KR20040015692A - 저장 안정성의 액상 피브리노겐 제형 - Google Patents

저장 안정성의 액상 피브리노겐 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2가 금속 이온을 포함하는 액상 또는 점액상 형태의 신규한 저장 안정성 피브리노겐 제형에 관한 것이다. 피브리노겐 제형은 기타 통상의 제형 성분을 포함할 수 있고, 특히 바람직하게는 착화제를 포함한다. 본 발명은 추가로 당해 발명의 피브리노겐 제형의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

저장 안정성의 액상 피브리노겐 제형{Storage-stable, liquid fibrinogen formulation}
본 발명은 2가 금속 이온을 포함하는 액상 또는 점액상 형태의 신규한 저장 안정성 피브리노겐 제형에 관한 것이다. 피브리노겐 제형은 기타 통상의 제형 성분을 포함할 수 있고, 특히 바람직하게는 착화제를 포함한다. 본 발명은 추가로 당해 발명의 피브리노겐 제형의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
피브리노겐은 주로 간에서 생산되는 단백질로서 혈장 단백질 함량의 약 2 내지 3%를 차지한다. 이는 응고에 중요한 역할을 한다. 혈관은 상해 또는 수술 중에 거의 항상 손상되며, 출혈이 발생한다. 혈액은 미세한 상처 부위에서 응고에 의해 굳어지며, 출혈이 멈춘다. 따라서, 응고 시스템은 인체로부터의 큰 혈액 손실을 보호한다. 응고 중에, 혈장 속에 존재하는 가용성 피브리노겐은 섬유상 불용성 피브린으로 전환되어 궁극적으로 안정한 혈전이 획득된다. 피브리노겐의 피브린으로의 전환은 트롬빈의 존재하에 발생한다. 트롬빈은 다수의 상이한 응고 인자를 포함하는 복잡한 쇄 반응 시스템을 통해 상해의 경우에 혈액 속에서 방출된다.
지혈 및 상처 치유에 대한 이의 중요성 때문에, 피브리노겐은 임상 용도에서 매우 중요하다.
응고는 피브리노겐이 부족한 경우에 부정확하게 작용한다. 이러한 결핍은, 예를 들면, 사람 혈장으로부터 분리된 피브리노겐을 투여함으로써 보상될 수 있다. 피브리노겐 결핍은 넓은 부위의 상처(예: 중화상), 파종성 정맥내 응고 또는 심각한 출혈에 의해 유발될 수 있다. 피브리노겐은 또한 피브린 밀봉재 성분으로서 매우 중요하며, 이 경우 피브리노겐은 통상 칼슘 함유 트롬빈 용액을 첨가함으로써 피브린으로 전환된다. 이러한 종류의 밀봉재는, 바람직하게는 외과 시술에서, 예를 들면, 봉합선의 보장 또는 밀봉에 사용된다. 이는 또한, 특히 간 및 비장과 같은 연조직 기관을 지혈하거나 봉합하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
단백질의 안정성은 약제 산업에서의 일반적인 문제이며, 상세하게는 각각의 단백질에 대해 신규한 용액을 필요로 한다. 단백질에 따라, 개별 제형 성분은 안정성에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 당해 제형 성분은 또한 예정된 저장 형태 및 저장 온도에 의존할 수 있다.
단백질은 특정 부형제의 첨가에 의해 흔히 동결건조되며 무수 형태로 저장된다. 이러한 경우, 건조 중에 안정성의 손실이 가능한 한 억제되어야 하며, 활성의 손실로 인해 재구성되지 않아야 한다. 재구성과 관련된 가능한 문제점은, 예를 들면, 응집성 또는 혼탁성이거나, 특히 높은 단백질 농도에서 단백질이 완전히 용해될 때까지 시간이 오래 걸린다는 점이다. 따라서, 이러한 단계를 극복할 수 있는 경우가 유리하다. 단백질 샘플의 동결은 흔히 사용되는 대안으로서, 해동 및 가온에 시간이 걸리고 0℃ 이하의 저장 온도가 보장되어야 하며 다중동결 및 해동이 통상 활성 손실과 관련된다는 결점이 있다.
따라서, 특히 피브리노겐 제형을 일반적으로 액상으로 저장하는 큰 이점은 동결건조된 제형의 재구성에 시간이 오래 걸리거나 동결된 제형의 해동 및 가온이 불필요해지기 때문에, 환자에게 활성 성분을 즉시 사용할 가능성이 있다는 점이다. 그러나, 중간체를 동결건조물로서 또는 동결된 상태로 저장한다 하더라도, 재구성되거나 해동된 피브리노겐 제형이 나중에 액상으로 존재하는 것이 장기간 동안 안정하므로 유리하다. 이는, 예를 들면, 물질이 수술 예방책으로서 재구성되지만 의학적인 고려 때문에 사용할 필요가 없는 경우에 명백하다. 단기간 동안에만 안정한 경우, 이러한 물질은 폐기되어야 하며 후일에 사용될 수 없다. 그러나, 안정성이 손실된 물질은, 당해 물질이 한정량으로만 시판되기 때문에, 특히 사람 공여자로부터 유도된 치료 물질인 경우 피해야 한다. 피브리노겐은 주로 사람 혈장으로부터 수득되기 때문에 이러한 치료 물질 중 하나이다.
피브린 밀봉재로서의 용도에서, 특히 피브리노겐은 액상 형태로 존재하는 것이 유리하다. 시판되는 밀봉재는 통상 두 가지 성분을 포함한다. 한 가지 성분은 흔히 인자 XIII 및 아프로티닌과 함께 피브리노겐을 포함하며, 다른 성분은, 흔히 칼슘 이온과 함께 트롬빈을 포함한다. 즉시 사용할 수 있는 밀봉재에 대한 재구성은 상대적으로 시간이 오래 걸리는데, 이는 특히 피브리노겐이 고농도로 존재하기 때문이다. 그러나, 예방책으로서의 밀봉재 제조의 결점은 트롬빈 함유 용액이 안정한 상태로 존재하더라도, 밀봉재의 효율이 저하되거나 당해 밀봉재가 심지어는완전히 쓸모 없어진다는 점이다.
액상 또는 점액상 형태의 본 발명의 피브리노겐 제형의 추가의 큰 이점은 시효 경화 내성이며, 이로써 실온에서조차 특정 시간 동안의 저장 가능성 및 비상 상황에서의 용도 특성이 개선될 수 있다. 이는 또한 실온에서조차 장기간에 걸쳐서 보장되는 안정성에 대해 전체 경로에 걸쳐서 저온이 보장될 수 없는 경우, 긴 이송 경로에 유리하다. 만성 피브리노겐 결핍의 드문 경우(예를 들면, 피브리노겐 합성의 유전 결함의 경우), 환자에게 피브리노겐의 연속 공급이 가능하다면 또한 유리할 수 있으며, 이를 위해 피브리노겐 용액에 대한 예비조절을 약 30℃의 저장 온도에 상응하는 체온 부근에서 수행한다. 따라서, 피브리노겐의 안정한 액상 제형은 많은 점에서 제조, 사용, 이송 및 환자에 대한 투여를 용이하게 한다.
혈장 단백질/응고 인자에 대해, 기타 성분 외에, 칼슘이 또한 액상 제형으로 사용될 수 있음을 나타내는 문헌이 있다. 이와 관련하여, 국제 공개특허공보 제WO 96/30041호 및 미국 특허 제5,925,738호를 기재할 수 있으며, 여기서 안정성 연구는 인자 VIII 및/또는 IX의 액상 제형으로 수행된다. 인자 VIII 및 IX의 활성 감소는 각각 혈우병 A 및 B를 유발한다. 인자 VIII의 경우, 예를 들면, 중쇄와 경쇄의 조합은 칼슘과 같은 2가 이온에 의존한다. 그러나, 이러한 인자에 대해 수득된 데이타는 피브리노겐에 명백하게 적용되지는 않으며, 이는 구조적으로도 기능적으로도 완전히 상이하다. 피브리노겐은 복잡한 구조를 갖는 매우 거대한 단백질이다. 이는 2개가 대칭으로 이루어진 약 340kDa의 당단백질이다. α, β 및 γ 쇄로 된 쌍은 3개의 도메인(중앙의 E 도메인과 2개의 동일한 D 도메인)을 형성하는연장된 형태(약 47nm)로 존재한다. 이러한 복잡한 구조는 피브린 형성에 없어서는 안 된다. 피브리노겐은 기질로서의, 구조적 매트릭스를 형성하는 피브린의 전구체이다. 이와는 반대로, 예를 들면, 인자 VIII 및 IX와 같은 응고 인자는 트롬빈의 형성을 위한 쇄 반응에 포함되는 기타 인자(인자 X)를 활성화하거나, 이의 활성화를 촉진시키는, 활성화된 형태의 효소 또는 보조 인자이다. 피브리노겐이 저장되는 경우, 복잡한 구조가 유지될 뿐만 아니라 피브리노겐이 공유결합적으로 가교결합된 피브린형 구조를 수득하도록 결합되지 않음이 보장되어야 한다. 또한, 선행 문헌에서, 피브리노겐과 칼슘과의 조합은 액상으로 피브리노겐 농축물의 저장 연장시 가능한 한 억제된다. 이는, 예를 들면, 시판되는 피브린 밀봉재를 사용하는 것이 명백하다. 여기서, 가교결합된 안정한 피브린의 형성에 필요한 칼슘은 저장을 위해 트롬빈 성분에 첨가되거나, 두 가지 성분으로부터 분리된 상태로 존재하되, 피브리노겐 성분과는 조합되지 않는다. 유럽 공개특허공보 제0 253 198호의 실제 실험편으로부터 나타낸, 피브리노겐, 인자 XIII, 프로트롬빈 인자, 트롬빈 억제제 및 혈장 억제제 성분을 갖는 단독 성분 밀봉재의 경우, 최적 칼슘 이온 농도는 트롬빈의 활성화에 대해서만 설정되며 사용되는 용액 중에 단지 0.5 내지 1mM이다. 칼슘 이온이 피브리노겐의 비-단백질분해성 불활성화에 대해 안정화 효과를 발휘한다는 것은 어느 문헌에도 언급되지 않았다. 또한, 밀봉재용 활성 성분의 혼합물은 바람직하게는 고형, 예를 들면, 바람직하게는 동결건조물로 존재한다. 그러나, 당해 명세서에 기재되고 청구된 피브리노겐 제형은 임의의 상당량의 프로트롬빈 인자 또는 트롬빈을 포함하지 않는다.
액상의 피브리노겐 및 칼슘 이온의 동시 연장 저장의 억제는 또한 피브리노겐을 수득하는 데 사용되는 사람 혈장 또는 이의 분획이 특히 열처리(저온 살균) 동안 칼슘 이온과 함께 혼합되는 경우에 명백하다. 여과 또는 침전과 같은 후속적인 공정 단계는 칼슘 농도를 다시 감소시켜, 최종 피브리노겐 제형 속에 존재하는 칼슘 이온의 양이, 예를 들면, 약 1mmol/l 이하로 실제로 미미하다. 이와 관련하여, 문헌[참조: 유럽 공개특허공보 제0 103 196호]을 참조하며, 여기서, CaCl25mM를 저온 살균 단계 중에 사용하되, 농도는 정맥내 주입용 제형 속에서와 피브린 밀봉재의 제조용 제형 속에서 모두 다시 감소된다. 고온에서 단기간에 걸쳐서 처리(저온 살균)하는 동안에 사용되는 용액 성분은, 물론 수개월 또는 심지어는 수년 동안에 저온 또는 실온에서 저장되는 용액 속에서 자동적으로 사용할 수 없다.
최종적으로, 국제 공개특허공보 제WO 01/48016호에는, 피브리노겐을 칼슘 이온을 포함할 수 있는 추출 완충액을 사용하여 분획 I 침전물로부터 용해시키는, 피브리노겐의 정제 방법이 기재되어 있다. 당해 방법의 기재된 단계에서, 피브리노겐의 단백질분해성 불활성화를 야기할 수 있는 플라스미노겐 불순물이 제거된다. 저장 중의 비-단백질분해성 불활성화와 관련하여 2가 금속 이온에 의해 피브리노겐의 안정화에 이르기까지 보고되어 있지 않다.
본 발명자들은, 놀랍게도, 2가 금속 이온을 첨가함으로써 0 내지 30℃의 온도 범위에서 액상으로 장기간 저장하는 동안 피브리노겐의 비-단백질분해성 불활성화가 억제되거나 감소될 수 있음을 밝혀내었다. 놀랍게도, 착화제의 동시 사용에 의해 안정성이 추가로 증가될 수 있다. 본 발명의 피브리노겐 제품은 액상에서 안정하며, 또한 피브리노겐 분자가 5개 이상인 공유결합성 피브리노겐 응집체가 실질적으로 없다.
본 발명의 목적은 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 8℃의 온도 범위에서 액상 또는 점액상 상태로 저장시 한달 이상 동안 안정한 저장 안정성 피브리노겐 제형을 제공하는 데 기초한다. 당해 목적은, 피브리노겐 외에, 농도가 100mM 이하인 2가 금속 이온 및, 경우에 따라, 하나 이상의 추가의 제형 성분을 포함하는 제형에 의해 달성된다. 추가의 양태는 특허청구범위 제2항 내지 제29항의 청구 내용에 관한 것이며 본 발명의 추가의 특징 및 이점은 바람직한 양태 및 실시예의 기재로부터 명백하다.
본 발명은 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 8℃의 온도 범위에서 2가 금속 이온 및, 경우에 따라, 하나 이상의 추가의 제형 성분을 첨가함으로써 액상 또는 점액상 상태로 저장시 한달 이상 동안 안정한 피브리노겐 제형(피브리노겐 제형)을 포함한다. 본 발명의 목적에 "안정한"이란, 피브리노겐 제형의 저장시 비-단배질분해성 불활성화로 인한 활성의 실질적인 감소가 발생하지 않고 초기 활성의 70% 이상이 유지됨을 의미한다. 이와 관련하여, 활성 감소는 문헌[참조: EuropeanPharmacopoeia (3rd edition (1997), pages 944-946]의 피브린 밀봉재 논문에 기재되어 있는 바와 같이 응고성 단백질을 측정함으로써 측정되는 것이다. 저장 온도는 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 10℃, 특히 바람직하게는 2 내지 8℃이다. 피브리노겐 제형에 대한 포지티브 안정화 효과는 또한 체온 영역의 저장 온도(37℃)에서 예상된다. 특히 바람직한 피브리노겐 제형은 3개월 이상, 특히 6개월 이상 동안 안정하다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 피브리노겐 제형은 24개월 이상 동안 안정하다. 따라서, 본 발명의 피브리노겐 제형은 바람직하게는 1개월 이상 동안 액상 또는 점액상 상태로 장기간 저장되는 경우에 바람직하게 사용될 수 있다.
피브리노겐이란, 바람직하게는, 예를 들면, 사람 혈장으로부터 수득되는 사람 피브리노겐을 의미한다. 이는 또한, 웅혈된 혈장 공여 및 개별적인 공여 둘 다로부터 분리될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개)과 같은 동물의 혈장 또는 젖으로부터 분리된 피브리노겐도 포함된다. 피브리노겐이 혈장으로부터 분리 및/또는 정제되는 경우, 통상 특히 인자 XIII(FXIII)과 같은 추가의 혈장 단백질이 동시에 정제된다. 추가의 보조 분리된 혈장 단백질은, 예를 들면, 정제 모드에 따라, 피브로넥틴(fibronectin), 응고 인자, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 혈청 알부민 및/또는 성장 인자일 수 있다. 주요 성분으로서의 피브리노겐 외에, 본 발명의 피브리노겐 제형은 또한 혈장 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 이의 예는 인자 XIII이다. FXIII는 트롬빈에 의해 활성화 형태로 전환되고 중합된 피브린 분자의 공유결합이 가능하다. 이는 피브리노겐 제형이 피브린 밀봉재에 사용되는 경우에 특히 유리하다.
그러나, 본 발명의 피브리노겐 제형에 사용되는 피브리노겐이란 또한 재조합 방법으로 제조된 피브리노겐 또는 활성 피브리노겐 유도체를 포함한다. 사람 피브리노겐을 제조하기 위한 바람직한 재조합 가능성은 특히 트랜스제닉(transgenic) 동물의 체액, 특히 젖으로부터 발생된다. 이와 관련하여 공지된 기술의 경우, 미국 특허 제5,639,940호 및 국제 공개특허공보 제WO 95/23868호를 참고할 수 있다. 재조합적으로 제조된 피브리노겐은 또한, 피브린 밀봉재의 구성을 변경시키기 위해, 예를 들면, 추가의 단백질, 특히 FXIII를 갖는 피브린 밀봉재와 같은 용도의 경우 본 발명의 피브리노겐 제형 속에서 혼합될 수 있거나[참조: 예를 들면, 국제 공개특허공보 제WO 99/56797호], 서방출용으로 의도되는 첨가물을 포함할 수 있다.
피브리노겐 제형 속에서 사용되는 피브리노겐이 트랜스제닉/재조합 제품, 혈장 및, 특히 사람 혈장으로부터 분리되는 경우, 사용되는 피브리노겐은 바람직하게는 하나 이상의 바이러스 불활성화 방법 또는 바이러스 감소 방법에 적용된다. 이는, 예를 들면, 산소의 배제, 나노여과(nanofiltration), 화학물질 첨가(예: 세제), UV 조사 또는 이의 조합하에 무수 상태에서 가열하는 저온 살균법과 같은 통상의 방법을 포함한다.
피브리노겐은 피브리노겐 제형 속에서, 바람직하게는 단량체성 단위로서 존재하지만, 바람직하게는 제품 특성에 역효과를 갖지 않는 다량체성 단위도 가능하다. 특히, 제형 성분 및 착화제 대 2가 금속 이온의 비율의 선택의 의도는 저장 중에 5개 이상의 피브리노겐 분자를 갖는 공유결합적으로 결합된 응집체의 형성을억제하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "액체"는, 바람직하게는 수용액, 즉 물을 필수적으로 포함하는 용액을 포함한다. 그러나, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 또는 이들의 혼합물과 같은 "비수성" 용액도 포함된다. 또한, "비수성" 용액과 혼합된 수용액이 포함된다. "점액상"은 물리적 또는 생화학적 변화 또는, 예를 들면, 히알루론산과 같은 제형 성분 때문에 점성인 액상 용액을 포함한다. 예를 들면, 알콜성 현탁액과 같은 비수성 현탁액도 포함된다.
피브리노겐은 본 발명의 액상 피브리노겐 제형으로 제조된 직후 저장될 수 있거나 중간체가 동결건조물로서 또는 동결된 상태로 저장된다. 본 발명의 액상 피브리노겐 제형은 환자에게 직접 사용될 수 있다.
본 발명의 피브리노겐 제형에서 2가 금속 이온은, 예를 들면, 알칼리 토금속(예: 마그네슘 및 칼슘 이온) 또는 비주류 원소(예: 아연 또는 망간 이온)일 수 있다. 칼슘 및 아연 이온이 특히 바람직하고, 예를 들면, CaCl2및 ZnCl2형태로 첨가될 수 있다. 원칙적으로, 적합한 2가 이온은 피브리노겐의 안정성을 향상시키는 이온이지만, 사용되는 농도에서 환자에게 투여시 미미한 부작용을 유발한다. 2가 금속 이온의 농도는 100mM 이하, 바람직하게는 40mM 이하, 특히 바람직하게는 0.02 내지 10mM이다. 바람직한 농도는 사용되는 2가 이온에 따라 선택되어야 한다. 따라서, 칼슘 이온의 특히 바람직한 농도는, 예를 들면, 약 1.5 내지 10mM인 반면, 아연 이온의 경우, 특히 바람직한 농도는 0.02 내지 1.5mM이다.
본 발명의 피브리노겐 제형의 바람직한 양태에서 추가로 유리한 제형 성분은 착화제이다. 이러한 착화제는, 예를 들면, 칼슘 이온과 같은 2가 이온과 결합될 수 있다. 본 발명자들은, 놀랍게도, 본 발명의 범주내에서, 안정화 2가 이온의 상당부가 착화제의 존재하에 착화된 형태로 존재할 것이 예상되더라도, 액상 피브리노겐 제형의 안정성이 이러한 착화제의 첨가에 의해 추가로 증가될 수 있음을 밝혀내었다. 이와 관련하여, 시트레이트가 특히 바람직하며, 이는 나트륨 시트레이트로서 첨가될 수 있다. 착화제는 바람직하게는 2가 금속 이온보다 높은 농도로 본 발명의 제형 속에 존재한다. 착화제는 150mM 이하, 바람직하게는 50mM 이하, 특히 바람직하게는 25mM 이하의 농도로 존재할 수 있다.
본 발명의 피브리노겐 제형은, 예를 들면, 1가 금속염, 아미노산, 동결건조 보조제, 탄수화물, 세제, 카오트로픽 시약(chaotropic agent), 억제제(예: 피브린용해 억제제 또는 피브리노겐용해 억제제), 프로테아제 억제제, 혈장 단백질, 산화방지제, 완충 물질 또는 이들의 혼합물과 같은 추가의 통상의 제형 성분을 포함할 수 있다. 이러한 첨가제는 실질적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 각종 요건을 기본으로 하여 선택된다. 첨가제는, 예를 들면, 계획된 중간체 저장(동결건조 또는 동결 상태)에 따라 선택될 수 있다. 공지된 단백질용 동결건조 보조제는, 예를 들면, 사카라이드(예: 슈크로즈 및 덱스트란), 당 알콜(예: 만니톨 및 소르비톨) 또는 아미노산이다. 당해 제형의 계획된 용도에 따라 또한 특정 제형을 결정한다. 피브리노겐의 정맥내 투여에 적합한, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 첨가제는 피브린 밀봉재로서 사용하기 위한 첨가제와 상이할 수 있다.
적합한 1가 금속염은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 몇몇 알칼리 금속염, 바람직하게는 나트륨염 및 칼륨염 또는 이들의 혼합물이다. 나트륨 이온이 특히 바람직하고, 예를 들면, 염화나트륨 형태로 존재할 수 있다. 1가 금속염의 농도는 바람직하게는 ≤300mM이다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 농도는 ≤200mM이다.
아미노산은 자연 발생 아미노산 및 이의 유도체를 모두 포함한다. 특히 바람직한 예는 중성 아미노산, 예를 들면, 글리신 및 아디프산 또는 염기성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 아르기닌) 또는 이들의 혼합물이다. 아르기닌 또는 이를 포함하는 혼합물이 특히 바람직하게 사용된다. 그러나, 아미노산 유도체, 예를 들면, 시트룰린도 사용될 수 있다.
가능한 억제제는 통상의 물질로부터 선택되는 단백질분해효소 억제제를 포함하며, 아프로티닌 또는 유사한 특이성의 억제제가 바람직하게 사용된다.
피브린용해 억제제는, 예를 들면, α-2-안티플라스민을 포함하는 안티플라스민, α-2-마크로글로불린, α-1-안티플라스민, PAI-1 및 PAI-2를 포함하는 플라스미노겐 활성화제 억제제(PAI), 트롬빈 활성화 가능한 피브린용해 억제제(TAFI), 아프로티닌(aprotinin) 및/또는 합성 물질(예: ε-아미노카프로산 또는 p-아미노메틸벤조산)을 포함한다. 피브린용해 억제제는 특히 생성된 피브린 중합체가 가능한 한 장기간 동안 안정해야 하는 경우에 유리하다.
사용될 수 있는 피브리노겐 억제제는, 예를 들면, 안티플라스민, C1 억제제 및 안티트롬빈이고, 안티트롬빈이 바람직하게 헤파린의 존재하에 사용된다.
혈장 단백질은 이미 언급한 바와 같이, 응고 인자(예: FXIII) 또는 단백질(예: 피브로넥틴), 폰 빌레브란트 인자, 혈청 알부민 또는 성장 인자일 수 있다. 이는 이미 분리된 피브로넥틴 속에서 오염성 단백질로서 존재할 수 있거나 후속적으로 피브로넥틴 제형에 첨가될 수 있다. 그러나, 혈장 단백질은 피브리노겐과 트롬빈의 동시 저장에 의해 피브린 제형이 유도될 수 있고, 피브리노겐 제형의 안정성이 보장될 수 없기 때문에 트롬빈을 함유하지 않아야 한다.
탄수화물은, 예를 들면, 글쿠코즈, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 만노즈, 트레할로즈, 락토즈, 셀룰로즈 및 전분 또는 이들의 유도체를 포함한다. 또한, 이는 혼합물 형태를 포함할 수 있다. 또한, 당 알콜, 예를 들면, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 탄수화물은 또한 본 발명의 목적을 위해 헤테로폴리사카라이드를 의미한다. 이는, 예를 들면, 특히 히알루론산과 같은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)을 포함한다.
마찬가지로, 세제는 통상의 물질을 포함하되, 바람직하게는 비이온성 세제, 예를 들면, 폴록사머(poloxamer) 또는 폴리소르베이트를 포함한다.
카오트로픽 시약은 수소결합을 파괴할 수 있는 시약을 의미한다. 우레아 및 구아니딘 또는 구아니디노 그룹 함유 첨가제, 및 관련된 화합물, 이의 혼합물 또는 카오트로픽염(예: KI)이 특히 바람직하다.
사용될 수 있는 산화방지제는 통상의 물질, 바람직하게는 아스코르브산이다.
완충제 물질은 피브리노겐 제형의 pH를 실질적으로 일정하게 조절하고 유지하는 물질이다. 바람직한 양태에 있어서, 제형의 pH는 5.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 특히 바람직하게는 6.5 내지 7.5로 조절된다. 이러한 종류의 가능한 완충제 물질의 예는 아미노산 및/또는 시트레이트, 특히 바람직한 양태로는 시트레이트이다. 마찬가지로, 기타 통상의 완충제 시스템, 예를 들면, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 포스페이트, 아세테이트, 석시네이트, 글리실글리신, 카보네이트 및 비카보네이트가 포함된다. pH의 조절 또는 보정은, 예를 들면, HCl 및 NaOH와 같은 산 또는 염기에 의해 수행될 수 있다.
이는 사용되는 양으로 환자에게 임의의 실질적인 부작용을 유발하지 않아야 하는, 사용될 수 있는 모든 제형 성분에 적용된다.
특히 바람직한 양태에 있어서, 본 발명의 피브리노겐 제형은 염화칼슘 및 나트륨 시트레이트 외에, 예를 들면, 염화나트륨 및 아르기닌을 포함한다. 추가로 바람직한 제형에 있어서, 염화칼슘, 나트륨 시트레이트, 염화나트륨 및 아르기닌 외에도, 아프로티닌 또는 C1 억제제가 또한 존재한다.
추가로 특히 바람직한 피브리노겐 제형은 실시예로부터 명백하다.
본 발명은 추가로 당해 발명의 피브리노겐 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이는 먼저 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 수득되는(분리 및/또는 정제되는) 피브리노겐을 수반한다. 이는 바람직하게는 사람 혈장으로부터 수득되지만, 동물 혈장으로부터 수득되는 것도 가능하다. 재조합성 피브리노겐은, 예를 들면, 동물 세포 배지 또는 트랜스제닉 동물의 젖의 발효 상층액으로부터 수득될 수 있다. 수득된 피브리노겐이 초기에 본 발명의 피브리노겐 제형에 상응하지 않는 용액 속에 존재하는 경우, 이는 당해 양태에 기재된 본 발명의 제형 성분, 특히2가 금속 이온을 포함하는 용액으로 대체된다. 상이한 용액의 교환 또는 동화 작용은, 예를 들면, 한외여과법, 투석법, 희석법 또는 생략된 제형 성분의 첨가법과 같은 방법으로 가능하다. 피브리노겐이 (예를 들면, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 황산암모늄 또는 글리신의 사용으로) 공지된 침전법으로 침전되는 경우, 본 발명의 2가 이온 및 추가의 제형 성분을 함유하는 용액 속에 재현탁되거나 용해될 수 있다. 피브리노겐이 동결건조물 형태로 존재하는 경우, 이는 생성된 제형이 본 발명의 피브리노겐 제형에 일치되도록 용액 속에서 재구성될 수 있다.
이러한 방식으로 수득된 본 발명의 피브리노겐 제형은 액상으로 직접 저장될 수 있다. 대안으로, 액상 제형은 또한 중간체를 동결 또는 동결건조시킬 수 있으며, 해동 또는 재구성된 후, 본 발명의 피브리노겐 제형에 상응하는 액상으로 추가로 저장될 수 있다.
본 발명의 피브리노겐 제형의 특히 바람직한 제조방법은 사람 혈장으로부터 수득되는 피브리노겐을 사용하여 수행되며 다음과 같은 주요 단계를 포함한다:
- 조악한 혈장 분획의 제조,
- 수산화알루미늄으로의 흡착,
- 바이러스 불활성화,
- 침전,
- 추가의 정제 및/또는 바이러스 불활성화 단계,
- 용액 성분을 한외여과법, 투석법 및/또는 희석법에 의해 하나 이상의 2가 금속염, 추가의 제형 성분, pH 조절제 및 농도 조절제를 포함하는 용액으로 대체,
- 여과에 의한 멸균 및
- 피브리노겐 제형을 직접 액상으로 저장하거나, 중간체를 동결 또는 동결건조시킨 후, 해동 또는 재구성을 통해 액상으로 저장.
본 발명은 추가로 당해 발명의 피브리노겐 제형의 용도에 관한 것이다. 가능한 용도는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본 발명의 피브리노겐 제형은 피브리노겐의 모든 공지된 용도에 사용될 수 있다. 본 발명의 피브리노겐 제형은 일반적으로 피브리노겐 결핍 상태의 치료에 적합하다. 이러한 결핍 상태는, 예를 들면, 주요 상처의 경우 및 넓은 부위의 화상, 약제를 통한 출혈의 병리학적 활성화[소모성 응고증, DIC(파종성 정맥내 응고증)라고도 불림], 또는 중증 간 질환(예를 들면, 간 연조직 손상으로 인해 합성이 감소되는 경우)의 경우, 심각한 출혈 후에 발생할 수 있다. 위에서 언급한 후천성 저섬유소원혈증(hypofibrinogenemias)(혈액 중 감소된 피브리노겐) 및 무섬유소원혈증(afibrinogenemias)(혈액 중 결핍되거나 크게 감소된 피브리노겐) 외에, 간에서 부재하거나 감소된 피브리노겐 합성에 의해 야기될 수 있는 희귀한 유전성 무섬유소원혈증 또는 저섬유소원혈증이 존재한다.
저섬유소원혈증 및 무섬유소원혈증의 경우, 본 발명의 피브리노겐 제형은 바람직하게는 상응하는 피브리노겐 결핍 상태를 보상하기 위해 환자에게 정맥내 주사된다. 투여량은 결핍 발생의 수준에 기초한다.
피브리노겐은 소위 피브린 밀봉재의 중요한 성분으로서 피브린 치료에 크게 중요하다. 피브린 밀봉재는 칼슘 및 FXIII의 존재하에 피브리노겐과 트롬빈의 조합시 가교결합된 피브린의 제형을 통해 최종 응고 단계를 모의한다.
의약에는 피브린 밀봉재의 다양한 가능한 용도가 존재한다. 언급할 중요한 것은 지혈, 상처 폐쇄, 유착 예방 및 상처 치유이다. 국소적인 수술중 지혈은 연조직 기관 및 심혈관 부위에서 특히 중요하다. 이러한 방식으로 중증 간 손상 후에 훨씬 심각한 출혈이 제어될 수 있다. 피브린 밀봉재는 또한 피부 상처의 폐쇄 및 고정(피부 이식 포함)과 봉합 밀봉(예: 십이지장 기부)에 사용된다. 언급될 수 있는 예는 경막형성술(duraplasty), 강 소멸 및 늑막 유출의 경감 치료용 늑막의 유착을 위한 용도이다. 피브린 밀봉재는 뼈, 연골 및 건과 같은 연접 조직의 접합에 유리하게 사용될 수 있다.
피브리노겐은 또한 피브린 매트릭스를 제조하기 위한 성분으로서 사용될 수 있다. 이러한 종류의 담체 물질은, 예를 들면, 성장 인자(예를 들면, 뼈 재생용 매트릭스로서의 뼈 유도성 단백질을 갖는다), 항생제, 소염제, 세포 증식 억제제 또는 상처 치유 촉진 첨가제와 같은 활성 성분의 서방출에 사용될 수 있다. 담체는 또한 피브린과 기타 물질과의 혼합물로 구성될 수 있다.
피브린 매트릭스는 추가로, 예를 들면, 조직 공학에서 세포 및 조직용 지지 물질 및 배양 배지로서 또는, 예를 들면, 바이오센서와 같은 이식물을 봉합하기 위한 생물 공학에서의 광범위한 가능한 용도를 갖는다.
본 발명을 추가로 다음 실시예에 의해 설명하지만, 임의의 제한적인 효과를 갖는 것으로 해석되지는 안된다.
실시예 1:
사람 혈장으로부터 피브리노겐의 제조
피브리노겐 출발물질을 수득하기 위해, 저온침전물을 NaCl/글리신 용액 속에 용해시키고, 10용적/용적% 수산화알루미늄 현탁액(Al(OH)3)을 흡착시킨다. Al(OH)3을 원심분리하여 제거한 후, 잔류하는 상층액을 글리신(최종 농도 2.45M)으로 침전시킨다. 추가로 처리하기 위해, 피브리노겐 풍부 침전물을 NaCl 용액 속에 용해시키고, 용액의 pH가 7.3으로 되도록 조절한다. 피브리노겐 용액을, 용액 1리터당 수산화알루미늄 현탁액 80㎖를 흡착시킨다. Al(OH)3을 여과 또는 원심분리하여 제거하고, 폐기시킨다. 상층액의 저온 살균을 위해, 피브리노겐 용액을 생리학적 NaCl 용액으로 OD280-320nm=48로 되도록 희석시킨다. 용액 1리터당 염화칼슘 이수화물 0.37g, 슈크로즈 1,000g 및 글리신 75g을 가하면서 당해 용액을 교반한다. pH를 7.5로 유지시킨다.
당해 용액을 +60℃로 가열하고, 온도를 10시간 동안 일정하게 유지시킨다. 이어서, 당해 용액을 냉각시킨다.
저온 살균된 피브리노겐 용액을 희석 용액(물 중 NaCl 3.5g/l; 삼나트륨 시트레이트 이수화물 6g/l)의 3배 용적과 혼합한다. 희석 용액 1리터당 글리신 90g을 교반하면서 가한다. 생성된 침전물을 원심분리하거나 여과하여 제거하고, 폐기시킨다.
상층액 1리터당 추가로 글리신 75g을 가한다. 피브리노겐 풍부 침전물을 원심분리하여 수득하고, 추가로 처리될 때까지 -25℃에서 저장한다.
플라스미노겐의 추가의 정제 및 제거를 위해, 피브리노겐 풍부 침전물을 초기에 적합한 수성 용매(NaCl 50mM; 삼나트륨 시트레이트 이수화물 20mM) 속에 용해시키고, 바람직하게는 당해 용매에 대해 투석한 후, 리간드로서의 L-리실 라디칼을 함유하는 매트릭스를 사용하여 크로마토그라피 칼럼을 통해 펌핑한다.
피브리노겐 제형을 초기에 적합한 한외여과하여 피브리노겐 함유 용액을 조절하여, 용도에 따라, 단백질 농도(OD280-320nm)=약 2 내지 200, 바람직하게는 약 20 내지 160으로 제조하고, 후속적으로 실시예 2에 기재된 제형 성분을 함유하는 용액에 대해 투석한다.
실시예 2:
피브리노겐 제형에 대한 안정성 연구
각종 제형에서의 피브리노겐의 안정성을 실시예 1에 기재한 바와 같이 제조된 사람 피브리노겐을 사용함으로써 연구한다. 이러한 목적을 위해, 각종 제형의 피브리노겐 용액(OD280-320nm=약 100)을 포함하는 용기를 30℃ 또는 2 내지 8℃에서 다양한 저장 기간(0개월, 1개월, 2개월, 3개월 및/또는 그 이상) 동안 저장한다. 적절한 저장 기간이 지난 후, 잔류하는 피브리노겐 함량을 측정한다. 이러한 목적을 위해, 응고 가능한 단백질 함량을 문헌[참조: European Pharmacopoeia (3rd edition (1997), pages 944-946]의 피브린 밀봉재 논문에 기재된 바와 같이 측정한다.
다음에 열거한 세 가지 제형에서, pH 7.2에서 NaCl 200 mM 및 10% L-Arg x HCl 외에, 나트륨 시트레이트 또는 염화칼슘, 또는 나트륨 시트레이트와 염화칼슘의 혼합물을 가한다.
제형 1: 20mM Na3시트레이트/200mM NaCl/10% L-Arg x HCl/pH 7.2
제형 2: 2.5mM CaCl2/200mM NaCl/10% L-Arg x HCl/pH 7.2
제형 3: 20mM Na3시트레이트/2.5mM CaCl2/200mM NaCl/10% L-Arg x HCl/pH 7.2
응고 가능한 단백질, 30℃에서 저장
저장 시간
0개월 1개월 2개월 3개월
제형 1 100% 93.1% 46.1% 28.9%
제형 2 100% 93.5% 79.6% 61.9%
제형 3 100% 99.7% 101.6% 92.6%
응고 가능한 단백질, 2 내지 8℃에서 저장
저장 시간
0개월 1개월 3개월 6개월
제형 1 100% 110.8% 99.4% 91.6%
제형 3 100% 110.9% 106.2% 97.5%
당해 시험은, CaCl2(제형 2)를 첨가하면 CaCl2(제형 1)를 사용한 대조군 제형에 비하여 30℃에서 저장시 피브리노겐의 현저한 안정성을 수득할 수 있음을 명확하게 나타낸다. 3개월 동안 저장한 후에도, 검출 가능한 응고 가능한 피브리노겐의 양은 여전히 대조군 제형의 양의 2배 이상이다(표 1). 안정성의 증가는 착화제 나트륨 시트레이트와 혼합된 CaCl2를 함유하는 제형(제형 3)에서 훨씬 더 현저하며, 이는 실제로 30℃에서 3개월 동안 저장한 후 대조군 제형 1에서와 같은 다수의 응고 가능한 단백질의 대략 3배를 함유한다. CaCl2및 나트륨 시트레이트(제형 3)의 안정성 효과는 보다 덜 하지만, 2 내지 8℃에서 3개월 또는 6개월 동안 저장시 대조군 제형에 비하여 여전히 검출될 수 있다(표 2). 2 내지 8℃에서 저장시 우수한 안정성이 일반적으로 예상되기 때문에, 단지 차이가 적을 것이 예상된다.
추가의 시험은 기타 제형 성분의 농도가 감소된 각종 제형에 대해 수행된다. 사용되는 피브리노겐 제형(OD280-320nm=약 134 내지 146)을 실시예 1에서 기재한 바와 비교 가능한 방식으로 제조하고, 30℃에서 각종 저장 시간(0, 1, 2 및/또는 3개월) 동안 저장한다. 적절한 저장 시간이 지난 후, 응고 가능한 단백질 함량을 측정([참조: European Pharmacopoeia, 3rd edition 1997, pages 944-946]의 피브린 밀봉재 논문 참조)하거나, 피브리노겐을 클라우스(Clauss)[참조: Clauss (1957), Acta-Haematol. 17, 237-246] 방법으로 측정한다(표 3 및 4).
제형 4: 4mM Na3시트레이트/100mM NaCl/5% L-Arg x HCl/pH 7.2
제형 5: 4mM Na3시트레이트/0.5mM CaCl2/100mM NaCl/5% L-Arg x HCl/pH 7.2
제형 6: 20mM Na3시트레이트/2.5mM CaCl2/100mM NaCl/5% L-Arg x HCl/pH7.2
제형 7: 12mM Na3시트레이트/1.5mM CaCl2/100mM NaCl/5% L-Arg x HCl/pH 7.2
응고 가능한 단백질, 30℃에서 저장
저장 시간
0개월 1개월 2개월 3개월
제형 4 100% 104.6% 73.9% 46.7%
제형 5 100% 112.5% 95.5% 91.9%
클라우스 방법에 의한 피브리노겐, 30℃에서 저장
저장 시간
0개월 1개월
제형 4 100% 50.2%
제형 5 100% 70.5%
제형 6 100% 79.5%
제형 7 100% 78.0%
당해 시험은, 염화칼슘 또는 염화칼슘과 시트레이트가 존재하는 한 대조군 제형(제형 4)과 비교한 안정성의 현저한 증가가 제형 5 내지 7에서도 역시 달성될 수 있음을 나타낸다. 또한, 클라우스 피브리노겐 시험에 따르면, 이러한 효과는 염화칼슘 및 시트레이트의 농도가 높은 경우 훨씬 우수한 경향이 있다.
본 발명에 따르면, 2가 금속 이온을 첨가함으로써 0 내지 30℃의 온도 범위에서 액상으로 장기간 저장하는 동안 피브리노겐의 비-단백질분해성 불활성화가 억제되거나 감소될 수 있다. 또한, 착화제의 동시 사용에 의해 안정성이 추가로 증가될 수 있다. 본 발명의 피브리노겐 제품은 액상에서 안정하며, 또한 피브리노겐 분자가 5개 이상인 공유결합성 피브리노겐 응집체가 실질적으로 없다.

Claims (32)

  1. 피브리노겐 외에, 100mM 이하의 농도의 2가 금속 이온과, 경우에 따라, 하나 이상의 추가의 제형 성분을 포함하며, 0 내지 30℃의 저장 온도에서 1개월 이상 동안 안정한, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  2. 제1항에 있어서, 2가 금속 이온이 칼슘 이온, 아연 이온 또는 이들의 혼합물인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2가 금속 이온이 40mM 이하, 특히 바람직하게는 0.02 내지 10mM의 농도로 존재하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가의 제형 성분 중 하나가 착화제인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  5. 제4항에 있어서, 착화제가 시트레이트인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 착화제가 2가 금속 이온보다 높은 농도로 존재하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  7. 제4항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 착화제가 150mM 이하, 바람직하게는 50mM 이하, 특히 바람직하게는 20mM 이하의 농도로 존재하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가의 제형 성분이 1가 금속염, 아미노산, 동결건조 보조제, 세제, 피브린용해 억제제, 피브리노겐용해 억제제, 프로테아제 억제제, 혈장 단백질, 탄수화물, 산화방지제, 완충 물질 및/또는 카오트로픽 시약(chaotropic agent) 또는 이들의 혼합물인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  9. 제8항에 있어서, 혈장 단백질이 인자 XIII, 피브로넥틴, 혈청 알부민, 폰 빌레브란트 인자 및/또는 성장 인자를 포함하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 염화칼슘, 나트륨 시트레이트, 염화나트륨 및 아르기닌을 포함하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 염화칼슘, 나트륨 시트레이트, 염화나트륨, 아르기닌 및 아프로티닌 또는 C1 억제제를 포함하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 염화칼슘, 나트륨 시트레이트, 염화나트륨, 아르기닌 및 알부민을 포함하는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 5.0 내지 8.0인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  14. 제13항에 있어서, pH가 6.5 내지 7.5인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 3개월 이상의 기간에 걸쳐서 안정한, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  16. 제15항에 있어서, 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 6개월 이상의 기간에 걸쳐서 안정한, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  17. 제15항에 있어서, 0 내지 30℃, 바람직하게는 2 내지 8℃에서 24개월 이상의기간에 걸쳐서 안정한, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 사용되는 피브리노겐이 하나 이상의 바이러스 불활성화 방법 또는 바이러스 감소 방법에 적용되는, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 재조합 피브리노겐이 사용되는, 피브리노겐 제형의 제조방법.
  21. 제19항에 있어서, 피브리노겐이 혈장으로부터 분리되는, 피브리노겐 제형의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 피브리노겐이 사람 혈장으로부터 수득되며, 다음과 같은 단계를 포함하는, 피브리노겐 제형의 제조방법:
    - 조악한 혈장 분획의 제조,
    - 수산화알루미늄으로의 흡착,
    - 바이러스 불활성화,
    - 침전,
    - 추가의 정제 및/또는 바이러스 불활성화 단계,
    - 용액 성분을 한외여과법, 투석법 및/또는 희석법에 의해 하나 이상의 2가 금속염, 추가의 제형 성분, pH 조절제 및 농도 조절제를 포함하는 용액으로 대체,
    - 여과에 의한 멸균 및
    - 피브리노겐 제형을 직접 액상으로 저장하거나, 중간체를 동결 또는 동결건조시킨 후, 해동 또는 재구성을 통해 액상으로 저장.
  23. 제19항에 있어서, 재구성된 후, 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형에 상응하는 동결건조물의 초기 제조가 수행되는, 피브리노겐 제형의 제조방법.
  24. 제19항에 있어서, 피브리노겐 제형의 중간체가 동결되며, 해동된 후, 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형에 상응하는, 피브리노겐 제형의 제조방법.
  25. 피브리노겐이 분리 및/또는 정제 후에 용해되어 있는 용액 성분이 제형 성분의 한외여과법, 투석법, 희석법 및/또는 첨가법에 의해 대체되거나 변경되어 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형을 생성시킴을 포함하는, 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형의 제조방법.
  26. 침전되거나 동결건조된 피브리노겐이 용액 속에서 재현탁, 용해 또는 재구성되어 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형을 생성시키는, 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형의 제조방법.
  27. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 피브리노겐 제형의 용도.
  28. 제27항에 있어서, 피브리노겐 결핍 상태 치료용 제품으로서의 피브리노겐 제형의 용도.
  29. 제27항에 있어서, 피브린 밀봉재 성분으로서의 피브리노겐 제형의 용도.
  30. 제27항에 있어서, 피브린 매트릭스 제조용 성분으로서의 피브리노겐 제형의 용도.
  31. 제27항에 있어서, 진단 조제로서의 피브리노겐 제형의 용도.
  32. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 6.0 내지 8.0인, 저장 안정성의 액상 또는 점액상 피브리노겐 제형.
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