KR20040051199A

KR20040051199A - 면역 크로마토그래피법을 이용한 돼지콜레라바이러스항체의 검출 키트

Info

Publication number: KR20040051199A
Application number: KR1020020079085A
Authority: KR
Inventors: 송재영; 최은진; 박종현; 안동준; 차상호; 권준헌
Original assignee: 대한민국(관리부서 농림부 국립수의과학검역원)
Priority date: 2002-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2004-06-18
Also published as: KR100543691B1

Abstract

본 발명은 항원-항체 반응을 이용하여 신속하게 돼지콜레라바이러스에 대한 항체의 존재유무를 검출할 수 있도록 고안된 검출 키트 및 이를 이용한 돼지콜레라바이러스 항체의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

면역 크로마토그래피법을 이용한 돼지콜레라바이러스 항체의 검출 키트 {Detection kit for the classical swine fever antibody using immunochromatography method}

종래 돼지콜레라에 대한 항체를 검출하는 방법으로는 바이러스 중화시험(virus neutralization : VN test), 효소면역항체를 이용한 엘리자(enzyme linked immunosorbent assay : ELISA) 및 라텍스(latex) 응집반응 등을 사용하였다. 그러나 이들 방법은 전문화된 인력 및 실험 장비를 필요로 하며 검출시간도 길어 야외에서 사용하기에는 부적합하였다. 구체적으로, 중화시험법은 항체량을 간접적으로 측정할 수 있지만, 돼지혈액을 채취하여 혈청성분만을 원심분리로 모은 다음 56℃에서 30분 이상 비동화하여 사용해야 하고 검사시간도 3 내지 5일이 걸릴 뿐 아니라 전문화된 인력을 필요로 하는 문제점이 있다. 또한, 엘리자 및 라텍스 응집반응을 이용한 항체검출 방법은 대량의 혈청 샘플을 처리할 수 있는 장점이 있지만, 4 내지 5시간 이상이 소요되며 전문적인 인력과 결과 판독용 장비를 필요로 하므로 양돈장에서 사용하기에는 부적합하였다.

이에 본 발명자들은 이와 같이 불편한 기존의 항체검출법을 보다 간편하고 효과적인 방법에 의해 대체하고자 노력하였으며, 그 결과 항원-항체 반응을 이용한 검출 키트를 새로 고안하여 이를 사용하면 소기의 목적이 달성될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 돼지콜레라바이러스 항체를 검출하기 위한 검출 키트를 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 이러한 검출 키트를 사용하여 돼지콜레라바이러스 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

도 1은 돼지콜레라바이러스 항원의 정제 모식도를 나타낸 것이고,

도 2는 항체검출 모식도이며,

도 3은 검출 키트 모식도이고,

도 4a는 돼지 혈액내에 돼지콜레라바이러스에 대한 항체가 존재할 경우 양성 또는 음성반응이 나타난 모식도이고,

도 4b는 돼지 혈액내에 돼지콜레라바이러스에 대한 항체가 존재할 경우 양성 또는 음성반응이 나타난 결과 사진이다.

본 발명에 따른 검출 키트의 원리를 도 3을 참조하여 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저, 스트립(strip) 형태의 니트로셀룰로스막(5)에 미리 정제된 돼지콜레라바이러스의 단백질 항원(1)을 고착시킨다. 이때, 바람직하게는 돼지콜레라바이러스의 구성단백질 중 돼지에서 항체를 가장 잘 생성하게 하는 단백질로 알려져 있어 항체검출용으로 가장 적절한 항원으로 판단되는 돼지콜레라바이러스의 E2 단백질을 사용한다. 또한, 니트로셀룰로스막의 다른 한편에는 항돼지IgG 항체(2)를 고착시킨다. 이와 같이 작제된 니트로셀룰로스막을 미리 준비된 가검물인 돼지 혈액 샘플과 접촉시킨다. 접촉은 돼지 혈액 샘플을 샘플 로딩 홀(4)을 통하여 샘플 패드(9)에 점적함으로써 이루어진다. 점적 후, 돼지 혈액 샘플은 니트로셀룰로스막(5)을 통하여 돼지콜레라바이러스 항원(1)이 고착된 곳으로 이동하게 되며, 동일한 방식으로 콘쥬게이트 패드(8)에 흡착된 항돼지IgG(anti-swine IgG) 골드(gold) 콘쥬게이트 역시 흡수 패드(3) 방향으로 이동하게 된다. 혈액 샘플내에 돼지콜레라바이러스 항체가 존재하면 이동하는 과정에 항원이 고착된 부위(1)에서 항원-항체 반응이 이루어지고, 항원-항체 결합물은 또한 항체에 감작된 골드 입자(항돼지IgG 골드 콘쥬게이트)와 반응하여 특유의 적자색을 나타내게 된다. 이에 따라, 돼지 혈액내의 항체 존재 유무에 따른 양성(항체 유) 또는 음성(항체 무)의 판정을 할 수 있다.

항원-항체 반응 및 항돼지IgG 골드 콘쥬게이트와의 반응은 완충액중에서 이루어지게 되며, 바람직하게는 트리스 완충액(TBST: Tris 50mM, NaCl 150mM, Tween 20 0.1%, pH 7.2)을 이용한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

돼지혈액의 채취 및 처리

돼지로부터 혈액을 직접 채혈하여 적혈구 제거용 필터를 통과시킨 혈청, 또는 돼지 귀정맥, 꼬리정맥 또는 도축시에 채취한 혈액을 셀룰로오스 흡수지에 흡수시킨 후 이를 500㎕의 트리스 완충액(Tris buffered saline: TBS, Tris 50mM, NaCl 150mM, pH 7.2, tween 20 0.1%)이 담겨진 투명한 튜브에 10분간 침지시켜 혈청성분만을 용출시킨 것을 검사혈액으로 사용하였다.

실시예 2

돼지콜레라바이러스 항원의 제조

돼지콜레라바이러스 ALD주의 E2 유전자를 클로닝하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 역전사중합효소 체인 반응(Reverse transcription polymerase chain reaction; RT-PCR)에 의해 증폭시키기 위하여 포워드 프라이머(forwardprimer)로서 5'-GGA TCC CGG CTA GCC TGC AAG GAA GAT-3'를 사용하고 안티센스 프라이머(antisense primer)로서 5'-GGA TCC TTC TGC GAA GTA ATC TGA-3'를 사용하였다. PCR 은 92℃에서 40초, 50℃에서 40초, 72℃에서 60초 동안 반응시키는 것을 1 사이클로하여 Thermocycler (PerkinElmer)에서 30 사이클 반응시켰으며, 아가로스 겔 전기영동에 의해 증폭된 유전자를 확인하였다. 증폭된 유전자를 전기영동하여 1021 bp 길이의 DNA 단편을 분리한 다음 pGemT (Promega) 및 Baculovirus 트랜스퍼 벡터인 pAcGP67B (Pharmingen)에 클로닝하여 pAcGP67BE2TNALD를 제작하였다. pAcGP67BE2TNALD와 바큘로바이러스 DNA(Pharmingen 사에서 구입)를 곤충세포 Sf21(Invitrogen 사에 구입)에 공형질감염 (cotransfection)시켜 E2 단백질을 발현하는 유전자 재조합 바큘로바이러스 BacE2TNALD를 제작하였다. BacE2TNALD를 곤충세포에 접종하여 6일간 배양한 후 상층액을 수확하였다. 6000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 수확하여 바이러스 불활화제(Binary ethylenimmine : BEI)로 처리하고, 인산완충액(10mM 포스페이트, pH 7.2)에 투석하고, 분주하고, 동결건조한 다음, 4℃에 보관하면서 본 발명에 따른 키트 제작에 사용하였다.

실시예 3

돼지콜레라바이러스 항원이 고착된 니트로셀룰로우스막 스트립 제조

실시예 2에서 준비된 돼지콜레라바이러스 유전자 재조합 E2 단백질이 인산완충액에 녹아 있는 용액을 분사기(BioDot, USA)에 넣고 표 1에서와 같은 조건으로 포아사이즈(pore size) 3 내지 5㎛의 니트로셀룰로스막에 분사하였다. 돼지콜레라바이러스 항원이 분사되는 위치는 니트로셀룰로스막에 혈액완충액이 침지되는 위치에서 14mm 정도 떨어진 위치이며, 대조 항원으로 사용하는 항돼지IgG 항체(구입처: Cappel 56970)의 인산완충용액을 돼지콜레라바이러스 항원이 분사된 위치에서 10mm 떨어진 위치에 표 1에서와 같은 조건으로 분사하였다. 항원이 분사된 니트로셀룰로스 막을 45℃에서 60분간 건조시킨 즉시 접착제가 도포된 폴리프로필렌 플레이트 막(backing plate)에 부착시켰다. 항돼지IgG 항체가 고정된 위치에서 7mm 상단 위치에 흡수지(밀리포어사, absorbent pad)를 위치시키고, 니트로셀룰로스막 하단에 도 3에서와 같이 콘쥬게이트 패드를 이어서 샘플패드(밀리포어사 absorbent pad)를 부착시켰다. 이를 도 3의 규격과 같이 4x60mm로 절단하여 돼지콜레라바이러스 항체검사용 키트를 완성하였다.

[표 1]

돼지콜레라바이러스 항원 분사 조건

구분	항돼지IgG 항체	돼지콜레라바이러스 항원
파라미터	농도(㎕/cm)	drop size(nm)	농도(㎕/cm)	drop size(nm)
파라미터	0.75	31.25	1	31.5

실시예 4

항돼지IgG가 흡착된 콜로이드 골드 콘쥬게이트의 제작

<항돼지IgG(anti-swine IgG : Cappel, 56970)가 흡착된 골드 콘쥬게이트의 제작>

항돼지IgG(anti-swine IgG : Cappel, 56970)를 2mM Borax buffer(Sigma,pH 9.0)에 2㎍/㎕ 농도가 되도록 투석하고 최종적으로 0.1㎍/㎕ 농도가 되도록 희석하였다. 한편, 직경 40nm의 콜로이드 골드(BBI, CG40)는 530nm에서의 흡광도가 0.957이 되도록 희석하고 pH 9.0이 되도록 100mM K₂CO₃로 조절하였다. 준비된 골드 용액에 항돼지IgG 용액을 신속히 첨가하고 (혼합비 ; 골드 용액 : 항돼지IgG 용액= 1:1 , v:v) 혼합액을 5분간 교반하였다. 1/10 volume의 10% 소혈청알부민(BSA, pH 9.0)을 첨가하고 10분간 교반하였다. 항체가 흡착된 골드 입자는 5000rpm에서 50분간 원심분리로 침전시켜 수확하고 이를 다시 1% BSA가 함유된 트리스 완충액(50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8,2)에 항돼지IgG가 첨가된 골드용액 volume의 1/10로 부유시켰다.

<항돼지IgG 골드 콘쥬게이트가 흡착된 콘쥬게이트 패드의 제작>

상기와 같이 제작된 항돼지IgG 골드 콘쥬게이트 용액 300㎕를 피펫을 이용하여 콘쥬게이트 패드(100x7mm)에 고르게 분사하여 흡착시켰다. 45℃에서 60분간 콘쥬게이트 패드를 건조시킨 후 실시예 3에서 제작한 항체 검사용 스트립에 도 3에 나타낸 바와 같이 유전자재조합 E2 단백질이 고착된 니트로셀룰로스막과 겹치게 부착시키고 여기에 샘플흡수용 패드를 부착시켰다. 완성된 스트립은 도 3에 나타낸 바와 같이 플라스틱 하우징에 넣어 사용하였다.

실시예 5

실시예 3 및 4에서 제작한 돼지콜레라 항원이 고착된 니트로셀룰로스 스트립을 사용하여 다음과 같이 항체 검출을 시도하였다.

플라스틱하우징의 샘플로딩 부위에 실시예 1에서 준비한 혈액 샘플을 50㎕ 떨어뜨리고 트리스 완충액(Tris 50mM, NaCl 150mM, 0.1% Tween 20, pH 7.2 : TBST)을 200㎕ 추가한 다음 10분간 반응시켰다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 니트로셀룰로스 스트립의 항원이 고착된 위치에 선상으로 적자색이 발현되는 동시에 항돼지IgG가 고착된 부위에 선상으로 적자색이 발현되는 경우 양성으로 판정하며 항원이 고착된 위치에는 선상으로 색깔이 발현되지 않고 항돼지IgG가 고착된 위치에만 선상으로 적자색이 발현되는 경우 음성으로 판정하였다.

실시예 6

키트를 이용한 돼지콜레라 항체의 검출

기존 검사법과의 항체검출 효율을 비교하기 위하여, 기존 ELISA 법에 의할 때 양성으로 판정된 490개의 혈청과 음성으로 판정된 139개의 혈청을 실시예 3 및 4의 방법에 따라 제작된 키트를 이용하여 검사하였다. 그 결과, 민감성은 97.6%였으며 특이성은 95%로 확인되어 기존 검사법과의 일치율이 매우 높게 나타났다 (표 2 참조).

[표 2]

항체검출 효율성 비교

	ELISA
	양성(+)	음성(-)
면역크로마토그라피법(골드 콘쥬게이트)	양성(+)	478	7
면역크로마토그라피법(골드 콘쥬게이트)	음성(-)	12	132
계		490	139
민감성 : 118/123 → 97.6%특이성 : 49/53 → 95.0%

한편, 돼지콜레라바이러스와 같은 바이러스속에 속하는 BVDV(Bovine Viral Diarrheal Virus) 및 BDV(Border Disease Virus)에 대한 항체(입수처 : 국립수의과학검역원)와의 교차반응성을 조사한 결과 BVDV 항체와는 50%의 교차반응성이 확인되었으며 BDV 항체와는 100% 교차반응성을 나타내었다(표 3 참조).

[표 3]

교차반응성 비교

	출처	No.	면역크로마토그라피법(골드 콘쥬게이트)	교차반응성(%)
	출처	No.	+ve	교차반응성(%)	-ve
Anti-BVDV	기니아피그	7	2	2	50
Anti-BVDV	돼지	3	3	0	50
Anti-BDV	기니아피그	6	6	0	100

+ve : positive : -ve : negative

한편, 기존의 ELISA 법에 의해 양성으로 확인된 총 178개의 혈장과 음성혈장 101개에 대해 혈장을 이용한 항체검출 실험을 수행한 결과 민감성 100%, 특이성 99%의 반응성을 보였다(표 4 참조).

[표 4]

혈장을 이용한 항체 검출

	ELISA
	양성(+)	음성(-)
면역크로마토그라피법(골드 콘쥬게이트)	양성(+)	178	1
면역크로마토그라피법(골드 콘쥬게이트)	음성(-)	0	100
계		178	101
민감성 : 178/178 → 100%특이성 : 100/101 → 99%

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 검출 키트를 이용하면 돼지 혈액내 돼지콜레라바이러스에 대한 항체의 존재 유무를 신속하게 검사할 수 있을 뿐 아니라 야외에서도 검사가 가능하므로 매우 유용하다. 특히, 돼지콜레라의 경우와 같이 현재 근절사업이 진행 중인 것은 농장에서 신속하게 항체를 검출할 수 있는 방법이 절실하게 요구되는데, 본 발명은 이러한 요구에 적절히 부응하고 있다.

Claims

돼지콜레라바이러스 항원 및 항돼지IgG 항체가 고착된 니트로셀룰로스막과 함께 항돼지IgG 항체 콜로이드 골드 콘쥬게이트가 흡착된 콘쥬게이트 패드를 포함함을 특징으로 하는 돼지콜레라바이러스 항체 검출용 키트.
제1항에 있어서, 돼지콜레라바이러스 항원이 돼지콜레라바이러스의 E2 단백질인 키트.
제1항에 있어서, 도 3에 도시한 구조를 갖는 키트.
제1항에 따른 키트를 돼지 혈액 및 완충액과 접촉시킴을 특징으로 하는 돼지콜레라바이러스의 항체 검출 방법.
제4항에 있어서, 완충액이 트리스 완충액인 방법.
제5항에 있어서, 완충액이 트리스 완충액(TBST: Tris 50mM, NaCl 150mM, Tween 20 0.1%, pH 7.2)인 방법.