son muy diferentes de aquellas otras especies, lo cual da cuenta de las dificultades iniciales en el intento de clonar la secuencia de ADN de FCEb, y explica por qué esta secuencia todavía no ha sido clonada exitosamente a pesar de las muchas aplicaciones comerciales prometedoras de una invención.

BREVE DESCRIPCION DE IA INVENCION La invención provee las secuencias de ADN que codifican el factor de crecimiento epitelial bovino (FCEb) , y la secuencia de las proteínas codificadas. Una porción de la secuencia de ADN del gen FCEb y la secuencia de aminoácido deducida de la proteína de FCEb codificada están descritas en la SEQ ID NOS: 8 ,y 9, respectivamente. La secuencia de ADN para la proteína de FCEb madura y la secuencia de aminoácido deducida de la proteína de FCEb madura son provistas en la SEQ ID NOS: 10 y 11, respectivamente. Así, la invención provee extensamente un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido para FCEb, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido seleccionado de a) una secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID NO: 9; b) una secuencia de aminoácido descrita en la SEB ID NO: 11; y c) una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente teniendo por lo menos 55%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 65%, más ¦preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% y más preferiblemente por lo menos 99% de homología, a la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID. NO: 9 o a la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID NO: 11. La invención se extiende a fragmentos del polipéptido aislado para factor de crecimiento epidérmico de bovino, caracterizado porque los fragmentos comprenden polipéptidos funcionalmente equivalentes como la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11. En otro aspecto de la invención, hay provisto un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido para FCEb, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido seleccionada de: a) una secuencia de nucleótido descrita en la SEQ ID NO: 8; b) una secuencia de nucleótido descrita en la SEB ID NO: 10; y c) una secuencia de nucleótido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, más preferiblemente por lo menos 95% y más preferiblemente por lo menos 99% de homología a la secuencia de nucleotido descrita en la SEQ ID NO: 8 o a la secuencia de nucleotido descrita en la SEQ ID NO: 10. La invención se extiende a fragmentos de ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos para FCEb, en donde los fragmentos comprenden secuencias de nucleotido funcionalmente equivalentes como la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 10. En otro aspecto amplio, la invención provee vectores y células comprendiendo una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de FCEb, y métodos para producción del polipéptido codificado. La invención se extiende a constructos de expresión que constituyen un ácido nucleico que codifica FCEb operablemente enlazado para controlar las secuencias capaces de dirigir la expresión del FCEb en un hospedador apropiado. La invención además se extiende a células hospedadoras las cuales han sido transformadas con, y expresan ADN que codifica el polipéptido FCEb, y a métodos de producción como células hospedadoras transformadas. La invención además se extiende a anticuerpos monoclonales y policlonales formulados contra el péptido de • FCEb o fragmentos de éste . El polipéptido FCEb o fragmentos funcionalmente equivalentes pueden ser usados en producciones de ganado y leche como un suplemento en alimento animal de granja para promover el crecimiento; para prevenir o tratar infecciones 'intestinales, particularmente infecciones enteropatogénicas E. - coli tales como colibacillosis entérica, giardiasis; y diarrea animal; para incrementar la absorción de nutrientes; y para estimular la maduración precoz de células intestinales para secretar un espectro apropiado de enzimas digestivas. En otro aspecto amplio, la invención provee un método para mejorar el crecimiento de un animal y un método para prevención y tratamiento de infección intestinal de un animal mediante administración del polipéptido FCEb. La invención así provee un aditivo de alimento comprendiendo una preparación seleccionada de: a) un polipéptido para FCEb codificado por un ácido nucleico; b) un polipéptido para FCEb codificado por un ácido nucleico, caracterizado porgue el polipéptido para FCEb está en combinación con ingredientes inertes o activos; c) un microorganismo o un tejido de planta, caracterizado porgue el microorganismo o el tejido de planta expresa un polipéptido para FCEb codificado mediante un ácido nucleico; y d) un medio de cultivo o un extracto obtenido del microorganismo o el tejido de planta, caracterizado porque el medio de cultivo o el extracto contiene un polipéptido para FCEb codificado por un ácido nucleico. En todavía otro aspecto amplio, la invención provee una composición de alimento comprendiendo un complemento alimenticio combinado o tratado con un polipéptido FCEb codificado por un ácido nucleico para FCEb. Como se usó aquí y en las reivindicaciones, los términos y frases presentadas abajo tienen las siguientes definiciones . "Anticuerpos" incluye anticuerpos monoclonal y policlonal . "Bovino" se refiere a especies de la subfamilia Bovina, la cual incluye Bison bison (Bisonte, Búfalo) , Bison bonasus (Bisonte Europeo o VJisent) , Bos frontalis (Gayal) , Bos indicus (Cebú) , Bos taurus (Vaca doméstica) , Boselaphus tragocamelus, Bubalus bubalis (Búfalo de agua) , fíyncerus caffer (búfalo africano, búfalo del Cabo) , Taurotragus derbianus, Taurotragus oryx (antílope africano común) , Tragelaphus angasii (Nyala) , Tragelaphus eurycerus, Tragelaphus imberbis (kudu inferior) , Tragelaphus scriptum (gamo de los arbustos) , Tragelaphus spekii (Sitatunga) , Tragelaphus strepsiceros (Kudu mayor) . "Circularización" significa la alineación de las terminaciones de un ADN linearizado y su unión para formar una molécula circular cerrada covalentemente o "ADN circular" . "Secuencia codificada" significa la parte de un gen que codifica para la secuencia de aminoácido de una proteína, o para un AR funcional tal como un ARNt o ARNr. "Complemento" o "secuencia complementaria" significa una secuencia de nucleótidos que forma un doble hidrógeno enlazado con otra secuencia de nucleótidos de conformidad a las reglas de base-emparej ada de Watson-Crick. Por ejemplo, la secuencia de base complementaria para 5'-AAGGCT-3" es 3'-TTCCGA-5' . "Reacción de cadena de polimerasa convencional" significa una técnica mediante la cual los fragmentos de ADN etiquetados son amplificados en una manera exponencial, caracterizados porque los cebos están diseñados para hibridizar a estándares opuestos de ADN y la extensión procede hacia adentro a través de los dos cebos.. "Degenerado" o "degeneración" significa una propiedad del código genético caracterizado porque más de un codón puede especificar un aminoácido particular. "En la dirección" significa en el lado 3' de cualquier sitio en el ADN o ARN. "Colibacillosis Entérico" significa una infección causada por cepas E. coli enterotoxigénicas (produciendo toxinas) . Las cepas E. coli se adhieren y multiplican en números grandes en la superficie del intestino delgado, y secretan las enterotoxinas que causan severas alteraciones digestivas llevando a diarrea clínica, deshidrat ción y altos niveles de mortalidad. "Enteropatogénico" significa tendiente a producir enfermedad en el tracto intestinal. "Exón" significa el segmento de un gen eucariótico que codifica para un dominio específico de una proteína. "Expresión" significa la transcripción de un gen en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARN mensajero (ARNm) con traducción subsiguiente en una proteína. Una secuencia de aminoácido que es "funcionalmente equivalente" para el FCEb es una secuencia de aminoácido que ha sido modificada por substituciones simples o múltiples, mediante adición y/o eliminación de aminoácidos, o donde uno o más aminoácidos han sido químicamente modificados, pero los cuales nunca conservan la actividad del FCEb. Las secuencias nucleótidas "funcionalmente equivalentes" son aquellas que codifican polipéptidos que tiene substancialmente la misma actividad biológica como FCEb. "Giardiasis" significa una infestación con o enfermedad provocada por un flagelado protozoario (género Giardia) la cual es a menudo caracterizado por diarrea. Dos secuencias de ácido nucleico son "heterólogas" a otra si las secuencias son derivadas de organismos separados, si los organismos son o no de diferentes especies, tanto como las secuencias no ocurran naturalmente juntas en el mismo arreglo en el mismo organismo. Dos polinucleótidos o polipéptidos son "homólogos" o idénticos" si la secuencia de residuos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para correspondencia máxima como se describió aquí . Las comparaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos son generalmente realizadas por comparación de porciones de las dos secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar las regiones locales de secuencia similar. La ventana de comparación es generalmente de alrededor de 20 a alrededor de 200 nucleótidos contiguos o residuos de aminoácido contiguos. El "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de homología de secuencia" para polinucleótidos y polipéptidos puede ser determinado por comparación de dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, caracterizado porque la porción del porción del polinucleótido o secuencia de polipéptido en la ventana de comparación puede incluir adiciones o eliminaciones (esto es, huecos) como se comparó a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) · para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado por: (a) determinación del número de posiciones en las cuales base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones de coincidencia; (b) dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventada ' de comparación; y, (c) multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede ser conducido por implementaciones computarizadas de algoritmos conocidos, o por inspección. Una lista proveyendo fuentes de software comercialmente disponible y libre es encontrada en Ausubel y colaboradores, (1990) . Los algoritmos de alineación de comparación de secuencia y secuencia múltipla fácilmente disponibles son, respectivamente los programas Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul y colaboradores, 1997) y Clustal W. Otros programas apropiados incluyen GAp, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el isconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, WI) . Para mayor certidumbre, como se usó aquí y en las reivindicaciones, el "porcentaje de identidad de secuencia" o porcentaje de homología de secuencia" de secuencias de aminoácido es determinado basado en secuencia óptima alineada determinada de conformidad con los valores dados del programa BLASTP, disponible como se describió arriba.

Como se discutió en mayor detalle aguí después, la homología entre las secuencias nucleótidas también puede ser determinada mediante análisis de hibridización de ADN, caracterizado porque la estabilidad del ADN de doble hebra híbrido es dependiente de la extensión de la base emparejada que ocurra. Las condiciones de alta temperatura y/o bajo contenido de sal reducen la estabilidad del híbrido, y pueden ser variadas para prevenir templanza de las secuencias que tiene menos que un grado seleccionado de homología. "Células hospedadoras" incluyen células hospedadoras de un animal, una planta, una levadura, un hongo, un protozoario y un procariótico. "Infección intestinal" está queriendo incluir, pero no está limitado a, infecciones E. coli enteropatogénicas tales como colibacillosis entérica; giardiasis; y diarrea animal. "Intrón" significa una secuencia interviniendo en un gen. Este es trascrito pero extirpado antes que el ARNm sea traducido . "Reacción en cadena de polimerasa inversa" significa una técnica usada para ampliar las secuencias de ADN conocidas flanqueando una región central de secuencias conocidas, caracterizada porque el ADN es digerido con enzimas de restricción apropiada y circulado, y los cebadores son diseñados para que la extensión proceda hacia fuera y el producto contenga secuencias en dirección ascendente y en la dirección descendente de las secuencias conocidas. "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" del estado natural . Si una composición o sustancia "aislada" ocurre en la naturaleza, esta ha sido cambiada o removida de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente naturalmente en un animal viviente no es "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado", como el término es empleado aqui . "Ganado" esto quiere incluir, por ejemplo, ganado lechero y de carne de res, cerdos, cabras, y ovejas. El término está queriendo incluir animales jóvenes y adultos. Un "polinucleótido" o "ácido nucleico" significa una secuencia linear de deoxirribonucleótidos (en ADN) o ribonucleótidos (en ARN) en la cual el carbón 3' del azúcar de pentosa de un nucleótido es enlazado al carbón 5' del azúcar de pentosa del nucleótido adyacente vía un grupo fosfato. El "polinucleótido" o "ácido nucleico" puede comprender ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico, y ADN sintético, o ARN, el cual puede ser de doble hebra o de hebra simple, y si es de hebra simple, puede ser la codificación estándar o no-codificación (anti-sentido) estándar. Una "construcción de polinucleótido" significa una molécula de ácido nucleico que es aislada de un gen ocurriendo naturalmente o la cual ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico los cuales están combinados y yuxtapuestos en una manera que no puede de otra manera existir en la naturaleza. Dos secuencias de ADN están "enlazadas operablemente" si la naturaleza del enlace no interfiere con la capacidad de las secuencias para efectuar sus funciones normales relativas a cada otra. Por ejemplo, una región promotora podría ser operablemente enlazada a una secuencia codificada se el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia codificada. Un "polipéptido" significa un polímero linear de aminoácidos que están enlazados por enlaces péptidos. "Promotor" significa una secuencia de ADN actuando cis, generalmente de 80-120 pares base largos y localizados en dirección contraria del sitio de iniciación de un gen, al cual la polimerasa de ARN puede enlazar e iniciar la transcripción correcta. Una molécula de ácido nucleico "recombinante" , por ejemplo una molécula de ADN recombinante, significa una secuencia de ácido nucleico nueva formada in vitro a través de la unión de dos o más moléculas de ADN no homologas (por ejemplo un plásmido recombinante conteniendo uno o más insertos de ADN externo clonado en su sitio de clonación o su polienlazador) . "Diarrea animal" significa diarrea prolongada en animales . "Cambios silentes" significan inclusión, por ejemplo de cambios que no alteran la secuencia de aminoácido codificada por el polinucleótido . "Transformación" significa la modificación directa del genoma de una célula por la aplicación externa del ADN recombinante purificado de otra célula de genotipo diferente, llevando a su captura e integración en el genoma de la célula del sujeto. En bacterias, el ADN recombinante no está integrado en el cromosoma bacterial, sino en su lugar replica autónomamente como un plásmido. Un "transgénico" significa un organismo en el cual el ADN externo ha sido introducido en la línea del germen. Una "planta transgénica" abarca todos los descendientes, híbridos, y cruces de estos, si se produjeron sexualmente o asexualmente, y la cual continúa abrigando el ADN externo, y esto quiere incluir plantas transgénicas , tejidos de planta, y células de planta. "En dirección ascendente" significa en el lado 5' de cualquier sitio en el ADN o ARN. Una "variante" o "variación" de un gen significa secuencias de nucleótidos que codifican para la misma proteína o que codifican para proteínas equivalentes que tiene actividad de FCEb. Una "variante" o "variación" de una proteína significa variantes (incluyendo derivados o análogos) de la proteína de FCEb o fragmentos de estos. Las variantes pueden diferenciarse en secuencia de aminoácido de la proteína de FCEb por uno o más substituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones, y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación. Un "vector" significa una molécula de ácido nucleico que es capaz de replicar autónomamente en una célula hospedadora y puede aceptar ADN externo. Un vector porta su propio origen de replicación, uno o más sitios de reconocimiento único para restricción de endonucleasas que pueden ser usadas para la inserción de ADN externo, y usualmente marcas seleccionables como genes que codifica para resistencia antibiótica, y a menudo secuencias de reconocimiento (por ejemplo, promotor) para la expresión del ADN insertado. Los vectores comunes incluyen, pero no están limitados a, vectores fago, cósmido, baculovirus , retroviral , y plásmidos .

BREVE DESCRIPCION DE L(j)S -????-TJQS- Las Figuras 1A y IB son una secuencia alineada de porciones de ADN que codifica secuencias del FCE bovino (SEQ ID NO: 8), con secuencias de FCE correspondiendo de ratón, cerdo y humano. Las fuentes de las secuencias de FCE son: 1) ratón (Gray y colaboradores, 1983; No. de acceso al GenBank J00380) nucleótidos 3108-3539, SEQ ID NO:24; 2) cerdo (Kim y colaboradores, 2001; No. de acceso al GenBank AF336151) nucleótidos 3172 a 3606, SEQ ID NO: 25; 3) humano (Bell y colaboradores, 1986; No. de acceso al GenBank X04571) nucleótidos 3170-3607, SEQ ID NO: 26; La Figura 2 muestra el alineamiento del ADN que codifica secuencias para la proteina de FCEb madura (SEQ ID NO: 10) con el ratón correspondiente (nucleótidos 3282 a 3440, SEQ ID NO:27), cerdo (nucleótidos 3346 a 3504, SEQ ID NO:28), y secuencias de humano (nucleótidos 3347 a 3505, SEQ ID NO:29) . La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de proteína de FCEb deducida (SEQ ID NO: 9) con el ratón correspondiente (residuos 919 a 1063, SEQ ID NO:30), cerdo (residuos 912 a 1056, SEQ ID NO: 31) y humano residuos (912 a 1057, SEQ ID NO: 32) secuencias de proteína de FCE. La Figura 4 es la alineación de la proteína de FCEb madura deducida (SEQ ID NO: 11) con el ratón correspondiente (residuos 977 a 1029, SEQ ID NO:33), cerdo (residuos 970 a 1022, SEQ ID NO:34), y humano (residuos 970 a 1022, SEQ ID NO: 35) proteínas de FCE maduras.

DESCRIPCION DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS El FCE es un polipéptido pequeño de 53 aminoácidos que es producido de una proteína precursora muy grande. La proteína precursora está codificada por un gen extendiendo 110 kb de ADN donde 24 exones cortos son separados por intrones de varios tamaños . Sobre la extirpación de los intrones, un ARNm de aproximadamente 4,700 pares base es producido el cual codifica la proteína precursora de aproximadamente 1,200 aminoácidos. La proteína de FCE humana madura es producida por extirpación de residuos de aminoácido '977 a 1029 de la proteína precursora las cuales son codificadas por los últimos 95 nucleótidos en la terminación 3' de exón 20 y por los primeros 64 nucleótidos en la terminación 5' de exón 21 el cual corresponde a ácidos nucleicos 3347-3505 del ARNm (Bell y colaboradores, 1986) .

I . Secuencias de ácido nucleico y polipéptido para FCEb. El ADN genómico es inicialmente aislado de la sangre de bovino (Ejemplo 1) . Para proceder con la clonación de las secuencias que codifican el FCEb, los cebadores de SEQ ID NOS : 1 y 2 en la presencia de ADN genómico total de bovino son usados en una reacción de cadena de polimerasa (RCP) (Ejemplo 2) . El cebador de la SEQ ID NO:l abarca nucleótidos 3215-3237 de la secuencia de ADNc de FCE humana y así se sitúa .en la dirección 5' de las secuencias que codifica la proteína de FCE madura. Este cebador es diseñado tal que las degeneraciones potenciales sean acomodadas mediante mezclado de bases nucleótidas. También degenerado, el cebador de SEQ ID NO: 2 abarca nucleótidos 3377-3400 de la secuencia de ADNc de FCE humano y está por lo tanto dentro de la región madura.

Con estos dos cebadores, un fragmento de par base 1456 (SEQ ID NO:3) es obtenido el cual es clonado y secuenciado. El fragmento tiene homología significante a secuencias de ADN de FCE de ratón y humano, conteniendo 56 pares base del exón 19, un intrón de 1320 pares base, y 80 pares base del exón '20, incluyendo 30 pares base que codifican los primeros diez aminoácidos en los términos de N¾ de la proteína de FCE madura, como se mostró por investigaciones de bases de datos de ADN y proteína para similares usando la versión 2.0 del algoritmo de BLAST (Altschul y colaboradores, 1997) . La estrategia inicial de los inventores para clonar las secuencias de ADN que codifica el remanente de la proteína de FCE madura fue para usar un cebador 5' específico de bovino diseñado de la secuencia obtenida arriba y un cebador 3' diseñado de la secuencia de otras especies en la dirección 3' de la región madura; sin embargo, esta estrategia no fue exitosa puesto que muchas combinaciones de cebadores probados no podían fortalecer y amplificar las secuencias de FCEb. Así fue sospechado que las secuencias de FCEb en la corriente 3' de la región madura no permitirían la amplificación exitosa cuando se usan cebadores diseñados de las secuencia de otras especies. Fue entonces usado el PCR inverso, que amplifica secuencias de flanqueo conocidas. En PCR convencional, los cebadores son diseñados para hibridizar a estándares opuestos de ADN y la extensión procede hacia dentro a través de los dos cebos. En el PC inverso, el ADN es circulado y los cebadores son diseñados tal que la extensión procede hacia fuera y el producto contiene secuencias en la dirección 5' y en la dirección 3' de las secuencias conocidas. (Ochman y colaboradores, 1988, Benkel y Fong, 1996.) . Para amplificar las secuencias de ADN en la dirección 5' y en la dirección 3 ' - de las secuencias de FCEb obtenidas arriba, el ADN genómico bovino es digerido con enzimas de restricción específica en reacciones separadas, después disuelto a una baja concentración, y enlazado (Ejemplo 3). En la baja concentración, el enlace intra-molecular es favorecido, generando círculos de ADN. Las enzimas de restricción BamH I, EcoR I, Hind III, y Sac I son seleccionadas porque cada una de ellas reconoce una secuencia de seis pares base; por lo tanto, el tamaño de fragmento promedio generado en la digestión es 4 kb que puede ser fácilmente amplificado por enzimas de polímeros de rango grande. Más aún, de conformidad con la secuencia previamente obtenida, hay un sitio BamH I cercano a la extremidad 5' del intrón entre los exones 19 y 20; así, si el ADN genómico es digerido con BamH I, circulado, y amplificado con cebadores diseñados de secuencias en la corriente 3' del sitio BamH I, el fragmento resultante contiene las secuencias del sitio BamH I en el intrón cercano al sitio BamH I cercano en la corriente 3' (Figura 4). No hay sitio de reconocimiento para las otras tres enzimas de restricción en la secuencia previamente obtenida; así, la amplificación de productos contienen secuencias en la corriente 5' de la secuencia conocida hasta el primer sitio de reconocimiento encontrado y las secuencias en la corriente 3' de las secuencias conocidas cercanas al sitio de restricción encontrado. Los cebadores de SEQ ID NOS: 4 y 5 (nucleótidos 1184 a 1204; y 1070 a 1090 de SEQ ID NO : 3 , respectivamente) son usados para amplificación de ADN digerido con las enzimas arriba mencionadas. Los cebadores de SEQ ID NOS: 6 y 7 (nucleótidos 1413-1434; y 375-394 de SEQ ID N0:3) son entonces usados en alícuotas de la primera reacción como plantillas. Estos cebadores son diseñados para amplificar fragmentos internos a aquellos amplificados por cebadores de SEQ ID NOS: 4 y 5 y esta reacción anidada confirma que las secuencias amplificadas en las primeras reacciones contienen secuencias FCE. La amplificación del ADN digerido con Sac I produce una banda única de aproximadamente 7,500 bp en un gel de agarosa y la ampliación anidada de ese material produce una banda muy intensa de tamaño menos como se esperaba. Este producto es entonces clonado y secuenciado (SEQ ID NO: 8; Ejemplo 3). El fragmento de ADN tiene homología importante con las secuencias de FCE de otras especies como se indicó por investigaciones de ADN y bases de datos de proteína para similares usando la versión 2.0 del algoritmo de BLAST (Altschul y colaboradores, 1997) . El fragmento abarca 483 nucleótidos de intrón, exón 19, el intrón de 1,320 pares base identificado previamente, exón 20, un intrón de 4.8 kilobases y 158 nucleótidos de exón 21. Este fragmento contiene secuencias homologas a aquellas identificadas previamente, más secuencias adicionales, incluyendo aquellas que codifican el resto de la proteína de FCE madura de bovino. La humana es la única especie para la cual las secuencias genómicas (incluyendo introñes) del gen de FCE de exones 19 a 21 están disponibles, e incluidas en un clon de 127 kb derivado de cromosoma humano 4 (Stone y colaboradores, 1998; número de acceso al Genbank ACO04050) . El exón 19 es de 124 pares base en bovino y humano; y exón 20 es de 145 pares base en bovino y 149 pares base en humano. Puesto que el clon bovino de la presente invención no contiene la secuencia completa de exón 21, su tamaño no puede ser comparado con el exón humano 21. Hay más variación en los tamaños de intrones, en aquel el . intrón entre exón 19 y 20 es 1362 pares base en humano y 1320 bares de base en bovino. El intrón entre los exones 20 y 21 es 4799 pares base en humano y 5171 pares base en bovino . Parece haber una inserción de una secuencia SINE en el intrón de bovino; sin embargo, el resto de la secuencia intrónica muestra homología significante al intrón humano. La figura 1 muestra el alineamiento del bovino con secuencias de FCE humanas, porcinas, y murinas . Las homologías generales entre las secuencias de ácido nucleico de bovino y humano, porción, y murino son 70%, 73% y 64% respectivamente usando la versión 2.0 del algoritmo de BLAST para comparar secuencias en pares . Los niveles de homología varían entre las regiones diferentes de las secuencias; por ejemplo, cuando solamente las secuencias del ácido nucleico de las proteínas maduras (figura 2) son comparadas, la homología entre bovino (SEQ ID NO: 9) y secuencias humana, porcina, y murina son 64%, 66% y 59%, respectivamente. Sin embargo, cuando solamente las secuencias de ácido nucleico en la corriente 5' de las secuencias que codifica proteínas maduras son comparadas, la homología entre las secuencias de bovino y humano, porcino, y murino son 82%, 85% y 72% respectivamente . Las secuencias exónicas del gen de FCE obtenido arriba codifica la proteína deducida de la SEQ ID NO: 10. La alineación de la secuencia de proteína de FCEb deducida con las secuencias de FCE humana, porcina y murina está mostrada en la Figura 3. La homología general entre las secuencias de proteína deducidas de bovino y humano, porcino, y murino es 49%, 51% y 46% cuando las secuencias están comparadas en pares usando la versión 2 del algoritmo de BLAST. Cuando los aminoácidos con características similares (o del mismo grupo) son considerados, la homología es 66%, 69% y 62% con la humana, porcina y murina respectivamente. Como fue el caso con la secuencia de ácido nucleico, los niveles de homología varían entre las diferentes regiones de la secuencia; por ejemplo, cuando solamente las proteínas maduras con comparadas (SEQ ID NO: 11 para la secuencia bovina; Figura 4), la homología entre las secuencias de proteína de bovino y humano, porcino, y murino son 39%, 36% y 36% respectivamente (65%, 62% y 60% cuando aminoácidos similares son considerados) . Sin embargo, cuando solamente las secuencias en la corriente 5' de las proteínas maduras con comparadas, la homología entre bovino y humano, porcino, y murino son 66%, 73% y 61% respectivamente (78%, 84% y 73% cuando aminoácidos similares son considerados) . La proteína de ' FCEb madura deducida tiene un peso molecular calculado de 6112.10 Da, y contiene aminoácidos específicos los cuales aparecen significantemente para estructura de proteína en otras especies, nominalmente la glicina en posiciones 17, 36 y 39 (las posiciones 18, 36 y 39 en otras especies) y tiroxina 37. En FCE humano, las tiroxinas 13, 22, y 29 están en proximidad cercana a cada una de las otras (Cooke y colaboradores, 1987) . En la proteína de FCEb deducida, la tirosina 13 y 22 están presentes, así como la fenilalanina 29 la cual es también un aminoácido aromático, y 5 cisteínas como opuestas a 6 en otros FCE conocidos. Los enlaces de bisulfuro en una proteína no son una razón primaria para el plegado peculiar de una cadena de proteína, sino más bien un dispositivo para incrementar la estabilidad de una conformación ya estable (Watson y colaboradores, 1985) . La proteína de FCEb deducida es también un homólogo de FCE de ratón, como se demostró por reconocimiento de pliegue indicado por un registro de consenso de 44.8. Los registros mayores que 12 son correctamente predichos más que 80% del tiempo (Fisher, 2000) . Los análisis de la secuencia de SEQ ID NO: 8 revelan un codón TGA en la estructura en el exón 19 (en la corriente 5' de la región madura) . Uno de los tres codones de terminación de cadena del código genético, el TGA también puede codificar para selenocisteína, el aminoácido veintiuno (Nasim y colaboradores, 2000; Tate y colaboradores, 1999). En genes de FCE de otras especies, el codón correspondiente es TGC el cual codifica para cisteína; así, la presencia de una selenocisteína podría constituir una substitución conservadora. En la presente invención, el análisis de manchado Southern de ADN genómico bovino es realizado para determinar el número de copias del gen de FCE en el genoma bovino (Ejemplo 4) . Si solamente una copia aparenta estar presente, es razonable asumir que la secuencia obtenida es del gen de FCE funcional y la proteína precursora podría ser una selenoproteína. El ADN genómico de bovino es digerido en reacciones separadas con las enzimas de restricción BamH I, EcoR I, Hind III, Sac I y Xab I. Treinta y cinco de cada producto de digestión son corridos en vías separadas de un gel de agarosa. El ADN es transferido a una membrana de nailon que es hibridizada con el fragmento de SEQ ID NO: 3 etiquetada con 32P-dCTP, lavada, y expuesta a película de rayos X por tres días . La sonda hibridiza a una banda única para cada uno de los digestos, sugiriendo fuertemente que hay solamente una copia única del gen de PCE en el genoma bovino.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un ácido nucleico aislado, purificado, o enriquecido comprendiendo la secuencia de SEQ ID NO: 9 y las secuencias complementarias a este. Los ácidos nucleicos aislados, purificados, o enriquecidos pueden comprender ADN, incluyendo ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de hebra única, y si es de hebra única puede ser la codificación estándar o no codificación (anti sentido) estándar. Alternativamente, los ácidos nucleicos aislados, purificados o enriquecidos pueden comprender ARN. El ADN genómico comprendiendo la secuencia de SEQ ID NO: 9 puede ser aislado usando varios métodos, tales como por PCR inversa de ADN genómico de bovino digerido con Sac I con cebadores de SEQ ID NOS: y 5, y cebadores de SEQ ID NOS : 6 y 7 como se describió. Otras combinaciones de cebadores también pueden ser diseñadas basadas en la secuencia de bovino para aislar el ADN de SEQ ID NO: 9 por PCR inverso de ADN genómico digerido con Sac I u otras enzimas de restricción. Las secuencias genómicas de SEQ ID NO: 9 también pueden ser obtenidas por TPC convencional mediante uso, por ejemplo, de los cebadores de las SEQ ID NOS : 6 y 14 como cebadores adelantado y de inversa, respectivamente. En segundo lugar, el ADN genómico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 también puede ser aislado por secuencias de amplificación de exones 20 y 21 por PCR convencional en reacciones separadas; por ejemplo exón 20 es amplificado usando los cebadores de SEQ ID NOS : 6 y 12 como cebadores de adelanto y de inversa, respectivamente. exón 21 es amplificado usando los cebadores de las SEQ ID NOS: 13 y 14 como cebadores de adelanto y de inversa, respectivamente, con los dos fragmentos resultantes estando enlazados . En tercer lugar, el ADN genómico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9 también puede ser aislado por contacto de una biblioteca genómica con una sonda hecha de una fragmento de la secuencia de SEQ ID NO: 8 bajo condiciones que permiten a la sonda hibidizar específicamente a las secuencias relacionadas. La hibridización de la sonda a ácidos nucleicos de secuencias relacionadas puede ser detectada por etiquetado de la sonda con un isótopo radioactivo, una tinta fluorescente, o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Los procedimientos para separar por exclusión bibliotecas genómicas han sido descritos por Ausubel y colaboradores, (1990) y Sambrook y colaboradores, (1989) . El ADN complementario de FCEb codificado puede ser aislado por PCR transcripción inversa.. En la presente invención, los fragmentes de ADNc que codifica la proteína de FCEb madura más las secuencias en la corriente 5' y en la corriente 3', son aisladas para confirmar que las secuencias genómicas obtenidas son transcritas (ejemplo 5) . El ARNm de riñon de bovino es trascrito inverso con el cebador de SEQ ID NO : 14. Siguiendo la transcripción inversa, el ADNc es usado en una reacción de PCR con los cebadores de SEQ ID NOS : 16 y 14 como cebadores de adelanto y de inversa, respectivamente. Varios productos son observados en el gel de agarosa. Una banda de ligeramente más de 400 pares base es cortada fuera del gel, purificado, y el ADN es usado como un plantilla para dos reacciones de PRC separadas, nombradas una con los cebadores de SEQ ID NOS; 16 y 12 como cebadores de adelanto e inverso, respectivamente; y la otra con los cebadores de SEQ IC NOS: 15 y 14 como cebadores de adelanto e inverso, respectivamente. Los fragmentos obtenidos son clonados y secuenciados . La secuencia obtenida (SEQ ID NO: 17) se encontró ser 98% homologa a las secuencias genómicas correspondientes. Las diferencias (6 fuera de 411 nucleótidos) podría ser debido al hecho de que los tejidos de diferentes animales son usados para aislar el ADN y ARN genómico. Cuando es comparado a al proteína deducida de la secuencia genómica, son evidentes dos cambios de aminoácidos en la secuencia de la proteína madura deducida de la secuencia de ADNc, nombrados glutamina en lugar de arginina en la posición 18, y glutamina en lugar de histidina en la posición 32. Alternativamente, las secuencias de ADN complementarias que codifica el FCEb también pueden ser aisladas por separación por exclusión de una biblioteca de ADNc, la cual es construida de un tejido de bovino expresando el gen de FCE. La biblioteca de ADNc es entonces contactada con una sonda comprendiendo la secuencia codificada del FCE o un fragmento de la secuencia de codificación de FCE bajo condiciones que permiten a la sonda hibridizar específicamente a secuencias complementarias. Los ADN complementario que hibridiza a la sonda son detectados y aislados. Los tejidos de bovino expresando el FCE son identificados por manchado de Northern o análisis de PCR. La secuencia que codifica la proteína de FCEb madura (SEQ ID NO: 9) puede ser producida sintéticamente por sintetizadores de ADN convencionales, por lo cual los fragmentos o porciones de SEQ ID NO : 9 pueden ser usados como intermediario para producción de la secuencia completa grande correspondiente. Los ácidos nucleicos aislados, purificados, o enriquecidos de la SEQ ID NO: 9 pueden así ser usados para preparar el péptido de la SEQ ID NO: 11. Es bien conocido que a menudo, menos que una proteína completa grande tiene la función de la proteína completa. Una proteína trunca, careciendo de una terminal-N, o una porción terminal -C puede retener actividad enzimática y/o biológica completa o parcial de la proteína completa grande; por ejemplo, el FCE humano, faltando los cinco últimos aminoácidos en la terminación COOH, retiene su capacidad de inhibir la secreción de ácido gástrico, mientras que el FCE de rata, perdiendo hasta tres residuos de terminal-N tiene actividad idéntica a la proteína nativa (Hollenberg y Gregory 1980; Simpson y colaboradores, 1985) . De aquí que, los fragmentos de SEQ ID NO: 9 que codifica proteínas de FCEb truncas y eliminadas internamente que retienen actividad de la proteína de FCEb completa están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos para fabricación de proteínas trucas y proteínas con eliminaciones internas son conocidos en la técnica. La actividad de un FCE trunco o eliminado internamente puede ser verificada usando por ejemplo, un ensayo de proliferación de síntesis/célula de ADN. Otro aspecto de la presente invención es un ácido nucleico aislado, purificado, o enriquecido que codifica la proteína o fragmentos de FCEb comprendiendo por lo menos 7 , más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52, aminoácidos consecutivos de la proteína de FCEb madura. Las secuencias codificadoras de estos ácidos nucleicos pueden ser idénticas a la secuencia de codificación de la proteína de FCEb, o secuencias de codificación diferente las cuales codifican la proteína de FCE o fragmentos comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52, aminoácidos consecutivos de la proteína de FCEb como un resultado de ' la redundancia o degeneración del código genético, el cual es conocido por aquellos en la técnica (Lewin, 1997). El ácido nucleico aislado, purificado, o enriquecido que codifica la proteína de FCEb madura puede incluir, pero no está limitada a, solamente la secuencia de codificación de la proteína de FCEb madura; la secuencia de codificación de la proteína de FCEb madura y las secuencias de codificación adicionales, como una secuencia líder o secuencias de proteína precursora; o la secuencia de codificación de la proteína de FCEb madura y las secuencias de no codificación, como intrones o secuencias de no codificación 5' y/o 3' de la secuencia de codificación. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico de FCEb puede ser imitadas usando sitios dirigidos de mutagénesis, u otras técnicas conocidas (Ausubel y colaboradores, 1990) , para introducir cambios silentes en la proteína de FCEb madura, los cambios nombrados que no alteran la secuencia de aminoácido codificada por el polinucleótido. Tales cambios pueden ser deseables con el propósito de introducir codones que son preferidos por los organismos hospedadores, de esa manera incrementa el nivel del polipéptido producido por las células hospedadoras que contiene un vector que codifica un polipéptido. Ciertas substituciones de aminoácido pueden ser hechas en secuencias de proteína sin afectar la función de la proteína. La presente invención así se relaciona también a polinucleotidos que tiene cambios de nucleótido con resultado en substituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncos de aminoácido en la proteína de FCEb madura. Los cambios de nucleótido pueden ser introducidos usando metástasis dirigida al sitio, mutagénesis química al azar, eliminación de exonucleasa III, y otras técnicas de ADN recombinantes (Ausubel y colaboradores, 1990) . Las variantes resultantes pueden exhibir las propiedades biológicas del FCEb; por ejemplo, tirosina de substitución con fenilalanina en la posición 13 tiene un pequeño efecto sobre el enlace de ' FCE humano a su receptor (Tadaki y Niyogi, 1993) . Alternativamente, los cambios de nucleótido pueden estar variantes alélicos que ocurren naturalmente, las cuales pueden ser aisladas por ácidos nucleicos de identificación de origen bovino los cuales hibridizan específicamente a sondas comprendiendo por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 60, más preferiblemente por lo menos 70, más preferiblemente por lo menos 80, más preferiblemente por lo menos 90, más preferiblemente por lo menos 100, más preferiblemente por lo menos 110, más preferiblemente por lo menos 120, más preferiblemente por lo menos 130, más preferiblemente por lo menos 140, más preferiblemente por lo menos 150, y más preferiblemente por lo menos 159 bases consecutivas de SEQ ID NO: 9 o las secuencias complementarias de éstas . La hibridización puede ser conducida bajo condiciones bajas, moderadas o altamente severas. Brevemente, una membrana de polímero conteniendo ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados está primero prehibridizado por 30 minutos a 45° C en una solución consistiendo de 0.9 M de NaCl, 50 mM de NaH2P04, pH de 7.0, 5.0 mM de Na2EDTA, 0.5% de SDS, 10X Denhardt, y 0.5 mg/ml de ácido poliriboadenílico . Aproximadamente 2 x 107 cpm (actividad especifica 4-9 x 108 cpm/ g) de sonda oligonucleótida de terminación etiquetada 32p son adicionadas a la solución. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana es lavada por 30 minutos a temperatura ambiente en 1 X SET (150 mM de NaCl, 20 mM de hidrocloruro Tris, pH 7.8 , 1 mM de Na2EDTA) conteniendo 0.5% de SDS, seguido por un lavado de 30 minutos en IX SET fresco a Tm-10°C por una sonda oligonucleótida. La membrana es entonces expuesta a película auto radiográfica para detectar signos de hibridización. Mediante la variación de la severidad de las condiciones de hibridización, los ácidos nucleicos que tiene diferentes niveles de homología a la sonda pueden ser identificados y aislados. La severidad puede ser variada por conducción de la hibridización en variación de temperaturas debajo de la temperatura de fusión (Tm) de la sonda, la cual puede ser calculada usando las siguientes fórmulas : Para sondas mayores que 100 nucleótidos en longitud, Tm es calculada usando la fórmula: Tm = 81.5 - 16.6(log[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N) donde N es la longitud de la sonda. Si la hibridización es llevada a cabo en una solución conteniendo formamida, Tm puede ser calculada usando la ecuación Tm = 81.5 16.6 (log [Na+] ) +0.41 (fracción G+C) -0.63 (%formamida) - (600/N) donde N es la longitud de la sonda. La prehibridización puede -ser llevada a cabo en 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, 0.5% SDS, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado; o 6X SSc; 5X de reactivo de Denhardt, 0.5% de SDS, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, 50% formamida. Las fórmulas para SSC y la solución de Senhardt están listadas en Sambrook y colaboradores, (1989) . La hibridación es conducida por adición de la sonda detectable a las soluciones de prehibridización de arriba. Cuando la sonda comprende el ADN estandarizado doble, esta es desnaturalizada antes de la adición a la solución de prehibridización. La membrana es contactada con la solución de hibridización por un período suficiente de tiempo para permitir a la sonda hibridizar a ADNc o ADN genómico conteniendo secuencias complementarias u homologas. Para sondas sobre 200 nucleótidos de longitud, la hibridización puede ser llevada a cabo a 15-25 °C debajo de la Tm. Para sondas menores tales como oligonucleótidos, las hibridización puede ser llevada a cabo a 5-10 °C debajo de la Tm. Preferiblemente, para hibridización en 6X SSc, la hibridización es conducida a aproximadamente 68 °C.

Preferiblemente, para hibridización en soluciones conteniendo formamida 50%, la hibridización es conducida a aproximadamente 42 °C. Todas las condiciones de hibridización externas son consideradas para ser de alta severidad. Siguiendo la hibridización. la membrana es primero lavada en 2X SSc, 0.1% SDS a temperatura ambiente por 15 minutos; después con 0. IX SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente por 30 minutos a 1 hora; después en 0.1X SSC, 0.5% de SDS a la temperatura de hibridización; y finalmente con 0. IX SSc a temperatura ambiente . Para sondas aligonucleótidas , son recomendados lavados menores. Los ácidos nucleicos que han hibridizado a la sonda son identificados por autoradiografía u otras técnicas convencionales. Para obtener ácidos nucleicos de homología decreciente a la sonda detectable, pueden ser usadas condiciones menos severas; por ejemplo, la temperatura de hibridización puede ser decrecida en incrementos de 5°C desde 68 QC hasta 42 °C en una solución amortiguadora de hibridización que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. Siguiendo la hibridización, la membrana puede ser lavada con 2X SSC, 0.5% SDS a la temperatura de hibridización. Tales condiciones son consideradas a ser de severidad "moderada" arriba de 50° C y severidad "baja" debajo de 50° C. Alternativamente, la hibridización puede ser llevada a cabo en soluciones amortiguadoras, tales como 6X SSC, conteniendo formamida a una temperatura de 42° C. En este caso, la concentración de formamida en la solución amortiguadora de hibridización puede ser reducida en incrementos de 5% desde 50% hasta 0% para identificar los clones que tiene niveles de decrecimiento de homología a la sonda. Siguiendo la hibridización, la membrana puede ser lavada con 6X SSC, 0.5% SDS a 50° C. Tales condiciones son consideradas por ser de severidad "moderada" arriba de 25% de formamida y de severidad "baja" debajo de 25% de formamida. Los métodos pueden ser usados para aislar ácidos nucleicos que tiene una secuencia con por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% de homología a la secuencia de FCEb o fragmentos comprendiendo por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 60, más preferiblemente por lo menos 70, más preferiblemente por lo menos 80, más preferiblemente por lo menos 90, más preferiblemente por lo menos 100, más preferiblemente por lo menos 110, más preferiblemente por lo menos 120, más preferiblemente por lo menos 130, más preferiblemente por lo menos 140, más preferiblemente por lo menos 150, y más preferiblemente por lo menos 159 bases consecutivas estas, y las secuencias complementarias a estas . La homología puede ser medida usando la versión 2 de BLAST con los parámetros dados (Altschul y colaboradores, 1990) . Adicionalmente, los procedimientos discutidos pueden ser usados para aislar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tiene por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 99% de homología a la proteína o fragmentos de FCE de la proteína de FCEb comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos como se determinó mediante el uso de la versión 2 BLASTX. El ácido nucleico aislado, purificado o enriquecido de SEQ ID NO: 9, las secuencias complementarias de este, o un fragmento comprendiendo por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 60, más preferiblemente por lo menos 70, más preferiblemente por lo menos 80, más preferiblemente por lo menos 90, más preferiblemente por lo menos 100, más preferiblemente por lo menos 110, más preferiblemente por lo menos 120, más preferiblemente por lo menos 130, más preferiblemente por lo menos 140, más preferiblemente por lo menos 150, y más preferiblemente por lo menos 159 bases consecutivas de SEQ ID NO: 9 o las secuencias complementarias de estas pueden ser usadas como sondas para identificar y aislar ADNc que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 11 o variantes de estos. En un procedimiento, una biblioteca de ADNc es construida de ARN extractado de un tejido bovino expresando el gen de FCEb, y contactado con una sonda comprendida de secuencia que codifica bajo condiciones que permiten la hibridización de la sonda para secuencias complementarias, las cuales son entonces detectadas y aisladas . Mediante variación de la severidad de las condiciones de hibridización usadas para identificar el ADNc del FCE, los ácidos nucleicos que tiene diferentes niveles de homología a la sonda pueden ser identificados y aislados. Los ADNc variantes también pueden ser aislados mediante el uso de cebadores diseñados de la secuencia de codificación o un fragmento de estos en una reacción de PCR con ADNc sintetizado de ARN de bovino como plantilla. Otro aspecto de la presente invención es la proteína o fragmentos de FCEb aislada o purificada comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos . La proteina de FCEb o fragmentos de esta puede ser obtenida por expresión de las secuencias de ADN de FGEb en un hospedador recombinante como se describió aquí . Alternativamente, la proteína de FCEb o fragmentos de ésta que comprenden por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos pueden ser producidos sintéticamente mediante sintetizadores de péptido convencional. Los fragmentos pueden servir como intermediarios para producción de la proteína de FCEb completa grande correspondiente mediante síntesis de péptido.

Alternativamente, la proteína de FCEb o fragmentos de esta también puede ser obtenida usando los ARNm transcritos de un ADN construido comprendiendo un promotor enlazado al ácido nucleico que codifica la proteína de FCEb o fragmentos de esta. El ADN construido puede ser linearizado antes de conducir una reacción de transcripción in vitro. El ARNm trascrito es entonces incubado con un extracto de traducción de célula libre apropiado, como un extracto de reticulocito de conejo, para producir la proteína de FCEb o fragmento de ést . Además, el polipéptido de FCEb o fragmentos de éste pueden ser obtenidos a través de enriquecimiento bioquímico o procedimientos de purificación. La secuencia de polipéptidos potencialmente homólogos o fragmentos puede ser determinada mediante digestión proteolítica y/o microsecuencia. La secuencia de la prospectiva de polipéptidos homólogos o fragmentos puede ser comparada a la proteína de FCEb deducida o un fragmento comprendiendo por lo menos- 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos usando un programa como la BLASTP, Versión 2. La presente invención también se extiende, a variantes (incluyendo derivados o análogos) de la proteína de FCEb o fragmentos comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos. Las variantes pueden diferir en secuencia de aminoácido de la proteína de FCEb por una o más substituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y cortes que pueden estar presentes en cualquier combinación. Las variantes pueden estar ocurriendo naturalmente o ser creadas in vitro usando el sitio dirigido a mutagénesis, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de eliminación de Exonucleasa III, y técnicas de clonación estándar. Alternativamente, las variantes, fragmentos, análogos o derivados pueden ser creados usando síntesis química o procedimientos de modificación. Las variantes de la proteína de FCEb pueden ser variantes en las cuales uno o más de los residuos de aminoácido de la proteína de FCEb son substituidas con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) como el residuo de aminoácido substituido puede o no ser uno codificado por el código genético. Las substituciones conservadoras involucran la substitución de un aminoácido dado en una polipéptido por otro aminoácido con características similares, con substituciones típicas como siguen: • reemplazo de un aminoácido alifático como alanina, valina, leucina, e isoleucina con otro aminoácido alifático; • reemplazo de serina con threonxna o viceversa; • reemplazo de un residuo ácido tal como aspartato o glutamato, con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo portando un grupo amida, tal como asparagina o glutamina, con otro residuo portando un grupo amida; • el intercambio de un residuo básico, como lisina o agrinina, con otro residuo básico; y • el reemplazo de un residuo aromático, como fenilalanina o tirosina, con otro residuo aromático. Otras variantes son aquellas en las cuales uno o más de los residuos de aminoácido de la proteína de FCE bobina incluye un grupo substituyente . Todavía otras variantes son aquellas en las cuales los aminoácidos adicionales son fundidos al polipéptido como una secuencia líder, una secuencia secretora, o una secuencia que facilita la purificación, enriquecimiento, o estabilización de la proteína. En algunas modalidades, el fragmento, derivativo o análogo incluye secuencias precursoras tales ' que el fragmento, derivativo o análogo puede ser activado por la hendidura de la porción del precursor para producir un péptido activo. Otro aspecto de la presente invención son polipéptidos o fragmentos de estos los cuales por lo menos el 55%, %, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 99% de homología a la proteína de FCEb o un fragmento comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, mas preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de éstos. La homología puede ser determinada usando un programa como BLASTP versión 2 con los parámetros dados, los cuales alinean los polipéptidos o fragmentos siendo comparados y determinan la extensión de la homología entre ellos . Se aprecia que la "homología" del aminoácido incluye substituciones de aminoácido conservador como se describió previamente. Los péptidos o fragmentos que tiene homología a la proteína de FCEb o un fragmento de esta puede ser obtenida por aislamiento de los ácidos nucleicos codificándolos usando las técnicas discutidas aquí. La proteína de FCEb o fragmentos que comprenden por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos, pueden también ser usados para generar anticuerpos los cuales enlazan específicamente a la proteína o fragmento. Para detectar el FCE en una muestra de tejido o fluido, la muestra es contactada con un anticuerpo, y su capacidad para enlazar es entonces determinada mediante etiquetado del anticuerpo con cualquiera de una etiqueta fluorescente, enzimática o de radioisótopo detectable, o alternativamente, un anticuerpo secundario que tiene una etiqueta. Los ensayos conocidos usados para detección del FCEb en una muestra incluyen ELISA, ensayo de sándwich, radioinmunoensayo, y manchado de Western. Los anticuerpos policlonales generados contra la proteína de FCEb o fragmentos que comprenden por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos pueden ser obtenidos por inyección o administración directa de la proteina o fragmentos a un animal . El anticuerpo obtenido enlaza entonces la proteína a sí mismo; así, aún cuando una secuencia que codifica solamente un fragmento de la proteína puede ser usado para generar anticuerpos que pueden enlazar a la proteína nativa completa grande. Los anticuerpos pueden entonces ser usados para aislar la proteína de las células de expresión de ésta. Para la preparación de anticuerpos monoclonales , cualquier método que provea anticuerpo producidos por cultivos de línea de célula continua pueden ser usados, tales como le hibridoma, trioma, hibridoma de célula B humano, y las técnicas de hibridoma EBV.

Los anticuerpos generados contra la proteína de FCEb o fragmentos comprendiendo por lo menos 7, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 51, y más preferiblemente por lo menos 52 aminoácidos consecutivos de estos pueden así ser usados para detectar la proteína de FCE en tejidos y fluido de bovino, y en separación por exclusión para una proteína similar de otros organismos, preferiblemente rumiantes. Las proteínas extraídas de tejidos o fluido de bovino u otros rumiantes, son contactadas con el anticuerpo y aquellas que específicamente enlazan son detectadas por cualquiera de los procedimientos descritos previamente. El gen de FCEb de la presente invención puede ser usado en hibridización heteróloga y experimentos que facilitan el aislamiento de los genes de codificación de FCE de otros mamíferos .

II . Sobreexpresión de la proteína de FCEb. La secuencia de codificación de FCEb caracterizada puede ser introducida en una variedad de sistemas de expresión para producción comercial . La tecnología de ADN recombinante ha facilitado la producción eficiente de hormonas de péptido tales como FGE . Las variedades industriales de microorganismos (por ejemplo, Aspergillus Níger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoder a reesei, Mucor miehei, Kluyverro yces lactic, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis o licheniformis) o plantas hospedadoras (por ejemplo, cánola, fríjol de soya, maíz, papa) pueden ser usadas para producir el FCEb. Todos los sistemas emplean una aproximación similar, caracterizada porque una construcción de expresión es ensamblada para incluir la secuencia de codificación de proteína de interés y secuencias de control como promotores, mejoradotes y terminadores , con secuencias de signo y marcadores seleccionables incluidos si se desea. Para lograr la expresión extracelular del FCEb, el constructo de expresión de la presente invención utiliza una secuencia de signo secretor, la cual no está para ser incluida si la expresión citoplásmica es. deseada. El promotor y la secuencia de señal son funcionales en la célula hospedadora y proveen para expresión y secreción del producto de secuencia de codificación. Las terminaciones de transcripción están incluidas para asegurar la transcripción eficiente. Las secuencias auxiliares que mejoran la expresión o purificación de proteína también pueden ser incluidas en la construcción de la expresión. El FCE bovino puede ser expresado en E. coli y P. pastoris (Ejemplo 6) . Un fragmento de ADN conteniendo solamente la secuencia que codifica la proteína madura es preparado por amplificación de las secuencias de codificación de la proteína madura en cada sitio del intrón de 5 kb separadamente con cebadores de SEQ ID NOS: 6 y 12; y cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 1 , y entonces enlazando los dos productos con un cebador de conjunción (SEQ ID NO: 15) . El producto final es clonado en vectores de expresión E. coli y P. pastoris . Un vector apropiado debe ser capaz de replicar autónomamente en una célula hospedadora y aceptar- el ADN externo. Un vector portando su propio origen de replicación, uno o más sitios de reconocimiento único para endonucleasas de restricción que pueden ser usadas para la inserción del ADN externo, y a menudo secuencias de reconocimiento (por ejemplo promotor) para la expresión del ADN insertado. Un marcador seleccionable también puede ser incluido para permitir la selección de células bacteriales portando la construcción deseada; por ejemplo, marcadores seleccionables procarióticos apropiados incluidos aquellos que confieren resistencia a antibióticos tales como ampicilina. Pueden ser seleccionados cualquiera de los vectores apropiados conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los vectores comunes incluyen, .pero no están limitados a, vectores de fago, cósmido, baculovirus, retroviral y plásmido. Los siguientes vectores plásmidos son provistos a manera de ejemplo: pEQ40, o un plásmido de las series pET, tales como pET26. Sin embargo, cualquier vector plásmido puede ser usado tan • ampliamente como éste sea replicable y viable en el hospedador. Una vez que un vector apropiado ha sido ensamblado, una variedad de técnicas están disponibles para introducir el ADn externo en las células hospedadoras . El vector de construcción de expresión puede ser introducido en el E. coli por electroporación, y en células P. pastoris transformación de protoplasto o electroporación. Para la electroporación, las células son lavadas con agua esterilizada y resuspendidas en una solución de baja conductividad (por ejemplo solución de sorbitol 1 M) . Un choque de alto voltaje aplicado a la suspensión de célula crea poros transitorios en las membranas de la célula a través de los cuales el ADN transformado entra a las células. En P. pastoris, el constructo de expresión es mantenida estable por integración, a través de recombinación homologa, en el locus aoxl (oxidasa de alcohol) . Las células hospedadoras portando el vector o la construcción de la expresión son. identificadas a través del uso del marcador seleccionable portado por el constructo de expresión o vector, y la presencia del gen de interés confirmado por hibridización, PCR, anticuerpos, y otras técnicas. Las células raicrobiales transformadas pueden ser crecidas por técnicas tales como fermentación en lotes y continua en líquido o medio semi sólido. Las células transformadas son propagadas bajo condiciones optimizadas para relaciones producto-costo máximas. Los rendimientos de producto pueden ser incrementados mediante manipulación de parámetros de cultivo tales como temperatura, pH, aireación, y composición del medio. La manipulación cuidadosa y monitoreo de las condiciones de crecimiento para células E. coli de alta expresión recombinante puede resultar en rendimientos de biomasa de cultivo y proteína de 150 g (peso húmedo) de células/1 y 5 g de proteína insoluble/1, respectivamente. Las bajas concentraciones de un inhibidor de proteasa (por ejemplo fluoruro de fenilmetilsulfonilo o pepstatino) pueden ser empleadas para reducir la proteolisis de la proteína sobre expresada, mientras las células hospedadoras deficientes de proteasa pueden ser usadas alternativamente para reducir o eliminar la degradación de la proteína. Para expresión microbial, la producción de una proteína de fusión puede también ser deseada para facilitar la purificación o proteger el FCEb de la degradación proteolítica. Siguiendo la fermentación, las células microbiales pueden ser removidas del medio a través de procesos corriente abajo tales como centrifugación y filtración. Si el producto deseado es secretado, este puede ser extraído del medio nutriente. En el caso de producción intracelular, las células son cosechadas y el producto liberado por ruptura de células usando fuerzas mecánicas, ultrasonido, enzimas, químicos y/o alta presión. La producción de un producto insoluble, que ocurre en sistemas de E. coli de alta expresión, puede facilitar la purificación del producto. Las inclusiones del producto son extraídas de células transtornadas por centrifugaci n, con proteínas contaminantes removidas por lavado con una solución amortiguadora conteniendo bajas concentraciones de un desnaturante (por ejemplo urea 0.5 a 6 M, SDS 0.1 a 1%, o guanidina-HCl 0.5 a 4.0 M) . Las inclusiones lavadas son solubilizadas en soluciones conteniendo urea de 6 a 8 M, SDS de 1 a 2%, o guanidina-HCl de 4 a 6 M, y producto solubilizado puede se renaturalizado por remoción lenta de agentes desnaturalizadotes durante la diálisis . El FCE bovino también puede ser expresado en células de plantas, tales como papas o Brassica napus. El constructo de expresión es insertada en un vector binario capaz de replicar en A. tumefaciens y movilización en células de planta. La construcción resultante es transformada en células A. tumefaciens, y el constructo de expresión es entonces transferida en células de hoja B. napus mediante movilización conyugal del vector binario:: el constructo de expresión. El constructo de expresión se integra al azar en el genoma de la célula de la planta. Después de la selección y separación por exclusión, las células de la planta transformadas pueden ser regeneradas en plantas íntegras y líneas variables de plantas transgénicas 'desarrolladas y cultivadas usando métodos conocidos. El FCE bovino puede ser extraído de porciones cosechadas o plantas íntegras mediante trituración, homogenización, y/o tratamiento químico. Las fusiones de oleosina lipofílica especifica de semilla facilita la purificación medíante partición de la proteína de fusión de oleosina en la fracción de aceite de semillas de canela molida, lejos de las proteínas acuosas (van Rooi en y Moloney, 1994) . Si es necesario, la purificación del producto de extractos microbiales, de fermentación, y plantas puede ser conducido usando la precipitación (por ejemplo, precipitación de sulfato de amonio) ; cromatografía (por ejemplo, filtración de gel, intercambio iónico, cromatografía de afinidad líquida) ; ultrafíltración; electroforesis ; extracción solvente-solvente (por ejemplo, precipitación de acetona) ; o combinaciones de estos métodos .

III . Actividad de las proteínas de FCEb Las proteínas de FCEb recombinantes obtenidas pueden ser evaluadas en su actividad usando por ejemplo, un ensayo de proliferación de síntesis/célula de ADN, puesto que el FCE es un mitógeno para tipos numerosos de células (ejemplo 7) . Brevemente, los fibroblastos de bovino son crecidos a semi-confluencia en placas de 24 pozos, a las cuales el FCEb recombinante (en varias concentraciones) y el FCE humano (el control positivo) son entonces adicionados a pozos separados. Dieciocho horas después de la adición del FCEb, es adicionada timidina tritiada a cada pozo para ser incorporada en el ADN sintetizado nuevamente. Ocho horas después, las células son cosechadas, y las timidinas no incorporadas e incorporadas son separadas por precipitación acida. La cantidad de radioactividad en cada fracción es determinada por destello continuo. Un incremento en la timidina tritiada incorporada comparada con células de control indica la estimulación de la síntesis de ADN en células de fibroblasto mediante el FCEb recombinante. Con este ensayo, también es posible comparar las potencias de FCEb y humano para estimular la síntesis y proliferación de ADN en células de bovino. En un ensayo similar, las células son cosechadas dieciocho horas después de la adición del FCEb y contadas para una determinación del efecto de los FCEb en la célula de proliferación.

IV. Formulaciones y Aplicaciones del FCEb. La proteína de FCEb o los fragmentos funcionalmente equivalentes de estos; todos o una porción de los cultivos o plantas microbiales transformadas; y extractos obtenidos de los cultivos o plantas pueden ser usados directamente en apiicaciones requiriendo actividad del FCEb. Las aplicaciones incluyen la promoción del crecimiento; prevención o tratamiento de infecciones intestinales ; incremento en la absorción de nutrientes; y aceleración del desarrollo de células intestinales inmaduras . La mayoría de los animales de granja difieren de los humanos en ser incapaces de absorber inmunoglobulinas a través de la placenta y en su lugar adquirir inmunidad de la captación de anticuerpos en la leche materna a través de un "gotero", estructura de célula intestinal inmadura. Aunque esta captación es lograda completa y rápidamente después del nacimiento, el tiempo para el reemplazo de las células intestinales inmaduras con maduras puede ser prolongado; por ejemplo tan largo como cuatro semanas en el lechón y posiblemente hasta tres meses en el becerro. Esta etapa puede crear varios problemas en la cria de animales, particularmente previniendo la utilización de dietas de tipo adulto, haciendo al animal neo natal dependiente en lactancia para nutrientes esenciales. La Publicación Internacional No. WO 88/04180 de Wilson y colaboradores, provee un método para promover maduración precoz de enzimas digestivas y crecimiento mediante administración del FCE a animales de granja. Para mejorar el crecimiento de becerros lecheros y de carne de res, la administración del FCE podría teóricamente ser derivada de cualquiera de las fuentes mamíferas . Se creyó comúnmente que la secuencia activa del FCE fue conservada cercanamente entre especies. Sin embargo, la secuencia activa del FCEb es significantemente diferente de todas las otras- secuencias de FCE- de mamíferos conocidas, como se demostró en esta invención. Por lo tanto, para promover el crecimiento de becerros lecheros o de carne de res, es preferible usar el FCEb el cual puede ser probablemente más potente en la afectación de la fisiología digestiva bovina y evitar efectos colaterales indeseables si el FCE de una fuente alternativa fuera usado. El FCE bovino también puede ser usado para promover el crecimiento de otras especies animales de graja, preferiblemente rumiantes tales como cabras y ovejas. El FCE puede ser involucrado en la regulación de la captación de nutrientes; por ejemplo, en el roedor, el FCE incrementa el transporte de electrolitos, glucosa y prolina a través de las membranas de borde de cepillo del yeyuno. El FCEb de la presente invención así también puede ser usado por períodos de tiempo más largos que lo necesario para modificar la estructura de la célula intestinal como se describió previamente. El incremento del potencial en la captación de nutrientes en respuesta al FCEb puede aumentar la eficiencia del alimento y mejorar el crecimiento.

Las células intestinales del animal joven deben permanecer en el estado inmaduro por un tiempo suficiente para permitir la transferencia de la inmunidad de la madre. La administración del FCEb así puede ser iniciada cuando los becerros tienen dos, tres o cuatro días de edad y ser continuada por solamente dos o cuatro días, si el efecto deseado es acelerar la maduración de la estructura de la célula intestina; o por un período mayor como cuatro a seis semanas, si el efecto deseado es tomar ventaja del incremento en la captación de nutrientes mediada por el FCEb. El mejor tiempo para la administración de FCEb para un efecto óptimo en los becerros puede haber sido determinado experimentalmente . El FCE bovino puede ser administrado de varias maneras, nombrados por cualquiera de los implantes o la ruta parenteral en intervalos de ocho horas como se sugirió en la Publicación Internacional No. O88/04180 de Wilson y colaboradores. Sin embargo, es preferida la administración oral en el alimento del animal o en el agua que bebe. La administración del FCE diariamente mejora el peso ganado en conejos blancos de Nueva Zelanda en una dosis de 100 g/kg de peso corpóreo por nueve días (Patente de EUA No. 5,753,622 de Buret y colaboradores). Para becerros, el FCE puede ser administrado oralmente, con el rango de dosis variando de 10-10,000 pg/Kg por día como un ejemplo. El FCE bovino también puede ser usado para prevenir o tratar infección intestinal. Las infecciones incluyen, pero no están limitadas a, infecciones de E. coli enteropatogénicas tales como colibacilosis entérica; giardiasis; y diarrea animal. El suplemento con FCE mejora las funciones intestinales de lechones infectados con rotavirus (Zijlstra y colaboradores, 1994) . Además, la administración oral del FCE reduce el nivel de infecciones entéricas en conejos y previene la reducción en el peso ganado causado por infección (Buret y colaboradores, 1997) . La Patente de EUA No. 5,753,622 de Buret y colaboradores, desglosa un método para tratamiento de diarrea animal y otras infecciones patogénicas, y para incrementar el peso ganado mediante la administración oral del FCE o por su administración en el alimento de animales. Para los becerros, el FCEb puede ser administrado oralmente, con el rango de dosis variando de 10-10, 000 g/kg por día como un ejemplo para prevención o tratamiento de diarrea animal u otras infecciones patogénicas . Para las aplicaciones de arriba, el FCEb puede ser preparado en la forma de FCEb crudo, FCEb purificado, o como un extracto obtenido de microorganismos transformados, tejido de planta transformado, o medio de cultivo o nutriente en el cual el FCEb puede ser secretado por microorganismos transformados. Varias formulaciones de FCEb pueden así ser preparadas para administración a animales jóvenes y adultos (esto es, reses, aves, cerdos, ovejas, cabras, otro ganado monogástrico o de rumiantes) para promover su crecimiento y salud. El FCE bovino puede ser formulado como un sólido, líquido, suspensión, aditivo de alimento, mezcla, o composición de alimento como sigue. i) Sólidos - El FCE bovino puede ser formulado como un sólido, como un bloque mineral, sal, granulo, pildora, extruido o polvo. En la forma de un polvo, el FCEb puede ser espolvoreado sobre el alimento a granel o mezclado con una ración, o extruido con otros rellenos de alimento a través de procesos conocidos. ii) Líquidos y suspensiones - El FCE bovino puede ser incorporado en líquidos, formulado como soluciones o suspensiones, mediante adición del FCEb liofilizado o en polvo a un líquido apropiado. El FCE bovino puede ser mezclado con el agua de beber del animal o provisto en otras formas líquidas para consumo. El FCE bovino puede ser combinado con alimento líquido, por ejemplo calostro, leche de hospital, leche entera y substitutos de leche, los cuales son tipos de alimento líquido conocidos en la técnica usados para proveer nutrición e inmunoprotección a los becerros. Los métodos de adición de ingredientes activos al alimento líquido son bien conocidos en la técnica, ver por ejemplo la Patente de EUA No. 5,785,990 de Langrehr. iii) Aditivo para Alimento El FCE bovino puede ser administrado en la forma de un aditivo de alimento comprendiendo una preparación de microorganismos liofilizados o tejidos de planta que han sido transformados a FCEb expresados. El aditivo para alimento puede estar incluido con el alimento regular de animales . iv) Mezcla adicional La incorporación de ingredientes activos en el alimento animal es comúnmente lograda por preparación de una pre mezcla del ingrediente activo, mezclando la pre mezcla con vitaminas y minerales, y entonces adicionando la pre mezcla o el aditivo de alimento al alimento. El FCE bovino puede ser mezclado adicionalmente con otros ingredientes activos conocidos por aquellos en la técnica, por ejemplo enzimas, antibióticos, prebióticos, o preparaciones vivas de bifidobacteria y bacteria de ácido láctico. Los ingredientes activos, incluyendo el FCEb solo o en combinación con otros ingredientes activos, puede ser combinado con nutrientes, tales como vitaminas (por ejemplo, vitaminas A, D, E y K, tiamina, riboflavina, etc.), y minerales (por ejemplo, cobre, cobalto, magnesio, yodo, sulfato de hierro, etc.), y macronutrientes (por ejemplo, granos semillas, pastos, grasas y aceites) . La premezcla puede entonces ser adicionada a ingredientes de alimento seco, incluyendo cereales (por ejemplo, trigo, avena, cebada, y maíz) , alimento de proteína vegetal, alimento de proteína animal, y productos de leche (por ejemplo, polvos de leche y polvos de suero) . v) Composición de Alimento - El FCE bovino puede ser provisto en la forma de una composición de alimento comprendiendo un relleno alimenticio en combinación o tratado con el FCEb. El FCE bovino puede ser mezclado con relleno alimenticio en forma seca,- por ejemplo como un polvo, o como un líquido para ser usado por ejemplo como un empapador o spray. Cualquier relleno alimenticio convencional puede ser usado, incluyendo granos de cereal tales como maíz, grano, sorgo, trigo, cebada, avena, alimento de proteína vegetal, pasto, heno, forraje, y silaje de maíz. Las formulaciones del FCEb pueden ser estabilizadas a través de la adición de otras proteínas (por ejemplo, gelatín, polvo de leche descremada, etc.) o agentes químicos (por ejemplo, glicerol, polietilén glicol, agentes de reducción y aldehidos) . También pueden ser incorporados en las formulaciones portadores farmacéuticamente aceptables, diluentes, y excipientes, por ejemplo, azúcares, leche en polvo, productos de leche, y derivados de celulosa. Para asegurar que los animales consumen una cantidad suficiente, puede ser adicionado saborizantes a la formulación para proveer el FCEb en una forma que aparezca paladeable y familiar para el animal . Las formulaciones del FCEb pueden ser adaptadas para animales jóvenes durante la etapa de crecimiento y engorda, en cantidades modificadas conteniendo el FCEb que pueden ser requeridas por animales adultos. El FCE bovino puede ser administrado en varias formas, a saber ya sea por implantes o la ruta parenteral . Sin embargo, es conveniente la administración oral en el alimento animal o en agua de beber. Alternativamente, un gen de FCEb con una secuencia promotora mej oradora apropiada puede ser integrada en un genoma animal y expresada selectivamente en un órgano o tejido que podría secretar el FCEb en el tracto gastrointestinal, eliminando de esa manera la necesidad de FCEb suplementario. La dosificación del FCEb depende de muchos factores que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, la forma particular del FCEb; la condición para la cual el FCEb está siendo usada (esto es, promoción de crecimiento o tratamiento de infección intestinal) ; el tipo, edad, y peso del animal. Para becerros, el FCEb puede ser administrado oralmente, con el rango de dosis variando de 10-10,000 g/kg por dia como un ejemplo. Para animales adultos se requieren rangos de dosis más grandes . Los ejemplos de aquí son dados a manera de ilustración y no están en forma de que proyecten limitar el alcance de la presente invención. Los esfuerzos han sido hechos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, temperatura, pH, cantidades) pero debe ser reconocida la posibilidad de alguna variación experimental y desviación.

Ejemplo 1 - Aislamiento de ADN genómico de Sos fcaurus. El ADN genómico fue aislado de la sangre bovina (Bos taurus) usando un método de extracción de sal (Millar y colaboradores, 1988) . Brevemente, las células nucleadas obtenidas de la sangre anticoagulada fueron resuspendidas en 3 mi de solución amortiguadora de lisis de núcleos (10 mM Tris-HCL, 400 mM de NaCl, y 2 mM de Na2EDTA, pH 8.2) en tubos de centrifugación de 15 mi. Los Usados fueron incubados por la noche con 200 µ? de 10% de SDS y 0.5 mi de solución de proteasa K (1 mi de proteasa K en 1% de SDS y 2 mM de Na2EDTA) . Después de la digestión, 1 mi de NaCl saturado (aproximadamente 6 M) fueron adicionados a cada tubo el cual fue agitado vigorosamente por 15 segundos, y después centrifugado a 2500 rpm por 15 min. El sobrenadante fue transferido a otro tubo de 15 mi, fueron adicionados 2 volúmenes de etanol absoluto (a temperatura ambiente) , y los tubos fueron invertidos varias veces hasta que el ADn precipitó. Los estándares de ADN fueron removidos con una pipeta y transferidos a un tubo m crocentrífugo^1 conteniendo 300 µ? de solución amortiguadora Tris.

Ejemplo 2 - Amplificación/ clonación, y secuencia del fragmento 1.5 fcb del gen de FCEb. i) Diseño de cebador para amplificación de PCR de un fragmento de FCEb genómico. Las siguientes secuencias de ADNc de FCE de especies mamíferas fueron analizadas para identificar regiones de homología : 1) humano (Bell y colaboradores, 1986; No. de acceso al GenBank X04571) ; 2) ratón (Gray y colaboradores, 1983; No. de acceso al GenBank J00380) ; 3) rata (Saggi y colaboradores, 1992; No. de acceso al GenBank U04842) ; 4) cerdo (Kim y colaboradores, 2001; No. de acceso al GenBank AF336151) ; y 5) caballo (Stewart y colaboradores; No. de acceso al GenBank S73527) . Una región altamente conservada localizada 83 aminoácidos en la corriente 5' de la proteína de FCE madura fue identificada y codificada la secuencia de aminoácido "CTNTEGGY" . Esta secuencia fue usada para diseñar el cebador de SEQ ID NO:l ya que las degeneraciones potenciales fueron acomodadas mediante mezclado de bases de nucleótidos en estas posiciones; 5'GACACA/C/G/T RGC/T ACA AAT ACA/C/G/T GAG GG3 ' . El cebador de la SEQ ID NO: 2 fue diseñado de una región muy conservada de la proteína madura de secuencia "DGYCKHDG" en FCE humano. Las degeneraciones potenciales fueron también acomodadas mediante mezclado de bases de nucleótidos en estas posiciones : 5 ' GAC/T GGG TAC TGC CTC CAC/T GG/AT GG 3 ' . Los cebadores fueron generados en un sintetizador de ADNYARN (Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City CA, 94404, USA, modelo #392) . ii) Amplificación, de PCR y clonación del fragmento de FCEb genómico 1.5 kb La aplicación fue realizada en 50 µ? , con 300 ng de ADN genómico de bovino como plantilla (como se aisló en el ejemplo 1) , 200 nM de cada uno de los cebadores de SEQ ID NOS: 1 y 2, 100 µ? dNTP (Roche Molecular Biochemicals, 201 boulevard Armand-Frappier, Laval, QC H7V 4A2 , Canadá, no. de catálogo 1 581 295), 1.5 U Taq POLIMERASA de ADN (Life Technologies, 9800 Medical Center Drive, P.O. Box 6482, Rockville, MD 20850, USA, no. de catálogo 1 0342-053), solución amortiguadora de reacción IX (suministrada con la enzima) y 1.5 mM de MgCl2. Después de un paso de desnaturalización inicial de 3.0 minutos a 96° C, el ciclo de RPC, que fue repetido treinta y cinco veces, consistiendo de (1) un paso de desnaturalización de 30 segundos a 94° C; (2) un paso de combinación de los pares base de 15 segundos a 57° C; y (3) un paso de éxtensión por 2 minutos a 72° C; seguido por un paso de extensión final por 5 minutos a 72° C. Quince µ? de la reacción PCR fueron corridos en un gel de agarosa 1%, el cual fue después teñido con bromuro de etidio, y visualizado bajo luz ultravioleta. Una banda de aproximadamente 1.5 kb fue cortada del gel y purificada mediante el paso a través de fibra de vidrio. Brevemente, una cantidad pequeña de fibra de vidrio fue colocada en un tubo de 0.5 mi con un pequeño agujero en la parte superior. La pieza de gel fue colocada sobre la parte superior de la fibra de vidrio y el tuvo fue colocado dentro de un tubo de 0.5 mi. Los tubos fueron centrifugados a 10,000 rpm por 10 minutos. Dos µ? del efluente fueron usados como plantilla en una reacción de PCR de 100 µ? (las mismas condiciones como arriba) para generar suficiente plantilla para clonación. Toda la reacción de amplificación fue corrida en un gel de agarosa de 1%, el cual fue entonces teñido con bromuro de etidio, y visualizado bajo luz ultravioleta. La banda de 1.5 kb fue cortada del gel y purificada con el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen Inc., 28159 Avenue Stanford, Valencia, CA 91355, USA, no. de catálogo 28704). Aproximadamente 50ng de ADN fueron ligados a 12.5 ng de vector de clonación pGEMT-EASY TA (Promega Corporation, 2800 ood Hollow Road, Madison, WI 53711-5399, USA, no. de catálogo A1360) con 3 unidades de ligasa de ADN T4 (Promega Corporation, no. de catálogo M1801)' en un volumen de 10 µ? por 16 horas a 4o C. Dos µ? de la mezcla de unión fue transformada en E. coli MAX Efficiency®DH5a ™Competent Cells (Life Technologies, no. de catálogo 18258-012) . iii) Secuencia del fragmento de FCE bovino genomico 1.5 kb La secuencia completa del inserto 1.5 kb (SEQ ID NO: 3) fue determinada por el s,iguiente método. El ADN de plantilla fue extraído de los cultivos de la noche de E. coli (transformados con un plásmido portando FCEb) con el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Inc, no. de catálogo 27104) . Las muestras fueron preparadas usando un BIGDYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT (Applied Biosystems, no. de catálogo 403051) para análisis en un sistema de secuencia de ADN (Applied Biosystems, modelo #373A) . Las secuencias de traslape fueron generadas mediante avance de los cebadores. Los datos de la secuencia de ADN fueron analizados usando el software SEQUENCHER™ (Gene Codes Corporation, 640 Avis Drive, Suite 300 Ann Arbor, Michigan 48108, no. de catálogo SQA3.1) .

Ejemplo 3 - PCR inverso para amplif cación de secuencias de ADN i) Diseño del cebador de la secuencia del fragmento de FCEb de 1.5 kb para PCR inverso Los cebadores fueron diseñados de la secuencia del fragmento de gen de FCEb 1.5 kb obtenido en el Ejemplo 2. Los cebadores de SEQ ID NOS : 4 (nucleótidos 1184 a 1204 de SEQ ID NO:3) y 5 (nucleótidos 1070 a 1090 de SEQ ID NO:3) fueron usados para la primera amplificación; y los cebadores de las SEQ ID NOS: 6 (nucleótidos 1413 a 1434 de SEQ ID NO: 3) y 7 nucleótidos 375 a 394 de SEQ ID NO:3) fueron diseñados para amplificar un fragmento interno al fragmento generado con los cebadores de SEQ ID NOS : y 5. ii) Preparación de la plantilla. La plantilla fue preparada mediante digestión de 1 g de ADN genómico de bovino con 40 U de Eco I, BamH I, Hind III y Sac I (New England BioLabs Inc., 32 Tozer oad, Beverly, MA 01915, USA, no. de catálogo s R0101S, R0136S, R0104S, R0156S) en reacciones de 100 µ? separadas a 37° C por la noche. Después de digestión, las enzimas fueron inactivadas por incubación a 80° C por 10 minutos. El ADN fue diluido a una concentración de 1 g/ml en agua, y después incubado con 30 U de ligasa de ADN T4 (Promega Corporation, no. de catálogo M1801) y solución amortiguadora de ligasa IX en un volumen de 1 mi por 16 horas a 16° C. A esta baja concentración, la unión intramolecular es favorecida, generación de círculos de ADN. Después de la unión, el ADN fue limpiado con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen Inc., no. de catálogo '28104) y eluido en un volumen final de 30 µ? de 10 mM Tris. El volumen fue reducido a 10 µ? por evaporación. iii) Reacción en cadena de Polimerasa. Alícuotas de cinco µ? de ADN ligado de cada digestión (que correspondió a alrededor de 300 ng de ADN) fueron usados como plantilla en PCR. Las mezclas de reacción contenían IX LA PCR BUFFER II (Pan Vera Corporation, 545 Science Drive, Madison, WI 53711 USA, no. de catálogo RR002M) , 2.5 mM de MgCl2, 1.6 mM de dNTPs (Pan Vera Corporation, no. de catálogo RR002M) , 0.2 µ? de cebador de SEQ ID NO: 4, 0.2 µ? cebador de SEQ ID NO: 5, 1.25 U TAKARA LA TAQ POLIMERASA (Pan Vera Corporation, no. de catálogo RR002M) en agua a 25 µ? . Después de un paso de desnaturalización inicial de 3.0 minutos a 96° C, el ciclo de RPC, que fue repetido treinta y cinco veces, consistiendo de (1) un paso de desnaturalización de 30 segundos a 94° C; (2) un paso de plantilla de 15 segundos a 61° C; y (3) un paso de extensión por 7 minutos a 68° C; seguido por un paso de extensión final por 5 minutos a 72° C. Un µ? de productos de amplificación fueron usados directamente para 30 ciclos de amplif caciones doblemente anidadas con los cebadores de SEQ ID NOS : 6 y 7 en las mismas condiciones como se describió excepto que el volumen de reacción fue de 50 µ?. Quince µ? de los productos de las amplificaciones anidadas primera y doble fueron corridas en un gel de agarosa 0.7%, el cual fue después teñido con bromuro de etidio, y visualizado bajo luz ultravioleta. Los productos generados de la amplificación de ADN digerido con Sac I fueron seleccionados para análisis porque la primera reacción de amplificación resultó en una simple banda ligera de aproximadamente 7.5 kb, y la amplificación anidada resultó en ADN mayor de tamaño ligeramente menor como se esperaba. El producto de la amplificación anidada fue clonado y secuenciado como se describió arriba. El fragmento de ADN obtenido (SEQ ID NO: 8) tiene homología significante al FCE humano (Bell y colaboradores, 1986; No. de acceso al GenBank X04571) como está indicado por investigadores de bases de datos de ADn y proteína para usos similares versión 2.0 del algoritmo de BLAST (Altschul y colaboradores, 1990) . El fragmento abarca 483 nucleótidos de intrón, exón 19, el intrón de 1,320 pares base identificado previamente, exón 20, un intron 5 Kb, y 158 nucleótidos de exón 21; así, este fragmento contiene secuencias homologas a las secuencias previamente identificadas más secuencias adicionales, incluyendo aquellas que codifica el resto de la proteína de FCEb madura.

Ejemplo 4 - Método de Southern para determinar el número de copias del gen de FCE en el genoma bovino . i) Transferencia de ADN a una membrana de nailon. Para determinar el número de copias del gen de FCE en el genoma bovino, fue hibridizado un manchado de Southern de ADN genómico bovino con el fragmento de SEQ ID NO:3. Brevemente, 35 µg de ADn genómico bovino fueron digeridos por la noche con enzimas de restricción BamH I, EcoR I, Hind III, Sac I y Xba I (New England BioLabs Inc., no. de catálogo s R0136S, R0101S, R0104S, R0156S, R0145S) en reacciones separadas. El ADN digerido fue separado en un gel de agarosa 0.7% en 30 V por 16 horas, y el gel fue teñido. Después de que el gel fue fotografiado, el ADN fue depurado sumergiendo el gel en HCl 0.2 N por 10 minutos, y después desnaturalizado en NaCl 1.5 M/NaOH 0.5 N con tres lavados de 15 minutos con agitación suave. El gel fue después desnaturalizado en NaCl 1.5 M/Tris-HCl 1 M (pH 7.5) con tres lavados de 10 minutos. El ADN fue entonces transferido a una Membrana de Nailon cargada positivamente (Roche Molecular Biochemicals, no. de catálogo 1 417 240) mediante capilaridad hacia arriba con 10X SSC como la solución amortiguadora de transferencia. Después de 24 horas, la membrana fue colocada entre el papel manchado y puesto en el horno a 80° C por 3 horas. ii) Preparación de la sonda. Veinte cinco ng del fragmento de SEQ ID NO: 3 fueron etiquetados con 50 µ?? de a32PdCTP (Amersham Pharmacia Biotech, 500 Morgan Boulevard, Baie d'Urfe, QC H9X-3V1, Canadá no. de catálogo PB 10205-250 uCi) usando un kit de etiquetado aleatorio (Roche Molecular Biochemicals , no. de catálogo 1 004 760) . La sonda fue purificada usando la columna NUC-TRAP (Stratagene, 11011 Morth Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, no. de catálogo 400 701) . iii) Pre-hibridización, hibridización, lavados y autorradiografxa. La membrana fue pre-humedecida en 2X SSC por 15 minutos. La Pre-hibridización se llevó a cabo a 42° C por 1 hora en un volumen de 10 mi de formamida desionizada 50%, SDS 1%, NaCl 1 M, sulfato de dextrano 10%, y 1 mg de ADN de esperma de salmón desnaturalizado en un horno de hibridización rotatorio. La sonda fue después adicionada a la solución amortiguadora de pre-hibridización y la hibridización se llevó a cabo por 12 horas a 42° C. La membrana fue lavada dos veces en 100 mi de 2X SSC/ SDS 1% a temperatura ambiente por 30 minutos; dos veces en 200 mi de 0.2X SSC/SDS 0.1% a 60° C por 1 hora; y dos veces en 200 mi de 0.1X SSC/SDS 0.1% a 60° C por 30 minutos. La membrana fue expuesta a película KODAK BIO-MAX MS (Kodak Canadá, 3500 Eglinton Avenue West, Toronto, ON M6M 1V3, Canadá, no. de catálogo 1435726) por tres días.

Ejemplo 5 - Aislamiento de ADNc. Para confirmar que las secuencias genómicas obtenidas fueron transcritas, el ADNc correspondiente fue clonado. Un 9 de AR m de riñon de bovino (Clontech, 1020 East Meado Circle, Palo Alto, CA 94303-4230, USA, No. de catálogo 6824-1) fue transcrito inverso con 10 pmol del cebador de SEQ ID NO: 14 en una reacción conteniendo la solución amortiguadora de transcripción inversa IX, 10 mM de DTT, 1 mM dNTP mezcla, 40 U de inhibidor de ARNasa y 15 U de transcriptasa inversa de Thermoscript (Life Technologies, no. de catálogo 11146-024) por 1 hora a 55° C. La transcriptasa inversa fue inactivada a 85° C por 5 min, fueron adicionados 100 U de ARNasa H, y la reacción fue incubada a 37° C por 20 minutos y después calentada a 70° C por 10 minutos. El ADNc fue limpiado con el kit de purificación de PCR QIAguick (Qiagen Inc., no. de catálogo 28104). Se usaron cinco µ? de la reacción de transcripción inversa como plantilla en una reacción de PCR conteniendo solución amortiguadora PCR IX (conteniendo 1.5 mM de MgCla) , 0.2 mM de cada d NTP, 0.4 µ? de cebador de SEQ ID NO: 16, 0.4 µ? de cebador de SEQ ID NO: 14, y 0.625 U TARARA Taq de ADN POLIMERASA (Pan Vera Corporation, no., de catálogo TAKR001B) y agua a 25 µ? . Después de un paso de desnaturalización inicial a 94° C por 4 minutos, el ciclo de RPC, que fue repetido cinco veces, consistió de: (1) un paso de desnaturalización de 30 segundos a 94° C; (2) un paso de plantilla de 30 segundos a 59° C; y (3) un paso de extensión por 30 segundos a 72° C; seguido de un paso de extensión final por 10 minutos a 72° C. Quince µ? fueron cargados en una gel agarosa 1.8%, la cual fue después teñida con bromuro de etidio, y visualizada bajo luz ultravioleta. Fueron observados varios productos de la reacción en el gel de agarosa. Fue cortada una banda de ligeramente más de 400 bp del gel, purificada y el ADN fue usado como plantilla para dos reacciones de PCR separadas: una con los cebadores de SEQ ID NOS: 16 y 12 como cebadores de adelanto e inversos, respectivamente; y el otro con los cebadores de SEQ ID NOS: 15 y 14 como cebadores de adelanto e inversos, respectivamente. Las condiciones fueron las mismas que arriba excepto que solamente se realizaron 35 ciclos. Los fragmentos obtenidos fueron clonados y secuenciados (SEQ ID NOS: 17 y 18) y las secuencias se encontraron para ser 98% homologas a las secuencias genómicas correspondientes usando la versión 2 del algoritmo de BLAST (Altschul y colaboradores, 1997) .

E emplo 6 - Sobreexpresión de la proteína madura de FCE bovina en E. coli y P. pastoris. i) Amplificación de las secuencias que codifican para la protexna de FCE bovina madura con el intrén. Para generar la secuencia para sobreexpresión de la proteína de FCE bovina madura, ha sido removido el intrón 5 kb que separa esta secuencia. La secuencia que codifica la terminación-N de la proteína fue amplificada con los cebadores de SEQ ID NOS : 6 y 12 , mientras que la secuencia que codifica el término Carboxi de la proteína fue amplificado con los cebadores de SEQ ID NOS: 13 y 14 en una reacción separada. Las cinco unidades de Pfu POLIMERASA DE ADN (Stratagene, no. de catálogo 600153) fue usada en la presencia de 1.5 mM de MgCl2 por un paso de desnaturalización inicial de 4 minutos a 94° C, seguido por el ciclo de RPC, el cual fue repetido treinta veces y consistió de: (1) un paso de desnaturalización de 30, segundos a 94° C; (2) un paso de plantilla de 30 segundo a 57° C; y (3) un paso de extensión por 30 segundos a 72° C; seguido de un paso de extensión final por 10 minutos a 72° C. Las reacciones de PCR fueron corridas en un gel de agarosa 1.8%, teñido con bromuro de etidio, y los productos fueron purificados usando el kit de Extracción de Gel QIAquick. (Qiagen Inc., no. de catálogo 28704) y 1 µ? de cada producto fue usado como plantilla para la síntesis de un enlace estándar único de los dos fragmentos. Esto fue efectuado por amplificación con los cebadores de SEQ ID NOS : 6 y 15 (que traslapa la extremidad 3' del fragmento terminal-N y la extremidad 5' del fragmento carboxi) en la dirección adelantada. El producto estandarizado único fue limpiado con el kit de purificación de PC QIAquick (Qiagen Inc., no. de catálogo 28104) y eluido en 50 µ? . Un µ? del eluente fue usado como plantilla para amplificación con los cebadores de SEQ ID NOS: 6 y 1 . El producto 292 bp fue purificado de un gel de agarosa 1.5% y clonado en vector de clonación pGEMT-EASY TA (Promega Corporation, no. de catálogo A1360) como se describió en el Ejemplo 2. ii) Construcción del vector de expresión E. coli Un número de vectores de expresión E. coli están disponibles comercialmente, y pueden ser usados para producir FCEb recombinante . Aquí, la construcción fue preparada con el vector pQE40 (Qiagen Inc., no. de catálogo 32915), el cual está basado en el sistema de transcripción-traducción de promotor T5 y está diseñado para expresión de la proteína (DHFR) -fusión de reductasa dihidrofolato de murina la cual protege péptidos cortos como FCE de proteolisis. El represor lac reprime al promotor T5, sin embargo, la adición de isopropilo-J3-D-tiogalactosida (IPTG) inactiva al represor lac, induciendo subsecuentemente la expresión de la proteína recombinante . Las secuencias que codifica la proteína de FCE madura y clonada en el vector clonado pGEMT-EASY TA (Promega Corporation, no. de catálogo A1360) fueron amplificadas con los cebadores de oligonucleotidos de SEQ ID NOS: 18 y 19. Los cebadores fueron diseñados para contener sitios de restricción apropiados (Sph I para el cebador de la SEQ ID NO: 18 y Hind III para el cebador de SEQ ID NO: 19) para facilita la clonación del producto resultante en pQE40. El cebador de SEQ ID NO: 18 también contenía secuencias de codificación para un sitio de reconocimiento para el Factor Xa. El producto amplificado fue digerido con Sph I y Hind III y enlazados en pQE40 divididos similarmente . iii) Transformación de E. coli y expresión de FCEb El constructo pQE40::FCEb es usado para transformar las células E. coli M15 competentes [pRep4] (Qiagen Inc., no. de catálogo 34210) mediante el método de choque térmico (Sambrook y colaboradores, 1989) . Después las células con colocadas en LB-agar conteniendo 25 g/ml de canamicina y 100 g/ml de ampicilina y crecidas por la noche a 37° C. Para identificar los clones con niveles altos de expresión, colonias únicas de transformantes son sacadas en 1.5 mi de medio LB con antibióticos como arriba. Estos cultivos pequeños son crecidos por la noche y son usados para inocular 10 mi de medio LB con antibióticos. Estos cultivos son después crecidos a 37° C por 30 minutos con agitación vigorosa hasta que el OD6oo alcanza 0.5-0.7. El IPTG es adicionado a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de la proteína recombinante y los cultivos son crecidos por unas 4-5 horas adicionales. Las células son cosechadas por centrifugación a 1500 RP por 10 minutos, resuspendidas en 400 µ? de solución amortiguadora de célula lisis, y purificado con Ni-NTA (Qiagen Inc., no. de catálogo 30210) . La proteína His-etiquetada recombinante es purificada con columnas Ni-NTA (Qiagen Inc., no. de catálogo 30210) y la cantidad de proteína producida es estimada por SDS-PAGE y manchado de Western. Los clones de expresión alta así pueden ser usados para estabilización de parámetros de expresión, probando la purificación de protocolos, y para producción de la proteína recombinante en gran escala. iv) Construcción del vector de expresión P. pastoris Las secuencias que codifican para la proteína de FCE de bovino maduras y apropiadas para inserción en los vectores de expresión P. pastoris fueron generados por RPC. Fueron preparados dos constructores para expresión extracelular, 2 designados como' "ExtrStop" y "ExtraTag" . LA construcción Extrastop fue generada con cebador de FCEb alfaA adelantado (SEQ ID NO.-20) y FCEb alfaA&ZB inverso (SEQ ID N0:21) . La construcción ExtraTag fue generada con el cebador de FCEb alfaA adelantado y el cebador inverso alfa AFXa&mycHIS (SEQ ID NO:22) . Estos cebadores contienen sitios de reconocimiento para enzimas de restricción para facilitar la clonación de los productos PCR resultantes en vectores de expresión P. pastoris (sitio Xho I en el cebador adelantado y sitio Xba I en los cebadores inversos) . Estos cebadores fueron usados para amplificar las secuencias de codificación de proteína de FCE bovina madura preparadas como se describió previamente. La POLIMERASA de ADN AmpliTaq (Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City CA, 94404, USA, no. de catálogo N808-0160) fue usado en un ciclo RPC, el cual fue repetido treinta y cinco veces, consistiendo de: (1) un paso de desnaturalización por 1 minuto a 94° C; (2) un paso de plantilla de 1 minuto a 65° C; y (3) un paso de extensión final por 4 minutos a 72° C. Los productos PCR fueron purificados de gel agarosa 1.5% y clonados en un vector de clonación pGE T-EASY (Promega Corporation, no. de catálogo A1350) para propagación de la construcción en E. coli. Para transferir la secuencia de codificación de FCEb en un vector de expresión P. pastoris, las construcciones fueron digeridas fuera del pGEMT con Xho I y Xba I (New England BioLabs Inc., no. de catálogo s R0146S, R0145S) , el gel purificado, y enlazado en un vector pPICZaA digerido similamiente (Invitrogen Corporation, 3985 B Sorrento Valley Blvd. San Diego, CA 92121 USA, no. de catálogo V195-20) . El ADN enlazado fue usado para transformación competente de E. coli MAX Efficiency®DH5a™ Competent Cells (Life Technologies, no. de catálogo 18258-012) y las transformaciones resultantes fueron separadas por exclusión mediante PCR para la presencia de las construcciones deseadas. El ADN plásmido fue purificado y fue usado para transformas el P. pastoris. v) Transformación de P.pastoris y expresión de FCEb Las células de P. pastoris son preparadas por inoculación de 50 mi de medio YPD fresco (50 mi) con 1 a 5 mi de un cultivo por la noche de variedad GS115 (Invitrogen Corporation, no. de catálogo K1710-01) , y crecimiento en 28° C con agitación que el cultivo alcanza un OD6oo de 1.2-1.5 (alrededor de 6 horas) . Las células de 20 mi de cultivo con una OD60o igual a 1.5 son cosechadas por centrifugación, lavadas con 10 m de Tris, mM de EDTA, Lic. 0.1 L, y solución amortiguadora de ditiotreitol 0.1 M (pH 7.4), y resuspendidas en 1 mi de solución amortiguadora TE/Lic./DTT. La suspensión es incubada a 30° C por 1 hora; lavada una vez con 1 mi de agua de hielo-fría y una vez con 1 mi de sorbitol 1 M de hielo-frío; y resuspendida en 160 µ? de sorbitos de hielo- frío para obtener una concentración de célula de alrededor de 1010células/ml . La construcción de la expresión pPICZa::FCEb (5 a 10 pg) , linearizados previamente con BstX I (New England BioLabs Inc., no. de catálogo R0113S) , es mezclada con 80 µ? ' de células y colocado en cubetas de electroporacion enfriadas (distancia inter electrodo 0.2 cm) en hielo por 5 minutos. Las células son pulsadas en 1.5 kV, 20 pF, 200 O, con un GENE PULSER (Bio-Rad Laboratories, Ltd., 5671 McAdam Road, Mississauga, ON L4Z 1N9, Canadá, no. de catálogo 165 2105) . Un mi de sorbitol 1 M de hielo-fría es adicionado a la cubeta y la mezcla resultante incubada a 30° C por 1 a 2 horas. Los transformadores resistentes de Zeocin son seleccionados en agar YPD conteniendo 100 pg/ml de zeocin y sorbitol 1 M. La biomasa es producida a partir de clones resistentes de zeocin mediante crecimiento aislado en caldo de BMGY a 30° C, 300 rpm por 24 horas. Las células son cosechadas mediante centrifugación, resuspendidas en medio de inducción (BMMY) , e incubadas por unos 6 a 12 días más, con la adición de metanol soluble en una concentración de 0.5% cada 24 horas. Las alícuotas del cultivo son recolectadas y almacenadas a -20° C hasta que se requieren para análisis. vi) Purificación de las proteínas expresadas con resina de afinidad Ni-NTA Las proteínas etiquetadas son purificadas usando Ni-NTA agarosa (Qiagen Inc., no. de catálogo 30210). Los iones de Níquel inmovilizados en perlas de agarosa magnética NTA en E. coli y P. pastoris que codifica para 6 residuos de histidina consecutivos (etiqueta 6X) en la Terminal de carboxi de la proteína recombinante (en la terminación-N para el vector E. coli) . Una alícuota de 3 mi de resina Ni-NTA (un 50% de lodo en etanol) es lavado 4 veces con 5 volúmenes de (15 mi) de una solución amortiguadora de lisis de célula (300 mM de NaCl y 10 m de imidazol en 50 mM de NaH2P04, pH 8.0) . La resina es resuspendida en 3 mi de solución amortiguadora de lisis de célula y el pH ajustado a 8.0 con NaOH 0.2 M. La proteína purificada es obtenida mediante mezclado de 1 mi de células E. coli y P. pastoris suspendidas con 100 µ? de resina lavada. Las muestras son incubadas por 30 minutos a 4° C con mezclado suave, y después lavadas dos veces con 500 µ? de solución amortiguadora de lavado (300 mM de NaCl y 20 mM de imidazol en 50 mM de NaH3P04, pH 8.0). La proteína purificadas son eluidas del lodo con 100 mi de una solución amortiguadora de elusión (300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol en 50 mM de NaH2PO, pH 8.0) . La etiqueta His del FCEb producido en E. coli o P. pastoris es removido mediante hendidura con el Factor Xa (ne England BioLabs Inc., no. de catálogo P80108) y la proteína de FCEb es nuevamente lavada con la resina de afinidad Ni-NTA (solamente la etiqueta His enlazará la resina) . La actividad biológica de las proteínas recombinantes es evaluada después en un ensayo de proliferación de célula/síntesis de ADN.

Ejemplo 7 - Ensayo de proliferación de células/síntesis de ADN Los fibroblastos bovinos fueron aislados de tej ido conectivo de músculo esqueletal , y crecidos a un nivel deseado de confluencia en 1 mi de ME (Life Technologies, no. de catálogo 23700) conteniendo 10% de suero de caballo (HyClone Laboratorios, Inc., 1725 S. HyClone oad, Logan, UT 84321, USA, no. de catálogo SH30074.03) y bicarbonato de sodio en placas de 24 pozos. El FCEb recombinante o fracciones de proteína conteniendo FCEb fueron adicionados al medio y las células fueron cultivadas por 18 horas a 39° C. El FCE humano recombinante (Sigma, 3050 Sprice Street, St-Louis, MO, USA, no. de catálogo E9644) sirvió como un control positivo y ninguna adición como un control negativo. Un Ci/ml de timidina tritiada (Amersham Pharmacia Biotech, no. de catálogo TRA310-250 Ci) fue adicionado a cada pozo y el cultivo incubado por otras 18 horas a 39° C. Después de remoción del medio, las células fueron lavadas dos veces con 200 µ? de PBS y después separado con 0.1% de tripsina en un volumen de 200 µ? por alrededor de 30 minutos a 39° C. Después de la ruptura de células por paso en y hacia fuera de las puntas de la pipeta, fueron removidos 125 µ? para conteo de células con un hemacitómetro y a las remanentes, fue adicionado 375 µ? de TCA 20% frío para precipitar por 20 minutos . Las células fueron entonces transferidas a tubos centrífugos de 1.5 mi y cada pozo fue lavado con 200 µ? de PBS lo cual fue adicionado al tubo apropiado. Los tubos fueron centrifugados por 15 minutos a 14000 rpm y el sobrenadante fue transferido a un frasco brillante. El extruído fue lavado con 200 µ? de TCA 10% y re-centrifugado. El sobrenadante fue transferido al mismo frasco brillante, conteniendo así la timidina etiquetada absorbida por las células pero no incorporada en el ADN. El extruído fue solubilízado con 40 µ? de NaOH 1 N por 10 minutos y transferido a un vial de escintilación que contiene 75 µ? de HC1 1 N, y así que contiene la timidina etiquetada que fue incorporada en el ADN. El brillo fue adicionado a todos los frascos que fueron contados por 1 min/muestra en un contador de escintilación (Beckman Coulter Inc., 4300 N. Harbor Boulevard, P. 0. Bos 3100, Pullerton, CA 92834-3100, USA, model # LS 6001C) .

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DOCUMENTOS DE PATENTES Barr, P.J., Merryweather, J.P., Mullenbach, G.T., Urdea, m.S. and Valenzuela, P. Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof. Patente de EUA No. 5,096,825, registrada en marzo 17, 1992. Buret, A.G., Gall, D., Hardin. J.A. and Olson, .E. Use of epidermal growth factor as a gastrointestinal therapeutic agent. Patente de EUA No. 5,753,622 registrada en Mayo 19, 1998. Langrehr, J.S. Feed fortifier and enhancer for preruminant calves and method of using same. Patente de EUA No. 5,785,990, registrada en Julio 28, 1998. Wilson, T.J.G., Tivey, D.R., Smith, M.W. , James, P.S. and Peters, T.J. Publicación internacional No. O 88/04180, publicada en Junio 16, 1988. Todas las publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece esta invención. Todas las publicaciones están incorporadas aquí por referencia a la misma extensión como si cada publicación individual fuera indicada específica e individualmente para ser incorporada por referencia.

Los términos y expresiones en esta especificación están usados como términos de descripción y no de limitación, a menos que específicamente de otra manera se defina aquí. No hay intención, en el uso de los términos y expresiones, de excluir equivalentes de las características ilustradas y descritas, estando reconocido que el alcance de la invención está definido y limitado solamente por las reivindicaciones que siguen. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico de bovino.
2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 9; b) una secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO:11; c) una secuencia de aminoácido f ncionalmente equivalente que tiene por lo menos 80% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 9 y d) una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 55% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 85% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 9.
4. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 90% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 9.
5. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 95% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO:9.
6. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 99% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 9.
7. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 60% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
8. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porgue el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalraente equivalente que tiene por lo menos 65% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO : 11.
9. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 70% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
10. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 75% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO:11. 11. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 80% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO:
11.
12. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado, porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 85% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO : 11.
13. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 90% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
14. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 95% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO : 11.
15. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 99% de homología a la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
16. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 8; b) una secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 10; y c) una secuencia de nucleotido funcionalmente equivalente que tiene por lo menos 75% de homología a la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO : 8 o a la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 10.
17. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotido que tiene por lo menos 80% de homología a la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.
18. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotido que tiene por lo menos 85% de homología a la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO:10.
19. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotido que tiene por lo menos 90% de homología a la secuencia de nucleotido descrita en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.
20. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 95% de homología a la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.
21. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 99% de homología a la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.
22. Un fragmento de un ácido nucleico aislado que codifica un polipeptido para factor de crecimiento epidérmico bovino, caracterizado porque el fragmento comprende una secuencia de nucleótido funcionalmente equivalente como la secuencia de nucleótido descrita en SEQ ID NO: 10.
23. Un fragmento de polipeptido aislado para factor de crecimiento epidérmico bovino, caracterizado porque el fragmento comprende un polipéptido funcionalmente equivalente como la secuencia de aminoácido descrita en SEQ ID NO: 11.
24. Un constructo de expresión capaz de dirigir la expresión de un factor de crecimiento epidérmico bovino en una célula hospedadora apropiada, caracterizado porque el constructo de expresión comprende un ácido nucleico como se establecen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21 enlazada operablemente a secuencias de control compatibles con la célula hospedadora.
25. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21.
26. Una célula hospedadora caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 21, tal que la célula pueda expresar un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico bovino codificado por el ácido nucleico.
27. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la célula es seleccionada de Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoder a reesei, Mucor míehei, Kluyverromyces lactic, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis, una célula de planta y una célula mamxfera.
28. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula es Escherichia coli .
29. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula es Pichia pastoris.
30. Un aditivo de alimento caracterizado porque comprende una preparación seleccionada del grupo que consiste de : a) un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico bovino codificado por un ácido nucleido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21; b) un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico bovino codificado por un ácido nucleido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21, en donde el polipéptido para factor de crecimiento epidérmico bovino está en combinación con ingredientes inertes o activos; c) un microorganismo o un tejido de planta, o una célula de mamífero, en donde el microorganismo, el tejido de planta o el tejido mamífero expresa un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico de bovino codificado por un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21; y d) un medio de cultivo o un extracto obtenido del microorganismo, el tejido de planta o el tejido mamífero, en donde el medio de cultivo o el extracto contiene un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico de bovino codificado por un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21.
31. El aditivo para alimento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el microorganismo es seleccionado de Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyverromyces lactic, Pichia pastoris, Saecharomyees cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis ? Bacillus licheniformis.
32. El aditivo para alimento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porgue el microorganismo es Bscherichia coli.
33. El aditivo para alimento de conformidad con la ' reivindicación 31, caracterizado porque el microorganismo es Pichia pastoris.
34. Una composición de alimentó caracterizado porque comprende un relleno alimenticio en combinación con un polipéptido de factor de crecimiento epidérmico bovino, o el relleno alimenticio tratado con un polipéptido de factor de crecimiento epidérmico bovino de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 15.
35. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porgue el polipéptido de factor de crecimiento epidérmico bovino está en la forma de un polvo o un liquido.
36. La composición de alimento de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el relleno alimenticio es seleccionado del grupo que consiste de maíz, grano, sorgo, trigo, cebada, avena, harinas de proteína vegetal, pasto, heno, forraje, y silaje de maíz.
37. Un método para producción de un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento epidérmico bovino caracterizado porque comprende los pasos de: a) cultivo de una célula hospedadora comprendiendo un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21 bajo condiciones favorables a la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico; y b) recuperación del polipéptido codificado de la célula hospedadora, el medio de cultivo comprendiendo la célula hospedadora, o un extracto obtenido de la célula hospedadora.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la célula hospedadora es seleccionada de Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoder a reesei, Mucor miehei, Kluyverromyces lactic, Plchia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia ' col!, Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis, una célula de planta y una célula de mamífero.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la célula hospedadora es Escherichia coli .
40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la célula hospedadora es Pichia pastoris.
41. Un método caracterizado porque es para producción de una planta que exprese un ácido nucleico de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 21, por introducción de ácido nucleico en una célula de la planta para que el ácido nucleico se vuelva incorporado en el genoma de la célula de la planta.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la planta es seleccionada de cánola, frijol de soya, maíz y papa.
43. El uso de un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico de bovino para administración a un animal para mejorar el crecimiento del animal.
44. El uso de conformidad con la reivindicación 43, en donde el polipéptido es seleccionado de cualquier polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 15.
45. El uso de conformidad con la reivindicación 44, en donde el animal es seleccionado de un cerdo, un lechón, una vaca, un becerro, una cabra, un chivo, una oveja, y un cordero .
46. El uso de conformidad con la reivindicación 45, donde el animal es una vaca o un becerro .
47. El uso de un polipéptido para factor de crecimiento epidérmico de bovino para administración a un animal para prevenir y tratar una infección intestinal del animal .
48. El uso de conformidad con la reivindicación 47, donde el polipéptido es seleccionado de cualquiera de los polipéptidos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 15.
49. El uso de conformidad con la reivindicación 48, donde el animal es seleccionado de un cerdo, un 1echón, una vaca, un becerro, una cabra, un chivo,, una oveja, y un cordero .
50. El uso de conformidad con la reivindicación 49, donde el animal es una vaca o un becerro.
51. El uso de conformidad con la reivindicación 49, donde la infección es seleccionada de diarrea animal, una infección de E. coli enteropatogénico, y giardiasis.
52. El uso de conformidad con la reivindicación 51, donde la infección E. coli enteropatogénica es colibacilosis entérica .
53. El uso de conformidad con la reivindicación 52 , donde el animal es un becerro .