CZ20024094A3

CZ20024094A3 - Farmaceutický přípravek pro léčení sclerosis multiplex obsahující nový interferon

Info

Publication number: CZ20024094A3
Application number: CZ20024094A
Authority: CZ
Inventors: Edward M. Croze; Daryl Faulds; T. Charis Wagner
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2001-06-18
Publication date: 2003-05-14
Also published as: CN1436086A; SI21080A; MXPA02012308A; RU2003100517A; LT2002123A; BG107370A; IL152996A0; US20020025304A1; NO20025964L; EE200200693A; SK17612002A3; KR20030009529A; EP1289541A2; NO20025964D0; CA2413077A1; JP2004505021A; HUP0300787A2; NZ522849A; PL359562A1; WO2001095929A3

Description

léčení sclerosis multiplex

Farmaceutický přípravek pro obsahující nový interferon

4.	Oblast techniky
ř -	Předkládaný	vynález se	týká nových	sekvencí.
	nukleových kyselin,	které kódují	interferon-beta-2	(IFN-p2)

a odpovídajících polypeptidu. Farmaceutický přípravek podle vynálezu, který obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a terapeuticky účinné množství polypeptidu humánního IFN-p2, jeho biologicky aktivního fragmentu nebo biologicky aktivního derivátu, je užitečný pro léčení sclerosis multiplex (roztroušené sklerózy mozkomíšní) u lidí.

Dosavadní stav techniky

Interferony jsou intercelulární signální proteiny,

které hrají důležitou úlohu	v mnoha	různých	biologických
procesech, jako je například	proliferace buněk	a imunitní
reakce.
Podstata vynálezu
Byly identifikovány	nové	nukleové	kyseliny,

polypeptidové sekvence, a příslušné regulátorové nukleové kyseliny, které kódují interferon-beta-2 (IFN-p2), což je třída intercelulárních signálních polypeptidu, které vykazují mimořádně velké množství biologických účinků, včetně např. protinádorového účinku, antivirového účinku a imunoregulačního « « účinku (Viz např. Cirelli and Tyring, Clin. Immunother. 3, 2787, 1995). Interferonový polypeptid podle předkládaného vynálezu, jeho fragmenty a deriváty, mají jednu nebo více z následujících biologických aktivit, včetně, aniž by však výčet byl omezující, IFN-βΖ bioaktivity IFN-p2-specifické imunogenní aktivity.

Termín IFN-p2 bioaktivita znamená např. funkční účinky jako je změna regulace, protinádorová buněčné membrány, anti-onkogenní aktivita, antivirová aktivita, inhibice buněčného růstu nebo protirůstová aktivita, antiproliferační aktivita, zesílení cytotoxicity lymfocytů, imunoregulační aktivita, indukce nebo inhibice diferenciace cílových buněk, aktivace makrofágů, potlačení (downregulation) onkogenů atd., dále imunologické účinky, jako je například redukce tvorby protilátek, zvýšení komponent buněčné membrány (hlavní histokompatibilní komplex, Fc receptory, (β2— mikroglobulin) , modulace buněčné (tj. buňkami zprostředkované) imunity, zvýšení produkce cytokinů (např. interleukinu), zesílení účinků cytotoxických T lymfocytů, zesílení účinků makrofágů a zesílení účinků žabíječských (natural killing) lymfocytů, dále vazebná aktivita interferonových receptorů, jako je například vazba k receptoru interferonu typu I, zejména jeho řetězci IFNAR2c, a buněčné účinky stimulované vazbou na tyto receptory, a dále také aktivace a/nebo asociace s intracelulárními signálními molekulami, jako je například Jakl, Tyk2, Stati, Stat2, IRS-1, IRS-2, CrkL, Crkli, Vav atd., a další efektory (např. MAPK) po směru (downstream) signální dráhy (viz např. Platanias and Fish, Exp. Hematology, 27:15831592, 1999.

Termínem anti-proliferační aktivita se míní v kontextu předkládaného vynálezu, že IFN-p2 inhibuje buněčný ·· ·· • · růst nebo indukuje apoptózu. To ilustrují připojené příklady, viz také obrázky 8, 9 a 15. Tak například IFN-p2 inhibuje proliferaci astrocytů v mozku. Tato aktivita je využitelná např. při léčení sclerosis multiplex (roztroušené sklerózy mozkomíšní), jelikož právě proliferace astrocytů může vést k zánětům neuronů, které jsou pro tuto nemoc charakteristické. Tím, že inhibuje růst astrocytů redukuje IFN~62 zánět a zmírňuje nemoc. Takže předkládaný vynález se týká také léčení sclerosis multiplex, které spočívá v tom, že se pacientovi podává takové množství IFN-p2, které jsou účinné k inhibici proliferace astrocytů a/nebo redukci zánětů.

Termín IFN-p2-specifická imunogenní aktivita znamená, např. to, že polypeptid vyvolává imunitní reakce, které jsou selektivní nebo alespoň přednostní pro IFN-p2, např. imunitní reakce selektivní pro savčí IFN-p2. Takže stimulace tvorby protilátky, T-lymfocytů, makrofágů, Blymfocytů, dendritických buněk apod. pomocí aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny, kterou tvoří savčí IFN-p2, např. IFN-p2 uvedený na obr. 2, je specifická imunogenní aktivita: Takovéto reakce mohou být měřeny rutinními způsoby.

IFN-32 je kompletní savčí polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je získatelná z přírodního zdroje, a který má jednu nebo více z výše uvedených bioaktivit. může mít např. sekvenci, která je ukázána na obr. 2, a která má otevřený čtecí rámec začínající iniciačním kodonem a končící stop kodonem. Patří sem jak přirozeně se vyskytující normální, přirozeně se vyskytující mutantní a přirozeně se vyskytující polymorfní sekvence, včetně sekvencí s jednonukleotidovými polymorfismy (SNP) atd. K přírodním zdrojům patří např. živé buňky, např. získané z tkáně nebo z celého organizmu, kultivované buněčné linie, včetně linií • · · · primárních buněk a imortalizovaných buněčných linií, biopsie tkání apod.

Předkládaný vynález se týká také fragmentů savčího IFN-p2. Fragmenty jsou výhodně biologicky aktivní fragmenty, termínem biologicky aktivní se míní, že polypeptidový fragment projevuje aktivitu v živém systému nebo se složkami živého systému.

K biologickým aktivitám patří aktivity již výše zmíněné, jako je např. IFN-p2-bioaktivita a IFN-p2-specifická imunogenní aktivita. Fragmenty mohou být připraveny jakýmkoliv požadovaným způsobem, včetně chemické syntézy, metod genového inženýrství, jako produkty štěpení apod. K biologicky aktivním fragmentům IFN-p2 patří polypeptidy, u kterých byla odstraněna nebo modifikována aminokyselinová sekvence buďto na karboxy-konci nebo amino-konci proteinu.

Výhodně jsou nukleové kyseliny a jejich fragmenty ukázané na obr. 12 a 13 vyloučeny. Výhodně jsou také polypeptidy a jejich fragmenty ukázané na obr. 14 vyloučeny. Avšak polypeptidy, které obsahují tyto sekvence nejsou vyloučeny., např. kompletní polypeptid IFN-p2 mající dva nebo více z těchto fragmentů nebo polypeptid mající jeden takový fragment a další aminokyselinovou sekvenci, buďto z IFN-p2 nebo z jiného zdroje.

Předkládaný vynález se dále týká IFN-p2, který má dedukovanou aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2 jako aminokyseliny 1 až 208. Vypočtená relativní molekulová hmotnost tohoto polypeptidu je přibližně 23,000 (daltonů) a predikovaný isoelektrický bod je 8,1. Je to protein stabilní v kyselém prostředí mající relativní molekulovou hmotnost přibližně 26,000 (daltonů) při měření pomocí SDS-PAGE. Neglykosylovaná forma produkovaná v E. coli má relativní • · · · ·· ·· ·· ♦ * · · • · · * * · · · · ··· · · · · ♦ ··· ·· ··· ···· ......

molekulovou hmotnost přibližně 20,500 (daltonů). Viz také příklady níže.

Jak je ukázáno na obr. 2, polypeptid má predikovanou signální sekvenci zahrnující aminokyseliny -1 až -21, dvě potenciální N-glykosylační místa, a sice aminokyseliny 74-77 a 83-86, a cysteinové zbytky v poloze 32, 142 a 154. Vznik disulfidické vazby lze předpovědět pro cysteinové zbytky 32 a 142. Obsahuje helix A (šroubovici A) zahrnující pozice aminokyselin 7-24, helix B v polohách 55-69, helix C v polohách 83-95, helix D v polohách 118-134 a helix E v polohách 143-158.

Zralý ΙΕΝ-β2 označuje takový IFN-p2, který již nemá aminokyseliny -1 až -21, je je ukázáno na obr. 2, a má délku 187 aminokyselin. Má také jedinečnou extenzi 18 aminokyselin na C-konci, při srovnání s další známými typy interferonů. Taková extenze může být využita jako markér pro IFN-p2, jak na úrovni nukleotidové, tak i aminokyselinové sekvence, a může být fúzována s heterologními polypeptidy.

Polypeptid IFN-βζ podle předkládaného vynálezu, např. polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je ukázána na obr. 2, může být analyzován pomocí jakékoliv vhodné metody s cílem identifikovat další strukturní a/nebo funkční domény v polypeptidu, včetně např. membránou procházejících (membránových) úseků nebo hydrofobních úseků. Například polypeptid IFN-βζ může být analyzován pomocí metody popsané v publikaci Kyte and Doolittle, J. Mol.-Biol., 157:105, 1982,

EMBL Protein Prediction, Rošt and Sander, Proteins, 19:55-72, 1994.

Další homology IFN-βζ podle předkládaného vynálezu mohou být získány ze savčích nebo jiných než savčích zdrojů různými metodami. Například hybrídizace s oligonukleotidy

(jako jsou např. primery pro amplifikaci kódujícího úseku 5'-ATG ATT ATC AAG CAC TTC TTT GGA-3' a 5'-CTA CCT CGG GCT TGT AAA CTC TGT-3', primery použité pro expresi v E. colí 5'-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3’ a 5'-GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT, primery pro úplnou známou sekvenci včetně 5' a 3' netranslatovaných úseků genomové sekvence 5'TTT AGG TGA CAC TAT AGA AT-3' a 5'-TAA AAT GGA TAG AAT ATA TAA-3’) může být využita k selekci homologů, např. postupem popsaným v Sambrook et al., Molecular Cloning, Chapter 11, 1989. Takové homology mají různý stupeň nukleotidové a aminokyselinové sekvenční identity a podobnosti s IFN-p2. K vhodným savčím organizmům patří např. hlodavci, jako je myš, potkan nebo křeček, opice, primáti, prase, kráva, kůň, pes, kočka apod. K jiným než savčím organizmům patří např. obratlovci i bezobratlí, danio pruhované (zebra fish, Danio rerio), kuře, Drosophila, C. elegans, Xenopus, kvasinky jako jsou například S. pombe, S. cerevisiae, kroužkovci, prokaryota, rostliny jako Arabidopsis, Crustacea, artemia (žábronožky) , viry a další. Pro výběr oligonukleotidů vhodných pro hybridizaci může být použit účinný způsob. Například IFN-p2-specifické úseky mohou být identifikovány srovnáním IFN-p2 podle vynálezu s dalšími typy IFN~p2 a pak selekcí těch aminokyselinových sekvencí, které se vyskytují výlučně v IFN-(32 podle vynálezu (tj . nekonzervativních čili specifických pro IFN~P2). Viz např. obr. 4 ukazující konzervativní a nekonzervativní úseky srovnáním odlišných typů interferonů. Mohou být vybrány nekonzervativní aminokyselinové sekvence (např. KSLSP) a na základě takových sekvencí pak mohou být navrženy degenerované sondy (viz např. Venkataraman et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 96:3658-3663, 1999). Další specifické (tj. nekonzervativní) a/nebo konzervativní aminokyselinové sekvence mohou být nalezeny rutinními postupy, to to • · např. pomocí prohledávání genových/proteinových databází pomocí souborů počítačových programů BLAST, což je odborníkům známo.

Vynález se týká také IFN-p2-specifických aminokyselinových sekvencí, např. definované aminokyselinové sekvence, která se vyskytuje konkrétně v sekvenci na obr. 2 a 4, ale nevyskytuje se v interferonech jiných typů. Výhodné polypeptidy podle vynálezu jsou úseky velikosti alespoň osm souvislých aminokyselin, např. tedy 9, 10, 12, 15, 20, 21, 22, 25, 30, 40, 50 aminokyselin atd. K takovým polypeptidu patří např. polypeptidy KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRÁNI, AEKLSGT, CLFFVFS, a QGRPLNDMKQELTTEFRSPR, a jejich fragmenty. IFN-βΖspecifické aminokyselinové sekvence nebo motivy mohou být užitečné pro přípravu peptidů sloužících jako antigeny k vyvolání specifické imunitní reakce. Protilátky získané po takové imunizaci pak mohou být použity jako specifická sonda pro savčí protein IFN-32 pro diagnostické nebo výzkumné účely, a také jako expresní markéry.

Jak bylo již uvedeno, polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat různé aminokyselinové sekvence pro IFN-p2 (např. kompletní sekvenci, tj. sekvenci mající start a stop kodon, jak je ukázáno na obr. 1, zralou aminokyselinovou sekvenci, tj. když IFN-p2 polypeptid je tvořen jako prekurzor, který je dále opracován na zralý polypeptid nebo jeho fragmenty. K užitečným fragmentům patři např. fragmenty obsahující nebo sestávající v podstatě z jakékoliv výše zmíněné domény a specifické nebo konzervativní aminokyselinové sekvence jako jsou například sekvence ukázané ne obr. 2 a 4.

Fragmenty polypeptidu IFN-p2 podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány tak, aby měly specifickou biologickou aktivitu, např. antivirovou, imunomodulační nebo • ·♦·· · ♦· ·· ·· _% ········*♦ • · · · · · * • · · · · · · · · ··· ·· · · · * ··· ·· ··· ···· ·· ···· protirůstovou aktivitu apod. Měřeni těchto aktivit lze provádět metodami, které jsou odborníkům známy, tyto peptidy mohou také být identifikovány a připraveny jak bylo popsáno v EP 496 162.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může také mít 100% nebo nižší aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde na obr. 2. Pro srozumitelnost následující diskuse je třeba uvést, že termín sekvenční identita znamená, že stejný nukleotid nebo stejná aminokyselina, které se vyskytují v sekvenci uvedené na obr. 1 a 2, se vyskytují v odpovídající poloze srovnávané sekvence. Polypeptid mající nižší než 100% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 1 a 2 může obsahovat různé substituce přirozeně se vyskytující sekvence, včetně homologních a nehomologních substitucí aminokyselin. Viz níže příklady homologních substitucí aminokyselin. Součet identických a homologních aminokyselinových zbytků dělený celkovým počtem aminokyselinových zbytků v sekvenci, se kterou je polypeptid IFN-£2 srovnán, vyjadřuje procenta sekvenční podobnosti. Pro potřeby výpočtu sekvenční identity a podobnosti mohou být srovnávané sekvence vzájemně přiřazeny a pak vypočtena podobnost jakýmkoliv známým způsobem, algoritmem, počítačovým programem, jako jsou např. FASTA, BLASTA atd.

Polypeptid mající nižší než 100% aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 může mít např. 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 70% nebo až nejméně přibližně 53% sekvenční identitu.

Předkládaný vynález se týká také polypeptidových muteinů IFN-βΣ, t j . jakéhokoliv polypeptidu, který má ♦ ·· · '♦ »· ···* aminokyselinovou sekvenci lišici se sekvenci od aminokyselinové sekvence ziskatelné z přírodních zdrojů (pro vysvětlení: fragment savčího IFN-p2 se v tomto smyslu neliší aminokyselinovou sekvencí od aminokyselinové sekvence přirozeně se vyskytujícího IFN-p2, ačkoliv se tyto sekvence samozřejmě liší počtem aminokyselin). Tedy muteiny polypeptidu IFN-p2 obsahují substituce, inzerce a delece aminokyselin, a to včetně takových aminokyselin, které se v přírodě nevyskytuj i.

Muteiny k aminokyselinové sekvenci IFN~32 podle vynálezu mohou také být připraveny na základě vyhledávání homologie v genových databankách, jako je např. Genbank EMBL. Vyhledávání sekvenční homologie se může uskutečnit různými postupy, včetně algoritmů popsaných v rodině počítačových programů BLAST, Smith-Watermanovým algoritmem apod. Muteiny mohou být vneseny do sekvence pomocí identifikace a přiřazení aminokyselin v doméně, které jsou identické a/nebo homologní mezi polypeptidy, a pak na základě takového porovnání modifikací aminokyselin. Tak například mutein polypeptidu IFNβ2 podle předkládaného vynálezu sdílí sekvenční identitu jinými interferony, jak je ukázáno na obr. 4. konzervativních aminokyselinových úseků těchto polypeptidů může pomoci identifikovat zbytky, jejichž modifikace by mohly vést k redukci, snížení nebo eliminaci biologických aktivit IFN-p2, jako je například receptorová vazebná aktivita pod. Například když porovnání odhalí identické aminokyseliny konzervované ve dvou nebo více doménách, dá se očekávat, že eliminace nebo substituce těchto aminokyselin by mohly mít nepříznivý účinek na biologickou aktivitu.

s různými Srovnáním ♦ 99 9 • * 9 9 9 I

Aminokyselinové substituce se mohou vytvořit také nahrazením aminokyseliny jednou homologní aminokyselinou. Homologní aminokyseliny jsou definovány na základě velikosti postranního řetězce a stupně polarizace, a jsou to: malé nepolární: cystein, prolin, alanin, threonin, pak malé polární: serin, glycin, kyselina asparagová, asparagin, velké polární: kyselina glutamová, glutamin, lysin, arginin, s intermediátní polaritou: tyrosin, histidin, tryptofan, velké nepolární: fenylalanin, methionin, leucin, isoleucin, valin. Homologní kyseliny mohou také být seskupeny následujícím způsobem: nenabité polární R skupiny: glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamin, kyselé aminokyseliny (negativně nabité): asparagová kyselina, glutamová kyselina, bazické aminokyseliny (pozitivně nabité): lysin, arginin, histidin. K homologním aminokyselinám patří také aminokyseliny popsané Dayhoffem v Atlas of Protein Secquence and Structure 5, 1978, a Argosem v EMBO J., 8, 779-785, 1989.

Mohou být připraveny takové muteiny, které nemají žádný účinek na aktivitu nebo které snižují nebo zvyšují aktivitu IFN-p2 oproti divokému typu. Mutace mohou být vytvořeny analogicky k dalším IFN-p2, jako je například fibroblastový interferon (beta-1) a alfa-interferon. Tak například IFN-p2 je složen do charakteristických pěti šroubovicových svazků typických pro interferony: helix A z aminokyselin v polohách 7-24, helix B v polohách 55-69, helix C v polohách 83-95, helix D v polohách 118-134 a helix E v polohách 143-158. Tyto helixy jsou spolu spojeny pomocí úseků se strukturou náhodné spirály nebo kličky, viz obr. 3. Mutace ve šroubovicové struktuře mohou být vytvořeny analogicky k IFN-βΙ (fibroblast), např. jak bylo popsáno v Runkel et al., Biochemistry, 39:2538-2551, 2000. například části helixu A, AB kličky a helixu E se účastní vazby k receptoru. Viz také Piehler and Schreiber, J. Mol. Biol., 294:223-237, 1999.

IFN-βΖ podle předkládaného vynálezu, podobně jako cysteinové 32, 142 zbytky a 154. podobně tvoří fibroblastový interferon, má tři v aminokyselinové sekvenci v polohách

Cysteinové zbytky v polohách 32 a 142 jsou lokalizovány jako cysteinové zbytky, které disulfidickou vazbu u fibroblastového interferonu: analogicky k fibroblastovému interferonu, aminokyselina v poloze 154 může být deletována nebo nahrazena neutrální aminokyselinou, jako je například glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin nebo methionin. Výhodné jsou serin a threonin, jelikož jsou chemicky podobné cysteinu. Odstraněním nepárového cysteinu lze zabránit vytváření nesprávných intramolekulárních nebo intermolekulárních disulfidických vazeb. Viz např. U.S. Patent č. 4,588,585. Mutace mohou také být vytvořeny podle U.S. Patentů č. 4,914,033, č. 5,545,723, a č. 5,580,723. Viz také např. Fish et al., J. Interferon Res., 12:257-66, 1992, Fish et al., J. Interferon Res., 9:97-114, 1989, DiMarco et al., J. Interferon Res., 13:139, 1993, Mitsui et al., Pharmacol.

Therap., 58:93-132, 1993, Wang et al., J. Immunol. 152:705715, 1994.

Vynález se dále týká muteinových nukleových kyselin kódujících muteinové polypeptidy. Tedy předkládaný vynález se týká nukleotidové sekvence uvedené zde na obr. 1, přičemž tato nukleová kyselina kóduje polypeptid, kde jedna nebo více aminokyselin jsou substituovány nebo deletovány, nebo oboje, a polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou má biologickou aktivitu, jako je například zlepšení izolace z bakteriálních buněk při rekombinantní expresi, nebo zvýšená bioaktivita.

• ··» «

Polypeptidový mutein, a jemu odpovídající kódující nukleotidová sekvence, má sekvenci jak je zde uvedena na obr. 2, s výjimkou toho, že jedna nebo více pozic jsou substituovány homologní aminokyselinou, např. se může jednat o 1, 5, 10, 15 nebo 20 substitucí. Jak tyto modifikace ovlivňují zmiňované aktivity může být měřeno výše zmíněnými metodami, nebo metodami popsanými dále nebo metodami, které jsou odborníkům známy.

5,545,723 a (např. U.S.

Jsou známy různé metody zkoumání (testování) aktivity IFN-p2. K použitelným testům patří například: antivirové testy, jako je například CPE (např. U.S. Patent č.

4,914,033, a připojené příklady), vazba receptorů

Patent č. 5,545,723 a připojené příklady), aktivace STÁT (viz např. příklady níže), aktivace IFN-p2-responzivních genů (např. interferonem-stimulovaný responzivní element (ISRE) je operativně spojen s reportérovým genem, jako je například luciferáza, jako je ukázáno v příkladech níže), fosforylace receptorů typu I (viz příklady), antiproliferativní test (U.S. Patent č. 4,914,033, hodnocení schopnosti IFN-p2 inhibovat replikaci buněčné linie, viz příklady), imunomodulační test (U.S. Patent č. 4,914,033), test buněčné cytotoxicity závislé na protilátce, Noronha et al:, J. Neuroimmunol. 46:145-154,

1993, inhibice T-lymfocyty a jejich produkce IFN-gamma (IFN-γ), experimentální alergická encefalomyelitida (EAE) (např. Louboutin et al., Acta Neurol. Scand., 88:97-99, 1993,

Rott et al., Eur. J. Immunol. , 23:1745-1751, 1993, a také příklady níže).

Savčí IFN-βΣ podle předkládaného vynálezu, nebo jeho substituované polypeptidy mohou také kterým patří lipidové glykosylace, kovalentní fragmenty nebo jeho obsahovat různé modifikace, ke modifikace, methylace, fosforylace, «4 »4 • 4 ♦

* modifikace (např. R skupin aminokyselin), substituce, delece nebo adice aminokyselin. Modifikace polypeptidu mohou být uskutečněny různými metodami, rekombinantně, synteticky, chemicky apod.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu (např. kompletní polypeptidy, jejich fragmenty nebo jejich mutace) mohou být využity různými způsoby, např. při testech, jako imunogeny pro protilátky, jak biologicky aktivní činidla (např.

aktivit spojených s IFN-p2 podle vynálezu).

Polypeptid IFN-P2 podle předkládaného vynálezu, jeho derivát nebo fragment, může být kombinován s jednou nebo více strukturními doménami, funkčními doménami, detekovatelnými doménami, antigenními doménami a/nebo požadovanými polypeptidy v takovém uspořádání, které se

Polypeptid těchto vlastností je

Tyto chimérické polypeptidy mohou být připraveny metodami, např. včetně chemické, syntetické, je popsáno níže, jako mající jednu nebo více v přírodě nevyskytuje, chimérický nebo fúzni polypeptid. různými kvazisyntetické a rekombinantní metody. Chimérická nukleová kyselina kódující chimérický polypeptid může obsahovat různé domény nebo požadované polypeptidy v souvislém (např. vícečetné N-koncové domény pro stabilizaci nebo zesílení aktivity) nebo přerušovaném otevřeném čtecím rámci, např. obsahujícím introny, sestřihová místa, enhancery apod.

být připravena různými 5,439,819. Doména nebo jakoukoliv požadovanou

Chimérická nukleová kyselina může metodami, viz např. U.S. Patent č požadovaný polypeptid mohou mít vlastnost, včetně biologické funkce jako je například signální funkce, funkce podporující růst, funkce buněčného směrování, targeting (např. signální sekvence, směrovaci/cílící sekvence, jako je například sekvence pro směrování do w ** ·· * • · * • * * *· «*··

Mfa ·· ♦ • * • · « • · · *·· »· *

··♦· endoplazmatického retikula nebo jádra), a další, strukturní funkce jako je například hydrofobní, hydrofilní, membránou procházející apod., receptor-ligandová funkce a/nebo detekční funkce, např. spojením s enzymem, fluorescenčním polypeptidem nebo zeleným fluorescenčním proteinem (Chalfie et al., Science, 263:80?, 1994, Cheng et al., Nátuře Biotechnology, 14:606, 1996, Levý et al., Nátuře Biotechnology 14:610, 1996), atd. Doména může také být imunoglobulin, např. pro zlepšení stability apod., jako je například těžký nebo lehký řetězec imunoglobulinu a/nebo Fc úsek nebo epitop tag sekvence.

Navíc polypeptid nebo jeho část mohou být použity jako selekční markér, když jsou vneseny do hostitelské buňky. Například nukleová kyselina kódující aminokyselinovou sekvenci podle předkládaného vynálezu může být fúzována ve shodném čtecím rámci s požadovanou kódující sekvencí, která pak účinkuje jako značka pro purifikaci nebo selekční nebo značící účely. Úsek fúze může kódovat štěpné místo pro usnadnění exprese, izolace, purifikace apod.

Polypeptid IFN-p2 podle předkládaného vynálezu nebo jeho fragment mohou být také spojeny s dalšími cytokiny, jako jsou například interferony, čímž se připraví chimérické nebo hybridní IFN-p2. Takový hybridní IFN-p2 může být hybrid mezi interferonem jakékoliv třídy, např. alfa, omega, gamma, epsílon, trofoblastový, fetální, apod. Mohou být připraveny hybridy (a muteiny, jak byly diskutovány výše), které mají sníženou nebo omezenou aktivitu ve srovnání s hybridy, ze kterých byly vytvořeny, např. omezenou aktivitu regulovat buněčný růst, sníženou antivirovou aktivitu nebo imunomodulační aktivitu. Viz např. U.S. Patent č. 4,758,428, kde byly popsány hybridy mezi fibroblastovým interferonem a • · · ·

interferonem alfa, např. s použitím aminokyselin 47-187, 74187, 1-73, atd. z fibroblastového interferonu.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být připraven v expresním systému, např. v systému in vivo, in vitro, v bezbuněčném systému, v rekombinantním systému nebo v buněčné fúzi podle předkládaného vynálezu. Modifikace polypeptidu vnesené takovým systémem zahrnují glykosylace, substituce aminokyselin (např. díky lišícímu se preferenčnímu využití kodonů), opracování polypeptidu jako je například štěpení, štěpení endopeptidázou nebo exopeptidázou, navázání chemické skupiny jako jsou včetně lipidy, fosfáty apod.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být izolován z přírodních zdrojů, transformovaných hostitelských buněk (z kultivačního média nebo z buněk) v oboru známými metodami, např. metodami použitými pro jiné interferony nebo rekombinantní proteiny, včetně extrakce detergentem (jako je např. neiontový detergent, Triton X-100, CHAPS, oktylglukosid, Igepal CA-630), fázové extrakce, n-butanolové extrakce, precipitace síranem amonným nebo ethanolem, kyselé extrakce, aniontové nebo kationtové výměnné chromatografie, chromatografie na fosfocelulóze, Sephadexu, chromatografie s hydrofóbní interakcí, chromatografie na hydroxyapatitu, lektinové chromatografie, gelové elektroforézy, afinitní chromatografie, SDS PAGE, chromatografie na skle s řízenými póry (CPG), afinitní chromatografie s protilátkaou, gelové filtrace, chromatografie na blue sepharose, na fenylagaróze, a CPG a chromatografie s chelatovaným zinkem (viz např. Heine and Billiau, Methods in Enzymology 78 (Part A): 443-456, 1981), chromatografie na Cibacron Blue F3GA-agaróze a HPLC (viz Kenny et al. , Methods in Enzymology, 78 (Part A): 435447, 1981). Metody byly také popsány v publikacích: Innnis and • · · · • ·

McCormick, Methods in Enzymology 119:397-403, 1986, Dembinski and Sullowski, Preparative Biochemistry, 16:175-186, 1986, Friesen et al., Methods in Enzymology 78 (Part A): 4330-435, 1981), Pestka et al. Annu. Rev. Biochem., 56:727-77, 1987. Kroky vhodné k sestavení správné prostorové struktury proteinu (Protein refolding) mohou být také použity, pokud je to nutné, pro dokončení sestavení zralého proteinu.

Předkládaný vynález se týká také nukleových kyselin, jako je například DNA a RNA, kódujících polypeptidy IFN-p2 podle vynálezu, a jejich fragmentů. IFN-p2 nukleová kyselina, nebo její fragment, je nukleová kyselina mající nukleotidovou sekvenci, kterou lze získat z přírodního zdroje. Tudíž zahrnuje přirozeně se vyskytující, normální sekvence, přirozeně se vyskytující mutované sekvence (mutanty), a také přirozeně se vyskytující polymorfní alely (např. SNP) apod. Přírodní zdroje zahrnují např. živé buňky získané z tkáně nebo z celého organizmu, nádoru, kultivované buněčné linie, včetně primárních a imortalizovaných buněčných linií.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může obsahovat kompletní kódující sekvenci, jak je ukázána na obr. 1, její degenerovanou sekvenci nebo její fragmenty. Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může také obsahovat nukleotidovou sekvenci, která je 100% komplementární, jako je např. anti-sense sekvence, k jakékoliv nukleotidové sekvenci výše či níže zmíněné.

Nukleová kyselina, tj . polymer nukleotidů nebo polynukleotid, podle předkládaného vynálezu může být získána z mnoha různých zdrojů. Může být získána z DNA nebo RNA, jako je například polyadenylovaná mRNA, např. izolováním z tkáně, buněk nebo celého organizmu. Nukleová kyselina může být získána přímo z DNA nebo RNA nebo z cDNA knihovny. Nukleová

	17	♦ · · · · • · · • · • · · • · · • · · · ·	• ·· ·· ·· • · · · · ♦ · • · · · · • · · · · · • · · · ♦
kyselina může	být	získána z	buněk	nebo	tkání	(např.
z embryonálních	nebo	dospělých	buněk	nebe	tkáně	srdce)
v určitém vývojovém stádiu, mající	požadovaný	genotyp,	fenotyp

atd.

Jak bylo popsáno pro IFN-p2 polypeptid již výše, nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu může obsahovat pouze kódující sekvenci, nebo kódující sekvenci a další kódující sekvenci, (např. sekvenci kódující pro vedoucí, sekreční, cílící, enzymatický, fluorescenční nebo jiný diagnostický peptid), nebo kódující sekvencí a nekódující sekvenci, např. netranslatované sekvence buďto 5' nebo 3' konce nebo rozptýlené v kódující sekvence, jako jsou např. introny. Nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující bez přerušení polypeptid znamená, že nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci kódující aminokyseliny (tj. aminokyselinovou sekvenci) IFN-p2 bez nekódujících nukleotidů, které by jakkoliv přerušovaly kódující sekvenci, tedy např. bez intronů. Taková nukleotidová sekvence může být také popsán jako souvislá (nepřerušovaná). Genomová DNA kódující humánní, myší nebo další savčí interferony může být snadno získána rutinním způsobem.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu také může obsahovat expresní kontrolní sekvence operativně spojené s nukleovou kyselinou popsanou výše. Termín expresní kontrolní sekvence označuje sekvenci nukleové kyseliny, která reguluje expresi polypeptidu kódovaného nukleovou kyselinou, se kterou je expresní kontrolní sekvence operativně spojena. Exprese může být regulována na úrovni mRNA nebo polypeptidu. Tedy expresní kontrolní sekvence zahrnují elementy související s mRNA také elementy související s proteiny. K takovým elementům patř buněčné), vazebné řetězec komplementární působit jako templát polymerázy (tj . vhodn kyseliny) . Předkládaný i promotory, enhancery sekvence pro ribozóm, transkripce atd. Expresní kontrolní sekvence je operativně spojena s nukleotidovog kódující sekvencí, když je expresní kontrolní sekvence umístěna takovým způsobem, že ovlivňuje nebo způsobuje expresi kódující sekvence. Například když je promotor operativně připojen k 5'-konci kódující sekvence, exprese kódující sekvence je pak řízena tímto promotorem. Expresní kontrolní sekvence může být heterologní nebo endogenní vzhledem k normálnímu genu.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být vybrána na zákládě hybridizace nukleových kyselin. Schopnost dvou preparátů jednořetězcových nukleových kyselin vzájemně hybridizovat je měřítkem komplementarity jejich nukleotidových sekvencí_r tedy např. párování baží A-T, G-C apod. Vynález se tedy také týká nukleových kyselin a jejich komplementů, které hybridizují s nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou zde na obr. 1. Nukleotidová sekvence hybridizující s touto sekvencí bude mít nukleové kyseliny nebo bude nebo pro takový řetězec v přítomnosti lého enzymu syntetizujícího nukleové vynález zahrnuje oba řetězce nukleové ;nse a anti-sense řetězec.

(virové nebo terminátory kyseliny, např. tedy se

Hybridizační bodmínky mohou být zvoleny tak, aby výběr nuk umožnily :leové kyseliny s požadovanou mírou nukleotidové komplementarity se sekvencí uvedenou na obr. 1. Nukleová kyselina schopná hybridizace s takovou sekvencí má výhodněji 90%, 92% a ještě výhodněji 95%, 97% nebo dokonce 100% komplementaritu. Předkládaný vynález se zejména týká nukleové kyseliny, která hybridizuje ···· se sekvencí nukleotidů uvedenou na obr. 1 v podmínkách nízké nebo vysoké stringence (přísnosti).

Nukleová kyselina, která hybridizuje se sekvencí ΙΓΝ-β2, může být vybrána různými způsoby, např. tzv. bloty (tj. matrice obsahující nukleové kyseliny), mikročipy nebo čipy s nukleovými kyselinami, obsahující požadované nukleové kyseliny, mohou být inkubovány v prehybridizačním roztoku (6XSSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA ze spermatu lososa, 5X Denhardtův roztok a 50% formamid) , ve 30 °C přes noc, a pak hybridizovány s detekovatelnou oligonukleotidovou sondou (viz níže) v hybridizačním roztoku (např. 6X SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA ze spermatu lososa, 5X Denhardtův roztok a 50% formamid) ve 42 °C přes noc, což jsou odborníkovi známé postupy. Bloty pak mohou být promyty v podmínkách s vysokou stringencí, které dovolí ponechat jen mene nez nesprávně spárovaných bp (mismatch) (např.

dvojí promytí ve 0,lX SSC a 0,1% SDS po dobu 30 minut v 65 °C), tj. vede k selekci sekvence mající 95% nebo vyšší sekvenční identitu. Dalším (neomezujícím) příkladem podmínek s vysokou stringencí je závěrečné promývání v 65 °C ve vodném pufru obsahujícím 30 MM NaCl a 0,5% SDS. Dalším příkladem podmínek vysoké stringence je hybrídizace v 7% SDS, 0,5 M NaPO₄, pH 7, 1 mM EDTA v 50 °C, např. přes noc, následovaná jedním nebo více promytími roztokem 1% SDS ve 42 °C.

Zatímco promývání v podmínkách s vysokou stringencí umožní ponechat méně než 5 % špatně spárovaných baží (mismatch), relaxované podmínky promývání neboli podmínky s nízkou stringencí (např. promytí dvakrát v 0,2XSSC a 0,5% SDS po dobu 30 minut ve 37 °C) dovolí až 20% mismatch. Dalším (neomezujícím) příkladem podmínek s nízkou stringencí je konečné promytí ve 42 °C v pufru obsahujícím 30 mM NaCl a 0,5% • · · ·

SDS. Promývání a hybridizace mohou být prováděny postupy popsanými v Sambrook et al., Molecular Cloning, 1939, Chapter

9.

Hybridizace může také být prováděna na základě výpočtu teploty tání (Tm) hybridu vytvořeného mezi sondou a její cílovou sekvencí, jak je to popsáno v Sambrook et al. Obecně, teplota Tm, ve které krátký oligonukleotid (obsahující 18 nebo méně nukleotidů) bude tát, tj . pustí se své cílové sekvence, je dána následující rovnicí: Tm = (počet A a T) x 2 °C + (počet C a G) x 4 °C. Pro delší molekuly platí jiný vzorec: Tm = 81,5 + 16,6 logio [Na⁺] + 0,41(% GC) - 600/N, kde [Na⁺] je molární koncentrace sodíkových iontů, % GC jsou procenta párů bází GC v sondě a N je délka. Hybridizace může být prováděna při teplotě o několik stupňů nižší než je vypočtená teplota, aby se zajistilo, že sonda a cílová sekvence mohou skutečně hybridizovat. Nesprávné párování se umožní dalším snížením teploty.

Stringentní podmínky mohou být vybrány pro izolaci sekvencí a případně jejich komplementů, které mají např. alespoň přibližně 95%, 97%, 98% nebo 99% nukleotidovou komplementaritu mezi sekvencí sondy (např. oligonukleotidem IFN-p2) a cílovou nukleovou kyselinou.

Podle předkládaného vynálezu, nukleová kyselina nebo polypeptid mohou obsahovat jeden nebo více rozdílů v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci uvedené zde na obr. 1 a 2. Změny nebo modifikace v nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvenci mohou být uskutečněny pomocí jakéhokoliv dostupného způsobu, včetně cílené nebo náhodné mutageneze.

Nukleová kyselina kódující savčí IFN-p2, jako je například humánní IFN-βζ podle vynálezu, může obsahovat • · · ·

nukleotidy, které se vyskytují v přirozeně se vyskytujícím genu, např. přirozeně se vyskytující polymorfismy, normální nebo mutované alely (nukleotid nebo aminokyselina), mutace, které byly objeveny v přírodní populaci savců, například u lidí, opic, prasat, myší, potkanů nebo králíků. Termín přirozeně se vyskytující (a také přírodní nebo přirozená) znamená, že nukleová kyselina je získatelná z přírodního zdroje, např. buněk a tkání zvířete, tělních tekutin, buněk v tkáňové kultuře nebo forensních vzorků. Přirozeně se vyskytující mutace zahrnují delece (např. zkrácení amino- nebo karboxy-konce), substituce, inverze nebo adice nukleotidové sekvence. Tyto geny mohou být detekovány a izolovány pomocí metod hybridizace nukleových kyselin, které jsou odborníkům dobře známy. Nukleotidová sekvence kódující savčí IFN-p2 podle vynálezu může obsahovat kodony nacházející se v přirozeně se vyskytujícím genu, transkriptu nebo cDNA, například, např. jak uvedeno na obr. 1, nebo může obsahovat degenerované kodony kódující stejnou aminokyselinovou sekvenci. Tak například se může požadovat změnit kodony v sekvenci s cílem optimalizovat sekvenci s ohledem na expresi v požadovaném hostiteli.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může obsahovat např. DNA, RNA, syntetickou nukleovou kyselinu, peptidovou nukleovou kyselinu, modifikované nukleotidy nebo jejich směsi. DNA může být dvoj řetězcová nebo jednořetšzcová. Nukleotidy v nukleové kyselině mohou být spojeny různými typy známých vazeb, např. esterovou vazbou nebo sulfamátovou, sulfamidovou, fosforothioátovbou, fosforamidátovou, methylfosfonátovou, karbamátovou vazbou apod., a to v závislosti na požadovaném účelu, jako je např. rezistence k nukleázám, jako je například RNAáza H, nebo zlepšená in vivo stabilita, apod., viz např. U.S. Patent č. 5,378,825.

• · · · «

Mohou být také vytvořeny různé modifikace nukleových kyselin, jako je například navázání detekovatelných markérů (avidin, biotin, radioaktivní elementy) , nebo skupin, které zlepšují hybridizaci, detekci nebo stabilitu. Nukleové kyseliny mohou také být navázány na pevný nosič, jako je např. nitrocelulóza, magnetické nebo paramagnetické mikroperličky (např. jak bylo popsáno v U.S. Patentu č. 5,411,863, U.S. Patentu č. 5,543,289, například obsahující feromagnetický, supermagnetický, paramagnetický, superparamagnetický oxidy železa a polysacharid), nylon, agaróza, diazotizovaná celulóza, latexové pevné mikrosféry, polyakrylamidy apod,., v závislosti na požadovaném způsobu (viz např. U.S. Patenty č. 5,470,967, 5,476,925, 5,478,893).

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká oligonukleotidových sond nebo nukleových kyselin jako sond. Takové oligonukleotidové sondy nebo nukleové kyseliny ve funkci sondy mohou být použity např. k detekci, kvantifikaci nebo izolace savčí nukleové kyseliny IFN-p2 v testovaném vzorku nebo k identifikaci homologů IFN-p2. Ve výhodném provedení může být nukleová kyselina podle vynálezu využita jako oligonukleotidové sonda, např. v PCR, pro diferenční expresní analýzu (differential display), pro genové čipy (viz např. Affymetrix GeneChips, U.S. Patenty č. 5,143,854, 5,424,1S6, 5,874,219, PCT WO 92/10092, PCT WO 90/15070), a další metody, které jsou odborníkům známy. Detekce může být potřebná pro mnohé účely, včetně výzkumu, diagnostiky a kriminalistiky. Pro diagnostické účely může být potřebné identifikovat přítomnost nebo stanovit množství sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, který byl získán z tkáně, buněk, tělních tekutin atd. Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu se týká způsobu detekce nukleové kyseliny, který zahrnuje kontaktování cílové nukleové kyseliny v testovaném

9 99

9 9

9· 9999

999 9 vzorku s oligonukleotidem v podmínkách vhodných pro dosažení hybridizace mezi cílovou sekvencí a oligonukleotidem, a detekci hybridizace. Oligonukleotid podle vynálezu může také být použit pro syntetickou amplifikaci nukleové kyseliny jako je například PCR (např. Saiki et al., Science, 241:53, 1988, U.S. Patent č. 4,683,202, PCR Protocols: Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academie. Press, New York, 1990), pro diferenční displej (viz např. Liang et al., Nucl. Acids Res., 21:3269-3275, 1993, U.S. Patent č. 5,599,672, W097/18454), lineární PCR nebo další amplifikační metody.

Detekce může být uskutečněna v kombinaci s oligonukleotidy pro další geny, např. geny účastnícími se v signální transdukci, růstu, karcinomu, apoptózy, nebo jakéhokoliv jiného genu zmíněného v tomto popisu. Oligonukleotidy mohou být také použity k testování na mutace, např. s použitím postupu mismatch DNA repair, jak bylo popsáno v U.S. Patentu č. 5,683,877, U.S. Patentu č.

5, 656, 430, Wu et al., Proč. 8783, 1992.

Nati. Acad. Sci. USA 89:8779Oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat jakoukoliv souvislou nukleotidovou sekvenci ze sekvence uvedené zde na obr. 1 nebo sekvence k ní komplementární. Tyto oligonukleotidy (nukleové kyseliny) podle vynálezu mohou mít jakoukoliv požadovanou velikost, např. přibližně 10 až 200 nukleotidů, 12 až 100, 12 až 50, 12 až 25, 14 až 16, alespoň však přibližně 15, alespoň přibližně 20, alespoň přibližně 25, alespoň přibližně 30 atd. Oligonukleotidy mohou obsahovat nukleotidy, které se v přírodě nevyskytují, např. inosin, AZT, 3TC apod. Oligonukleotidy mohou mít 100% identitu nebo komplementaritu se sekvencí na obr. 1 nebo mají neshodné pozice (mismatches) nebo • ·« · • * • · · · * · « • ·· · · · · · · • · · · · ··· ··« ·· ··· ···· »· ···· nukleotidové substituce, např. 1, 2, 3, 4 nebo 5 substitucí.

Podle předkládaného vynález může být oligonukleotid součástí soupravy (kitu), která obsahuje požadovaný pufr (např. fosfátový pufr, Tris, apod.), detekční prostředky a další. Přitom oligonukleotid může být neznačený nebo značený, s radioaktivní nebo neradioaktivní značkou, jak je odborníkům známo.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nukleotidové sekvence, která je unikátní pro savčí IFN-βΣ. Termínem unikátní sekvence v IFN-p2 se míní definované pořadí nukleotidů, které se vyskytuje v IFN-βζ, např. v nukleotidové sekvenci na obr. 1, ale výjimečně nebo jen velmi zřídka v jiné nukleové kyselině, obzvláště se nevyskytuje v nukleové kyselině zvířete, výhodně savce, jako například člověka, potkana, myši apod. K unikátním nukleotidovým sekvencím patří sekvence, nebo jejich komplementy, kódující aminokyselinové sekvence KHFFGTV, IIFQQRQV, KSLSP, FRÁNI, AEKLSGT, CLFFVFS, a QGRPLNDMKQELTTEFRSPR, a jejich fragmenty, jak je ukázáno na obr. 1. Takové sekvence mohou být použity jako sondy v jakékoliv metodě popsané v této přihlášce nebo v jiné publikaci uvedené zde formou odkazu. Vynález se týká jak sense tak i antisense nukleotidové sekvence. Unikátní nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být určena rutinním způsobem. Nukleová kyselina obsahující takové unikátní sekvence může být použita jako hybridizační sonda pro identifikaci přítomnosti např. humánního nebo myšího IFN-βζ ve vzorku obsahujícím směs nukleových kyselin, např. metodou Northern blot. Hybridizace mohou být prováděny v podmínkách vysoké stringence (viz výše) pro selekci nukleových kyselin (a jejich komplementů, které mohou obsahovat kódující sekvence) majících alespoň 95% identitu (tj . komplementaritu) se sondou, ale mohou být použity i podmínky s nižší stringencí. Unikátní • ··*· · 00 00 ·· • 0 * 00 > 0 0 ♦ 0 • · 0 0 0 0 0 0 00 0 00000 • 00 · 0 000

000 00 000 0000 ·· 0000

IFN~P2 nukleotidové sekvence mohou být také fúzovány ve správném čtecím rámci, svým 5' nebo 3' koncem, s různými nukleotidovými sekvencemi, které jsou zmíněny v předkládaném popisu, včetně kódující sekvence pro další části IFN-p2, enzymy, GFP, expresních kontrolních sekvencí atd.

Jak již bylo diskutováno, hybridizace může být prováděna v různých podmínkách, v závislosti na požadované selektivitě, např. jak bylo popsáno v Sambrook et al. , Molecular Cloning, 1989. Například pro specifickou detekci IFN-p2 podle předkládaného vynálezu se oligonukleotid hybridizuje s cílovou nukleovou kyselinou v podmínkách, ve kterých s ní hybridizuje pouze oligonukleotid, tj . když oligonukleotid je 100% komplementární s cílovou sekvencí. Jiné podmínky se použijí, když je třeba vybrat cílovou nukleovou kyselinu, která má nižší než 100% nukleotidovou komplementaritu, alespoň přibližně např. 99%, 97%, 95%, 90%,

86,4%, 85%, 70%, 67%.

Antisense nukleové kyseliny mohou být připraveny z nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu, výhodně nukleové kyseliny s anti-sense sekvencí k sekvenci na obr. 1. Antisense nukleové kyseliny mohou být využity různými způsoby, například pro regulaci nebo modulaci exprese IFN-p2, např. pro inhibici exprese, pro detekci exprese nebo pro hybridzaci in sítu. Tyto oligonukleotidy mohou být použity analogicky U.S. Patentu č. 5,576,208. Za účelem regulace nebo modulace exprese IFN~p2 anti-sense oligonukleotidy mohou být operativně spojeny s expresní kontrolní sekvencí.

Pro inhibici IFN-p2 může být zkonstruován oligonukleotid odpovídající sense poloze podél cDNA. Viz např. J. Milligan et al., Current Concepts in Antisense Drug Design., J. Med. Chem. 36(14): 1923-1937, 1993, Helene and

* ©» ·» »© ©« © · » © » • · · · © • · · © · · © · · · · t · · ©© ♦ © © · ·«>©

Touhne, Biochim. Biophys. Acta 1049: 99-125, 1990, Cohen, J. S., Ed., Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibítors of Gene Expression, CRC Press: Boča. Raton, Fla., 1987, Crooke, S., Basic Principles of Antisense Therapeutics, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, Jul. 1998. Takové oligonukleotidy mohou být resistentní k nuklázám, např. s použitím různých chemických vazeb, jak bylo popsáno např. v U.S. Patentu č. 6,040,296 nebo ve výše zmíněných odkazech. Celková délka přibližně do 35 bp může být použita v buněčné kultuře s kationtovými liposomy pro usnadnění buněčného příjmu, ale pro in vivo použití jsou výhodně podávány kratší oligonukleotidy, např. obsahující 25 nukleotidů.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být značena jakýmkoliv požadovaným způsobem. Nukleová kyselina může být značena použitím radioaktivních značek jako je například ³²P, ³⁵S, ¹²⁵I nebo ¹⁴C, aby byly zmíněny alespoň některé obecně používané značky. Radioaktivní značení může být prováděno jakýkoliv známým způsobem, jako je například koncové značení 3' nebo 5' konce s použitím radioaktivně značeného nukleotidu, polynukleotidylkinázy (s nebo bez defosforylace nebo ligázy (v závislosti na tom, který konec má Může být také použito neradioaktivní značení, a kombinací nukleové kyseliny podle vynálezu se zbytky/skupinami, které mají imunologické vlastnosti (antigeny, hapteny), specifickou afinitu pro určité reagencie (ligandy), vlastnosti umožňující provedení detekovatelně enzymatické reakce (enzymy nebo koenzymy, substráty enzymů nebo další látky účastnící se enzymatické reakce), nebo charakteristické fyzikální vlastnosti, jako je například fluorescence nebo emise nebo absorpce světla v požadované vlnové délce apod.

fosfatázou) být značen sice např,

99*9 9 «» ·· *·

Α» « ·· * 9 * « «

9 · 9 9 · 1 • 9· 9·9·· 9 • 99 9 9 9 9 9 • 99 99 »99**99 99 99 <9

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu, včetně oligonukleotidů, anti-sense nukleových kyselin atd., může být použita k detekci exprese IFN-βζ v celých orgánech, tkáních, buňkách apod., a sice užitím různých technik, jako je např. Northern blot, PCR, in šitu hybridizace, diferenciální display, matrice nukleových kyselin (např. genové čipy), dot bloty apod. Tyto nukleové kyseliny jsou zejména užitečné pro detekci narušené exprese, např. buněčně specifických a/nebo subcelulárních alterací. Mohou být stanoveny buďto hladiny exprese samotného IFN-βζ nebo v kombinaci s dalšími genovými produkty, obzvláště s dalšími genovými produkty podílejícími se na produkci cytokinů.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být exprimována v mnoha různých systémech, in vitro a in vivo, podle požadovaného účelu. Tak například nukleová kyselina může být vložena do expresního vektoru, vnesena do požadovaného hostitele a ten pak kultivován v účinných podmínkách vhodných k dosažení účinné exprese polypeptidu kódovaného nukleovou kyselinou. Účinné podmínky jsou jakékoliv kultivační podmínky, které jsou vhodné k dosažení produkce polypeptidu pomocí hostitelských buněk, a zahrnují faktory jako je účinná teplota, pH, médium, aditiva média, ve kterém jsou hostitelské buňky pěstovány (např. aditiva, která zesilují nebo indukují expresi jako je například butyrát nebo methotrexat, je-li kódující nukleová kyselina v sousedství genu pro dhfr), cykloheximid, buněčné hustoty, kultivační misky apod. Nukleová kyselina může být vnesena do buněk jakýmkoliv účinným způsobem, včetně např. přenosu nahé DNA, kalciumfosfátové precipitace, elektroporace, injekce, DEAE-dextranem zprostředkované transfekce, fúze s lipozómy, asociace s činidly, která zesilují příjem nukleové kyseliny do buněk, a virové transfekce. Buňky, do kterých byla nukleová kyselina transformované může být do chromozómu podle předkládaného vynálezu vnesena, jsou hostitelské buňky. Nukleová kyselina extrachromozomová nebo je integrována hostitelské buňky. To může být trvale nebo přechodně. Expresní vektor je vybrán pro svou kompatibilitu s hostitelskou buňkou. K vhodným hostitelským buňkám patří savčí buňky, např. buňky COS, CV1, BHTL, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293, PAE, humánní buňky jako jsou humánní fibroblasty, humánní primární nádorové buňky, buňky varlat, gliové buňky, neurony, oligodendrocyty, astrocyty, neuroblastomové buňky, gliomové buňky atd., hmyzí buňky, jako jsou např. buňky Sf9 (S. frugipeda) a buňky z Drosophily, bakterie, jako je například E. coli,

Streptococcus, Bacillus, kvasinky jako jsou například Sacharomyces, např. S. cerevisiae, houbové buňky, rostlinné buňky, embryonální kmenové buňky (např. savčí, jako jsou například myší nebo humánní), neuronální kmenové buňky, fibroblasty, svalové buňky, srdeční buňky a T-lymfocyty.

Expresní kontrolní sekvence jsou podobně vybrány pro svou kompatibilitu s hostitelem a požadovaným účelem, jako je např. vysoký počet kopií, vysoká množství, indukce, amplifikace, řízení exprese. K dalším sekvencím, které mohou být použity, patří enhancery (zesilující sekvence), jako je například enhancer z SV40, CMV nebo RSV, indukovatelné promotory, elementy specifické pro buněčný typ nebo sekvence, které umožňují selektivní nebo buněčně specifickou expresi. Promotory, které mohou být použity pro expresi, zahrnují např. endogenní promotor, promotory dalších genů zúčastněných v buněčné dráze signální transdukce, promotory vhodné pro bakteriální hostitele jako je promotor MMTV, SV40, trp, lac, tac nebo T7, nebo promotory vhodné pro kvasinky, jako je promotor genu alkoholoxidázy nebo PGH. RNA promotory, jako je například T7 nebo SP6, mohou být použity k vytvoření RNA transkriptů. Viz např. Meiton et al., Nucleic Acid Res., 12(18):7035-7056, 1984, Dunn and Studier, J. Mol. Biol., 166:477-435, 1984, U.S. Patent č. 5,891,636, Studier et al.,

Gene Expression Technology, Methods in Enzynzoloy, 85:60-89, 1987 .

Nukleová kyselina nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako velikostní markér při elektroforéze nukleových kyselin nebo proteinů, chromatografií apod. definované restrikčni fragmenty mohou být určeny na základě prohledáváni sekvence na restrikčni místa, výpočtem velikosti a provedením odpovídajícího štěpení.

Polypeptid IFN-^2 a nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány. Termínem izolovány se míní to, že jsou ve formě, ve které se nevysykytují ve svém původním prostředí nebo v přírodě, jsou např. více koncentrovány, více purifikovány, odděleny od ostatních složek, přítomné v lyzátu buněk, které exprimují IFN-p2 apod. Když je IFN-p2 exprimován jako heterologní nukleová kyselina v transfekované buněčné linii, nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu je vnesena do buněk, jak bylo popsáno výše, v podmínkách, ve kterých je nukleová kyselina exprimována. Termín heterologní znamená, že nukleová kyselina byla vnesena do buněčné linie lidskou činností. Vnášení nukleových kyselin do buněk již bylo diskutováno výše. Transfekovaná (nebo transformovaná) buňka exprimující ΊΤΝ-β2 nukleovou kyselinu může být lyžována, jak je popsáno v příkladech, a použita ve způsobu jako lyzát (tj . izolovaná) nebo může být použita intaktní buněčná linie.

Obecně termín účinné podmínky znamená např. prostředí, ve kterém je dosaženo požadovaného účinku. Takové prostředí zahrnuje faktory jako jsou např. pufry, oxidační i

»· · • · · · činidla, redukční činidla, pH, kofaktory, teplotu, koncentrace iontů, vhodné stáří a/nebo stádium vývoje buňky (jako je například určitá fáze buněčného cyklu nebo určité stádium, kdy jsou konkrétní geny exprimovány), a které jsou užity při kultivaci buněk, a tedy i kultivační podmínky (včetně substrátu, koncentrace kyslíku, oxid uhličitého atd.).

Předkládaný vynález se týká také způsobu modulace, výhodně inhibice, exprese nukleové kyseliny kódující IFN-p2 podle předkládaného vynálezu, který zahrnuje kroky, kdy se buňky exprimující IFN-p2 podle vynálezu přivedou do kontaktu s množstvím činidla, jako je například antisense oligonukleotid nebo antisense RNA IFN-p2, které je účinné pro sekvenčně specifickou inhibici exprese nukleové kyseliny.

Sekvenčně specifická inhibice exprese nukleové kyseliny může být uskutečněna obvyklým způsobem pomocí antisense nukleové kyseliny, jako jsou například antisense oligonukleotidy nebo RNA. oligonukleotidy, jako jsou

Tak například antisense například fosfodiester- nebo fosforothioátdeoxyoligonukleotidy mohou být zkonstruovány pro specifický úsek IFN-p2 RNA, jako je například iniciační místo translace, a mohou pak být podány do buněk exprimujících tento gen v množství účinném pro inhibici jejich exprese. Obecně, antisense nukleová kyselina je nukleová kyselina, která je komplementární k sense nebo kódujícímu řetězci dané nukleové kyseliny, a v důsledku toho je také komplementární a tudíž schopná specificky hybridizovat s mRNA transkripty nukleové kyseliny. Výhodné antisense oligonukleotidy obsahují 5' úsek cílového genu, obzvláště pak úsek obsahující iniciační kodon.

Ke zvýšení stability, podávaná nukleová kyselina může být modifikovaná, např. aby byla resistentní vůči buněčným enzymům, oxidaci, redukci, nukleázám apod., nebo aby se zvýšil

• · · ·

její příjem buňkou. Jakákoliv vhodná modifikace může být použita, jako jsou např. fosforothioátové, methylfosfonátové nebo fosfodiesterové oligonukleotidy navázané k akridinovému interkalačnímu činidlu a/nebo hydrofobnímu úseku (ocásku) , derivátům psoralenu, nebo modifikace 2'-ribózy, deriváty pentózy nebo deriváty dusíkaté báze, a další, viz např. U.S.

Patenty č. 5,576,208,

5,744,362, 6,040,296, a 6,046,319, kde byly popsány antisense oligonukleotidy, modifikace pod., které mohou být použitelné v předkládaném vynálezu. Obecně antisense nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahují monomery přirozeně se vyskytujících nukleotidů, nukleotidů, které se v přírodě nevyskytují a jejich libovolné kombinace, které zvyšují stabilitu nebo buněčný příjem.

Antisense nukleové kyseliny mohou být podávány jako nahá nukleová kyselina, v komplexu nebo opouzdřená pomocí dalších činidel, která usnadňují příjem do buněk, přímou injekcí do buňky, a nebo jakýmkoliv jiným vhodným prostředkem, který je odborníkům znám pro podávání nukleové kyseliny.

Předkládaný vynález se dále týká použití IFN-p2 podle vynálezu, jako je například humánní IFN-B2, pro léčení jakékoliv nemoci, poruchy nebo stavu, pro které je potřebná bioaktivita ΙΤΝ-β2. Použití se týká podávání účinného množství IFN~32 podle vynálezu příjemci, který takové léčení potřebuje, pro jeden nebo více z následujících účelů: regulace antionkogenu, protinádorová aktivita, antivirová aktivita, inhibice buněčného růstu nebo protirůstová aktivity, antiproliferační aktivita (např. množství IFN-βζ nutné účinné inhibici proliferace astrocytů), zesílení cytotoxicity lymfocytů, imunoregulační aktivita, indukce nebo inhibice diferenciace cílových buněk, aktivace makrofágů, down-regulace onkogenů apod., imunologické účinky, jako je například • · · · .1 • · 9 9 · · <· « · · ······· redukce tvorby protilátek, zvýšení složek buněčné membrány (hlavní histokompatibilní, Fc receptory, p2-mikroglobulin), modulace buněčné imunity, zvýšení produkce cytokinů (např. interleukinu), zesílení účinků cytotoxických T lymfocytů, zesílení účinků makrofágů a zesílení NK (natural killing) aktivity. IFN-p2 může být podáván k léčení např. karcinomu, autoimunitních poruch a virových infekcí (viz např. Cirelli and Tyring, Clin Immunother. 3:27-87, 1995, pro různé nemoci, které mohou být léčeny působením IFN-p2 podle vynálezu, konkrétně viz použití alfa- a beta-inteferonů).

IFN-p2 může být podáván jako polypeptid nebo může být podáván jako nukleová kyselina, např. při genové terapii. Když je podáván jako nukleová kyselina, může být podáván v jakékoliv formě, která je účinná pro dosažení exprese, např. jako nahá DNA, jako vektor (jako je například virový vektor, např. adenovirus), v komplexu s lipozómy nebo dalšími nosiči, mikrosférami apod. Viz také výše, kde bylo již podrobněji diskutováno podávání nukleových kyselin, jejich exprese v hostiteli apod.

Jakýkoliv druh rakoviny může být léčen podle předkládaného vynálezu, např. také intraepitheliální neoplázie děložního hrdla a karcinom děložního hrdla (viz např. DePalo et al., Int. J. Tissue React. 6:523-527, 1984, pro dávky, způsoby podávání, léčebný režim atd.), melanom a metastázující melanom (viz např. Beiteke et al., Hautarzt, 44:365-371, 1994, pro dávky, způsoby podávání, léčebný režim atd.), leukémie vlasatých buněk, Kaposiho sarkom, karcinom bazálních buněk, karcinom squamosních buněk, karcinom ledvin, karcinoidní nádory, kožní T-buněčný lymfom, nehodgkinský lymfom (pro další karcinomy viz také Dorr, Drugs 45(2):177211, 1993).

• «· »J ♦ « • Λ ♦· » · · > ♦ roztroušená z hlediska

Autoimunitní onemocnění může také být léčeno podle předkládaného vynálezu, a sice onemocnění jako je např. sclerosis multiplex (viz např. Yong et al., Neurology, 51:682689, 1998, pro dávky, způsoby podávání, léčebný režim atd.), revmatoidní artritida apod. Sclerosis multiplex (MS), skleróza mozkomíšní, je autoimunitní nemoc, patologie charakterizovaná perivaskulárními a periventrikulárními záněty, které vedou k demyelinace, destrukci axonů a následné glióze. Hlavním znakem chronických lézí MS jsou demyelinované gliotické plaky tvořící se v důsledku lokální hypertrofie a hyperplázie astrocytů. Tyto astrocytové plaky narušují normální vedení v axonech a představují fyzikální překážku pro remyelinaci. Tudíž faktory, které inhibují astrocytózu, mají terapeuticky prospěšné účinky, zejména v pozdějších stádiích nemoci. Tedy schopnost IFN-p2 inhibovat astrocyty je obzvláště užitečná při léčení MS.

Virové nemoci a infekce mohou být také léčeny podle předkládaný vynálezu, např. nemoci způsobené viry jako je humánní papilloma virus (např. Puligheddu et al. , Eur. J. Gynaecol. Oncol. 9:161-162,. 1988, Costa et al., Cervix 6:203212, 1988, pro dávky, způsoby podávání, léčebný režim atd.), condylomata acuminata (Schonfeld et al., Lancet, 1:1038-1042, 1984, pro dávky, způsoby podávání, léčebný režim atd.), viry hepatitidy B, C a D, HIV, atd.

Termínem podávání se míní to, že IFN-βΖ nebo další účinná látka se přenáší do cíle, kterým je např. nádor, imunitní systém, léze v mozku (např. místo zánětu v mozku, jak jsou např. pozorována při sclerosis multiplex nebo dalších zánětlivých onemocněních mozku) atd. ΙΕΝ-β2 může být podáván do jakéhokoliv cíle (např. in vivo, in vitro nebo in šitu), «·

• · · ·

včetně buněk v kulturách a příjemce mající poranění nebo nemoc, která má být léčena, účinným způspbem pro dosažení požadovaného účinku, jak bylo popsáno již výše, např. formulace ΙΕΝ-β2 mohou být podávány pomocí injekce přímo do cílového místa nebo jeho těsné blízkosti. Může také být podáván topicky, enterálně, parenterálně, intravenózně, intramuskulárně, subkutánně, perorálně, nasálně, intracerebrálně, intraventrikulárně, atd. např. v závislosti na lokalizaci cílového místa, které má být léčeno. IFN-p2 může také být podáván jako nukleová kyselina pro příjem buňkami. Metody podávání nukleových kyselin zahrnují metody výše popsané a také další obvyklé metody, které jsou odborníkům známy.

Účinné množství IFN-p2 je podáváno do cílového místa. Účinné množství je takové množství, které je vhodné k dosažení požadovaného účinku, výhodně prospěšného nebo terapeutického účinku, např. množství účinné k inhibici proliferace astrocytů. Takové množství může být určeno rutinním způsobem, např. provedením experimentu dávka-reakce, ve kterém se cílovým buňkám podává různé množství, a stanoví se množství vhodné pro dosažení požadovaného účinku, např. antivirového účinku, imunomodulačního účinku apod. Množství se také určuje na základě různých dalších faktorů, jako je např. prostředí, kam se IFN~p2 podává (např. pacient se sclerosis multiplex, zvířecí model, buňky tkáňové kultury apod.), místo, kde jsou buňky, na které se má působit, věk, celkový zdravotní stav, pohlaví a hmotnost pacienta nebo zvířete, které se mají léčit. Užitečné množství je např. 1,6 MIU (milion mezinárodních jednotek podle mezinárodního referenčního standardu) a 8 MIU podávaných subkutánně obden. Termínem léčení se míní jakýkoliv účinek, který vede ke zlepšení stavu, nemoci nebo poruchy.

• » · «

Účinné množství IFN-p2 může být podáváno ještě s dalšími účinnými látkami, např. účinný látkami pro léčení karcinomů, virových onemocnění, MS, hepatitidy a jakékoliv jiné nemoci, která může být také léčena podáváním IFN-p2. K takovým účinným látkám patří cytotoxická, antivirová a chemoterapeutická činidla.

Předkládaný vynález se dále týká také protilátek, které specificky rozpoznávají IFN-p2 podle předkládaného vynálezu. Protilátka specifická pro ΐΕΝ-β2 znamená, že protilátka rozpoznává definovanou aminokyselinovou sekvenci uvnitř sekvence IFN-βί, např. sekvenci uvedenou zde na obr. 2. Tedy specifická protilátka se obecně váže s vyšší afinitou k aminokyselinové sekvenci, tj . k epitopů uvedenému na obr. 2, než k jinému epitopů, např. když je vazba detekována a/nebo měřena pomocí imunoblotovacího testu nebo jiným známým způsobem. Takže protilátka, která je specifická pro epitop humánního IFN-βί, je použitelná pro detekci přítomnosti epitopů ve vzorku, např. vzorku tkáně obsahující genový produkt humánního IFN-p2, a k odlišení od vzorků, ve kterých epitop přítomen není. Užitečná protilátka je protilátka proti unikátnímu C-konci ΙΡΝ-β2, např. QGRPLNDMKQELTTEFRSPR nebo jeho fragmentům. Takové protilátky jsou použitelné jak bylo popsáno v katalogu (Research Product Catalog) firmy Santa Cruz Biotechnology, lne. a mohou být v souladu s tím také formulovány.

Protilátky, např. polyklonální, monoklonální, rekombinantní, chimérické nebo humanizované, mohou být připravena jakýmkoliv požadovaným způsobem (viz také např. screening rekombinantních imunoglobulinových knihoven, např. Orlandi et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 86:3833-3837, 1989, Huse et al., Science, 256:1275-1281, 1989), a in vitro • · · « ««···*· • · » · ··♦»♦ • » · ►· · · · ··· *· ··· ·»9· 99 9999 stimulace populace lymfocytu, Winter and Milstein, Nátuře,

349: 293-299, 1991). Tak například pro produkci monoklonální protilátky se polypeptid podle obr. 2 podá subkutánně a/nebo intraperitoneálně myši, koze nebo králíkovi, buďto s nebo bez adjuvans, a to v množství účinném k vyvolání imunitní reakce. Protilátky mohou také být protilátky s jednoduchých řetězcem (jednořetězcové protilátky) nebo Fab fragmenty protilátky. Protilátky mohou být IgM nebo IgG, subtypů IgG2a, IgGl apod. Protilátky a imunitní reakce mohou také být vyvolány podáváním nahé DNA (viz např. U.S.Patenty č. 5,703,055, 5,589,466,

5,580,859).

Interferony nebo jejich fragmenty pro použití k indukci protilátek nemusejí mít bioaktivitu, avšak musejí být imunogenní (mít imunogenní aktivitu), buďto samotné nebo v kombinace s nosičem. Peptidy pro použití k indukci IFN-p2 specifických protilátek mají aminokyselinovou sekvenci ' tvořenou alespoň pěti aminokyselinami, výhodně alespoň 10 aminokyselinami. Krátké aminokyselinové sekvence, např. jen pěti aminokyselin, mohou být fúzovány s dalším proteinem, jako je například hemokyanin z přílipky. Nebo jiným užitečným nosičem, a k produkci protilátky se pak užije takováto chimérická molekula. Úseky IFN-32 použitelné k vytváření protilátky mohou být vybrány empiricky nebo např. aminokyselinová sekvence IFN-βΣ dedukovaná z cDNA může být analyzována a mohou tak být určeny úseky s vysokou imunogenicitou. Analýza k výběru vhodného epitopu byla popsána např. v Ausubel, F.M. et al. (1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2. John Wiley & Sons).

Konkrétní IFN-p2 protilátky jsou užitečné pro diagnostiku prepatologických stavů a chronických nebo akutních onemocnění, která jsou charakteristická rozdíly v ♦ ·· ·· «· · « *· · » • » · · • · · · * • · · ·

·· ·· · · množství nebo v distribuci ΐΕΝ-β2. Diagnostické testy pro IFN-βζ zahrnují metody s využitím protilátky a značky k detekci ΙΡΝ-β2 v humánních (nebo myších, je-li použita myš, atd.) tělních tekutinách, tkáních nebo extraktech tkání. Protilátky mohou být neutralizující a mohou být použity v testu aktivity IFN-βζ, např. jako kontroly k neutralizaci aktivity interferonů.

Polypeptidy a protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity bez modifikace nebo s modifikací. Často jsou polypeptidy a protilátky značeny tím, že jsou navázány, buďto kovalentně nebo nekovalentně, na látky, které poskytují detekovatelný signál. Velké množství různých značek a kondenzačních technik je známo a bylo popsáno v odborné literatuře. K vhodným značkám patří radionuklidy, enzymy, substráty enzymů, kofaktory, inhibitory, fluorescenční činidla, chemiluminescenční činidla, magnetické částice apod. (viz patenty popisující použití takových značek: U.S. Patenty č. 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149, a 4,366,241) .

Protilátky a další ligandy, které váží ΙΕΝ-β2, mohou být použity různými způsoby, včetně použití v terapii, diagnostice a jako nástroje v komerčním výzkumu, např. pro kvantifikaci hladiny interferonů ve zvířatech, tkáních, buňkách atd., pro identifikaci buněčné lokalizace a distribuce interferonů, k purifikaci interferonů nebo polypeptidu obsahujícího jeho část, k modulaci jeho funkce, pro Western bloty, pro testy ELISA, imunoprecipitaci, RIA, a další testy. Předkládaný vynález se tedy týká také těchto testů, přípravků a souprav k provádění těchto testů. S využitím těchto a dalších metody protilátka podle předkládaného vynálezu může být použita k detekcí ΙΕΝ-β2 polypeptidu nebo jeho fragmentů • · · · :

v různých vzorkách, jako jsou tkáně, buňky, tělní tekutiny, krev, moč, mozkomíšní mok.

Kromě toho, ligandy, které se váží na IFN-p2 polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho deriváty, mohou také být připraveny s použitím syntetických peptidových knihoven nebo aptamerů (např. Pitrung et al., U.S. Patent č. 5,143,854, Geysen et al. , J. Immunol. Methods 102:259-274, 1987, Scott et al. , Science, 249:386, 1990, Blakwell et al., Science, 250:1104, 1990, Tuerk et al., 1990, Science, 249:505).

Předkládaný vynález se týká také IFN-βΣ polypeptidu, připraveného požadovaným způsobem, např. jak bylo popsáno v U.S. Patentu č. 5,434,050. Značený polypeptid může být použit, např. ve vazebných testech, jako například vtestech k identifikaci látek, které se vážou na IFN-p2, pro sledování pohybu IFN-p2 v buňkách, nebo v systémech in vitro, in vivo nebo in sítu atd.

Nukleová kyselina, polypeptid, protilátka, IFN-βΣ atd. ' mohou být izolované. Termínem izolovaný se míní, že materiál je ve formě, která se nevyskytuje v jeho původním prostředí nebo v přírodě, je např. více koncentrovaný, více purifikovaný, oddělený od ostatních složek, apod. Izolovaná nukleová kyselina zahrnuje např. nukleovou kyselinu mající sekvenci IFN-p2 oddělenou z chromozomové DNA vyskytující se v živém zvířeti, např. v podobě kompletního genu, jeho transkriptu nebo cDNA. Tato nukleová kyselina může být částí vektoru nebo vložena do chromozómu (pomocí specifického genového cílení, targetingu, nebo pomocí náhodné integrace v poloze jiné než je její normální poloha), a přesto se jedná o izolovanou formu, neboť není ve formě, v jaké se vyskytuje ve svém přirozeném prostředí. Nukleová kyselina nebo ·· » · » ·

polypeptid podle předkládaného vynálezu mohou také být v podstatě purifikované. Termínem v podstatě purifikovaná se míní, že nukleová kyselina nebo polypeptid jsou odděleny a v podstatě zbaveny ostatních nukleových kyselin nebo peptidů, čili nukleová kyselina nebo polypeptid představují primární účinnou složku takového v podstatě purifikovaného preparátu.

Předkládaný vynález se také týká transgenních zvířat, např. savců s výjimkou člověka, jako je například myš, obsahujících IFN-fi2. Transgenní zvířata mohou být připravena známými metodami, jako je např. injekce rekombinantního genu na pronukleu 1-buněčného embrya, vnesení umělého kvasinkového chromozómu do embryonálních kmenových buněk, metody cílení genů, metody embryonálních kmenových buněk apod. (viz např. U.S. Patenty č. 4,736,866, 4,873,191, 4,873,316, 5,082,779,

5,304,489, 5,174,986, 5,175,384, 5,175,385, 5,221,778, Gordon et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980, Palmiter et al., Cell, 41:343-345, 1985, Palmiter et al:, Annu. Rev.

Genet., 20:465-499, 1986, Askew et al., Mol. Cell. Biol.,

13:4115-4124, 1993,. Games et al. , Nátuře, 373:523-527, 1995,

Valancius and Smithies, Mol. Cell. Biol., 11:1402-1408, 1991,

Stacey et al., Mol. Cell. Biol., 14:1009-1016, 1994, Fiasty et al, Nátuře, 350:243-246, 1995, Rubinstein et al, Nucl. Acids

Res., 21:2613-2617, 1993). Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být vnesena do jakéhokoliv savce s výjimkou člověka, včetně myši (Hogan et al. , Manipulating the Mouše Embryo: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), prasete (Hammer et al., Nátuře 315:343-345, 1985), ovce (Hammer et al., Nátuře, 315:343-345, 1985), krávy, potkana nebo primáta (viz také Church, Trends ih Biotech., 5:13-19, 1987, Clark et al., Trends in Biotech., 5:20-24, 1987), DePamphilis et al.,

BioTechhiques, 6:662-680, 1988), Kromě toho je např. snadno to· «to « ♦ » • » * • · · · • · to >· tototo·

dostupná komerční příprava transgenních laboratorních potkanů a myší přesně dle požadavků zákazníka. Tato transgenní zvířata mohou být užitečné modely pro testování funkce IFN-P2, jako potrava pro hady, jako genetický markér k detekci původu kmenu (tj. kde byl vložen IFN-p2 nebo jeho fragment) apod. Taková transgenní zvířata mohou dále obsahovat další transgeny. Transgenní zvířata mohou být připravena a použita jakýmikoliv způsoby, které jsou odborníkům známy.

Předkládaný vynález se dále týká savčích buněk, ve kterých byla exprese genu kódujícího IFN-p2 vyloučena (knocked out) nebo narušena. Takové narušení genu může být uskutečněno pomocí účinných prostředků jako je např. např. antisense nebo pomocí inzerce nukleotidové sekvence, která je účinná v supresi genové exprese. Termín gen je v tomto kontextu používán ve významu sekvence kódující IFN-p2 tak jak existuje na chromozómu a obsahuje svou promotorovou sekvenci a další regulační úseky.

Předkládaný vynález se obzvláště týká savce obsahujícího jednu nebo více buněk, ve kterých je exprese genu funkčně inaktivována nebo narušena. Funkční inaktivace nebo narušení znamenají např. částečnou nebo úplnou redukci exprese alespoň části polypeptidu kódovaného endogenním genem IFN-p2 v jedině buňce, ve vybraných buňkách nebo ve všech buňkách zvířete. Termín vyloučení nebo vyřazení funkce (knocked out) je v této souvislosti synonymem pro funkční inaktivaci genu.

V jednom provedení vynálezu byla použita strategie genového cílení (targeting), která umožňuje vnesení požadované nukleotidové sekvence do genu IFN-p2. Strategie genového targetingu výhodně využívá dvojné reciproké rekombinace a pozitivního selekčního markéru pro inzerci nukleotidové sekvence do cílové nukleové kyseliny. Cílová * · · · nukleové kyselina je výhodně gen, výhodněji gen ve svém konkrétním chromozómovém lokusu. Požadovaná nukleotidové sekvence je vložena do genu takovým způspbem, že gen je funkčně narušen, tj. jeho exprese je částečně nebo úplně redukována.

Podle dalšího aspektu předkládaného vynálezu je targeting vektor použit ke vložení selekčního markéru do předem definované polohy v genu IFN-p2. Poloha je vybrána tak, aby po inzerci selekčního markéru bylo dosaženo funkčního narušení genu. Pro takový účel je výhodným provedením vynálezu molekula rekombinantní nukleové kyseliny obsahující: (1) 5' nukleotidovou sekvenci, která je účinná k dosažení homologní rekombinace v prvním předem definované poloze savčího genu IFN-βΖ, operativně spojeného s (2) 5' koncem první selektovatelné nukleotidové sekvence, která poskytuje první selekční znak buňkám, ve kterých je přítomna, a (3) 3' nukleotidovou sekvenci, která je účinná k dosažení homologní rekombinace v druhé předem definované poloze savčího genu IFN-p2, např. genu IFN-p2 operativně připojenému k 3' konci první selektovatelné nukleotidové sekvence. Rekombinantní molekula nukleové kyseliny je účinná k dosažení homologní rekombinace v savčím chromozómu v předem definované poloze. Fragmenty targeting vektoru spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu, např. molekuly rekombinantní nukleové kyseliny obsahující elementy (1) a (2) nebo obsahující elementy (2) a (3) atd.

Termín rekombinantní se týká např. molekuly nukleové kyseliny, která byla modifikovaná zásahem člověka, např. obsahuje fragmenty nukleové kyseliny z odlišných zdrojů nebo je to molekula nukleové kyseliny z jediného zdroje, která ale byla upravena metodami genového inženýrství

4 • «4 ♦* ·♦

4 4 4 4 4

4 4 4 · · 4 4 4 ·

4 4 4 4 ·« · ·♦·« 44 4444 (technologií rekombinantní DNA). Takže molekula nukleové kyseliny je rekombinantní např. když obsahuje nukleotidovou sekvenci savčího IFN-p2 a genový markér. Molekula je také rekombinantní, když obsahuje sekvence z téhož genu, ale uspořádané takovým způsobem, který se v přírodě nevyskytuje, tzn. nepřirozeně (uměle) uspořádané.

Homologní rekombinace označuje proces, kdy se molekuly nukleové kyseliny s podobnou genetickou informací k sobě přiblíží a vymění si nukleotidové řetězce. Nukleotidová sekvence rekombinantní nukleové kyseliny, která je účinná k dosažení homologní rekombinace v předem definované poloze cílové nukleové kyseliny, tudíž indikuje nukleotidovou sekvenci, která umožňuje výměnu nukleotidových řetězců mezi molekulami rekombinantní nukleové kyseliny v definované poloze cílového genu, např. myšího genu IFN-βζ. Účinná nukleotidová sekvence obecně obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární k požadované cílové molekule nukleové kyseliny (např. genovému lokusu, který má být modifikován), a podporuje párování nukleotidových bází. Jakákoliv nukleotidová sekvence může být použita, pokud umožňuje homologní rekombinaci ve specifické a vybrané poloze v sekvenci cílové molekuly nukleové kyseliny. Obecně existuje exponenciální závislost účinnosti targetingu na míře nebo délce homologie mezi targeting vektorem a cílovým lokusem (Výběr a použití sekvence účinné pro homologní rekombinace byly popsány např. v Deng and Capecchi, Mol. Cell. Biol., 12:3365-3371, 1992, Bollag et al.,

Annu. Rev. Genet., 23:199-225, 1989, Waldman and Liskay, Mol.

Cell. Biol., 8:5350-5357, 1988).

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká suprese (potlačení exprese) nebo funkčního narušení exprese genu IFN-p2. Termíny narušení genu, případně genové porušení ·* »·· *

99·· suprese exprese nebo potlačení genové exprese, a také funkční inaktivace genu nebo funkční genová inaktivace označují modifikace genu, které snižují nebo zcela brání expresi genu a/nebo jeho produktu v buňce. Exprese genového produktu může být potlačena úplně nebo pouze částečně, např. redukována o 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % nebo více. Funkčně narušený gen, konkrétně např. funkčně narušený gen IFN-βζ, zahrnuje také modifikovaný gen, který exprimuje zkrácený polypeptid mající kratší sekvenci než je celá kódující sekvence genu divokého typu. Takový gen je ilustrován na obr. 1. Gen může být funkčně narušen také tím, že je ovlivněna struktura jeho mRNA takovým způspbem, že se tvoří netranslatovatelný produkt, např. s posunem čtecího rámce nebo se sníženou stabilitou apod.

Podle předkládaného vynálezu je IFN-βζ gen modifikován takovým způsobem, že je účinný k narušení exprese odpovídajícího genového produktu. Tedy např. funkčně narušený rekombinantní gen IFN-βζ neexprimuje funkční polypeptid IFN-βζ nebo exprimuje funkční polypeptid IFN-βζ jen v takové hladině, které je nižší než je hladina u divokého typu, např. je snížena o 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % nebo více.

Nefunkčním nebo funkčně inaktivním polypeptidem IFN-βζ se míní např. polypeptid IFN-βΖ, který postrádá jednu nebo více ze svých bioaktivit. Gen může být modifikován v kterékoliv účinné poloze, např. v úseku enhancerů, promotoru, regulačních úseků, nekódující sekvence, kódující sekvence, intronů, exonů, atd., vedoucí ke snížení nebo zabránění exprese genu v buňkách. Inzerce do úseku genu IFN-βζ, např. myšího genu IFN-βζ, může být uskutečněna pomocí homologní rekombinace. Rekombinantní molekula nukleové kyseliny obsahující úseky genové homologie a nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér se vloží do promotoru a/nebo kódujícího úseku a/nebo »· · · · * · · nekódujících úseků genu IFN-βζ, čímž se funkčně naruší exprese genu. Když je takový knock out konstrukt vnesen do buňky, může se konstrukt integrovat do genomové DNA. Takže potomstvo buňky bude exprimovat pouze jednu funkční kopii genu, druhá kopie nebude již dále exprimovat genový produkt nebo ho bude exprimovat jen ve velmi nízké hladině, jelikož endogenní nukleotidová sekvence genu je nyní porušena vloženou nukleotidovou sekvencí. Pokud je to třeba, funkční gen může být inaktivován ve druhém analogickém kroku.

Nukleotidová sekvence účinná pro homologní rekombinaci může být operativně spojena s nukleotidovou sekvencí, výhodně nukleotidovou sekvencí pro selekční markér nebo genem, který má být vložen do požadované cílové nukleové kyseliny.

Rekombinantní nukleová kyselina je výhodně vnesena do buněk s chromozómovou DNA, která obsahuje endogenní gen, který má být vyřazen (knocked out). V buňce se rekombinantní molekula nukleové kyseliny může integrovat pomocí homologní rekombinace do DNA buňky v takové poloze, že zabrání nebo přeruší transkripci genu, který má být funkčně vyřazen. Taková inzerce se obvykle uskuteční pomocí homologní rekombinace (tj. úseky targeting vektoru, které jsou homologní nebo komplementární k endogenní DNA sekvenci hybridizují vzájemně po vnesení targeting vektoru do buňky, tyto úseky pak mohou rekombinovat, čímž je část targeting vektoru vložena do odpovídající polohy endogenní DNA) .

Jak bylo diskutováno, jedna nebo více nukleotidových sekvencí může být vloženo do genu pro potlačení jeho exprese. Je potřebné určit přítomnost vložené nukleotidové sekvence v genu. To může být uskutečněno různými způsoby, jako je např. hybridizace nukleových kyselin, vazba protilátky k epitopu kódovanému vloženou nukleovou kyselinou nebo selekce na fenotyp odpovídající vložené sekvenci. V souladu s tím je taková vložená ···· nukleotidová sekvence označována jako první selektovatelná nukleotidová sekvence. Tato první selektovatelná nukleotidová sekvence výhodně poskytuje buňkám, ve kterých je přítomna, první selekční znak. Termín selekční znak označuje nějakou vlastnost, která je exprimována v buňkách, a která může být vybrána přednostně před dalšími nebo jinými vlastnostmi. Selektovatelná nukleotidová sekvence, známá spíše jako gen pro selekční markér, může být jakákoliv molekula nukleové kyseliny, která je detekovatelná a/nebo testovatelná po jejím vložení genomové DNA savce. Selekční vlastnosti mohou být pozitivní, tj .

exprimována nebo získána buňkou a jejíž přítomnost umožňuje selekci takových buněk. Pozitivní selekční vlastnost umožňuje např. buňce nebo organizmu přežít, je to např. rezistence k antibiotikům, rezistence ke ouabainu (gen pro ouabainrezistentní Na/K ATPázu). K příkladům vlastností pozitivní selekce patří geny rezistence, a odpovídající selekční činidla zahrnují tedy např. gen Neo a činidlo G418 nebo kanamycin, Hyg a hygromycin, hisD a histidinol, (tj. selektovatelná) vlastnost, která je

Gpt xantin, Ble a bleomycin,

5,464,764

Přítomnost

Hprt hypoxantin (viz např. U.S. Patent č.

Capecchi, Science, 244:1288-1292,

1989).

selekčního genu v cílové sekvenci může být identifikována pomocí vazby produkt selekčního genu, např, ligandů, které rozpoznávají protilátka může být použita k identifikaci polypeptidového produktu kódovaného selekčním genem, vhodný ligand může být použit k identifikaci exprese receptorů polypeptidu kódovaného selekčním genem nebo může být proveden test na expresi enzymu kódovaného selekčním genem. Výhodně gen pro selekční markér kóduje polypeptid, který se přirozeně v savci nevyskytuje.

Gen pro selekční markér může být operativně spojen se svým vlastním promotorem nebo s jiným promotorem z jakéhokoliv • ·· · ·♦ • 9 9 • * ♦ ♦ · · · • · · ·· ·«·· zdroje, který je aktivní nebo může být snadno aktivován v buňkách, do kterých je vložen. Avšak gen pro selekční markér nemusí být připojen ke svému vlastnímu promotoru, může být transkribován z promotoru genu, do kterého je vložen. Gen pro selekční markér může obsahovat jednu nebo více sekvencí, které řídí a/nebo napomáhají jeho expresi, jako je např. ribozomrozpoznávající sekvence, enhancerová sekvence, sekvence, která poskytuje stabilitu polypeptidu nebo RNA a/nebo polyA sekvence připojená ke 3' konci pro terminaci transkripce genu.

Pozitivní selekční markér umožňuje selekci rekombinant, které mají pozitivní selekční markér integrovaný v cílové nukleové kyselině pomocí homologní rekombinace. Gene targeting vektor podle předkládaného vynálezu může také druhý selekční znak kódovaný druhým genem, jako pomoc pro přesnější selekci Negativní selekční markér umožňuje dále obsahovat selektovátelným cílových rekombinant selekci proti buňkám, u kterých došlo pouze k nehomologní rekombinaci. V jednom výhodném provedení vynálezu druhý gen pro selekční markér poskytuje negativní selekční znak buňkám, do kterých byl vnesen. Takové negativní selekční znaky mohou být uspořádány v targeting vektoru takovým způsobem, že mohou být použity k rozlišení mezi událostí náhodné integrace a homologní rekombinace. Termínem negativní selekce se míní selekční znaky, které, když je buňka získá, mají za následek ztrátu životaschopnosti buňky (tj . jsou pro buňku letální). Nukleosidový analog gancyklovir, který je přednostně toxický pro buňky exprimující HSV tk (thymidinkinázu z viru Herpes simplex), může být použit jako negativní selekční činidlo, a sice pro selekci buněk, které nemají integrovaný selekční markér HSV tk. FIAU, tj. 1,2-deoxy-2-fluor-a-darabinofuranosyl-5-joduracil, může také být použit jako selekční činidlo pro selekci buněk postrádajících HSV tk.

• ·· »* · * ♦ · • · • · ·1· »4«· * 9 9

9 * « » « 9

9 9

99··

Další negativní selekční markéry mohou být použit analogicky. Příklady negativních selekčních znaků (resp. genů) a odpovídajících činidel jsou thymidinkináza (HSV tk) a acyklovir, gancyklovir nebo FIAU, Hprt a 6-thioguanin nebo 6-thioxantin, difterický toxin, ricinový toxin, cytosindeamináza a 5-fluorcytosin.

Negativní selekční markér je typicky v targeting vektoru vložen 5' nebo 3' od rekombinogenních homologických úseků, aby se při nahrazení homologických úseků při dvojitém crossoveru přenesl pozitivní selekční markér do předem určené lokalizace v cílové nukleové kyselině, ale přitom se nepřenesl negativní selekční markér. Tak například kazeta může být loklaizována na 3' konci myšího genu, přibližně 150 párů bází od 3' stop kodonu. V targeting vektoru může být také použito více (než jeden) negativních selekčních markérů. Tak například umístění dvou negativních selekčních markérů na 5' a 3' konce targeting vektoru dále zesiluje selekci proti cílovým buňkám, u kterých došlo k náhodné integraci vektoru. Náhodná integrace má někdy za následek přestavbu vektoru, která vede k vystřižení celého nebo části negativního selekčního markéru před místem náhodné integrace. Když k tomu dojde, pak nemůže být negativní selekce použita k eliminaci těch buněk, které mají integrovaný targeting vektor pouze náhodnou integrací místo homologní rekombinace. Použití více než jednoho negativního selekčního markéru podstatně zvyšuje pravděpodobnost, že náhodná integrace povede k inzerci alespoň jednoho negativního selekčního markéru. Pro tyto účely se užijí negativní selekční markéry, které jsou stejné nebo odlišné.

Použití schématu pozitivní-negativní selekce snižuje pozadí buněk majících nesprávně integrovanou sekvenci ·· ·· *· • · » · t • « · · • <* · · · • · · * ··«· ·· ···· »»(*· %

• 1 • ·· targeting konstruktu. Pozitivně-negativní selekce typicky zahrnuje použití dvou aktivních selekčních markérů: (1) pozitivní selekční markér (např. neo), který může být trvale exprimován po náhodné integraci nebo po homologní rekombinaci v cílovém místě, a (2) negativní selekční markér (např. tk) , který může být trvale exprimován pouze po náhodné integraci. Kombinací pozitivní a negativní selekce se dosáhne toho, že mohou být účinně selektovány hostitelské buňky mající správně cílenou událost homologní rekombinace. Schémata pozitivnínegativní selekce byla popsána např. v U.S. Patentu č. 5,464,764, a WO 94/06908. Avšak je třeba uznat, že jeden nebo více negativních selekčních markérů nejsou nezbytné k provedení předkládaného vynálezu, např. pro přípravu transgenního zvířete, kde je gen IFN-p2 funkčně inaktivován nebo narušen.

Molekula rekombinantní nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může také obsahovat celý vektor nebo jeho část. Vektor je např. molekula nukleové kyseliny, která se může autonomně replikovat v hostitelské buňce, např. tedy molekula obsahující replikační počátek. Vektory jsou použitelné k provádění tzv. genových manipulací, k množeni a/nebo přípravě velkého množství rekombinantní molekul v požadovaném hostiteli. Odborník snadno vybere vektor podle požadovaného účelu, např. k množení rekombinantních molekul v bakteriích, kvasinkách nebo hmyzích nebo savčích buňkách. Následující vektory jsou uvedeny jako neomezující příklady.

Bakteriální vektory: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pDlO, Phagescript, ΦΧΙ74, pBK fagemid, pNH8A, pNH16a, pNHl8Z, pNH46A (Stratagene), Bluescript KS+II (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia).

• *··· ·· 4 • · · ··· ·* ·· ·· s

4· * · «

···· »· • · • · • « • » •»tt

Eukaryotické vektory: PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG, pSVL (Pharmacia).

Kterýkoliv další vektor, např. plazmid, virus nebo jejich části, může být použit, pokud je replikovatelný a životaschopný ve zvoleném hostiteli. Vektor obsahovat sekvence, které umožňují replikaci může také v hostiteli, jehož genom je modifikovaný. Použití takového vektoru může prodloužit období interakce, během kterého může proběhnout homologní rekombinace, nebo může zvýšit cílicí účinnost. Příkladem targeting vektoru, který může být použit podle předkládaného vynálezu, je pNTK popsaný v Molecular Biology, Ausubel, F.M. (ed.), et al., Unit 9.16, OBR. 9.16.1.

Podle předkládaného vynálezu funkce genu IFN-p2 může být narušena nebo vyřazena pomocí inzerce exogenní nebo heterologní sekvence do genu, čímž se naruší funkce genu. Například exogenní nebo heterologní sekvence může být vložena do úseku genu IFN-p2 před prvním start kodonem. Nukleotidové sekvence kódující selekční znak může být vložena do genu IFN-βί pomocí homologní rekombinace takovým způsobem, že je operativně spojena s endogenním promotorem IFN-βΣ genu. Po integraci genu selekčního markéru do požadované předem definované polohy v genu IFN-βζ je exprese selekčního znaku řízena endogenním promotorem genu ΙΕΝ-β2, což dovoluje jeho detekci v buňkách, do kterých se integroval.

Gen selekčního markéru může také být integrován v poloze 3' po směru (downstream) od prvního start kodonu genu ΙΕΝ-β2. Selekční markér může být integrován mimo čtecí rámec a nebo shodně s čtecím rámcem polypeptidu ΙΤΝ-β2, takže pak vzniká fúzní polypeptid, přičemž fúzní polypeptid je méně aktivní než normální produkt. Detekcí pouze těch buněk, které exprimuji tento znak, mohou být vybrány buňky, které obsahují ·· ·

integrovanou sekvenci v požadovaném místě. Vhodným způsobem pro provádění takové selekce je použití rezistence k antibiotikům. V příkladech dále uvedených byla užita rezistence k neomycinu jako selekční znak. Buňky pěstované v přítomnosti toxické koncentrace neomycinu normálně odumírají. Získání genu rezistence k neomycinu pomocí homologní rekombinace umožní buňkám uniknout letálnímu účinku, čímž je umožněna jejich selekce.

Gen IFN-βΖ vyřazen nebo funkčně narušen integrační událostí. Inzerce selekčního genu před kódující sekvenci IFN-βΖ účinně izoluje gen od promotorové sekvence, a tím brání jeho expresi. Když selekční gen obsahuje terminátor transkripce, pak transkripce genu s využitím promotoru IFN-βΖ skončí bezprostředně za ním a tudíž jen velmi zřídka povede k transkripci kódující sekvence IFN-βζ. Gen IFN-βΖ může také být vyřazen pomocí delece bez nahrazení, jako je například místně cílená delece části genu. Deletovaný úsek může být v takovém případě kódující úsek nebo regulační úsek genu.

Gen IFN-βζ může být modifikován v jakékoliv požadované poloze. Může být modifikován tím, že je připraven zkrácený polypeptid IFN-P2, který má jednu nebo více aktivit úplného polypeptidu IFN-p2. Z rekombinantního genu mohou být také vložené sekvence odstraněny, je-li to třeba. V příkladu neomycinová kazeta nahrazující exony myšího genu IFN-βζ gen funkčně inaktivuje. Neomycinová kazeta může být následně odstraněna z genu IFN-βΖ např. pomocí rekombinázového systému. Místně specifický rekombinační systém Cre-lox je zvláště použitelný pro odstranění sekvence z rekombinantního genu. Aby mohl být užit sytém Cre-lox, jsou integrována do chromozómu společně se selekčním genem rozpoznávací místa rekombinázy, která později umožní jeho odstranění. Pro návody k použití systémů • · • ·· · s rekombinázou pro vystřihování genů viz např. U.S. Patenty č. 5,626,159, 5,527,695, a 5,434,066, a také Orban, P.C., et al., Tissue-and Site-Specific DNA Recombination in Transgenic Míce, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:6861-6865, 1992, 0'Gorman, S., et al.,. Recombinase-Mediated Gene Activation and Site-Specific Integration in Mammalian, Cells, Science, 251:1351-1355, 1991, Sauer, B., et al., Cre-stimulated recombination at loxP-Containing DNA sequences placed into the mammalian genome, Nucl. Acids Res.,. 17(1):147-161, 1989.

Pro další aspekty týkající se nukleových kyselin se odkazujeme na standardní učebnice a příručka molekulární biologie, např. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Sciences Publishing, lne., New York, 1986, Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985, Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press, 1989, Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci humánního interferonu-beta-2, včetně 5' a 3' sekvence.

Obr. 2 ukazuje aminokyselinovou sekvenci humánního interferonu-beta-2. Je uvedena translace otevřeného čtecího rámce pro IFN-p2. Signální sekvence je zvýrazněna kurzívou a dvě potenciální místa N-glykosylace a také cysteiny schopné vytvořit disulfidickou vazbu jsou znázorněny podtržením a tučně.

• · • · · ·

Obr. 3 ukazuje trojrozměrnou strukturu struktury interferonu typu I. Všechny tři IFN sdílejí společný motiv svazku 5 šroubovic charakteristický pro humánní IFN typu I. Kromě toho, IFN-pib a IFN-p2 jsou si navzájem podobné v lokalizaci jejich potenciálních N-glykosylačních míst a předpokládaných disulfidických vazeb. Unikátní C-koncová aminokyselinová sekvence je však přítomna pouze v IFN-p2.

Obr porovnávající interferonů.

je humánní přiřazení (alignment) proteinů interferon-beta-2 s ostatními typy

Obr. 5 představuje fylogenetické srovnání IFN-p2 s humánními interferony typu I a typu II. Na základě konzervativního profilu cysteinů, potenciálních Nglykosylačních míst a fylogenetické analýzy se ukázalo, že IFN-p2 je blíže příbuzný s IFN-β než s dalšími interferony.

Obr. 6 ukazuje test s reportérovým genem ISREluciferáza závislý na IFN typu I pro humánní interferon-beta-.

Obr. 7 ukazuje výsledky k receptoru humánního IFN-£2 typu protilátky anti-IFN-p2.

inhibice vazby IFN-p2 I účinkem polyklonální

Obr. 8 proliferaci buněk (A a B) ukazuje účinek interferonů na

Obr. 9 ilustruje antiproliferativní aktivitu IFN-p2 na humánní buňky.

Obr. 10 ukazuje antivirovou aktivitu interferonů na humánní buňky.

• ·

Obr. 11 ukazuje kompetici mezi IFN-a2 a IFN-p2 o vazbu k receptoru interferonů typu I.

Obr. 12 je 5' úsek genomové nukleotidové sekvence humánního IFN-p2.

Obr. 13 je nukleotidové sekvence kódující 5' úsek humánního IFN-βζ.

Obr. 14 je 5' úsek polypeptidové sekvence humánního

ΙΕΝ-β2.

Obr. 15 ukazuje antiproliferační účinek ΙΓΝ-β2 na humánní fetální astrocyty. (A) je fetální mozková kultura 1 bez jakékoliv stimulace a (B) je fetální mozková kultura stimulovaná EGF, (C) je fetální mozková kultura 2 bez jakékoliv stimulace a (D) je fetální mozková kultura stimulovaná EGF.

Příklady provedení vynálezu

Exprese a purifikace IFN-βΣ

Purifikovaný IFN-P2 byl porovnáván s IFN-pib pomocí SDS-PAGE. IFN-P2 má zjevnou molekulovou hmotnost 26 kD jak bylo určeno prostřednictvím SDS-PAGE, zatímco IFN-pib má zjevnou molekulovou hmotnost přibližně 20,5 kD.

Metoda: PCR primery (5'-GGA ATT CCT ACT ACC TCG GGC TTC TAA-3' a 5'GCG CGC GCA TAT GCT AGA TTT GAA ACT GAT TAT-3') byly navrženy s cílem amplifikovat kódujícího úsek IFN-βΣ, a sice bez signální sekvence, z izolované humánní genomové DNA • · pro následnou ligaci do IPTG indukovatelného pet5a expresního vektoru (Promega Corp). Po indukci ΙΓΝ-β2 byl izolován z inkluzních tělísek E. coli a solubilizován s použitím Zwittergent 3-14 (Russell-Harde et al., J. Interferon Cytokine Res., 15, 31-37, 1995). Purifikace IFN-βΖ ze solubilizovaných inkluzních tělísek bylo dosaženo s použitím iontoměničové chromatografie následované vylučovací chromatografií. Pás o velikosti 26 kD, odpovídající IFN-βΣ, byl eluován z SDS-PAGE gelu a analyzován N-koncovým sekvencováním proteinu: prvních 10 aminokyselin odpovídalo aminokyselinám očekávaným pro IFN-βΕ. Kromě toho bylo prováděno štěpení bromkyanem poskytující několik fragmentů, které byly sekvencovány a bylo zjištěno, že měly předpovídanou proteinovou sekvenci, což prokazovalo, že byl úspěšně exprimován a purifikován kompletní protein.

Aktivace ISRE-luciferázového reportérového genu závislého na interferonu prostřednictvím ΙΕΝ-β2

Buňky T98G byly transfekovány plazmidem obsahujícím ISRE-luciferázový konstrukt a byl izolován stabilní klon exprimující konstrukt. 3xl0⁴ buněk bylo naneseno na misky přes noc a purifikovaný IFN-βζ byl přidán v uvedených koncentracích. Po čtyřech hodinách byly buňky testovány na luciferázovou aktivitu s použitím luciferázové testovací soupravy, jak bylo popsáno v protokolu kitu (Promega kat. č. E1501). IFN-βζ specificky aktivoval ISRE reportérový gen závislý na interferonu. (viz obr. 6). S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti ΙΕΝ-β2 podobné vlastnostem ΙΓΝ-β-lb.

«« ··

Inhibice vazby ΙΕΝ-β2 k humánnímu typu I interferonového receptoru myší anti-IFN^2 polyklonální protilátkou

Peptid odpovídající unikátnímu C-koncovému úseku IFN-βΣ (KLSKQGRPLNDMKQELTTEFR) byl syntetizován, kondenzován ke KLH a použit k imunizaci myší kmene Swiss-Webster pro celkem čtyři imunizace po dobu dvou měsíců. Po imunizaci byla odebrána séra a bylo prokázáno, že obsahují protilátky, které specificky vážou ΙΕΝ-β2. Kromě toho anti-IFN-^2 séra blokovala indukci ISRE-luciferázového reportérového genu závislého na IFN prostřednictvím ΙΤΝ-β2. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti ΙΡΝ-β2 podobné vlastnostem IFN-^lb.

pěstováno

Metoda: 3xl0⁴ přes noc a buněk 20 ng bylo naneseno na misky a ΙΓΝ-β2 bylo přidáno buď v přítomnosti anti-IFN-^2 séra nebo normálního myšího séra po dobu čtyř hodin, a pak testováno na přítomnost indukované luciferázy s použitím luciferázové testovací soupravy a standardního protokolu od firmy Promega Corp. (viz obr. 7).

Účinek IFN^lb a ΙΕΝ-β2 na proliferaci humánních buněk HT1080

IFN-^lb a ΙΡΝ-β2 mají antiproliferativní účinek u obou buněk HT1080 a buněk HT1080IFNAR2c. To bylo evidentní na obou panelech z testu s modří Alamar (obr. 8A a Β) , a také vizuálním vyšetřením. Antiproliferativní účinek koreloval se zvýšením počtu receptorů, jako dokázáno zvýšeným účinkem v buňkách HT1080IFNAR2c, které měly pětinásobný počet IFN vazebných míst ve srovnání s buňkami HT1080. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti IFN-βζ podobné vlastnostem IFN-pib.

Metoda: buňky HTl080lFNAR2c jsou buňky HT1080, kter nadměrně exprimují IFNAR2c. Tyto buňky projevovaly pětinásobný počet vazebných míst pro IFN než parentální buňky HT1080. 25xl0⁴ buněk/ml bylo naneseno na misky a pěstováno přes noc a buď nestimulováno nebo stimulováno s 1 pg/ml_z 500 ng/ml, 200 ng/ml nebo 50 ng/ml IFN-p2. Ale buňky HT1080 byly stimulovány s 1 pg/ml, 500 ng/ml nebo 200 ng/ml IFN-β, zatímco buňky HT1080IFNAR2C byly stimulovány s 500 ng/ml, 200 ng/ml nebo 50 ng/ml IFN-β. Modř Alamar (patent Spojených Států č. 5 501 959) byla použita k měření buněčné proliferace s použitím standardního protokolu a z reprezentativního pole byly v každý časový bod odebírány fotografie. Média obsahující interferon byla vyměňována denně. Všechna ošetření byla prováděna v triplikátech. (viz obr. 8).

Antiproliferativní aktivity ΙΕΝ-β2 na humánní buňky HT1080 při měření krátkodobou inkorporací ³[H] thymidinu

Inkorporace ³[H] thymidinu byla měřena 48 hodin po přidání ΙΕΝ-β2 (šrafováný sloupec) nebo kontrolního pufru (plný sloupec). Inkorporace ³[H] thymidinu je předložena jako CPM inkorporované do 10⁶ buněk. Data (obr. 9) představují průměrné hodnoty n = 3 a variace mezi opakováními byly menší než 15%. IFN-βζ snižoval významně inkorporací thymidinu, např. přibližně o 86%. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti IFN-βζ podobné vlastnostem ΙΡΝ-βΙΚ ·· ·· * * • » » • · · • · « ♦ ♦ ··· ·

Metody: buňky byly vysety (2xl0⁴ buněk/jamku) na 24 jamkové kultivační destičky, inkubovány přes noc, a pak stimulovány s IFN-p2 (1 gg/ml po dobu 24 hodin. Buňky pak byly inkubovány v kompletních médiích obsahujících ³[H] thymidin ([methyl-3H] thymidin), specifická aktivita =40-60 Ci/mmol, Amersham Life Science) a sklizeny po 24 hodinách. Buňky byly promyty fyziologickým roztok pufrovaným s fosfáty (PBS), pak následovala 10% trichloroctová (TCA) kyselina a 100% ethanol. Před určováním inkorporace radioaktivity byly buňky solubilizovány v IM hydroxidu draselném a smíchány se scintilační tekutinou Ecolume.

Aktivace IFN receptorů typu I prostřednictvím ΙΕΝ-β2

IFN-p2 indukoval tyrozinovou fosforylaci IFNAR2c receptorového řetězce humánního IFN receptorů typu I. Buňky byly buď nestimulovány nebo stimulovány humánním IFN-a2, IFN-pib nebo IFN~P2 (1000 - 2000 relativních jednotek/10⁶ buněk po dobu 15 minut). Fosforylace byla pozorována v přítomnosti ale ne v nepřítomnosti interferonů. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti IFN-p2 podobné vlastnostem IFN-pib.

Metody: Daudi buňky exprimující IFNAR2c (5xl0⁷ buněk) byly solubilizovány v lyzačním pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,5, obsahující 1% Nonidet-40 (objem/objem) (NP-40), 150mM chlorid sodný, lmM EDTA, 2,5% glycerol (objem/objem), l,0mM fluorid sodný, l,0mM ortovanadičnan sodný, l,0mM fenylmethysulfonylfluorid (PMSF), 0,5 pg/ml leupeptinu a 5,0 gg/ml inhibitoru trypsinu) po dobu 30 minut ve 4°C a nerozpustná látka byla odstraněna centrifugací. Pro imunoprecipitaci IFNAR2c antiséra • ·· · ·» ···· a rozděleny

Proteiny byly (Pro-Blot) a (+) nebo negativní kontrolní antiséra (-) byla přidána ke každému vzorku, vzorky byly inkubovány přes noc, smíchány s Protein-G agarózou (Boehringer-Mannheim), prostřednictvím SDS-PAGE (10% Novex gely). přeneseny na difluorpolyvinylidenové filtry inkubovány v blokovacím pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,5 obsahující 0,1% Tween 20 (objem/objem), 150mM chlorid sodný, lmM EDTA, l,0mM fluorid sodný, l,0mM ortovanadičnan sodný, l,0mM PMSF, 0,5 gg/ml leupeptinu a 5,0 gg/ml inhibitoru trypsinu) přes noc ve 4°C, inkubovány s antifosfotyrozinovou protilátkou (Ab PY99, Santa Cruz Biotechnology, lne. Santa Cruz, CA) a promyty v blokovacím pufru. Po promytí byla membrána inkubována se specifickou druhou protilátkou (1:1000 ředění) kondenzovanou s křenovou peroxidázou (HRP) po dobu 1 hodiny, promyta 3 krát v blokovacím pufru a vyvolána s použitím detekční metody chemiluminiscence (Pierce).

Aktivace STATI a STAT2 v buňkách Daudi stimulací s ΙΕΝ-β2

Buňky Daudi byly stimulovány s IFN-plb nebo IFN-βΣ (1000 až 2000 relativních jednotek/10⁶ buněk) po dobu 15 minut, solubilizovány v lyzačním pufru a STATI a STAT2 byly imunoprecipitovány. Po imunoprecipitaci byla detekována tyrozinová fosforylace STATI a STAT2 s použitím fosfotyrozinové specifické protilátky pro oba typy IFN. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti ΙΕΝ-β2 podobné vlastnostem IFN^lb.

Metody: buňky Daudi (lxlO⁷ buněk) byly solubilizovány v lyzačním pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,5, obsahující 1% Nonidet-40 (objem/objem) (NP-40), 150mM chlorid sodný, lmM

Λ · • * · ► ♦ ····

EDTA, 2,5% glycerol (objem/objem), Ι,ΟπιΜ fluorid sodný, l,0mM ortovanadičnan sodný, l,0mM fenylmethysulfonylfluorid (PMSF), 0,5 pg/ml leupeptinu a 5,0 pg/ml inhibitoru trypsinu) po dobu 30 minut ve 4°C a nerozpustná látka byla odstraněna centrifugací. Po imunoprecipitaci protilátky STATI a 2 (Stati p91 a Stat2 (C-20), v daném pořadí, Santa Cruz Biotechnology, Cruz, CA) byly přidány ke každému vzorku, přes noc, smíchány s Protein-G agarózou rozděleny prostřednictvím

Proteiny lne. Santa inkubovány (Boehringer-Mannheim) a (10% Novex gely), difluorpolyvinylidenové byly

SDS-PAGE přeneseny na filtry (Pro-Blot) a inkubovány v blokovacím pufru (20mM Tris-HCl, pH 7,5 obsahující 0,1% Tween 20 (objem/objem), 150mM chlorid sodný, lmM EDTA, l,0mM fluorid sodný, Ι,ΟπιΜ ortovanadičnan sodný, l,0mM PMSF, 0,5 pg/ml leupeptinu a 5,0 μς/πιΐ inhibitoru trypsinu) přes noc ve 4°C, inkubovány s antifosfotyrozinovou protilátkou (PY99, Santa Cruz Biotechnology, lne. Santa Cruz, CA) a promyty v blokovacím pufru. Po promytí byla membrána inkubována se specifickou druhou protilátkou (1:1000 ředění) kondenzovanou s křenovou peroxidázou (HRP) po dobu 1 hodiny, promyta 3 krát v blokovacím pufru a vyvolána s použitím detekční metody chemiluminiscence (Pierce).

Antivirová aktivita IFN-P2 a IFN-plb

Humánní buňky WISH byly stimulovány buď s IFN-pib nebo IFN-p2, pak následovala infekce virem vezikulární stomatitidy (VSV). Virový cytopatický účinek (CPE) byl měřen s použitím redoxního barviva modři Alamar. Jednotky antivirové aktivity odpovídající IFN-pib byly vyneseny do grafu podél osy

X. Specifická antivirová aktivita IFN-βζ byla stanovena na 4,0 až 8,0xl0⁶ mezinárodních jednotek (IU) na mg. (viz obr. 10). S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti IFN~P2 podobné vlastnostem IFN-pib.

Metody: buňky WISH (30,000 buněk/jamku) byly naneseny na misky na 96 jamkové mikrotitrační destičky Falcon a ponechány přes noc, aby se přichytily, buňky byly stimulovány s IFN-pib (1000 IU v první jamce, specifická aktivita = 2,5xl0⁷IU/ml) nebo IFN-βΖ (1 μρ v první jamce), ředěno 1:1 přes destičku, po 6 hodinách následovalo přidání VSV (7xl0³ jednotek tvořících plaky/jamka (PFU)) po dobu 18 hodin. Po inkubaci byla média odstraněna a 100 μΐ modři Alamar (Biosource International) (1:10 ředění médiem zásobního roztoku dodávaného výrobcem) bylo přidáno ke každé jamce. Po inkubaci po dobu 30 - 60 minut ve 37 °C bylo stanoveno CPE měřením absorbance v 600 nm.

IFN-βζ kompetuje s IFN-a2 o vazbu k IFN receptoru typu I na buňkách HT1080 lxlO⁶ HT1080 buněk bylo inkubováno po dobu 90 minut s 15 ng/ml ³²P-značeného IFN-a2 (Pestka Biomedical č. 51100) v kompletních tkáňových kultivačních médiích (10% FBS, DMEM). Po inkubaci byly buňky dvakrát promyty tkáňovým kultivačním médiem, solubilizovány v 1% SDS, smíchány se scintilační tekutinou a počítány. 15 pg/ml IFN~P2 kompetovalo z více než 90 % značeného IFN-βζ vázaného na buňky HT1080. Testy byly prováděny v triplikátech a standardní odchylky byly menší než 10 procent. Viz obr. 11.

• ·

« » · ί * · * ♦ « » *

444·

Kompetitivní vazba IFN~P2 k IFN receptoru typu I na buňky Daudi

Vazebné testy kompetice o ligand byly prováděny s fosforylovanou formou IFN-a2. Ligand je fosforylován (specifické aktivity 60-62 μϋί/μρ), jak bylo popsáno (Croze,

E., et al., J. Biol. Chem., 271: 33165-33168, 1996) . Vazebná data jsou analyzována, jak bylo popsáno (Scatchard, G. , Ann.

N. Y. Acad. Sci., 51, 660-672, 1965). Nespecifická vazba je stanovena v přítomnosti 100-násobného nadbytku neznačeného IFN. Kompetitivní vazba různých IFN je určována inkubací zvyšujících se množství neznačeného IFN-a2, IFN-plb nebo ΙΕΝ-β2 s konstantním množstvím fosforylovaného IFN-a2. S použitím tohoto testu prokazuje IFN-P2 funkční vlastnosti podobné vlastnostem IFN-plb.

IFN-β specifické sestavení IFN receptoru typu I

IFN-plb interaguje s IFN receptorem typu I způsobem rozlišitelným od IFN-a2. S použitím tohoto testu prokazuje IFN-P2 funkční vlastnosti podobné vlastnostem IFN-pib.

Metody: buňky (lxlO⁸) byly stimulovány s IFN v koncentraci 200 IU/10⁶ buněk ve 37 °C po dobu 15 minut v inkubátoru s CO₂. Po ošetření byly buňky rychle sklizeny ve 4°C centrifugací (3000 x g, 3 minuty) a okamžitě solubilizovány v ledově chladném lyzačním pufru (lOOmM Tris, pH 8,0, obsahujícím 150mM NaCl, 10% glycerol (objem/objem), 1% NP-40 (objem/objem), lmM ortovanadičnan, lmM pyrofosfát sodný, lmM fluorid sodný, lmM EDTA, lmM fenylmethylsulfonylfluorid, μρ/ιηΐ leupeptinu a 5 μς/ιηΐ inhibitoru trypsinu) . Lyzát byl stočen (16, 000 x g, 30 minuty) ve 4°C a supernatant byl * · · *

<· *· • » * • · ♦ • » · • · 9 ·· ·♦·· sebrán. Buněčné lyzáty byly imunoprecipitovány s použitím protilátek anti-IFNARl, jak bylo popsáno (Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996) nebo králičích polyklonálních antisér IFNAR2.2 (10 μΐ antiséra/10⁸ buněk), pak následovala analýza SDS-PAGE s použitím Novex 8% Tris-glycinových gelů. Po elektroforéze proteiny byly přeneseny na fluoridpolyvinylidenové (PVDF) filtry (Pro-Blot) a blokovány pufrem 20mM Tris, pH 8,0, obsahujícím 150mM NaCl, lmM ortovanadičnan, lmM pyrofosfát sodný, lmM fluorid sodný, lmM PMSF, a 0,1% Tween 20 přes noc při teplotě místnosti. Filtry pak byly inkubovány s protilátkami namířenými proti IFNAR1 (40H2, 0,1 μg/ml, jak bylo popsáno v Croze, E., et al., J. Biol. Chem., 271, 33165-33168, 1996) nebo IFNAR2 (10 μΐ antiséra/10 ml blokovací pufr) po dobu 2 až 3 hodin při teplotě místnosti, pak následovala čtyři 10-minutová promytí blokovacím pufrem. Promytý filtr pak byl inkubován s odpovídající druhou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP) po dobu 2 až 3 hodin při teplotě místnosti, promyt a vyvolán s použitím chemiluminescence (Enhanced Chemiluminescence Detection Kit, Pierce).

Preferenční indukce genů prostřednictvím odlišných tříd interferonů

Interferony indukovaly překrývající se typické sady genů v pěstovaných buňkách. Buňky Daudi nebo HT1080 byly stimulovány buď s humánním IFN-a2 (1000 IU/10⁶ buněk), IFN-plb (1000 IU/10⁶ buněk), IFN-γ (1000 IU/10⁶ buněk) nebo ΙΕΝ-β2 (1000 IU/10⁶ buněk) po dobu 17 hodin, a celé buněčné pelety byly sebrány a zpracovány pro analýzu TaqMan®, jak bylo <

• ♦ • « » « popsáno v protokolech (TaqMan© Gold RT-PCR Protocol Manual, Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation P/N 402876 Rev. A 1997). Pro RNázové protékání testy genové exprese byly buňky stimulovány a sklízeny, jak bylo popsáno (Sandhya, R. Et al., J. Biol. Chem., 271, 22878-22884, 1996). Geny preferenčně indukované prostřednictvím IFN-plb byly normalizovány k expresi ISG 6-16, genu indukovaného rovným dílem prostřednictvím IFN-a a IFN-β. S použitím tohoto testu prokazuje IFN-βζ funkční vlastnosti podobné vlastnostem IFN-pib.

Antiproliferační účinek IFN-βζ na humánní fetální astrocyty

Astrocyty přispívají k rozvoji MS lézí, a původci prokázali, že IFN-βΖ inhibuje proliferaci humánních fetálních astrocytů in vitro. Toto pozorování předpokládá, že IFN-βζ mohou působit jako růstový regulátor proliferace astrocytů, a tudíž zabránit vytvoření reaktivních gliových lézí u MS. S použitím tohoto testu byly prokázány funkční vlastnosti ΙΕΝ-β2 podobné vlastnostem IFN-pib.

Metody:

(A) Příprava astrogliových kultur: Astrocyty obohacené kultury z fetálních humánních mozků byly připraveny ze 2 odlišných fetálních mozků z 17-22 týdnů trvající gestace. Tkáň byla získána od Advanced Bioscience Resource lne. po legálním terapeutickém abortu. Poté, co byly odstraněny meningy, byly mozky rozřezány a rozloženy na jednobuněčnou suspenzi jemným pipetováním následovaným protlačením suspenze přes sítka, buňky byly v resuspendovány v médiu dle Iscoveho obsahujícím 10% FCS v přítomnosti směsi antibiotik obsahující «0 ·» • 0 *

• « 0 • 00 0000

0000 penicilín, streptomycin a fungizon, a mikroglie byly odstraňovány každý den po celý týden rozlišovací adhezní technikou. Astrocyty byly pak pěstovány po dobu alespoň 8-10 týdnů a živeny dvakrát týdně. Kontaminující mikroglie, neurony a progenitory oligodendrocytů nemohou přežít tyto podmínky dlouhodobých tkáňových kultur. Na konci tohoto období původci obarvili kultury GFAP, 04 a nestinovými protilátkami a potvrdili, že kultury jsou z více než 95 % čisté astrocyty. Kultury byly zmraženy v tekutém N₂ předtím, než byly použity pro proliferační test.

(B) Proliferační test: Astrocyty byly rozmraženy ze zmraženého zásobního roztoku .a pěstovány ve výše popsaných médiích po alespoň dvě pasáže předtím, než byly použity pro proliferační test. buňky byly naneseny na 96 jamkové destičky v koncentraci 2xl0⁴ buněk/ml s 10 ng/ml EGF (R&D Systems) nebo bez něj. Test byl prováděn v médiu s nízkým obsahem séra (2% FCS) . Kultury byly ošetřeny s IFN-βζ (zásobní roztok 1 mg/ml) nebo pufrem jako kontrolou v ukázaném ředění. Po 4 dnech inkubace byly kultury inkubovány přes noc s ³H-thymidinem a destičky byly zmražen před sklízením buněk.

Aktivita ΙΡΝ-β2 v modelu hlodavců se sclerosis multiplex

Experimentální alergická encefalomyelitida (EAE) je široce používaná jako zvířecí model pro sclerosis multiplex (Swanborg, G., Clin. Immunol. Immunopathol., 77, 4-13, 1995, Martin, R. a McFarland, H., Springer Semin. Immunopathol., 18, 1-24, 1996). IFN-Plb vykazuje in vivo účinnost v těchto relevantních modelech MS. S použitím těchto modelů prokazuje IFN-βΖ funkční vlastnosti podobné vlastnostem IFN-pib.

• · ♦ ·· • 9·9· «· ·'· * · · • « ·

Metody:

(A) Pasivní transfer experimentální alergické encefalomyelitidy u SJL myší:

Zvířata a materiál: 8 týdnů staré samice SJL myší (Jackson Laboratories), RPMI 1640 s L-glutaminem a 25mM HEPES, lx, 0,1 μ filtrace (Life Technologies, katalog, č. 22400-089), FBS, definované (Hyclone, inaktivováno teplem, kat č. SH30070.01), MEM roztok neesenciálních aminokyselin, lOmM, lOOx (Life Technologies, katalog. č. 11140-050), 2merkaptoethanol, ΙΟΟΟχ, 5,5xl0~² M v D-PBS (Life Technologies, katalog, č. 21985-023), penicilin/streptomycin, 10 000 ϋ/μρ na ml (Bio-Whittaker, katalog. č. 17-602 E), Hankův vyvážený solný roztok, lx, 0,1 μ filtrace (Life Technologies, katalog, č. 24020-117) .

Experiment: 8 týdnů staré samice SJL myší byly imunizovány 0,1 ml subkutánní (rozděleno mezi kořen ocasu a horní část hřbetu) injekcí obsahující 150 μς proteolipidový protein (PLP) v kompletním Freundově adjuvans (CFA) s 200 μς M. Tuberculosis H37Ra (základ) . 11 dnů později byly myším vyříznuty axiální, brachiální a ingvinální lymfatické uzliny a pěstovány v koncentraci 6xl0⁶ buněk/ml v následujícím médiu (ke 450 ml RPMI 1640 (s L-glutaminem plus HEPES) bylo přidáno 50 ml FBS, 0,455 ml 2-merkaptoethanolu, 5,0 ml pen/strep a 5,0 ml neesenciálních aminokyselin. K buňkám bylo přidáno PLP za zisku konečné koncentrace 50 μρ/ιηΐ. buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin ve 37 °C, 7% CO₂. buňky byly sklízeny a promyty dvakrát v HBSS. životaschopnost buněk lymfatických uzlin byla stanovena vylučováním trypanové modři. Koncentrace buněk lymfatických uzlin byla upravena na 4xl0⁷ buněk na ml. 2xl0⁷buněk lymfatických uzlin bylo ínjikováno intraperitoneálně ·♦ »♦·· ·· ► « · *

♦ ·*« (objem dávky = 0,5 ml) na myš naivním 8 týdnů starým samicím SJL myší. Myši byly váženy a skóre bylo hodnoceno denně. Ošetření s IFN~P2 a IFN-pib bylo podáváno dle potřeby. Klinické hodnocení (EAE skóre/symptomy): 0/normální, 1/ ochablý ocas, 2/obtíže při rovném stání, 3/nekompletní paralýza jedné nebo obou zadních končetin, 4/kompletní paralýza jedné nebo obou zadních končetin, 5/imobilní, umírající nebo mrtvá.

(B) Akutní experimentální alergická encefalomyelitida u laboratorních potkanů kmene Lewis:

Zvířata a materiál: samice laboratorních potkanů kmene Lewis (Charles River) , imunizované ve věku 8 týdnů, homogenizované preparáty míchy (ze samců 'morčat kmene Hartley, Simonsen Labs, Gilroy):

Morčatům o hmotnosti 500-700 gramu byla podana eutanázie s CO₂. Míchy byly odstraněny s použitím ostrých kostních nůžek pro řezání obratlů, promyty ve fyziologickém roztoku, osušeny jednou filtračním papírem a pak uloženy v 80°C až do dne použití. Míchy pak byly zváženy a homogenizovány v solném roztoku homogenát morčecí míchy byl (Difco, Detroit, Michigan) tuberculosis (rozetřeným pomocí ml bylo injikováno do chodidla celkem 0,1 ml na jednoho potkana.

(1 g/ml) antigenní emulze: smíchán v poměru 1:1 s CFA s 1 mg/ml Mycobacterium tloučku v třecí misce). 0,05 každé zadní končetiny, tedy

Experiment: potkani byli 1. den imunizováni s jednou bolusovou injekcí. Potkani byli zváženi a pak byli denně sledováni. Dávky IFN-βζ a IFN-pib byly podávány podle potřeby. Klinické hodnoceni (EAE skóre/symptomy): 0/normální, 1/ochablý ocas, 2/neúplná paralýza jedné nebo obou zadních končetin, 3/ kompletní paralýza jedné nebo obou zadních končetin s tím, že končetiny se mohou pohybovat, ale nemohou pohnout tělem, ·«« «

♦ · ·· φ ♦· · · • · · * φ · · · * • * · ♦ ·

Μ« *· ··♦ Φ·*·

4/kompletní paralýza obou zadních končetin, 5/kompletní paralýza zadních končetin a slabost jedné nebo obou předních končetin, nebo umírající či uhynulý.

Předcházející popis vysvětlil vynález v plném rozsahu. Předcházející výhodná specifická provedení byla tudíž použita jen jako ilustrace a pro lepší pochopení, proto rozsah vynálezu nijak neomezují. Citované patentové přihlášky, patenty a další publikace jsou v předkládané přihlášce plně zahrnuty formou odkazu.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Farmaceutický přípravek pro léčení sclerosis multiplex u savce vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a terapeuticky účinné množství humánního polypeptidu IFN-p2 uvedeného na obr. 2, nebo jeho biologicky aktivního fragmentu nebo jeho biologicky aktivního derivátu.
2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že savec je člověk.
3. Způsob podávání savci farmaceutického přípravku k léčení sclerosis multiplex savce, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a terapeuticky účinné množství humánního polypeptidu IFN-p2 uvedeného na obr. 2, nebo jeho biologicky aktivního fragmentu nebo jeho biologicky aktivního derivátu.
4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že savec je člověk.
5. Farmaceutický přípravek pro léčení sclerosis multiplex savce vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a terapeuticky účinné množství humánního polypeptidu IFN-p2 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu nebo jeho biologicky aktivního derivátu.

v···

4*1 44 • « ·

4»

4 ·

4 4· ·

4··· « « «44 • 4444 44 4444
6. Způsob podávání savci farmaceutického přípravku k léčení sclerosis multiplex savce, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje farmaceuticky přijatelný excipient a terapeuticky účinné množství humánního polypeptidu IFN-p2 nebo jeho biologicky aktivního fragmentu nebo jeho biologicky aktivního derivátu.