KR20030009529A

KR20030009529A - 다발성 경화증의 치료를 위한 신규 인터페론

Info

Publication number: KR20030009529A
Application number: KR1020027017090A
Authority: KR
Inventors: 에드워드 엠. 크로즈; 다릴 파울즈; 티. 차리스 와그너
Original assignee: 쉐링 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2001-06-18
Publication date: 2003-01-29
Also published as: JP2004505021A; SI21080A; US20020025304A1; EE200200693A; RU2003100517A; NO20025964L; BR0111852A; SK17612002A3; PL359562A1; CZ20024094A3; WO2001095929A3; BG107370A; AU2001267099A1; LT2002123A; CA2413077A1; NO20025964D0; IL152996A0; NZ522849A; HUP0300787A2; WO2001095929A2

Abstract

본 발명은 인터페론-베타-2 ("IFN-β2")를 코딩하는 신규 핵산 및 폴리펩티드 서열에 관한 것이다. 제약상 허용가능한 부형제를 포함하고 인간 IFN-β2 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 유도체를 치료 유효량으로 포함하는 제약 조성물은 인간의 다발성 경화증 치료에 유용하다.

Description

다발성 경화증의 치료를 위한 신규 인터페론 {Novel Interferon for the Treatment of Multiple Sclerosis}

인터페론은 세포 증식 및 면역 반응 등을 비롯한 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포간 신호전달 단백질이다.

도 1은 인간 인터페론-베타-2 (IFN-β2)의 뉴클레오티드 서열 (5' 및 3' 서열 포함)을 나타낸다.

도 2는 인간 인터페론-베타-2의 아미노산 서열을 나타낸다. IFN-β2에 대한 오픈 리딩 프레임의 번역을 나타낸다. 신호 서열은 이탤릭체로 나타내었고, 2개의 잠재적인 N-글리코실화 부위 및 이황 결합을 형성할 수 있는 시스테인은 밑줄 및 굵은체로 나타내었다.

도 3은 제I형 인터페론의 3차원 구조를 나타낸다. 모든 3종의 IFN은 5개의 나선형 다발의 모티프를 공유하며, 이는 인간 제I형 IFN에 공통적인 특징이다. 또한, IFN-β1b 및 IFN-β2은 잠재적인 N-글리코실화 부위의 위치 및 제안된 이황 결합의 위치가 서로와 유사하다. 오직 IFN-β2에만 독특한 C-말단 아미노산 서열이 존재한다.

도 4는 인간 인터페론-베타-2를 다른 유형의 인터페론과 비교한 단백질 정렬이다.

도 5는 인간 제I형 및 제II형 인터페론에 대해 IFN-β2를 계통발생학적으로 비교한 것이다. 시스테인 보존 양상을 기초로 하는 잠재적인 N-글리코실화 부위 및 계통발생학적 분석에서, IFN-β2는 임의의 다른 인터페론 보다도 IFN-β와 더욱 밀접한 관계가 있다.

도 6은 인간 인터페론-베타-2에 대한 제I형 IFN-의존성 ISRE-루시퍼라제 리포터 분석을 나타낸다.

도 7은 항-IFN-β2 폴리클로날 항체를 사용한, 인간 제I형 인터페론 수용체에 대한 IFN-β2의 결합 억제 결과를 나타낸다.

도 8A 및 도 8B는 세포 증식에 대한 인터페론의 효과를 나타낸다.

도 9는 인간 세포에 대한 IFN-β2의 항-증식 활성을 예시한다.

도 10은 인간 세포에 대한 인터페론의 항-바이러스 활성을 나타낸다.

도 11은 제I형 인터페론 수용체와의 결합에 대하여 IFN-α2 와 IFN-β2 사이의 경쟁을 나타낸다.

도 12는 인간 IFN-β2의 5' 게놈 뉴클레오티드 서열이다.

도 13은 인간 IFN-β2의 5' 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

도 14는 인간 IFN-β2의 5' 폴리펩티드 서열이다.

도 15는 IFN-β2과의 반응에서 인간 태아 성상세포의 항-증식을 나타낸다: 도 15A는 자극하지 않은 태아 뇌 배양물 1이고, 도 15B는 EGF로 자극시킨 태아 뇌배양물 1이고, 도 15C는 자극하지 않은 태아 뇌 배양물 2이며, 도 15D는 EGF로 자극시킨 태아 뇌 배양물 2이다.

인터페론-베타-2 ("IFN-β2")는 항-종양 작용, 항-바이러스 작용 및 면역조절 작용 등을 비롯한 수많은 생물학적 효과를 발휘하는 세포간 신호전달 폴리펩티드의 한 클래스이며, 이를 코딩하는 신규 핵산, 폴리펩티드 서열 및 핵산 조절자가 확인된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Cirelli and Tyring, Clin. Immunother. 3, 27-87, 1995]을 참조한다. 본 발명의 인터페론 폴리펩티드, 이의 단편 및 이의 유도체는 IFN-β2 생물활성 및 IFN-β2-특이적 면역원성 활성 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 1가지 이상의 생물학적 활성을 보유한다.

"IFN-β2 생물활성"은 기능적 효과, 예를 들어 세포 막 변경, 항-종양유전자 조절, 항-종양 활성, 항-바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항-성장 활성, 항-증식, 림프구의 세포독성 증대, 면역조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제, 대식세포의 활성화, 종양유전자의 하향조절 등; 면역학적 효과, 예를 들어 항체 형성의 감소, 세포 막 성분 (주조직적합성복합체, Fc 수용체, β2-마이크로글로불린)의 증가, 세포-매개 면역의 조정, 사이토킨 (예를 들어 인터루킨) 생성의 증가, 세포독성 T 세포의 효과 증가, 대식세포의 효과 증가 및 천연 킬링 (killing)의 증가; 인터페론 수용체 결합 활성, 예를 들어 인터페론 제I형 수용체, 특히 이의 IFNAR2c 쇄와의 결합 및 이러한 수용체 결합 등에 의해 자극되는 세포 효과; 세포내 신호전달 분자 (예를 들어 Jak1, Tyk2, Stat1, Stat2, IRS-1, IRS-2, CrkL,CrkII, Vav 등 및 다른 다운스트림 이펙터 (예를 들어 MAPK))의 활성화 및(또는) 이와의 결합 등을 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Platanias and Fish, Exp. Hematology, 27:1583-1592, 1999]을 참조한다.

"항-증식 활성"이라는 어구는 본 발명에 따른 IFN-β2가 세포 성장을 억제하거나 아폽토시스 (apoptosis)를 유도한다는 것을 의미한다. 이는 하기의 실시예에도 예시되어 있다. 또한, 도 8, 도 9 및 도 15를 참조한다. 예를 들면, IFN-β2는 뇌에서의 성상세포 증식을 억제한다. 이러한 활성은 다발성 경화증 등의 치료에 유용한데, 이는 성상세포의 증식이 다발성 경화증의 특징인 뉴런 염증을 초래할 수 있기 때문이다. 성상세포의 성장을 억제함으로써, IFN-β2는 염증을 감소시키고 상기 질환을 경감시킨다. 그러므로, 본 발명은 IFN-β2를 성상세포 증식 억제 및(또는) 염증 감소에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증의 치료 방법에 관한 것이다.

"IFN-β2-특이적 면역원성 활성"은 예를 들어 IFN-β2 폴리펩티드가 IFN-β2에 대해 선택적이거나 우선적인 면역학적 반응, 예를 들어 포유동물의 IFN-β2에 선택적인 면역학적 반응을 유발한다는 것을 의미한다. 그러므로, 포유동물의 IFN-β2, 예를 들어 도 2의 IFN-β2로부터 선택된 아미노산 서열 등에 의한 항체, T-세포, 대식세포, B-세포, 수초 세포 등의 자극은 특이적 면역원성 활성이다. 이들 반응은 통상적으로 측정할 수 있다.

IFN-β2는 천연 공급원로부터 수득가능하고 상기 언급한 생물활성 1가지 이상을 보유하는 아미노산 서열을 갖는, 포유동물의 전장 폴리펩티드이다. 이는 개시 코돈에서 출발하여 정지 코돈에서 종결하는 오픈 리딩 프레임을 가지며, 도 2에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는다. 이는 천연 발생 정상 서열, 천연 발생 돌연변이체 서열 및 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 서열 등을 포함하는 천연 발생 다형성 서열을 포함한다. 천연 공급원의 예로는 원발성 및 불멸화 세포주, 생검(生檢)된 조직 등을 포함하는 조직 또는 온전한 유기체, 배양된 세포주 등으로부터 수득가능한 살아있는 세포 등이 있다.

또한, 본 발명은 포유동물의 IFN-β2 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 "생물학적으로 활성"인 것이 바람직하다. "생물학적으로 활성"은 폴리펩티드 단편이 살아있는 시스템에서 또는 살아있는 시스템의 성분들과 함께 있을 때 활성을 보유한다는 것을 의미한다. 생물학적 활성으로는 상기에서 언급한 활성, 예를 들어 IFN-β2-생물활성 및 IFN-β2-특이적 면역원성 활성 등이 있다. 단편은 화학적 합성, 유전공학, 절단 생성 등을 포함하는 임의의 원하는 방법에 따라 제조할 수 있다. IFN-β2의 생물학적 활성 단편은 상기 단백질의 카르복시-말단 또는 아미노-말단을 제거하거나 변형시킨 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

도 12 및 도 13의 핵산 및 이의 단편은 제외하는 것이 바람직하다. 도 14의 폴리펩티드 및 이의 단편은 제외하는 것이 바람직하다. 그러나, 이들 서열을 함유하거나 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 전장 IFN-β2, 이들 언급한 단편들 중 2개 이상을 보유하는 폴리펩티드 또는 언급한 단편 중 하나 및 IFN-β2 또는 다른 공급원으로부터의 추가의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드는 제외하지 않는다.

또한, 본 발명은 도 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 1 내지 208의 추정 서열을 갖는 IFN-β2에 관한 것이다. 이의 분자량 계산치는 약 23,000 달톤이고, 예측되는 등전점(等電點)은 8.1이다. 이는 SDS-PAGE를 통해 측정한 바에 따른 분자량이 약 26,000 달톤인 산-안정한 단백질이다. 대장균에서 생성된 비글리코실화 형태의 분자량은 약 20,500 달톤이다. 하기의 실시예를 참조한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 이는 아미노산 -1 내지 -21에 예측되는 신호 서열이 있고, 아미노산 74 내지 77 및 아미노산 83 내지 86에 2개의 잠재적인 N-글리코실화 부위가 있으며, 아미노산 32, 142 및 154에 시스테인 잔기가 있다. 이황 결합은 시스테인 잔기 32와 142 사이에 형성될 것이라 예측된다. 이는 아미노산 위치 7 내지 24의 나선 A, 아미노산 위치 55 내지 69의 나선 B, 아미노산 위치 83 내지 95의 나선 C, 아미노산 위치 118 내지 134의 나선 D 및 아미노산 위치 143 내지 158의 나선 E를 포함한다.

성숙한 IFN-β2는 도 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 -1 내지 -21이 없는 IFN-β2를 지칭하며, 이는 아미노산 187개 길이이다. 또한, 다른 공지된 유형의 인터페론들과 비교할 때, 이는 C-말단에 독특한 18개 아미노산 연장부가 있다. 이러한 연장부를 뉴클레오티드 및 아미노산 수준 모두에서 IFN-β2에 대한 마커로서 사용할 수 있으며, 이종 폴리펩티드에 융합시킬 수 있다.

본 발명의 IFN-β2 폴리펩티드, 예를 들어 도 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 IFN-β2 폴리펩티드를 임의의 적합한 방법으로 분석하여 막 스패닝 (spanning) 영역, 소수성 영역 등을 비롯하여 상기 폴리펩티드에 있는 다른 구조적 및(또는) 기능적 도메인을 확인할 수 있다. 예를 들어, IFN-β2 폴리펩티드는 문헌 ([Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105, 1982], [EMBL Protein Predict; Rost and Sander, Proteins, 19:55-72, 1994]) 등에 개시된 방법을 통해 분석할 수 있다.

본 발명의 IFN-β2의 다른 상동체는 포유동물 공급원 및 포유동물이 아닌 공급원으로부터 다양한 방법에 따라 수득할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 코딩 영역을 증폭하기 위한 프라이머: 5'-ATG ATT ATC AAG CAC TTC TTT GGA-3' 및 5'-CTA CCT CGG GCT TCT AAA CTC TGT-3')를 사용한 혼성화를 이용할 수 있다. 대장균에서의 발현에 사용되는 프라이머는 5'-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3' 및 5'-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3'이다. 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, Chapter 11, 1989] 등에 기재된 바와 같이, 5' 및 3'의 비번역되는 게놈 서열을 포함하는 공지된 전장 서열에 대한 프라이머인 5'-TTT AGG TGA CAC TAT AGA AT-3' 및 5'-TAA AAT GGA TAG AAT ATA TAA-3'를 사용하여 상동체를 선택할 수 있다. 이러한 상동체는 IFN-β2에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 동일성 및 서열 유사성 정도가 다양할 수 있다. 포유동물 유기체의 예로는 설치류, 마우스, 래트, 햄스터, 원숭이, 유인원, 돼지, 소, 말, 개, 고양이 등이 있다. 포유동물이 아닌 유기체의 예로는 척추동물, 무척추동물, 제브라다니오, 닭, 초파리, 선충 (C. elegance), 제노푸스, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 폼베 (S. pombe), 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 회충, 원핵생물, 식물, 아라비돕시스 (Arabidopsis), 갑각류, 아르테미아, 바이러스 등이 있다. 혼성화를 위한 올리고뉴클레오티드를 선택하기 위해서, 효과적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IFN-β2를 다른 유형의 IFN-β2와 비교하여 본 발명의 IFN-β2에만 존재하는 아미노산 서열 (즉, 비보존되거나 IFN-β2에 "특이적인" 서열)을 선택함으로써 IFN-β2-특이적 영역을 확인할 수 있다. 예를 들어, 상이한 유형의 인터페론들 사이의 보존 영역 및 비보존 영역을 나타낸 도 4를 참조한다. 비보존된 아미노산 서열 (예를 들어 KSLSP)을 선택할 수 있고, 이 서열을 기초로 동의성 (degenerate) 프로브를 고안할 수 있다. 또한, 문헌 [Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96:3658-3663, 1999]을 참조한다. 컴퓨터 프로그램인 BLAST 세트를 사용한 유전자/단백질 데이타베이스 검색 등을 통해, 다른 특이적 (즉, 비보존된) 및(또는) 보존된 아미노산 서열을 통상적으로 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 IFN-β2-특이적 아미노산 서열, 예를 들어 도 2 및 도 4의 특정 서열에서는 발견되나, 다른 유형의 인터페론들에서는 발견되지 않는 한정된 아미노산 서열에 관한 것이다. 바람직한 폴리펩티드는 약 8개 이상, 예를 들어 약 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 21개, 22개, 25개, 30개, 40개, 50개 등의 연속적인 아미노산이다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어 KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRANI, AEKLSGT, CLFFVFS 및 QGRPLNDMKQELTTEFRSPR 및 이의 단편을 포함할 수 있다. IFN-β2-특이적 아미노산 서열 또는 모티프는 이들 서열 또는 모티프에 특이적인 면역 반응을 유발하기 위한 항원으로서의 펩티드 생성에 유용할 수 있다. 진단 목적 또는 연구 목적을 위해서, 이러한 면역화를 통해 수득한 항체를 발현 마커 등을 비롯하여 포유동물의 IFN-β2 단백질에 대한 특이적 프로브로 사용할 수 있다.

언급한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 IFN-β2에 대한 다양한 아미노산 서열 (예를 들면, 전장 서열, 즉, 도 1에 나타낸 바와 같은 출발 코돈 및 정지 코돈을 갖는 서열; 성숙한 아미노산 서열, 즉, IFN-β2 폴리펩티드가 성숙한 폴리펩티드로 프로세싱되는 전구체로서 생성될 아미노산 서열 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 유용한 단편의 예로는 상기 언급한 도메인 중 임의의 도메인 및 도 2 및 도 4에 나타낸 바와 같은 특이적 또는 보존된 아미노산 서열을 포함하거나 필수적으로 이들로 구성된 단편 등이 있다.

본 발명의 IFN-β2 폴리펩티드 단편으로는 항-바이러스 활성, 면역조정 활성, 항-성장 활성 등을 비롯한 특이적인 생물학적 활성을 갖는 것을 선택한다. 이러한 활성의 측정은 공지된 바와 같이 수행할 수 있다. 하기를 참조한다. 이들 펩티드는 EP 496 162에 기재된 바와 같이 확인하고 제조할 수도 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 도 2에 도시한 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 100％ 이하일 수도 있다. 하기의 논의에서, 서열 동일성은 도 1 및 도 2에 도시한 서열에 나타낸 것과 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 비교된 서열(들)의 상응하는 위치에서 발견된다는 것을 의미한다. 도 1 및 도 2에 도시한 아미노산 서열과의 서열 동일성이 100％ 미만인 폴리펩티드는 상동성 및 비-상동성 아미노산 치환 등을 비롯하여 천연 발생 서열로부터의 다양한 치환을 함유할 수 있다. 하기의 상동성 아미노산 치환의 예를 참조한다. IFN-β2 폴리펩티드와 비교한 서열에서 동일한 잔기 및 상동성 잔기의 합을 전체 잔기 수로 나눈 값이 서열 유사성(％)이다. 서열 동일성 및 서열 유사성을 계산하기 위해서, 비교할 서열을FASTA, BLASTA 등을 비롯한 컴퓨터 프로그램, 알고리즘 등의 임의의 원하는 방법에 따라 정렬하고 계산할 수 있다.

도 2의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 100％ 미만인 폴리펩티드의 서열 동일성은 약 99％, 98％, 97％, 96％, 95％, 94％, 93％, 92％, 91％, 90％, 88％, 85％, 80％, 75％, 70％이거나 약 53％ 정도일 수도 있다.

또한, 본 발명은 IFN-β2의 폴리펩티드 뮤테인 (muteins), 즉, 아미노산 서열이 천연 공급원으로부터 수득가능한 아미노산 서열과 상이한 임의의 폴리펩티드에 관한 것이다 (포유동물의 IFN-β2 단편은 천연 발생 IFN-β2와 아미노산 수는 상이하지만 아미노산 서열은 상이하지 않음). 그러므로, IFN-β2 폴리펩티드 뮤테인은 비-천연 발생 아미노산을 포함하는, 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다.

또한, 본 발명의 IFN-β2 아미노산 서열에 관한 뮤테인은 유전자 데이타 은행인 진뱅크 (Genbank), EMBL 등으로부터의 상동성 검색을 기초로 제조할 수도 있다. 서열 상동성 검색은 BLAST 패밀리의 컴퓨터 프로그램, 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘 등에 기재된 알고리즘 등을 포함하는 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 폴리펩티드들 사이에 동일하고(하거나) 상동성인 도메인 내에 있는 아미노산을 확인하고 정렬한 후, 상기와 같은 정렬을 기초로 아미노산을 변형시켜 뮤테인(들)을 서열에 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 IFN-β2는 도 4에 나타낸 바와 같이 여러가지 공지된 인터페론들과 서열 동일성을 공유한다. 이들 폴리펩티드를 보존된 아미노산 잔기에서 정렬하여, 변형될 경우에 IFN-β2의 생물학적 활성, 예를 들어 수용체 결합 활성 등을 줄이거나 감소시키거나 제거할 것이라 예측되는 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, 정렬을 통해 2개 이상의 도메인들 사이에 보존되어 있는 동일한 아미노산들을 밝혀낸 경우, 상기 아미노산(들)을 제거 또는 치환하면 생물학적 활성에 부정적인 영향을 미칠 것이라 예측된다.

또한, 아미노산 치환은 하나의 상동성 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하여 수행할 수도 있다. 상동성 아미노산들은 측쇄의 크기 및 극성 정도를 기초로 예를 들어 다음과 같이 분류될 수 있다: 작은 비극성 아미노산 - 시스테인, 프롤린, 알라닌, 트레오닌; 작은 극성 아미노산 - 세린, 글리신, 아스파르테이트, 아스파라진; 큰 극성 아미노산 - 글루타메이트, 글루타민, 라이신, 아르기닌; 중간 크기의 극성 아미노산 - 티로신, 히스티딘, 트립토판; 큰 비극성 아미노산 - 페닐알라닌, 메티오닌, 루이신, 이소루이신, 발린. 또한, 상동성 아미노산을 다음과 같이 분류할 수도 있다: 비대전된 극성 R기 - 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민; 산성 아미노산 (음으로 대전됨) - 아스파르트산 및 글루탐산; 염기성 아미노산 (양으로 대전됨) - 라이신, 아르기닌, 히스티딘. 상동성 아미노산은 문헌 ([Dayhoff., Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978] 및 [Argos., EMBO J., 8, 779-785, 1989])에 기재된 아미노산들을 포함할 수도 있다.

IFN-β2의 활성에 영향을 주지 않은 뮤테인을 제조할 수도 있고, 또는 IFN-β2의 활성을 야생형의 활성에 비해 감소 또는 증가시킨 뮤테인을 제조할 수도 있다. 돌연변이체는 다른 IFN-β2, 예를 들어 섬유아세포 인터페론 (베타-1) 및 알파-인터페론 등과 유사하게 제조될 수 있다. 예를 들어, IFN-β2는 인터페론에 전형적인 특징적인 5개의 나선형 다발로 폴딩된다: 아미노산 위치 7 내지 24의 나선 A, 아미노산 위치 55 내지 69의 나선 B, 아미노산 위치 83 내지 95의 나선 C, 아미노산 위치 118 내지 134의 나선 D 및 아미노산 위치 143 내지 158의 나선 E. 이들 나선은 랜덤 코일 또는 루프 영역에 의해 함께 모여 있다. 도 3을 참조한다. 문헌 [Runkel et al., Biochemistry, 39:2538-2551, 2000] 등에 기재된 바와 같이, 상기 나선형 구조에 대한 돌연변이체는 IFN-β1 (섬유아세포 인터페론)과 유사하게 제조할 수 있다. 예를 들어, A 나선, AB 루프 및 E 나선의 일부를 수용체 결합부에 포함시킨다. 또한, 문헌 [Piehler and Schreiber, J. Mol. Biol., 294:223-237, 1999]을 참조한다.

본 발명의 IFN-β2에는 섬유아세포 인터페론과 유사하게 아미노산 위치 32, 142 및 154에 3개의 시스테인 잔기가 있다. 위치 32 및 142의 시스테인 잔기는 섬유아세포 인터페론에서 이황 결합을 형성한다고 공지된 시스테인 잔기들과 위치면에서 유사하다. 섬유아세포 인터페론과 유사하게, 위치 154의 상기 아미노산은 결실되거나 중성 아미노산, 예를 들어 글리신, 발린, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 세린, 트레오닌 또는 메티오닌 등으로 치환될 수 있다. 세린 및 트레오닌이 바람직한데, 이는 이들이 시스테인과 화학적으로 유사하기 때문이다. 쌍을 형성하지 않는 시스테인을 제거하여 옳지 않은 분자내 및 분자간 이황 결합의 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,588,585호를 참조한다. 돌연변이는 미국 특허 제4,914,033호, 동 제5,545,723호 및 동 제5,580,723호에 따라 제조될 수도 있다. 또한, 예를 들어 문헌 ([Fish et al., J. Interferon Res., 12:257-66, 1992], [Fish et al., J. Interferon Res., 9:97-114, 1989], [DiMarco et al., J. Interferon Res., 13:139, 1993], [Mitsui et al., Pharmacol. Therap., 58:93-132, 1993], [Wang et al., J. Immunol., 152:705-715, 1994])을 참조한다.

본 발명은 뮤테인 폴리펩티드를 코딩하는 뮤테인 핵산에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 폴리펩티드 및 1개 이상의 아미노산 위치가 치환 및(또는) 결실된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산인 도 1의 뉴클레오티드 서열에 관한 것이며, 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 생물학적 활성을 보유하는데, 예를 들어 재조합적으로 발현될 때 박테리아 세포로부터의 회수율이 증대되거나 생물활성이 증대된다. 폴리펩티드 뮤테인 및 이의 상응하는 뉴클레오티드 코딩 서열은 1군데 이상의 위치가 상동성 아미노산으로 치환, 예를 들어 1, 5, 10, 15 또는 20군데가 치환된 경우를 제외하고는 도 2에 도시한 아미노산 서열일 수 있다. 변형이 상기에서 언급한 활성에 어떠한 영향을 미치는지는 상기 및 하기에 기재된 방법 및 당업자에게 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다.

IFN-β2 활성을 분석하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있다. 유용한 분석법의 예로는 항-바이러스 분석법, 예를 들어 CPE (예를 들어 미국 특허 제5,545,723호 및 동 제4,914,033호, 하기 실시예); 수용체 결합 (예를 들어 미국 특허 제5,545,723호 및 하기 실시예; STAT 활성화 (예를 들어 하기 실시예); IFN-β2 반응성 유전자 (예를 들어 루시퍼라제 등과 같은 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 인터페론-자극 반응 요소 (ISRE); 하기 실시예에 나타낸 바와 같음)의 활성화; 제I형 수용체의 인산화 (하기 실시예); 항-증식 (미국 특허 제4,914,033호, 세포주의 복제에 대한 IFN-β2의 억제력 평가; 하기 실시예); 면역조정 (미국 특허 제4,914,033호, 항체-의존성 세포의 세포독성; 문헌 [Noronha et al., J. Neuroimmunol., 46:145-154, 1993], T-림프구 및 이에 의한 IFN-감마 ("IFN-γ") 생성의 억제; 실험적 알레르기성 뇌척수염 ("EAE") (예를 들어 [Louboutin et al., Acta Neurol. Scand., 88:97-99, 1993], [Rott et al., Eur. J. Immunol., 23:1745-1751, 1993], 하기 실시예) 등이 있다.

또한, 본 발명의 포유동물 IFN-β2, 이의 단편 또는 치환된 폴리펩티드는 지질 변형, 메틸화, 인산화, 글리코실화, 공유 결합의 변형 (예를 들어 아미노산의 R기 변형), 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 아미노산 부가 등을 비롯한 다양한 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 재조합 방법, 합성법, 화학적 방법 등을 비롯한 다양한 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 (예를 들면, 전장, 이의 단편, 이의 돌연변이체)는 다양한 방법에 사용할 수 있으며, 예를 들어 분석법에 하기에 기재한 바와 같은 항체에 대한 면역원으로서, 생물학적 활성제 (예를 들어 본 발명의 IFN-β2와 관련된 활성을 1가지 이상 보유함)로서 사용할 수 있다.

본 발명의 IFN-β2, 이의 유도체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리펩티드를 1개 이상의 구조적 도메인, 기능적 도메인, 검출가능한 도메인, 항원성 도메인 및(또는) 원하는 관심 폴리펩티드와 자연계에서는 일어나지 않는 배열, 즉, 천연 발생이 아닌 배열로 결합시킬 수 있다. 이러한 특징을 포함하는 폴리펩티드가 키메라 또는 융합 폴리펩티드이다. 이러한 키메라 폴리펩티드는 화학적 방법, 합성법, 유사-합성법 및(또는) 재조합 방법 등을 비롯한 다양한 방법에 따라 제조할 수 있다. 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 핵산은 다양한 도메인 또는 원하는 폴리펩티드를 연속적으로 함유 (예를 들어 복수개의 N-말단 도메인을 사용하여 활성을 증대시키거나 안정화시킴)하거나 인트론, 스플라이싱 부위, 인핸서 등을 함유하는, 차단된 오픈 리딩 프레임을 함유할 수 있다. 상기 키메라 핵산은 다양한 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,439,819호를 참조한다. 도메인 또는 원하는 폴리펩티드는 신호전달 기능, 성장 촉진 기능, 세포 표적화 기능 (예를 들어 신호 서열, 표적 서열, 예를 들어 소포체 또는 핵을 표적으로 하는 서열) 등을 비롯한 생물학적 기능, 소수성 기능, 친수성 기능, 막-스패닝 기능 등을 비롯한 구조적 기능, 수용체-리간드 기능 및(또는) 예를 들어 효소, 형광성 폴리펩티드, 녹색 형광성 단백질 (문헌 [Chalfie et al., Science, 263:802, 1994], [Cheng et al., Nature Biotechnology, 14:606, 1996], [Levy et al., Nature Biotechnology, 14:610, 1996]) 등을 사용한 경우에는 검출가능한 기능 등을 포함하는 임의의 원하는 특성을 보유할 수 있다. 또한, 도메인은 예를 들어 안정성을 증대시키기 위해 면역글로불린 중쇄, 경쇄 및(또는) Fc 영역 등의 면역글로불린이거나 에피토프 태그 서열일 수도 있다.

또한, 숙주 세포에 도입시키는 경우, 폴리펩티드 또는 이의 일부를 선택가능한 마커로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 원하는 코딩 서열에 프레임내 (in-frame) 융합시키고, 정제, 선별 또는 마킹 (marking) 목적 등을 위한 태그로서 작용하도록 할 수 있다. 이러한 융합 영역은 절단 부위를 코딩하여 발현, 단리, 정제 등을 용이하게 할 수 있다.

또한, 본 발명의 IFN-β2 폴리펩티드 또는 이의 단편을 다른 사이토킨, 예를 들어 인터페론과 조합시켜 키메라 또는 하이브리드 IFN-β2를 제조할 수 있다. 이러한 하이브리드 IFN-β2는 알파, 오메가, 감마, 엡실론, 영양막, 태아 등을 비롯한 인터페론의 임의의 클래스 사이일 수 있다. 하이브리드 (및 상기 논의한 바와 같은 뮤테인)은 이들이 생성된 하이브리드에 비해 활성이 감소되거나 제한되도록, 예를 들어 세포 성장 조절 활성, 항-바이러스 활성 또는 면역조정 활성 등이 제한되도록 제조할 수 있다. 섬유아세포 인터페론과 알파-인터페론의 하이브리드, 예를 들어 섬유아세포 인터페론의 아미노산 약 47 내지 187, 74 내지 187, 1 내지 73 등을 사용하여 제조한 하이브리드에 관해서는 예를 들어 미국 특허 제4,758,428호를 참조한다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 발현 시스템, 예를 들어 생체내, 시험관내, 무세포, 재조합, 세포 융합 등의 발현 시스템 중에서 본 발명에 따라 제조할 수 있다. 이러한 시스템에 의해 부여되는 폴리펩티드 변형으로는 글리코실화, 아미노산 치환 (예를 들어 코돈 사용을 달리함으로써), 폴리펩티드 프로세싱, 예를 들어 소화, 절단, 엔도펩티다제 활성 또는 엑소펩티다제 활성, 지질 및 인산염 등과 같은 화학적 잔기의 부착 등이 있다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 통상적인 방법, 예를 들어 세정제 추출법 (예를 들어 비이온성 세정제, 트리톤 X-100, CHAPS, 옥틸글루코시드, Igepal CA-630), 상 추출법, n-부탄올 추출법, 황산암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 세파덱스, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기천공법, 친화성 크로마토그래피, SDS PAGE, CPG 크로마토그래피 (Controlled Pore Glass chromatography), 항체 친화성 크로마토그래피, 겔 여과법, 블루 세파로스, 페닐-아가로스 크로마토그래피, CPG 및 아연-킬레이팅 크로마토그래피 (예를 들어 [Heine and Billiau, Methods in Enzymology, 78 (Part A): 448-456, 1981), 시바크론 블루 (Cibacron Blue) F3GA-아가로스 및 HPLC [Kenny et al., Methods in Enzymology, 78 (Part A):435-447, 1981]) 등을 비롯하여, 다른 인터페론 및 다른 재조합 단백질에 적용되는 방법 등에 따라 천연 공급원, 형질전환된 숙주 세포 (배양 배지 또는 세포)로부터 회수할 수 있다. 또한, 문헌 ([Innis and McCormick, Methods in Enzymology, 119:397-403, 1986], [Dembinski and Sulkowski, Preparative Biochemistry, 16:175-186, 1986], [Friesen et al, Methods in Enzymology, 78 (Part A):4330-435, 1981)], [Pestka et al., Annu. Rev. Biochem., 56:727-77, 1987]) 등을 참조한다. 필요에 따라, 성숙한 단백질 구성의 완결시에 단백질 리폴딩 단계를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 IFN-β2 폴리펩티드 및 이의 단편을 코딩하는 핵산, 예를 들어 DNA 및 RNA에 관한 것이다. IFN-β2 핵산 또는 이의 단편은 천연 공급원으로부터 수득가능한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산이다. 그러므로, 이는천연 발생, 정상, 천연 발생 돌연변이체 및 천연 발생 다형성 대립유전자 (예를 들어 SNP) 등을 포함한다. 천연 공급원의 예로는, 조직 및 온전한 유기체, 종양, 배양된 세포주, 예를 들어 원발성 및 불멸화 세포주 등으로부터 수득한 살아있는 세포 등이 있다.

본 발명의 핵산 서열은 도 1에 나타낸 바와 같은 완전한 코딩 서열, 이의 동의성 서열 및 이의 단편을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 상기 및 하기에서 언급한 임의의 뉴클레오티드 서열에 100％ 상보적인 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 안티센스 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 핵산, 즉, 뉴클레오티드 폴리머 또는 폴리뉴클레오티드는 여러가지 상이한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 이는 조직, 세포 또는 온전한 유기체 등으로부터 단리한 DNA 또는 RNA, 예를 들어 폴리아데닐화된 mRNA로부터 수득할 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA로부터 수득하거나 cDNA 라이브러리로부터 직접 수득할 수 있다. 원하는 유전형, 표현형 등을 갖는 핵산은 발생의 특정 단계에서 세포 또는 조직 (예를 들어 배자(胚子) 또는 성체의 심장 세포 또는 조직)으로부터 수득할 수 있다.

상기에서 IFN-β2 폴리펩티드에 관해 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 코딩 서열만을 포함할 수도 있고, 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열 (예를 들어 리더 펩티드, 분비 펩티드, 표적화 펩티드, 효소 펩티드, 형광성 펩티드 또는 다른 진단용 펩티드를 코딩하는 서열), 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예를 들어 5' 또는 3' 말단에 있거나 코딩 서열에 분산되어 있는 비번역 서열, 예를 들어 인트론을 포함할 수도 있다. 폴리펩티드에 대한 차단 없이 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 코딩 서열내에 이를 차단하거나 이에 개입된 비-코딩 뉴클레오티드 없이, 예를 들어 인트론(들) 없이 IFN-β2의 아미노산을 코딩하는 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 연속적으로 기재될 수도 있다. 인간, 마우스 또는 다른 포유동물의 인터페론 등을 코딩하는 게놈 DNA는 통상적으로 수득할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 핵산은 상기 기재한 바와 같은 핵산에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함할 수도 있다. "발현 조절 서열"이라는 어구는 상기 서열이 작동가능하게 연결되어 있는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 발현은 mRNA 또는 폴리펩티드 수준에서 조절될 수 있다. 그러므로, 발현 조절 서열은 mRNA-관련 요소 및 단백질-관련 요소를 포함한다. 이러한 요소들로는 프로모터, 인핸서 (바이러스 또는 세포), 리보솜 결합 서열, 전사 터미네이터 등이 있다. 발현 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 달성하거나 그에 영향을 미치는 위치에서 뉴클레오티드 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 경우, 상기 코딩 서열의 발현은 상기 프로모터에 의해 구동된다. 발현 조절 서열은 정상 유전자에 대해 이종 서열이거나 내인성 서열일 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 핵산 혼성화를 기초로 선택할 수 있다. 2종의 단일 가닥 핵산 제제가 함께 혼성화되는 능력은 이들의 뉴클레오티드 서열 상보성, 예를 들어 A-T, G-C 등과 같이 뉴클레오티드 사이의 염기쌍 형성의 측정치이다. 그러므로, 본 발명은 또한 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 혼성화하는 핵산 및 이들의 상보체에 관한 것이다. 상기 상보체의 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 상보적 핵산 가닥을 가지거나, 중합효소 (즉, 적당한 핵산 합성 효소)의 존재하에 이에 대한 주형으로 작용할 것이다. 본 발명은 핵산의 두가닥 모두, 예를 들어 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다.

혼성화 조건은 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열과의 뉴클레오티드 상보성이 원하는 정도인 핵산이 선택되도록 결정할 수 있다. 이 서열과 혼성화할 수 있는 핵산은 서열들 사이의 상보성이 바람직하게는 예를 들어 약 85％, 더욱 바람직하게는 90％, 92％, 훨씬 더욱 바람직하게는 95％, 97％ 또는 100％이다. 특히, 본 발명은 저엄격 또는 고엄격 조건하에서 도 1에 도시한 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 핵산 서열에 관한 것이다.

IFN-β2 서열과 혼성화하는 핵산은 다양한 방법으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 공지된 방법에 따라, 관심 핵산을 포함하는 블롯 (즉, 핵산을 함유하는 매트릭스), 칩 어레이 (array) 및 기타의 매트릭스를 예비혼성화 용액 (6 ×SSC, 0.5％ SDS, 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA, 5 ×덴하르트 (Denhardt's) 용액 및 50％ 포름아미드) 중에 30℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후에, 검출가능한 올리고뉴클레오티드 프로브 (하기 참조)와 함께 혼성화 용액 (예를 들어 6 ×SSC, 0.5％ SDS, 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA 및 50％ 포름아미드) 중에서 42℃에서 밤새 혼성화시킬 수 있다. 블롯들을 예를 들어 5％ 미만의 bp 미스매치 (mismatch)를 허용하는 고엄격 조건, 즉, 서열 동일성이 95％ 이상인 서열을 선택할 수 있는 고엄격 조건하에 세척 (예를 들어 65℃에서 0.1 ×SSC 및 0.1％ SDS 중에서 30분 동안 2회 세척)할 수 있다. 고엄격 조건의 다른 예로는 65℃에서 30 mM NaCl 및 0.5％ SDS를 함유하는 완충 수용액 중에서의 최종 세척 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 고엄격 조건의 다른 예는 50℃에서 7％ SDS, 0.5 M NaPO₄, pH 7, 1 mM EDTA 중에서의 혼성화, 예를 들어 밤새 혼성화 시킨 후에, 42℃에서 1％ SDS 용액을 사용하여 1회 이상 세척하는 것이다.

고엄격 세척을 통해 5％ 미만의 미스매치가 허용될 수 있는 반면, 완화된 세척 조건 또는 저엄격 세척 조건 (예를 들어 37℃에서 0.2 ×SSC 및 0.5％ SDS 중에서 30분 동안 2회 세척)은 미스매치를 20％까지 허용할 수 있다. 저엄격 조건의 다른 예로는 42℃에서 30 mM NaCl 및 0.5％ SDS를 함유하는 완충액 중에서의 최종 세척 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세척 및 혼성화는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, Chapter 9]에 기재된 바와 같이 수행할 수도 있다.

또한, 혼성화는 문헌 [Sambrook et al]에 기재된 바와 같이 프로브와 이의 표적 사이에 형성된 하이브리드의 융점 (Tm) 계산치를 기초로 할 수도 있다. 통상적으로, 짧은 올리고뉴클레오티드 (18개 이하의 뉴클레오티드 함유)가 이의 표적 서열로부터 용융되는 온도인 Tm은 하기의 식을 통해 주어진다: Tm = (A 및 T의 수) × 2℃ + (C 및 G의 수) × 4℃. 더 긴 분자의 경우에 적용되는 식은 Tm = 81.5 + 16.6log₁₀[Na⁺] + 0.41 (％GC) - 600/N (여기서, [Na⁺]는 나트륨 이온의 몰농도이고, ％GC는 상기 프로브에 존재하는 GC 염기쌍의 비율(％)이며, N은 길이임)이다. 이온도 미만의 여러 온도에서 혼성화를 수행하여 프로브 및 표적이 확실히 혼성화할 수 있도록 할 수 있다. 온도를 훨씬 더 낮추는 경우, 미스매치가 허용될 수 있다.

엄격 조건은 프로브 (예를 들어 IFN-β2의 올리고뉴클레오티드)와 표적 핵산 사이의 뉴클레오티드 상보성이 예를 들어 약 95％, 97％, 98％, 99％ 이상인 서열 및 이들의 상보체가 단리되도록 선택할 수 있다.

본 발명에 따라서, 핵산 또는 폴리펩티드는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 도 1 및 도 2에 도시한 서열과 1개 이상 상이할 수 있다. 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열에 대한 변화 또는 변형은 지정 또는 랜덤 돌연변이유발법 등을 비롯한 임의의 사용이능한 방법을 통해 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 포유동물의 IFN-β2, 예를 들어 인간 IFN-β2를 코딩하는 핵산은 천연 발생 유전자, 예를 들어 천연 발생 다형성, 정상 또는 돌연변이 대립유전자 (뉴클레오티드 또는 아미노산), 천연 집단의 포유동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 돼지, 마우스, 래트 또는 토끼 등에서 발견되는 돌연변이체 등에서 발생하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "천연 발생"이라는 용어는 핵산이 천연 공급원, 예를 들어 동물 조직 및 세포, 체액, 조직 배양 세포, 법의학 수사 샘플 등으로부터 수득가능하다는 것을 의미한다. 천연 발생 돌연변이는 뉴클레오티드 서열의 결실 (예를 들어 말단절단형 (truncated) 아미노- 또는 카르복시-말단), 치환, 역위 또는 부가를 포함할 수 있다. 이들 유전자는 당업자라면 알고 있을 본 발명에 따른 핵산 혼성화를 통해 검출 및 단리할 수 있다. 본 발명의 포유동물의 IFN-β2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 도 1에 도시한 바와 같이 천연 발생 유전자, 전사체 또는 cDNA에서 발견되는 코돈을 함유하거나, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 동의성 코돈을 함유할 수 있다. 예를 들면, 서열내 코돈을 변화시켜 원하는 숙주 내에서 상기 서열의 발현을 최적화하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 예를 들어 DNA, RNA, 합성 핵산, 펩티드 핵산, 변형된 뉴클레오티드 또는 혼합물을 포함할 수 있다. DNA는 이중 가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 핵산을 포함하는 뉴클레오티드는 RNAase H와 같은 뉴클레아제에 대한 내성 부여, 생체내 안정성의 개선 등과 같은 원하는 목적에 따라 에스테르, 술파메이트, 술파미드, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 카르바메이트 등을 비롯한 여러가지 공지된 결합을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,378,825호를 참조한다.

검출가능한 마커 (아비딘, 비오틴, 방사선활성 요소)를 부착하거나, 혼성화, 검출 또는 안정성을 개선시키는 잔기를 부착하는 등, 핵산을 다양하게 변형시킬 수 있다. 또한, 원하는 방법에 따라 상기 핵산을 고체 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스, 자성 또는 상자성 미소구 (미국 특허 제5,411,863호, 동 제5,543,289호 등에 기재된 바와 같음; 예를 들면, 강자성, 초자성, 상자성, 초상자성, 산화철 및 다당류를 포함함), 나일론, 아가로스, 디아조화된 셀룰로스, 라텍스 고체 미소구, 폴리아크릴아미드 등에 부착시킬 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,470,967호, 동 제5,476,925호, 동 제5,478,893호를 참조한다.

본 발명의 다른 측면은 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 프로브에 관한 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 프로브를 사용하여 예를 들어 시험 샘플 중 포유동물의 IFN-β2 핵산을 검출, 정량 또는 단리하거나, IFN-β2 상동체를 확인할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산을 예를 들어 PCR, 차별적 디스플레이, 유전자 칩 (예를 들어 어피메트릭스 진칩스 (Affymetrix GeneChips); 미국 특허 제5,143,854호, 동 제5,424,186호, 동 제5,874,219호, PCT WO 92/10092, PCT WO 90/15070) 및 다른 사용이능한 방법에서 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용할 수 있다. 검출은 연구, 진단 및 법의학 수사 등을 비롯한 여러가지 상이한 목적에 바람직할 수 있다. 진단 목적을 위해서는, 조직, 세포, 체액 등으로부터 수득한 샘플 중 핵산 서열의 존재 여부 또는 양을 확인하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 방법에서, 본 발명은 시험 샘플 중의 표적 핵산을 표적물과 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화 달성에 효과적인 조건하에 상기 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계 및 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 핵산의 검출 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 PCR (예를 들어 [Saiki et al., Science, 241:53, 1988], 미국 특허 제4,683,202호, [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, New York, 1990]); 차별적 디스플레이 (예를 들어 문헌 [Liang et al., Nucl. Acids Res., 21:3269-3275, 1993], 미국 특허 제5,599,672호, WO97/18454 참조), 선형 PCR 또는 다른 증폭 방법 등을 비롯한 합성 핵산 증폭법에 사용할 수도 있다.

검출은 다른 유전자, 예를 들어 신호 전달, 성장, 암, 아폽토시스에 관여하는 유전자 또는 상기 또는 하기에서 언급한 임의의 유전자에 대한 올리고뉴클레오티드와 조합하여 수행할 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,683,877호, 동 제5,656,430호, [Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:8779-8783, 1992])에 기재된 바와 같은 미스매치 DNA 복구 기술 등을 통해 올리고뉴클레오티드를 사용하여 돌연변이에 대해 시험할 수도 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 도 1의 임의의 연속적인 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대한 상보체 또는 상기에서 언급한 임의의 서열 또는 이에 대한 상보체를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이들 올리고뉴클레오티드 (핵산)는 임의의 원하는 크기일 수 있으며, 예를 들어 약 10 내지 200개 뉴클레오티드, 12 내지 100개, 12 내지 50개, 12 내지 25개, 14 내지 16개, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상 등일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드에는 비-천연 발생 뉴클레오티드, 예를 들어 이노신, AZT, 3TC 등이 있을 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 도 1의 서열과의 동일성 또는 상보성이 100％이거나, 미스매치 또는 1, 2, 3, 4 또는 5 치환 등의 뉴클레오티드 치환이 있을 수 있다. 본 발명에 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 완충액 (예를 들어 인산염 완충액, 트리스 완충액 등), 검출 조성물 등을 포함하는 키트를 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드에는 당업계에 공지된 바와 같이 방사선활성 또는 비-방사선활성 표지를 사용하여 표지하거나 표지하 않을 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 포유동물의 IFN-β2에 독특한 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. IFN-β2에 독특한 서열은 IFN-β2에 존재하는 정의된 순서의 뉴클레오티드, 예를 들어 도 1의 뉴클레오티드 서열에는 존재하나, 다른 핵산에는 거의 존재하지 않거나 드물게 존재하며, 특히 동물 핵산, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스 등과 같은 포유동물의 핵산에는 존재하지 않는 서열을 의미한다. 독특한 뉴클레오티드 서열로는 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRANI, AEKLSGT, CLFFVFS 및 QGRPLNDMKQELTTEFRSPR 및 이의 단편을 코딩하는 서열 또는 이의 상보체 등이 있다. 이러한 서열을 본원에 기재한 방법 또는 본원의 참고문헌에 기재된 임의의 방법에서 프로브로 사용할 수 있다. 센스 및 안티센스 뉴클레오티드 서열 모두가 포함된다. 본 발명에 따른 독특한 핵산은 통상적으로 결정할 수 있다. 이러한 독특한 서열을 포함하는 핵산을 혼성화 프로브로서 사용하여 핵산의 혼합물을 포함하는 샘플, 예를 들어 노던 블롯 상에서 인간 또는 마우스 IFN-β2 등의 존재를 확인할 수 있다. 고엄격 조건 (상기 참조)하에 혼성화를 수행하여 프로브에 대한 동일성 (즉, 상보성)이 95％ 이상인 핵산들 (및 코딩 서열을 함유할 수 있는 이들의 상보체)을 선별할 수 있으나, 덜 엄격한 조건을 사용할 수도 있다. 또한, 상기 특허 문헌을 통해 언급한 바와 같이, 독특한 IFN-β2 뉴클레오티드 서열을 이의 5' 또는 3' 말단에서 IFN-β2의 다른 부분, 효소, GFP 등, 발현 조절 서열에 대한 코딩 서열을 포함하는 다양한 뉴클레오티드 서열에 프레임내 융합할 수도 있다.

앞서 논의한 바와 같이, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989]에 기재된 바와 같이 원하는 선택성에 따라 상이한 조건하에서 혼성화를 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IFN-β2를 특이적으로 검출하기 위해서, 오직 올리고뉴클레오티드만이 표적 핵산에 혼성화되는 조건하에서, 예를 들어 상기 표적에 100％ 상보적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이를 표적 핵산과 혼성화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 상보성이 100％ 미만, 예를 들어 약 99％, 97％, 95％, 90％, 86.4％, 85％, 70％, 67％ 이상인 표적 핵산을 선별하고자 하는 경우에는 상이한 조건을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 핵산으로부터 안티센스 핵산, 바람직하게는 도 1의 서열에 대한 안티센스 핵산을 제조할 수도 있다. 안티센스 핵산은 IFN-β2의 발현을 조절하거나 조정하는 등의 다양한 방법, 예를 들어 이를 억제하거나, 이의 발현을 검출하거나 계내 (in situ) 혼성화에 사용할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,576,208호와 유사하게 사용할 수 있다. IFN-β2의 발현을 조절하거나 조정하기 위한 목적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

IFN-β2의 억제를 위해서, 올리고뉴클레오티드는 cDNA의 상응하는 센스 위치로 고안할 수 있다. 예를 들어 문헌 ([J. Milligan et al., Current Concepts in Antisense Drug Design., J. Med. Chem. 36(14):1923-1937, 1993], [Helene and Toulme, Biochim. Biophys. Acta, 1049:99-125, 1990], [Cohen, J. S., Ed., Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, Fla., 1987], [Crooke, S., Basic Principles of Antisense Therapeutics, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, July 1998])을 참조한다. 미국 특허 제6,040,296호 또는 상기 언급한 참고문헌에 개시된 다양한 화학적 결합법 등을 사용할 때, 이러한 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-내성이 있을 수 있다. 세포 배양시에 양이온성 리포좀을 사용하여, 총 길이가 약 35 bp인올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 세포내 유입을 용이하게 할 수 있으나, 생체내 사용하기 위해서는 더 짧은 길이의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 25개 뉴클레오티드를 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산을 임의의 원하는 방법에 따라 표지할 수 있다. 방사선활성 추적자, 예를 들어³²P,³⁵S,¹²⁵I,³H 또는¹⁴C 등과 같이 통상적으로 사용되는 몇가지 추적자를 사용하여 핵산을 표지할 수 있다. 방사선활성 표지는 예를 들어 방사선표지된 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 키나제 (포스파타제에 의한 탈인산화는 일어거나 일어나지 않음) 또는 리가제 (표지될 말단에 따라 달라짐)를 사용하여 3' 또는 5' 말단에 말단 표지하는 등, 임의의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 특성이 있거나 (항원, 합텐), 특정 시약에 특이적 친화성이 있거나 (리간드), 검출가능한 효소 반응이 완결되도록 할 수 있는 특성이 있거나 (효소 또는 보조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 관여하는 다른 물질), 또는 형광성 또는 원하는 파장에서의 광방출 또는 광흡수 등을 비롯한 특징적인 물성이 있는 잔기와 본 발명의 핵산을 조합한 비-방사선활성 표지를 사용할 수도 있다.

올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 등을 비롯한 본 발명에 따른 핵산을 사용하여 노던 블롯, PCR, 계내 혼성화, 차별적 디스플레이, 핵산 어레이 (예를 들어 "유전자 칩"), 도트 블롯 등의 다양한 기술을 통해 온전한 기관, 조직, 세포 등에서의 IFN-β2 발현을 검출할 수 있다. 이러한 핵산은 IFN-β2의 교란된 발현, 예를 들어 세포-특이적 및(또는) 세포내 변경의 검출에 특히 유용할 수 있다. IFN-β2의 수준은 IFN-β2 단독에 대해서만 측정하거나, 다른 유전자 생성물, 특히 사이토킨 생성에 관여하는 다른 유전자 생성물 수준과 합하여 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 원하는 목적에 따라 여러가지 상이한 시스템내, 시험관내 및 생체내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 핵산을 발현 벡터에 삽입하여 원하는 숙주에 도입하고 상기 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현 달성에 효과적인 조건하에 배양할 수 있다. 효과적인 조건은 숙주 세포에 의한 폴리펩티드 생성 달성에 적합한 임의의 배양 조건을 포함하며, 효과적인 온도, pH, 배지, 숙주 세포를 배양할 배지에 넣는 첨가제 (예를 들어 발현을 증폭시키거나 유도하는 첨가제, 예를 들어 코딩 핵산이 dhfr 유전자에 인접한 경우에는 부티레이트 또는 메톡트렉세이트), 시클로헥스이미드, 세포 밀도, 배양 접시 등을 포함한다. 예를 들어 순수한 (naked) DNA, 인산칼슘 침전법, 전기천공법, 주입법, DEAE-덱스트란 매개 형질감염법, 리포좀을 사용한 융합법, 세포로의 유입을 증대시키는 작용제와의 결합, 바이러스 형질감염법 등을 비롯한 임의의 효과적인 방법을 통해 핵산을 세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명의 핵산이 도입된 세포가 형질전환된 숙주 세포이다. 상기 핵산은 염색체외 존재하거나 숙주 세포의 염색체(들)에 통합될 수도 있다. 이는 안정적일 수도 있고 또는 일시적일 수도 있다. 발현 벡터는 숙주 세포와의 적합성에 따라 선택한다. 숙주 세포로는 포유동물의 세포, 예를 들어 COS, CV1, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293, PAE, 인간, 인간 섬유아세포, 인간 원발성 종양 세포, 고환, 신경교, 뉴런, 희돌기교세포, 성상세포, 신경모세포종, 신경교종 등, 곤충 세포, 예를 들어 Sf9 (에스. 프루기페다 (S. frugipeda)) 및 초파리, 박테리아, 예를 들어 대장균, 연쇄상구균, 바실러스, 효모, 예를 들어 사카로마이세스 (Sacharomyces), 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 진균 세포, 식물 세포, 배자 간세포 (stem cell) (예를 들어 마우스 또는 인간 등의 포유동물의 간세포), 뉴런 간세포, 섬유아세포, 근세포, 심장 세포 및 T-세포 등이 있다.

발현 조절 서열은 숙주 적합성 및 원하는 목적, 예를 들어 높은 카피수, 많은 양, 유도, 증폭, 발현 조절 등에 따라 유사하게 선택한다. 사용할 수 있는 다른 서열로는 인핸서, 예를 들어 SV40, CMV, RSV로부터의 인핸서, 유도가능한 프로모터, 세포 유형에 따른 특이적 요소 또는 선택적 또는 특이적 세포 발현을 허용하는 서열 등이 있다. 이의 발현을 구동하기 위해 사용할 수 있는 프로모터의 예로는 내인성 프로모터, 세포 신호 전달 경로에 관여하는 다른 유전자의 프로모터, MMTV, SV40, trp, lac, tac 또는 T7 프로모터 (박테리아 숙주의 경우); 또는 알파 인자, 알콜 옥시다제 또는 PGH 프로모터 (효모의 경우) 등이 있다. T7 또는 SP6 등과 같은 RNA 프로모터를 사용하여 RNA 전사체를 생성할 수 있다. 예를 들어 문헌 ([Melton et al., Nucleic Acids Res., 12(18):7035-7056, 1984], [Dunn and Studier, J. Mol. Biol., 166:477-435, 1984], 미국 특허 제5,891,636호, [Studier et al., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85:60-89, 1987])을 참조한다.

본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드를 핵산 또는 단백질 전기천공법, 크로마토그래피 등에서의 크기 마커로 사용할 수 있다. 제한 부위에 대한 서열을 스캐닝하고 크기를 계산하여 상응하는 제한 소화를 수행함으로써 정의된 제한 단편을 결정할 수 있다.

본 발명의 IFN-β2 폴리펩티드 및 핵산은 "단리"될 수 있다. "단리"라는 용어는 상기 물질이 원래의 환경 또는 자연계에서는 발견되지 않는 형태, 예를 들어 더욱 농축된 형태, 더욱 정제된 형태, 성분들로부터 분리된 형태, 이종 IFN-β2 유전자가 발현된 세포의 용균물 중에 존재하는 형태 등이라는 것을 의미한다. IFN-β2가 형질감염된 세포주에서 이종 핵산으로서 발현되는 경우, 본 발명에 따른 핵산을 상기 핵산이 발현되는 조건하에서 상기 기재한 바와 같은 세포로 도입한다. "이종"이라는 용어는 "인간의 조작"을 통해 세포주에 도입된 핵산을 의미한다. 핵산을 세포주에 도입하는 방법은 상기에서 논의하였다. IFN-β2 핵산을 발현하는 형질감염된 (또는 형질전환된) 세포는 하기 실시예에서 기재한 바와 같이 용균시켜 상기 방법에서 용균물로서 사용할 수도 있고 (즉, "단리시켜" 사용함), 또는 세포주를 무손상으로 사용할 수도 있다.

통상적으로, "효과적인 조건"이라는 용어는 원하는 효과가 달성되는 환경 등을 의미한다. 이러한 환경으로는 완충액, 산화제, 환원제, pH, 보조인자, 온도, 이온 농도, 사용할 세포의 적합한 연령 및(또는) 단계 (예를 들어, 세포 주기의 특정 시기 또는 유전자가 발현되는 특정 단계), 배양 조건 (기질, 산소, 이산화탄소 등을 포함함) 등이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 IFN-β2를 발현하는 세포를 상기 핵산의 발현을 서열-특이적으로 억제하는데 효과적인 양의 작용제, 예를 들어 IFN-β2의 안티센스올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 RNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 IFN-β2를 코딩하는 핵산의 발현을 조정, 바람직하게는 억제하는 방법에 관한 것이다.

통상적으로, 핵산의 서열-특이적 억제는 안티센스 핵산, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNA를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드를 IFN-β2 RNA의 특이적 영역, 예를 들어 번역 개시 부위에 대해 고안한 후에, 이러한 유전자를 발현하는 세포에 이의 발현 억제 유효량으로 투여할 수 있다. 통상적으로, 안티센스 핵산은 주어진 핵산의 센스 또는 코딩 가닥에 상보적인 핵산이기 때문에 상기 핵산의 mRNA 전사체에 상보적이어서, 상기 mRNA 전사체와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자의 5' 영역, 특히 개시 코돈을 함유하는 영역을 포함한다.

안정성을 증대시키기 위해서, 투여할 핵산을 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 상기 핵산을 세포의 효소, 산화, 환원, 뉴클레아제 등에 내성이 있도록 만들거나, 또는 상기 핵산의 세포로의 유입을 증대시키기 위해 변형시킨다. 임의의 적합한 변형체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 아크리딘 삽입성 작용제 및(또는) 소수성 꼬리 (tail), 소랄렌 유도체, 2'-리보스 변형체, 펜토스 당 유도체, 질소 염기 유도체 등에 연결된 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 등이 있다. 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형 등과 관련하여 미국 특허 제5,576,208호, 동 제5,744,362호, 동 제6,040,296호 및 동제6,046,319호를 참고하며, 이는 본 발명에 유용할 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 안티센스 핵산은 천연 발생 뉴클레오티드, 비-천연 발생 뉴클레오티드의 단량체 및 이들의 조합물을 포함하여 세포내 유입 및(또는) 안정성을 증대시킬 수 있다.

안티센스는 순수한 핵산으로 투여하거나, 상기 핵산의 세포내 유입, 상기 핵산의 세포내 주입을 용이하게 하는 다른 작용제 또는 임의의 적합한 전달 수단과 함께 및 이들을 통해 복합체를 형성하거나 캡슐화된 핵산으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 IFN-β2 생물활성이 요구되는 임의의 상태, 장애, 질환 등을 치료하기 위한 본 발명의 IFN-β2, 예를 들어 인간 IFN-β2의 사용 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 하기의 목적 중 하나 이상을 위한 처치가 필요한 숙주에게 유효량의 본 발명의 IFN-β2를 투여하는 단계를 포함한다: 항-종양유전자 조절, 항-종양 활성, 항-바이러스 활성, 세포 성장 억제 또는 항-성장 활성, 항-증식 (예를 들어 IFN-β2를 성상세포의 증식 억제에 효과적인 양으로 투여함), 림프구의 세포독성 증대, 면역조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제, 대식세포의 활성화, 종양유전자의 하향조절 등; 면역학적 효과, 예를 들어 항체 형성의 감소, 세포 막 성분 (주조직적합성복합체, Fc 수용체, β2-마이크로글로불린)의 증가, 세포-매개 면역의 조정, 사이토킨 (예를 들어 인터루킨) 생성의 증가, 세포독성 T 세포의 효과 증가, 대식세포의 효과 증가 및 천연 킬링의 증가. IFN-β2를 투여하여 암, 자가면역 장애 및 바이러스 감염 등을 치료할 수 있다. 본 발명의 IFN-β2, 특히 알파- 및 베타-인터페론을 사용하여 치료할 수 있는 다양한 장애에 관해서는 예를 들어 문헌 [Cirelli and Tyring, Clin Immunbother. 3:27-87, 1995]을 참조한다.

IFN-β2는 폴리펩티드로서 투여하거나, 유전자 요법 등에서는 핵산으로서 투여할 수 있다. 핵산으로서 투여하는 경우에는 발현 달성에 효과적인 임의의 형태, 예를 들어 순수한 DNA, 벡터 (예를 들어 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터), 리포좀 또는 다른 운반체 (carrier), 마이크로버블 등과 복합체를 형성한 형태로서 제공될 수 있다. 핵산의 투여, 숙주 중에서의 이의 발현 등과 관련한 더 많은 정보를 위해서는 상기 문헌을 참조한다.

임의의 암을 본 발명에 따라 치료할 수 있으며, 예를 들어 자궁경부 상피내 신생물 및 자궁경부암 (투여량, 투여 경로, 섭생 등에 관해서는 예를 들어 문헌 [DePalo et al., Int. J. Tissue React., 6:523-527, 1984] 참조), 흑색종 및 전이성 흑색종 (투여량, 투여 경로, 섭생 등에 관해서는 예를 들어 문헌 [Beiteke et al., Hautarzt, 44:365-371, 1994] 참조), 모발상 세포 백혈병, 카포시 육종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 신장 세포 암종, 카르시노이드 종양, 피부 T 세포 림프종, 비비호지킨 림프종 (또한, 다른 암에 관해서는 문헌 [Dorr, Drugs, 45(2):177-211, 1993] 참조) 등을 치료할 수 있다.

자가면역 질환 역시 본 발명에 따라 치료할 수 있으며, 예를 들어 다발성 경화증 (투여량, 투여 경로, 섭생 등에 관해서는 예를 들어 문헌 [Yong et al., Neurology, 51:682-689, 1998] 참조), 류마티스성 관절염 등을 치료할 수 있다. 다발성 경화증 ("MS")은 탈수초, 축삭 붕괴 및 이후의 신경교증을 초래하는 혈관주위 및 뇌실주위의 염증이라는 병리적 특징이 있는 자가면역 질환이다. 만성 MS 병변의 특징은 국소적인 성상세포 비대증 및 과형성의 결과로서 형성된 탈수초된 신경교 플라크이다. 이러한 성상세포 플라크는 정상적인 축삭 전도를 방해하고 재수초화에 대한 물리적 장벽을 제공한다. 그러므로, 성상세포증을 억제하는 인자는 특히 질환의 후기 단계에서 이로운 치료적 관련성이 있다. 그러므로, IFN-β2에 의한 성상세포 억제력이 MS 치료에 특히 유용하다.

또한, 예를 들어 인간 유두종 바이러스 (투여량, 투여 경로, 섭생 등에 관해서는 예를 들어 문헌 ([Puligheddu et al., Eur. J. Gynaecol. Oncol., 9:161-162, 1988], [Costa et al., Cervix, 6:203-212, 1988]) 참조), 첨형 콘딜로마 (투여량, 투여 경로, 섭생 등에 관해서는 문헌 [Schonfeld et al., Lancet, 1:1038-1042, 1984] 참조), B형, C형 및 D형 간염바이러스, HIV 등의 바이러스 질환 및 감염도 본 발명에 따라 치료할 수 있다.

"투여"라는 용어는 IFN-β2 또는 다른 활성 작용제를 표적, 예를 들어 종양, 면역계, 뇌 병변 (예를 들어 뇌 염증 부위, 예를 들어 다발성 경화증 또는 다른 뇌 염증 상태에서 관찰되는 부위) 등에 전달하는 것을 의미한다. IFN-β2는 배양 중인 세포 및 치료될 상해, 상태 또는 질환이 있는 숙주 등을 비롯한 임의의 표적에 상기 기재한 바와 같은 효과를 달성하는데 적합한 효과적인 경로를 통해 투여 (예를 들어 생체내, 시험관내 또는 계내)할 수 있으며, 예를 들어 IFN-β2 제제를 표적 부위에 직접 또는 표적 부위 부근에 주입하여 투여할 수 있다. 또한, 치료할 표적 부위의 위치 등에 따라 국소, 장내, 비경구, 정맥내, 근육내, 피하, 경구, 비내, 대뇌내, 심실내 등으로 투여할 수도 있다. 또한, 세포에 의한 IFN-β2의 유입을 위해 IFN-β2를 핵산으로서 투여할 수도 있다. 핵산 투여 방법으로는 상기 기재한 방법 및 당업계의 다른 통상적인 방법 등이 있다.

IFN-β2는 표적에 유효량으로 투여한다. 유효량은 원하는 효과, 바람직하게는 이로운 효과 또는 치료 효과 달성에 유용한 양, 예를 들어 성상세포 증식 억제에 효과적인 양이다. 이러한 양은 통상적으로 결정될 수 있으며, 예를 들어 표적 세포에 IFN-β2를 투여량을 변화시키면서 투여하여 원하는 목적, 예를 들어 항-바이러스 효과, 면역조정 효과 달성에 효과적인 양을 결정하는 투여량-반응 실험을 수행하여 결정할 수 있다. IFN-β2를 투여할 환경 (예를 들어 다발성 경화증을 앓는 환자, 동물 모델, 조직 배양 세포 등), 치료할 세포의 부위, 치료할 환자 또는 동물의 연령, 건강 상태, 성별 및 체중 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 투여량을 선택할 수 있다. 유용한 양의 예로는 예를 들어 1.6 MIU (Million International Unit, 국제 표준 기준에 따름) 및 8 MIU의 격일 피하 투여 등이 있다. "치료"라는 용어는 상태, 질환, 장애 등이 개선되는 임의의 효과를 의미한다.

IFN-β2의 유효량을 다른 효과적인 작용제, 예를 들어 암, 바이러스, MS, 간염바이러스 및 IFN-β2로 치료할 수 있는 임의의 다른 상태를 치료하기 위한 효과적인 작용제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 작용제는 세포독성인 항-바이러스제, 화학요법제 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 IFN-β2를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. IFN-β2에 특이적인 항체는 IFN-β2 내에 있거나 IFN-β2를 포함하는 아미노산의 정의된 서열, 예를 들어 도 2의 서열을 인식하는 항체를 의미한다. 그러므로, 특이적 항체는 면역블롯 분석법 또는 다른 통상적인 면역분석법 등을 통해 검출되고(되거나) 측정되는 바와 같이 통상적으로 도 2의 아미노산 서열, 즉, 에피토프에 상이한 에피토프(들) 보다 더 높은 친화성으로 결합할 것이다. 그러므로, 인간 IFN-β2의 에피토프에 특이적인 항체는 예를 들어 인간 IFN-β2 유전자 생성물을 함유하는 조직 샘플 중에서 에피토프의 존재 검출에 유용하여, 에피토프가 있는 샘플과 에피토프가 없는 샘플을 구별한다. 유용한 항체는 IFN-β2의 독특한 C-말단, 예를 들어 QGRPLNDMKQELTTEFRSPR 또는 이의 단편에 대한 것이다. 문헌 [Research Product Catalog, 산타클루즈 바이오테크놀로지, 인크. (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 제품,]에 기재된 바와 같이, 이러한 항체들은 유용하기 때문에 제제화될 수 있다.

항체, 예를 들어 폴리클로날, 모노클로날, 재조합, 키메라, 인간화 항체는 임의의 원하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 스크리닝 재조합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어 문헌 [Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:3833-3837, 1989], [Huse et al., Science, 256:1275-1281, 1989]), 림프구 집단의 시험관내 자극 [Winter and Milstein, Nature, 349:293-299, 1991]을 참조한다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 제조하기 위해서, 도 2에 따른 폴리펩티드를 아쥬반트의 존재 또는 부재하에 마우스, 염소 또는 토끼에게 면역 반응 유발에 효과적인 양으로 피하 및(또는) 복강내 투여할 수 있다. 상기 항체는 단쇄 또는 Fab 단편일 수도 있다. 상기 항체는 IgM, IgG, 서브타입, IgG2a, IgG1 등일 수 있다. 또한, 순수한 DNA를 투여하여 항체 및 면역 반응을 발생시킬 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,703,055호, 동 제5,589,466호, 동 제5,580,859호를 참조한다.

항체 유도에 사용하기 위한 인터페론 또는 이의 단편은 생물활성을 보유할 필요는 없으나, 이들은 단독으로 또는 운반체와 조합되어 면역원성 활성을 보유해야 한다. IFN-β2-특이적 항체 유도에 사용하기 위한 펩티드는 5개 이상의 아미노산, 바람직하게는 10개 이상의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 짧은 스트레치의 아미노산, 예를 들어 5개 아미노산을 다른 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 다른 유용한 운반체 단백질 및 항체 제조에 사용되는 키메라 분자의 아미노산에 융합시킬 수 있다. 항체 제조에 유용한 IFN-β2의 영역은 실험적으로 선택하거나 예를 들어 cDNA로부터 추정되는 바와 같은 IFN-β2의 아미노산 서열을 분석하여, 고도의 면역원성을 나타내는 영역을 결정할 수 있다. 적당한 에피토프를 선택하기 위한 분석법은 예를 들어 문헌 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2. John Wiley ＆ Sons (1989)] 등에 기재되어 있다.

특정 IFN-β2 항체는 예비병리 (prepathologic) 상태의 진단 및 IFN-β2의 양 또는 분포 차이로 특징지어지는 만성 또는 급성 질환의 진단에 유용하다. IFN-β2에 대한 진단 시험으로는 상기 항체 및 인간 (또는 마우스를 사용하는 경우에는 마우스 등의) 체액, 조직 또는 이러한 조직의 추출물 중 IFN-β2를 검출하기 위한 표지를 사용하는 방법 등이 있다. 항체를 중화시키고, IFN-β2 활성 분석시에 예를 들어 인터페론 활성을 중화시키기 위한 대조군으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 항체는 변형시키거나 변형시키지 않은 채로 사용할 수 있다. 종종, 폴리펩티드 및 항체는 검출가능한 신호를 내는 물질과의 공유결합또는 비공유결합을 통해 이들을 연결하여 표지할 것이다. 광범위하게 다양한 표지 및 접합 기술은 공지되어 있으며 과학 문헌 및 특허 문헌 모두에 널리 보고되어 있다. 적합한 표지로는 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광성 작용제, 화학발광제, 자성 입자 등이 있다. 이러한 표지의 사용을 교시하는 특허 문헌으로는 미국 특허 제3,817,837호, 동 제3,850,752호, 동 제3,939,350호, 동 제3,996,345호, 동 제4,277,437호, 동 제4,275,149호 및 동 제4,366,241호 등이 있다.

IFN-β2에 결합하는 항체 및 다른 리간드는 치료용, 진단용 및 시판하기 위한 연구 도구, 예를 들어 동물, 조직, 세포 등 중 인터페론 폴리펩티드의 수준 정량, 세포내 위치 및(또는) 이의 분포 확인, 이의 정제 또는 이의 일부를 포함하는 폴리펩티드의 정제, 이의 기능 조정, 웨스턴 블롯법, ELISA법, 면역침전법, RIA법 등의 다양한 방법에 사용할 수 있다. 본 발명은 이러한 분석법, 조성물 및 이를 수행하기 위한 키트 등에 관한 것이다. 이러한 방법 및 기타의 방법을 사용하여, 본 발명에 따른 항체는 조직, 세포, 체액, 혈액, 소변, 뇌척수액 등을 비롯한 다양한 샘플 중 IFN-β2 폴리펩티드 또는 이의 단편의 검출에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 IFN-β2 폴리펩티드에 결합하는 리간드 또는 이의 유도체는 예를 들어 합성 펩티드 라이브러리 또는 아프타머 (aptamer) 등을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어 피트룽 (Pitrung) 등의 미국 특허 제5,143,854호, [Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1987], [Scott et al., Science, 249:386, 1990], [Blackwell et al., Science, 250:1104, 1990], [Tuerket al., 1990, Science, 249:505] 참조).

또한, 본 발명은 원하는 방법, 예를 들어 미국 특허 제5,434,050호에 개시된 바와 같은 방법에 따라 제조된 IFN-β2 폴리펩티드에 관한 것이다. 표지된 폴리펩티드를 예를 들어 IFN-β2에 결합하거나 부착하는 물질의 확인, 세포에서 IFN-β2의 이동 추적 등을 위한 결합 분석시에 시험관내, 생체내 또는 계내 시스템 등에서 사용할 수 있다.

핵산, 폴리펩티드, 항체, IFN-β2 등은 단리할 수 있다. "단리"는 상기 물질이 원래의 환경 또는 자연계에서는 발견되지 않는 형태, 예를 들어 더욱 농축된 형태, 더욱 정제된 형태, 성분들로부터 분리된 형태 등이라는 것을 의미한다. 단리된 핵산의 예로는 살아있는 동물에서 발견되는 완전한 유전자 등으로서의 염색체 DNA, 전사체 또는 cDNA로부터 분리된 IFN-β2 서열을 갖는 핵산 등이 있다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수도 있고, 또는 염색체에 삽입 (특이적 유전자 표적화 또는 정상 위치가 아닌 위치에서의 랜덤 통합을 통한 삽입)될 수 있으며, 이는 이의 천연 환경에서 발견되는 형태가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드를 실질적으로 정제할 수도 있다. 실질적으로 정제한다는 말은 상기 핵산 또는 폴리펩티드를 분리하여 본질적으로 다른 핵산 또는 폴리펩티드가 없다는 것을 의미하며, 즉, 상기 핵산 또는 폴리펩티드가 주요한 활성 구성성분이라는 의미이다.

또한, 본 발명은 IFN-β2를 포함하는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스 등의 비-인간 포유동물에 관한 것이다. 트랜스제닉 동물은 재조합 유전자를 1-세포배자의 전핵에 주입하는 전핵 주입법, 인위적인 효모 염색체를 배자 간세포에 혼입하는 방법, 유전자 표적화 방법, 배자 간세포 방법 등을 비롯한 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌 (미국 특허 제4,736,866호, 동 제4,873,191호, 동 제4,873,316호, 동 제5,082,779호, 동 제5,304,489호, 동 제5,174,986호, 동 제5,175,384호, 동 제5,175,385호, 동 제5,221,778호, [Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980], [Palmiter et al., Cell, 41:343-345, 1985], [Palmiter et al., Annu. Rev. Genet., 20:465-499, 1986], [Askew et al., Mol. Cell. Biol., 13:4115-4124, 1993], [Games et al., Nature, 373:523-527, 1995], [Valancius and Smithies, Mol. Cell. Biol., 11:1402-1408, 1991], [Stacey et al., Mol. Cell. Biol., 14:1009-1016, 1994], [Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995], [Rubinstein et al., Nucl. Acids Res., 21:2613-2617, 1993])을 참조한다. 본 발명에 따른 핵산은 마우스 [Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986], 돼지 [Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985], 양 [Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985], 소, 래트 또는 영장류 등을 비롯한 임의의 비-인간 포유동물에 도입될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 ([Church, Trends in Biotech., 5:13-19, 1987], [Clark et al., Trends in Biotech., 5:20-24, 1987] 및 [DePamphilis et al., BioTechniques, 6:662-680, 1988])을 참조한다. 또한, 전형적인 트랜스제닉 래트 및 마우스 제품 등이 시판되기도 한다. 이들 트랜스제닉 동물은 뱀의 먹이로서, 원래 균주 (즉, IFN-β2 또는 이의 단편이삽입된 균주)를 검출하기 위한 유전적 마커 등으로서 IFN-β2 기능을 시험하기 위한 유용한 동물 모델일 수 있다. 이러한 트랜스제닉 동물은 다른 트랜스진을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스제닉 동물은 임의의 적합한 방법에 따라 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 IFN-β2를 코딩하는 유전자 발현이 "녹아웃" 또는 파괴된 포유동물의 세포에 관한 것이다. 이러한 유전자 파괴는 안티센스 등을 포함하는 효과적인 수단, 또는 유전자 발현을 저해하는데 효과적인 뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 수행될 수 있다. 여기서 사용된 "유전자"라는 용어는 염색체상에 존재하는 IFN-β2 코딩 서열이 이의 프로모터 서열 및 다른 조절 영역을 포함한다는 것을 의미한다.

특히, 본 발명은 유전자 발현이 기능적으로 불활성화되거나 파괴된 세포를 1개 이상 함유하는 포유동물에 관한 것이다. 기능적 불활성화 또는 파괴는 예를 들어 포유동물의 단일 세포, 선택된 세포 또는 세포 전체의 내인성 IFN-β2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 적어도 일부의 발현을 부분적으로 또는 완전히 감소시킨다는 것을 지칭한다. "녹아웃"이라는 용어는 유전자의 기능적 불활성화와 동의어이다.

한 실시양태에서, 원하는 뉴클레오티드 서열의 IFN-β2 유전자로의 도입을 용이하게 하는 유전자 표적화 전략을 이용한다. 유전자 표적화 전략은 이중 상호 (reciprocal) 재조합 및 포지티브 (positive) 선택가능한 마커를 사용하여 뉴클레오티드 서열의 표적 핵산으로의 삽입을 보조하게 하는 것이 바람직하다. 표적 핵산은 바람직하게는 유전자, 더욱 바람직하게는 특정 염색체 좌위상의 유전자이다. 원하는 뉴클레오티드 서열을 유전자가 기능적으로 파괴되도록 하는, 즉, 이의 발현이 부분적으로 또는 완전하게 감소되도록 하는 방식으로 유전자에 삽입시킨다.

본 발명의 한 측면에서, 표적 벡터를 사용하여 선택가능한 마커를 IFN-β2 유전자의 정해진 위치에 삽입한다. 이 위치로는 상기 선택가능한 마커를 삽입한 후에 유전자의 기능적 파괴가 달성되는 곳을 선택한다. 이러한 목적을 위해서, 바람직한 실시양태는 (1) 제1의 선택가능한 뉴클레오티드 서열이 존재하는 세포에 제1 선택-특징을 부여하는, 제1의 선택가능한 뉴클레오티드 서열의 5' 말단, (2) 상기 (1)에 작동가능하게 연결된, 포유동물의 IFN-β2 유전자의 정해진 제1 위치에서의 상동성 재조합 달성에 효과적인 5' 뉴클레오티드 서열, 및 (3) 포유동물의 IFN-β2 유전자, 예를 들어 제1의 선택가능한 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 IFN-β2 유전자의 정해진 제2 위치에서의 상동성 재조합 달성에 효과적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자이다. 상기 재조합 핵산 분자는 포유동물 염색체의 정해진 위치에서 상동성 재조합 달성에 효과적이다. 또한, 표적 벡터의 단편, 예를 들어 요소 (1) 및 (2)을 포함하거나 요소 (1) 및 (3)을 포함하는 등의 재조합 핵산 분자도 본 발명의 범위에 속한다.

재조합이라는 용어는 예를 들어 인간의 조작에 의해 변형된 핵산 분자, 예를 들어 상이한 공급원들로부터의 핵산 단편들을 포함하는 핵산 분자 또는 유전자조작된 하나의 공급원으로부터의 핵산 분자를 지칭한다. 그러므로, 상기 핵산 분자는 예를 들어 포유동물의 IFN-β2 유전자로부터의 뉴클레오티드 서열 및 선택가능한마커 유전자를 포함하기 때문에 재조합된 것이다. 또한, 상기 분자가 동일한 유전자로부터의 서열을 함유하지만, 자연계에서는 일어나지 않는 배열, 즉, 비-천연 발생 배열 방식으로 배열된 경우에도 재조합된 것이다.

상동성 재조합은 유사한 유전적 정보를 갖는 핵산 분자들이 나란히 놓여 뉴클레오티드 가닥을 교환하는 과정을 지칭한다. 그러므로, 표적 핵산의 정해진 위치에서 상동성 재조합 달성에 효과적인 재조합 핵산의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자, 예를 들어 마우스 IFN-β2 유전자의 정의된 위치에서 재조합 핵산 분자 사이의 뉴클레오티드 가닥 교환을 용이하게 하는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 통상적으로, 효과적인 뉴클레오티드 서열은 원하는 표적 핵산 분자 (예를 들어 변형될 유전자 좌위)에 상보적이어서 뉴클레오티드 염기쌍 형성을 촉진하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 임의의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산 분자의 특이적 및 선택된 위치에서의 상동성 재조합을 용이하게 한다면, 이를 사용할 수 있다. 통상적으로, 표적화 효율은 표적 벡터와 표적 좌위 사이의 상동성 정도 또는 길이에 따라 급격하게 달라진다. 상동성 재조합에 효과적인 서열의 선택 및 용도는 예를 들어 문헌 ([Deng and Capecchi, Mol. Cell. Biol., 12:3365-3371, 1992], [Bollag et al., Annu. Rev. Genet., 23:199-225, 1989], [Waldman and Liskay, Mol Cell. Biol., 8:5350-5357, 1988]) 등에 기재되어 있다.

본 발명의 한 측면은 IFN-β2 유전자의 발현을 저해하거나 기능적으로 파괴하는 것이다. "유전자의 파괴", "유전자 파괴", "발현 저해", "유전자 저해", "유전자의 기능적 불활성화" 또는 "기능적 유전자 불활성화"라는 어구는 세포내 유전자 발현 및(또는) 이의 생성물을 감소시키거나 방지하는 방식으로 상기 유전자를 변형시킨다는 것을 지칭한다. 유전자 생성물의 발현은 완전하게 저해되거나, 또는 부분적으로만 저해될 수도 있으며, 예를 들어 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 이상 감소될 수 있다. 기능적으로 파괴된 유전자, 예를 들어 기능적으로 파괴된 IFN-β2 유전자는 야생형 유전자의 전체 코딩 서열 보다 작으며 말단절단형 폴리펩티드를 발현하는 변형된 유전자를 포함한다. 이러한 유전자를 도 1에 예시하였다. 또한, 유전자는 번역가능하지 않은 메세지가 생성되도록 하는 방식으로 상기 유전자의 mRNA 구조에 영향을 미쳐 기능적으로 파괴할 수도 있으며, 예를 들어 프레임 시프트 (frame-shift), 안정성 감소 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따라서, IFN-β2 유전자는 상응하는 유전자 생성물의 발현 파괴에 효과적인 방식으로 변형된다. 그러므로, 예를 들어 기능적으로 파괴된 재조합 IFN-β2 유전자는 기능적 IFN-β2 폴리펩티드를 발현하지 않거나, 또는 기능적 IFN-β2 폴리펩티드를 IFN-β2의 야생형 수준 미만으로, 예를 들어 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 이상 감소된 수준으로 발현한다. "기능적이지 않은" 또는 "기능적으로 불활성인" IFN-β2 폴리펩티드는 예를 들어 IFN-β2의 생물활성이 1가지 이상 없는 IFN-β2를 의미한다. 유전자를 임의의 효과적인 위치, 예를 들어 인핸서, 프로모터, 조절 영역, 비코딩 서열, 코딩 서열, 인트론, 엑손 등에서 변형시켜, 세포 내에서 상기 유전자의 발현을 감소시키거나 방지할 수 있다. IFN-β2 유전자, 예를 들어 뮤린 (murine) IFN-β2 유전자 영역으로의 삽입은 상동성 재조합을 통해 수행될 수 있다. 상동성 유전자 영역 및 선택가능한 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함하는 재조합 핵산 분자를 IFN-β2의 프로모터 및(또는) 코딩 영역 및(또는) 비코딩 영역에 삽입함으로써, 상기 유전자의 발현이 기능적으로 파괴된다. 이어서, 이러한 녹아웃 구조물을 세포에 삽입하는 경우, 상기 구조물은 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 그러므로, 상기 세포의 자손은 상기에서 삽입된 뉴클레오티드 서열에 의해 유전자의 내인성 뉴클레오티드 서열이 파괴되기 때문에, 유전자의 기능적 카피 (copy)를 하나만 발현하며, 다른 카피는 유전자 생성물을 더 이상 발현하지 못하거나, 감소된 수준으로 발현할 것이다. 원한다면, 기능적 유전자를 유사한 제2 단계에서 불활성화시킬 수 있다.

상동성 재조합에 효과적인 뉴클레오티드 서열은 원하는 표적 핵산에 삽입될 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 선택가능한 마커 뉴클레오티드 서열 또는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

재조합 핵산을 녹아웃될 내인성 유전자를 함유하는 염색체 DNA를 갖는 세포에 삽입시키는 것이 바람직하다. 세포 내에서, 상기 재조합 핵산 분자는 녹아웃된 유전자의 전사를 방지하거나 차단하는 위치에서 세포의 DNA와의 상동성 재조합을 통해 통합될 수 있다. 이러한 삽입은 통상적으로 상동성 재조합을 통해 일어난다 (즉, 표적 벡터가 세포내로 삽입된 경우, 표적 벡터의 영역 중 내인성 DNA 서열에 상동성이 있거나 상보적인 영역이 서로 혼성화된 후에 이 영역들이 재조합하여 표적 벡터의 일부가 상기 내인성 DNA의 상응하는 위치로 혼입될 수 있음). 논의한 바와 같이, 1개 이상의 뉴클레오티드 서열이 유전자에 삽입되어 상기 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 유전자에서 삽입된 뉴클레오티드 서열의 존재를 결정하는것이 바람직하다. 이는 핵산 혼성화, 삽입된 핵산에 의해 코딩되는 에피토프에 대한 항체 결합, 또는 삽입된 서열의 표현형 선택 등을 비롯한 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 그러므로, 이렇게 삽입된 뉴클레오티드 서열은 제1의 선택가능한 뉴클레오티드 서열이라 지칭될 수 있다. 제1의 선택가능한 뉴클레오티드 서열은 이것이 존재하는 세포에 제1 선택-특징을 부여하는 것이 바람직하다. "선택-특징"이라는 어구는 예를 들어 세포 내에서 발현되어 다른 특징(들)에 비해 우선적으로 선택될 수 있는 특징을 의미한다. 선택가능한 마커 유전자라고도 공지된 선택가능한 뉴클레오티드 서열은 포유동물의 게놈 DNA로 혼입된 후에 검출가능하고(하거나) 분석가능한 임의의 핵산 분자일 수 있다. 선택-특징은 포지티브 특징, 즉, 세포에서 발현되거나 획득되는 경우에 이의 존재를 통해 이를 발현하거나 획득한 세포를 선별할 수 있는 특징일 수 있다. 포지티브 선택-특징은 세포 또는 유기체가 생존할 수 있게 하며, 예를 들어 항생제 내성, 우아바인-내성 (우아바인-내성 나트륨/칼륨 ATPase 단백질에 대한 유전자) 등이 있다. 포지티브 선택-특징 및 상응하는 선택 작용제의 예로는 Neo 및 G418 또는 가노마이신; Hyg 및 히그로마이신, hisD 및 히스티디놀; Gpt 및 크산틴; Ble 및 블레오마이신; Hprt 및 히포크산틴 등이 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,464,764호 및 문헌 [Capecchi, Science, 244:1288-1292, 1989]을 참조한다. 또한, 표적화된 서열내 선택가능한 유전자의 존재 여부를 선택가능한 유전자의 생성물을 인식하는 결합 리간드를 사용하여 확인할 수 있으며, 예를 들어 항체를 사용하여 선택가능한 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 생성물을 확인하거나, 적당한 리간드를 사용하여 선택가능한 유전자에 의해 코딩되는 수용체폴리펩티드의 발현을 확인하거나, 또는 선택가능한 유전자에 의해 코딩되는 효소의 발현을 분석함으로써 확인할 수 있다. 상기 선택가능한 마커 유전자는 포유동물에서는 천연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 것이 바람직하다.

상기 선택가능한 마커 유전자는 활성이거나 상기 유전자가 삽입된 세포에서 쉽게 활성화될 수 있는 자신의 프로모터 또는 임의의 공급원으로부터의 다른 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 그러나, 선택가능한 마커 유전자는 이것이 삽입된 유전자의 프로코터를 사용하여 전사시킬 수 있기 때문에, 자신의 프로모터가 부착되어 있을 필요가 없다. 선택가능한 마커 유전자는 이의 발현을 구동하고(하거나) 보조하기 위한 1종 이상의 서열, 예를 들어 리보솜-인식 서열, 인핸서 서열, 폴리펩티드 또는 RNA에 안정성을 부여하는 서열 및(또는) 유전자의 전사를 종결시키기 위해 상기 유전자의 3' 말단에 부착된 폴리A 서열 등을 포함할 수 있다.

포지티브 선택가능한 마커는 이러한 포지티브 선택가능한 마커가 상동성 재조합에 의해 표적 핵산으로 통합된 재조합체의 선택을 용이하게 한다. 또한, 본 발명에 따른 유전자 표적 벡터는 제2 선택가능한 유전자에 의해 코딩되는 제2 선택-특징을 추가로 포함하여, 올바르게 표적화된 재조합체의 선택을 추가로 보조할 수 있다. 네가티브 (negative) 선택 마커는 비-상동성 재조합만이 일어난 세포를 선택할 수 있도록 한다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 제2 선택가능한 마커 유전자는 이것이 도입된 세포에 네가티브 선택-특징을 부여한다. 이러한 네가티브 선택-특징들은 랜덤 통합 사건과 상동성 재조합을 구별하는데 사용할 수 있도록 하는 방식으로 표적 벡터에 배열될 수 있다. 네가티브 선택이라는 용어는 세포가 이를 획득하는 경우에 생존력을 잃게 되는 (즉, 세포에 치명적인) 선택-특징을 의미한다. HSV tk (단순 포진 바이러스 티미딘 키나제)를 발현하는 세포에 우선적으로 독성이 있는 뉴클레오시드 유사체인 간시클로비르는 HSV tk 선택가능한 마커가 통합되어 있지 않는 세포를 선택하기 때문에 네가티브 선택 작용제로서 사용될 수 있다. 또한, FIAU (1,2-데옥시-2-플루오로-알파-d-아라비노푸란실-5-요오도우라실)를 HSV tk가 없는 세포를 선택하기 위한 선택 작용제로서 사용할 수도 있다. 다른 네가티브 선택가능한 마커를 유사하게 사용할 수 있다. 네가티브 선택-특징 및 상응하는 선택 작용제의 예로는 티미딘 키나제 (HSV tk) 및 아시클로비르, 간시클로비르 또는 FIAU; Hprt 및 6-티오구아닌 또는 6-티오크산틴; 디프테리아 독소; 리신 독소; 시토신 데아미나제 및 5-플루오로시토신 등이 있다.

전형적으로, 네가티브 선택가능한 마커는 유전자 표적 벡터 5' 또는 3'에서 유전자재조합 상동성 영역에 배열되어 상동성 영역의 이중-교차 대체 재조합에 의해 상기 네가티브 선택가능한 마커가 이동되지 않도록 한다 (포지티브 선택가능한 마커는 표적 핵산상의 정해진 위치로 이동됨). 예를 들어, tk 카세트는 뮤린 유전자의 3' 말단, 3' 정지 코돈으로부터 약 150 염기쌍인 곳에 위치할 수 있다. 또한, 표적 벡터에서 1종 초과의 네가티브 선택가능한 마커를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 표적 벡터의 5' 및 3' 말단에 2개의 네가티브 선택 벡터를 위치시키면, 벡터를 랜덤하게 통합시킨 표적 세포에 대한 선택이 더욱 증대된다. 랜덤 통합 전과 비교했을 때, 랜덤 통합은 종종 벡터의 재배열, 네가티브 선택가능한 마커의 전체 또는 일부의 절제를 초래한다. 이렇게 되면, 네가티브 선택을 사용하여 상동성재조합이 아닌 랜덤 통합에 의해 표적 벡터를 혼입시킨 세포를 제거할 수 없게 된다. 1종 초과의 네가티브 선택가능한 마커의 사용은 실질적으로 랜덤 통합이 1종 이상의 네가티브 선택가능한 마커의 삽입을 초래할 가능성을 증대시킨다. 이러한 목적을 위해서, 네가티브 선택가능한 마커들은 동일할 수도 있고, 또는 상이할 수도 있다.

포지티브-네가티브 선택법을 사용하면, 옳지 않게 통합된 표적화 구조물 서열을 갖는 세포의 백그라운드를 줄이게 된다. 전형적으로, 포지티브-네가티브 선택은 하기의 2가지 활성의 선택가능한 마커의 사용을 포함한다: (1) 랜덤 통합 또는 상동성 표적화 후에 안정하게 발현될 수 있는 포지티브 선택가능한 마커 (예를 들어 neo), 및 (2) 오직 랜덤 통합 후에만 안정하게 발현될 수 있는 네가티브 선택가능한 마커 (예를 들어 tk). 포지티브 및 네가티브 선택 모두를 조합하여, 올바르게 표적화된 상동성 재조합 사건이 일어난 숙주 세포를 효율적으로 수득할 수 있다. 포지티브-네가티브 선택법은 예를 들어 미국 특허 제5,464,764호, WO 94/06908 등에 기재되어 있다. 그러나, IFN-β2 유전자가 기능적으로 불활성화되거나 파괴된 트랜스제닉 동물의 생성에는 1종 이상의 네가티브 선택가능한 마커가 필요하지 않다는 것을 인지해야 한다.

본 발명에 따른 재조합 핵산 분자는 또한 벡터의 전체 또는 일부를 포함할 수도 있다. 벡터의 한 예는 복제 기점 등을 함유하여 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 원하는 숙주 내에서 다량의 재조합 분자를 조작하고(하거나) 증식시키고(시키거나) 수득하는데 유용할 수 있다. 당업자는 원하는 목적, 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물의 세포내 재조합 분자의 증식 등에 따라 벡터를 선택할 수 있다. 예로서, 하기의 벡터가 제공된다: 박테리아: pQE70, pQE60, pQE-9 (퀴아젠 (Qiagen) 제품), pBS, pD10, 파지스크립트 (Phagescript), ΦX174, pBK 파지미드 (Phagemid), pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A (스트라타진 (Stratagene) 제품); 블루스크립트 (Bluescript) KS⁺II (스트라타진 제품); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (파르마샤 (Pharmacia) 제품), 진핵: PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (스트라타진 제품), pSVK3, PBPV, PMSG, pSVL (파르마샤 제품). 그러나, 임의의 다른 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 이의 일부도 이들이 원하는 숙주에서 복제가능하고 생존가능하다면 사용할 수 있다. 또한, 벡터는 게놈이 변형된 숙주에서 상기 벡터를 복제할 수 있도록 하는 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 벡터를 사용함으로써 재조합이 일어날 수 있는 상호작용 기간이 연장되어, 표적화 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 유전자 표적 벡터의 예가 문헌 [Molecular Biology, ed. by Ausubel, F.M., et al., Unit 9.16, FIG. 9.16.1 (pNTK)]에 기재되어 있다.

본 발명의 한 측면에 따라서, IFN-β2 유전자의 기능을 파괴시키거나 외인성 또는 이종 서열을 이에 삽입하여 녹아웃시킴으로써 이의 기능을 차단한다. 예를 들어, 외인성 또는 이종 서열을 IFN-β2 유전자 영역의 제1 출발 코돈 앞에 삽입할 수 있다. 선택가능한 특징을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상동성 재조합을 통해, 상기 서열이 IFN-β2 유전자의 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 하는 방식으로 IFN-β2 유전자에 삽입할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자가 IFN-β2 유전자의 원하는 정해진 위치에 통합된 후에, 내인성 IFN-β2 유전자 프로모터에 의해 선택가능한 특징의 발현이 구동되어, 이러한 통합이 일어난 세포를 검출할 수 있다.

또한, 선택가능한 마커 유전자는 3'의 다운스트림 위치에서 IFN-β2 유전자의 제1 출발 코돈에 통합될 수도 있다. 상기 IFN-β2 유전자는 IFN-β2 폴리펩티드를 사용하여 리딩 프레임 밖 (out-of-reading frame) 또는 리딩 프레임내 통합시켜, 정상 생성물 보다 활성이 약한 융합 폴리펩티드가 제조되도록 할 수 있다. 상기 특징을 발현하는 세포만을 검출함으로써, 원하는 위치에서 통합된 서열을 함유하는 세포를 선택할 수 있다. 이러한 선택을 수행하기 위한 편리한 한가지 방법은 항생제 내성을 이용하는 것이다. 하기의 실시예에서는 선택가능한 특징으로서 네오마이신 내성을 이용하였다. 독성 농도의 네오마이신 존재 하에 성장시킨 세포는 통상적으로 사멸할 것이다. 상동성 재조합에 의한 네오마이신 내성 유전자의 획득은 세포를 치명적인 영향으로부터 보호하여 이들의 선택을 용이하게 한다.

통합 사건을 통해 IFN-β2 유전자를 녹아웃시키거나 기능적으로 차단시킨다. IFN-β2 코딩 서열 앞쪽에 선택가능한 유전자를 삽입함으로써, IFN-β2가 발현될 수 없게 하면서 이를 프로모터 서열로부터 효과적으로 단리한다. 선택가능한 유전자가 전사 터미네이터를 함유하는 경우에는, 이후에 IFN-β2 프로모터를 사용한 상기 유전자의 전사가 즉시 종결되고 IFN-β2 코딩 서열이 거의 전사되지 않도록 한다. 또한, IFN-β2 유전자를 대체물 없이 결실시켜, 예를 들어 유전자의 일부를부위-지정 결실시켜 녹아웃시킬 수도 있다. 결실된 영역은 상기 유전자의 조절 영역을 코딩하는 영역일 수 있다.

IFN-β2 유전자를 임의의 원하는 위치에서 변형시킬 수 있다. 이러한 변형을 통해, 완전한 IFN-β2 폴리펩티드의 1개 이상의 활성을 보유하는 말단절단형 IFN-β2 폴리펩티드가 생성되도록 할 수 있다. 원한다면, 삽입체(들)을 재조합 유전자로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 마우스 IFN-β2 유전자의 엑손을 네오마이신 카세트로 대체시켜 이를 기능적으로 불활성화시킨다. 이후에, 재조합 효소 시스템 등을 사용하여 IFN-β2 유전자로부터 네오마이신 카세트를 제거할 수 있다. Cre-lox 부위-특이적 재조합 시스템이 재조합 유전자로부터의 서열 제거에 특히 유용하다. Cre-lox 시스템을 사용하기 위해서는, 재조합 효소 인식 부위를 선택가능한 유전자가 있는 염색체로 통합시켜, 이후에 이것이 용이하게 제거되도록 한다. 재조합 효소 절제 시스템에 대한 지침과 관련해서는, 예를 들어 미국 특허 제5,626,159호, 동 제5,527,695호 및 동 제5,434,066호 등을 참조한다. 또한, 문헌 ([Orban, P. C., et al., "Tissue- and Site-Specific DNA Recombination in Transgenic Mice", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6861-6865, 1992], [O'Gorman, S., et al., "Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in Mammalian Cells", Science, 251:1351-1355, 1991], [Sauer, B., et al., "Cre-stimulated recombination at loxP-Containing DNA sequences placed into the mammalian genome", Nucl. Acids Res., 17(1):147-161, 1989])을 참조한다.

핵산의 다른 측면과 관련해서는, 분자생물학의 표준 교재를 참고할 수 있다. 예를 들어 문헌 ([Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986], [Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985], [Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press, 1989], [Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995])을 참조한다.

IFN-β2의 발현 및 정제 :

정제된 IFN-β2를 SDS-PAGE를 통해 IFN-β1b와 비교했다. SDS-PAGE를 통해 측정된 바와 같이 IFN-β2의 명백한 분자량은 26 kDa인 반면, IFN-β1b의 명백한 분자량은 대략 20.5 kDa이었다.

방법:PCR 프라이머 (5'-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3' 및 5'-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3')를 고안하여 인간 게놈 DNA 제제로부터 IFN-β2의 코딩 영역 (신호 서열 제외)을 증폭시킨 후에, IPTG 유도가능한 pet5a 발현 벡터 (프로메가 코포레이션 (Promega Corp.))로 라이게이션시켰다. 유도 후에, 대장균 봉입체(封入體)로부터 IFN-β2를 단리하고 쯔비터전트 (Zwittergent) 3-14를 사용하여 용해시켰다 [Russell-Harde et al., J. Interferon Cytokine Res., 15, 31-37, 1995]. 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 후에 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여, 용해된 봉입체로부터 IFN-β2를 정제했다. SDS-PAGE 겔로부터 IFN-β2에 상응하는 26 kDa 밴드를 용출시켜 N-말단 단백질 서열결정을 통해 분석했다. 처음 10개의 아미노산은 IFN-β2에 대해 예측되는 아미노산에 상응했다. 또한, 취화사이안 소화를 수행하여 수득된 여러개의 단편을 서열결정하여 이들이 예측된 단백질 서열을 갖는다는 것을 알아냈으며, 이는 전체 단백질이 성공적으로 발현되어 정제되었다는 것을 증명하는 것이다.

IFN-β2에 의한 인터페론 의존성 ISRE-루시퍼라제 리포터의 활성화 :

T98G 세포를 ISRE-루시퍼라제 구조물을 함유하는 플라스미드로 형질감염시켜, 상기 구조물을 발현하는 안정한 클론을 단리했다. 3 ×10⁴개 세포를 밤새 플레이팅해두고, 정제된 IFN-β2를 지시된 농도로 첨가했다. 4시간 후에, 루시퍼라제 분석 키트를 상기 키트 프로토콜 (프로메가 카탈로그 번호 E1501)에 기재된 바와 같이 사용하여 상기 세포를 루시퍼라제 활성에 대해 분석했다. IFN-β2는 인터페론 의존성 ISRE 리포터를 특이적으로 활성화시켰다. 도 6을 참조한다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

항-IFN-β2 마우스 폴리클로날 항체를 사용한, 인간 제I형 인터페론 수용체에 대한 IFN-β2의 결합 억제 :

IFN-β2의 독특한 C-말단 영역에 상응하는 펩티드 (KLSKQGRPLNDMKQELTTEFR)를 합성하여 KLH과 커플링시키고, 이를 사용하여 스위스-웹스터 (Swiss-Webster) 마우스를 2달에 걸쳐 총 4회 면역화시켰다. 면역화 후에 혈청을 수집하여 IFN-β2와 특이적으로 결합하는 항체를 함유한다는 것을 확인했다. 또한, 상기항-IFN-β2 혈청은 IFN-β2에 의한 IFN 의존성 ISRE-루시퍼라제 리포터의 유도를 차단했다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:3 ×10⁴개 세포를 밤새 플레이팅해두고, 항-IFN-β2 혈청 또는 정상 마우스 혈청의 존재하에 IFN-β2 20 ng을 첨가하고, 4시간이 지난 후에 프로메가 코포레이션의 루시퍼라제 분석 키트 및 표준 프로토콜을 사용하여 유도된 루시퍼라제의 존재에 대해 분석했다. 도 7을 참조한다.

인간 HT1080 세포 증식에 대한 IFN-β1b 및 IFN-β2의 효과 :

IFN-β1b 및 IFN-β2는 HT1080 세포 및 HT1080IFNAR2c 세포 모두에 대한 항-증식 효과가 있다. 이는 알라마 블루 (Alamar Blue) 분석 패널 (도 8A 및 도 8B)에서 뿐 아니라 가시적으로 확인했을 때도 분명했다. IFN 결합 부위의 수가 HT1080 세포에 비해 5배 더 많은 HT1080IFNAR2c 세포에서의 효과 증가로 병백한 바와 같이, 항-증식 효과는 수용체 수 증가와 상관관계가 있다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:HT1080IFNAR2c 세포는 IFNAR2c를 과다 발현하는 HT1080 세포이다. 이들 세포는 IFN 결합 부위 수가 모(母) HT1080 세포 보다 5배 더 많다. 2 ×10⁴내지 5 ×10⁴개 세포/mL을 밤새 플레이팅해두고, 자극하지 않거나 IFN-β2 1 ㎍/mL, 500 ng/mL, 200 ng/mL 또는 50 ng/mL로 자극했다. 그러나, HT1080 세포는 IFN-β 1㎍/mL, 500 ng/mL 또는 200 ng/mL로 자극한 반면, HT1080IFNAR2c 세포는 IFN-β 500 ng/mL, 200 ng/mL 또는 50 ng/mL로 자극했다. 알라마 블루 (미국 특허 제5,501,959호)를 표준 프로토콜에 따라 사용하여 세포 증식을 측정하고, 각 시간마다 대표 영역의 사진을 찍었다. 인터페론을 함유하는 배지를 매일 교체했다. 모든 처치를 3벌로 수행했다. 도 8을 참조한다.

단기간 ³ [H] 티미딘 혼입량을 통해 측정한, 인간 HT1080 세포에 대한 IFN-β2의 항-증식 활성 :

³[H] 티미딘의 혼입량을 IFN-β2을 첨가 한 지 48시간 후 (스트리핑 컬럼) 또는 완충액 대조군 (충전 컬럼)에 대해 측정했다.³[H] 티미딘 혼입량은 혼입된 CPM/10⁶개 세포로 표시된다. 데이타 (도 9)는 n = 3에 대한 평균값 및 복제물들 사이의 편차가 15％ 미만임을 나타낸다. IFN-β2는 티미딘 혼입량을 유의하게 감소시켰으며, 예를 들어 약 86％ 감소시켰다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:세포를 24-웰 세포 배양 플레이트에 접종 (2 ×10⁴개 세포/웰)하여 밤새 인큐베이션시킨 후에 IFN-β2 (1 ㎍/mL)로 24시간 동안 자극시켰다. 이어서, 세포를³[H] 티미딘 ([메틸-³H] 티미딘, 비(比)활성 = 40 내지 60 Ci/mmol, 아머샴 라이프 사이언스 (Amersham Life Science) 제품)을 함유하는 완전 배지 중에 인큐베이션시키고 24시간 후에 수거했다. 세포를 인산염 완충 염수 (PBS)로 세척한 후에 10％ 트리클로로아세트산 (TCA) 및 100％ 에탄올로 세척했다. 세포를 1 M 수산화칼륨 중에 용해하고 에콜럼 (Ecolume) 섬광계수액과 혼합한 후에, 방사선활성의 혼입량을 측정했다.

IFN-β2에 의한 제I형 IFN 수용체의 활성화 :

IFN-β2는 인간 제I형 IFN 수용체 중 IFNAR2c 수용체 쇄의 티로신 인산화를 유도했다. 세포를 자극하지 않거나 (무자극) 또는 인간 IFN-α2, IFN-β1b 또는 IFN-β2 (1000 내지 2000 상대 유닛/10⁶개 세포, 15분)로 자극했다. 인터페론이 존재하는 경우에는 인산화가 관찰되었으나, 인터페론이 존재하지 않는 경우에는 관찰되지 않았다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:IFNAR2c를 발현하는 다우디 (Daudi) 세포 (5 ×10⁷개 세포)를 용균 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1％ NP-40 (Nonidet-40) (v/v), 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 2.5％ 글리세롤 (v/v), 1.0 mM 불화나트륨, 1.0 mM 오르토바나딘산 나트륨, 1.0 mM 페닐메티술포닐 플루오라이드 (PMSF), 0.5 ㎍/mL 류펩틴 및 5.0 ㎍/mL 트립신 억제제를 함유함) 중에 30분 동안 4℃에서 용해시키고, 원심분리하여 불용성 물질을 제거했다. 면역침전을 위해, IFNAR2c 항-혈청 (+) 또는 네가티브 대조군 항-혈청 (-)을 각 샘플에 첨가하여 밤새 인큐베이션시키고, 프로테인-G (Protein-G) 아가로스 (베링거-만하임 (Boehringer-Mannheim) 제품)와 혼합하여SDS-PAGE (10％ 노벡스 (Novex) 겔)를 통해 분석했다. 단백질들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터에 이동시키고 (프로-블롯 (Pro-Blot)), 차단 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.1％ Tween 20 (v/v), 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1.0 mM 불화나트륨, 1.0 mM 오르토바나딘산 나트륨, 1.0 mM PMSF, 0.5 ㎍/mL 류펩틴 및 5.0 ㎍/mL 트립신 억제제를 함유함) 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고, 항-포스포티로신 항체 (ab PY99, 미국 캘리포니아주 산타클루즈에 소재하는 산타클루즈 바이오테크놀로지, 인크. 제품)와 인큐베이션시켜 차단 완충액 중에서 세척했다. 세척한 후에, 상기 막을 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 커플링시킨 특이적 2차 항체 (1 : 1000 희석물)와 1시간 동안 인큐베이션하여 차단 완충액 중에서 3회 세척하고, 화학발광 검출 방법 (피어스 (Pierce) 제품)을 사용하여 발색시켰다.

다우디 세포에서 IFN-β2를 사용한 자극에 의한, STAT1 및 STAT2의 활성화 :

다우디 세포를 IFN-β1b 또는 IFN-β2 (1000 내지 2000 상대 유닛/10⁶개 세포)로 15분 동안 자극하고 용균 완충액 중에 용해시켜 STAT1 및 STAT2를 면역침전시켰다. 면역침전 후에 포스포티로신 특이적 항체를 사용했을 때, 두가지 IFN형 모두에 대해 STAT1 및 STAT2의 티로신 인산화가 검출되었다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:다우디 세포 (1 ×10⁷개 세포)를 용균 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1％ NP-40 (Nonidet-40) (v/v), 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 2.5％ 글리세롤(v/v), 1.0 mM 불화나트륨, 1.0 mM 오르토바나딘산 나트륨, 1.0 mM 페닐메티술포닐 플루오라이드 (PMSF), 0.5 ㎍/mL 류펩틴 및 5.0 ㎍/mL 트립신 억제제를 함유함) 중에 30분 동안 4℃에서 용해시키고, 원심분리하여 불용성 물질을 제거했다. 면역침전을 위해, STAT1 및 STAT2 항체 (각각 Stat1 p91 및 Stat2 (C-20), 미국 캘리포니아주 산타클루즈에 소재하는 산타클루즈 바이오테크놀로지, 인크. 제품)를 각 샘플에 첨가하여 밤새 인큐베이션시키고, 프로테인-G 아가로스 (베링거-만하임 제품)와 혼합하여 SDS-PAGE (10％ 노벡스 겔)를 통해 분석했다. 단백질들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터에 이동시키고 (프로-블롯), 차단 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.1％ Tween 20 (v/v), 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1.0 mM 불화나트륨, 1.0 mM 오르토바나딘산 나트륨, 1.0 mM PMSF, 0.5 ㎍/mL 류펩틴 및 5.0 ㎍/mL 트립신 억제제를 함유함) 중에서 밤새 4℃에서 인큐베이션시키고, 항-포스포티로신 항체 (PY99, 미국 캘리포니아주 산타클루즈에 소재하는 산타클루즈 바이오테크놀로지, 인크. 제품)와 인큐베이션시켜 차단 완충액 중에서 세척했다. 세척한 후에, 상기 막을 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 커플링시킨 특이적 2차 항체 (1 : 1000 희석물)와 1시간 동안 인큐베이션하여 차단 완충액 중에서 3회 세척하고, 화학발광 검출 방법 (피어스 제품)을 사용하여 발색시켰다.

IFN-β2 및 IFN-β1b의 항-바이러스 활성 :

인간 WISH 세포를 IFN-β1b 또는 IFN-β2로 자극시킨 후에 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로 감염시켰다. 산화환원 염료인 알라마 블루를 사용하여 바이러스 세포변성 효과 (CPE)를 측정했다. IFN-β1b에 상응하는 항-바이러스 활성 유닛을X-축에 플롯팅했다. IFN-β2의 특이적 항-바이러스 활성은 1 mg 당 4.0 ×10⁶내지 8.0 ×10⁶IU (International Unit)인 것으로 측정되었다. 도 10을 참조한다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:WISH 세포 (30,000개 세포/웰)를 96-웰 팔콘 (Falcon) 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하여 밤새 부착시켰다. 세포를 IFN-β1b (제1 웰에 1000 IU; 비활성 = 2.5 ×10⁷IU/mL) 또는 IFN-β2 (제1 웰에 1 ㎍) (플레이트에서 1 : 1로 희석함)로 6시간 동안 자극한 후에 VSV (7 ×10³플라크 형성 단위/웰, (PFU))를 첨가하여 18시간 동안 두었다. 인큐베이션시킨 후에, 배지를 제거하고 알라마 블루 (바이오소스 인터내셔널 (Biosource International) 제품) (구입한 스톡 용액을 배지 중에 1 : 10으로 희석함) 100 ㎕를 각 웰에 첨가했다. 30 내지 60분 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후에, 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 CPE를 결정했다.

IFN-β2는 HT1080 세포에서 제I형 IFN 수용체와의 결합에 대해 IFN-α2와 경쟁함 :

1 ×10⁶HT1080 세포를 전체 세포 배양 배지 (10％ FBS, DMEM) 중에서 15 ng/mL³²P-표지된 IFN-α2 (페스트카 바이오메디칼 (Pestka Biomedical) #51100)과 90분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후에, 세포를 세포 배양 배지로 2회 세척하고 1％ SDS 중에 용해시켰으며, 섬광계수액과 혼합하여 계수했다. IFN-β215 ㎍/mL는 HT1080 세포에 결합된 상기 표지된 IFN-β2와 90％ 초과로 경쟁했다. 분석은 3벌로 수행하였으며 표준 편차는 10％ 미만이었다. 도 11을 참조한다.

다우디 세포상의 제I형 IFN 수용체에 대한, IFN-β2의 경쟁적 결합 :

IFN-α2의 인산화 형태를 사용하여 경쟁적 리간드 결합 분석을 수행했다. 문헌 [Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271:33165-33168, 1996]에 기재된 바와 같이 상기 리간드를 인산화시켰다 (비활성: 60 내지 62 μCi/㎍). 문헌 [Scatchard, G., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51, 660-672, 1965]에 기재된 바에 따라 결합 데이타를 분석했다. 100-배 과량의 표지되지 않은 IFN의 존재하에서 비특이적 결합을 측정했다. 표지되지 않은 IFN-α2, IFN-β1b 또는 IFN-β2의 양을 점차 증가시키면서 일정량의 인산화된 IFN-α2와 인큐베이션시켜 상이한 IFN들의 경쟁적 결합을 측정했다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

제I형 IFN 수용체의 IFN-β 특이적 조립 :

IFN-β1b는 IFN-α2와 구별되는 방식으로 제I형 IFN 수용체와 상호작용했다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:세포 (1 ×10⁸)를 200 IU/10⁶개 세포 농도로 37℃에서 15분 동안 CO₂인큐베이터에서 IFN로 자극시켰다. 처치 후에, 4℃에서 원심분리 (3000 ×g, 3분)하여 세포를 신속하게 수거하고 빙냉 용균 완충액 (100 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl,10％ 글리세롤 (v/v), 1％ NP-40 (v/v), 1 mM 오르토바나딘산염, 1 mM 피로인산나트, 1 mM 불화나트륨, 1 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 5 ㎍/mL 류펩틴 및 5 ㎍/mL 트립신 억제제를 함유함) 중에 즉시 용해했다. 상기 용균물을 4℃에서 원심분리 (16,000 ×g, 30분)하고 상층액을 수집했다. 문헌 [Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996]에 기재된 바와 같이, 세포 용균물을 항-IFNAR1 항체를 사용하거나, 또는 IFNAR2.2 토끼 폴리클로날 항-혈청 (항-혈청 10 ㎕/10⁸개 세포)을 사용하여 면역침전시킨 후에 노벡스 8％ 트리스-글리신 겔을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 수행했다. 전기천공 후에, 단백질들을 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 필터에 이동시키고 (프로-블롯), 20 mM 트리스 (pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM 오르토바나딘산염, 1 mM 피로인산나트, 1 mM 불화나트륨, 1 mM PMSF 및 0.1％ Tween 20을 함유함)로 밤새 상온에서 차단시켰다. 이어서, 상기 필터를 IFNAR1 (40H2, 0.1 ㎍/mL, 문헌 [Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996]에 기재된 바와 같음) 또는 IFNAR2 (항-혈청 10 ㎕/차단 완충액 10 mL)에 대해 지시된 항체와 2 내지 3시간 동안 상온에서 인큐베이션시킨 후에 40분 동안 차단 완충액으로 세척했다. 이어서, 세척된 필터를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 접합된 상응하는 2차 항체와 2 내지 3시간 동안 상온에서 인큐베이션시키켜 세척하고 화학발광법 (인핸스드 켐일루미네슨스 디텍션 키트 (Enhanced Chemiluminescence Detection Kit), 피어스 제품)을 사용하여 발색시켰다.

상이한 클래스의 인터페론들에 의한 유전자의 우선적 유도 :

인터페론은 배양된 세포에서 중복되는 별개 세트의 유전자를 유도한다. 다우디 또는 HT1080 세포를 인간 IFN-α2 (1000 IU/10⁶개 세포), IFN-β1b (1000 IU/10⁶개 세포), IFN-γ (1000 IU/10⁶개 세포), 또는 IFN-β2 (1000 IU/10⁶개 세포)로 17시간 동안 자극하고, 온전한 세포 펠렛을 수집하여 문헌 [TaqMan (등록상표) Gold RT-PCR Protocol Manual, Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation P/N 402876 Rev. A 1997]에 기재된 바와 같이 태크맨 (TaqMan) (등록상표) 분석을 위한 처리를 했다. 문헌 [Sandhya, R. et al., J. Biol. Chem., 271, 22878-22884, 1996]에 기재된 바와 같이, 유전자 발현물의 RNase 보호 분석을 위해서 세포를 자극하고 수거했다. IFN-β1b에 의해 우선적으로 유도된 유전자는 IFN-α 및 IFN-β에 의해 동등하게 유도되는 유전자인 ISG 6-16 발현이 정상적이었다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

IFN-β2에 대한 반응에서 인간 태아 성상세포의 항-증식 :

성상세포는 MS 병변의 발생에 기여하며, 본 출원인들은 본원에서 IFN-β2가 인간 태아 성상세포의 증식을 시험관내 억제한다는 것을 밝혀냈다. 이러한 관찰은 IFN-β2가 성상세포 증식의 성장 조절자로서 작용할 수 있어서, MS시 반응성 신경교성 병변의 형성을 방지할 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 분석을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:

(A) 대교세포 배양물의 제조:2개의 상이한 인간 태아 (임신 17 내지 22주째) 뇌로부터 성상세포-풍부 배양물을 제조하였다. 합법적인 치료적 유산을 통해 어드밴스드 바이오사이언스 리소스 인크. (Advanced Bioscience Resource Inc.)로부터 조직을 얻었다. 뇌척수막을 제거한 후에, 뇌를 절단하고 피펫을 완만하게 사용하여 단일 세포 현탁액으로 분리시킨 후에 이들을 체에 통과시켰다. 세포를 페니실린, 스트렙토마이신 및 펀자이존 (fungizone)을 함유하는 항생제 칵테일의 존재 하에 10％ FCS를 함유하는 이스코브 (Iscove's) 배지 중에 재현탁하고, 차별적 접착 기술을 통해 소교세포를 1주일 동안 매일 제거하였다. 이어서, 성상세포를 8 내지 10 주 이상 동안 성장시켜 1주일에 2회 공급하였다. 소교세포, 뉴런 및 희돌기교세포의 전구세포 오염물은 이러한 장기간의 배양 조건하에서는 생존할 수 없다. 상기 기간이 끝난 후에, 배양물을 GFAP, O4 및 네스틴 항체로 염색하고 95％ 초과의 순수한 성상세포가 존재한다는 것을 확인하였다. 배양물을 액체 N₂중에 냉동시켰다가 증식 분석에 사용했다.

(B) 증식 분석:냉동된 스톡으로부터 성상세포를 해동시켜 상기 기재한 배지 중에서 2계대 이상 성장시킨 후에, 증식 분석에 사용했다. 10 ng/mL EGF (R ＆ D 시스템스 (R ＆ D Systems) 제품)의 존재 또는 부재하에 세포를 96-웰 플레이트에 2 ×10⁴개 세포/mL로 플레이팅시켰다. 저혈청 배지 (2％ FCS) 중에서 분석을 수행했다. 배양물에 지시된 희석 농도의 IFN-β2 (1 mg/mL 스톡) 또는 완충액 대조군을 처치하였다. 4일 동안 인큐베이션 후에, 상기 배양물을³H-티미딘과 함께 밤새 인큐베이션하고, 상기 플레이트를 냉동시켰다가 수거했다.

다발성 경화증의 설치류 모델에서 IFN-β2의 활성 :

실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증을 위한 동물 모델로서 광범위하게 사용된다 (문헌 [Swanborg, G., Clin. Immunol. Immunopathol., 77, 4-13, 1995], [Martin, R. and McFarland, H., Springer Semin. Immunopathol., 18, 1-24, 1996]). IFN-β1b는 관련된 이들 MS 모델에서 생체내 효능을 나타냈다. 이러한 모델을 사용하여, IFN-β2의 기능적 특성이 IFN-β1b의 기능적 특성과 유사하다는 것을 증명했다.

방법:

(A) SJL 마우스에서 수동 수송 실험적 알레르기성 뇌척수염

동물 및 물질:8주된 암컷 SJL 마우스 (잭슨 레버러토리스 (Jackson Laboratories)로부터 얻음); L-글루타민 및 25 mM HEPES를 함유하는 RPMI 1640 (1 ×) (0.1 미크론으로 여과함) (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies) 제품, 카탈로그 번호 22400-089); 규정된 FBS (하이클론 (Hyclone) 제품, 가열 처리에 의해 불활성화시킴, 카탈로그 번호 SH30070.01); 10 mM MEM 불필수 아미노산 용액 (100 ×) (라이프 테크놀로지스 제품, 카탈로그 번호 11140-050); D-PBS 중 5.5 ×10^-2M 2-메르캅토에탄올 (1000 ×) (라이프 테크놀로지스 제품, 카탈로그 번호 21985-023); 페니실린/스트렙토마이신, 1 mL 당 10,000 U/㎍ (바이오-휘테이커 (Bio-Whittaker) 제품, 카탈로그 번호 17-602 E); 행크 발랜스드 설트 (Hank's Balanced Salt) 용액(1 ×) (0.1 미크론으로 여과함) (라이프 테크놀로지스 제품; 카탈로그 번호 24020-117).

실험:8주된 암컷 SJL 마우스에 결핵균인 H37Ra 200 ㎍를 함유하는 완전 프로인트 아쥬반트 ("CFA", complete Freund's adjuvant) 중 150 ㎍ 프로테오리피드 단백질 ("PLP") (분쇄시킴)을 함유하는 주사액 0.1 mL을 피하 주사 (꼬리 하단 및 등 위쪽에 나누어 주사함)하여 면역화시켰다. 11일 후에, 상기 마우스로부터 액와 림프절, 상완 림프절 및 서혜 림프절 세포를 취하여, RPMI 1640 (L-글루타민 및 HEPES 함유) 450 mL에 FBS 50 mL, 2-메르캅토에탄올 0.455 mL, 페니실린/스트렙토마이신 5.0 mL 및 불필수 아미노산 5.0 mL을 첨가한 배지 중에서 6 ×10⁶개 세포/mL로 배양했다. 상기 세포에 PLP를 첨가하여 최종 농도를 50 ㎍/mL로 만들었다. 세포를 72시간 동안 37℃, 7％ CO₂중에서 인큐베이션시켰다. 세포를 수거하여 HBSS 중에서 2회 세척했다. 림프절 세포들의 생존력을 트립판 블루 (Trypan Blue) 배제 실험을 통해 평가했다. 림프절 세포들의 농도를 1 mL 당 4 ×10⁷개 세포로 조정했다. 2 ×10⁷개 림프절 세포를 투약되지 않은 8주된 암컷 SJL 마우스에게 복강내 주사 (마우스 당 투여한 부피 = 0.5 mL)했다. 상기 마우스의 체중을 재고 매일 스코어링했다. 필요에 따라, IFN-β2 및 IFN-β1b 처치물을 투여했다. 임상 평가 (EAE 스코어/증상): 0/정상; 1/꼬리에 기운이 없음; 2/자세를 가누기 어려움; 3/뒷다리 중 하나 또는 둘 다의 불완전한 마비; 4/뒷다리 중 하나 또는 둘 다의 완전한 마비;5/움직이지 않거나 사망 직전 또는 사망.

(B) 루이스 (Lewis) 래트에서의 급성 실험적 알레르기성 뇌척수염

동물 및 물질:암컷 루이스 래트 (챠알스 리버 (Charles River)로부터 구입, 8주째에 면역화함; 척수 균질물 제조 (미국 길로리에 소재하는 사이몬센 랩스 (Simonsen Labs)에서 얻은 수컷 하르틀리 (Hartley) 기니아 피그로부터 제조):

500 내지 700 g짜리 기니아 피그를 CO₂로 안락사시켰다. 날카로운 골가위를 사용하여 척추를 잘라 척수를 취하여 염수 중에 헹궈 1회 블롯팅하고, 사용하는 날까지 -80℃에 저장하였다. 이어서, 척수의 무게를 재고 1 g/mL 염수 중에 균질화했다.

항원 에멀젼:기니아 피그 척수 균질물을 1 mg/mL 결핵균 (막자와 막자 사발을 사용하여 분쇄함)을 함유하는 CFA (미국 미시건주 디트로이트에 소재하는 디프코 (Difco) 제품)와 1 : 1로 혼합했다. 0.05 mL을 래트 당 총 0.1 mL로 뒷다리 풋패드 각각에 주사했다.

실험:제1일에 래트에게 단일 농축괴를 주입하여 면역화시켰다. 래트의 체중을 재고 매일 스코어링했다. 필요에 따라, IFN-β2 및 IFN-β1b 처치물을 투여했다. 임상 평가 (EAE 스코어/증상): 0/정상; 1/꼬리에 기운이 없음; 2/뒷다리 중 하나 또는 둘 다의 불완전한 마비; 3/뒷다리 중 하나 또는 둘 다의 완전한 마비로 움직일 수는 있으나 몸을 이동시킬 수는 없음; 4/뒷다리 중 하나 또는 둘 다의 완전한 마비; 5/뒷다리 모두의 완전한 마비 및 앞다리 중 하나 또는 둘 다가 약함 또는 사망 직전 또는 사망.

전술한 기재로서 본 발명을 완전히 활용할 수 있다. 그러므로, 전술한 바람직한 구체적인 실시양태는 단지 예시하기 위해서일 뿐이며, 어떠한 방식으로도 개시된 내용을 제한하려 하는 것이 아니다. 상기에서 언급한 모든 출원, 특허 문헌 및 간행물 및 도에서 개시한 전체 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

Claims

치료 유효량의 도 2의 인간 IFN-β2 (인터페론-베타-2) 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 유도체 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는, 포유동물에서의 다발성 경화증 치료에 유용한 제약 조성물.
제1항에 있어서, 포유동물이 인간인 제약 조성물.
치료 유효량의 도 2의 인간 IFN-β2 (인터페론-베타-2) 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 유도체 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는, 포유동물에서의 다발성 경화증 치료에 유용한 제약 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 방법.
제3항에 있어서, 포유동물이 인간인 것인 방법.
치료 유효량의 인간 IFN-β2 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 유도체 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는, 포유동물에서의 다발성 경화증 치료에 유용한 제약 조성물.
치료 유효량의 인간 IFN-β2 폴리펩티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 이의 생물학적 활성 유도체 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는, 포유동물에서의 다발성 경화증 치료에 유용한 제약 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 방법.