KR20030084908A - 단백질로부터 시트레이트 및 알루미늄을 제거하는 방법 - Google Patents

단백질로부터 시트레이트 및 알루미늄을 제거하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질을 포함하는 용액의 pH를 약 7 내지 약 10으로 조정하고 이 pH가 조정된 용액을 이온의 농도가 낮은 수용액에 대해 투석여과하여 시트레이트, 알루미늄, 및 기타 다가 이온과 오염물을 단백질로부터 제거하는 방법을 제공한다.

Description

단백질로부터 시트레이트 및 알루미늄을 제거하는 방법 {METHOD TO REMOVE CITRATE AND ALUMINUM FROM PROTEINS}
생물학적 활성 단백질은 종종 인간에게 치료제로 투여된다. 이러한 단백질에는 부작용을 일으킬 수도 있는 오염물이 없어야만 한다는 것이 중요하다. 예를 들면 정맥내 투여용 및 혈장 용량의 확장제(plasma volume expander)용 용액으로 널리 사용되고 있는 정제된 인간 혈청 알부민(알부민)은 인간에게 사용이 허용되지 않는 수준의 알루미늄을 함유할 수도 있다는 것이 알려져 있다.
인간에서 알루미늄의 존재는 알쯔하이머 유형의 노인성 치매 및 신경 섬유의 퇴행과 연관되어 있다. 정맥으로 투여된 알루미늄은 조직과 뇌와 같은 기관 내에서 축적되어, 체내에서 알루미늄을 적절하게 제거할 수 없는 신장의 기능이 손상된 환자에게는 특별한 치료가 고안되어야 한다. 이러한 환자들에게서는 투석액 중의 알루미늄 오염물은 골연화증, 소적혈구 빈혈, 및 투석성 뇌질환(dialysis encephalopathy)과 관련되고 있다. 결과적으로, 정맥내 투여용으로 유럽에서 판매되고 있는 알부민은 5, 20, 또는 25% 단백질 농도의 용액 내에서 알루미늄의 수준이 200 ppb 이하가 되어야만 할 것을 규정하고 있다. 철, 납, 수은, 크롬, 구리 및 니켈과 같은 기타 금속의 부작용도 연구되어 있다.
알부민은 다수의 원인에 의해 알루미늄으로 오염되는 되는 데, 이 원인으로는 알부민 처리 동안 사용되는 규조토, 유리 용기, 점토가 충전된 탄성 함유물 및 규조토를 함유하는 심층 필터가 포함된다는 것이 알려져 있다(Quagliaro, D.A. 등, Aluminum in Albumin for Injection, Journal of Parenteral Science & Technology, 42(6), 187-190(1988)).
일부 용액은 저장 기간 동안 알루미늄 수준의 증가를 나타내며, 이는 유리 용기로부터 알루미늄이 추출된 것에 기인한 것이다. 유리 용기는 알루미늄 오염의 주된 원인인 것으로, 이러한 용기의 다수가 1 내지 5%의 알루미늄으로 이루어져 있다. 단백질 용액에서 알루미늄의 수준에 기여하는 다른 인자로는 유리 용기내에 용액을 저장하는 조건 및 단백질 용액에 존재하는 용질의 상태가 있다. 예를 들면 시트레이트 음이온과 같은 알파 하이드록시기를 가진 카르복시산은 금속 이온에 대한 우수한 킬레이팅제(chelator)이며, 알루미늄-오염 물질에 대한 용해 효과도 잘 알려져 있다.
시트레이트 이온은 항응고제인 구연산나트륨 내에서 혈장을 수집하는 과정을 포함하는 통상적인 혈장사혈(plasmapheresis) 과정 중에 혈장-유도된 단백질에 도입된다. 예를 들면, 아세톤 공정에 의해 알부민 용액을 처리하는 출발 물질인 가용화된 Cohn Fraction V 분말은 약 7.6 mM 내지 약 9.7 mM(약 2232 ppm 내지 약2853 ppm)의 시트레이트 함량을 가진다. 따라서, 인간에 투여하고 자 하는 알부민 및 다른 단백질 용액에서 알루미늄의 수준을 낮추기 위한 것 외에, 저장 동안 유리 용기로부터 시트레이트 이온에 의해 알루미늄의 용해될 가능성을 방지하기 위해 시트레이트의 수준을 낮추도록 하는 것도 중요하다.
다가의 알루미늄 이온은 다른 다가의 이온과 함께 단백질에 결합하고, EDTA와 같은 킬레이팅제로 이들 이온을 제거하고자 하는 시도는 크게 성공적이지는 않았다. 한외여과 투석기법도 알부민과 같은 단백질로부터 다가 이온을 제거하는 데 사용되어 왔다. 이러한 방법은 투석 중 일가 이온으로 단백질에 결합된 다가 이온을 교체하려 하는 것이다. 예를 들면, 미국 특허 제 Re.36,256호에는 염화나트륨, 초산나트륨과 같은 3% 염의 수용액을 알부민으로부터 알루미늄 이온을 교체하는 투석여과기를 사용하는 것을 기재하고 있다. 유사하게, 미국 특허 제5,229,498호에는 일가 알칼리금속 이온 또는 암모늄 이온을 약 0.15M에서 포화 농도까지 함유한 수용액에 대해 투석여과에 의해 단백질로부터 다가 이온을 교체하고 제거하는 방법이 기재되어 있다.
그러나 상기의 경우에, 투석여과된 단백질은 결합되어 있는 1가 이온을 함유하고 있다. 결과적으로 1가 이온을 제거하기 위해 보통 탈이온수에 대해 투석여과의 추가 공정을 해당 단백질에 실시해야만 한다. 따라서, 일가 이온을 제거하기 위한 후속 공정 없이도, 시트레이트 이온과 알루미늄 이온 모두가 다른 다가 이온과 함께 단백질에서 제거되는 방법이 있으면 바람직할 것이다.
본 발명은 생물학적 활성 단백질로부터 시트레이트, 알루미늄, 및 기타 다가 이온을 제거하는 데 유용한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 특히 알부민을 함유한 용액으로부터 알루미늄 및 시트레이트 이온을 제거하는 데 유용한 것이다.
본 발명의 상기와 기타 특징과 특성 및 이점은 이하의 상세한 설명, 첨부된 특허청구의 범위 및 첨부된 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라, 단백질 용액을 순수에 의해 투석여과하기 위한 시스템의 개략도.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라, Cohn Fraction V 분말로부터 투석여과된 알부민 용액을 제조하는 방법과 순수에 대해 투석여과되는 경우 pH 6.2, 8.8, 9.0 또는 9.2에서 알부민 용액의 시트레이트와 알루미늄 수준을 테스트하기 위한 샘플 채취 지점을 나타내는 순서도.
도 3은 다양한 용량의 탈이온수에 대해 투석여과된 정화(clarified) Fraction V 용액에서 시트레이트의 감소에 대한 pH(6.2, 8.8, 9.0 또는 9.2)의 효과를 나타내는 그래프.
도 4는 pH 8.8, 9.0 또는 9.2에서 정제 Fraction V 용액에서 시트레이트의 감소에 대한 투석여과 용량에 대한 효과를 나타내는 그래프.
도 5는 다양한 용량의 탈이온수에 대해 투석여과된 정화 Fraction V 용액에서 시트레이트의 감소에 대한 pH(6.0, 9.0 또는 9.2)의 효과를 나타내는 그래프.
도 6은 실시예 5에 따라 제조된 정화 Fraction V 용액을 탈이온수에 대해 투석여과하기 전과 후의 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 7은 실시예 6에 따라 제조된 로트 1의 정화된 Fraction V 용액을 탈이온수에 대해 투석여과하기 전과 후의 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 8은 실시예 6에 따라 제조된 로트 2의 정화된 Fraction V 용액을 탈이온수에 대해 투석여과하기 전과 후의 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 9는 실시예 5에 따라 제조된 20% 알부민 용액(최종 용기 샘플)에서 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 10은 실시예 6에 따라 제조된 로트 1의 25% 알부민 용액(최종 용기 샘플)에서 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 11은 실시예 6에 따라 제조된 로트 2의 25% 알부민 용액(최종 용기 샘플)에서 시트레이트와 알루미늄 이온의 감소에 대한 투석여과 pH의 효과를 나타내는 그래프.
도 12는 20% 및 25% 알부민 용액을 제조하는 동안 채취한 샘플의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼의 중첩 플롯.
본 발명은 단백질을 함유하는 용액의 pH를 약 7 내지 약 10의 pH로 조정하고, 순수에 대해 pH를 조정한 용액을 투석여과 함으로써, 단백질로부터 시트레이트, 알루미늄, 및 기타 다가 이온과 오염물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 단백질로부터 시트레이트, 알루미늄, 및 기타 다가 이온과 오염물을 제거하기 위한 간단하고 경제적이며 효율적인 공정을 제공한다. 본 발명의 방법은 알부민으로부터 시트레이트 및 알루미늄 이온을 제공하기에 특히 유용한 것이다.
본 발명의 출발 물질은 시트레이트 및/또는 알루미늄 이온도 함유하는 어떠한 단백질 함유 수용액도 가능하다. 예를 들면 이 출발 물질은 상업적으로 제조된 알부민, Cohn 방법(본 명세서에서 전문이 병합되어 참조되는 Cohn 등,J. Amer. Chem. Soc., 68: 459-478(1946))에 따르는 용해된 Fraction V 분말 또는 Fraction V 페이스트, 또는 알부민 또는 기타 혈장 단백질을 함유하는 임의의 다른 수용액일 수 있다. 본 명세서에서 전문이 병합되어 참조되는 미국 특허 제5,250,662호에는 출발 물질로 적합한 알부민을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명을 실시하는 데 적합한 출발 물질의 다른 예로는 면역글로불린, Factor Ⅷ, Factor Ⅸ, 알파-1-단백질분해효소 억제제 및/또는 프로트롬빈 복합물을 함유하는 수용액을 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다.
초기 단백질 함유 용액은 우선 1N NaOH과 같은 염기로 pH를 약 7 내지 약 10으로 조정한다. 일 실시 형태에서, 알부민을 함유하는 용액은 pH를 약 8.8 내지 약 9.2로 조정한다. 단백질 용액은 침전된 단백질 또는 기타 미립자를 제거하기위해 예비 여과되는 것이 바람직하다.
이후, 단백질-함유 용액을 투석여과기에 적용한다. 투석여과기는 단백질의 분자량 보다 작은 기공을 가진 투석여과막을 가진 것 중에서 선택되어, 알루미늄 이온과 시트레이트 이온과 같은 다가 이온, 염, 용액 및 기타 작은 분자는 투석여과막을 통과하지만 단백질은 남기도록 한다. 알부민 용액으로부터 시트레이트와 알루미늄을 제거하는 데 적합한 투석여과막은 예를 들면 Millipore UF-10 KD 여과막 및 Millipore UF-30KD 여과막(Millipore Corporation, 미국 매사츄세츠주 Bedford 소재)을 포함한다.
단백질-함유 용액은 투석여과막 또는 투석여과막들에 대해 평행한 방향으로 투석여과기를 통과시킨다. 압력 구배가 여과기에 대해 적용된다. 단백질 함유 용액이 투석여과막을 통과하여 이동함에 따라, 오염물은 투석여과막을 여과물로 통과하나, 단백질은 잔류물로 남는다. 순수를 잔류물에 첨가하고 얻어진 희석 잔류물을 추가로 투석여과하기 위해 재순환시킨다. 이 공정을 오염물이 원하는 정도로 감소될 때까지 반복한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "순수(pure water)"라는 것은 탈이온수와 증류수를 포함하는 이온의 농도가 낮은 수용액을 의미한다. 순수는 1995 United States Pharmacopoeia, National Formulary 18(본 명세서에 전문이 참조로 병합됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 또한 주사용 물, 주사용 항균수, 흡기를 위한 멸균수, 주사용 멸균수, 관계용수, 및 정제된 물을 포함한다.
도 1에는 본 발명을 실시하는 데 유용한 시스템(10)이 나타나 있다. pH 조정된 단백질 용액을 공급 탱크(12)에 투입한다. 펌프(14)에 의해 용액이 호스(16)를 통해 투석여과막(도시되지 않음)을 가지고 있는 투석여과기(18)로 유입된다. 여과물은 파이프(20)을 통해 투석여과기로부터 제거되고, 잔류물은 파이프(22)를 통해 공급 탱크로 재순환되어 되돌아간다.
물탱크(24)내에 들어 있는 순수, 예를 들면 탈이온수는 펌프(28)에 의해 호스(26)를 통해 공급 탱크로 유입된다. 교반기(30)는 순수와 공급 탱크 내의 잔류물을 혼합한다.
바람직한 제1 실시형태에서는, 여과물이 투석여과기로부터 제거되는 속도와 동일한 속도로 순수가 공급 탱크(12)로 계속 첨가된다. 이 실시형태에서, 단백질 용액/잔류물의 용량은 일정하게 유지된다("항량 워시 투석여과("constant volume wash diafiltration")). 잔류물에 첨가되는 순수가 초기 단백질 용액의 용량 또는 중량의 적어도 약 3배 이상이 될 때까지 또는 오염물의 감소가 소망하는 정도에 도달할 때까지 잔류물은 투석여과기와 공급탱크로 계속 재순환된다.
바람직한 제2 실시형태에서는, 순수가 연속식 보다는 배치식으로 잔류물에 첨가된다. 이 "배치식 투석여과(batch-wise diafiltration)" 실시형태에서는 여과물이 제거되고 잔류물 내에 단백질의 함량이 증가됨에 따라 잔류물의 용량은 감소한다. 잔류물에서 단백질 함량이 2배 내지 10배로 증가하는 경우, 잔류물의 용량이 단백질 용액의 초기 용량으로 회복되기에 충분한 함량의 순수를 공급 탱크에 첨가한다. 투석여과기와 공급 탱크로 재순환하는 방법과, 순수를 공급 탱크에 배치식으로 첨가하는 방법은 다가 이온의 농도가 소망하는 농도에 도달할 때까지 계속된다.
본 발명의 방법의 예는 이하에 설정되어 있다.
실시예 1
탈이온수에 대한 알부민의 항량 워시 투석여과
pH 7.2에서 상업적으로 제조된 25% 알부민 용액 약 40 ㎖을 본 발명의 방법에 따라 투석여과하였다. 알부민 용액을 10 KD Millipore® UF 여과막을 구비한 투석여과기로 순환시키면서, 여과물을 제거하고 탈이온수를 여과물이 제거되는 속도와 동일한 속도로 여과물에 계속 첨가하였다. 약 280 ㎖ 용량의 탈이온수가 첨가될 때까지 투석여과를 반복하였다. 투석여과된 알부민 용액에서 알루미늄과 시트레이트에 대해 실험하였다.
시트레이트 이온에 대해서 West Coast Analytical Services (WCAS; 미국 캘리포니아주의 Santa Fe Springs 소재)에서 샘플을 실험하였다. WCAS에서 사용된 이온 크로마토그래피법에서는 시트레이트 이온은 압축 전도율(suppressed conductivity)로 검출되고 외부의 표준물질을 참조하여 정량화하였다.
알루미늄 테스트도 WCAS에서 Inductively Coupled Plasma Mass Spectroscopy(ICPMS) 방법을 이용하여 실시하였다. 이 방법에서, 플라즈마에서 발생된 양이온을 진공 인터페이스에 도입하였다. 인터페이스는 샘플이 도입된 후에 동위원소 질량의 범위에 대한 데이터를 인식하는 모쿼트라폴 매스 스펙트로메타(quadrapole mass spectrometer)이다. 데이터를 다채널 분석기에서 기록하고 수집하고 표준물질과 비교하여 알루미늄의 농도를 산출하는 데 사용하였다.
결과는 표 1에 나타나 있다.
표 1
투석여과 이전과 이후의 25% 알부민에서 시트레이트와 알루미늄의 수준
샘플 시트레이트 수준(ppm) 알루미늄 수준(ppb)
출발 물질(25% 알부민) 1236 258
투석여과된 용액, pH7.2 35 48
투석여과된 후 감소율(%) 97% 81%
표 1에서 나타난 바와 같이, 상업적으로 제조된 25% 알부민에서 시트레이트의 97%가 pH 7.2에서 탈이온수에 대해 투석여과하는 도중 제거되었고, 알루미늄의 81%가 제거되었다.
실시예 2
알부민의 항량 워시 투석여과 동안 알루미늄과 시트레이트의 제거에 대한 pH의 효과
상업적으로 제조된 25% 알부민 용액을 탈이온수로 3배 희석하였다. 희석된 알부민 용액을 3개의 샘플로 나누었다. 1N NaOH를 이용하여 첫 번째 샘플의 pH를 8.1로 조정하고 두 번째 샘플의 pH를 9.1로 조정하고 세 번째 샘플의 pH를 9.9로 조정하였다.
각 샘플로부터 50㎖를 취하여 각각에 탈이온수에 대한 항량 워시 투석여과를 10 KD Millipore UF 여과막을 이용하여 개별적으로 실시하였다. 약 350 ㎖의 탈이온수가 첨가될 때까지 투석여과를 계속하였다. 투석여과 전과 후에, 희석된 알부민 용액에서 시트레이트와 알루미늄 수준을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 2에 나타나 있다.
표 2
투석여과 전과 후의 알부민 용액 내의 시트레이트와 알루미늄 수준
샘플 시트레이트 수준(ppm) 알루미늄 수준(ppb)
출발 물질(3배 희석된 25% 알부민) 280 74
투석여과된 용액, pH 8.1 <50 10
투석여과된 용액, pH 9.1 <50 <10
투석여과된 용액, pH 9.9 <50 <10
표 2에서 나타난 바와 같이, 시판되는 알부민에서 시트레이트 수준은 실험된 모든 pH 조건에서 50 ppm 이하로 감소되었다. pH 8.1에서 알루미늄 수준은 74 ppb에서 10 ppb로 감소되었으나, pH 9.1과 pH 9.9에서 알루미늄 수준은 10 ppb 미만으로 감소되었다.
실시예 3
Cohn Fraction V 페이스트 - 탈이온수에 대해 항량 워시 투석여과 후의 알루미늄과 시트레이트 이온 수준에 대한 pH의 효과
Cohn Fraction V 페이스트를 탈이온수에 현탁시켜 대략 7% 단백질을 함유하는 알부민 용액을 제조하였다. pH를 4.6으로 조정한 후, 알부민 용액에 미리 평형화시킨 DEAE Sephadex A-50 수지로 처리하였다. 알부민 용액을 미리 여과시켜 통과된 부분을 취하고 이 용액으로부터 5개의 50㎖의 분획을 준비하였다. 첫 번째 분획의 pH를 5.0으로, 두 번째 분획의 pH를 7.0으로, 세 번째 분획의 pH를 8.0으로, 네 번째 분획의 pH를 9.0으로, 그리고 다섯 번째 분획의 pH를 10.0으로 조정하였다.
10 KD Millipore UF 여과막을 이용하여 각 분획에 대해 탈이온수에 대한 항량 워시 투석여과를 개별적으로 실시하였다. 약 350 ㎖의 탈이온수가 첨가될 때까지 투석여과를 계속하였다. 투석여과 전과 후에, 알부민 용액에서 시트레이트와 알루미늄 수준을 측정하였다. 결과는 표 3에 나타나 있다.
표 3
투석여과 전과 후의 알부민 용액 내의 시트레이트와 알루미늄 수준
샘플 시트레이트 수준(ppm) 알루미늄 수준(ppb)
출발 물질(대략 7% 단백질 농도의 알부민 용액에서) 제공안됨 84
투석여과된 용액, pH 5.0 433 82
투석여과된 용액, pH 7.0 180 66
투석여과된 용액, pH 8.0 97 36
투석여과된 용액, pH 9.0 64 35
투석여과된 용액, pH 10.0 2 50
표 3에서 나타난 바와 같이, pH가 증가하는 조건에서 알부민 용액을 투석여과하면, 시트레이트와 알루미늄 수준은 감소하는 경향이 있다. pH 10에서 알루미늄의 수준은 pH 9.0과 pH 8.0에서 수준에 비해 약간 상승되지만, 일반적으로 pH가 증가함에 따라 알루미늄과 시트레이트의 수준은 모두 감소된다.
실시예 4
알루미늄과 시트레이트 수준에 대한 pH 10에서 탈이온수에 대해 투석여과하는 효과
아세톤 처리된 Cohn Fraction V 페이스트로부터 얻어진 Cohn Fraction V 분말로부터 대략 7% 단백질을 함유하는 알부민 용액을 제조하였다. 알부민 용액의pH는 약 10으로 조정하였다.
30 KD Millipore® UF 여과막을 구비한 투과여과기를 이용하여 pH가 조정된 알부민 용액을 탈이온수에 대해 투석여과하였다. 공급탱크로부터 알부민 용액을 투석여과기로 펌프에 의해 공급하였다. 여과물을 제거하는 동시에, 잔류물을 공급 탱크로 재순환하여 되돌렸다. 여과물이 제거되는 속도와 동일한 속도로 탈이온수를 공급 탱크에 계속 첨가하였다. 탈이온수의 함량이 단백질 용액의 본래 중량의 약 7배가 첨가되면, 투석여과 공정을 중지하였다. 단백질 용액의 샘플을 수집하고 시트레이트와 알루미늄에 대해 실험하였다. 결과는 표 4에 나타나 있다.
표 4
투석여과 전과 후의 알부민 용액 내의 시트레이트와 알루미늄 수준
샘플 시트레이트 수준(ppm) 알루미늄 수준(ppb)
출발 물질(대략 7% 단백질 농도의 알부민 용액에서) 1700 49
투석여과된 용액, pH 9.9 <2 2
표 4에서 나타난 바와 같이, 단백질 용액의 pH를 약 10으로 조정하고, 탈이온수에 대해 용액을 투석여과 한 후, 시트레이트 수준은 초기값인 1700 ppm으로부터 2 ppm미만으로 감소되고, 알루미늄 수준은 49 ppb에서 2 ppb로 감소되었다.
실시예 5
pH 6.2, 8.8, 9.0, 또는 9.2로 조정된 가용화된 Cohn Fraction V 분말로부터 20% 알부민의 제조
아세톤 처리된 Cohn Fraction V 페이스트로부터 얻어진 Fraction V 분말의약 1.5㎏을 0 내지 10℃의 차가운 탈이온수에 현탁시켜, 대략 8% 단백질을 함유한 용액을 얻었다. 온도를 0 내지 10℃로 유지하면서 pH를 약 6.5±0.5로 조정하였다. pH가 조정된 알부민 용액을 필터 제제와 함께 CUNO CPX90SP 심층 필터를 통해 여과시켜 정화시켰다.
정화된 용액을 4개의 4㎏의 하부 로트들로 나누고, 각 하부 로트의 pH를 1N NaOH에 의해 6.2(대조군), 8.8, 9.0 또는 9.2로 조정하였다. 각 pH가 조정된 하부 로트를 용해된 Fraction V 용액의 처음 중량의 5배 ("5X 용량")의 용량의 차가운(약 2℃ 내지 약 8℃) 탈이온수로 2회 투석여과하였다. 투석여과가 완료된 시점의 단백질 농도는 13±3%였다. 투석여과된 알부민 용액의 pH는 0.5N HCl(pH 6.2의 대조군에 대해) 또는 1.0N HCl(pH 8.8, 9.0 및 9.2의 하부 로트에 대해)으로 pH 6.70-6.85로 조정하였다.
투석여과된 알부민 용액을 소듐 카프릴레이트와 소듐 아세틸 트립토판으로 각각의 최종 농도가 단백질의 g당 0.08 밀리몰이 되도록 안정화시켰다. 여과에 의한 정화 후, 용액을 60±0.5℃에서 2시간 동안 가열하였다. 가열된 알부민 용액을 5 내지 10℃의 온도까지 빠르게 냉각하고, 여과에 의해 정화하고, 23 내지 26%의 단백질 용액까지 농축하였다.
용액을 소듐 카프릴레이트와 소듐 아세틸 트립토판으로 알부민 g당 0.08 밀리몰의 수준까지 재안정화시켰다. pH를 6.9±0.5까지 조정하고, 소듐은 리터당 145±15mEq으로 조정하고 단백질은 약 20%로 조정하였다.
용액을 멸균시킨 잔류 필터를 통해 멸균 여과시키고 멸균된 병(타입 Ⅱ 유리)에 채우고 염소첨가된 고무 병마개로 닫았다. 밀봉된 병을 60±0.5℃에서 10시간 이상 또는 11시간 이상 동안 가열처리하였다.
실시예 6
pH 6.2, 9.0 또는 9.2로 조정된 가용화된 Cohn Faction V 분말로부터 25% 알부민의 제조
25% 알부민을 2개의 별도 로트(로트 1 및 로트 2)로 나누고, 각 로트는 다시 3개의 4㎏ 하부 로트로 나누고, 각 하부 로트의 pH를 6.2(대조군), 9.0 또는 9.2로 조정하고, 각 하부 로트로부터 최종 가열된 알부민 용액을 농축하여 약 25% 농도의 단백질 용액을 얻는다는 점 외에는 실시예 5의 방법과 동일하게 Cohn Fraction V 분말로부터 25% 알부민의 2개의 별도 로트를 제조하였다.
20%와 25%의 알부민(실시예 5 및 6)을 제조하는 동안 3 단계(투석여과 전에(출발 물질 "SM"), 투석여과 후에(pH를 6.70-6.85로 조정한 후, 투석여과 샘플 "DS") 그리고 멸균 유리 용기 내에서 저온 살균 후(최종 용기 샘플 "FS"))에서 실험을 위한 샘플을 채취였다. 도 2에는 3개의 샘플 채취 지점을 함께 표시하여 알부민의 제조방법을 나타내고 있다.
실시예 7
다양한 pH와 다양한 투석여과 워시 용량에서 Fraction V 용액의 투석여과
시트레이트의 감소 시 투석여과 동안 정화된 Fraction V 용액의 pH를 높이는 효과에 대해 측정하였다. 대조군으로 pH 6.2에서 투석여과를 실시하였다. 실시예 5로 부터얻은 투석여과된 Fraction V 용액("DS") 샘플을 시트레이트에 대해 WestCoast Analytical Service(WCAS; 미국 캘리포니아주 Santa Fe Springs 소재)와 Alpha Therapeutic Corporation (ATC; 미국 캘리포니아주 Los Angeles) 모두에서 실험하였다.
상기에서 기재된 바와 같이 시트레이트 수준을 측정하기 위한 WCAS에서 사용된 이온 크로마토그래피 방법은 검출 한계가 2 ppm였다. ATC에서 사용되는 비색계 방법에서는 표준 시트레이트 용액 및 탈단백화된 샘플을 혼합하고 피리딘과 아세트산 무수물과 반응시켰다. 약 45분의 기간 후에, 이 용액의 425㎚(OD425)에서 광학 밀도를 측정하였다. 각 샘플의 시트레이트 이온 함량을 표준 곡선으로부터 산출하여 결정하였다. 이 방법은 0.1 mM(29 ppm)의 검출한계를 가진다. 검출한계 이하의 모든 시트레이트값을 이하에 설명하는 도 3-5에서는 검출 한계값으로 기재하였다.
투석여과 항량 워시를 4배 용량 또는 6배 용량으로 한 것 이외에는 실시예 5의 방법에 따라 제조된 투석여과된 Fraction V 용액으로부터 취한 추가 샘플을 채취하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 차가운(약 2℃ 내지 약 8℃) 탈이온수에 대해 pH 8.8, 9.0 및 9.2에서 투석여과하는 것으로 pH 6.2에서 투석여과(383 ppm)에 비해 시트레이트의 함량(약 38 내지 5 ppm)을 낮춘 용액을 제공하였다.
워시 용량을 4배 용량 또는 6배 용량 중 하나로 한 샘플에서 pH 8.8, 9.0 또는 9.2에서 투석여과시킨 경우, 시트레이트의 수준이 낮은 것으로 나타났다(50ppm 이하). 도 3 및 4 참조. 도 4에서 나타난 바와 같이, 사용된 각 pH에서, 정화된Fraction V 용액을 투석여과하는 데 사용된 탈이온수의 용량이 높을수록, 시트레이트의 감소량도 증가하였다.
25% 알부민 로트를 실시예 6에서와 동일하게 정화된 Fraction V 용액을 pH 6.2(대조군), pH 9.0 및 pH 9.2에서 4배 용량 또는 5배 용량의 탈이온수로 투석여화하여 제조한 경우 동일한 결과가 나타났다. 도 5에 나타난 바와 같이, pH 9.0과 9.2에서 4배 또는 5배 용량의 탈이온수로, 투석여과한 이후의 시트레이트 함량은 2 ppm의 검출한계 이하이나, 대조군(pH 6.2, 5배 용량)의 시트레이트 함량은 264 ppm이었다.
실시예 8
20% 및 25% 알부민의 정화된 Fraction V의 투석여과 전과 후 및 최종 용기 용액에서 시트레이트와 알루미늄의 수준
실시예 5의 20% 알부민 및 실시예 6의 25% 알부민의 로트 1과 로트 2의 제조로시 얻은 3개의 샘플 각각에 대해 시트레이트와 알루미늄의 수준을 측정하였다. 결과는 표 5, 6, 및 6 및 도 6 내지 11에 나타나 있다.
알루미늄 테스트를 그라파이트 로(graphite furnace)의 원자흡착법(GFAAS)을 이용하여 ATC에서 실시하였다. 이 방법은 일반적으로 전기로 가열하는 그라파이트 로의 분무기(atomizer)에 의해 원자를 발생시키는 것이다. 용매, 유기 분자 및/또는 무기 물질을 제거하기 위해 건조하고 태워버린 후, 샘플을 제한 영역에서 자유 원자를 발생시키도록 분무하였다. GFAAS에 의해 만들어진 흡착 신호는 가파른 피크를 나타내고 그 면적은 샘플 내에 존재하는 분석물 원자의 함량과 관련될 수 있다. Varian 그라파이트 로 모델 GTA96Z 및 프로그램할 수 있는 샘플링을 하는 Varian 자동샘플러 PSD96을 구비한 Varian SpectrAA-400 Zeeman Atomic Absorption Spectrometer를 사용하여 알루미늄을 측정하였다. 2.5% 단백질 함량이 되도록 샘플을 희석시켜서, 내부가 열분해성 코팅된 플래튜 튜브(pyrolytically coated plateau tube)인 열분해성 그라파이트 플랫포옴에 도입하였다. 원자 흡수 분석은 309.3㎚였다.
3개의 샘플 채취 지점(SM, DS, 및 FS)에서 수집한 샘플의 단백질 농도가 상이하기 때문에, 표 5와 도 6 내지 11에 나타난 알루미늄 값은 2.5% 단백질로 표준화하여 농도를 유지시켰다.
시트레이트 테스트는 상기에서 기재된 바와 같이 ATC 및 WCAS 모두에서 실시하였다. 모든 시트레이트와 알루미늄은 모두 표 5, 6 및 7에 나타난 바와 같이 검출 한계 이하이고, 도 6 내지 11에서는 각 해당 검출한계값이 지정되어 있다.
표 5
알루미늄 테스트 결과
알부민 제조 DF pH 2.5% 단백질로 표준화된 샘플에서 알루미늄(ppb)
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 6 <5 7
8.8 6 <5 16
9.0 6 <5 <5
9.2 6 24 <5
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 13 44 9
9.0 13 37 <5
9.2 13 7 <5
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 28 18 14
9.0 28 9 8
9.2 28 <5 <5
DF = 투석여과; ppb = 10억분의 1
표 6
시트레이트 테스트 결과(Alpha Therapeutic Corporation)
알부민 제조 DF pH 시트레이트 (ppm)
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 3370 624 218
8.8 3370 41 <29
9.0 3370 32 <29
9.2 3370 <29 <29
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 1982 618 303
9.0 1982 <29 <29
9.2 1982 <29 <29
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 2156 597 412
9.0 2156 <29 <29
9.2 2156 <29 <29
DF = 투석여과; ppm = 백만분의 1
이 표에서 시트레이트의 값은 미국 캘리포니아주의 Los Angeles 소재의 Alpha Therapeutics Corporation (ATC)에서 측정하였다.
표 7
시트레이트 테스트 결과 (West Coast Analytical Service)
알부민 제조 DF pH 시트레이트(ppm)
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 1900 383 57
8.8 1900 15 <2
9.0 1900 12 <2
9.2 1900 6 <2
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 1770 264 111
9.0 1770 <2 8
9.2 1770 <2 <2
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 1840 407 144
9.0 1840 <2 <2
9.2 1840 <2 <2
DF = 투석여과; ppm = 백만불의 1
이 표에서 시트레이트의 값은 West Coast Analytical Service (WCAS)에서 측정함.
표 5에 나타난 바와 같이, pH 6.2, 8.8 또는 9.0 중 하나에서 투석여과 후 알루미늄 농도는 정화된 Fraction V 용액에서 6ppb에서 투석여과된 샘플(실시예 5)에서 5ppb 이하로 감소하였다. 그러나 놀랍게도, 알루미늄의 농도는 pH 9.2에서 투석여과한 경우, SM에서는 6ppb이고 DS에서는 24ppb로 현저하게 증가하였다. pH9.2에서 투석여과된 알부민 용액의 최종 용기(FS)는 5 ppb 미만의 알루미늄 농도를 가진 것으로 나타났다는 것을 주목할 만한 것이다(표 5). pH 8.8에서 투석여과된 샘플을 제외하고, 최종 용기에서 알루미늄 농도는 투석여과 pH가 증가하는 경우 감소하는 경향을 나타내었다.
유사하게, 실시예 6에서 제조된 25% 알부민 용액에 대한 결과에서는 투석여과 pH가 증가하는 경우 알루미늄의 농도가 감소하는 것을 보여준다. 예를 들면 pH 6.2에서 투석여과 후 알부민 용액에서 알루미늄의 수준은 44ppb이고 pH 9.0과 9.2에서 각각 37ppb와 7ppb로 감소하거나(실시예 6, 로트 1), 또는 18ppb이고, pH 9.0 및 9.2에서 각각 9ppb와 <5ppb로 감소하였다(실시예 6, 로트 2).
표 6에서 나타난 바와 같이, 높은 pH 값에서 탈이온수에 대해 투석여과 후에 알부민 용액의 시트레이트 수준에서도 유사한 결과가 나타났다. pH 6.2에서 정화된 Fraction V 용액(SM)의 투석여과로 시트레이트 함량은 3370ppm에서 약 624 ppm(2.12mM)(실시예 5)로 감소되었다. 투석여과 pH를 8.8, 9.0 또는 9.2로 증가시키는 것으로 투석여과 샘플(DS)에서 시트레이트의 함량은 41 ppm(0.14mM) 내지 29ppm(<0.10mM)까지 감소한다. 실시예 6에서 제조된 25% 알부민의 용액을 pH 6.2에서 투석여과한 후의 시트레이트 수준은 618ppm(로트 1) 및 597ppm(로트 2)이고, pH 9.0 또는 9.2에서 투석여과한 후에는 검출한계(29ppm 또는 0.10ppm 이하) 이하로 떨어지는 유사한 결과가 나타났다(표 6). West Coast Analytical Service에 보내진 샘플에서도 유사한 결과가 나타났다(표 7).
출발물질(SM) 및 투석여과 용액(DS)에 대한 알루미늄과 시트레이트 분석 결과는 도 6(실시예 5, 20% 알부민), 도 7(실시예 6 로트 1, 25% 알부민), 및 도 8(실시예 6 로트 2, 25% 알부민)에서 그래프로 나타나 있다. 20% 및 25% 알부민 용액의 제조 동안 정화된 Fraction V 용액의 투석여과 전과 후에 얻어진 결과를 고려할 때, 투석여과 pH가 8.8, 9.0 또는 9.2로 증가하는 경우 용액의 시트레이트와 알루미늄 함량은 감소하는 것으로 나타났다.
최종 용기 샘플의 시트레이트와 알루미늄 결과에서도 투석여과 pH를 증가하는 것이 시트레이트와 알루미늄의 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 최종 용기 샘플에서 시트레이트 수준은 여과 pH가 pH 6.2에서 pH 8.8, 9.0 또는 9.2로 증가하는 경우 29ppm 이하로 감소하였다(표 6). pH 9.0 또는 9.2에서 투석여과된 각 알부민 제제의 최종 용기 용액에서 알루미늄 수준은 해당 대조군(pH 6.2에서 투석여과됨)에 비해 감소하였다(표 5). 모든 경우에서, 20% 또는 25%의 단백질로 표준화 한 후 최종 용기에서 알루미늄의 수준은 200ppb 알루미늄 이하의 요건 내에 있는 것이다. 최종 용기 용액(FS)의 알루미늄 과 시트레이트 결과는 도 9(실시예 5, 20% 알부민), 도 10(실시예 6 로트 1, 25% 알부민), 및 도 11(실시예 6 로트 2, 25% 알부민)에서 그래프로 나타나 있다.
이들 결과에서는 높은 pH에서 알루미늄 또는 단백질에 결합하는 시트레이트가 투석여과에 의해 약해지거나 쉽게 제거할 수 있다는 것을 암시한다. 이것은 높은 pH(염기성의 pH)에서 시트레이트와 알루미늄의 정전기적 인력이 2개의 화학종 사이의 쿨롬적 반발력에 기인하여 약화된다는 것을 보여준 Rabinow, B.E., Ericson, S. 및 Shelbourne, T.M. (1989) J. Parenter, Sci, Technol, 43:132-139와 일치한다.
실시예 9
20% 및 25% 알부민의 정화된 Fraction V의 투석여과 전과 후 및 최종 용기 용액의 순도, 투명도, 아세톤 함량 및 HPSEC 결과
투석여과 pH가 증가하면 시트레이트와 알루미늄의 수준을 낮출 수가 있지만, 높은 투석여과 pH에 의해 알부민 용액의 다른 물리적 특성에 부작용을 미치지 않도록 하는 것이 중요하다. 대부분의 시판되는 알부민 용액은 다양한 물리적 특성에 대해 소정의 요건에 맞추어져야만 한다. 예를 들면 시판되는 알부민 용액의 통상적인 요건은 다음과 같은 것을 포함한다: 200ppb 이하의 알루미늄 함량을 가질 것, 96% 이상의 알부민 순도를 가질 것; 0.02 g/100㎖ 이하의 아세톤 함량을 가질 것, 및 80% 이상의 모노머와 9%, 15%, 및 6% 이하의 다이머, 폴리머 및 분획의 분자 크기의 분포를 가질 것. 따라서, 실시예 5와 6에 기재된 3가지 알부민 제제 모두에서 취한 SM, DS, 및 FS 샘플에 대해 이러한 물리적 특성을 측정하였다.
다양한 pH에서 투석여과하기 전과 후의 정화된 Fraction V 용액과 최종 용기 용액의 순도를 셀룰로즈 아세테이트 막 전기영동(CAME)에 의해 측정하였다. 결과는 표 8에 나타나 있다.
표 8: CAME 테스트 결과
알부민 제조 DF pH 알부민(%)*
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 99.1 99.0 99.8
8.8 99.1 99.6 99.8
9.0 99.1 99.5 99.1
9.2 99.1 99.6 99.7
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 99.0 99.4 99.9
9.0 99.0 99.4 99.9
9.2 99.0 99.1 99.8
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 99.2 99.4 98.9
9.0 99.2 99.3 99.2
9.2 99.2 99.8 99.2
DF = 투석여과
*알부민(%)은 CAME에 의해 측정한 샘플에 존재하는 총단백질에 대한 알부민의 함량을 의미함.
표 8에 나타난 바와 같이, 3가지 제제 모두에서 알부민 용액의 순도는 투석여과 전에 99.0% 내지 99.2%이고, 투석여과 후에 99.0 내지 99.8%였다. 모든 최종 용기 용액 모두의 순도는 98.9% 내지 99.9% 알부민의 범위로, 요구되는 96%이상의 알부민 내에 있는 것이다.
투석여과 전과 후의 알부민 용액 및 최종 용기 용액 내의 투명도는 12×75 ㎜ 시험관을 이용한 탁도계에 의해 측정하였다. 결과는 표 9에 나타나 있다.
표 9: 탁도계 테스트 결과
알부민 제조 DF pH 투명도(NTU)
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 2.0 3.5 2.1
8.8 2.0 1.6 2.6
9.0 2.0 1.4 2.4
9.2 2.0 1.2 2.4
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 2.0 3.6 1.9
9.0 2.0 2.4 2.1
9.2 2.0 2.4 1.8
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 2.2 4.3 1.9
9.0 2.2 2.4 1.6
9.2 2.2 2.2 1.8
DF = 투석여과
NTU = 탁도계로 측정한 탁도 단위
정제된 Fraction V 용액의 투명도는 3개의 제제 모두에서 투석여과 전에 2.0NTU 내지 2.2NTU의 범위였다. pH 6.2에서 투석여과한 후에 탁도에서 탁도계 탐독에서 증가가 있었다. 투석여과 pH가 pH 8.8, 9.0 또는 9.2로 증가하는 경우, 투명도는 약간 개선되거나 거의 동일하게 유지된다. 모든 최종 용기 용액의 투명도는 1.6 NTU 내지 2.6 NTU의 범위였다.
투석여과 전과 후의 알부민 용액 및 최종 용기 용액의 아세톤 함량은 표 10에 나타나 있다.
표 10: 아세톤 테스트 결과
알부민 제조 DF pH 아세톤(g/100㎖)
정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
실시예 520% 알부민 6.2 0.010 0.001 0.001
8.8 0.010 0.004 0.001
9.0 0.010 0.002 0.001
9.2 0.010 0.002 0.001
실시예 625% 알부민로트 1 6.2 0.003 0.001 0.001
9.0 0.003 0.001 0.001
9.2 0.003 0.001 0.001
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 0.006 0.001 0.002
9.0 0.006 0.002 0.002
9.2 0.006 0.001 0.002
DF = 투석여과
투석여과 전, 아세톤 함량은 3개의 알부민 제제 모두에서 0.003 내지 0.010g/100㎖의 범위였다. 아세톤의 수준은 투석여과 후에 0.001 내지 0.004 g/100㎖의 범위로 투석여과 pH에 의해 영향을 받는 것으로 보이지는 않는다. 아세톤의 출발 수준은 낮지만, 투석여과 후에 아세톤의 함량에서 감소는 아세톤이 과정 중에 추가로 제거되었다는 것을 나타낸다. 모든 최종 용기 용액의 아세톤 함량은 0.001 내지 0.002 g/100 ㎖의 범위인 것으로, 0.02 g/100 ㎖ 이하라는 규정 내에 있는 것이다.
실시예 5 및 6에 기재된 3가지 알부민 제제를 투석여과 전 및 후에 그리고 최종 용기 용액에 대해 High Performance Size Exclusion Chromatograph(HPSEC)로 측정한 알부민의 분자 분포는 표 11, 12 및 13에 나타나 있다.
표 11: HPSEC으로 측정한 분자 분포(실시예 5: 20% 알부민)
DF pH 분자의 크기(%) 정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
6.2 모노머 94.3 92.9 88.3
다이머 4.0 5.4 2.4
폴리머 0.9 1.3 8.6
분획 0.8 0.4 0.7
8.8 모노머 94.3 93.7 87.2
다이머 4.0 3.9 3.2
폴리머 0.9 1.3 9.1
분획 0.8 1.1 0.5
9.0 모노머 94.3 94.9 87.5
다이머 4.0 3.4 2.8
폴리머 0.9 1.0 8.9
분획 0.8 0.7 0.8
9.2 모노머 94.3 94.3 87.3
다이머 4.0 4.0 2.8
폴리머 0.9 1.0 9.2
분획 0.8 0.7 0.7
DF = 투석여과; 폴리머= 다이머 보다 큼
표 12 HPSEC으로 측정한 분자 분포(실시예 6: 로트 1, 25% 알부민)
DF pH 분자의 크기(%) 정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
6.2 모노머 92.3 92.2 87.3
다이머 5.2 6.0 3.4
폴리머 0.6 1.3 8.9
분획 1.9 0.5 0.4
9.0 모노머 92.3 93.5 87.8
다이머 5.2 5.1 2.7
폴리머 0.6 0.9 8.7
분획 1.9 0.05 0.8
9.2 모노머 92.3 92.4 87.4
다이머 5.2 5.4 3.2
폴리머 0.6 1.0 8.9
분획 1.9 1.2 0.5
DF = 투석여과; 폴리머= 다이머 보다 큼
표 13: HPSEC으로 측정한 분자 분포(실시예 6: 로트 2, 25% 알부민)
DF pH 분자의 크기(%) 정화된 Fraction V 용액(SM) 투석여과된 Fraction V 용액(DS) 최종 용기 알부민 용액(FS)
6.2 모노머 88.1 93.5 87.3
다이머 8.8 4.8 2.3
폴리머 0.9 0.6 8.3
분획 2.2 1.1 0.7
9.0 모노머 88.1 94.1 89.3
다이머 8.8 4.1 2.1
폴리머 0.9 1.0 8.3
분획 2.2 0.8 0.3
9.2 모노머 88.1 93.9 87.8
다이머 8.8 4.8 2.5
폴리머 0.9 0.7 8.9
분획 2.2 0.6 0.8
DF = 투석여과; 폴리머= 다이머 보다 큼
표 11, 12 및 13에 나타나 있는 바와 같이, 투석여과 전에 모노머의 함량은 88.1% 내지 94.3%였고, 다이머의 함량은 4.0% 내지 8.8%였고, 폴리머의 함량은 0.6% 내지 0.9%였고, 분획의 함량은 0.8 내지 2.2%였다. 투석 여과 후에는, 모노머의 함량은 92.2% 내지 94.9%였고, 다이머의 함량은 3.4% 내지 6.0%였고, 폴리머의 함량은 0.6% 내지 1.3%였고, 분획의 함량은 0.4 내지 1.2%였다. 최종 용기 용액의 모노머 함량은 87.2% 내지 89.3%로, 이 명세서 내의 모든 함량은 80% 이상이었다. 또한, 다이머, 폴리머 및 분획의 함량은 모두 특정한 범위 내에 있다(각각 9%, 15% 및 6% 이하).
3가지 제제 사이에 모노머, 다이머, 폴리머 및 분획의 상대적인 함량에서 큰 차이가 있기는 하지만, 각 제제 내에서 이러한 차이는 현저하지는 않다.
실시예 10
20% 및 25% 알부민의 최종 용기 용액 내에서 단백질 2차 구조
알부민 용액의 최종 용기의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼의 중첩 플렛(도 12)에서는 샘플내에 함유된 단백질의 구조가 질적으로 매우 유사하다는 것이 밝혀졌다. CD 테스트는 Common Wealth Biotechnologies, Inc.(미국 버지니아주의 Richmond 소재)에서 실시하였다.
실시예 11
20% 및 25%의 알부민의 최종 용기 용액의 시차주사 열량측정(DSC) 결과
알부민의 최종 용기 용액의 DSC 결과를 표 14에 요약하였다. 대조군(pH 6.2에서 투석 여과)과 샘플(pH 8.8, 9.0 및 9.2에서 투석 여과)의 용융 온도, 몰비열(molar heat) 및 Van't Hoff 열 변환(Hv)는 평균의 ±2의 표준편차 이내에 있었다. 이러한 데이터에서는 실시예 5 및 6에서 준비한 3개의 로트 모두에서 얻은 최종 용기 샘플 중에서 2차 단백질 구조에서 현저한 차이는 없었다는 것을 가리킨다. DSC 테스트도 Common Wealth Biotechnologies, Inc.(미국 버지니아주 Richmond 소재)에서 실시하였다.
표 14
알부민 최종 용기 용액의 시차주사 열량측정 결과
샘플 투석여과 pH 용융온도(℃) 몰비열,H(cal/mol) Vhoff,Hv(cal/mol)
실시예 520% 알부민 6.2 66.27 2.29E+05 9.88E+04
8.8 67.17 2.39E+05 9.91E+04
9.0 67.40 2.59E+05 1.03E+05
9.2 67.52 2.30E+05 1.04E+05
실시예625% 알부민로트 1 6.2 66.38 2.28E+05 9.53E+04
9.0 66.51 2.24E+05 9.38E+04
9.2 66.38 2.37E+05 9.27E+04
실시예 625% 알부민로트 2 6.2 66.61 2.34E+05 1.02E+05
9.0 66.08 2.42E+05 9.79E+04
9.2 66.80 2.39E+05 9.97E+04
평균 적용안됨 66.76 2.37E+05 9.86E+04
표준 편차 적용안됨 0.50 9.89E+03 3.81E+03
실시예 12
20% 및 25% 알부민의 최종 용기 용액의 총 단백질, 열 안정성 및 형태
실시예 5 및 6에 설명된 바와 같은 20% 및 25% 알부민의 최종 용기 용액(FS)에서 총 단백질 농도를 표 15에 나타내었다. 시판하는 알부민 용액에서 총 단백질 함량은 18.8 내지 21.2 g/100㎖(20% 알부민) 또는 23.5 내지 26.5 g/100㎖(25 알부민)이여야 한다는 통상적인 요건이 있다.
표 15
20% 및 25% 알부민의 최종 용기 용액에서 단백질 농도
알부민 제제 DF pH 총단백질(g/100㎖)
20% 알부민(실시예 5) 6.2 20.5
8.8 19.9
9.0 19.6
9.2 19.0
25% 알부민로트 1(실시예 6) 6.2 23.9
9.0 23.5
9.2 24.1
25% 알부민로트 2(실시예 6) 6.2 27.3
9.0 23.5
9.2 23.5
표 15에서 나타난 바와 같이, 20% 알부민의 최종 용기의 단백질 함량은 19.0 내지 20.5 g /100㎖인 것으로, 요건인 18.8 내지 21.2g/100㎖의 범위 내에 속하는 것이다. 또한, 25% 알부민 로트 1의 최종 용기의 단백질 농도는 23.5 내지 24.1g/100㎖인 것으로, 이는 요구 범위인 23.5 내지 26.5g/100㎖의 범위 내에 속하는 것이다. 로트 2(25% 알부민)의 3개의 최종 용기의 단백질 농도는 27.3g/100㎖인 것으로, 이는 요구 범위 보다도 0.8 g/100㎖ 더 높은 것이다. 그러나 단백질 함량에서 작은 차이가 알부민 최종 용기 제품 또는 제품에서 알루미늄의 수준에 부정적인 영향을 주어서는 안된다.
열안정성 시험(표 16에 도시됨)에서는 다양한 투석여과 pH값에서 실시한 실시예 5 및 6에서 제조된 20% 및 25% 알부민은 특정한 수준의 범위 내에 존재하였다(가열 전과 후에 극명하게 대조군에서는 16NTU 또는 샘플에서는 21NTU를넘지 않음).
표 16
알부민 최종 용기 용액의 열 안정성
알부민 제제 DF pH 가열 전 육안 관찰 가열 후 육안 관찰 투명성(NTU)
대조군 샘플 대조군 샘플 가열전 대조군 가열후 샘플
20% 알부민(실시예 5) 6.2 투명 투명 가열안됨 투명 6.0 7.0
8.8 투명 투명 가열안됨 투명 6.4 7.2
9.0 투명 투명 가열안됨 투명 6.0 6.9
9.2 투명 투명 가열안됨 투명 6.1 7.0
25% 알부민(실시예 6, 로트 1) 6.2 투명 투명 가열안됨 투명 4.8 5.7
9.0 투명 투명 가열안됨 투명 5.1 5.8
9.2 투명 투명 가열안됨 투명 5.4 6.5
25% 알부민(실시예 6, 로트 2) 6.2 투명 투명 가열안됨 투명 4.4 5.0
9.0 투명 투명 가열안됨 투명 4.2 5.1
9.2 투명 투명 가열안됨 투명 4.5 5.3
* 탁도는 30-mL Hach 비율의 샘플 셀을 이용하여 측정하였음.
마지막으로, 높은 pH에서 투석여과된 알부민 산물의 형태가 투명하고, 약간 점질이며, 다양한 색도의 녹색 또는 호박색 내지 딸기 색상의 용액일 것을 요구하는 상업적 요건 내에 있는 것인지를 판단하기 위해 모든 최종 용기 용액을 육안으로 관찰하였다. 모든 최종 용기 샘플은 투명하고, 호박색이며 약간 점질인 것으로, 이 요건 범주 내에 있다는 것을 알았다.
8.8 내지 9.2 범위의 pH에서 정화된 Fraction V 용액을 투석여과하여, 최종 알부민 용액의 측정가능한 특성을 현저하게 변경시키는 일없이, 최종 알부민 용액의 시트레이트 함량을 검출 한계(29 ppm 또는 0.10 mM) 이하로 낮추고, 알루미늄의 수준을 감소시켰다.
상기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, pH-조절된 단백질 용액의 순수에 대한 투석여과는 시트레이트와 알루미늄 이온을 제거하기 위한 간단하고 효과적인 방법이다. 상기에서 단백질의 pH를 약 7로 조정하고, 순수에 대해 투석여과하여, 다가 이온, 1가 이온, 염, 용매 및 기타 저분자량의 분자를 동시에 단백질로부터 제거할 수 있다.
단백질 용액으로부터 오염물을 제거하는 방법의 실시형태를 설명하는 상기 기재는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 그러나 당업자라면 본 발명은 변경할 수 있는 것으로, 상기에 기재된 특정 실시형태로 제한되는 것은 아니라는 것을 분명히 알 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 다음의 청구 범위에서 정해지는 것이다.

Claims (33)

  1. 단백질 및 다가 이온을 포함하는 수용액을 제공하는 단계;
    상기 수용액의 pH를 약 7 내지 약 10으로 조정하는 단계; 및
    상기 수용액을 순수에 대해 투석여과하여 다가 이온을 포함하는 여과물과 단백질을 포함하는 잔류물을 제공하는 단계
    를 포함하는 단백질로부터 다가 이온을 제거하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    다가 이온이 알루미늄 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 다가 이온 제거 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질이 알부민, 면역글로불린, 인자 Ⅷ(Factor Ⅷ), 인자 Ⅸ(Factor Ⅸ), 알파-1-단백질분해효소 저해제, 및 프로트롬빈 복합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 다가 이온 제거 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 수용액이 상기 수용액의 용량의 적어도 약 3배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 다가 이온 제거 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 수용액이 수용액의 용량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 다가 이온 제거 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 수용액이 수용액의 중량의 적어도 약 3배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 다가 이온 제거 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 수용액이 수용액의 중량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 다가 이온 제거 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 약 8.5 내지 약 9.5로 조정하는 다가 이온 제거 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 약 8.8 내지 약 9.2로 조정하는 다가 이온 제거 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 수용액이 가용화된 Cohn Fraction V인 다가 이온 제거 방법.
  11. 단백질 및 다가 이온을 포함하며, pH가 약 7 내지 약 10으로 조정된 수용액을 공급 탱크에 도입하는 단계;
    상기 공급 탱크에서 상기 수용액을 펌프에 의해 투석여과기에 공급하여 상기 단백질을 포함하는 잔류물 및 다가 이온을 포함하는 여과물을 제조하고 상기 여과물은 F1의 속도로 상기 투석여과기로부터 제거하는 단계;
    상기 잔류물을 상기 공급 탱크로 이송시키는 단계;
    상기 공급 탱크 내의 잔류물에 순수를 첨가하여 희석된 잔류물을 제공하는 단계; 및
    상기 공급 탱크로부터 희석된 잔류물을 투석여과 장치를 통해 공급 탱크로 펌프에 의해 되돌리고 상기 단백질로부터 다기 이온을 제거할 때까지 순수를 첨가하는 것을 반복하는 단계
    를 포함하는 단백질로부터 다가 이온을 제거하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    다가 이온이 알루미늄, 시트레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 다가 이온 제거 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 단백질이 알부민, 면역글로불린, 인자 Ⅷ(Factor Ⅷ), 인자 Ⅸ(Factor Ⅸ), 알파-1-단백질분해효소 저해제, 및 프로트롬빈 복합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 다가 이온 제거 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 단백질이 알부민이고 상기 다가 이온이 시트레이트인 다가 이온 제거 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 단백질이 알부민이고 상기 다가 이온이 알루미늄인 다가 이온 제거 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 순수가 상기 수용액의 용량의 적어도 약 3배의 양으로 첨가되는 다가 이온 제거 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 순수가 상기 수용액의 용량의 적어도 약 5배의 양으로 첨가되는 다가 이온 제거 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 순수가 상기 수용액의 중량의 적어도 약 3배의 양으로 첨가되는 다가 이온 제거 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 순수가 상기 수용액의 중량의 적어도 약 5배의 양으로 첨가되는 다가 이온 제거 방법.
  20. 제11항에 있어서,
    상기 순수가 약 F1의 속도로 첨가되는 다가 이온 제거 방법.
  21. 제11항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 약 8.8 내지 약 9.2로 조정하는 다가 이온 제거 방법.
  22. 알부민 및 시트레이트 이온을 포함하는 수용액을 제공하는 단계;
    상기 수용액의 pH를 약 7.0 내지 약 10.0으로 조정하는 단계; 및
    상기 pH가 조정된 수용액을 순수에 대해 투석여과하여 알부민을 포함하는 잔류물 및 시트레이트 이온을 포함하는 여과물을 제공하는 단계
    를 포함하는 단백질로부터 시트레이트 이온을 제거하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 수용액이 가용화된 Cohn Fraction Ⅴ인 시트레이트 이온 제거 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 수용액의 pH가 약 8.5 내지 약 9.5로 조절되는 시트레이트 이온 제거 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 수용액의 pH가 약 8.8 내지 약 9.2로 조절되는 시트레이트 이온 제거 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 pH가 조정된 수용액이 상기 수용액의 중량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 시트레이트 이온 제거 방법.
  27. 제22항에 있어서,
    상기 pH가 조정된 수용액이 상기 수용액의 용량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 시트레이트 이온 제거 방법.
  28. 알부민 및 알루미늄 이온을 포함하는 수용액을 제공하는 단계;
    상기 수용액의 pH를 약 7.0 내지 약 10.0으로 조정하는 단계; 및
    상기 pH가 조정된 수용액을 순수에 대해 투석여과하여 알부민을 포함하는 잔류물 및 알루미늄 이온을 포함하는 여과물을 제공하는 단계
    를 포함하는 단백질로부터 알루미늄 이온을 제거하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 수용액이 가용화된 Cohn Fraction V인 알루미늄 이온 제거 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 약 8.5 내지 약 9.5로 조정하는 알루미늄 이온 제거 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 수용액의 pH를 약 8.8 내지 약 9.2로 조정하는 알루미늄 이온 제거 방법.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 pH가 조정된 수용액이 상기 수용액의 중량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 알루미늄 이온 제거 방법.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 pH가 조정된 수용액이 상기 수용액의 용량의 적어도 약 5배의 양의 순수에 대해 투석여과되는 알루미늄 이온 제거 방법.
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