SI21080A - Novi interferon za zdravljenje multiple skleroze - Google Patents

Abstract

Izum se nanaša na nova zaporedja nukleinskih kislin in polipeptidov, ki kodirajo za interferon-beta-2 ("IFN-beta2"). Farmacevtski pripravek, ki vsebuje farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in terapevtsko učinkovito količino humanega polipeptida IFN-beta2, njegov biološko aktivni delec ali njegov biološko aktivni derivat, je koristen pri zdravljenju multiple skleroze pri ljudeh.ŕ

Description

NOVI INTERFERON ZA ZDRAVLJENJE MULTIPLE SKLEROZE

OZADJE IZUMA

Interferoni so medcelični signalni proteini, ki igrajo pomembno vlogo pri raznih bioloških procesih, ki vključujejo npr. proliferacijo celic in imunski odziv.

KRATEK OPIS SLIK

Sl. 1 kaže zaporedje nukleotidov humanega interferona beta 2, vključno z zaporedjema 5' In 3'.

Sl. 2 kaže zaporedje aminokislin humanega interferona beta 2. Prikazana je translacija odprtega bralnega okvira za IFN-P2. Signalno zaporedje je prikazano v ležečem tisku, dve potencialni mesti N-glikosilacije in cisteini, sposobni tvorbe disulfidne vezi, so prikazani podčrtano in z odebeljenim tiskom.

Sl. 3 kaže tridimenzionalne strukture interferonov tipa I. Vsi trije IFN-ji imajo skupno 5vijačno snopno motivno (angl. motif) značilnost humanih IFN-jev tipa I. Poleg tega sta si IFN-βΙό in IFN-βζ podobna na položaju njunih potencialnih glikosilacijskih mest in predlaganih disulfidnih vezi. Zaporedje enojnih C-končnih aminokislin je prisotno samo v IFN-βΖ.

Sl. 4 kaže poravnavo proteinov, kjer se primerja humani interferon beta 2 z drugimi tipi interferonov.

Sl. 5 je filogenetska primerjava IFN-p2-ja s humanimi interferoni tipa I in tipa II. Na osnovi vzorca cisteinske konzervacije, potencialnih mest N-glikosilacije in filogenetske analize je IFN-P2 tesneje povezan z IFN-β kot s katerimikoli drugimi interferoni.

Sl. 6 kaže poročevalni poskus od IFN odvisne ISRE-luciferaze tipa I za humani interferon beta 2.

Sl. 7 kaže rezultate inhibicije vezave IFN-p2-ja na humani receptor interferona tipa I z anti-IFN-32 poliklonskim protitelesom.

Sl. 8 (A in B) kaže učinek interferonov na proliferacijo celic.

Sl. 9 kaže antiproliferativne dejavnosti IFN-p2-ja na humane celice.

Sl. 10 kaže protivirozno aktivnost interferonov na humane celice.

Sl. 11 kaže tekmovanje med IFN-a2 in IFN-βζ za vezavo na receptor interferona tipa I.

Sl. 12 ie 5' zaporedje genomskih nukleotidov humanega IFN-B2-ia.

Sl. 13 je zaporedje nukleotidov, ki kodira za območje 5' humanega IFN-p2-ja.

Sl. 14 ie zaporedje 5' oolipeptidov humanega IFN-P2-ja.

Sl. 15 kaže antiproliferacijo humanih fetalnih astrocitov v odgovoru na IFN-p2. (A) je fetalna možganska kultura 1 brez stimulacije in (B) je fetalna možganska kultura 1 z EGF stimulacijo; (C) je fetalna možganska kultura 2 brez stimulacije in (D) je fetalna možganska kultura 2 z EGF stimulacijo.

OPIS IZUMA

Identificirali smo nove nukleinske kisline, zaporedja polipeptidov in njihove regulatorje nukleinskih kislin, ki kodirajo za interferon beta 2 (IFN-p2). ki ie razred medceličnih signalnih polipeptidov, ki izvajajo obilico bioloških učinkov, med drugim npr. protitumorsko delovanje, protivirozno delovanje, imunoregulatorno delovanje. Glei npr. Cirelli and Tyring, Ciin. Immunother. 3, 27-87, 1995. Interferonski polipeptid tega izuma, njegovi delci in derivati imaio eno ali več naslednjih bioloških aktivnosti, vključno z bioaktivnostjo IFN-p2-ja in specifično imunogensko aktivnostjo IFN-p2-ja, a ne omejeno samo na te.

Bioaktivnost IFN-p2-ja pomeni, npr. funkcionalne učinke, kot so spremembe v celičnih membranah, antionkoaena regulacija, protitumorska aktivnost, protivirusna aktivnost, inhibicija rasti celic ali protirastna aktivnost, antiproliferacija, povečanje citotoksičnosti limfocitov, imunoregulatorna aktivnost, induciranje ali inhibicija razlikovanja tarčnih celic, aktivacija makrofagov, navzdolnja regulacija onkogenov, itd; imunološke učinke, kot so zmanjšanje tvorbe protiteles, povečanje komponent celične membrane (kompleks hude histokompatibilnosti, receptor Fc, mikroglobulin β2), moduliranje celično posredovane imunosti, povečanje proizvodnje citokina (npr. interlevkin), povečanje citotoksičnih učinkov T-celic, povečanje učinkov makrofagov ter povečanje naravnega ubijanja; vezavna aktivnost receptorja interferona, kot ie vezava na interferon receptorja tipa I, zlasti njegove IFNAR2c verige in celični učinki, ki jih stimulira taka vezava receptorja; aktivacija in/ali povezava z medceličnimi signalnimi molekulami, kot so Jaki, Tvk2. Stati, Stat2, IRS-1, IRS-2, CrkL, Crkli, Vav, itd. ter drugi navzdoljni efektorji (npr. MAPK). Glej, npr. Plataniasand Fish, Exp. Hematology, 27:1583-1592, 1999.

Z izrazom antiDroliferaciiska aktivnost mislimo, da IFN-O2 do tem izumu inhibira rast celic ali inducira apoptozo. To je prikazano v spodnjih primerih. Glej tudi slike 8, 9 in 15. Na Drimer: IFN-βΣ inhibira proliferaciio astrocitov v možganih. Ta aktivnost ie uDorabna npr. pri zdravljenju multiple skleroze, saj lahko proliferacija astrocitov vodi do vnetja nevronov, značilnega za to bolezen. Z inhibiraniem rasti astrocitov IFN-B2 zmanjšuje vnetje in izboljša bolezen. Tako se pričujoči izum nanaša na postopke za zdravljenje multiDle skleroze, ki vsebujejo dajanje takih količin IFN-p2-ia. ki so učinkovite za inhibiranje proliferacije astrocitov in/ali zmanjšanje vnetja.

Za IFN-B2 specifična imunoaenska aktivnost pomeni, npr. da polipeptid IFN-B2 izvabi imunološki odgovor, ki je selektiven ali prednosten za IFN-p2, npr. imunološki odgovor, ki ie selektiven za IFN-B2 sesalcev. Torej je stimulacija protiteles, T-celic, makrofagov, B-celic, dendritskih celic, itd., z zaporedjem aminokislin, izbranih iz sesalskih IFN-p2ip\/ nnr IFN-R?-ia na «I ? snarifična imi innn^notcka aktivnost Ta nrlnnvnra lahko

J ^— ‘ , J - > - - .....— - - - - - - _ _ — - - _ - _ merimo rutinsko.

IFN-P2 ie sesalski polipeptid s polno dolžino, ki ima zaporedje aminokislin, ki ga dobimo iz naravnega vira, in ki ima eno ali več zgoraj omenjenih bioaktivnosti. Lahko ima zaporedje, prikazano na sl. 2. z odprtim bralnim okvirom, ki se začne s startnim kodonom in konča s stop kodonom. Vključuje naravno pojavljajoča se normalna, naravno pojavljajoča se mutantna in naravno pojavljajoča se polimorfna zaporedja, vključno polimorfizme z enim nukleotidom (single nucleotide polymorphism - SNP), itd. Naravni viri vključujejo, npr. žive celice, npr. dobljene iz tkiv ali celotnih organizmov, gojenih celičnih linij, vključno primarnih in imortaliziranih celičnih linij, z biopsijo odvzetih tkiv. itd.

Ta izum se nanaša tudi na delce sesalskega IFN-p2-ja. Delci so prednostno biološko aktivni. Z biološko aktivni mislimo, da ie polipeptidni delec aktiven v živem sistemu ali ima komponente živega sistema. Biološke aktivnosti vključujejo tiste, ki smo jih omenili, npr. bioaktivnost IFN-B2-ia in IFN-B2-specifična imunogenska aktivnost. Delce lahko pripravimo po katerikoli želeni metodi, vključno s kemični sintezo, genetskim inženiringom, produkti cepitve, itd. Biološko aktivni delec IFN-B2-ia vključuje polipeptide, ki smo jim bili odstranili zaporedja aminokislin ali smo jih modificirali bodisi na karboksilnem koncu ali amino koncu proteina.

Prednostno so nukleinske kisline in njihovi delci na slikah 12 in 13 izključeni. Prednostno so polipeptidi in njihovi delci na sliki 14 izključeni. Vendar polipeptidi, ki vsebujejo ali obsegajo ta zaporedja, niso izključeni, npr. IFN-B2 s polno dolžino, polipeptid, ki ima dva ali več teh omenjenih delcev, ali polipeptid, ki ima enega omenjenih ΗθΙπθν in HnHatna zannrAdja aminokislin, hnHi?i iz IFN-RO-ja O.!i !Z drugega vira.

Ta izum se tudi nanaša na IFN-B2. ki ima izpeljano zaporedje aminokislin 1 do 208. kot kaže slika 2. Njegova izračunana molekulska masa je okoli 23.000 daltonov in pričakovana izoelektrična točka je 8,1. Je kislinsko stabilen protein, ki ima mulekulsko maso okrog 26.000 daltonov, kot smo jo izmerili s SDS-PAGE. Neglikosilirana oblika proizvedena v E. coli ima molekulsko maso okrog 20.500 daltonov. Glej primere spodaj. Kot kaže slika 2, ima pričakovano signalno zaporedje od aminokisline -1 do -21, dve potencialni mesti N-glikosilacije pri aminoksilinah 74-77 in 83-86 in cisteinske ostanke pri 32, 142 in 154. Disulfidna vez naj bi se tvorila med cisteinskima ostankoma 32 in 142. Obsega vijačnico A na položajih aminokislin 7-24, vijačnico B na 55-69. vijačnico C na 83-95, vijačnico D na 118-134 in vijačnico E na 143-158.

Zreli IFN-B2 se nanaša na IFN-B2. ki nima aminokislin od -1 do -21. kot je prikazano na sl. 2, in ima v dolžino 187 aminokislin. Ima tudi edinstveno ekstenzijo 18 aminokislin na karboksilnem koncu, če ga primerjamo z drugimi znanimi tipi interferonov. Taka ekstenzija se lahko uporablja kot označevalec za IFN-32, tako na nukleotidnem kot na aminokislinskem nivoju in io lahko pripojimo heterolognim polipeptidom.

Polipeptid IFN-βζ po izumu, ki ima npr. zaporedje aminokislin, prikazano na sl. 2, lahko analiziramo s katerimikoli ustreznimi postopki, da identificiramo druge strukturne in/ali funkcionalne domene v polipeptidu, vključno z območji raztezanja membrane, hidrofobnimi območji. Na primer: polipeptid IFN-B2 lahko analiziramo s postopki, opisanimi npr. v Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105, 1982; EMBL Protein Predict; Rostand Sander, Proteins. 19:55-72, 1994.

Druge homologe IFN-B2-jev tega izuma lahko dobimo iz sesalskih in nesesalskih virov po različnih postopkih. Na primer s hibridizacijo z oligonukleotidi (npr. začetni oligonukleotidi za pomnoževanje kodirnega območja -5'-ATG ATT ATC AAG CAC TTC I I I GGA-3' in 5-CTA CCT CGG GCT TCT AAA CTC TGT-3'). Začetni oligonukleotidi, ki se uporabljajo za izražanje v E. coli - 5'-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC

TAA-3' in 5'-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3'. Začetni oligonukleotidi za znano zaporedje s polno dolžino, ki vključuje 5' in 3' neprevejeno zaporedje genomov - 5'-TTT AGG TGA CAC TAT AGA AT-3' in 5-TAA AAT GGA TAG AAT ATA TAA-3' - se lahko uporabljajo za izbiranje homologov, kot je npr. opisano v Sambrook et al.. Molecular Cloning. 11. poglavje. 1989. Taki homologi imaio lahko različne stopnje identičnih ali podobnih zaporedij nukleotidov in aminokislin kot IFN-p2. Sesalski organizmi vključujejo npr. glodalca. miš. podgano, hrčka, polopico. opico, prašiča, kravo, konja, psa, mačko, itd. Nesesalski organizmi vključujejo npr. vretenčarje, nevretenčarje, cebrice. kokoši. Drosophila. C. elegans. Xenopus. kvasovke, kot so S. pombe, S. cerevisiae, gliste, prokarioti, rastline, Arabidopsis, Crustacea, artemie, virusi, itd. Za izbiro oligonukleotidov za hibridizacijo lahko uporabimo učinkovito metodo. IFNp2-specifična območja lahko npr. identificiramo tako, da primerjamo IFN-P2 po izumu z drugimi tipi IFN-82 in izberemo tista zaporedja aminokislin, ki se pojavljajo samo v prvem (se pravi nekonzerviranem ali specifičnem za IFN-p2-ju). Glej npr. sl. 4, ki kaže konzervirana in nekonzervirana območja med različnimi tipi interferona. Izberemo lahko nekonzervirana zaporedja aminokislin (npr. KSLSP) in oblikujemo na takih zaporedjih degenerirane vzorce. Glei tudi Venkataraman et al.. Proč. Natl. Acad. ScL 96:36583663, 1999. Druga specifična (se pravi nekonzervirana) in/ali konzervirana zaporedja aminokislin lahko najdemo rutinsko, npr. z iskanjem genske/proteinske podatkovne baze z uporabo računalniških programov BLAST.

Izum se nanaša tudi na IFN-B2-specifična zaporedja aminokislin, nor. definirano zaporedje aminokislin, ki ga najdemo v določenem zaporedju slik 2 in 4, vendar ne pri drugih vrstah interferonov. Prednostni polipeptidi imaio vsai okrog osem sosednjih aminokislin, npr. okrog 9, 10, 12, 15, 20, 21, 22, 25, 30, 40, 50, itd. Taki polipeptidi lahko obsegajo npr. KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRANI, AEKLSGT, CLFFVFS in QGRPLNDMKQELTTEFRSPR in njihove delce. IFN-p2-specifično zaporedje aminokislin ali motiv (angl. motit) lahko uporabljamo za proizvodnjo peptidov kot antigenov za generiranje imunskega odgovora, ki je zanj specifičen. Protitelesa dobljena s tako imunizacijo lahko uporabljamo kot specifičen vzorec za sesalski protein IFN-p2 v diagnostične ali raziskovalne namene, vključno kot ekspresijske označevalce. Kot smo že omenili, lahko oolioeptidi oo tem izumu obsegajo različna zaporedja aminokislin za IFN-βζ (npr. zaporedje s polno dolžino, se pravi tako, ki ima startni in stop kodon, kot je prikazano na sl. 1, zrelo zaporedje aminokislin (se pravi tako. kjer se polipeptid IFN-P2 producira kot prekurzor, ki ga predelamo v zreli polipeptid ali njegove delce). Uporabni delci vključujejo na primer delce, ki vsebujejo katerokoli zgorai omenjeno domeno ali so v bistvu sestavljeni iz njih ter specifična ali konzervirana zaporedja aminokislin, kot so prikazana na sl. 2 in 4.

Delec polipeptida IFN-32 po izumu lahko izberemo tako, da ima specifično biološko aktivnost, npr. protivirusno, imunomodulatorno, protirastno, itd. Merienie teh aktivnosti lahko opravimo po znanih postopkih. Glej spodaj. Te peptide lahko tudi identificiramo in jih pripravimo kot ie opisano v EP 496 162.

Identičnost zaporedja aminokislin polipeptida po tem izumu je lahko tudi 100%-na ali mani v primerjavi z zaporedjem aminokislin, predstavljenim na sl. 2. Za namene naslednje diskusije pomeni identičnost zaporedja to, da najdemo isti nukleotid ali aminokislino kot v zaporedju, predstavljenem na sl. 1 in 2. na ustreznem položaju primerjanega/-ih zaporedja/-ij. Polipeptid, katerega identičnost zaporedja aminokislin je mani kot 100%-na z zaporedji aminokislin, predstavljenimi na sl. 1 in 2, lahko vsebuje različne substitucije iz naravno pojavljajočega se zaporedja, vključno homologne in nehomologne substitucije aminokislin. Spodaj alej primere homologne substitucije aminokislin. Vsota identičnih in homolognih ostankov deljena s celotnim številom ostankov v zaporedju, na katerem primerjamo polipeptid IFN-B2, ie enaka odstotku podobnosti zaporedja. Zaradi izračuna identičnosti in podobnosti zaporedja lahko primerjana zaporedja poravnamo in izračunamo po katerikoli želeni metodi, algoritmu, računalniškem programu, itd., vključno npr. FASTA, BLASTA.

Polipeptid, katerega identičnost zaporedja aminokislin ie mani kot 100% v primerjavi z zaporedjem aminokislin na sl. 2, ima lahko okrog 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%. 70% ali pa celo samo 53% identičnosti zaporedja.

Ta izum se nanaša na polipeptidne muteine IFN-p2-ia. t.i. vsak polipeptid. ki ima zaporedje aminokislin, ki se razlikuje po zaporedju aminokislin od zaporedja aminokislin, ki ga dobimo iz naravnega vira (delec sesalskega IFN-P2-ja se ne razlikuje po zaporedju aminokislin od naravno pojavljajočega se IFN-p2-ja, čeprav se razlikuje v številu aminokislin). Tako polipeptidni muteini IFN-p2-ia vsebujejo aminokislinske substitucije, vstavitve in delecije, vključno z nenaravno pojavljajočimi se aminokislinami.

Muteine zaporedja aminokislin IFN-p2-ia po izumu lahko pripravimo na osnovi iskanja homologije iz genetskih podatkovnih bank, npr. Genbank, EMBL. Iskanje homologije zaporedij lahko dosežemo z različnimi postopki, vključno z algoritmi, opisanimi v družini računalniških programov BLAST, Smith-VVatermanovim algoritmom itd. Mutein(e) lahko uvedemo v zaporedje tako. da identificiramo in poravnamo aminokisline znotraj domene, ki je identična in/ali homologna med polipeptidi in potem modificiramo aminokislino na osnovi take poravnave. Na primer IFN-B2 po izumu ima identično zaporedje z različnimi znanimi interferoni, kot kaže sl. 4. S poravnavami med temi polipeptidi na konzerviranih ostankih aminokislin lahko identificiramo ostanke, katerih modifikacijo bi pričakovali, da bo zmanjšala, znižala ali odpravila biološko aktivnost IFNB2-ia, kot je receptor vezavne aktivnosti, itd. Na primer: kjer s poravnavo odkrijemo identične aminokisline, konzervirane med dvema ali več domenami, bi pričakovali, da bo eliminacija ali substitucija aminokisline) negativno vplivala na njeno biološko aktivnost.

Substitucijo aminokislin lahko opravimo tudi z zamenjavo ene homologne aminokisline z drugo. Homologne aminokisline lahko definiramo na osnovi velikosti stranske verige in stopnje polarizacije, ki vključuje majhne nepolarne: cistein, prolin, alanin, treonin; majhne polarne: serin, glicin, aspartat, asparagin; velike polarne: glutamat, glutamin, lizin, arginin: srednje polarne: tirozin, histidin, triptofan; velike nepolarne: fenilalanin. metionin, levcin, izolevcin, valin. Homologne kisline lahko združimo tudi v naslednje skupine: nenabite polarne R skupine, glicin, serin. treonin, cistein, tirozin, asparagin, glutamin; kislinske aminokisline (negativno nabite), asparaginska kislina in glutaminska kislina; bazične aminokisline (pozitivno nabite), lizin, arginin. histidin. Homologne aminokisline lahko vključujejo tudi tiste, ki jih je Dayhoff opisal v Atlas of Protein Seguence and Structure 5. 1978 in Argos v EMBO J., 8. 779-785, 1989.

Lahko pripravimo muteine, ki ne vplivajo na aktivnost, ali ki zmanjšajo ali povečajo aktivnost IFN-p2-ja v primerjavi z divjim tipom. Mutacije lahko opravimo po analogiji z drugimi IFN-p2-ji, kot so fibroblastni interferon (beta-1) in interferoni alfa. Na primer IFNβ2 razkriva po značilnosti pet vijačnih svežnjev, značilnih za interferon; vijačnica A na položajih aminokislin 7-24, vijačnica B na 55-69, vijačnica C na 83-95, vijačnica D na 118-134 in vijačnica E na 143-158. Te vijačnice so povezane z naključnimi klobčiči ali zankastimi območji. Glej sl. 3. Mutacije vijačnih struktur lahko opravimo po analogiji z IFN-βΙ (fibroblast), npr., kot je opisano v Runkel et ah, Biochemistry, 39:2538-2551,

2000. Na primer deli vijačnice A, zanka AB in vijačnica E so vključeno v vezavo receptorja. Glej tudi Pichler and Schreiber, J. Mol. Biol., 294:223-237, 1999.

IFN-B2 po izumu, kot ie fibroblastni interferon, ima tri cisteinske ostanke na položajih aminokislin 32, 142 in 154. Cisteinski ostanki na položajih 32 in 142 so podobni po lokaciji s cisteinskimi ostanki, za katere je znano, da tvorijo disulfidno vez v fibroblastnem interferonu. Po analogiji s fibroblastnim interferonom lahko aminokislino na Doložaiu 154 deletiramo ali substituiramo z nevtralno aminokislino, kot ie alicin. valin.

IZ Z W · ’ alanin, levcin, izolevcin, tirozin, fenilalanin, histidin, triptofan, serin, treonin ali metionin. Prednost imata serin in treonin zaradi njune kemijske podobnosti s cisteinom. Odstranitev cisteina brez para lahko prepreči tvorbo nepravilnih intramolekulskih in intermolekulskih disulfidnih vezi. Glei nor. U.S. Dat. št. 4.588.585. Mutacije lahko

Z » » · Z opravimo v skladu z U.S. pat. št. 4,914,033, 5,545,723 in 5,580,723. Glej tudi npr. Fish etal., J. Interferon Res., 12:257-66, 1992; Fish etal., J. Interferon Res., 9:97-114, 1989: DiMarco et al., J. Interferon Res., 13:139, 1993; Mitsui et al., Pharmacol. Therap., 58:93-132, 1993; Wang etal., J. Immunol., 152:705-715, 1994.

Izum se nanaša na muteinske nukleinske kisline, ki kodirajo za take muteinske polipeptide. Tako se ta izum nanaša na zaporedja nukleotidov s sl. 1, pri čemer omenjene nukleinske kisline kodirajo za polipeptid in eden ali več aminokislinskih položajev ie substituiranih ali deletiranih ali oboje in polipeptid, ki ga je kodirala nukleinska kislina, ima biološko aktivnost, kot je boljši izplen iz bakterijskih celic, kadar so rekombinantno izražene, ali boljša bioaktivnost. Polipeptidni mutein in njegovo ustrezno nukleotidno kodirno zaporedje ima lahko zaporedje aminokislin, predstavljeno na sl. 2, razen tam, kjer je eden ali več položajev substituiranih s homolognimi aminokislinami, npr., kjer je 1, 5, 10, 15 ali 20 substitucij. Kako modifikacija vpliva na omenjene aktivnosti lahko izmerimo po postopkih opisanih zgoraj, spodaj in kot jih poznajo strokovnjaki.

Poznani so različni postopki za preizkušanje aktivnosti IFN-p2-ja. Koristni poskusi npr. vključujejo: protivirusne poskuse, kot CPE (npr. U.S. pat št. 5,545,723 in 4,914,033; primeri spodaj); vezava receptorjev (npr. U.S. pat. št. 5,545,723 in primeri spodaj; aktivacija STAT (npr. primeri spodaj); aktivacija odzivnih genov IFN-p2-ja (npr. z interferonom stimulirani odzivni element - interferon-stimulated response element (ISRE), ki so operativno vezani s poročevalskim genom, kot je luciferaza, kot je prikazan v primerih spodaj); fosforilacija receptorja tipa I (primeri spodaj);

antiproliferativne (U.S. pat. št. 4.914.033. dosega zmožnosti IFN-B2-ia za inhibiranie replikacije celičnih linij; primeri spodaj); imunomodulatorno (U.S. pat. št. 4,914,033, od prititelesa odvisna celična citotoksičnost; Noronha et at., J. Neuroimmunol., 46:145-154, 1993, inhibiranje T-limfocitov in njihova proizvodnja IFN-gama (IFN-γ); eksperimentalni alergijski encefalomiolitis (EAE) (npr. Louboutin et ali, Acta Neurol. ScancL 88:97-99, 1993; Rottetal., Eur. J. Immunol., 23:1745-1751, 1993; primeri spodaj).

Sesalski IFN-B2 po izumu, delci ali njegovi substituirani polipeptidi lahko tudi vsebujejo različne modifikacije, pri čemer take modifikacije vsebujejo lipidno modifikacijo, metilacijo, fosforilacijo, alikosilaciio, kovalentne modifikacije (npr. skupine R aminokisline), aminokislinsko substitucijo, aminokislinsko delecijo ali aminokislinsko adiciio. Modifikacije polipeptida lahko opravimo po različnih metodah, vključno rekombinantnih, sintetičnih, kemijskih, itd.

Polipeptidi po izumu (npr. s polno dolžino, njihovi delci, njihove mutacije) se lahko uporabljajo na različne načine, npr. v poskusih, kot imunogeni za protitelesa, kot je opisano spodaj, kot biološko aktivna sredstva (npr. ki imajo eno ali več aktivnosti, povezanih z IFN-p2-jem po izumu).

Polipeptid, ki kodira za IFN-P2 po izumu, njegov derivat ali njegov delec, lahko kombiniramo z eno ali več strukturnimi domenami, funkcijskimi domenami, ugotovljivimi domenami, antigenskimi domenami in/ali želenim polipeptidom, ki nas zanima, v razporeditvi, ki se v naravi ne pojavlja, se pravi ni naravno pojavljajoč se. Polipeptid, ki vsebuje take lastnosti, ie himerični ali fuzijski polipeptid. Tak himerični polipeptid lahko pripravimo po različnih metodah, vključno kemijskih, sintetičnih, kvazi-sintetičnih in/ali rekombinantnih metodah. Himerična nukleinska kislina, ki kodira za himerični polipeptid, lahko vsebuje različne domene ali želene polipeptide v kontinuiranem (npr. z več Nterminalnimi domenami za stabiliziranje ali izboljšanje aktivnosti) ali prekinjenem odprtem bralnem okviru, npr. ki vsebuje introne, mesta delitve, ojačevalce, itd. Himerično nukleinsko kislino lahko proizvedemo po različnih metodah. Glej npr. U.S. pat. št. 5,439,819. Domena ali želeni polipeptid ima lahko kakršnokoli želeno lastnost, vključno biološko funkcijo, kot ie signaliziranje, promoviranje rasti, celično ciljanje (npr. signalno zaporedje, tarčno zaporedje, kot je ciljanje na endoplazmatski retikulum ali nukleus), itd., strukturno funkcijo kot ie hidrofobna, hidrofilna, membransko napenjalna, itd, receptorsko-ligandno funkcijo in/ali ugotovljive funkcije, npr. kombinirane z encimom, fluorescentnim polipeptidom, zelenim fluorescentnim proteinom, (Chalfie et

-1010 al.. Science. 263:802, 1994; Cheng et al.. Nature Biotechnologv, 14:606. 1996; Levv et al., Nature Biotechnology, 14:610, 1996), itd. Domena je lahko tudi imunoglobulin, npr. za jačanje stabilnosti, itd., kot je imunoglobulinska težka, lahka veriga in/ali Fc območje ali epitopno označevalno zaporedje.

Poleg tega se lahko polipeptid ali njegov del uporablja kot selektivni označevalec, kadar je uveden v gostiteljsko celico. Na primer nukleinsko kislino, ki kodira za zaporedje aminokislin po izumu, lahko spojimo znotraj okvira na želeno kodirno zaporedje in deluje kot oznaka za čiščenje, izbiro ali označevanje. Območje fuzije lahko kodira mesto cepitve za olajšanje ekspresije, izolacije, čiščenja, itd.

Polipeptid IFN-p2 po izumu ali njegov delec lahko kombiniramo tudi z drugimi citokini, kot so interferoni, da dobimo himerične ali hibridne IFN-p2-je. Taki hibridni IFN-B2-ji so lahko med katerimkoli razredom interferonov, vključno alfa, omega, gama, epsilon, trofoblast, fetalni, itd. Izdelamo lahko hibride (in muteine, kot je bilo opisano zgoraj), ki imajo zmanjšane ali omejene aktivnosti v primerjavi s hibridi, iz katerih so narejeni, npr. omejeni na regufatomo aktivnost rasti celic, protivirusno aktivnost ali imunomodulatorno aktivnost. Glej npr. U.S. pat. št. 4,758,428 za hibride med fibroblastnim interferonom in alfa interferonom, npr. ki uporabljajo okrog aminokislin 47-187, 74-187, 1-73, itd. fibroblastnega interferona.

PoliDeDtid oo izumu lahko izdelamo v eksDresiiskem sistemu, nor. in vivo. in vitro.

C * 1 · * ’ > <

brezcelično, rekombinantno, s celično fuzijo, itd. po izumu. Modifikacije na polipeptidu, ki jih povzročajo taki sistemi, vključujejo alikosilacijo, aminokislinsko substitucijo (npr. z razlikovanjem uporabe kodona), obdelavo polipeptida, kot je razkrajanje, cepitev, endopeptidazna ali eksopeptidazna aktivnost, pripajanje kemijskih delov, vključno lipidov in fosfatov, itd.

Polipeptid po izumu lahko dobimo iz naravnih virov, transformiranih gostiteljskih celic (gojišče ali celice) po običajnih postopkih, npr. postopkih, ki se uporabljajo na drugih interferonih in drugih rekombinantnih proteinih, vključno ekstrakcija detergenta (npr. neionskega detergenta, Tritono Χ-100, CHAPS, oktilglukozid, Igepal Ca-630), fazna ekstrakcija, n-butanol ekstrakcija, obarianie amonijevega sulfata ali etanola, kislinska ekstrakcija, anionsko- ali kationsko-izmenjevalna kromatografija, fosfocelulozna kromatoarafiia. SeDhadex. hidrofobna interakciiska kromatoarafiia. hidroksiDatitna ' » » J J ‘ s kromatografija, lecitinska kromatografija, gel elektroforeza, afinitetna kromatografija, SDS PAGE, kontrolirana porna steklena kromatografija (controlled pore glass

-1111 chromatographv - CPG)_; protitelesna afinitetna kromatografija, gel filtracija, modra sefaroza, fenil-agarozna kromatografija, CPG in cink-kelirna kromatografija (npr. Heine and Billiau, Methods in Enzymology. 78 (Del Α): 448-456, 1981), Cibacron Blue F3GAAgaroza in HPLC (Kenny et al., Methods in Enzymology, (Del Α): 435-447, 1981). Glej tudi Innis and McCormick, Methods in Enzymology, 119:397-403, 1986; Dembinski and Sulkowski, Preparative Biochemistry, 16:175-186, 1986; Friesen et al., Methods in Enzvmologv, 78 (Del Α): 4330-435, 1981); Pestka et al., Annu. Rev. Biochem., 56:72777, 1987. Po potrebi lahko pri končanju konfiguracije zrelega proteina uporabimo korake Donovneaa zlaaania.

I s/ o J

Ta izum se nanaša tudi na nukleinske kisline, kot so DNA-ji in RNA-ji, ki kodirajo za polipeptide IFN-P2, in njihove delce po izumu. Nukleinska kislina IFN-βΣ, ali nien delec, je nukleinska kislina, ki ima zaporedje nukleotidov, ki ga dobimo iz naravnega vira. Zato vključuje naravno pojavljajoče se, normalne, naravno pojavljajoče se mutantne in naravno pojavljajoče se polimorfne alele (npr. SNP-je), itd. Naravni viri vključujejo, npr. žive celice, dobliene iz tkiv in celih oraanizmov. tumorjev, aoienih celičnih linii. vkliučno primarnih in imortaliziranih celičnih linij.

Zaporedje nukleinske kisline po izumu lahko vsebuje popolno kodirno zaporedje, kot prikazuje sl. 1, njena degenerirana zaporedja in njene delce. Nukleinska kislina po izumu lahko tudi vsebuie zaooredie nukleotidov, ki ie 100%-no komolementarno. nor. protismisel kateremukoli zaporedju nukleotidov, omenjenemu zgoraj in spodaj. Nukleinsko kislino, se pravi polimer nukleotidov ali polinukleotidov po izumu, lahko dobimo iz raznih virov. Lahko jo dobimo iz DNA ali RNA, kot je poliadenilirana mRNA, npr., izolirana iz tkiv, celic ali celega organizma. Nukleinsko kislino lahko dobimo neposredno iz DNA ah' RNA ali iz knjižnice cDNA. Nukleinsko kislino lahko dobimo iz celice ali tkiva inor. iz embrionskih ali odraslih srčnih celic ali tkivi na določeni stoonii

V « 1 I t razvoja, ki ima želeni genotip, fenotip, itd.

Kot je opisano za polipeptid IFN-p2, opisan zgoraj, lahko nukleinska kislina, ki vsebuie zaporedje nukleotidov, ki kodira za polipeptid po izumu, vključuje samo kodirno zaooredie: kodirno zaooredie in dodatno kodirno zaooredie (nor. zaooredia. ki kodiraio • * ' » * » Λ \ I I J Λ za vodilne, sekrecijske, ciljne, encimatske, fluorescentne ali druge diagnostične peptide), kodirna zaporedja in nekodirna zaporedja, npr. nepreveiena zaporedja na koncu 5' ali 3' ali razpršene v kodirnem zaporedju, npr. introni.

-1212

Nukleinska kislina, ki vsebuje zaporedje nukleotidov, ki kodira brez prekinitve za polipeptid pomeni, da zaporedje nukleotidov vsebuje kodirno zaporedje aminokislin za IFN-B2. ne da bi nekodimi nukleotidi prekinili kodirno zaporedje ali se vani vmešali, npr. odsotni intron(i). Tako nukleotidno zaporedje lahko opišemo tudi kot sosesko. Genomno DNA, ki kodira za človeški, mišji ali druge sesalske interferone, itd., lahko dobimo rutinsko.

Nukleinska kislina po izumu lahko vsebuje tudi ekspresijsko nadzorno zaporedje, ki je operabilno vezano na nukleinsko kislino, kot je opisano zgoraj. Izraz ekspresijsko nadzorno zaporedje pomeni zaporedje nukleinske kisline, ki regulira ekspresijo poiipeptida, ki ga je kodirala nukleinska kislina, na katero je operabilno vezan. Ekspresijo lahko reguliramo na nivoju mRNA ali poiipeptida. Tako ekspresijsko nadzorno zaporedje vsebuje z mRNA povezane elemente in s proteini povezane elemente. Taki elementi vključujejo promotorje, ojačevalce (virusne ali celične), zaporedja vezavnih ribosomov, transkripcijska zaključevalna zaporedja, itd. Ekspresijsko nadzorno zaporedje je operabilno vezano na kodirno zaporedje nukleotidov, kadar je ekspresijsko nadzorno zaporedje nameščeno tako, da doseže ekspresijo kodirnega zaporedja. Na primer ko je promotor operabilno vezan 5' na kodirno zaporedje, promotor poganja ekspresijo kodirnega zaporedja. Ekspresijska nadzorna zaporedja so lahko heterologna ali endogena z normalnim genom.

Nukleinsko kislino po izumu lahko izberemo na osnovi hibridizacije nukleinske kisline. Sposobnost dveh pripravkov enoverižne nukleinske kisline za hibridiziranje je merilo komplementarnosti njunih zaporedij nukleotidov, npr. paritev baz med nukleotidi, kot je A-T, G-C, itd. Izum se torej nanaša tudi na nukleinske kisline in njihove komplemente, ki hibridizirajo v nukleinsko kislino z zaporedjem nukleotidov, kot je predstavljeno na sl. 1. Zaporedje nukleotidov, ki hibridizira v slednje zaporedje, bo imelo komplementarno verigo nukleinske kisline ali pa bo delovalo kot matrica za le-to v prisotnosti polimeraze (se pravi ustreznega encima, ki sintetizira nukleinsko kislino). Ta izum vključuje oba trakova nukleinske kisline, npr. kodirajoči trak in nekodirajoči trak.

Lahko izberemo take hibridizacijske pogoje, da izberemo nukleinske kisline, ki imajo želeno količino komplementarnosti nukleotidov z zaporedjem nukleotidov, predstavljenim na sl. 1. Nukleinska kislina, sposobna hibridizacije v tako zaporedje, ima zaželeno npr. okrog 85%, bolj zaželeno 90%, 92% in še bolj zaželeno 95%, 97% ali

-1313

100% komplementarnost med zaporedji. Ta izum se zlasti nanaša na zaporedja nukleinskih kislin, ki hibridizirajo v zaporedje nukleotidov, predstavljeno na sl. 1 v pogojih šibke ali močne stringence.

Nukleinske kisline, ki hibridizirajo v zaporedja IFN-p2-ja, lahko izberemo na različne načine. Na primer odtise (t.i. matrikse, ki vsebujejo nukleinsko kislino), razporeditve drobcev in druge matrikse, ki vsebujejo nukleinske kisline, ki nas zanimajo, lahko inkubiramo v predhibridizacijski raztopini (6X SSC, 0,5% SDS, 100 μα/ml DNA denaturirane sperme lososa, 5X Denhardtove raztopine in 50% formamida) pri 30°C preko noči in potem hibridiziramo z zaznavno oligonukleotidno sondo, (glei spodaj) v hibridizacijski raztopini (6X SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml DNA denaturirane sperme lososa, in 50% formamida) Dri 42°C Dreko noči v skladu z znanimi DOStoDki. Odtise lahko operemo v močno stringentnih pogojih, ki dopuščajo npr. manj kot 5% bp neujemanje (npr. peremo dvakrat v 0,1X SSC in 0,1% SDS 30 minut pri 65°C), t j. izbiranje zaporedij s 95-odstotno ali večjo identičnostjo zaporedja. Drugi neomejujoči Drimeri visoko strinaentnih Doaoiev vkliučuieio končno Dranie Dri 65°C v vodnem oufru.

f » κχ λ λ λ Λ «4* 1 » ki vsebuje 30 mM NaCI in 0,5% SDS. Še en primer visoko stringentnih pogojev je hibridizacija v 7% SDS, 0,5 M NaPO₄, pH 7, 1 mM EDTA pri 50°C, npr., preko noči, čemur sledu eno ali več pranj z 1%-no raztopino SDS pri 42°C.

Medtem ko visokostringentna pranja dopuščajo mani kot 5%-no neujemanje, sproščeni ali nizkostringentni pogoji pranja (npr. dvakratno pranje v 0,2X SSC in 0,5 % SDS 30 minut pri 37°C) dovoljujejo do 20%-no neujemanje. Še en neomejujoči primer nizkostringentnih pogojev vključuje končno pranje pri 42°C v pufru, ki vsebuje 30 mM NaCI in 0,5 % SDS. Pranje in hibridizacijo lahko izvedemo tudi tako, kot je opisano v Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, 9. poglavje.

Hibridizacija lahko temelji tudi na izračunu temperature taljenja (Tm) hibrida, ki se ustvari med sondo in njeno tarčo, kot je opisano v Sambrook et al. Temperatura Tm, pri kateri se bo kratek oligonukleotid (z 18 nukleotidi ali manj) stalil s svojega tarčnega zaporedja, je podana z naslednjo enačbo: Tm = (število A-jev in T-jev) X 2°C + (število C-iev in G-iev) X 4°C. Za daljše molekule Tm = 81,5 + 16,6log₁₀fNa⁺j + 0,41(%GC) 600/N, pri čemer je [Na⁺] molska koncentracija natrijevih ionov, % GC je odstotek GC parov baz v sondi in N ie dolžina. Hibridizacijo lahko izvedemo Dri več stODiniah Dod to temperaturo, da zagotovimo hibridizacijo vzorca in tarče. Neujemanja lahko dopustimo s še dodatnim znižanjem temperature.

-1414

Stringentne pogoje lahko izberemo za izoliranje zaporedij in njihovih komplementov, ki imajo, npr., vsaj okoli 95%-no, 97%-no, 98%-no, 99%-no komplementarnost nukleotidov med sondo (npr. oligonukleotidom IFN-p2-ja) in tarčno nukleinsko kislino.

Po tem izumu lahko nukleinska kislina ali polipeptid obsega eno ali več razlik v zaporedju nukleotidov ali aminokislin, prikazanem na sl. 1 in 2. Spremembe ali modifikacije v zaporedju nukleotidov in/ali aminokislin lahko dosežemo s katerokoli dostopno metodo, vključno z usmerjeno ali naključno mutagenezo.

Nukleinska kislina, ki kodira za sesalski IFN-p2, kot je humani IFN-p2 po izumu, lahko vsebuje nukleotide, ki se pojavljajo na naravno pojavljajočem se genu, npr. naravno pojavljajoči se polimorfizmi, normalni ali mutantni aleli (nukleotid ali aminokislina), mutacije, ki jih odkrijemo v naravni populaciji sesalcev, kot so ljudje, opice, prašiči, miši, podgane ali zajci. Z izrazom naravno pojavljajoči se mislimo, da nukleinsko kislino dobimo iz naravnega vira, npr. živalskega tkiva in celic, telesnih tekočin, tkivnih celičnih kultur, forenzičnih vzorcev. Naravno pojavljajoče se mutacije lahko vključujejo delecije (npr. prisekan amino ali karboksilni konec), substitucije, inverzije ali adicije zaporedja nukleotidov. Te gene lahko odkrijemo in izoliramo s hibridizacijo nukleinske kisline po metodah, ki jih strokovnjaki poznajo. Zaporedje nukleotidov, ki kodira za sesalski IFN-B2 po izumu, lahko vsebuje kodone, ki jih najdemo v naravno pojavljajočem se genu, transkriptu ali cDNA, na primer - primer: kot ie predstavljeno na sl. 1 ali lahko vsebuje degenerirane kodone, ki kodirajo za ista zaporedja aminokislin. Npr., morda je zaželeno, da spremenimo kodone v zaporedju za optimiranje zaporedja za ekspresijo v želenem gostitelju.

Nukleinska kislina po izumu lahko vsebuje npr. DNA, RNA, sintetično nukleinsko kislino, peptidno nukleinsko kislino, modificirane nukleotide ali mešanice. DNA je lahko dvoverižna ali enoverižna. Nukleotide, ki vsebujejo nukleinsko kislino, lahko združimo prek različnih povezav, npr. estra, sulfamata, sulfamida, fosforotioata, fosforamidata, metilfosfonata, karbamata. itd., odvisno od želeneaa namena, nor. rezistenca na nukleaze, kot je RNAza H, izboljšana stabilnost in vitro, itd. Glej npr. U.S. patent št. 5,378,825.

Na nukleinskih kislinah lahko opravimo različne modifikacije, kot so pripojitev zaznavnih označevalcev (avidin, biotin, radioaktivni elementi), delov, ki izboljšajo hibridizacijo, zaznavo ali stabilnost. Nukleinske kisline so lahko pripojene tudi trdnim nosilcem, npr. nitrocelulozi, magnetnim ali paramagnetnim mikrosferam (npr. kot je opisano v U.S. pat.

-1515 št. 5,411,863; U.S. pat. št. 5,543,289; ki na primer vsebujejo feromagnetni, supermagnetni, paramagnetni, superparamagnetni, železov oksid in polisaharid), najlonu, agarozi, diazotirani celulozi, lateks trdnim mikrosferam, poliakrilamidom, itd., po želenem postopku. Glej npr. U.S. pat. št. 5,470,967; 5,476,925; 5,478,893.

Drugi vidik tega izuma se nanaša na oligonukleotide ali sonde nukleinskih kislin. Take oligonukleotide ali sonde nukleinskih kislin lahko uporabljamo npr. za odkrivanje, kvantificiranje ali izoliranje nukleinske kisline sesalskega IFN-p2-ja v testnem vzorcu ali za identificiranje homologov IFN-p2-ja. V prednosnem izvedbenem primeru lahko nukleinske kisine uporabljamo kot oligonukleotidne sonde, npr. v PCR, diferencialnem prikazu, delcih gena (npr. Affymetrix GeneChips; U.S. pat. št. 5,143,854, U.S. pat št. 5,424,186; U.S. pat. št. 5,874,219; PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070) ter druge razpoložljive metode. Odkrivanje je zaželeno iz različnih razlogov, raziskovalnih, diagnostičnih in forenzičnih. Za diagnostične namene je verjetno zaželeno, da identificiramo prisotnost ali količino zaporedja nukleinskih kislin v vzorcu, pri čemer vzorec dobimo iz tkiva, celic, telesnih tekočin in podobno. Po prednostni metodi se ta izum nanaša na postopek za odkrivanje nukleinske kisline, ki vsebuje stik tarčne nukleinske kisline v testnem vzorcu z oligonukleotidom v pogojih, ki so učinkoviti za dosego hibridizacije med tarčo in oligonukleotidom; in odkrivanje hibridizacije. Oligonukleotid po izumu se lahko uporablja tudi v pomnoževanju sintetične nukleinske kisline kot je PCR (npr. Saiki et al., Science, 241:53, 1988; U.S. pat št. 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, New York, 1990); diferencialni prikaz (glej npr. Liang et al., Nucl. Acids Res., 21:32693275, 1993; U.S. pat. št. 5,599,672; VVO97/18454; linearni PCR; ali drugi pomnoževalni postopki.

Odkrivanje lahko opravimo v kombinaciji z oligonukleotidi za druge gene, npr. gene, ki so vključeni v prenos signala, rast, raka, apoptozo ali katerikoli drug gen, omenjen zgoraj in spodaj, itd. Oligonukleotidi se lahko uporabljajo tudi za testiranje za mutacije, npr. z uporabo tehnologije popravljanja neujemanja DNA, kot je opisano v U.S. pat. št. 5,683,877; U.S. pat št. 5,656,430; Wu et al., Proč. Natl. Acad.Sci., 89:8779-8783, 1992. Oligonukleotidi po izumu lahko vsebujejo kakršnokoli kontinuirano zaporedje nukleotidov s sl. 1 ali njegov komplement, ali katerokoli od zaporedij ali njegovih komplementov, kot je omenjeno zgoraj. Ti oligonukleotidi (nukleinska kislina) po izumu imajo lahko kakršnokoli želeno velikost, npr. okoli 10-200 nukleotidov, 12-100, 12-50,

-1616

12-25. 14-16 ali vsaj okoli 15, vsaj okoli 20_: vsai okoli 25. vsaj okoli 30. itd. Oligonukleotidi lahko vsebujejo nenaravno pojavljajoče se nukleotide, npr. inozin, AZT, 3TC. itd. Oligonukleotidi imajo lahko 100%-no identičnost ali komplementarnost z zaporedjem s sl. 1, ali pa imajo lahko neujemanja ali substitucije nukleotidov, npr. 1, 2, 3, 4 ali 5 substitucij. Po tem izumu ima lahko nukleotid komplet, pri čemer komplet vključuje želeni pufer (npr. fosfat, Tris, itd.), sestavke za odkrivanje, itd. Oligonukleotid je lahko označen ali neoznačen z radioaktivnimi ali neradioaktivnimi označevalci, kot je v znanosti znano.

Drugi vidik tega izuma je zapordje nukleotidov, ki je edinstvena za sesalski IFN-32. Z edinstvenim zaporedjem IFN-p2-ja imamo v mislih definirano zaporedje nukleotidov, ki se pojavi v IFN-p2-ju, npr. v nukleotidnih zaporedjih s sl. 1, vendar redko ali nepogosto v drugih nukleinskih kislinah, zlasti ne v živalski nukleinski kislini, prednostno sesalcu, kot je človek, podgana, miš, itd. Edinstvena zaporedja nukleotidov vključujejo zaporedja ali njihove komplemente, ki kodirajo za amino kisline KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRANI, AEKLSGT, CLFFVFS in QGRPLNDMKQELTTEFRSPR in njihovi delci, kot kaže sl. 1. Taka zaporedja se lahko uporabljajo kot sonde v katerikoli tukaj opisani metodi ali metodi vključeni v referenco. Vključene so smiselna in nesmiselna zaporedja nukleotidov. Edinstveno nukleinsko kislino po izumu lahko določimo rutinsko. Nukleinska kislina, ki vsebuje tako edinstveno zaporedje, se lahko uporablja kot hibridizacijska sonda za identificiranje prisotnosti npr. človeškega ali mišjega IFN-p2-ja v vzorcu, ki vsebuje mešanico nukleinskih kislin, npr. na northern prenosu.

Hibridizacijo lahko opravimo v močno stringentnih pogojih (glej zgoraj), da izberemo nukleinske kisline (in njihove komplemente, ki lahko vsebujejo kodirno zaporedje), ki imajo vsaj 96%-no identičnost (se pravi komplementarnost) s sondo, lahko pa uporabimo tudi manj stringentne pogoje. Edinstveno zaporedje nukleotidov IFN-p2-ja lahko združimo v okviru, bodisi na 5' ali 3' koncu, v različna zaporedja nukleotidov, kot je omenjeno v celotnem opisu patenta, vključno s kodirnimi zaporedji za druge dele IFNp2-ja, encime, GFP, itd., ekspresijska nadzorna zaporedja, itd.

Kot smo že povedali, lahko hibridizacijo opravimo v različnih pogojih, odvisno od želene selektivnosti, npr. kot je opisano v Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989. Da bi na primer specifično odkrili IFN-p2 v tem izumu, lahko oligonukleotid hibridiziramo s tarčno nukleinsko kislino v pogojih, v katerih se oligonukleotid samo hibridizira z njo, npr. kjer je oligonukleotid 100%-no komplementaren s tarčo. Uporabimo lahko različne pogoje,

-1717 če želimo izbrati tarčne nukleinske kisline, ki imajo manj kot 100-odstotno komplementarnost nukleotidov, vsaj okoli npr. 99%, 97%, 95%, 90%, 86,4%, 85%, 70%, 67%.

Protismiselno nukleinsko kislino lahko tudi pripravimo iz nukleinske kisline po izumu, prednostno kot protismisel na zaporedje s sl. 1. Protismiselno nukleinsko kislino lahko uporabljamo na različne načine, kot so npr. reguliranje ali moduliranje ekspresije IFNp2-ja, inhibiranje le-tega, odkrivanje njegove ekspresije ali za hibridizacijo in situ. Ti oligonukleotidi se lahko uporabljajo analogno z U.S. pat št. 5,576,208. Za reguliranje ali moduliranje ekspresije IFN-p2-ja, lahko protismiselni nukleotid operabilno povežemo z ekspresijskim nadzornim zaporedjem.

Za inhibiranje IFN-£2-ja lahko oblikujemo oligonukleotid na ustrezni smiselni položaj vzdolž cDNA. Glej npr. J. Milligan et al., Current Concepts in Antisense Drug Design, J. Med. Chem. 36(14): 1923-1937, 1993; Helene and Toulme, Biochim. Biophys. Acta, 1049: 99-125, 1990; Cohen, J.S., Ed., Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, Fla., 1987; Crooke, S., Basic Principles of Antisense Therapeutics. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, Jul. 1998. Taki oligonukleotidi so lahko nukleaza-rezistentni, npr. uporabljajo različne kemijske povezanosti, opisane v U.S. pat. št. 6,040,296 ali v zgoraj omenjenih referencah. Skupna dolžina okoli 35 bp se lahko uporablja v celični kulturi s kationskimi liposomi za lažji celični vnos, za uporabo in vivo pa dajemo prednostno krajše oligonukleotide, npr. 25 nukleotidov.

Nukleinsko kislino po tem izumu lahko označimo v skladu s katerokoli želeno metodo. Nukleinsko kislino lahko označimo z uporabo radioaktivnih označevalcev, kot so ³²P, ³⁵S, ¹²⁵J, ³H ali ¹⁴C, če omenimo samo nekaj najobičajnejših označevalcev. Radioaktivno označevanje lahko opravimo po katerikoli metodi, kot je na primer terminalno označevanje na 3' ali 5' koncu z uporabo radiooznačenega nukleotida, polinukleotidne kinaze (z defosforilacijo s fosfatazo ali brez nje) ali ligaze (odvisno od konca, ki ga označujemo). Uporabimo lahko tudi neradioaktivno označevanje s kombiniranjem nukleinske kisline po izumu z ostanki, ki imajo imunološke lastnosti (antigeni, hapteni), specifično afiniteto za določene reagente (Ugandi), lastnosti, ki omogočajo dokončanje zaznavnih encimskih reakcij (encimi ali koencimi, substrati encimov ali druge snovi, vključene v encimsko reakcijo) ali značilne fizikalne lastnosti, kot so fluorescenca ali emisija ali absorbcija svetlobe pri želeni valovni dolžini, itd.

-1818

Nukleinsko kislino po izumu, vključno oligonukleotide, protismiselno nukleinsko kislino, itd., lahko uporabljamo za odkrivanje ekspresije IFN-p2-ja v celih organih, tkivih, celicah, itd., z različnimi tehnikami, vključno s prenosom northern, PCR, hibridizacijo in situ, direrencialnim prikazom, razporeditve nukleinske kisline (npr. deli genov), točkovnimi prenosi, itd. Take nukleinske kisline so lahko zlasti koristne pri odkrivanju motene ekspresije npr. celično specifičnih in/ali podceličnih sprememb IFN-32-ja. Stopnje IFNB2-ja lahko določimo same ali v kombinaciji z drugimi genskimi produkti, zlasti drugimi genskimi produkti, vključenimi v proizvodnjo citokina.

Nukleinska kislina po izumu je lahko izražena v različnih sistemih, in vitro ter in vivo, glede na želeni namen. Nukleinsko kislino lahko npr. vstavimo v ekspresijski vektor, uvedemo v želenega gostitelja in gojimo v kulturi v pogojih, ki so učinkoviti za dosego ekspresije poiipeptida, ki ga kodira ta nukleinska kislina. Učinkoviti pogoji obsegajo kakršnekoli pogoje kulture, ki so primerni za doseganje proizvodnje poiipeptida z gostiteljsko celico, vključno učinkovite temperature, pH, medij, aditivi k mediju, v katerem gojimo celičnega gostitelja (npr. aditivi, ki povečajo ali inducirajo ekspresijo, kot so butirat ali metotreksat, če je kodirna nukleinska kislina sosednja genu dhfr), cikloheksimida, gostot celic, posod, v katerih gojimo celice, itd. Nukleinsko kislino lahko uvedemo v celico s katerokoli učinkovito metodo, vključno npr. z golo DNA, z obarjanjem kalcijevega fosfata, elektroporacijo, injiciranjem. DEAE-Dextran mediirano transfekcijo, fuzijo z liposomi, povezavo s sredstvi, ki pospešijo njihov vnos v celice, virusno transfekcijo. Celica, v katero smo uvedli nukleinsko kislino po tem izumu, je transformirana gostiteljska celica. Nukleinska kislina je lahko ekstrakromosomska ali integrirana v kromosom(e) gostiteljske celice. Lahko je stabilna ali prehodna. Ekspresijski vektor izberemo tako, da je kompatibilen z gostiteljsko celico. Gostiteljske celice vključujejo sesalske celice, npr. COS, CV1, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293, PAE, humano, humani fibroblast, humane primarne tumorske celice, testise, glie, nevrone, oligodendrocite, astrocite. nevroblastome. gliome, itd., celice insektov, kot so Sf9 (S. frugipeda) in Drosophila, bakterije, kot so E. coli, Streptococcus, bacile, kvasovke, kot so Sacharomvces, S. cerevisiae, glivične celice, rastlinske celice, embrionske izvorne celice (npr. sesalske, kot so mišje ali človeške), nevronaine izvorne celice, fibroblaste, mišične celice, srčne celice in T-celice,

Ekspresijska nadzorna zaporedja podobno izberemo tako, da so kompatibilna z gostiteljem in za želeni namen, npr. visoko število kopij, velike količine, indukcija,

-1919 pomnoževanje, nadzirana ekspresija. Druga zaporedja, ki se lahko uporabljajo, vključujejo ojačevalce, kot so iz SV40, CMV, RSV, inducibilni promotorji, celičnospecifični elementi, ali zaporedja, ki omogočajo selektivno ali specifično ekspresijo celic. Uporabljamo lahko promotorje, da ženejo njeno ekspresijo, vključujejo npr. endogeni promotor, promotorje drugih genov v poti celičnega prenosa signala, MMTV, SV40, trp, lac, tac ali T7 promotorje za bakterijske gostitelje; ali alfa faktor, alkohol-oksidazo ali PGH promotone za kvasovke. Promotorje RNA lahko uporabljamo za proizvodnjo transkriptov RNA, kot sta T7 ali SP6. Glej npr. Melton et al., Nucleic Acids Res., 12(18):7035-7056, 1984; Dunn and Studier, J. Mol. Biol.; 166:477-435, 1984; U.S. pat. št. 5,891,636; Studier et al., Gene Expression Technoiogy, Methods in Enzymology, 85:60-89, 1987.

Nukleinska kislina ali polipeptid po izumu se lahko uporablja kot označevalec velikosti v nukleinski kislini ali proteinski elektroforezi, kromatografiji, itd. Definirane restrikcijske fragmente lahko ugotovimo s pregledovanjem zaporedja na restrikcijska mesta, izračunavanjem velikosti in opravljanjem ustreznega restrikcijskega izvlečka.

Polipeptid IFN-p2 in nukleinsko kislino po tem izumu lahko izoliramo. Z izrazom izoliran imamo v mislih, da sta v obliki, v kateri ju ne najdemo v njunem originalnem okolju ali v naravi, npr. bolj koncentrirana, bolj očiščena, ločena od komponent, prisotna v lizatu celice, v kateri je izražen heterologni gen IFN-P2. Kadar je IFN-02 izražen kot heterologna nukleinska kislina v transfekcijski celični liniji, uvedemo nukleinsko kislino po tem izumu v celico, kot je opisano zgoraj, v pogojih, v katerih je nukleinska kislina izražena. Izraz heterologen pomeni, da smo nukleinsko kislino uvedli v celično linijo z roko človeka. Uvajanje nukleinske kisline v celično linijo ie opisano zgoraj. Transfektirano (ali transformirano) celico, ki izraža nukleinsko kislino IFN-p2-ja, lahko liziramo, kot je opisano v primerih, in porabimo v postopku kot lizat (se pravi izolirano), celično linijo pa lahko uporabljamo tudi nedotaknjeno.

Na splošno velja, da izraz učinkoviti pogoji pomeni, npr. okolje, v katerem dosežemo želeni učinek. Tako okolje vključuje npr. pufre, oksidima sredstva, reducirna sredstva, pH, kofaktorje, temperaturo, ionsko koncentracijo, primerno starost in/ali stopnjo celice (zlasti poseben del celičnega cikla ali posebna stopnja, kjer se posebni geni izrazijo), kjer se celice uoorabliaio. Doaoii kulture (vkliučno substrat, kisik, oaliikov dioksid. itd, V Ta izum se nanaša tudi na postopek moduliranja, prednostno inhibiranja, ekspresije nukleinske kisline, ki kodira za IFN-p2 po izumu, in obsega: dajanje celice, ki izraža

-2020

IFN-P2 po izumu, v stik s količino sredstva, kot je protismiselni oligonukleotid ali protismiselna RNA IFN-p2-ja, ki je učinkovita za zaporedje-specifično inhibiranje ekspresije omenjene nukleinske kisline.

Zaporedje-specifično inhibicijo nukleinske kisline lahko dosežemo po konvencionalni poti z uporabo protismiselne nukleinske kisline, kot so protismiselni oligonukleotidi ali RNA. Na primer protismiselne oligonukleotide, kot so fosfordiester ali fosforotioat deoksioligonukleotidi, lahko oblikujemo v specifična območja IFN-B2-ia RNA, kot na primer v mesto iniciacije translacije, in jih lahko potem dajemo v celice, ki izražajo take gene v količinah, ki so učinkovite za inhibiranje njihove ekspresije. Protismiselna nukleinska kislina je na splošno nukleinska kislina, ki je komplementarna smiselni ali kodirni verigi dane nukleinske kisline in je kot rezultat tudi komplementarna in lahko tako specifično hibridizirajo z mRNA transkripti nukleinske kisline. Prednostni protismiselni oligonukleotidi vključujejo 5' območje tarčnega gena, zlasti območje, ki vsebuje iniciacijski kodon.

Za povečanje stabilnosti lahko dodajanje nukleinske kisline modificiramo, jo npr. naredimo rezistentno na celične encime, oksidacijo, redukcijo, nukleaze, itd, ali da Dovečamo nien vnos v celice. UDorabimo lahko katerokoli ustrezno modifikacijo vkliučno »Ji J J npr. fosforotioate, metilfosfonate, fosfodiester oligonukleotid, vezan na akridininterkalacijsko sredstvo in/ali hidrofobni rep, derivate psoralens. 2'-riboza modifikacije, derivate pentoza sladkorja, derivate dušikove baze, itd. Glej npr. U.S. pat. št. 5,576,208, 5,744.362. 6.040.296 in 6.046.319 za orotismiselne oliaonukleotide. modifikacije, itd., ki se lahko uporabljajo v izumu. Protismiselna nukleinska kislina po izumu lahko na splošno vsebuje manomere naravno pojavljajočih se nukleotidov, nenaravno pojavljajočih se nukleotidov in teh kombinacij, za povečanje celičnega vnosa in/ali stabilnosti.

Protismisel lahko dajemo kot golo nukleinsko kislino, kompleksirano ali vkapsulirano z drugim sredstvom, ki olajša njegov vnos v celico, iniicirano v celice ali katerokoli drugo ustrezno dajalno sredstvo.

Ta izum se nanaša tudi na postopke za uporabo IFN-p2-ja po izumu, kot ie humani IFNβ2, za zdravljenje kakršnihkoli stanj, nepravilnosti, bolezni, itd. pri katerih je želena bioaktivnost IFN^2-ia. Taki postopki vključujejo dajanje učinkovite količine IFN-B2-ja po izumu v gostitelja, ki potrebuje zdravljenje zaradi enega ali več naslednjih vzrokov: protionkogena regulacija, protitumorska aktivnost, protivirusna aktivnost, inhibicija rasti

-2121 celic ali protirastna aktivnost, antiproliferacija (npr. količine IFN-p2-ia, ki so učinkovite za inhibiranje proliferacije astrocitov), povečanje citotoksičnosti limfocitov, imunoregulatorna aktivnost, induciranje ali inhibicija diferenciacije tarčnih celic, aktivacija makrofagov, navzdoljna regulacija onkogenov, itd.; imunološki učinki, kot so zmanjšanje tvorbe protiteles, povečanje komponent celične membrane (hud kompleks histokompatibilnosti, receptor Fc, mikroglobulin β2), muduliranje celično mediirane imunosti, povečanje proizvodnje citokina (npr. interlevkina), povečanje citotoksičnih učinkov T-celice, povečanje učinkov makrofagov in povečanje naravnega ubijanja. IFNB2 lahko dajemo za zdravljenje npr. raka, avtoimunskih nepravilnosti ter virusnih infekcij. Glej npr. Cirelli and Tyring, Ciin. Immunobother, 3:27-87, 1995, glede različnih nepravilnosti, ki jih lahko zdravimo z !FN-R2-jem po Izumu; glej zlasti uporabe za interferone alfa in beta.

IFN-P2 lahko dajemo kot polipeptid ali pa ga dajemo kot nukleinsko kislino, kot npr. v genski terapiji. Če ga dajemo kot nukleinsko kislino, je lahko na voljo v kakršnikoli obliki, ki je učinkovita za doseganje ekspresije, kot npr. gola DNA, kot vektor (kot je virusni vektor, npr. adenovirus), kompleksiran v liposomih ali drugih nosilcih, mikromehurčkih, itd. Glej zgoraj glede več informacij o dajanju nukleinskih kislin, njihovi ekspresiji v gostitelju, itd.

Vsako vrsto raka lahko zdravimo v skladu s tem izumom, nor. cervikalno intraeoitelialno ' s · neoplazijo in cervikalni rak (npr. glej DePaolo et al., Int. J. Tissue React., 6:523-527, 1984, glede odmerkov, dajalnih poti, režimov, itd ), melanom in metastatski melanom (glej npr. Beiteke et al., Hautarzt, 44:365-371, 1994 glede odmerkov, dajalnih poti, režimov, itd.), levkemija kosmatih celic, Kaposijev sarkom, karcinom bazalne celice, karcinom luskavih celic, karcinom ledvičnih celic, karcinoidni tumorji, limfom kutanih Tcelic, ne-Hodakinsov limfom (glede drugih vrst rakov glej tudi Dorr, Drugs, 45(2):177211, 1993).

Avtoimune bolezni lahko tudi zdravimo v skladu s tem izumom, npr. multiplo sklerozo (glej npr. Young et al., Neurology, 51:682-689, 1998, glede odmerkov, dajalnih poti, režimov, itd ), revmatoidni artritis, itd. Multipla skleroza (MS) ie avtoimuna bolezen, ki jo patološko označuje perivaskularno in periventrikulirano vnetje, ki vodi k demielinaciji, aksonalni destrukciji in končno aliozi. Znak kroničnih lezii MS so demielinirani gliotski plaki, ki se tvorijo kot rezultat lokalne astrocitne hipertrofije in hiperplazije. Ti astrocitni plaki se vmešajo z normalno aksonalno kondukcijo in predstavljajo fizično oviro za

-2222 remielinaciio. Zato imajo dejavniki, ki inhibiraio astrocitozo, uoodne teraoevtske implikacije, zlasti v zadnjih stadijih bolezni. Zato je sposobnost IFN-p2-ja za inhibiranje astrocitov zlasti koristna za zdravljenje MS-ia.

Virusne bolezni in infekcije lahko tudi zdravimo v skladu s tem izumom, npr. virus človeškega papiloma (npr. Puligheddu eta!.. Eur. J. Gvnaecol. Oncol.. 9:161-162. 1988: Costa et al., Cervix, 6:203-212, 1988 glede odmerkov, dajalnih poti, režimov, itd.), condvlomata acuminata (Schonfeld et al.. Lancet. 1:1038-1042. 1984. glede odmerkov, dajalnih poti, režimov, itd.), hepatitis B, C in D, HIV, itd.

Z izrazom dajanje imamo v mislih, da IFN-B2 ali drugo aktivno sredstvo dovajamo tarči, npr. v tumor, imunski sistem, možgansko ležijo (npr. mesto možganskega vnetja, kot so mesta, ki jih opazimo pri multipli sklerozi ali drugih pogojih možganskega vnetja), itd. IFN-p2 lahko dajemo katerikoli tarči (npr. in vivo, in vitro ali in situ), vključno celicam v kulturi in gostiteljih, ki imajo poškodbo, stanje ali bolezen, ki jo ie treba zdraviti, po učinkoviti poti, ki je primerna za dosego zgoraj opisanega učinka, npr. formulacijo IFNP2-ja lahko dajemo z injekcijo neposredno v ciljno mesto ali tik ob to mesto. Dajemo ga lahko tudi lokalno, enteralno, parenteralno, intravenozno, intramuskularno, subkutano, peroralno, nazalno, intracerebralno, intraventrikularno, itd. glede na mesto ciljnega mesta, ki ga zdravimo. IFN-p2 lahko dajemo tudi kot nukleinsko kislino za vnos v celice. Postopki za dajanje nukleinske kisline vključujejo zgoraj opisane in druge konvencionalne znanstvene tehnike.

Učinkovito količino IFN-P2-ia dajemo v tarčo. Učinkovite količine so take količine, ki so učinkovite za dosego želenega učinka, prednostno ugodnega ali terapevtskega učinka, npr. učinkovita količina za inhibiranje proliferacije astrocitov. Takšno količino lahko določimo rutinsko, npr. z eksperimentom odziva na odmerek, pri katerem dajemo tarčnim celicam različne odmerke, da določimo učinkovito količino za doseganje želenega cilja, npr. izkazanega protivirusnega učinka, izkazanega imunomodulatornega učinka. Količine lahko izberemo na osnovi različnih dejavnikov, vključno z okoljem, v katerega dajemo IFN-p2 (npr. pacient z multiplo sklerozo, živalski model, kulture tkivnih celic, itd.), območjem celic, ki jih zdravimo, starostjo, zdravjem, spolom in težo pacienta ali živali, ki ga zdravimo, itd. Koristne količine vključujejo npr. 1,6 MIE (milijon internacionalnih enot po mednarodnem referenčnem standardu) in 8 MIE danih subkutano vsak drugi dan. Z izrazom zdravljenje imamo v mislih učinek, ki ima za rezultat izboljšanje stanja, bolezni, nepravilnosti, itd.

-2323

Učinkovito količino IFN-p2-ja lahko dajemo z drugimi učinkovitimi sredstvi, npr. učinkovitimi sredstvi za zdravljenje raka, virusov, MS-a, hepatitisa ali katerihkoli drugih stanj, ki jih lahko zdravimo z IFN-p2-iem. Taka sredstva so lahko citotoksična, protivirusno sredstvo, kemoterapevtsko sredstvo, itd.

Ta izum se nanaša tudi na protitelesa, ki specifično prepoznavajo IFN-P2 po izumu. Protitelo, specifično za IFN-p2, pomeni, da to protitelo prepozna definirano zaporedje aminokislin znotraj IFN-p2-ja ali ki vključuje IFN-p2, npr. zaporedje s sl. 2. Tako se bo specifično protitelo na splošno vezalo z večjo afiniteto na zaporedje aminokislin, se pravi epitop, ki ga najdemo na sl. 2 kot na drug(e) epitop(e), npr. kot jih odkrijemo in/ali izmerimo s poskusom imuno-prenosa ali drugim konvencionalnim imunoposkusom. Tako je protitelo, ki je specifično za nek epitop človeškega IFN-p2-ia, koristno za odkrivanje prisotnosti epitopa v vzorcu, npr. vzorcu tkiva, ki vsebuje genski produkt človeškega IFN-P2-ja, in ga razlikoval od vzorcev, v katerih tega epitopa ni. Koristno protitelo je na edinstveni C-terminal IFN-p2-ja, npr. QGRPLNDMKQELTTEFRSPR ali njegov delec. Koristna so taka protitelesa, kot so opisana v Santa Cruz Biotechnologv, Inc., Research Product Catalog, in jih lahko formuliramo v skladu s tem.

Protitelesa, npr. poliklonska, monoklonska, rekombinantna, himerna, humanizirana lahko pripravimo po kateremkoli želenem postopku. Glej tudi pregledovanje rekombinantnih imunoglobulinskih knjižnic (npr. Orlandi et al., Proč. Natl. Acad. Sci., 86:3833-3837, 1989; Huse et al., Science, 256:1275-1281, 1989); stimulacija populacij limfocitov in vitro; VVinter and Miltein, Nature, 349:293-299, 1991. Za proizvodnjo monoklonskih protiteles lahko na primer dajemo polipeptid po sl. 2 mišim, kozam ali zajcem subkutano in/ali intraperitonealno, z adjuvansom ali brez, v količini, ki je učinkovita za izvabljanje imunskega odgovora. Protitelesa so lahko tudi enoverižni ali delci Fab. Protitelesa so lahko IgM, IgG, podtipi, !gG2a, lgG1, itd. Protitelesa in imunske odgovore lahko generiramo tudi z dajanjem gole DNA. Glej npr. U.S. pat št. 5,703,055; 5,589,466; 5,580,859.

Ni treba, da so interferon ali njegovi delci za uporabo za indukcijo protiteles, bioaktivni; morajo pa imeti imunogensko aktivnost, bodisi sami bodisi v kombinaciji z nosilcem. Peptidi, ki se uporabljajo pri indukciji protiteles, specifičnih za IFN-P2, imajo lahko amino sekvenco, ki sestoji iz vsaj petih aminokislin, prednostno vsaj 10 aminokislin. Kratke razpone aminokislin, npr. pet aminokislin, lahko spojimo z aminokislinami drugega

-2424 proteina, kot je hemocianin polža megathura crenulata (angl. keyhole limpet hemocyanin - KLH) ali drug uporabni nosilec ter himerno molekulo, ki se uporablja za produkcijo protiteles. Območja IFN-fi2-ja, ki so uporabna za izdelavo protiteles, lahko izberemo empirično ali pa lahko npr. zaporedje aminokislin IFN-p2-ja, kot ga deduciramo iz cDNA, analiziramo, da določimo območja visoke imunogenskosti. Analiza za izbiro ustreznih epitopov je opisana npr. v Ausubel, F.M. et al. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, 2. del John Wiley & Sons).

Določena protitelesa IFN-p2-ja so koristna za diagnosticiranje predpatoloških stanj ter kroničnih ali akutnih bolezni, za katere je značilna različna količina ali porazdelitev IFNp2-ja. Diagnostični testi za IFN-p2 vključujejo postopke, ki uporabljajo protitelo in oznako za odkrivanje IFN-32-ja v človeških (ali mišjih., itd., če uporabljamo miš, itd.) telesnih tekočinah, tkivih ali izvlečkih takih tkiv. Protitelesa so lahko nevtralizajoča in se lahko uporabljajo v poskusih za aktivnost IFN-p2-ja, npr. kot kontrole za nevtraliziranje aktivnosti interferona.

Polipeptidi in protitelesa tega izuma se lahko uporabljajo z modifikacijo ali brez nje. Pogosto polipeptide in protitelesa označimo tako, da jih združimo, bodisi kovalentno ali nekovalentno, s snovjo, ki omogoča zaznavni signal. Znanih je veliko različnih označevalnikov in konjugacijskih tehnik, o katerih je bilo obširno poročano tako v znanstveni kot v patentni literaturi. Ustrezni označevalniki vključujejo radionuklide, encime, substrate, kofaktorje, inhibitorje, fluorescentna sredstva, kemiluminiscentna sredstva, magnetne delce in podobno. Patenti, ki govorijo o uporabi takih označevalnikov vključujejo U.S. pat. št. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 in 4,366,241.

Protitelesa in drugi ligandi, ki vežejo IFN-p2, se lahko uporabljajo na različne načine, vključno kot terapevtska, diagnostična orodja ter kot orodja za komercialno raziskavo; npr. za kvantitiranje stopenj interferonskega polipeptida v živalih, tkivih, celicah itd. za ugotavljanje njegove celične lokalizacije in/ali porazdelitve, za njegovo čiščenje ali polipeptida, ki vsebuje njegov delec, za moduliranje njegove funkcije, v vvestern prenosih, ELISA, imunoprecipitaciji, RIA, itd. Ta izum se nanaša na take poskuse, sestavke in opremo za njihovo izvajanje, itd. Ob uporabi teh in drugih postopkov lahko protitelo po tem izumu uporabimo za odkrivanje polipeptida IFN-βζ ali njegovih delcev v

-2525 različnih vzorcih, vključno tkivih, celicah, telesnih tekočinah, krvi, urinu, cerebrospinalni tekočini.

Poleg tega lahko pripravimo tudi ligande, ki se vežejo na polipeptid IFN-βΣ po tem izumu ali na njegov derivat, npr. z uporabo knjižnic sintetičnih peptidov ali aptamerov (npr. Pitrung et al., U.S. pat. št. 5,143,854; Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1987; Scott et al., Science, 249:386, 1990; Blackwell et al., Science, 250:1104, 1990; Tuerketal., 1990, Science, 249:505).

Ta izum se nanaša tudi na polipeptid IFN-p2, pripravljen po želenem postopku, kot je npr. opisano v U.S. pat št. 5,434,050. Označen polipeptid se lahko uporablja npr. v poskusih vezave za odkrivanje snovi, ki se vežejo ali pripojijo na lFN-p2 za sledenje gibanja IFN-p2-ja v celici, v sistemu in vitro, in vivo ali in situ, itd.

Nukleinsko kislino, polipeptid, protitelo, IFN-p2, itd., lahko izoliramo. Z izrazom izoliramo imamo v mislih, da je material v obliki, v kateri ga ne najdemo v njegovem originalnem okolju ali v naravi, npr. bolj koncentriran, bolj očiščen, ločen od komponent, itd. Izolirana nukleinska kislina vključuje npr. nukleinsko kislino, ki ima zaporedje IFN32-ja ločeno od kromosomske DNA, ki jo najdemo v živi živali, npr. kot popolni gen, transkript ali cDNA. Ta nukleinska kislina je lahko del vektorja ali pa je lahko vstavljena v kromosom (z določenim genskim ciljanjem ali z naključno integracijo na položaj, ki ni njegov običajni položaj) in še vedno izolirana, tako da ni v obliki, v kateri jo najdemo v naravnem okolju. Nukleinsko kislino ali polipeptid po izumu lahko tudi obsežno očistimo. Z obsežno očistimo mislimo, da nukleinsko kislino ali polipeptid ločimo in je v bistvu brez drugih nukleinskih kislin ali polipeptidov, se pravi da je ta nukleinska kislina ali polipeptid primarna in aktivna konstituenta.

Ta izum se nanaša tudi na transgensko žival, npr. nečloveškega sesalca, kot je miš, ki ima IFN-p2. Transgenske živali lahko pripravimo po znanih postopkih, npr. s pronuklearnim injiciranjem rekombinantnih genov v pronuklee 1-celičnih embrijev, ki imajo umetni kromosom kvasovk v embrionske izvorne celice, postopke za gensko ciljanje, metodologijo za embrionsko izvorno celico. Glej npr. U.S. pat št. 4,736,866; 4,873,191; 4,873,316; 5,082,779; 5,304,489; 5,174,986; 5,175,384; 5,175,385; 5,221,778; Gordon et al., Proč. Natl. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980; Palmiter et al., Celi, 41:343-345, 1985; Palmiter et al., Annu. Rev. Genet., 20:465-499, 1986; Askew et al., Mol. Celi. Biol., 13:4115-4124, 1993; Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Valancius and Smithies, Mol. Celi. Biol., 11:1402-1408, 1991; Stacey et al., Mol. Celi.

-2626

Biol., 14:1009-1016, 1994; Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995; Rubinstein et al., Nucl. Acids Res., 21:2613-2617, 1993. Nukleinsko kislino po tem izumu lahko uvedemo v kateregakoli nečloveškega sesalca, vključno miš (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), prašiča (Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985), ovco (Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985), govedo, podgano ali primata. Glej tudi npr. Church, Trends in Biotech., 5:13-19, 1987; Clark et al., Trends in Biotech., 5:20-24, 1987) in DePamphilis et al., BioTechniques, 6:662-680, 1988). Poleg tega je npr. običajna produkcija transgenih podgan in miši komercialno dostopna. Te transgene živali so lahko koristni živalski modeli za testiranje funkcije IFN-p2-ja, kot hrana za kače, kot genetski označevalec za odkrivanje izvora razpoka (npr. kjer je bil IFN-p2 ali njegov delec vstavljen), itd. Take transgene živali imajo lahko druge transgene. Transgene živali lahko pripravimo in uporabimo po katerikoli ustrezni metodi,

Ta izum se nanaša tudi na sesalsko celico, v kateri je bila ekspresija za gensko kodirajoči IFN-£2 izbita ali raztrgana. Tako gensko izbitje lahko dosežemo z učinkovitim sredstvom, ki vključuje npr. protismisel, ali z vstavitvijo zaporedja nukleotidov, ki je učinkovito za potlačenje genske ekspresije. Izraz gen se uporablja v tem smislu, da pomeni zaporedje, ki kodira IFN-p2, kot obstaja na kromosomu in mora vključevati promotorsko zaporedje in druga regulatorna območja.

Izum se zlasti nanaša na sesalca, ki ima eno ali več celic, v katerih je ekspresija gena funkcijsko inaktivirana ali raztrgana. Funkcijska inaktivacija ali raztrganje se nanaša npr. na delno ali popolno redukcijo ekspresije vsaj dela polipeptida, ki ga je kodiral endogeni gen IFN-p2 ene same celice, izbranih celic ali vseh celic sesalca. Izraz izbit ie sinonim za funkcijsko inaktivacijo gena.

Po enem izvedbenem primeru se uporablja strategija ciljanja genov, ki olajša uvajanje želenega zaporedja nukleotidov v gen IFN-p2. Pri strategiji ciljanja genov prednostno uporabimo dvojno recipročno rekombinacijo in pozitivni selektivni označevalec, ki pomaga pri uvajanju zaporedja nukleotidov v ciljno nukleinsko kislino. Ciljna nukleinska kislina je prednostno gen, še bolj prednostno gen na njegovem določenem kromosomskem mestu. Želeno zaporedje nukleotidov vstavimo v gen tako, da je gen funkcijsko prekinjen, se pravi njegova ekspresija je delno ali v celoti zmanjšana.

Po enem vidiku izuma se uporablja ciljni vektor za vstavljanje selektivnega označevalca v vnaprej določen položaj gena IFN-P2. Položaj izberemo zato, da dosežemo

-2727 funkcionalno prekinitev gena po vstavitvi selektivnega označevalca. Za take namene je prednostni izvedbeni primer molekula rekombinantne nukleinske kisline, ki vsebuje: (1) zaporedje nukleotidov 5', ki je učinkovito za dosego homologne rekombinacije na prvem vnaprej določenem položaju sesalskega gena IFN-P2, ki je operabilno vezan na (2) 5' terminal prvega selektabilnega zaporedja nukleotidov, ki prenaša prvo značilnost izbire na celico, v kateri je prisotna in (3) 3' zaporedje nukleotidov, ki je učinkovita za dosego homologne rekombinacije na drugem vnaprej določenem položaju sesalskega gena IFN-p2, npr. gena IFN-p2, ki je operabilno vezan na 3' terminal prvega selektabilnega zaporedja nukleotidov. Molekula rekombinantne nukleinske kisline je učinkovita za dosego homologne rekombinacije v sesalskem kromosomu na vnaprej določenem položaju. Delci ciljanega vektorja so tudi v obsegu izuma, npr. molekule rekombinantne nukleinske kisline, ki vsebujejo elementa (1) in (2) ali vsebujejo elementa (2) in (3), itd. Izraz rekombinanten se nanaša npr. na molekulo nukleinske kisline, ki jo je modificiral človek, npr. vsebuje delce nukleinske kisline iz različnih virov ali molekulo nukleinske kisline iz enega vira, ki je bil obdelan z inženiringom. Se pravi, da je molekula nukleinske kisline rekombinantna, ker npr. vsebuje zaporedje nukleotidov sesalskega gena IFN-p2 in selektabilni označevalski gen. Molekula je tudi rekombinantna, kadar vsebuje zaporedja iz istega gena, vendar so le-ta razvrščene na način, ki se ne pojavlja v naravi, se pravi nenaravno pojavljajoča se razporeditev.

Homologna rekombinacija se nanaša na postopek, v katerem se molekule nukleinske kisline s podobno genetsko informacijo razvrstijo ena zraven druge in izmenjajo nukleotidne verige. Zaporedje nukleotidov rekombinantne nukleinske kisline, ki je učinkovita za dosego homologne rekombinacija na vnaprej določenem položaju ciljne nukleinske kisline, zato določa zaporedje nukleotidov, kar poenostavi izmenjavo nukleotidnih verig med molekulo rekombinantne nukleinske kisline na določenem položaju ciljažnega gena, npr. mišji gen IFN-p2. Učinkovito zaporedje nukleotidov na splošno vsebuje zaporedje nukleotidov, ki je komplementarno želeni ciljni molekuli nukleinske kisline (npr. gensko mesto, ki ga modificiramo) in pospešuje paritev nukleotidnih baz. Uporabimo lahko katerokoli zaporedje nukleotidov, v kolikor olajša homologno rekombinacijo na določenem in izbranem položaju vzdolž molekule ciljne nukleinske kisline. Na splošno vlada eksponentna odvisnost ciljne učinkovitosti na obseg ali dolžino homologije med ciljnim vektorjem in ciljnim lokusom. Izbira in uporaba zaporedij, učinkovitih za homologno rekombinacijo, sta opisani npr. v Deng and

-2828

Capecchi, Mol. Celi. Biol., 12:3365-3371, 1992; Bollag et al., Annu. Rev. Genet., 23:199-225,1989; VValdman and Liskay, Mol. Celi. Biol., 8:5350-5357, 1988.

En vidik tega izuma je potlačiti afi funkcionalno prekiniti ekspresijo gena IFN-P2. Fraze prekinitev gena, genska prekinitev, potlačenje ekspresije, gensko potlačenje, funkcionalna inaktivacija gena, ali funkcionalna genska inaktivacija se nanašajo na modifikacijo gena na način, ki zmanjša ali prepreči ekspresijo tega gena in/ali njegovega produkta v celici. Ekspresijo genskega produkta lahko popolnoma ali samo delno potlačimo, npr. zmanjšamo za 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ali več. Funkcionalno potlačeni gen, npr. funkcionalno potlačeni gen lFN-p2 vključuje modificirani gen, ki izraža prisekani polipeptid, ki ima manj kot celotno kodirno zaporedje gena divjega tipa. Tak gen je prikazan na sl. 1. Gen lahko tudi funkcijsko potlačimo, tako da vplivamo na njegovo strukturo mRNA tako, da ustvarimo neprenosljivo sporočilo, npr. premik okvira, zmanjšana stabilnost, itd.

V skladu s tem izumom modificiramo gen IFN-p2 na tak način, ki je učinkovit za raztrganje ekspresije ustreznega genskega produkta. Tako npr. funkcionalno raztrgani rekombinantni gen IFN-32 ne izraža funkcionalnega polipeptida IFN-βζ ali izraža funkcionalni polipeptid IFN-βζ na nivojih, ki so nižji od nivojev divjih tipov IFN-p2-ja, npr. zmanjšani za 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ali več. Z nefunkcionalnim ali funkcionalno inaktivnim polipeptidom IFN-02 imamo v mislih, da npr. IFN-P2 nima ene ali več svojih bioaktivnosti. Gen lahko modificiramo na kateremkoli učinkovitem položaju, npr. ojačevalcih, promotorjih, regulatornih območjih, nekodirnih zaporedjih, kodirnih zaporedjih, intronih, eksonih, itd., tako da zmanjšamo ali preprečimo ekspresijo tega gena v celici. Vstavitev v območje gena IFN-32, npr. glodavskega gena IFN-p2, lahko dosežemo s homologno rekombinacijo. Molekulo rekombinantne nukleinske kisline, ki vsebuje območja genske homologije in zaporedje nukleotidov, ki kodira za selektivni označevalski gen, vstavimo v promotor in/ali kodirno območje in/ali nekodirna območja IFN-p2-ja, pri čemer je ekspresija gena funkcionalno raztrgana. Ko potem ta izbiti konstrukt vstavimo v celico, se lahko ta konstrukt integrira v genomsko DNA. Tako bodo potomci celice izražali samo funkcionalno kopijo gena; druga kopija ne bo več izražala genskega produkta ali pa ga bo izražala na zmanjšani stopnji, saj je endogeno zaporedje nukleotidov gena sedaj prekinjeno z vstavljenim zaporedjem nukleotidov. Po želji lahko funkcionalni gen inaktiviramo v drugem analognem koraku.

-2929

Zaporedje nukleotidov, ki je učinkovito za homologno rekombinacijo, lahko operabilno vežemo na zaporedje nukleotidov, prednostno selektabilno označevalsko zaporedje nukleotidov ali gen, ki ga bomo vstavili v želeno ciljno nukleinsko kislino.

Rekombinantno nukleinsko kislino prednostno vstavimo v celico s kromosomsko DNA, ki vsebuje endogeni gen, ki ga je treba izbiti. V celici se lahko molekula rekombinantne nukleinske kisline integrira s homologno rekombinacijo s celično DNA na takem položaju, da prepreči ali prekine transkripcijo gena, ki ga je treba izbiti. Taka vstavitev se običajno pojavi s homologno rekombinacijo (se pravi območja ciljnega vektorja, ki so homologna ali komplimentarna zaporedjem endogene DNA, med seboj hibridizirajo, ko ciljni vektor vstavimo v celico; ta območja se lahko potem rekombinirajo, tako da je del ciljnega vektorja vključen v ustrezni položaj endogene DNA. Kot smo že pisali, lahko eno ali več zaporedij nukleotidov vstavimo v gen, da potlačimo njegovo ekspresijo. Želeno je, da določimo prisotnost vstavljenega zaporedja nukleotidov v genu.To lahko dosežemo na različne načine, vključno s hibridizacijo nukleinske kisline, vezavo protitelesa na epitop, ki ga je kodirala vstavljena nukleinska kislina, ali z izbiro za fenotip vstavljenega zaporedja. Skladno s tem lahko tako vstavljeno zaporedje nukleotidov imenujemo kot prvo selektabilno zaporedje nukleotidov. Prvo selektabilno zaporedje nukleotidov prednostno prenaša prvo izbirno značilnost na celico, v kateri je prisotno. Z izrazom izbirna značilnost mislimo npr. značilnost, ki je izražena v celici in ki jo lahko izberemo pred drugo ali drugimi značilnostmi. Selektabilno zaporedje nukleotidov, znano tudi kot selektabilni označevalski gen, je lahko molekula katerekoli nukleinske kisline, ki jo lahko odkrijemo in/ali testiramo, potem ko je bila vključena v genomsko DNA sesalca. Izbirna značilnost je lahko pozitivna značilnost, t.j. značilnost, ki jo izražajo ali pridobijo celice, in prisotnost katere omogoča izbiro takih celic. Pozitivna izbirna značilnost lahko omogoča preživetje celice ali organizma, npr, antibiotična odpornost, rezistenca na ouabain (gen za ouabain-rezistentni natrij/kalij ATPaza protein). Primeri pozitivnih izbirnih značilnosti in ustrezno izbirno sredstvo vključujejo npr. Neo in G418 ali kenomicin; Hyg in higromicin, hisD in histidinol; Gpt in ksantin; Ble in bleomicin; Hprt in hipoksantin. Glej npr. U.S. pat št. 5,464,764 in Capecchi, Science, 244:1288-1292, 1989. Prisotnost selektabilnega gena v ciljanem zaporedju lahko tudi določimo z uporabo vezavnih ligandov, ki razpoznajo produkt selektabilnega gena, lahko npr. uporabimo protitelo za identificiranje polipeptidnega produkta, ki gaje kodiral selektabilni gen, lahko uporabimo ustrezni ligand, da identificiramo ekspresijo

-3030 receptorskega polipeptida, ki ga je kodiral selektabilni gen, ali pa testitamo ekspresijo encima, ki ga je kodiral selektabilni gen. Prednostno selektabilni označevalski gen kodira polipeptid, ki se običajno ne pojavlja v sesalcu.

Selektabilni označevalski gen lahko operabilno vežemo na njegov lastni promotor ali na drug promotor iz kateregakoli vira, ki bo aktiven in ga lahko zlahka aktiviramo v celici, v katero ga vstavimo. Ni pa nujno, da ima selektabilni označevalski gen pripojen svoj lastni promotor, saj se lahko transkribira z uporabo promotorja gena, v katerega je vstavljen. Selektabilni označevalski gen lahko vsebuje eno ali več zaporedij, da poganja in/ali pomaga v njegovi ekspresiji, vključno npr. zaporedja za razpoznavanje ribosomov, zaporedja ojačevalcev, zaporedij, ki prenašajo stabilnost na polipeptid ali RNA 'm/ali zaporedje poliA, pripojeno na njen konec 3' za zaključek transkripcije gena.

Pozitivni selektabilni označevalec lajša izbiro za rekombinante, v katere se je integriral pozitivni selektabilni označevalec v ciljno nukleinsko kislino s homologno rekombinacijo. Genski ciljni vektor po izumu lahko nadalje vsebuje drugo izbirno značilnost, ki jo kodira drugi selektabilni gen, ki dalje pomaga pri izbiri pravilno ciljanih rekombinant. Negativni izbirni označevalec dovoljuje izbiro s celicami, v katerih se je pojavila samo nehomologna rekombinacija. Po enem prednostnem izvedbenem primeru drugi selektabilni označevalski gen prenaša negativno izbirno značilnost na celico, v katero je bil vstavljen. Tako negativno izbirno značilnost lahko uredimo v ciljnem vektorju tako, da ga lahko uporabljamo za diskriminiranje med naključnimi integracijskimi dogodki in homologno rekombinacijo. Z izrazom negativni izbor imamo v mislih izbirno značilnost, ki, kadar jo pridobi celica, ima za rezultat njeno izgubo sposobnosti za življenje (t.j. je smrtonosna za celico). Nukleozidni analog, ganciklovir, ki je prednostno toksičen za celice, ki izražajo HSV tk (herpes simplex virus thymidine kinase), se lahko uporablja kot negativno izbirno sredstvo, saj izbira za celice, ki nimajo integriranega selektabilnega označevalca za HSV tk. FIAU (1,2-deoksi-2-fluoro-.alfa.-darabinofuransil-5-joduracil) se lahko tudi uporabljajo kot izbirno sredstvo za izbiranje za celice, ki nimajo HSV tk. Drugi negativni selektabilni označevalci se lahko uporabljajo analogno. Primeri negativnih izbirnih značilnosti in ustrezna timidin kinaza (HSV tk) in aciklovir, ganciklovir ali FIAU; Hprt in 6-tiogvanin ali 6-tioksantin; difteria toksin; ricin toksin; citosin deaminaza in 5-fluorocitosin.

Negativni selektabilni označevalec je tipično razporejen na genskem ciljnem vektorju 5' ali 3' do rekombinogenskih homolognih območij, tako da nadomestna rekmbinacija z

-3131 dvojnim prekrižanjem homolognih območjih prenaša pozitivni selektabilni označevalec na vnaprej določeno lokacijo na ciljni nukleinski kislini, ampak ne prenaša negativnega selektabilnega označevalca. Tk caseta se lahko nahaja npr. na 3' koncu glodavskega gena okrog 150 parov baz od 3' stop kodona. V ciljnem vektorju se lahko uporablja več kot en negativni selektabilni označevalec. Pozicioniranje npr. dveh negativnih izbirnih vektorjev na koncih 5' in 3' ciljnega vektorja nadalje poveča izbiro za ciljne celice, ki so se naključno integrirale vektor. Naključna integracija ima včasih za rezultat prerazporeditev vektorja, kar ima za rezultat pokončanje celega ali dela negativnega selektabilnega označevalca pred naključno integracijo. Ko pride do tega, ne moremo uporabiti negativne izbire za eliminiranje tistih celic, ki so se inkorporirale v ciljni vektor, ampak z naključno integracijo in ne s homologno rekombinacijo. Uporaba več kot enega negativnega selektabilnega označevalca bistveno poveča verjetnost, da bo imela naključna integracija za rezultat vstavitev vsaj enega negativno selektabilnega označevalca. Za take namene so lahko negativni selektabilni označevalci enaki ali različni.

Uporaba sheme pozitivno-negativne izbire zmanjša ozadje celic, ki imajo nepravilno vstavljena ciljna zaporedja konstrukta. Pozitivno-negativna izbira tipično vključuje izbiro dveh aktivnih selektabilnih označevalcev: (1) pozitivni selektabilni označevalec (npr. neo), ki je lahko stabilno izražen po naključni integraciji ali homolognem ciljanju in (2) negativni selektabilni označevalec (npr. tk), ki je lahko stabilno izražen samo po naključni integraciji. S kombiniranjem pozitivnega in negativnega izbora lahko učinkovito dobimo gostiteljske celice, ki imajo pravilno ciljani homologni rekombinantni dogodek. Sheme pozitivno-negativne izbire so opisane npr. v U S. pat. št. 5,464,764; WO 94/06908. Priznano pa je, da eden ali več negativnih selektabilnih označevalcev ni potrebnih za izvajanje tega izuma, npr. produciranje transgene živali, v kateri je gen IFN-P2 funkcionalno inaktiviran ali prekinjen.

Molekula rekombinantne nukleinske kisline po izumu lahko vsebuje tudi cel vektor ali del njega. Vektor je npr. molekula nukleinske kisline, ki se lahko avtonomno replicira v gostiteljski celici, npr. vsebuje vir replikacije. Vektorji so lahko koristni za izvajanje manipulacij, za propagiranje in/ali pridobivanje velikih količin rekombinantnih molekul v želenem gostitelju. Izkušen strokovnjak lahko izbere vektor glede na želeni namen, npr. za propagiranje rekombinantne molekule v celicah bakerij, kvasovk, insektov ali sesalcev. Naslednji vektorji so podani s primerom. Bakterijski: pQE70, pQE60, pQE-9

-3232 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, ΦΧ174, pBK Phagemid, pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A (Stratagene); Bluescript KS⁺II (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Evkariontski: PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG, pSVL (Pharmacia). Lahko pa uporabimo katerikoli drugi vektor npr. plazmide, viruse ali njihove dele, v kolikor so sposobni podvojevanja in življenja v želenem gostitelju. Vektor lahko vsebuje tudi zaporedja, ki omogočajo njegovo podvojevanje v gostitelju, katerega genom naj bi modificirali. Uporaba takega vektorja lahko razširi trajanje interakcije, med katero se lahko pojavi rekombinacija, s čimer se poveča učinkovitost ciljanja. Primer genskega ciljanega vektorja, ki se lahko uporablja po tem izumu, je opisan v Molecular Bioiogy, ed. Ausubel, F.M., et al., enota 9.16, Sl. 9.16.1 (pNTK).

Skladno z enim vidikom tega izuma lahko funkcijo gena IFN-32 prekinemo ali izbijemo z vstavitvijo eksogenega ali heterolognega zaporedja, ki prekine njegovo funkcijo. Eksogeno ali heterologno zaporedje lahko npr. vstavimo v območje gena IFN-βζ pred njegov prvi startni kodon. Zaporedje nukleotidov, ki kodira za selektabilno značilnost, lahko vstavimo v gen ΙΕΝ-β2 na tak način s homologno rekombinacijo, tako da je operabilno vezan na endogeni promotor gena IFN-p2. Po integraciji selektabilnega označevalskega gena v želeni vnaprej določen položaj gena ΙΡΝ-β2 usmerja ekspresijo selektabilne značilnosti endogeni promotor gena IFN-32 in omogoča njegovo odkrivanje v tiste celice, v katere se je integriral.

Selektabilni označevalski gen lahko integriramo tudi na navzdolnjih položajih 3' do prvega startnega kodona gena ΙΡΝ-β2. Gen ΙΡΝ-β2 lahko integriramo izven bralnega okvira ali v bralnem okviru s polipeptidom IFN-p2, tako da naredimo fuzijski polipeptid, pri čemer je fuzijski polipeptid manj aktiven kot normalen produkt. Z odkrivanjem samo tistih celic, ki izražajo značilnost, lahko izberemo celice, ki vsebujejo integrirano zaporedje na želenem položaju. Primeren način za izvajanje take selekcije je uporaba antibiotične rezistence. V spodaj predstavljenih primerih smo uporabili kot selektabilno značilnost neomicinsko rezistenco. Celice, ki zrastejo v prisotnosti toksične koncentracije neomicina, bodo normalno umrle. Pridobivanje gena, rezistentnega na neomicin s homologno rekombinacijo, reši celice pred smrtonosnim učinkom, s čimer se olajša njihov izbor.

-3333

Gen IFN-P2 je izbit ali funkcijsko prekinjen z integracijskim dogodkom. Vstavitev selektabilnega gena pred kodirno zaporedje IFN-p2-ja ga učinkovito izolira pred promotorskim zaporedjem, s čimer onemogoči njegovo ekspresijo. Če selektabilni gen vsebuje transkripcijski terminator, potem se bo transkripcija gena, ki uporablja promotor IFN-p2, končala takoj po njem in bo imela redko za rezultat transkripcijo kodirnega zaporedje IFN-p2-ja. Gen IFN-p2 lahko izbijemo tudi z delecijo brez nadomestitve, kot je pozicijsko usmerjena delecija dela gena. Deletirana območja so lahko kodirna območja regulirnih območij gena.

Gen IFN-βΣ lahko modificiramo na kateremkkoli želenem položaju. Modificiramo ga lahko tako, da se producira prisekani polipeptid IFN-P2, ki ima eno ali več aktivnosti celotnega polipeptida IFN-p2. Po želji lahko vstavitev(-ve) odstranimo iz rekombinantnega gena. V primeru je neomicinska kaseta zamenjala eksone mišjega gena IFN-P2, da bi ga funkcionalno inaktivirala. Neomicinsko kaseto lahko potem odstranimo iz gena IFN-P2 npr. z uporabo sistema rekombinaze. Usmerjen rekombinacijski sistem Cre-Ιοχ je zlasti koristen za odstranjevanje zaporedij iz rekombinantnega gena. Z uporabo sistema Cre-Ιοχ integriramo mesta prepoznavanja rekombinaze v kromosom skupaj s selektabilnim genom, da poenostavimo njegovo kasnejšo odstranitev. Glede smernic o sistemih ekscizije rekombinaze glej npr. U.S. pat. št. 5,626,159, 5,527,695 in 5,434,066. Glej tudi Orban, et al., Tissue-and Site-Specific DNA Recombination in Transgenic Mice, Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6861-6865, 1992; 0'Gorman, S., et al., Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in Mammalian Celiš, Science, 251:1351-1355, 1991; Sauer, B., etal., Crestimulated recombination at ΙοχΡ-Containing DNA sequences placed into the mammalian genome, Nucl. Acids Res., 17(1):147-161, 1989.

Glede drugih vidikov nukleinskih kislin se sklicujemo na standardne učbenike molekularne biologije. Glej npr. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press, 1989; Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995.

-3434

PRIMERI

Ekspresija in čiščenje IFN-p2-ja. Očiščeni IFN-j32 smo primerjali z IFN-pib s SDSPAGE. IFN-p2 ima navidezno molekularno težo 26 kDa, kot smo jo ugotovili s SDSPAGE, medtem ko ima IFN-pib navidezno molekulsko maso okrog 10,5 kDa.

Postopek: začetni oligonukleotidi PCR (5-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3' IN 5-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3') so bili oblikovani tako, da ojačajo kodirno območje IFN-p2-ja, minus signalno zaporedje, iz preparata človeške genomske DNA za naknadno ligacijo v IPTG inducibilni pet5a ekspresijski vektor (Promega Corp). Po indukciji smo IFN-P2 izolirali iz E. coli inkluzijskih telesc in ga solubilizirali z uporabo Zvvittergent 3-14 (Russell-Harde et al., J. Interferon Cytokine Res., 15, 31-37, 1995). Očiščenje IFN-p2-ja iz solubiliziranih inkluzijskih telesc smo dosegli z uporabo ionsko-izmenjevalne kromatografije, ki ji je sledila kromatografija z ločevanjem po velikosti. Liso 26 kDa, ki je ustrezala IFN-p2-ju, smo izpirali iz gela SDS-PAGE in jo analizirali z N-terminalnim določanjem zaporedja proteinov. Prvih 10 aminokislin je ustrezalo tistim, ki smo jih pričakovali za IFN-P2. Poleg tega smo opravili tudi digestijo s cianogen bromidom, kar je dalo več delcev, ki smo jim določili zaporedje in ugotovili, da imajo predvidena zaporedja proteinov, kar je kazalo na to, da je bil celoten protein uspešno eksprimiran in očiščen.

Aktivacija poročevalskega gena ISRE-luciferaze odvisnega od interferona z IFNp2-jem. Celice T98G smo transfektirali s plazmidom, ki je vseboval konstrukt ISREluciferaza in stabilni klon, ki je izražal, da je konstrukt izoliran. Celice 3X10⁴ smo dali na ploščo preko noči in dodali očiščeni IFN-P2 v navedenih koncentracijah. Po štirih urah smo celice testirali na aktivnost luciferaze z uporabo opreme za poskus luciferaze, kot je opisana v protokolu opreme (Promega Cat. #E1501). IFN-βζ je specifično aktiviral poročevalski gen ISRE, odvisen od interferona. Glej sl. 6. Pri uporabi tega poskusa je IFN-32 pokazal funkcionalne lastnosti podobne tistim, kijih ima IFN-pib.

Inhibicija vezave IFN-p2-ja na človeški receptor interferona tipa I z anti-IFN-p2 mišjim poliklonskim protitelesom. Peptid, ki je ustrezal enkratnemu C-terminalnemu območju IFN-p2-ja (KLSKQGRPLNDMKQELTTEFR) smo sintetizirali, spojili s KLH in ga uporabili za imuniziranje Swiss-Webstrovih miši štirikrat v dveh mesecih. Po imunizaciji smo zbrali serume in izkazalo se je, da vsebujejo protitelesa, ki specifično

-3535 vežejo IFN-P2. Nadalje so anti-IFN-p2 serumi blokirali indukcijo od IFN odvisnega ISREluciferaza poročevalskega gena z IFN-P2. S tem poskusom je IFN-P2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, kijih ima IFN-βΙ b.

Postopek: Celice 3X10⁴ smo dali na ploščo preko noči in dodajali 20 ng IFN-p2-ja, bodisi v prisotnosti anti-IFN-p2 serumov bodisi normalnih mišjih serumov, štiri ure in potem testirali prisotnost inducirane liciferaze z uporabo opreme za testiranje z luciferazo in standardnega protokola iz Promega Corp. Glej sl. 7.

Učinek IFN-pib-ja in IFN-p2-ja na proliferacijo človeških celic HT1080. IFN-βΙ b in IFN-P2 imata protiproliferativni učinek tako v celicah HT1080 in v celicah HT1080IFNAR2c. To je bilo jasno iz panelov poskusov Alamar Blue (sl. 8A in B) pa tudi iz vizualnega pregleda. Antiproliferacijski učinek je bil soodnosen s povečanjem števila receptorjev, kar je prikazal povečan učinek v celicah HT1080IFNAR2c, ki imajo petkratno število vezavnih mest IFN-ja v primerjavi s celicami HT1080. S tem poskusom je ΙΕΝ-β2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN-pib.

Postopek: Celice HT1080IFNAR2c so celice HT1080, ki prekomerno izražajo IFNAR2c. Te celice imajo petkrat večje število vezavnih mest za IFN kot prvotne celice HT1080. 25X10⁴ celic/ml smo pustili na plošči preko noči in jih ali pustili nestimulirane ali jih stimulirali z 1 pg/ml, 500 ng/ml, 200 ng/ml ali 50 ng/ml IFN-$2-ja. Celice HT1080 smo stimulirali z 1pg/ml, 500 ng/ml ali 200 ng/mo IFN^2-ja, medtem ko smo celice HT1080IFNAR2c stimulirali s 500 ng/ml, 200 ng/ml ali 50 ng/ml IFN^2-ja.Za merjenje proliferacije celic smo uporabili Alamar Blue (U.S. patent št. 5,501,959) z uporabo standardnega protokola in fotografirali smo vsakič, kije bilo polje reprezentativno. Medij, ki je vseboval interferon, smo dnevno menjavali. Vse obdelave smo delali po trikrat. Glej sl. 8.

Antiproliferativne aktivnosti IFN^2-ja na človeških celicah HT1080, izmerjene s kratkotrajno vključitvijo ³[H] timidina Vključitev ³[H] timidina smo merili 48 ur po adiciji IFN^2-ja (progast stolpec) ali pufrske kontrole (zapolnjen stolpec). Vključitev ³[Hj timidina je predstavljena kot CPM vstavljen/10⁶celic. Podatki (sl. 9) predstavljajo srednje vrednosti n = 3 in variacije med replikah, pri čemer je manj kot 15% IFN^2-ja bistveno zmanjšalo vključitev timidina, npr. za okoli 86%. Pri tem poskusu je ΙΡΝ-β2 prikazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, kijih ima IFN^Ib.

-3636

Postopki; Celice smo posadili (2X10⁴ celic/vdolbino) v ploščo za celično kulturo s 24 vdolbinicami, inkubirali preko noči in potem 24 ur stimulirali z IFN-P2 (1gg/ml). Celice smo potem inkubirali preko noči v popolnem mediju, ki je vseboval ³[H] timidin ([metil³H] timidin, specifična aktivnost = 40 - 60 Ci/mmol, Amersham Life Science) in jih pobrali po 24 urah. Celice smo oprali s fosfatnim pufrom s soljo (PBS), nato z 10odstotno trikloroocetno (TCA) kislino in 100-odstotnim etanolom. Pred določanjem inkorporacije radioaktivnosti smo celice solubilizirali v 1M kalijevega hidroksida in pomešali s scintilacijsko tekočino Ecolume.

Aktivacija receptorja IFN tipa I z IFN-p2-jem. IFN-P2 je induciral tirozin fosforilacijo receptorske verige IFNAR2c Človeškega receptorja IFN tipa I. Celice so bile ali nestimulirane (nestim.) ali stimulirane z IFN-a2, IFN-pib ali IFN-p2 (1000 - 2000 relativnih enot/10⁶ celic 15 minut). Fosforilacijo smo opazovali v prisotnosti, a ne v odsotnosti interferona. Pri tem poskusu je IFN-βΣ prikazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN-pib.

Postopki: Daudijeve celice, ki izražajo IFNAR2c (5X10⁷ celic) smo solubilizirali v liza pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, z vsebnostjo 1-odstotnega Nonidet-40 (v/v) (NP-40), 150 mM natrijevega klorida, 1 mM EDTA, 2,5-odstotni glicerol (v/v), 1,0 mM natrijev fluorid, 1,0 mM natrijev ortovanadat, 1,0 mM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF), 0,5 gg/ml leupeptin in 5,0 gg/ml tripsin inhibitor) pri 4°C 30 minut in netopni material odstranili s centrifugiranjem. Za imunoprecipitacijo IFNAR2c-ja smo vsakemu vzorcu dodali protiserume (+) ali negativno kontrolo protiserumov (-), jih inkubirali preko noči, zmešali s Protein-G agarozo (Boehringer-Mannheim) in razkrojili s SDS-PAGE (10-odstotni Novex geli). Proteine smo prenesli v poliviniliden difluorid filtre (Pro-Blot) in jih inkubirali v blokirnem pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, ki je vseboval 0,1-odstotni Tween 20 (v/v), 150 mM natrijevega klorida, 1 mM EDTA, 1,0 mM natrijevega fluorida, 1,0 mM natrijevega ortovanadata, 1,0 mM PMSF, 0,5 gg/ml leupeptina in 5,0 μg/ml tripsin inhibitor) preko noči pri 4°C, inkubirali z antifosfotirozin protitelesom (ab ΡΥ99, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA) ter oprali v blokirnem pufru. Po pranju smo membrano inkubirali s specifičnim drugim protitelesom (razredčenje 1:1000), spojenim s hrenovo peroksidazo (HRP) 1 uro, oprali trikrat v blokirnem pufru ter razvili s postopkom kemiluminiscentne detekcije (Pierce).

-3737

Aktivacija STAT1 in STAT2 v Daudijevih celicah s stimulacijo z IFN-[32-ja.

Daudijeve celice smo stimulirali z IFN-pib-jem ali IFN-32-jem (1000 - 2000 relativnih enot/10⁶ celic) 15 minut, solubilizirali v liza pufru in STAT1 ter STAT2 imunoprecipitirali. Po imunoprecipitaciji smo odkrili tirozin fosforilacijo STAT1-ja in STAT2-ja z uporabo fosfotirozinu specifičnega protitelesa za oba tipa IFN-ja. Pri tem poskusu je IFN-βζ prikazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN-pib.

Postopki: Daudijeve celice (1X10⁷ celic) smo solubilizirali v liza pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, z vsebnostjo 1-odstotnega Nonidet-40 (v/v) (NP-40), 150 mM natrijevega klorida, 1 mM EDTA, 2,5-odstotni glicerol (v/v), 1,0 mM natrijev fluorid, 1,0 mM natrijev ortovanadat, 1,0 mM fenilmetilsulfonil fluoride (PMSF), 0,5 pg/ml leupeptin in 5,0 pg/ml tripsin inhibitor) pri 4°C 30 minut in netopni material odstranili s centrifugiranjem. Za imunoprecipitacijo smo vsakemu vzorcu dodali protitelesa STAT1 in 2 (Stati p91 oz. Stat2 (C-20) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA) jih inkubirali preko noči, zmešali s Protein-G agarozo (Boehringer-Mannheim) in razkrojili s SDS-PAGE (10odstotni Novex geli). Proteine smo prenesli v poliviniliden difluorid filtre (Pro-Blot) in jih inkubirali v blokirnem pufru (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, ki je vseboval 0,1-odstotni Tvveen 20 (v/v), 150 mM natrijevega klorida, 1 mM EDTA, 1,0 mM natrijevega fluorida, 1,0 mM natrijevega ortovanadata, 1,0 mM PMSF, 0,5 pg/ml leupeptina in 5,0 pg/ml tripsin inhibitor) preko noči pri 4°C, inkubirali z antifosfotirozin protitelesom (ΡΥ99, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA) ter oprali v blokirnem pufru. Po pranju smo membrano inkubirali s specifičnim drugim protitelesom (razredčenje 1:1000), spojenim s hrenovo peroksidazo (HRP) 1 uro, oprali trikrat v blokirnem pufru ter razvili s postopkom kemiluminiscentne detekcije (Pierce).

Pritivirusna aktivnost IFN-p2-ja in IFN-βΙ b-ja. Človeške celice WISH smo stimulirali z IFN-βΙ b ali ΙΕΝ-β2, čemur je sledila infekcija z virusom vezikulamega stomatitisa (VSV). Virusni citopatski učinek (Viral Cytopathic Effect - CPE) smo merili z redoksno barvo Alamar Blue. Enote protivirusne aktivnosti, ki so ustrezale IFN-p1b-ju so se izrisale vzdolž osi X. Ugotovili smo, da je specifična protivirusna aktivnost IFN (52-ja 4,0 8,0X10⁶ internacionalnih enot (I.E.) na mg. Glej sl. 10. Pri tem poskusu je IFN-p2 prikazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, kijih ima IFN^Ib.

-3838

Postopki: Celice WISH (30.000 celic/vdolbino) smo razdelili na ploščo v Falcon mikrotitrske plošče Falcon s 96 vdolbinicami in jih pustili preko noči, da so se prijele. Celice smo stimulirali z IFN-pib-jem (1000 I.E. v prvi vdolbini; specifična aktivnost = 2,5X10⁷ I.E./ml) ali IFN-p2-jem (1 pg v prvi vdolbini), razredčili 1:1 po vsej plošči, 6 ur, potem smo dodajali VSV (7x10³ plak-formirajočih enot /vdolbino (PFU) 18 ur. Po inkubaciji smo medij odstranili in v vsako vdolbino dodali 100 μΙ Alamar Blue (Biosource International) (razredčitev 1:10 dobavljene založne raztopine v mediju). Po 30-60minutni inkubaciji pri 37°C smo določili CPE z merjenjem absorbcije pri 600 nm.

IFN-βΣ tekmuje z IFN-a2 za vezavo na receptor IFN tipa I na celicah HT1080. 1X10⁶ celic HT1080 smo inkubirali 90 minut s 15ng/ml ³²P-označenim IFN-a2-jem (Pestka Biomedical #51100) v popolnem mediju celične kulture (10-odstotni FBS, DMEM). Po inkubaciji smo celice dvakrat oprali s celičnim kulturnim medijem, solubilizirali v 1odstotnem SIS, zmešali s scintilacijsko tekočino in prešteli. 15 μg/ml IFN-p2-ja je tekmovalo z več kot 90% označenih IFN-p2-jev, vezanih na celice HT1080. Poskuse smo ponovili trikrat in standardni odkloni so mili manjši od 10%. Glej sl. 11.

Kompetitiva vezava IFN-p2-ja na receptor IFN tipa I na Daudijevih celicah.

Vezavne poskuse kompetitivnih ligandov smo opravili v fosforilirani obliki IFN-a2-ja. Ligand je fosforiliran (specifične aktivnosti 60-62 pCi/pg), kot je opisano v Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271:33165-33168, 1996. Podatke o vezavi smo analizirali tako, kot je opisano v Scatchard, G., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51,660-672, 1965. Nespecifično vezavo smo določili v prisotnosti 100-kratnega presežka neoznačenih IFN-jev. Kompetitivno vezavo različnih IFN-iev smo ugotovili z inkubiranjem naraščajočih količin neoznačenih IFN-a2, IFN-βΙό ali IFN-βΣ s konstantno količino fosforiliranega IFN-a2-ja. Pri tem poskusu je IFN-βΣ prikazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN^Ib.

IFN-p2-specifična sestava receptorja IFN tipa I. IFN-pib je v interakciji z receptorjem IFN tipa I na način, ki se razlikuje od IFN-a2. Pri tem poskusu je ΙΡΝ-β2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN^Ib.

Postopki: Celice (1X10⁸) stimuliramo 15 minut z IFN-ji v koncentraciji 200 I.E./10⁶ celic pri 37°C v inkubatorju s CO2. Po obdelavi celice hitro poberemo pri 4°C s

-3939 centrifugiranjem (300 x g, 3 minute) in takoj solubiliziramo v ledeno hladnem liza pufru (100 mM Tris, pH 8,0, ki vsebuje 150 mM NaCI, 10odstotni glicerol (v/v), 1 odstotni NP40 (v/v), 1 mM ortovanadat, 1 mM natrijev pirofosfat, 1 mM natrijev fluorid, 1 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoride, 5 μg/ml leupeptin in 5 pg/ml tripsin inhibitor). Lizat centrifugiramo (16.000 x g, 30 minut) pri 4°C in supernatant poberemo. Celične lizate imunoprecipitiramo z uporabo protiteles anti-IFNAR1, kot je opisano v Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996, ali IFNAR2.2 zajčjih poliklonskih antiserumov (10 μΙ antiserumov/10⁸ celic), čemur sledi analiza SDS-PAGE z uporabo Novex 8odstotnih Tris-glicin gelov. Po elektroforezi prenesemo proteine v poliviniliden fluoridne (PVDF) filtre (Pro-Blot) in blokiramo z 20 mM Tris, pH 8,0, ki vsebuje 150 mM NaCI, 1 mM ortovanadat, 1 mM natrijev pirofosfat, 1 mM natrijev fluorid, 1 mM PMSF in 0,1odstotni Tween 20 preko noči pri sobni temperaturi. Filtre smo potem inkubirali s protitelesi, usmerjenimi proti IFNAR1 (40H2, 0,1 pg/ml, kot je opisano v Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996) ali IFNAR2 (10 μΙ protiserumov/10 ml blokirnega pufra) 2 do 3 ure pri sobni temperaturi, čemur je sledilo 4 10-minutnih pranj z blokirnim pufrom. Oprani filter smo potem inkubirali z ustreznim protitelesom konjugiranim s hrenovo peroksidazo (HRP) 2 do 3 ure pri sobni temperaturi, ga oprali in razvili s kemiluminiscenco (Enhanced Chemiluminiscence Detection Kit, Pierce). Preferenčna indukcija genov z različnimi razredi interferonov. Interferoni inducirajo prekrivanje, distinktne množice genov v gojenih celicah. Daudijeve celice ali celice HT1080 stimuliramo s človeškim IFN-a2 (1000 1.E./10⁶ celic), IFN-pib (1000 I.E./10⁶ celic), IFN-γ (1000 I.E./10⁶ celic) ali IFN-32 (1000 I.E./10⁶ celic) 17 ur in celotno celično usedlino poberemo in obdelamo z analizo TaqMan®, kot je opisano v TaqMan® Gold RT-PCR Protocol Manual, Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation P/N 402876 Rev. A 1997. Za poskuse z zaščito RNaze za ekspresijo genov smo celice stimulirali in jih pobrali, kot je opisano v Sandhya, R. et al., J. Biol. Chem., 271, 22878-22884, 1996. Geni, prednostno inducirani z IFN-p1a-jem, se normalizirajo na ekspresijo ISG 6-16, gen induciramo enako z IFN-α in IFN-β. Pri tem poskusu je IFN-p2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, kijih ima IFN-[51b.

Antiproliferacija človeških fetalnih astrocitov v odgovoru na ΙΕΝ-β2. Astrociti povzročajo razvoj MS lezij in tukaj prikažemo, da IFN-p2 inhibira proliferacijo človeških

-4040 fetalnih astrocitov in vitro. S tem opazovanjem smo dognali, da lahko IFN-p2 deluje kot rastni regulator za proliferacijo astrocitov in s tem preprečuje tvorbo reaktivnih gliotskih lezij pri MS. Pri tem poskusu je IFN-p2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN-p1b.

Postopki:

(A) Priprava astroglialnih kultur: z astrociti obogatene kulture iz fetalnih človeških možganov smo pripravili iz 2 različnih fetalnih možganov starih 17-22 tednov. Tkivo smo dobili od Advanced Bioscience Resource Inc. po zakonitem terapevtskem abortusu. Po odstranitvi možganske mrene smo možgane secirali in razčlenili v suspenzijo posameznih celic z blagim kapanjem, potem pa smo jih prepasirali skozi sita. Celice smo resuspendirali v Iscovovem mediju, ki je vseboval 10-odstotni FCS v prisotnosti antibiotičnega koktejla, ki je vseboval penicilin, streptomicin ter fungizon in mikroglie smo odstranjevali en teden vsak dan z različnimi adhezijskimi tehnikami. Astrocite smo potem pustili rasti vsaj 8-10 tednov in jih hranili dvakrat na teden. Kontaminirne mikroglie, nevroni in oligodendrocitni progenitorji ne morejo preživeti teh dolgotrajnih pogojev kulture. Na koncu tega obdobja smo kulture pobarvali z GFAP, 04 in nestin protitelesi ter potrdili, da vsebujejo več kot 95% čistih astrocitov. Kulture smo zamrznili v tekočem N₂, preden smo jih uporabili za proliferacijski poskus.

(B) Proliferacijski poskus: astrocite smo vzeli iz zamrznjene zaloge in jih pustili rasti v zgoraj opisanem mediju vsaj dva prehoda, preden smo jih uporabili za proliferacijski poskus. Celice smo porazdelili na plošče s 96 vdolbinicami z 2X10⁴ celic/ml z ali brez 10 ng/ml EGF (R&D Systems). Poskus smo opravili v mediju z nizko vsebnostjo serumov (2-odstotni FCS). Kulture smo obdelali z IFN-(S2 (1 mg/ml zaloge) ati s pufrsko kontrolo v indiciranih razredčenji. Po štirih dnevih inkubacije smo kulture inkubirali preko noči s ³H-timidin in plošče zamrznili, preden smo celice pobrali.

Aktivnost IFN-p2-ja v glodavskih modelih multiple skleroze. Eksperimentalni alergijski encefalomiefitis (EAE) se zelo uporablja kot živalski model za multiplo sklerozo (Swanborg, G., Ciin. Immunol. Immnopathol., 77, 4-13, 1995; Martin, R. and McFarland, H., Springer Semin. Immunopathol., 18, 1-24, 1996). IFN-p1b kaže učinkovitost in vivo pri teh relevantnih MS modelih. Pri teh modelih je IFN-p2 pokazal funkcionalne lastnosti, podobne tistim, ki jih ima IFN-pib.

-4141

Postopki:

(A) Eksperimentalni alergijski encefalomieiitis s pasivnim prenosom pri miših SJL.

Živali in materiali: 8 tednov stare samice miši SJL (Jackson Laboratories); RPMI 1640, z L-glutaminom in 25 mM HEPES, 1X, 0,1 mikron filtrirane (Life Technologies, Cat # 22400-089); FBS, definiran (Hyclone, toplotno inaktivirane, Cat # SH30070.01); MEM raztopina neesencialnih aminokislin, 10 mM, 100Χ (Life Technologies, Cat # 11140050); 2-merkaptoetanol, 1000Χ, 5,5X10'² M v D-PBS (Life Technologies, Cat # 21985023); penicilin/streptomicin, 10.000 U/ug na ml (Bio-Whittaker, Cat # 17-602 E); Hankova uravnovešena solna raztopina, 1X, 0,1 mikrona filtrirana (Life Technologies; Cat #24020-117);

Eksperiment: 8 tednov stare samice miši SJL smo imunizirali z 0,1 ml subkutane (razdeljene med začetkom repa in gornjim križem) injekcije, ki je vsebovala 150 pg proteolipid proteina (PLP) v polnem Freundovem adjuvansu (CFA) z 200 pg M. tuberculosis H37Ra (osnova). 11 dni kasneje smo izrezali aksialne, brahialne in ingvinalne celice limfnih vozlov iz miši ter jih gojili na 6X10⁶ celic/ml v naslednjem mediju (450 ml RPMI 1640 (z L-glutamin plus HEPES) dodaj 50 ml FBS, 0,455 ml 2merkaptoetanola, 5,0 ml Pen/Strep in 5,0 ml neesencialnih amino kislin. Celicam dodamo PLP, da dobimo končno koncentracijo 50 pg/ml. Celice inkubiramo 72 ur pri 37°C, 7-odstotni CO₂. Celice poberemo in operemo dvakrat v HBSS. Viabilnost celic limfnega vozla določimo z izločanjem Trypan Blue. Koncentracijo celic limfnega vozla naravnamo na 4x10⁷ celic na ml. 2X10⁷ celic limfnega vozla vbrizgamo intraperitonealno (volumen odmerka = 0,5 ml) na miš v naivne 8 tednov stare mišje samice SJL. Miši tehtamo in merimo vsak dan. Zdravljenje z IFN-32 in IFN-pib dajemo po potrebi. Klinična ocena (EAE ocena/simptomi); 0/normalna; 1/ohlapen rep; 2/težko postavljanje na noge; 3/nepopolna paraliza enega ali obeh zadnjih udov; 4/popolna paraliza enega ali obeh zadnjih udov; 5/imobilna, umirajoča ali mrtva.

(B) Akutni eksperimentalni alergijski encefalomieiitis pri Levvisovih podganah: Živali in materiali: samice Levvisovih podgan (Charles River), imunizirane v starosti 8 tednov; pripravek s homogenatom hrbtenjače (iz samcev Hartleyevih morskih prašičkov, Simonsen Labs, Gilroy):

500-700-gramske morske prašičke smo evtanazirali s CO₂. Hrbtenjače smo odstranili z ostrimi škarjami za kosti, da smo prerezali vretenca, jih oprali v fiziološki raztopini,

-4242 enkrat prenesli in shranili pri -80°C do dneva uporabe. Hrbtenjače smo potem stehtali in homogenizirali s fiziološko raztopino pri 1 g/ml fiziološke raztopine; antigen emulzija; homogenat hrbtenjač morskih prašičkov smo mešali 1:1 s CFA (Difco, Detroit, Michigan) z 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (zmletih z možnarjem in batom). 0,05 ml smo vbrizgali v vsako blazinico na zadnji nogi v skupni količini 0,1 ml na podgano. Eksperiment: 1. dan smo podgane imunizirali z eno samo bolus injekcijo. Podgane smo tehtali in ocenjevali vsak dan. Zdravljenje z IFN-P2 in IFN-p1b dajemo po potrebi. Klinična ocena (EAE ocena/simptomi): 0/normalna; 1/ohlapen rep; 2/nepopolna paraliza enega ali obeh zadnjih udov; 3/popolna paraliza enega ali obeh zadnjih udov; 5/popolna paraliza zadnjih udov in šibkost enega ali obeh prednjih udov ali umirajoča ali mrtva.

V gornjem opisu se ta izum uporablja v celoti. Prejšnje prednostne specifične izvedbene primere je treba torej obravnavati zgolj kot ilustrativne in ne omejujejo preostalega opisa na kakršenkoli način. Celoten opis vseh prijav, patentov in objav, citiranih zgoraj in v slikah, so s tem vstavljene kot referenca v celoti.

Claims (6)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Farmacevtski pripravek, ki je koristen pri zdravljenju multiple skleroze pri sesalcih, pri čemer ta pripravek vsebuje farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in terapevtsko učinkovito količino humanega polipeptida IFN-p2 s sl. 2, njegov biološko aktivni delec ali njegov biološko aktivni derivat.
2. 2. Farmacevtski pripravek po zahtevku 1, pri čemer je sesalec, ki ga potrebuje, človek.
3. 3. Farmacevtski pripravek ki vsebuje farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in terapevtsko učinkovito količino humanega polipeptida IFN-p2 s sl. 2, njegov biološko aktivni delec ali njegov biološko aktivni derivat za dajanje sesalcu, ki ga potrebuje in ki je koristen pri multipli sklerozi pri sesalcih.
4. 4. Farmacevtski pripravek 3, pri čemer je sesalec, ki ga potrebuje, človek.
5. 5. Farmacevtski pripravek, ki je koristen pri zdravljenju multiple skleroze pri sesalcih, pri čemer ta pripravek vsebuje farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in terapevtsko učinkovito količino humanega polipeptida IFN-p2, njegov biološko aktivni delec ali njegov biološko aktivni derivat.
6. 6. Farmacevtski pripravek ki vsebuje farmacevtsko sprejemljiv ekscipient in terapevtsko učinkovito količino humanega polipeptida IFN-P2, njegov biološko aktivni delec ali njegov biološko aktivni derivat za dajanje sesalcu, ki ga potrebuje in ki je koristen pri multipli sklerozi pri sesalcih.