KR102096526B1

KR102096526B1 - 식물 유래 ｄｎａ 탈메틸효소를 이용한 동물세포에서의 인터페론의 발현 수준의 증가용 조성물, 항바이러스용 조성물, 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR102096526B1
Application number: KR1020180088150A
Authority: KR
Inventors: 허진회; 목영근
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-04-02
Also published as: WO2019022578A2; US20200017876A1; WO2019022578A3; KR20190013626A

Abstract

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물 또는 키트, 항바이러스용 조성물, 및 이들을 이용한 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 이에 의하면, 동물세포에서 DME의 발현을 유도함으로써 세포 분열 없이도 DME에IFNβ의 발현 증가에 의해 빠른 시간 내에 항바이러스 반응을 유도할 수 있다.

Description

식물 유래 ＤＮＡ 탈메틸효소를 이용한 동물세포에서의 인터페론의 발현 수준의 증가용 조성물, 항바이러스용 조성물, 및 이를 이용한 방법{Composition for increasing expression level of interferon in animal cell using plant DNA demethylase, antiviral composition, and method using the same}

식물 유래 DNA 탈메틸효소를 이용한 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물 또는 키트, 항바이러스용 조성물, 및 이들을 이용한 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.

DNA 메틸화(mehtylation)는 염색질 구조 및 유전자 발현을 조절하는 주요 후성유전학적(epigenetic) 기작의 하나이다. 일반적으로, DNA 과메틸화(hypermethylation)에 의해 염색질이 응축되고 유전자의 발현이 억제되고, DNA 탈메틸화(demethylation)에 의해 염색질의 응축이 풀어지고 유전자의 발현이 유도된다. 진핵생물에서 DNDNA 메틸화 일반적으로 DNA 염기 중 하나인 시토신(cytosine)의 5-메틸시토신(5-methylcytosine: 5mC)으로의 변환을 의미하며, DNA 메틸화효소(DNA methyltransfrase: DNMT)에 의해 이루어진다. DNA 탈메틸화는 5-메틸시토신의 시토신으로 변환을 말하고, 수동적 또는 능동적 탈메틸화가 일어난다. 동물에서 능동적 탈메틸화는 DNA 수산화효소(hydroxylase)인 TET(Ten-Eleven Translocation) 단백질에 의해 5mC이 산화되어 5-히드록시메틸시토신(5-hydoxymethylcytosine: 5hmC)으로 변환되고, 순차적으로 5-포르밀시토신(5-formylcytosine: 5fC) 및 5-카르복실시토신(5-carboxylcytosine: 5caC)으로 변형되고, 이후 티민 글리코실라제와 같은 미스매치 글리코실라제에 의해 제거된다. 식물에서 능동적 5mC의 탈메틸화는 DNA 글리코실라제(glycosylase)인 DEMETER가 DNA에서 5mC를 직접적으로 제거하고 염기 절제 수선(base excision repair)을 통해 시토신으로 변환시킬 수 있다(Choi et al., Cell, vol.110, pp.33-42, July 12, 2002). 식물의 DME 유전자군은 지금까지 진핵생물에서 직접적으로 5mC를 제거할 수 있는 유일한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것으로 알려져 있다.

사람의 경우, 비정상적인 DNA 메틸화는 암을 포함한 주요 질병의 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에 DNA 탈메틸화제를 치료제로 이용할 수 있다. 예를 들어, 5-아자시티딘(azacytidine, Vidaza®), 5-아자-2'-데옥시시티딘(Decitabine, Dacogen®) 등의 DNA 탈메틸화제는 암이나 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome: MSD)의 치료제로서 이용되고 있다.

따라서, 식물의 DNA 탈메틸 유전자인 DME를 동물세포에 발현시켜 게놈의 탈메틸화 유도하고 이에 의한 세포 신호전달을 분석하여, DME를 다양한 질병의 예방 및 치료에 이용할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다.

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 항바이러스용 조성물을 제공한다.

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 키트를 제공한다.

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.

일 양상은 DNA 탈메틸화 촉매 활성을 갖는 식물 유래 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

상기 식물 유래 폴리펩티드는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 DNA 탈메틸화효소(demethylase)일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 DEMETER(DME) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 DME는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이와 약 99% 이상, 약 95% 이상, 약 90% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 70% 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 DME는 Genbank accession No. AAM77215의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 DEMETER 변이체는 서열번호 1의 DME의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1 내지 677번째 아미노산 서열이 결실(deletion)된 것일 수 있다. 상기 DEMETER 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 DNA로부터 메틸화된 시토신을 절제(excise)하는 탈메틸화효소(demethylase)일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 뉴클레오티드의 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 가수분해함으로써 DNA에서 메틸화된 시토신을 절제하는 DNA 글리코실라제(glycosylase)일 수 있다. 상기 메틸화된 시토신은 5-메틸시토신(5-methylcytosine: 5mC)일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 5-메틸시토신 뉴클레오시드로부터 5-메틸시토신의 염기를 제거하는 염기 절제 수선(base excision repair)을 매개할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 포함된 것일 수 있다. 상기 발현 벡터는 동물 세포에서 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터일 수 있다.

상기 동물 세포는 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 고양이, 또는 마우스로부터 유래된 세포일 수 있다. 상기 동물 세포는 신장 세포, 면역 세포, 암세포, 심장 세포, 신경 세포, 베타 세포(beta cell: β-cell), 줄기세포, 또는 섬유아세포(fibroblast cell)일 수 있다.

상기 인터페론(interferon: IFN)은 척추동물의 면역 세포에서 만들어지는 단백질로서, 바이러스, 세균, 기생충, 종양 등 위부의 침입자에 대응하는 사이토카인을 말한다. 상기 인터페론은 세포 내에서 바이러스의 증식을 막는 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 인터페론은 자연살해 세포, 대식 세포, 수지상 세포 등을 활성화시킬 수 있다. 상기 인터페론은 제1형 인터페론, 제2형 인터페론, 또는 제3형 인터페론일 수 있다. 상기 인터페론은 인터페론-알파(interferon alpha: IFNα), 인터페론-베타(interferon beta: IFNβ), 인터페론-감마(interferon gamma: IFNγ), 인터페론-카파(interferon kappa: IFN-κ), 인터페론-델타(interferon delta: IFN-δ), 인터페론-엡실론(interferon epsilon: IFN-ε), 인터페론-타우(interferon tau: IFN-τ), 인터페론-오메가(interferon omega: IFN-ω), 및 인터페론-제타(interferon zeta: IFN-ζ)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.

상기 인터페론의 발현 수준의 증가는 인터페론의 전사, 번역, 또는 번역 후 가공 단계에서 인터페론을 암호화하는 mRNA의 양, mRNA의 수명, 인터페론 단백질의 양, 인터페론 단백질의 수명, 또는 인터페론 단백질의 분비량의 증가일 수 있다. 상기 인터페론의 발현 수준의 증가는 음성 대조군에서의 인터페론의 발현 수준에 비해 증가된 것일 수 있다. 상기 음성 대조군은 DNA 탈메틸화 촉매 활성을 갖는 식물 유래 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 동물 세포일 수 있다.

상기 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo), 또는 생체 외(ex vivo) 투여용일 수 있다.

다른 양상은 DNA 탈메틸화 촉매 활성을 갖는 식물 유래 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항바이러스용 조성물을 제공한다.

상기 식물 유래 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 및 DNA 탈메틸화는 전술한 바와 같다.

상기 항바이러스용 조성물은 세포 증식을 억제하고, 바이러스 감염 또는 이에 의한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 약학적 조성물일 수 있다. 상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.

상기 조성물은 다른 항바이러스제 또는 항균제를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 DNA 탈메틸화 촉매 활성을 갖는 식물 유래 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 키트를 제공한다.

상기 식물 유래 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, DNA 탈메틸화, 동물 세포, 인터페론, 및 인터페론의 발현 수준의 증가는 전술한 바와 같다.

상기 키트는 상기 동물 세포에 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 형질전환, 형질도입, 형질감염, 또는 형질 주입에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 리포펙타민(lipofectamine)을 포함할 수 있다.

다른 양상은 DNA 탈메틸화 촉매 활성을 갖는 식물 유래 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동물 세포를 인큐베이션시켜 상기 폴리뉴클레오티드를 동물 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 폴리뉴클레오티드와 동물 세포를 인큐베이션시켜 상기 폴리뉴클레오티드를 동물 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질감염, 또는 형질 주입일 수 있다.

상기 방법은 동물 세포의 DNA를 탈메틸화시킴으로써 인터페론 유전자의 발현을 유도할 수 있다.

상기 방법은 시험관 내 세포에서 또는 개체 내에서 항-바이러스 반응을 유도할 수 있다. 상기 방법에 의해 항-바이러스 반응을 유도할 경우, 상기 방법은 개체의 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있다. 상기 개체는 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 바이러스에 감염되었거나 감염될 가능성이 큰 개체일 수 있다. 투여 방법은 경구, 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여 방법은 예를 들어, 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal), 또는 피내 경로일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 상기 상기 폴리뉴클레오티드의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.

동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물 또는 키트, 항바이러스용 조성물, 및 이들을 이용한 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법에 의하면, 동물세포에서 DME의 발현을 유도함으로써 세포 분열 없이도 DME에IFNβ의 발현 증가에 의해 빠른 시간 내에 항바이러스 반응을 유도할 수 있다.

도 1a는 DMEΔ 폴리펩티드의 구성을 나타내는 모식도이고, 도 1b 및 도 1c는 GFP 또는 GFP-DME의 발현 벡터 pCDNA3.1를 형질전환한 동물세포의 공초점 레이저 현미경 이미지 및 시험관 내 5-메틸시토신 제거 실험 결과를 나타낸다.
도 2a는 DME가 발현되는 세포의 배양 시간별 세포 수(ml 당)를 나타내는 그래프이고, 도 2b는 DME 및 5-아자시티딘의 존재시 세포의 배양 시간별 세포 수(ml 당)를 나타내는 그래프이고, 도 2c는 DME가 발현되는 세포의 세포 분열 주기를 나타낸 그래프이다(왼쪽: GFP 형질전환 세포, 오른쪽: DMEΔ 형질전환 세포).
도 3a 및 도 3b는 각각 TENEL 분석 결과를 나타낸 이미지 및 TENEL 양성 세포(%)를 유세포 분석법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 DME가 형질전환된 세포에서 각각 인터페론 유전자(interferon stimulated gene; ISG), 세포 분열에 관여하는 유전자, 및 열 충격 단백질 유전자의 실시간 유전자 증폭 반응 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DME가 형질전환된 세포에서 형질전환 후 시간에 따른 IFNβ의 발현 수준을 확인한 면역블로팅 이미지 및 발현 변화 배수를 나타낸 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 형질전환

사이토메갈로바이러스 핵 위치 신호(nuclear localization signal: NLS)를 준비하고, pEGFP-C1 벡터(Clontech)의 Bgl II 및 Sal I 부위로 삽입하였다.

Mok, Y. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, vol.107, pp.19225-19230에 기재된 바와 같이, DMEΔN677ΔIDR1::lnk 단편(이하, DMEΔ라고 함)을 제작하였다. 구체적으로, DME는 5-메틸시토신 제거 활성을 갖는 애기장대 유래 DME(서열번호 1; Genbank accession No. AAM77215.1; Choi et al., Cell, vol.110, pp.33-42, July 12, 2002)로부터 활성에 불필요한 부분을 제거하고 도메인 A, 글리코실라제(glycosylase) 도메인 및 도메인 B를 포함하도록 변형하였다. 또한, DME는 N-말단으로부터 1 내지 677번째 뉴클레오티드에 DNA 결합 활성을 갖는 부위가 있고, 이 부위가 존재할 경우 표적이 아닌 핵산이 탈메틸화 되는 오프-타겟(off-target)이 생길 가능성이 있다. 따라서, DMEΔ(서열번호 2)는 N-말단을 부분적으로 제거하면서 오프-타겟이 존재하지 않는 DME 변이체로 제작되었다. 도 1a에서, "GFP"는 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein)을 나타내고, "NLS"는 핵 위치 신호(nuclear localization signal)(서열번호 3)를 나타내고, "링커" 또는 "lnk"는 N-AGSSGNGSSGNG-C의 링커 서열(서열번호 4)을 나타내고, "IDR2"는 도메인간 부위 2(interdomain region 2)을 나타낸다.

DMEΔ를 NLS가 삽입된 pEGFP-C1 벡터의 Sal I 및 Bam HI 부위로 삽입하여 pEGFP-NLS-DMEΔ를 준비하였다. EGFP-NLS-DMEΔ 단편을 증폭하여 pCDNA3.1/hygro/lacZ 벡터에 클로닝하여 pCDAN3.1-GFP-NLS-DMEΔ를 제작하였다. 음성 대조군으로 pCDAN3.1-GFP를 사용하였다.

2. 형질전환

식물 유래 DME 유전자를 포함하고 있는 재조합벡터로 동물세포를 형질전환하기 위해, 형질전환 24시간 전에 인간 배아 신장 유래의 HEK-293T 세포를 60 mm 세포배양 접시에 5x10⁵개의 세포가 되도록 준비하였다. pCDNA3.1 벡터에 각각 클로닝된 GFP, GFP-DME를 각각 10 ㎍ 준비하여 리포펙타민 2000(Invitrogen, 미국)을 이용하여 HEK-293T 세포에 형질전환하였다.

3. GFP-DME의 5-메틸시토신 제거 실험

형질전환 48시간 후 FACS AriaⅢ를 이용하여 GFP, GFP-DME를 처리한 세포에서 각각 녹색 형광단백질이 발현되는 세포만을 구분하여 형질전환된 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 원심분리하여 모은 후 세포 용해 완충액(50 mM Tis-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10%(v/v) 글리세롤 0.1 mM DTT(dithiothreitol) 및, 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche, 스위스))에 재현탁하였다. 세포가 들어있는 시험관을 얼음에 넣은 후 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 세포를 분쇄한 후 원심분리하여 수용성 단백질이 있는 상층액을 취하여 얻은 전세포 추출액을 추후 실험에 이용하였다.

하기 뉴클레오티드 서열의 5-메틸시토신이 있는 35 mer 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용하여 방사성 동위원소로 표지하였다:

5'-CTATACCTCCTCAACTC[5mC]GGTCACCGTCTCCGGCG-3' (서열번호 5)

방사성 동위원소로 표지된 올리고뉴클레오타이드에 전세포 추출액 10 ㎍을 넣고 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다.

4. 세포 증식 분석

GFP 또는 GFP-DME를 HEK-293T에 형질전환한 후 24 시간부터 96 시간까지 24 시간마다 세포의 수를 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용해서 측정하였다. 또한, 형질전환 후 24 시간부터 매 24 시간마다 200 ㎍/㎖의 하이그로마이신 b(hygromycin b)를 함유한 신선한 배지로 교체하여 배양하였다.

5. 세포 분열 주기 분석

GFP 또는 GFP-DME를 HEK-293T에 형질전환한 후 48 시간째에 세포를 수확하였다. 수확한 세포를 차가운 70%(v/v) 에탄올에 재부유(resuspension)하여 4℃에서 교반기에 하룻밤 동안 교반하며 고정하였다. 고정한 세포를 원심분리기를 이용하여 수확한 후 0.5 ㎖의 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂ 및 10㎕ RNase A(80 ㎍/㎖, Sigma, 미국))에 재부유한 후 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI) 50 ㎍/㎖의 농축액 25 ㎕를 넣어 상온에서 30분간 암실에서 교반하였다. 그 후, FACS Calibur로 DNA가 PI로 염색된 세포를 분석하여, 세포 분열 주기를 확인하였다.

6. TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석

GFP 또는 GFP-DME를 HEK-293T에 형질전환한 후 48시간째에 세포를 수확하고, 수확한 세포를 차가운 70% 에탄올에 재부유(resuspension)하여 4℃에서 교반기에 하룻밤 동안 교반하여 고정시켰다. 고정한 세포를 원심분리기를 이용하여 수확한 후 0.1 ㎖의 완충액(5x 반응 완충액, 25 mM CoCl₂, 0.02 mM BrdUTP, TdT 효소(400 Unit))에 재부유한 후 37℃의 습도가 높은 곳에서, 매 15분 마다 약하게 흔들어주며, 총 한 시간 동안 반응시켰다.

세포를 PBS 완충액로 세척한 후 BrdUTP alexa 594-접합 항체(Life Technologies)를 1:50의 비율로 완충액(PBS 중 5%(w/v) BSA, 0.3%(v/v) Triton X-100)에 희석하여 빛이 차단된 상온에서 30분간 반응시키고, 반응 후 RNase를 첨가하고 30분간 같은 조건에서 추가 반응시켰다. 그 후, PBS 완충액로 세척하고 FACS Calibur로 분석하였다.

7. 면역블로팅

세포를 세포 용해 완충액(50 mM Tis-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40 및, 프로테아제 저해제 칵테일 정제(Roche, 스위스))에서 용해시켜 총 단백질을 수득하였다. 수득된 총 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드에 전기영동하고 면역블로팅을 수행하였다. 면역블로팅에 사용된 1차 항체는 항-IFNβ 항체(Abcam) 및 항-β-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하였다.

실시예 1. 식물의 DNA 탈메틸 효소 DME를 동물세포 HEK-293T에 발현시킨 후 5-메틸시토신의 제거 확인

GFP-DME를 pCDNA3.1 벡터에 클로닝하여 동물세포에 형질전환 할 수 있도록 준비하였고, 대조군으로 사용할 GFP도 pCDNA3.1 벡터에 클로닝한 후, 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK-293T 세포에 형질전환하였다. GFP 및 GFP-DME의 동물세포 내에서 발현유무, 및 GFP-DME의 세포 내 위치를 확인하기 위해서 공초점 레이저 현미경을 이용하여 형질전환된 세포를 관찰하였다. 형질전환된 동물세포에서 식물 유래 DME의 발현 및 DNA 탈메틸화 활성을 시험관 내 실험 분석 결과를 각각 도 1b 및 도 1c에 나타내었다. 도 1b에서 초록색은 GFP 또는 GFP-DME를 나타내고 파란색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색된 핵을 나타낸다. 도 1c에서 "S"는 기질을 나타내고, "P"는 절단된 5-메틸시토신 산물을 나타낸다.

도 1b에 나타난 바와 같이, GFP 및 GFP-DME가 동물세포에서 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. GFP는 세포질 전체에 걸쳐 고르게 위치하였고, GFP-DME는 동물세포의 핵 내에 위치하고 하였다. 따라서, 식물의 탈메틸 효소 DME가 동물세포의 핵에서 발현하는 것을 확인하였다.

또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 형질전환된 세포의 전세포 추출액을 이용한 방사성 동위원소로 표지된 올리고뉴클레오타이드의 5-메틸시토신 제거능을 분석한 결과, 동물세포에 발현된 GFP-DME가 5-메틸시토신을 효과적으로 제거하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. DME의 발현에 의한 세포의 변화

DME 유전자는 식물에만 존재하는 유전자로 동물에는 존재하지 않는 유전자이다. 외부 유전자가 유입되어 세포 내에 변화가 생길 것으로 예측되어, 형질전환된 동물세포의 세포 증식과 분열 양상을 분석하였다.

DME가 발현되는 세포의 배양 시간별 세포 수를 도 2a에 나타내었다. DMEΔ K1286Q는 DME의 촉매 돌연변이로 탈메틸화 기능이 없다. 도 2a에 나타난 바와 같이, GFP가 형질전환된 세포는 배양 시간에 비례하여 세포의 수가 증가하여, 정상적인 증식이 이루어지는 것을 확인할 수 있는데 반해, GFP-DME가 형질전환된 세포는 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 정상적인 5-메틸시토신 제거 기능이 없는 DME의 촉매돌연변이인 DME K1286Q는 GFP가 형질전환된 세포와 유사하게, 배양 시간에 비례하여 세포 수가 증가되는 경향을 보여주어, 정상적인 기능을 가진 DME의 형질전환으로 인해 세포 증식이 억제되고 있는 것을 알 수 있었다.

또한, DNA 메틸화 효소의 기능을 억제하는 5-아자시티딘을 처리했을 경우의 세포 증식 양상을 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 5-아자시티딘을 처리함으로 인해 세포의 증식이 GFP-DME가 발현되는 세포에서 더 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

세포의 분열주기를 분석하고 그 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, GFP가 발현된 세포는 정상적인 분열이 이루어지는 것을 확인할 수 있었으나(왼쪽 그래프), GFP-DME가 발현되는 세포는 세포분열 주기 중 DNA가 복제되는 S 주기에서 분열이 늦어지고 있는 것을 알 수 있었다(오른쪽 그래프).

실시예 3. DNA 탈메틸화에 의한 DNA 손상

식물 유래 DME는 5-메틸시토신을 직접적으로 인지하여 제거한다. 또한 과도한 5-메틸시토신 제거로 인해 DNA에 손상이 발생할 수 있으므로, DME로 형질전환된 세포에서 손상된 DNA를 확인하기 위해 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석을 수행하였다. 과도한 DNA 탈메틸화에 의한 DNA 손상을 항원-항체 반응을 통하여 공초점 레이저현미경 분석 및 유세포 분석으로 확인하고, 그 결과를 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다(도 3a에서 막대 눈금: 10 ㎛). 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, DME가 발현되는 세포에서 약 3배 정도 많은 DNA가 손상된 것을 알 수 있었다.

실시예 4. DNA 탈메틸화에 의한 유전자 발현변화

식물 유래 DNA 탈메틸 효소는 DNA의 5-메틸시토신을 제거하여 유전자의 발현을 유도한다. 이에, DME로 형질전환된 세포에서 유전자의 발현 양상의 변화를 분석하였다. 분석은 Affymatrix사의 Human Genome U133 Plus 2.0 Array Platform을 이용하였다. DME가 발현되는 세포에서 발현이 변하는 유전자의 목록을 하기 표 1에 나타내었다.

실시예 5. 항바이러스 기능을 하는 인터페론 관련 유전자의 증가

DME에 의한 유전자 발현 변화를 분석한 결과, DME를 발현하는 세포에서 항 바이러스 기능을 하는 인터페론(interferon: IFN) 관련 유전자의 발현이 증가되는 것을 알 수 있었다(표 1). 상기 결과를 토대로, 주요 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해 실시간 유전자 증폭을 수행하였다. 인터페론 유전자(interferon stimulated gene; ISG)의 발현 배수, 세포 분열에 관여하는 유전자의 발현 배수, 및 열 충격 단백질 유전자의 발현 배수를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다(대응표본(paired-sample) t 검정법으로 분석함, *: p<0.05, **: p<0.005).

도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, DME의 발현에 의해, 인터페론 관련 유전자, 세포 주기 관련 유전자 및 분자 샤페론인 열 충격 단백질(heat shock protein)의 발현이 증가된 것을 알 수 있었다. 특히, IFIT는 바이러스 감염시 높게 상향 조절되는 단백질로서, 바이러스성 RNA에 직접 결합하여 바이러스성 RNA의 번역을 억제하는 단백질로 알려져 있다. 도 4a에 나타난 바와 같이, GFP-DMEΔ가 형질전환된 HEK-293T에서 여러 종류의 IFIT가 유의하게 상향조절되어, DME의 발현에 의한 항바이러스 반응이 유도될 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 6. DME의 발현에 의한 항바이러스 반응의 유도

IFN은 감염된 세포로부터 분비되는 세포신호 단백질로서, 세포의 선천성(intrinsic) 항미생물 상태를 유도한다. DME에 의해 인터페론 관련 유전자의 발현이 증가되었기 때문에, DMEΔ가 형질전환된 HEK-293T 세포에서 IFNβ의 발현에 변화가 있는지 확인하였다. GFP 또는 GFP-DMEΔ의 형질전환 후 24 시간 및 48시간에 단백질 발현 양상을 면역블로팅으로 확인하였다. 면역블로팅 이미지 및 밴드 강도를 분석하여 발현 변화 배수를 나타낸 그래프를 도 5에 나타내었다(*: p<0.05).

도 5에 나타난 바와 같이, GFP-DMEΔ가 형질전환된 HEK-293T는 약 48시간 후 높은 수준의 IFNβ를 생성하였다. IFNβ는 선천성 면역 반응에 관련된 항바이러스 활성을 갖는 단백질이므로, 동물세포에서 DME의 발현을 유도함으로써 항바이러스 반응을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 아울러, 도 2c에 나타난 바와 같이 DME의 발현에 의해 세포 증식이 억제되므로, 세포 분열 없이도 IFNβ의 발현 증가에 의해 빠른 시간 내에 항바이러스 반응을 유도할 수 있다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Composition for increasing expression level of interferon in animal cell using plant DNA demethylase, antiviral composition, and method using the same <130> PN119109KR <150> KR 10-2017-0096227 <151> 2017-07-28 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1729 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEMETER protein [Arabidopsis thaliana] <400> 1 Met Gln Ser Ile Met Asp Ser Ser Ala Val Asn Ala Thr Glu Ala Thr 1 5 10 15 Glu Gln Asn Asp Gly Ser Arg Gln Asp Val Leu Glu Phe Asp Leu Asn 20 25 30 Lys Thr Pro Gln Gln Lys Pro Ser Lys Arg Lys Arg Lys Phe Met Pro 35 40 45 Lys Val Val Val Glu Gly Lys Pro Lys Arg Lys Pro Arg Lys Pro Ala 50 55 60 Glu Leu Pro Lys Val Val Val Glu Gly Lys Pro Lys Arg Lys Pro Arg 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Gln Glu Lys Val Lys Ser Lys Glu Thr Gly Ser Ala 85 90 95 Lys Lys Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ala Thr Lys Lys Pro Ala Asn Val 100 105 110 Gly Asp Met Ser Asn Lys Ser Pro Glu Val Thr Leu Lys Ser Cys Arg 115 120 125 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Gly Gly Gln Gln His Gly Leu Leu Ile Lys Asn Gln Gln Pro Gly Ser 340 345 350 Leu Ile Arg Gly Gln Gln Pro Cys Val Pro Leu Ile Asp Gln Gln Pro 355 360 365 Ala Thr Pro Lys Gly Phe Thr His Leu Asn Gln Met Val Ala Thr Ser 370 375 380 Met Ser Ser Pro Gly Leu Arg Pro His Ser Gln Ser Gln Val Pro Thr 385 390 395 400 Thr Tyr Leu His Val Glu Ser Val Ser Arg Ile Leu Asn Gly Thr Thr 405 410 415 Gly Thr Cys Gln Arg Ser Arg Ala Pro Ala Tyr Asp Ser Leu Gln Gln 420 425 430 Asp Ile His Gln Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Ser His Glu Ile Ser Asn 435 440 445 Gly Asn Gly Cys Lys Lys Ala Leu Pro Gln Asn Ser Ser Leu Pro Thr 450 455 460 Pro Ile Met Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg Gly Ser Lys Arg Gln Tyr 465 470 475 480 His Arg Ala Met Gly Gln Thr Glu Lys His Asp Leu Asn Leu Ala Gln 485 490 495 Gln Ile Ala Gln Ser Gln Asp Val Glu Arg His Asn Ser Ser Thr Cys 500 505 510 Val Glu Tyr Leu Asp Ala Ala Lys Lys Thr Lys Ile Gln Lys Val Val 515 520 525 Gln Glu Asn Leu His Gly Met Pro Pro Glu Val Ile Glu Ile Glu Asp 530 535 540 Asp Pro Thr Asp Gly Ala Arg Lys Gly Lys Asn Thr Ala Ser Ile Ser 545 550 555 560 Lys Gly Ala Ser Lys Gly Asn Ser Ser Pro Val Lys Lys Thr Ala Glu 565 570 575 Lys Glu Lys Cys Ile Val Pro Lys Thr Pro Ala Lys Lys Gly Arg Ala 580 585 590 Gly Arg Lys Lys Ser Val Pro Pro Pro Ala His Ala Ser Glu Ile Gln 595 600 605 Leu Trp Gln Pro Thr Pro Pro Lys Thr Pro Leu Ser Arg Ser Lys Pro 610 615 620 Lys Gly Lys Gly Arg Lys Ser Ile Gln Asp Ser Gly Lys Ala Arg Gly 625 630 635 640 Pro Ser Gly Glu Leu Leu Cys Gln Asp Ser Ile Ala Glu Ile Ile Tyr 645 650 655 Arg Met Gln Asn Leu Tyr Leu Gly Asp Lys Glu Arg Glu Gln Glu Gln 660 665 670 Asn Ala Met Val Leu Tyr Lys Gly Asp Gly Ala Leu Val Pro Tyr Glu 675 680 685 Ser Lys Lys Arg Lys Pro Arg Pro Lys Val Asp Ile Asp Asp Glu Thr 690 695 700 Thr Arg Ile Trp Asn Leu Leu Met Gly Lys Gly Asp Glu Lys Glu Gly 705 710 715 720 Asp Glu Glu Lys Asp Lys Lys Lys Glu Lys Trp Trp Glu Glu Glu Arg 725 730 735 Arg Val Phe Arg Gly Arg Ala Asp Ser Phe Ile Ala Arg Met His Leu 740 745 750 Val Gln Gly Asp Arg Arg Phe Ser Pro Trp Lys Gly Ser Val Val Asp 755 760 765 Ser Val Ile Gly Val Phe Leu Thr Gln Asn Val Ser Asp His Leu Ser 770 775 780 Ser Ser Ala Phe Met Ser Leu Ala Ala Arg Phe Pro Pro Lys Leu Ser 785 790 795 800 Ser Ser Arg Glu Asp Glu Arg Asn Val Arg Ser Val Val Val Glu Asp 805 810 815 Pro Glu Gly Cys Ile Leu Asn Leu Asn Glu Ile Pro Ser Trp Gln Glu 820 825 830 Lys Val Gln His Pro Ser Asp Met Glu Val Ser Gly Val Asp Ser Gly 835 840 845 Ser Lys Glu Gln Leu Arg Asp Cys Ser Asn Ser Gly Ile Glu Arg Phe 850 855 860 Asn Phe Leu Glu Lys Ser Ile Gln Asn Leu Glu Glu Glu Val Leu Ser 865 870 875 880 Ser Gln Asp Ser Phe Asp Pro Ala Ile Phe Gln Ser Cys Gly Arg Val 885 890 895 Gly Ser Cys Ser Cys Ser Lys Ser Asp Ala Glu Phe Pro Thr Thr Arg 900 905 910 Cys Glu Thr Lys Thr Val Ser Gly Thr Ser Gln Ser Val Gln Thr Gly 915 920 925 Ser Pro Asn Leu Ser Asp Glu Ile Cys Leu Gln Gly Asn Glu Arg Pro 930 935 940 His Leu Tyr Glu Gly Ser Gly Asp Val Gln Lys Gln Glu Thr Thr Asn 945 950 955 960 Val 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Glu Tyr Lys 1155 1160 1165 Glu Thr Asn Ala Thr Ile Leu Arg Glu Met Lys Gly Thr Leu Ala Asp 1170 1175 1180 Gly Lys Lys Pro Thr Ser Gln Trp Asp Ser Leu Arg Lys Asp Val Glu 1185 1190 1195 1200 Gly Asn Glu Gly Arg Gln Glu Arg Asn Lys Asn Asn Met Asp Ser Ile 1205 1210 1215 Asp Tyr Glu Ala Ile Arg Arg Ala Ser Ile Ser Glu Ile Ser Glu Ala 1220 1225 1230 Ile Lys Glu Arg Gly Met Asn Asn Met Leu Ala Val Arg Ile Lys Asp 1235 1240 1245 Phe Leu Glu Arg Ile Val Lys Asp His Gly Gly Ile Asp Leu Glu Trp 1250 1255 1260 Leu Arg Glu Ser Pro Pro Asp Lys Ala Lys Asp Tyr Leu Leu Ser Ile 1265 1270 1275 1280 Arg Gly Leu Gly Leu Lys Ser Val Glu Cys Val Arg Leu Leu Thr Leu 1285 1290 1295 His Asn Leu Ala Phe Pro Val Asp Thr Asn Val Gly Arg Ile Ala Val 1300 1305 1310 Arg Met Gly Trp Val Pro Leu Gln Pro Leu Pro Glu Ser Leu Gln Leu 1315 1320 1325 His Leu Leu Glu Leu Tyr Pro Val Leu Glu Ser Ile Gln Lys Phe Leu 1330 1335 1340 Trp Pro Arg Leu Cys Lys Leu Asp Gln Arg Thr Leu Tyr Glu Leu His 1345 1350 1355 1360 Tyr Gln 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Gly Leu Gly Leu Lys Ser Val Glu Cys Val Arg Leu Leu Thr Leu 225 230 235 240 His Asn Leu Ala Phe Pro Val Asp Thr Asn Val Gly Arg Ile Ala Val 245 250 255 Arg Met Gly Trp Val Pro Leu Gln Pro Leu Pro Glu Ser Leu Gln Leu 260 265 270 His Leu Leu Glu Leu Tyr Pro Val Leu Glu Ser Ile Gln Lys Phe Leu 275 280 285 Trp Pro Arg Leu Cys Lys Leu Asp Gln Arg Thr Leu Tyr Glu Leu His 290 295 300 Tyr Gln Leu Ile Thr Phe Gly Lys Val Phe Cys Thr Lys Ser Arg Pro 305 310 315 320 Asn Cys Asn Ala Cys Pro Met Arg Gly Glu Cys Arg His Phe Ala Ser 325 330 335 Ala Tyr Ala Ser Ala Arg Leu Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Arg Ser 340 345 350 Leu Thr Ser Ala Thr Ile Pro Val Pro Pro Glu Ser Phe Pro Pro Val 355 360 365 Ala Ile Pro Met Ile Glu Leu Pro Leu Pro Leu Glu Lys Ser Leu Ala 370 375 380 Ser Gly Ala Pro Ser Asn Arg Glu Asn Cys Glu Pro Ile Ile Glu Glu 385 390 395 400 Pro Ala Ser Pro Gly Gln Glu Cys Thr Glu Ile Thr Glu Ser Asp Ile 405 410 415 Glu Asp Ala Tyr Tyr Asn Glu Asp Pro Asp Glu Ile Pro Thr Ile Lys 420 425 430 Leu Asn Ile Glu Gln Phe Gly Met Thr Leu Arg Glu His Met Glu Arg 435 440 445 Asn Met Glu Leu Gln Glu Gly Asp Met Ser Lys Ala Leu Val Ala Leu 450 455 460 His Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro Thr Pro Lys Leu Lys Asn Ile Ser 465 470 475 480 Arg Leu Arg Thr Glu His Gln Val Tyr Glu Leu Pro Asp Ser His Arg 485 490 495 Leu Leu Asp Gly Met Asp Lys Arg Glu Pro Asp Asp Pro Ser Pro Tyr 500 505 510 Leu Leu Ala Ile Trp Thr Pro Gly Glu Thr Ala Asn Ser Ala Gln Pro 515 520 525 Pro Glu Gln Lys Cys Gly Gly Lys Ala Ser Gly Lys Met Cys Phe Asp 530 535 540 Glu Thr Cys Ser Glu Cys Asn Ser Leu Arg Glu Ala Asn Ser Gln Thr 545 550 555 560 Val Arg Gly Thr Leu Leu Ile Pro Cys Arg Thr Ala Met Arg Gly Ser 565 570 575 Phe Pro Leu Asn Gly Thr Tyr Phe Gln Val Asn Glu Leu Phe Ala Asp 580 585 590 His Glu Ser Ser Leu Lys Pro Ile Asp Val Pro Arg Asp Trp Ile Trp 595 600 605 Asp Leu Pro Arg Arg Thr Val Tyr Phe Gly Thr Ser Val Thr Ser Ile 610 615 620 Phe Arg Gly Leu Ser Thr Glu Gln Ile Gln Phe Cys Phe Trp Lys Gly 625 630 635 640 Phe Val Cys Val Arg Gly Phe Glu Gln Lys Thr Arg Ala Pro Arg Pro 645 650 655 Leu Met Ala Arg Leu His Phe Pro Ala Ser Lys Leu Lys Asn Asn Lys 660 665 670 Thr <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization signal <400> 3 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Val Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 4 Ala Gly Ser Ser Gly Asn Gly Ser Ser Gly Asn Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35 mer oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18) <223> m5c <400> 5 ctatacctcc tcaactccgg tcaccgtctc cggcg 35

Claims

식물 유래 DNA 탈메틸화효소 DEMETER(DME) 또는 이의 변이체, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 식물 유래 DNA 탈메틸화효소는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래 DNA 탈메틸화효소인 것인 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 DEMETER 변이체는 서열번호 1의 DME의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1 내지 677번째 아미노산 서열이 결실(deletion)된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 DEMETER 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 DEMETER 또는 이의 변이체는 DNA로부터 메틸화된 시토신을 절제하는 탈메틸화효소인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 동물 세포는 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 고양이, 또는 마우스로부터 유래된 세포인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 인터페론은 인터페론-알파(interferon alpha: IFNα), 인터페론-베타(interferon beta: IFNβ), 인터페론-감마(interferon gamma: IFNγ), 인터페론-카파(interferon kappa: IFN-κ), 인터페론-델타(interferon delta: IFN-δ), 인터페론-엡실론(interferon epsilon: IFN-ε), 인터페론-타우(interferon tau: IFN-τ), 인터페론-오메가(interferon omega: IFN-ω), 및 인터페론-제타(interferon zeta: IFN-ζ)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo), 또는 생체 외(ex vivo) 투여용인 것인 조성물.
식물 유래 DNA 탈메틸화효소 DEMETER 또는 이의 변이체, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동물 세포에서의 항바이러스용 조성물.
식물 유래 DNA 탈메틸화효소 DEMETER 또는 이의 변이체, 또는 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키기 위한 키트.
식물 유래 DNA 탈메틸화효소 DEMETER 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 동물 세포를 인큐베이션시켜 상기 폴리뉴클레오티드를 동물 세포에 도입하는 단계를 포함하는,
동물 세포에서 인터페론의 발현 수준을 증가시키는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 방법은 동물 세포의 DNA를 탈메틸화시킴으로써 인터페론 유전자의 발현을 유도하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 방법은 항-바이러스 반응을 유도하는 것인 방법.