KR20020083519A - 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

기재와 폴리히드록시알카노에이트를 가지고, 상기 기재의 적어도 일부는 상기 폴리히드록시알카노에이트로 피복되고, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산 유닛, 3-히드록시-n-길초산유닛을 제외한 3-히드록시알칸산유닛을 함유하는 구조체.

Description

구조체 및 그 제조방법{CONSTRUCT AND METHOD FOR MAKING IT}
본 발명은 폴리히드록시알카노에이트와 기재를 구비하고, 이 폴리히드록시알카노에이트가 이 기재의 적어도 일부를 피복한 구조를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 구조체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛 또는 3-히드록시-n-길초산유닛 이외의 3-히드록시알칸산유닛을 모노머유닛으로서 적어도 함유하는 폴리히드록시알카노에이트와 기재를 구비하고, 이 폴리히드록시알카노에이트가 이 기재의 적어도 일부를 피복하고 있는 것을 특징으로 하는 구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중쇄장 폴리히드록시알카노에이트 생합성 반응에 관여하는 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 기재에 고정화하고, 이 효소에 의해 3-히드록시아실 보효소 A를 중합시키고 폴리히드록시알카노에이트를 합성시킴으로써 이 기재의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 것을 특징으로 하는, 구조체의 구조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 구조체에는 입상(粒狀)의 기재에 폴리히드록시알카노에이트를 피복한 캡슐 구조체와, 평판 또는 필름형상의 기재를 폴리히드록시알카노에이트로 피복한, 평판 또는 필름형상의 적층 구조체가 포함된다.
본 발명의 구조체는 기능성 구조체로서 폭넓은 용도에 이용 가능하며, 예를들면 캡슐구조체를 전자사진용의 캡슐토너로서 사용할 수 있으며, 또한 적층구조체를 OHP필름이나 잉크제트기록지 등의 기록매체로서 사용할 수 있다.
고분자재료는 현대의 산업이나 생활에 불가결한 것이며, 염가경량인 것, 성형성이 좋은 것 등으로부터 가전품의 하우징재를 비롯해서 포장재나 완충재, 또는 섬유재료 등 여러 분야에 걸쳐서 이용되고 있다. 한편, 이들 고분자재료의 안정한 성질을 이용해서 고분자의 분자쇄에 여러 가지 기능을 발현하는 치환기를 도입해서 액정재료나 코팅재 등의 각종 기능재료도 얻어지고 있다. 이들 기능재료는 구조재료로서의 고분자보다도 부가가치가 높기 때문에 소량 생산이라도 큰 시장 니드(need)를 기대할 수 있다. 이와같은 고분자기능재료는 이제까지 고분자의 합성프로세스 중에서, 또는 합성한 고분자를 치환기로 수식함으로써 유기합성 화학적수법에 의해 얻어지고 있다. 고분자기능재료의 기본 골격이 되는 고분자는 대부분의 경우, 석유계원료로부터 유기합성화학적 수법에 의해 얻어지고 있다. 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리염화비닐, 폴리아크릴아미드 등이 그 전형적인 예이다.
그래서, 본원 발명자들은 고분자화합물에 큰 부가가치를 주기 위한 하나의 요소기술로서 고분자화합물에 의해 기재를 피복한 중량구조체에 착안해 왔다. 이와같이 고분자화합물로 특정의 기재를 피복함으로써 극히 유용한 기능성을 가진 복합 구조체를 얻을 수 있다. 이와 같은 구조체의 구체적인 용도로서는, 예를들면 고분자화합물에 토너성분을 내포시킨 마이크로 캡슐 구조체로 이루어진 전자사진용 캡슐토너나, 고분자화합물로 시트형상의 기재를 피복한 잉크제트기록방식용 기록매체등을 들 수 있다.
일반적으로, 전자사진법은 광 도전성물질을 이용하고, 여러 가지 수단에 의해 감광체 상에 전기적 잠상을 형성하고, 이어서 이 잠상을 토너를 이용해서 현상하고, 필요에 따라서 종이 등의 전사재에 토너화상을 전사한 후, 가열 압력, 또는 용제증기 등에 의해 정착해서 복사화상을 얻는 것이다. 이 목적에 사용하는 토너로서 종래 열가소성수지 중에 염, 안료로 이루어진 착색제를 용융 혼합하고, 균일하게 분산한 후, 미분쇄장치 및 분급기에 의해 소망의 입경으로 하는 "분쇄토너"가 사용되어 왔다. 이 토너는 뛰어난 능력을 가진 것이지만, 그 제조공정상, 취성이 요구되기 때문에 재료의 선택범위 등에 일정한 제한이 있는 등의 과제가 있었다. 이와같은 과제를 극복하기 위해 일본 특공소 36-10231 호 공보 등에 의해 현탁중합법에 의한 "중합토너" 의 제조가 제안되고 있다. 현탁중합법에 있어서는 중합성 단량체, 착색제, 중합개시제, 또한 필요에 따라서 가교제, 하전제어제 등을 균일하게 용해 또는 분산시킨 후, 분산안정제를 함유하는 연속상(예를 들면, 수상)에 교반기로 분산하고, 동시에 중합반응을 행하게 해서 소망의 토너를 얻는다. 이 방법은 분쇄공정이 포함되지 않기 때문에 토너에 취성이 필요하지 않아, 연질의 재료를 사용할 수 있는 등의 이점이 있다. 그러나, 이와 같은 미소입경의 중합토너로는 착색제나 전하제어제가 토너표층에 노출되기 쉽기 때문에 착색제의 영향이 발생하기 쉬워지고, 또한 대전의 균일성의 저하가 염려된다. 이들 과제를 해결하기 위해 중합체 입자표면을 고분자화합물로 이루어진 일층 또는 복수층의 외피로 피복한, 소위 "캡슐토너"가 제안되어 있다.
이와 같은 캡슐토너로서는, 예를들면 일본특개평 8-286416 호 공보에 있어서, 극성수지를 함유하는 외피로 중합입자를 피복한 정전하현상용 캡슐토너 및 그 제조방법이 개시되어 있다. 이 방법은 토너성분을 포함하는 중합입자로 이루어진 코어의 둘레에 유기합성 화학적 수법에 의해 외피를 형성시킨 것이며, 상기의 과제를 개선하고, 화질 내구성의 향상, 대전의 균일화 및 안정화를 실현시킨 뛰어난 정전하현상용 캡슐토너를 공급할 수 있다. 또한, 일본특개평 9-292735호 공보에서는 강고한 외피수지에 의해서 이형제(離型劑)재료 및 열팽창이 큰 재료로 이루어진 코어를 피복한 화상형성용 캡슐토너가 개시되어 있다. 상기 토너는 정착시의 과열에 의해서 코어 내의 열팽창성 재료가 팽창해서 외피를 파괴함으로써 내포하는 이형제 재료를 외부로 압출하도록 구성된 기능성 마이크로 캡슐이며, 필름 가열형의 정착장치를 사용하는 경우에는 오프셋을 방지할 수 있고, 또한, 롤러전착기를 사용한 경우에는 저가압에서의 정착을 가능하게 하고 또한 종이주름을 저감할 수 있는 등의 효과를 기대할 수 있다. 마찬가지로, 고분자화합물을 외피로 하는 캡슐토너와 그 제조방법으로서는 일본특개평 5-119531호 공보, 동 특개평 5-249725호 공보, 동 특개평 6-332225호 공보, 동 특개평 9-43896호 공보, 동 특개평 10-78676호 공보, 동 특개평 11-7163호 공보, 동 특개평 2000-66444호 공보, 동 특개평 2000-112174호 공보, 특개 2000-330321호 공보등이 개시되어 있으며, 이들 모두 현탁중합법, 유화중합법, 침전중합법, 분산중합법, 소웁프리유화중합법 시트중합법 등의 유기합성화학적 수법에 의해 소망의 캡슐구조체를 제조하고 있다.
그러나, 이들 캡슐토너의 제조방법에 있어서는, 그 제조공정이 극히 복잡하게 되는 제조공정에 있어서 대량의 용매류나 계면활성제를 사용하는 등의 과제도 있었다.
한편, 고분자화합물로 시트형상의 기재를 피복한 적층구조체로 이루어진 기록매체로서는, 예를들면 잉크제트기록 방식에 있어서의 기록매체를 들 수 있다. 잉크제트기록방식은 여러 가지 작동원리에 의해 잉크의 미소방울을 비상시켜서 종이 등의 기록매체에 부착시켜서 화상, 문자등의 기록을 행하는 것이다. 이 기록방식에서는 잉크 속에 물, 물과 유기용제의 혼합액 등의 다량의 용매를 포함하고 있기 때문에 고색농도를 얻기 위해서는 대량의 잉크를 사용할 필요가 있다. 또한, 잉크방울은 연속적으로 사출되기 때문에 최초의 방울이 사출되면 잉크방울이 융합해서 잉크의 도트가 접합하는 비딩현상이 발생해서 화상이 교란된다. 이 때문에 잉크제트기록용매체에는 잉크흡수량이 크고 흡수속도가 높은 것이 요구된다.
이를 위해서 기재 상에 잉크수용층을 형성해서 잉크흡수성을 높인 기록매체가 제안되어 있다. 예를들면 일본특개소 55-146786호 등에서는 기재를 폴리비닐 알콜이나 폴리비닐 피롤리돈등의 수용성 수지로 피복한 기록매체가 제안되어 있다. 또한, 일본특개평 5-221112호 등에서는 내수성수지를 사용한 기록매체가 제안되어 있다. 또한, 이온성수지를 잉크수용층으로서 사용한 기록매체가 제창되어 있으며(예를들면,일본특개평 11-78221호 공보, 동 특개 2000-190631호 공보 등), 물에 대한 젖음성이나 내수성, 염료정착성 등이 뛰어나고, 잉크의 흡수건조성이나 화상선명성이 뛰어난 기록매체가 얻어지고 있다.
잉크흡수층을 기재 상에 형성시키는 방법으로서는, 종래는 도말(塗抹)에 의한 방법이 일반적이며, 예를들면 블레이드코팅방식, 에어나이프 코팅방식,롤코팅방식, 플래시코팅방식, 그라비아코팅방식, 키스코팅방식, 다이코팅방식, 압출코팅방식, 슬라이드호퍼코팅방식, 커튼코팅방식, 스프레이코팅방식 등을 사용한 방법에 의해 행해져 왔다.
또한, 이상에 예시한 어떤 방법에 있어서도 기재의 피복을 위해서 사용하는 고분자화합물은 유기합성적 수법에 의해 합성·구조체화 되고, 이에 여러 가지 기능이 부가되어 있다.
한편, 최근, 생물공학적 수법에 의해서 고분자화합물을 제조하는 연구가 활발하게 행해져 오고 있으며, 또한 일부에서 실용화되어 있다. 예를들면, 미생물 유래의 고분자화합물로서 폴리 -3- 히드록시-n-낙산(PHB), 3-히드록시-n-낙산과 3-히드록시-n-길초산과의 공중합체(PHB/V)등의 폴리히드록시알카노에이트(PHA), 박테리아 셀룰로스나 풀루란 등의 다당류, 폴리-γ-글루타민산이나 폴리리진등의 폴리아미노산등이 알려지고 있다. 특히 PHA는 종래의 플라스틱과 마찬가지로 용융가공 등에 의해 각종 제품에 이용할 수 있는데다 생체적합성에도 뛰어나고, 의료용 연질부재 등으로서의 응용도 기대되고 있다.
이제까지 많은 미생물이 PHA를 생산해서 균체 내에 축적하는 것이 보고되어 왔다. 예를들면, 알칼리게네스 유트로푸스 H16주(Alcaligenes eutrophus H16, ATCC No. 17699), 메틸로 박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코커스 속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)의 미생물에 의한 PHB/V 의 생산이 보고되고 있다(일본특개평 5-74492 호 공보, 동 특공평 6-15604호 공보, 동 특공평 7-14352호 공보, 동 특공평 8-19227호 공보 등), 또한 코마모나스 아시도보란스 IFO 13852 주(Comamonas acidovorans IFO 13852)가 3-히드록시-n-낙산과 4-히드록시-n-낙산을 모노머유닛에 가진 PHA를 생산하는 것이 개시되어 있다(일본특개평 9-191893호 공보). 또한, 아에로모나스 캐비에(Aeromonas caviae)에 의해 3-히드록시-n-낙산과 3-히드록시헥산산과의 공중합체를 생산하는 것이 개시되어 있다(일본특개평 5-93049호 공보, 동 특개평 7-265065호 공보).
이들 PHB나 PHB/V의 생합성은 여러 가지 탄소원으로부터 생체 내의 여러 가지 대사경로를 거쳐 생성된 (R)-3-히드록시부티릴 CoA 또는 (R)-3-히드록시발레릴 CoA를 기질로 한 효소에 의한 중합반응에 의해서 행해진다. 이 중합반응을 촉매하는 효소가 PHB합성효소(PHB폴리메라제 또는 PHB 신타제라고도 함)이다. 또한, CoA란, 보효소 A(coenzyme A)의 약칭이며, 그 화학구조는 하기 화학식과 같다.
또한, 최근, 탄소수가 3으로부터 12정도까지의 중쇄장(medium-chain-length)의 3-히드록시알칸산유닛으로 이루어진 폴리히드록시알카노에이트(mcl-PHA)에 대한 연구가 정력적으로 행해지고 있다.
예를들면, 일본특허공보 제 2642937호에서는 슈도모나스 올레오보란스 ATCC 29347 주(Pseudomonas oleovorans ATCC 29347)에 비환상지방족탄화수소를 부여함으로써 탄소수가 6내지 12까지의 3-히드록시알칸산의 모노머유닛을 가진 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다. 또한, Appl. Environ. Microbiol., 58, 746(1992)에는 슈도모나스 레지노보란스(Pseudomonas resinovorans)가 옥탄산을 단일 탄소원으로 해서 3-히드록시-n-낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데카산을 모노머유닛으로 하는 PHA를 생산하고, 또한 헥산산을 단일 탄소원으로 해서 3-히드록시-n-낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데카산을 유닛으로 하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다. 여기서, 원료의 지방산보다도 쇄장이 긴 3-히드록시알칸산 모노머유닛의 도입은 후술하는 지방산 합성경로를 경유하고 있다고 생각된다.
Int. J. Biol. Macromol., 16(3), 119(1994) 에는 슈도모나스속 61-3주(Pseudomonas sp. strain 61-3)가 글루콘산 나트륨을 단일 탄소원으로서 3-히드록시-n-낙산, 3-히드록시헥산산, 3-히드록시옥탄산, 3-히드록시데카산, 3-히드록시도데칸산등의 3-히드록시알칸산 및 3-히드록시-5-cis-데센산, 3-히드록시-5-cis-도데센산 등의 3-히드록시알겐산을 유닛으로 하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있다.
상기 PHA는 측쇄에 알킬기를 가진 모노머유닛으로 이루어진 PHA(usual-PHA)이다. 그러나, 보다 광범위한 응용, 예를들면 기능성폴리머로서의 응용을 고려했을 경우, 알킬기 이외의 치환기(예를들면, 페닐기, 불포화탄화수소, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 할로겐화탄화수소, 에폭시드 등)을 측쇄에 도입한 PHA(unusual-PHA)가 극히 유용하다.
페닐기를 가진 unusual-PHA 의 생합성의 예로서는, 예를 들면, 슈도모나스 올레오보란스가 5-페닐길초산으로부터 3-히드록시-5-페닐길초산유닛을 포함하는 PHA를 생산한다고 보고되어 있다(Polymers, 24, 5256-5260(1991), Macromol, Chem., 191, 1957-1965(1990): Chirality, 3, 492-494(1991)). 또한 Polymers,29 1762-1766(1996)에서 슈도모나스 올레오보란스가 5-(4-톨릴)길초산(5-(4-메틸페닐)길초산)으로부터 3-히드록시-5-(4-톨릴)길초산유닛을 포함하는 PHA를 생산한다고보고되어 있다. 또한, Polymers, 32, 2889-2895(1999)에는 슈도모나스 올레오보란스가 5-(2, 4-디니트로페닐)길초산으로부터 3-히드록시-5-(2, 4-디니트로페닐)길초산유닛 및 3-히드록시-5-(4-니트로페닐)길초산유닛을 포함하는 PHA를 생산한다고 보고되어 있다.
또한, 페녹시기를 가진 unusual-PHA 의 예로서는, Macromol. Chem. phys., 195, 1665-1672(1994)에서 슈도모나스 올레오보란에서 11-페녹시운데칸산으로부터 3-히드록시-5-페녹시길초산유닛 및 3-히드록시-9-페녹시노난산유닛을 포함하는 PHA를 생산한다고 보고되어 있다. 또한, Polymers, 29, 3423-3435(1996)에는 슈도모나스 올레오보란스가 6-페녹시헥산산으로부터 3-히드록시-4-페녹시낙산유닛 및 3-히드록시-6-페녹시헥산산유닛을 포함하는 PHA를, 8-페녹시옥탄산으로부터 3-히드록시-4-페녹시낙산유닛, 3-히드록시-6-페녹시헥산산유닛 및 3-히드록시-8-페녹시옥탄산유닛을 포함하는 PHA를 11-페녹시운데칸산으로부터 3-히드록시-5-페녹시길초산유닛 및 3-히드록시-7-페녹시헵탄산유닛을 포함하는 PHA를, 생산하는 것이 보고되어 있다. 또한, Can. J. Microbiol., 41, 32-43)1995)에서는 슈도모나스 올레오보란스 ATCC 29347 주 및 슈도모나스 푸티다 KT 2442 주 (Pseudomonas putida KT 2442)가 p-시아노페녹시헥산산 또는 p-니트로페녹시헥산산으로부터 3-히드록시-p-시아노페녹시헥산산유닛 또는 3-히드록시-p-니트로페녹시헥산산유닛을 포함하는 PHA를 생산한다고 보고하고 있다. 일본특허 제 2989175호 공보에는 3-히드록시-5-(모노플루오로페녹시)길초산유닛 또는 3-히드록시-5-(디플루오로페녹시)길초산유닛으로 이루어진 호모폴리머, 적어도 3-히드록시-5-(모노플루오로페녹시)펜타노에이트유닛 또는 3-히드록시-5-(디플루오로페녹시)펜타노에이트유닛을 함유하는 코포리머와 그 제조방법이 기재되어 있으며, 그 효과로서 융점이 높고 양호한 가공성을 유지하면서 입체규칙성, 발수성을 부여할 수 있다고 하고 있다.
또한, 시클로헥실기를 가진 unusual-PHA 의 예로서는 polymers, 30, 1611-1615(1997)에 슈도모나스 올레오보란스 시클로헥실낙산 또는 시클로헥실길초산으로부터 이 PHA를 생산한다는 보고가 있다.
이들 mcl-PHA 나 unusual-PHA의 생합성은 원료가 되는 각종 알칸산으로부터 생체내의 여러 가지 대사경로 (예를들면, β산화계나 지방산합성경로)를 거쳐 생성된 (R)-3-히드록시아실 CoA를 기질로 한, 효소에 의한 중합반응에 의해서 행해진다. 이 중합반응을 촉매하는 효소가 PHA합성효소 (PHA폴리메라제 또는 PHA신하제라고함)이다. 이하에 β산화계 및 PHA합성효소에 의한 중합반응을 거쳐 알칸산이PHA가 될 때까지의 반응을 표시한다
한편, 지방산 합성경로를 거치는 경우에는 이 경로중에 발생한 (R)-3-히드록시아실-ACP(ACP 란 아실 캐리어 프로테인을 말함)로부터 변환된 (R)-3-히드록시아실 CoA를 기질로 하고, 마찬가지로 PHA 합성효소에 의해 PHA가 합성된다고 생각된다.
최근, 상기 PHB합성효소나 PHA합성효소를 균체 외로 꺼내서 무세포계(in virto)에서 PHA를 합성하려고 하는 시도가 이루어지고 있다.
예를들면, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,92, 6279-6283(1995)에서는 알칼리게네스 유트로푸스 유래의 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA을 작용시킴으로써 3-히드록시-n-낙산유닛으로 이루어진 PHB를 합성하는 것에 성공하고 있다. 또한, Int. J. Biol. Macromol., 25, 55-60(1999)에서는 알칼리게네스 유트로푸스 유래의 PHB 합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA 나 3-히드록시발레릴 CoA를 작용시킴으로써 3-히드록시-n-낙산유닛이나 3-히드록시-n-길초산유닛으로 이루어진 PHA의 합성에 성공하고 있다. 또한, 이 보고에서는 라세미체의 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시킨 바, 효소의 입체선택성에 의해서 R체의 3-히드록시-n-낙산유닛만으로 이루어진 PHB가 합성된 것으로 하고 있다. Macromol. Rapid Commun., 21, 77-84(2000)에 있어서도 알칼리게네스 유트로푸스 유래의 PHB합성효소를 사용한 세포 외에서의 PHB합성이 보고되어 있다.
또한, FEMS Microbiol. Lett., 168, 319-324(19998)에서는 크로마티움 비노섬(Chromatium vinosum) 유래의 PHB합성효소에 3-히드록시부티릴 CoA를 작용시킴으로써 3-히드록시-n-낙산유닛으로 이루어진 PHB를 합성하는 데에 성공하고 있다.
Appl. Microbiol, Biotechnol., 54, 37-43(2000)에서는 슈도모나스 아에루기노사)(Pseudomonas aeruginosa)의 PHA합성효소에 3-히드록시데카노일 CoA를 작용시킴으로써 3-히드록시데칸산유닛으로 이루어진 PHA를 합성하고 있다.
상기한 바와같이, 생물공학적 수법을 고분자화합물의 합성에 적용함으로써 종래의 유기합성적 수법에서는 실현이 곤란하였던 새로운 고분자화합물의 합성이나, 새로운 기능·구조의 부여가 가능하게 된다고 기대되고 있다. 또한, 종래의 유기합성화학적 수법에서는 다단계에 걸친 반응을 요하고 있던 제조공정을 1단계의 공정만으로 실현할 수 있는 경우도 많이 있으며, 제조프로세스의 간략화나 코스트다운, 소요시간의 단축 등의 효과도 기대되고 있다. 또한, 유기용제나 산, 알칼리, 계면활성제 등의 사용삭감, 온화한 반응조건의 설정, 비석유계원료나 저순도원료로부터의 합성 등이 가능하게 되어 보다 환경저부하 또한 자원 순환형의 합성프로세스의 실현이 가능하게된다. 또한, 저순도원료로부터의 합성에 대해서 더 상세하게 설명하면, 생물공학적 합성프로세스에서는 일반적으로 촉매인 효소의 기질 특이성이 높기 때문에 저순도의 원료를 사용해도 소망의 반응을 선택적으로 진행시키는 것이 가능하며, 따라서 폐기물이나 리사이클원료등의 사용도 기대할 수 있다.
한편, 상기한 바와 같이, 본원 발명자들은 고분자화합물에 큰 부가가치를 부여하기 위한 요소기술로서 고분자화합물로 기재를 피복한 구조체에 착안하여 왔다. 이와 같이 고분자 화합물로 특정한 기재를 피복함으로써 극히 유용한 기능성을 가진 복합구조체를 얻을 수 있다. 상기와 같은 구조체를 제조하기 위해서 종래 유기합성적 수법에 의해서 많이 행해져 왔지만, 이 수법에는 일정한 한계가 있었다.
만일, 이와같은 구조체를 상술한 바와같은 생물공학적 수법에 의해 제조할 수 있으면 종래의 유기합성적 수법으로는 실현이 곤란하였던 새로운 고분자화합물의 이용이나, 새로운 기능·구조의 부여가 가능하게 된다고 기대할 수 있는 데다 보다 환경저부하 또한 자원순환형의 제조프로세스를 저코스트로 실현할 수 있는 것으로 생각된다. 예를들면, 생물의 촉매작용에 특유의 극히 엄밀한 분자인식능이나 입체선택성을 이용해서 종래의 유기합성 화학적 수법에서는 실현이 곤란하였던 새로운 기능성 고분자화합물이나, 극히 키랄리티가 높은 고분자화합물에 의해 피복된 캡슐구조체나 적층구조체를 극히 간편하고 또한, 환경저부하의 프로세스에 의해 제조하는 것이 가능하게 된다.
따라서, 본 발명의 목적은 생물공학적 수법에 의해 제조할 수 있는 고기능의 고분자화합물 구조체를 제공하는 데 있다. 또한 본 발명은 기능성복합구조체로서 광범위하게 이용가능한 고분자화합물에 의해 기재를 피복한 구조체의 효율적인 제조방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 실시예 1에 있어서의 캡슐 구조체의 외피의 GC-MS 분석결과를 표시하는 도면;
도 2는 실시예 4에 있어서의 캡슐 구조체의 외피의 GC-MS 분석결과를 표시하는 도면;
도 3은 실시예 5에 있어서의 캡슐 구조체의 외피의 GC-MS 분석결과를 표시하는 도면;
도 4는 실시예 11에 있어서의 적층구조체의 피복층의 GC-MS 분석결과를 표시하는 도면.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들이 예의 검토한 결과, PHA합성효소를 기재표면에 고정화하고, 여기에 3-히드록시아실 CoA를 가해서 반응시킴으로써 기재 표면에 소망의 PHA를 합성시켜서 기재를 PHA로 피복한 구조체를 얻을 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 이 PHA에 화학수식을 실시함으로써 각종의 특성 등을 개량한 구조체를 얻을 수 있는 것을 발견했다. 더 상세하게는, 예를들면 이 PHA에 그라프트쇄를 도입함으로써 이 그라프트쇄에 기인하는 각종 특성을 구비한 PHA가 기재의 적어도 일부를 피복한 구조체를 얻을 수 있는 것을 발견했다. 또한, 이 PHA를 가교화시킴으로써 소망의 물리화학적 성질 (예를들면, 기계적 강도, 내약품성, 내열성등)을 구비한 PHA가 기재의 적어도 일부를 피복한 구조체를 얻을 수 있는 것을 발견했다. 또한, 본 발명에 있어서의 화학수식(Chemical modification)이란, 고분자재료의 분자내 또는 분자간, 또는 고분자재료와 다른 화학물질과의 사이에서 화학반응을 행하게 함으로써 이 고분자재료의 분자구조를 개변하는 것을 말한다. 또한, 가교(crosslinking)란, 고분자재료의 분자내 또는 분자간을 화학적으로 또는 물리화학적으로 결합시켜서 망상구조를 만드는 것을 말하며, 가교제(crosslinking agent)란, 상기 가교반응을 행하기 위해서 첨가하는 상기 고분자재료와 일정한 반응성을 가진 물질을 말한다.
즉 본 발명은 3-히드록시알칸산유닛(단 3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛 또는 3-히드록시-n-길초산유닛을 제외)을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트가 기재의 적어도 일부를 피복하고 있는 것을 특징으로 하는 구조체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 중쇄장 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 기재표면에 고정하고, 이 효소에 의해 3-히드록시아실 보효소 A를 중합시켜서 폴리히드록시알카노에이트를 합성함으로써 상기 기재의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 기재를 코어(심재료)로 하고, mcl-PHA나 unusual-PHA를 외피로 하는 캡슐구조체에 관한 것으로, 더 상세하게는, 코어에 착색제를 적어도 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 캡슐구조체, 이 착색제가 안료를 적어도 함유하고 있는 캡슐구조체, 또는 코어가 안료인 캡슐구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 평판 또는 필름형상의 기재의 적어도 일부를 mcl-PHA나 unusual-PHA 로 피복한 적층구조체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 캡슐구조체로 이루어진 전자사진용 캡슐토너 또는 상기 적층구조체로 이루어진 기록매체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 토너를 사용한 화상형성방법, 화상형성장치에 관한 것이다.
(바람직한 실시형태의 설명)
본 발명의 구조체는 치환기를 측쇄에 가진 다양한 구조의 모노머유닛을 포함하는 PHA에 의해 기재가 피복된 형태를 가진 구조체이고, 전자사진용 캡슐토너나 기록매체등의 고기능성 구조체로서 극히 유용하다. 이하에 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
〈PHA〉
본 발명에 이용가능한 PHA로서는 mcl-PHA의 합성반응에 관여하는 PHA합성효소에 의해서 합성될 수 있는 PHA(즉 각종 mcl-PHA나 unusual-PHA 등)이면 특히 한정은 되지 않는다. 상술한 바와 같이, PHA 합성 효소는 생물체 내에서의 PHA 합성반응계에 있어서의 최종단계를 촉매하는 효소이며, 따라서 생물체 내에 있어서 합성될 수 있는 것이 알려져 있는 PHA 이면 모두 이 효소에 의한 촉매작용을 받아서 합성되고 있게 된다. 따라서, 소망의 PHA에 대응하는 3-히드록시아실 CoA를 본 발명에 있어서의 기재에 고정화된 이 효소에 작용시킴으로써 생물체 내에 있어서 합성될 수 있는 것이 알려져 있는 여러 종류의 PHA로 기재를 피복한 구조체를 작성하는 것이 가능하다.
이와같은 PHA로서, 구체적으로는, 하기 화학식[1] 내지 [10]으로 표시되는모노머유닛을 적어도 포함하는 PHA를 예시할 수 있다.
여기서 이 모노머유닛은 식중 R1 및 a의 조합이 하기의 어느 하나인 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
(1) R1이 수소원자(H)이고, a가 3 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
(2) R1이 할로겐원자(H)이고, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
(3) R1이 발색단이고, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
(4) R1이 카르복시기 또는 그 염이고, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
(5) R1 이
이고, a가 1 내지 7의 정수의 어느 하나인 모노머유닛.
여기서 b는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
여기서 c는 1 내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
여기서 d는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
여기서 e는 1 내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5, -C3H7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
여기서 f는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시한다.
여기서 G는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시한다.
여기서 h는 1 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R6는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R", -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고, 여기서 R'는 수소원자 (H), Na, K, -CH3,, -C2H5의 어느 하나이며, R"는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.
여기서 i는 1 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R" 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고, 여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3,, -C2H5의 어느 하나이며, R"는-OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다
여기서 j는, 1내지 9의 정수의 어느 하나를 표시한다.
또한, 상기 할로겐원자의 구체예로서는 불소, 염소, 취소등을 들 수 있다. 또한, 상기의 발색단으로서는 그 3-히드록시아실 CoA 체가 PHA 합성효소의 촉매작용을 받을 수 있는 것인 한 특히 한정은 되지 않지만, 고분자합성시의 입체장해 등을 고려하면 3-히드록시아실 CoA분자 내에 있어서, CoA가 결합된 카르복시기와 발색단 사이에 탄소수 1 내지 5의 메틸렌쇄가 있는 쪽이 바람직하다. 또한, 발색단의 광흡수파장이 가시역에 있으면 착색된 구조체를 얻을 수 있고, 가시역 이외에 광흡수파장이 있어도 여러 가지 전자재료로서 이용할 수 있다. 이와 같은 발색단의 예로서 니트로소, 니트로, 아조, 디아릴메탄, 트리아릴메탄, 키산텐, 아크리딘, 퀴놀린, 메틴, 티아졸, 인다민, 인도페놀, 락톤, 아미노케톤, 히드록시케톤, 스틸벤, 아진, 옥사진, 티아진, 안트라퀴논, 프탈로시아닌, 인디고이드 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 PHA로서는 상기 모노머유닛을 복수 포함하는 랜덤공중합체나 블록공중합체를 사용하는 것도 가능하며, 각 모노머유닛이나 포함되는 관능기의 특성을 이용한 PHA의 물성제어나 복수의 기능의 부여, 관능기 간의 상호작용을 이용한 새로운 기능의 발현등이 가능하게 된다.
또한, 기질인 3-히드록시아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성을 경시적으로 변화시킴으로써 구조체의 형상이 입상이면 안쪽으로부터 바깥쪽을 향하는 방향으로, 구조체의 형상이 평면형상이면 수직방향으로 PHA 의 모노머유닛 조성을 변화시키는 것도 가능하다.
이에 의해서, 예를들면 캡슐토너의 경우, 글라스전이온도가 높은 PHA를 토너표층에, 글라스전이온도가 낮은 PHA를 그보다 안쪽의 층에 형성시킴으로써 보존시에는 내블록킹성이 뛰어나고, 정착시에는 저온정착성이 뛰어나다는 등의 복수의 기능을 보유시키는 것이 가능하게 된다.
또한, 예를들면 기재와 친화성이 낮은 PHA 로 피복구조체를 형성할 필요가 있는 경우, 우선 기재를 기재와 친화성이 높은 PHA로 피복하고, 그 기재와 친화성이 높은 PHA의 모노머유닛 조성을, 목적으로 하는 PHA 의 모노머유닛 조성에, 안쪽으로부터 바깥쪽을 향하는 방향 또는 수직방향으로 변화, 예를들면 다층구조 또는 그라디엔트 구조로 함으로써 기재와의 결합을 강고히 한 PHA 피막을 형성하는 것이 가능하게 된다.
또 예를들면, 기재와 친화성이 낮은 PHA로 피복구조체를 형성할 필요가 있을 경우, 먼저 기재를 기재와 친화성이 높은 PHA로 피복하고, 그 기재와 친화성이 높은 PHA의 모노머유닛조성을, 목적으로 하는 PHA의 모노머유닛조성에, 안쪽으로부터 바깥쪽으로 향하는 방향 또는 수직방향으로 변화, 예를들면 다층구조 또는 그래디언트 구조로 함으로써, 기재와의 결합을 강고하게 한 PHA피막을 형성하는 것이 가능하게 된다.
또, 3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛 3-히드록시 -n-기초산유닛, 4-히드록시-n-낙산유닛등은, 그들만으로 이루어진PHA로서는 mcl-PHA 나 unusual-PHA 에는 해당되지 않으나, 이들의 모노머유닛이 앞서 예시한 바와같은 모노머유닛중에 혼재하고 있는PHA에 대해서는, 본 발명에 있어서 이용가능하다. 또, 필요에 따라서, PHA를 합성한 후, 또는 합성중에, 또 화학수식등을 실시해도 된다. PHA의 분자량은, 수평균분자량으로 1,000~1,000만정도, 가령 상기 구조체를 전자사진용 캡슐토너로서 사용하는 경우는 3000~100만 정도로 하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 구조체에 사용하는, PHA합성효소에 의해 합성되는 PHA는, 일반적으로 R체만으로 구성되는 이소택틱 폴리머이다.
〈3-히드록시아실 CoA〉
본 발명의 PHA합성효소의 기질로서 사용하는 3-히드록시아실 CoA 로서, 구체적으로는, 하기 화학식 [11]~[20]에서 표시되는 3-히드록시아실 CoA를 예시할 수 있다.
(단, 상기 화학식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고, 식중 R1및 a의 조합이 하기의 어느 하나인 군에서 선택되는 적어도 하나이고, 또한, 상기 화학식[1]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 R1 및 a와 대응한다. R1이 수소원자(H)이고 a가 3내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛, R1이 할로겐원자이고 a가 1~10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛, R1이 발색단이고 a가 1~10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛, R1이 카르복실기 또는 그 염이고 a가 1~10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛, R1 이고 a가 1~7의 정수의 어느 하나인 모노머유닛.)
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
b는 상기화학식 [2]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 b와 대응하는 0~7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R2는 상기 화학식[2]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 R2와 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
c는 상기화학식 [3]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 c와 대응하는 1~8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R3는 상기 화학식[3]에서 표시되는 모노머유닛에있어서의 R3와 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
d는 상기화학식 [4]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 이와 대응하는 0~7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R4는 상기 화학식[4]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 R4와 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
e는 상기화학식 [5]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 e와 대응하는 1~8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R5는 상기 화학식[5]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 R5와 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7,-CH3, -C2H5,-C3H7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
f는 상기화학식 [6]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 f와 대응하는 0~7의 정수의 어느 하나를 표시한다.
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
g는 상기화학식 [7]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 g와 대응하는 1~8의 정수의 어느 하나를 표시한다.2
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
h는 상기화학식 [8]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 h와 대응하는 1~7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R6는 상기 화학식[8]에서 표시되는 모노머유닛에있어서의 R6와 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR’, -SO2R”, -CH3, -C2H5,-C3H7,-CH(CH3)2, -C(CH3)3으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3, -C2H5의 어느 하나이고, R" 는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
i는 상기화학식 [9]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 i와 대응하는 1~7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R7은 상기 화학식[9]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 R7과 대응하는, 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR', -SO2R" 로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
여기서 R'는 수소원자(H), Na, K, -CH3, -C2H5의 어느 하나이고, R" 는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
(단, 식중 -SCoA는 알칸산에 결합한 보효소 A를 표시하고,
j는 상기화학식 [10]에서 표시되는 모노머유닛에 있어서의 j와 대응하는 1~9의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
이들의 3-히드록시아실 CoA는, 예를들면, 효소를 사용한 in vitro 합성법, 미생물이나 식물등의 생물체를 사용한 in vivo 합성법, 화학합성법 중에서 적당히 선택한 방법으로 합성해서 사용할 수 있다. 특히, 효소합성법은 상기 기질의 합성에 일반적으로 사용되고 있는 방법이고, 시판하는 아실 CoA 합성효소(아실 CoA리가제 E, C, 6, 2, 1, 3)를 사용한 하기 반응,
아실 CoA 합성효소
3-히드록시알칸산 =CoA→ 3- 히드록시아실 CoA를 사용한 방법등이 알려져 있다(Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997), Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 37-43(2000)등). 효소나 생물체를 사용한 합성공정에는, 배치식의 합성방법을 사용해도 되고, 또, 고정화효소나 고정화세포를 사용해서 연속 생산해도 된다.
〈PHA 합성효소 및 그 생산균〉
본 발명에 사용하는 PHA합성효소는, 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 적당히 선택된 미생물, 또는 그들 미생물의 PHA 합성효소 유전자를 도입한 형질전환체에 의해 생산된 것을 사용할 수 있다.
PHA합성효소를 생산하는 미생물로서는, 예를들면, mcl-PHA 나 unusual-PHA의 생산균을 사용할 수 있고, 이와같은 미생물로서, 상기의 슈도모나스·올레오보란스, 슈도모나스·레디노보란스, 슈도모나스속 61-3주,슈도모나스·푸티다·KT2442균주, 슈도모나스·아엘기노사등 외에, 본 발명자들에 의해 분리된, 슈도모나스·푸티다·P91주(Pseudomonas putida P91), 슈도모나스·치코리아이·H45주((Pseudomonas cichorii H45), 슈도모나스·치코리아이·YN2주(Pseudomonas cichorii YN2), 슈도모나스·제세니. P161주((Pseudomonas jessenii P161)등의 슈도모나스속 미생물이나, 일본 특개 2001-78753호 공보에 기재된 버크홀데리아속·OK3주(Burkholderia sp. OK3, FERM 9-17370), 동 특개 2001-69968호 공보에 기재된 버크홀데리아속·OK4주(Burkholderia sp. OK4, FERM 9-17371)등의 버크홀데리아속 미생물을 사용할 수 있다. 또, 이들 미생물에 가해서, 아에로모나스속(Aeromonas sp.), 코마모나스속(Comamonas sp.)등에 속하고, mcl-PHA 나 unusual-PHA를 생산하는 미생물을 사용하는 것도 가능하다.
또한, P91주는 기탁번호 FERM BP-7373 으로서, H45주는 기탁번호 FERM BP-7374 로서, YN2주는 기탁번호 FERM BP-7375 로서 P161주는 기탁번호 FERM BP-7376 으로서, 특허수속상의 미생물의 기탁의 국제적 승인에 관한 부타페스트 조약에 의거하여, 독립행정법인 산업기술 종합 연구소 특허생물 기탁센터(경제산업성산업기술 종합연구소(구 통산산업성 공업기술원) 생명공학공업 기술연구소 특허미생물기탁센터)에 국제기탁되어 있다.
또한, 상기의 P91주, H45주, YN2주 및 P161주의 균학적성질을 열거하면 이하와 같은 것이다. 또, P161주에 대해서는, 16S rRNA의 염기배열을 배열번호: 1에 표시한다.
(슈도모나스·푸티다·P91주의 균학적성질)
(1) 형태학적 성질
세포의 모양과 크기 : 간상균, 0.1㎛ × 1.5㎛
세포의 다형성 : 없음
운동성 : 있음
포자 형성 : 없음
그램염색성 : 음성
콜로니 형상
: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저 볼록형상,
표층이 매끄러움, 광택, 크림색.
(2) 생리학적 성질
카탈라제 : 양성
옥시다제 : 양성
O/F 시험 : 산화형
질산염의 환원 : 음성
인돌의 생성 : 음성
D-글루코스산성화 : 음성
아르기닌디하이드롤라제 : 양성
우레아제 : 음성
에스쿨린가수분해 : 음성
젤라틴가수분해 : 음성
β-갈락토시다제 : 음성
King's B 한천에서의 형광색소생산 : 양성
(3) 기질동화능력
D-글루코스 : 양성
L-아라비노스 : 음성
D-만노스 : 음성
D-만니톨 : 음성
N-아세틸-D-글루코사민 : 음성
말토스: 음성
글루콘산칼륨: 양성
n-카프르산 : 양성
아디프산 : 음성
DL-말산 : 양성
시트르산나트륨 : 양성
아세트산페닐: 양성
(슈도모나스·치코리아이-H45주의 균학적 성질)
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기 : 간상균, 0.8㎛×1.0 내지 1.2㎛
세포의 다형성 : 없음
운동성: 있음
포자형성 : 없음
그램염색성 : 음성
콜로니형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상,
표층이 매끄러움, 광택, 크림색
(2) 생리학적 성질
카탈라제 : 양성
옥시다제 : 양성
O/F 시험 : 산화형
질산염의 환원 : 음성
인돌의 생성 : 음성
D-글루코스산성화 : 음성
아르기닌디하이드롤라제 : 음성
우레아제 : 음성
에스쿨린가수분해 : 음성
젤라틴가수분해 : 음성
β-갈락토시다제 : 음성
King's B한천에서의 형광색소생산 : 양성
4% NaCl 에서의 생육 : 음성
폴리 -β-히드록시부티르산의 축적 : 음성
(3) 기질동화능력
D-글루코스 : 양성
L-아라비노스 : 음성
D-만노스 : 양성
D-만니톨 : 양성
N-아세틸-D-글루코사민 : 양성
말토스 : 음성
글루콘산칼륨 : 양성
n-카프르산 : 양성
아디프산 : 음성
dl-말산 : 양성
시트르산나트륨 : 양성
아세트산페닐 : 양성
(슈도모나스·치코리아이 YN2주의 균학적 성질)
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기 : 간상균, 0.8㎛×1.5 내지 2.0㎛
세포의 다형성 : 없음
운동성 : 있음
포자형성 : 없음
그램염색성 : 음성
콜로니형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상,
표층이 매끄러움, 광택, 반투명
(2) 생리학적 성질
카탈라제 : 양성
옥시다제 : 양성
O/F 시험 : 산화형
질산염의 환원 : 음성
인돌의 생성 : 양성
D-글루코스산성화 : 음성
아르기닌디하이드롤라제 : 음성
젤라틴가수분해 : 음성
β-갈락토시다제 : 음성
King's B한천에서의 형광색소생산 : 양성
4% NaCl 에서의 생육 : 양성(약한생육)
폴리 -β-히드록시부티르산의 축적 : 음성
Tween 80의 가수분해 : 양성
(3) 기질동화능력
D-글루코스 : 양성
L-아라비노스 : 양성
D-만노스 : 음성
D-만니톨 : 음성
N-아세틸-D-글루코사민 : 음성
말토스 : 음성
글루콘산칼륨 : 양성
n-카프르산 : 양성
이디프산 : 음성
dl-말산 : 양성
시트르산나트륨 : 양성
아세트산페닐 ; 양성
(슈도모나스·제세니·P161주의 균학적 성질)
(1) 형태학적 성질
세포의 형상과 크기 : 구형, 직경 0.6㎛,
간상균형상, 0.6㎛×1.5 내지 2.0㎛
세포의 다형성 : 있음(신장형)
운동성 : 있음
포자형성 : 없음
그램염색성 : 음성
콜로니형상 : 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상,
표층이 매끄러움, 담황색
(2) 생리학적 성질
카탈라제 : 양성
옥시다제 : 양성
O/F 시험 : 산화형
질산염의 환원 : 양성
인돌의 생성 : 음성
아르기닌디하이드롤라제 : 양성
우레아제 : 음성
에스쿨린가수분해 : 음성
젤라틴가수분해 : 음성
β-갈락토시다제 : 음성
King's B한천에서의 형광색소생산 : 양성
(3) 기질동화능력
D-글루코스 : 양성
L-아라비노스 : 양성
D-만노스 : 양성
D-만니톨 : 양성
N-아세틸-D-글루코사민 : 양성
말토스 : 음성
글루콘산칼륨 : 양성
n-카프르산 : 양성
아디프산 : 음성
dl-말산 : 양성
시트르산나트륨 : 양성
아세트산페닐 : 양성
본 발명에 관한 PHA합성효소의 생산에 사용하는 미생물의 통상의 배양, 예를들면, 보존균주의 작성, PHA합성효소의 생산에 필요하게 되는 균수나 활성상태를 확보하기 위한 증식등에는, 사용하는 미생물의 증식에 필요한 성분을 함유한 배지를 적당히 선택해서 사용한다. 예를들면, 미생물의 생육이나 생존에 악영향을 미치는 것이 아닌한, 일반적인 천연배지(육즙배지, 효모엑스등)나, 영양원을 첨가한 합성배지 등, 어떠한 종류의 배지도 사용할 수 있다.
배양은 액체배양이나 고체배양등, 상기 미생물이 증식하는 방법이면 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 또한, 배치배양, 피드배치배양, 반연속배양, 연속배양등의 종류도 불문이다. 액체배치 배양의 형태로서는, 진탕플라스크에 의해서 진탕시켜서 산소를 공급하는 방법, 쟈퍼멘터에 의한 교반통기 방식의 산소 공급 방법이 있다. 또, 이들의 공정을 복수단 접속한 다단방식을 채용해도 된다.
상기한 바와같은 PHA 생산미생물을 사용해서, PHA 합성효소를 생산하는 경우는, 예를들면, 옥탄산이나 노난산등의 알칸산을 함유한 무기배지에서 상기 미생물을 증식시키고, 대수 증식기로부터 정상기 초기에 걸친 미생물을 원심분리등에 의해 회수해서 소망의 효소를 추출하는 방법등을 사용할 수 있다. 또한, 상기와 같은 조건에서 배양을 행하면, 첨가한 알칸산에 유래하는 mcl-PHA가 균체내에 합성되는 것으로 되나, 이 경우, 일반적으로 PHA 합성효소는 균체내에 형성되는 PHA의 미립자에 결합해서 존재하는 것으로 되어 있다. 그러나, 본 발명자들의 검토에 의하면, 상기의 방법으로 배양한 균체의 파쇄액을 원심분리한 상청액에도, 상당정도의 효소활성이 존재하고 있는 것을 알고 있다. 이것은, 상기와 같은 대수 증식기로부터 정상기 초기에 걸친 비교적 배양초기에는, 균체내에서 상기 효소가 활발하게 계속 생산되고 있기 때문에, 유리상태의 PHA합성효소도 상당정도 존재하기 때문으로 추정된다.
상기의 배양 방법에 사용하는 무기 배지로서는, 인원,(예를들면 인산염등), 질소원(예를들면, 암모늄염, 질산염등)등, 미생물이 증식할 수 있는 성분을 함유하고 있는 것이면 어떠한 것이라도 되고, 예를들면 무기염배지로서는, MSB배지, E배지(J. Biol, chem, 218, 97-106(1956), M9 배지등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 실시예에서 사용하는 M9배지의 조성은 이하와 같은 것이다.
Na2HPO4: 6.2g
KH2PO4: 3.0g
NaCl : 0.5g
NH4Cl : 1.0g
(배지 1ℓ중, pH 7.0)
또한, 양호한 증식 및 PHA합성효소의 생산을 위해서는, 상기의 무기염배지에 이하에 표시하는 미소량 성분용액을 0.3%(v/v)정도 첨가하는 것이 바람직하다.
(미소량 성분용액)
니트릴로 3아세트산 : 1.5g
MgSO4: 3.0g
MnSO4: 0.5g
NaCl : 1.0g
FeSO4:0.1g
CaCl2: 0.1g
CoCl2: 0.1g
ZnSO4: 0.1g
CuSO4: 0.1g
AIK(SO4)2: 0.1g
H3BO3: 0.1g
Na2MoO4: 0.1g
NiCl2: 0.1g
(1ℓ 중)
배양온도로서는 상기의 균주가 양호하게 증식가능한 온도이면 되고, 예를들면 14~40℃, 바람직하게는, 20~35℃ 정도가 적당하다.
또 상기의 PHA생산균이 가지는 PHA합성효소 유전자를 도입한 형질전환체를 사용해서, 소망의 PHA합성효소를 생산하는 것도 가능하다. PHA합성효소 유전자의 클로닝, 발현 벡터의 제작, 및 형질전환체의 제작은, 정법에 따라서 행할 수 있다. 대장균등의 세균을 숙주로 해서 얻어진 형질전환체에 있어서는, 배양에 사용하는 배지로서, 천연배지 또는 합성배지, 예를들면, LB배지, M9배지들을 들 수 있다. 또 배양온도는 25~37℃의 범위이고, 호기적으로 8~27 시간 배양함으로써, 미생물의 증식을 도모한다. 그 후 집균하고, 균체내에 축적된 PHA 합성효소의 회수를 행할 수 있다. 배지에는, 필요에 따라서, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신등의 항생물질을 첨가해도 된다. 또, 발현벡터에 있어서, 유도성의 프로모터를 사용하는 경우는, 형질전환체를 배양할 때에, 상기 프로모터가 대응하는 유도물질을 배지에 첨가해서 발현을 촉구해도 된다. 예를들면, 이소프로필 -β-D-티오갈라크노피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA)등이 유도물질로서 들 수 있다.
PHA 합성효소로서는, 미생물의 균체파쇄액이나, 황산암모늄등에 의해 단백질 성분을 침전·회수한 유안염석물등의 조잡효소를 사용해도 되고, 또, 각종 방법으로 정제한 정제 효소를 사용해도 된다. 상기 효소에는 필요에 따라서, 금속염, 글리세린, 디티오슬레이톨, EDTA 소혈청알부민(BSA)등의 안정화제, 부활제를 적당히 첨가해서 사용할 수 있다.
PHA합성 효소의 분리·정제 방법은, PHA 합성효소의 효소 활성이 유지되는 방법이면 어떠한 방법도 이용할 수가 있다. 예를들면, 얻을 수 있던 미생물균체를, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기, 리소자임이나 각종 계면활성제등을 이용해 파쇄 한 후, 원심분리해 얻을 수 있던 결점 효소액, 또는 여기로부터 조제한 유안염석물에 대해, 어피니티 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과등의 수단을 단독 또는 적당히 조합하는 것에 의해 정제 효소를 얻을 수 있다. 특히, 유전자 재조합 단백질은, N말단이나 C말단에 히스티진잔기등의 [태그]를 결합한 융합 단백질의 형태로 발현시켜, 이 태그를 개재해서 친화성 수지에 결합시킴으로써, 보다 간편하게 정제 할 수가 있다. 융합 단백질로부터 목적의 단백질을 분리하려면, 트론빈, 혈액 응고인자 Xa등의 프로테아제로 절단 하는, pH를 저하 하게 하는, 결합 경합제로서 고농도의 이미다졸을 첨가하는 등의 방법을 이용하면 좋다. 혹은, 발현 벡터로서 pTYBI (New Englan Biolab 사제)를 이용했을 경우와 같이 태그가 인테인을 포함한 경우는 dithiothreitol 등으로 환원 조건으로서 절단한다. 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 가능으로 하는 융합 단백질에는, 히스티진태그 외에 글루타치온 S-트란스페라제(GST), 키친 결합 도메인(CBD), 마르토스 결합 단백(MBP), 혹은 티오레독신(TRX) 등도 공지이다. GST 융합 단백질은, GST 친화성 레진에 의해 정제할 수가 있다.
PHA합성 효소의 활성 측정은, 기보의 각종 방법을 이용할 수가 있지만, 예를들면, 3-히드록시 아실 CoA가 PHA합성효소의 촉매 작용에 의해 중합해 PHA가 되는 과정에서 방출되는 CoA를, 5,5'-디티오비스(2-니트로 벤조산)로 발색시켜 측정하는 것을 측정 원리로 하는, 이하에 나타내는 방법에 따라 측정할 수가 있다. 시약 1: 소 혈청알부민(Sigma 사제)을 0. 1 M 트리스 염산 버퍼 (pH 8. 0)에3.0mg/ml 용해, 시약 2:3 -히드로키시오크타노일 CoA를 0. 1 M 트리스 염산 버퍼 (pH 8. 0)에 3.0mM 용해, 시약 3 트리 클로로아세트산을 0. 1 M 트리스 염산 버퍼 (pH 8. 0)에 10mg/ml 용해, 시약 4: 5,5'-디티오비스 (2-/니트로벤조산)를 0. 1 M 트리스 염산 버퍼 (pH 8. 0)에 2.0mM 용해, /제 1반응(PHA합성 반응) : 시료(효소) 용액 100μl에 시약 1를 100μl첨가해서 혼합해, 30℃ 로 1분간 프레인큐베이트 한다. 여기에, 시약 2를 100μl첨가해서 혼합해, 30℃ 로 1~30분간 인큐베이트 한 후, 시약 3을 첨가해서 반응을 정지시킨다. 제 2 반응 (유리 CoA의 발색 반응) : 반응 정지한 제 1 반응액을 원심분리(15,000×g, 10분간)해, 이 상청 500μl 에 시약 4를 500μl 첨가해, 30℃ 로 10분간 인큐베이트 한 후, 412㎚ 의 흡광도를 측정한다. 효소 활성의 산출: 1분간에 1μmol의 CoA를 방출시키는 효소량을 1단위(U)로 한다.
또한, 상기 효소에 의해 합성되는 PHA는, 일반적으로 R체만으로 구성되는 이소택틱인 폴리머이다.
＜기재＞
본 발명의 방법으로 이용하는 기재로서는, PHA 합성 효소를 고정화할 수 있는 것이면, 일반적인 고분자 화합물이나 무기계 고형물, 예를 들면, 수지, 유리, 금속등으로부터 적당히 선택해서 이용할 수가 있다. 또 PHA 합성 효소의 고정화 방법이나, 제작한 구조체의 응용의 형태등에 따라서, 기재의 종류나 구조를 적당히 선택해서 이용할 수가 있다.
예를 들면, 본 발명의 캡슐 구조체에 있어서의 기재(코어)로서 스티렌, α-메틸스티렌, β-메틸스티렌, o-메틸스티렌, m-메틸스티렌, p-메틸스티렌, 2,4디메틸스티렌, p-n-부틸스티렌, p-tert부틸 스티렌, p-n-헥실스티렌, p-n-옥틸스티렌, p-n-테실스티렌, p-n-도데실스티렌, p-메톡시 스티렌, p-페닐스티렌 등의 스티렌계 중합성 모노머, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, n-프로필 아크릴 레이트, iso-프로필 아크릴레이트, n-부틸아크릴레이트, iso-부틸 아크릴레이트, tert-부틸아크릴레이트, n-아밀 아크릴레이트, n-헥실 아크릴레이트, 2-에틸 헥실 아크릴레이트, n-옥틸아크릴레이트, n-노닐 아크릴레이트,
시크로 헥실 아크릴레이트, 벤질 아크릴레이트, 디메틸 포스메이트 에틸 아크릴레이트, 디에틸포스페이트 에틸 아크릴레이트, 디부틸포스페이트에틸아크릴레이트, 2-벤조일옥시에틸아크릴레이트 등의 아크릴계 중합성모노머, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, n-프로필 메타크릴레이트, iso-프로필 메타크릴레이트, n-부틸레타크릴레이트, iso-부틸메타크릴레이트, tert-부틸메타크릴레이트, n-아밀 메타크릴레이트, n-헥실메타크릴레이트, 2-에틸 헥실 메타크릴레이트, n-옥틸 메타 크릴레이트, n-노닐 메타크릴레이트, 디에틸포스페이트 에틸 아크릴레이트, 디부틸포스페이트 에틸 메타아크릴레이트 등의 메타크릴계 중합성 모노머, 메틸렌 지방족 모노카르복시산에스테르류, 아세트산 비닐, 프로피온산 비닐, 벤조에산비닐, 부티르산비닐, 벤조산비닐, 포름산비닐등의 비닐 에스테르류, 비닐메틸에테르, 비닐에틸에테르, 비닐이소부틸에테르 등의 비닐 에테르류, 비닐메틸케톤, 비닐 헥실 케톤, 비닐 이소프로필 케톤 등의 비닐 케톤류 등의 비닐계 중합성 모노머로 이루어진 군으로부터 선택된 중합성모노머를 중합시켜 제조된 수지 미립자, 혹은 상기 모노머계에 극성기중합체나 착색제 등의 각종 첨가제를 첨가해서 제조된 수지 미립자, 파라핀 왁스, 폴리올레핀(polyolefin) 왁스, 핏샤트로핏슈왁스, 아미드 왁스, 고급 지방산, 에스테르 왁스 및 이들의 유도체 또는 이들의 그라프트 또는 블록화합물 등을 함유하는 미립자, 카오리나이트, 벤토나이트, 탤크, 운모 등의 점토 광물, 알루미나, 이산화 티탄 등의 금속 산화물, 실리카 겔, 히드록시아파타이트, 인산 칼슘 겔 등의 불용성무기염, 카본 블랙, 산화동, 이산화 망간, 아닐린블랙, 활성탄, 비자성 페라이트, 마그네타이트 등의 흑색 안료, 황연, 아연황, 황색 산화철, 카드뮴 엘로우, 미네랄 퍼스트 옐로우, 니켈 티탄 옐로우, 네이부르스옐로우, 나프톨 옐로우 S, 한자 옐로우 G, 한자 옐로우10G, 벤지진옐로우 G, 벤지진옐로우 GR, 퀴놀린 옐로우 레이크, 퍼머넨트옐로우 NCG, 타트라진레이크 등의 황색 안료, 적색 황연, 몰리브덴 오렌지, 퍼머넨트 오렌지 GTR, 피라조론오렌지, 발칸 오렌지, 벤지진오렌지 G, 인더스 렌 브릴리언트 오렌지 RK, 인더스 렌 브릴리언트 오렌지 GK 등의 오랜지색안료,
벤 컬러, 카드뮴 레드연단, 황화 수은, 카드뮴, 퍼머넨트 레드 4R, 리졸레드, 피라조론레드, 워팅레드, 칼슘염, 레이크 레드 C, 레이크 레드 D, 브릴리언트카민 6B, 브릴리언트카민 3B, 에오키신레이크, 로다민레이크 B, 알리자린 레이크 등의 적색 안료, 감청, 코발트 블루, 알카리 불루 레이크, 빅토리아 블루 레이크, 프탈로시아닌 블루, 무금속 프탈로시아닌 믈루, 프탈로시아닌 블루일부분 염소 화합물, 퍼스트 스카이블루, 인더스 렌 블루 BC 등의 청색 안료, 망간보라색, 퍼스트 바이올렛 B, 메틸바이오렛에이크 등으 보라색 안료, 산화 크롬 그린, 피그먼트그린B, 마라카이트그린레이트, 파이널 옐로우 그린 G 등의 녹색 안료, 아연화, 산화 티탄, 안티몬흰색, 황화 아연 등의 백색 안료, 바리타 가루, 탄산바륨, 진흙, 실리카, 화이트 카본, 탤크, 알루미나 화이트 등의 체질 안료 등을 이용할 수가 있지만, 물론 이것들로 한정되는 것은 아니다. 코어의 형상은, 그 용도에 따라서 적당히 선택 가능하지만, 예를 들면, 입자직경 0.1μm로부터 1.0mm의 범위내의 입자직경을 가지는 입자를 이용하면 된다. 또한, 상기 구조체를 전자 사진용의 캡슐 토너로서 이용하는 경우에는, 그 입자직경을 3.0μm∼10μm의 범위내에서 선택하면 된다.
또, 본발명의 적층 구조체의 기재로서는, 폴리 에틸렌 테레프탈레이드(PET), 디아세테이트, 트리 아세테이트, 셀로판, 셀룰로이드, 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리이미드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리 아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등의 플라스틱으로 이루어진 필름, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 알콜, 아세틸셀룰로스, 폴리카보네이트(polycarbonate), 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 테플론 등으로 이루어진 다공성 고분자막, 목판, 유리판, 무명, 레이온, 아크릴, 비단, 폴리에스테르 등의 옷감, 상질지, 안질지, 아트지, 본드지, 재생지, 버라이타지, 캐스트 코트지, 골판지, 레진 코트지 등의 종이를 이용할 수가 있지만, 물론 이것들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기재의 표면이 매끄러운 것이어도, 요철이 붙은 것이어도 되고, 투명, 반투명, 불투명의 어느것이어도 된다. 또, 이것들 상기 기재 중에서 2 종류 이상을 서로 접합시킨 것이어도 된다.
〈구조체의 제작〉
본 발명의 구조체의 제조 방법에는, 기재에 PHA 합성 효소에 3-히드록시 아실 CoA를 반응시켜서 PHA를 합성시키는 공정을 포함하는 것이다.
기재에 PHA 합성 효소를 고정화하는 방법으로서는, 상기 효소의 활성이 유지될 수 있는 것이고, 또한, 소망의 기재에 있어서 적용 가능한 것이면, 통상 행해지고 있는 효소 고정화 방법중에서 임의로 선택해서 이용할 수 있다. 예를 들면, 공유결합법, 이온 흡착법, 소수 흡착법, 물리적 흡착법, 어피니티 흡착법, 가교법, 격자형 포괄법 등을 예시할 수가 있지만, 특히 이온 흡착이나 소수 흡착을 이용한 고정화 방법이 간편하다.
PHA 합성 효소 등의 효소 단백질은, 아미노산이 다수 결합한 폴리펩티드이며, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파라긴산, 글루타민산 등의 유리의 이온성기를 가지는 아미노산에 의해서 이온 흡착체로서의 성질을 나타내고, 또 아라닌, 바린, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 트리프트판, 페닐 알라닌, 프로인 등의 유리의 소수성기를 가지는 아미노산에 의하고, 또 유기 고분자라고하는 점에서 소수 흡착체로서의 성질를 가지고 있다. 따라서, 정도의 차이는 있지만, 이온성이나 소수성, 또는 이온성과 소수성의 양쪽의 성질을 가지는 고체 표면에 흡착시키는 것이 가능하다.
주로 이온 흡착법에 따라 PHA 합성 효소를 고정화하는 방법에서는, 이온성관능기를 표면에 발현하고 있는 코어를 이용하면 되고, 예를 들면, 카오리나이트, 벤트나이트, 탤크, 운모 등의 점토 광물, 알루미나, 이산화 티탄 등의 금속산화물,실리카 겔, 히드록시 어퍼타이트, 인산 칼슘 겔 등의 불용성 무기염 등을 코어로서 이용할 수가 있다. 또, 이것들을 주요한 성분으로 하는 무기 안료, 이온교환 수지, 키토산, 포리아미노포리스테렌 등의, 이온성 관능기를 가지는 중합체도 이온 흡착성 코어로서 이용할 수가 있다.
또, 주로 소수 흡착에 의해 PHA 합성 효소를 고정화하는 방법에서는, 표면이 비극성인 코어를 이용하면 되고, 예를 들면, 스티렌계 폴리머, 아크릴계 폴리머, 메타크릴계 폴리머, 비닐 에스테르류, 비닐계 폴리머 등, 이온성 관능기를 표면에 발현하고 있지 않는, 혹은 소수성 관능기를 표면에 발현하고 있는 많은 중합체를 코어로서 이용할 수가 있다. 방향고리를 복수 가지는 아조 안료나 축합다환의 프타로시아닌계 안료, 안트라 퀴논계 안료 등의 유기안료, 카본 블랙 등은 소수 흡착성이다.
이온 흡착법 또는 소수 흡착법에 의한 PHA 합성 효소의 코어에의 고정화는, 상기 효소와 코어를 소정의 반응액중에서 혼합함으로써 달성된다.
이 때, 상기 효소가 코어의 표면에 균등하게 흡착되도록, 반응 용기를 적당한 강도로 진탕 혹은 교반하는 것이 바람직하다.
반응액의pH나 염 농도, 온도에 의해 코어 및 PHA 합성 효소의 표면 전하의 정부나 전하량, 소수성이 변화하므로, 이용하는 코어의 성질에 ??추어, 효소 활성상 허용되는 범위내에서 용액의 조정을 실시하는 것이 바람직하다. 예을 들면, 코어가 주로 이온 흡착성인 경우에는, 염 농도를 내리므로써. 코어와 PHA 합성 효소와의 흡착에 기여하는 전하량을 늘릴 수가 있다. 또, pH를 바꾸므로써, 양자의 반대 전하를 늘릴 수가 있다.
코어가 주로 소수 흡착성인 경우에는, 염 농도를 올리므로써 양자의 소수성을 늘릴 수가 있다. 또, 미리 전기 영동이나 적은 각 등을 측정해, 코어나 PHA 합성 효소의 하전 상태나 소수성을 조사하므로써, 흡착에 적절한 용액 조건을 설정 할 수도 있다. 또한, 코어와 PHA 합성 효소와의 흡착량을 직접 측정해서 조건을 요구할 수도 있다. 흡착량의 측정은,
예를 들면,
코어가 분산된 용액에 농도 기지의 PHA 합성 효소 용액을 첨가해, 흡착처리를 실시한 후, 용액중의 PHA합성 효소 농도를 측정해, 차인법에 의해 흡착 효소량을 구하는 방법을 이용하면 된다.
이온 흡착법이나 소수 흡착법에 따라 효소를 고정화 하기 어려운 코어 재질의 경우는, 조작의 번잡함이나 효소의 실활의 가능성을 고려하면 공유결합법에 따라도 상관없다. 예를 들면, 방향족 아미노기를 가지는 고체 입자를 디아조화해, 이것에 효소를 디아조커플링하는 방법이나, 카르복실기, 아미노기를 가지는 고체 입자와 효소의 사이에 펩티드 결합을 형성시키는 방법, 할로겐기를 가지는 고체 입자와 효소의 아미노기등과의 사이에서 알킬화하는 방법, 브롬화 시안으로 활성화 한 다당류 입자와 효소의 아미노기를 반응시키는 방법, 고체 입자의 아미노기와 효소의 아미노기와의 사이를 가교하는 방법, 알데리드기 또는 케톤기를 가지는 화합물과 이소시아니드 화합물의 존재하, 카르복실기, 아미노기를 가지는 고체 입자와 효소를 반응시키는 방법, 디술피드기를 가지는 고체 입자와 효소의 티올기와의 사이에서 교환 반응시키는 방법 등이 있다.
또, 어피니티 흡착에 의해 고체 입자에 흡착해도 된다. 어피니티 흡착이란, 생체 고분자와 거기에 특이적인 친화력을 나타내는, 리간드로 불리는 특정 물질과의 사이의 생물학적 흡착으로, 예를 들면, 효소와 기질, 항체와 힝원, 리셉터와 아세틸코린 등의 정보 물질, mRNA와 tRNA 등이 있다. 일반에, 어피니티 흡착을 이용해 효소를 고정화하는 방법으로서 효소의 기질이나 반응 생성물, 길항저해제, 보조효소, 알로스테릭에펙터 등을 리간드로서 고체에 결합시켜, 이 고체에 효소를 첨가해 어피니티 흡착시키는 방법을 취한다. 그렇지만, PHA 합성 효소에 대해서는, 예를 들면, 기질인 3-히드록시아실CoA를 리간드로서 이용했을 경우, 상기 효소의 PHA 합성을 촉매하는 활성 부위가 리간드와의 결합에 의해 막혀버리기 때문에, PHA를 합성할 수 없게 된다고 하는 문제가 발생한다. 그렇지만, 다른 생체 고분자를 PHA 합성 효소에 융합시켜, 상기 생체 고분자으 리간드를 어피니티 흡착에 이용하므로써 고정화 후도 PHA 합성 효소의 활성을 유지할 수가 있다. PHA 합성 효소와 생체 고분자와의 융합은 유전자 공학적 수법에 의해서 행하여도 되고, 또 PHA 합성 효소에 화학적으로 결합시켜도 된다. 이용하는 생체 고분자로서는, 대응하는 리간드가 입수 용이해, 그 리간드가 코어에 용이하게 결합할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 상관없지만, 유전자 재조합에 의해 융합물을 발현시키는 경우에는, 단백질인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 형질 전환에 의해 GST를 발현하는 우전자 배열에 PHA 합성 효소의 유전자 배열을 연결한 대장균을 이용해, GST와 PHA 합성 효소와의 융합 단백질을 생산해, 이것을 GST의 리간드인 글루타치온을 결합한 Sepharose에첨가함으로써, PHA 합성 효소를 Sepharose에 어피니티 흡착시킬 수가 있다.
또, 기재에 대해서 결합능을 가지는 아미노산 배열을 포함한 펩티드를 PHA 합성 효소에 융합해 제시시켜, 상기 기재에 대해서 결합능을 가지는 아미노산 배열의 펩티드 부분과 기재와의 결합성에 의거해서, 상기 기재 표면에 PHA 합성 효소를 고정화할 수도 있다.
기재에 대한 결합능을 가지는 아미노산 배열은, 예를 들면 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해 결정할 수가 있다. 특히 예를 들면 M13계 파아지의 표면 단백질(예를 들면 geneⅢ 단백질)의 N말단측 유전자에 랜덤 합성 유전자를 연결해 조제된 파아지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 매우 적합하게 이용할 수가 있지만, 이 경우 기재에 대한 결합능을 가지는 아미노산 배열을 결정하려면, 다음과 같은 순서를 취한다. 즉, 기재 혹은 상기 기재를 구성하는 적어도 일성분에 대해서 파지디스프레이펩티드라이브라리를 첨가함으로써 접촉시켜, 그 후 세정에 의해 결합 파지와 비결합 파지를 분리한다. 기재 결합 파지를 산 등에 의해 용출하여 완충액으로 중화 한 후 대장균에 감염시키고 파지를 증폭한다. 이 선별을 여러 차례 반복하면 목적의 기재에 결합능이 있는 복수의 클론이 농축된다. 여기서 단일인 클론을 얻기 위해 재차 대장균에 감염시킨 상태로 배지 플레이트상에 콜로니를 만들게 한다. 각각으 단일 콜로니를 액체 배지에서 배양한 후, 배지상청중에 존재하는 파지를 포리틸렌글리콘 등으로 침전 정제해, 그 염기 배열을 해석하면 펩티드의 구조를 알 수 있다.
상기 방법에 의해 얻을 수 있던 기재에 대한 결합능을 가지는 펩티드의 아미노산 배열은, 통상의 유전자 공학적 수법을 이용해, PHA 합성 효소에 융합해 이용된다. 기재에 대한 결합능을 가지는 펩티드는 PHA 합성 효소의 N말단 혹은 C말단에 연결해 발현할 수가 있다. 또 적당한 스페이서배열을 삽입해 발현할 수도 있다. 스페이서배열로서는, 약 3∼약 400 아미노산이 바람직하고, 또, 스페이서배열은 어떠한 아미노산을 포함해도 된다.
가장 바람직하기는, 스페이서배열은, PHA 합성 효소가 기능하는 것을 방해하지 않고, 또, PHA 합성 효소가 기재에 결합하는 것을 방해하지 않는 것이다.
상기 방법에 의해 제작된 고정화 효소는, 그대로도 이용할 수가 있지만, 또한 동결건조 등을 베푼 다음 사용할 수도 있다.
3-히드록시 아실 CoA의 중합에 의해 PHA가 합성되는 반응에 있어서 방출되는 CoA량이 1분간에 1μmol이 되는 PHA합성 효소량을 1단위(U)로 했을 때, 기재에 고정하는 효소의 양은, 예를 들면 기재가 캡슐 구조체의 코어인 경우, 기재 1g당 10단위(U)에서 1,000단위(U), 바람직하게는 50단위(U)로부터 500단위(U)의 범위내로 설정하면 된다.
상기의 고정화 효소는 소망한 PHA의 원료가 되는 3-히드록시 아실 CoA를 포함한 수계 반응액중에 투입되어 기재 표면의 PHA 합성 효소에 의해 PHA가 합성되므로써, 기재가 PHA에 의해 피복된 구조체를 형성한다. 상기 수계 반응액은, PHA 합성 효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 조건에 조정된 반응계로서 구성되어야 할 것이고, 예를 들면 통상, pH 5.5로부터 pH 9.0, 바람직하게는 pH 7.0으로부터 pH 8.5가 되도록, 완충액에 의해 조제한다. 다만, 사용하는 PHA 합성 효소의 지적 pH나 pH안정성에 따라서는, 상기 범위 이외에 조건을 설정하는 일도 제외되지 않는다. 완충액의 종류는, 사용하는 PHA 합성 효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 것이면, 설정하는 pH영역 등에 따라서 적당히 선택해 이용할 수가 있지만, 예를 들면, 일반의 생화학 반응에 이용되는 완충액, 구체적으로는 아세트산 버퍼, 인산 버퍼, 인산 칼륨 버퍼, 3-(N-모르포리노) 프로판 술폰산(MOPS) 버퍼, N-트리스(히드록시메틸3-아미노 프로판 술폰산(TAPS) 버퍼, 트리스 염산 버퍼, 글리신 버퍼, 2-(시클로 헥실 아미노) 에탄 술폰산(CHES) 버퍼 등을 이용하면 된다. 완충액의 농도도, 사용하는 PHA 합성 효소의 활성을 발휘시밀 수 있는 것이면 특히 한정되지 않지만, 통상 5.0 mM에서 1.0 M, 바람직하게는 0. 1 M으로부터 0.2 M의 농도의 것을 사용하면 된다. 반응 온도는, 사용하는 PHA 합성 효소으 특성에 따라서 적당히 설정하는 것이지만, 통상 4℃∼50℃, 바람직하기는 20℃∼40℃로설정하면 된다. 다만, 사용하는 PHA 합성 효소의 지적온도나 내열성에 따라서는, 상기 범위 이외에 조건을 설정하는 일도 제외되지 않는다. 반응 시간은, 사용하는 PHA 합성 효소의 안정성 등에도 의하지만, 농상, 1분간에서 24시간, 바람직하기는 30분간에서 3시간의 범위내에거 적당히 선택해 설정한다. 반응액중의 3-히드록시 아실 CoA 농도는, 사용하는 PHA 합성 효소의 활성을 발휘시킬 수 있는 범위내에서 적당히 설정하는 것이지만, 통상, 0.1mM으로부터 1.0 M, 바람직하기는 0.2mM으로부터 0.2 M의 범위내에서 설정하면 된다. 또한 반응액중에 있어서의 3-히드록시 아실 CoA 농도가 높은 경우, 일반적으로, 반응계의 pH가 저하하는 경향에 있기 때문에, 3-히드록시 아실 CoA 농도를 높게 설정하는 경우는, 상기의 완충액 농도도 좀 높은 듯하게 설정하는 것이 바람직하다.
또, 상기 공정에 있어서, 수계 반응액중의 3-히드록시 아실 CoA의 종류나 농도 등의 조성을 경시적으로 변화시키므로써, 구조체의 형상이 입자형상이면 안쪽에서 바깥쪽으로 향하는 방향으로, 구조체의 형상이 평면형상이면 수직 방향으로, 기재를 피복하는 PHA의 모노머 유닛 조성을 변화시킬 수가 있다.
이 모노머 유닛 조성이 변화한 구조체의 형태로서 예를 들면, PHA 피막의 조성 변화가 연속적으로, 안쪽에서 바깥쪽으로 향하는 방향 혹은 수직 방향으로 조성의 구배를 형성한 1층의 PHA가 기재를 피복한 형태를 들 수가 있다. 제조 방법으로서는, 예를 들면, PHA를 합성하면서 반응액중에 별도조성의 3-히드록시 아실 CoA를 첨가하는 등의 방법에 의하면 좋다.
또 다른 형태로서 PHA 피막의 조성 변화가 단계적으로, 조성이 다른 PHA가 기재를 다층에 피복한 형태를 들 수가 있다. 이 제조 방법으로서는, 어느 3-히드록시 아실 CoA의 조성으로 PHA를 합성한 후, 원심분리 등에 의해 조제중의 구조체를 반응액으로부터 일단 회수해, 이것에 다른 3-히드록시 아실 CoA의 조성으로 이루어진 반응액을 재차 첨가하는 등 방법에 의하면 된다.
상기 반응에 의해 얻을 수 있던 구조체는, 필요에 따라서, 세정 공정에 제공한다. 구조체의 세정 방법은, 상기 구조체 제조의 목적상 바람직하지 않은 변화를, 상기 구조체에 미치는 것이 아닌 한, 특히 한정은 되지 않는다,. 구조체가, 기재를 코어로 해 PHA를 외피로 하는 캡슐 구조체인 겨우는, 예를 들면, 원심분리에 의해 상기 구조체를 침전시켜, 상청을 제거함으로써, 반응액에 함유되는 불요 성분을 제거할 수가 있다. 여기에 물, 완충액, 메틴올 등의 상기 PHA가 불용인 세정제를 첨가해, 원심분리를 하는 조작을 실시함으로써, 한층 더 세정할 수도 있다. 또, 원심분리 대신에, 여과등의 수법을 이용해도 된다. 한편, 구조체가, 평판 형상의 기재를 PHA로 피복한 구조체인 경우는, 예를 들면, 상기 세정제에 침지하는 등을 하여 세정할 수가 있다. 또한 상기 구좇;는, 필요에 따라서, 건조 공정에 제공할 수가 있다. 또한 상기 구조체에 각종 2차 가공이나 화학 수식등의 처리를 가해 사용할 수도 있다.
예를 들면, 기재를 피복한 PHA에 화학 수식을 실시함으로써, 게다가 유용한 기능·특성을 구비한 구조체를 얻을 수 있다.
예들 들면, 상기 PHA에 그라프트 사슬을 도입함으로써, 상기 그라프트 사슬에 기인하는 각종의 특성을 갖춘 PHA가, 기재의 적어도 일부를 피복한 구조체를 얻을 수 있다. 또, 상기 PHA를 가교화시킴으로써, 구조체의 기계적 강도, 내약품성, 내열성 등을 제어하는 것이 가능하다.
화학 수식의 방법은, 소망한 기능·구조를 얻는 목적을 만족시키는 방법이면 특히 한정은 되지 않지만, 예를 들면, 반응성 관능기를 곁사슬에 가지는 PHA를 합성해, 상기 관능기의 화학반응을 이용해서 화학수식하는 방법을, 썩 알맞는 방법으로서 이용할 수 있다.
상기의 반응성 관능기의 종류는, 소망한 기능·구조를 얻는 목적을 만족시키는 것이면 특히 한정되지 않지만, 예를 들면, 상기한 에폭시기를 예시할 수가 있다. 에폭시기를 곁사슬에 가지는 PHA는, 통상의 에폭시기를 가지는 폴리머와 마찬가지의 화학적 변환을 실시할 수가 있다. 구체적으로는, 예를 들면 수산기로 변환하거나 술폰기를 도입하는 것이 가능하다. 또, 티올이나 아민을 가지는 화합물, 구체적으로는, 에폭시기와의 반응성이 높은 아미노기를 말단에 가지는 화합물등을 첨가해 반응시키므로써, 폴리머의 그라프트사슬이 형성된다.
아미노기를 말단에 가지는 화합물로서는, 폴히비닐 아민, 폴리에틸렌이민, 아미노 변성 폴리실록산(아미노 변성 실리콘 오일) 등의아미노 변성 폴리머를 예시할 수가 있다. 이 중, 아미노 변성 폴리실록산으로서는, 시판하는 변성 실리콘 오일을 사용??도 되고, 또, J. Amer. Chem Soc., 78,2278(1956) 등에 기재의 방법으로 합성해 사용할 수도 있어 상기 폴리머의 그라프트사슬의 부가에 의한 내열성의 향상 등의 효과를 기애할 수 있다.
또, 에폭시기를 가지는 폴리머의 화학적 변환의 다른 예로서 핵사메틸렌디아민 등의 디아민 화합물, 무수 숙신산, 2-에틸-메틸이미다졸, 전자선 조사 등에 의한 가교 반응을 들 수 있다. 이 중, 에폭시기를 곁사슬에 가지는 PHA와 헥사메틸렌디아민과의 반응은, 하기의 스킴에 표시하는 바와 같은 형태로 진행해, 가교 폴리머가 생성한다.
얻을 수 있던 구조체에 대해, 기재가 PHA로 피복되고 있는 것을 확인하는 방법으로서는, 일반적으로는, 예를 들면, 가스 크로마토그래피등에 의한 조성 분석과전자현미경등에 의한 형태 관찰을 조합한 방법이나, 비행 시간형 2차 이온 질량 분석 장치(TOP-SIMS)와 이온 스패터링 기술을 이용해, 각 구성층의 매스 스펙트럼으로부터 구조를 판정하는 방법등을 이용할 수가 있다. 그러나, 또 직접적 또한 간편한 확인 방법으로서 본 발명자들에 의해 새롭게 개발된, Nile 블루 A염색과 형광 현미경 관찰을 조합한 방방을 이용할 수도 있다. 본 발명자들은, PHA 합성 효소를 이용한 무세포계(in vitro)에서의 PHA 합성을 간편하게 판정할 수 있는 방법에 대해 예의 검토를 계속해 온 결과, PHA에 특이적으로 결합해 형광을 발하는 성질을 가지는 약제이며, APP1, Environ. Microbio., 44,238-241(1982)에 있어서 미생물 세포(in vivo)에서의 pha생산의 간이적 판별로 이용할 수가 있다고 보고되고 있는 Nile 블루 A가, 적절한 사용 방법 및 사용 조건의 설정에 의해, 무세포계에서의 PHA 합서의 판정에도 이용할 수가 있는 것을 발견하여 상기의 방법을 완성시켰다. 즉, 본 방법에서는, 소정 농도의 Nile 블루 A용액을 여과한 후, PHA를 함유한 반응액에 혼합해, 형광 현미경으로 일정한 파장의 여기광을 조사하면서 관찰함으로써, 합성된 PHA만으로부터 형광을 발하게 해 이것을 관찰함으로써, 무세포계에서의 PHA 합성을 간단하고 쉽게 판정할 수가 있다. 사용한 기재가 상기 조건하에서 형광을 발하는 성질을 가지는 것이 아닌 한, 상기 방법을 본 발명의 구조CPD의 제조에 응용함으로써, 기재의 표면을 피목한 PHA를 직접적으로 관찰해, 평가할 수 있다.
또, 기재를 피복하고 있는 PHA의 안쪽으로부터 바깥쪽을 향하는 방향 혹은 수직 방향의 조성분포는, 이온스퍼터링기술과 비행시간형 2차이온질량분석장치(TOF-SIMS)를 조합해서 평가할 수 있다.
〈구조체의 이용〉
본 발명의 특징의 하나는, 통상의 유기 합성 화학적 수법에서는 제조가 곤란했던 구조체의 제조를 가능하게 한 것이며, 따라서, 종래의 유기 합성 화학적 수법으로 제조된 캡슐 구조체나 적층 구조체에는 없는 뛰어난 특성을 부여한 구조체를 얻는 것이 가능하다, 예를 들면, 종래의 유기 합성적 수법에서는 실현이 곤란했던 새로운 고분자 화합물의 이용이나, 새로운 기능·구조의 부여가 가능하게 된다. 또한 구체적으로는, 생물의 촉매 작용에 특유의 지극히 엄밀한 분자 인식능이나 입체 선택성을 이용해, 종래의 유기 합성 화학적 수법에서는 실현이 곤란했던 새로운 기능성 고분자 화합물이나, 지극히 키랄리티가 높은 고분자 화합물에 의해 피복된 캡슐 구조체나 적층 구조체등을, 지극히 간편한 프로세스로 제조하는 것이 가능하게된다.
상기와 같은 구조체의 응용의 일례로서는, 전자 사진용 고기능 캡슐 토너를 들 수 있다. 상술한 대로, 전자 사진용 캡슐 토너에 있어서는, 그 제조공정이 지극히 복잡하게 되고, 또. 제조 공정에 있어서 대량의 용매류나 계면활성제를 사용하는 등의 과제가 있었다. 본 발명의 방법에 의해, 상기와 같은 과제를 해결해, 캡슐 토너를 간편하게 제조할 수 있는 방법이 제공된다. 또한 그 외피의 두께나 모노머 유닛의 조성등도 비교적 용이하게 제어할 수 있다. 또 일본국 특개평8-286416호 공보에 의하면, 캡슐 토너의 외피에 폴리에스테르등의 극성 수지를 함유시키므로써, 화질 내구성의 향상, 대전의 균일화 및 안정화등의 효과를 얻을 수 있다고 여겨지고 있지만, 본 발명의 방법에의해 얻을 수 있는 캡슐 토너에 있어서의 PHA로 이루어진 외피에도, 상기와 같은 효과를 기대할 수 있다.또한, 본 발명의 방법에서는, 여러 가지의 관능기를 가지는 PHA를 외피로서 이용할 수가 있기 때문에, 이것들 관능기에 의한 토너의 표면 물성의 제어나, 새로우 SRLSMD성의 부여 등도 가능해진다. 또 코어 부분의 제조 공정을 제외하면, 그 제조에 있어서 유기용매나 계면활성등을 거의, 혹은 전혀 사용하지 않고, 또한, 반응 조건도 지극히 온화하기 때문에, 제조상의 환경 부하를 큰폭으로 저감하는 것이 가능하다.
본 발명의 구조체의 응용의 또하나의 예로서는, 예를 들면, 잉크젯 기록방식에 있어서의 기록 매체를 들 수 있다. 상술한 대로, 상기 기록 매체에 있어서 잉크 흡수층을 기재상에 형셩시키는 방법으로서는, 종래는 도말에 의한 방법이 일반적이었다. 본 발명의 방법에 의해서, 상기 방법을 이용하는 일 없이, 새롭게 기록 매체를 제조하는 것이 가능해진다. 즉, 효소를 고정화한 기재롸 예를 들면, 하기 화학식 [21],
로 나타내지는 3-히드록시피메릴 CoA를 반응시키므로써, 하기 화학식
[22]
로 나타내지는, PHA, 즉, 음이온성 관능기인 카르복실기를 곁사슬에 가지는 PHA를 잉크 수용층으로서 중층한 기록 매체를 제조할 수가 있다. 본 발명의 방법에 의해, 종래의 수법에서는 제조가 곤란했던, 상기와 같은 신규 기능성 기록 매체의 제조가 가능해지지만, 종래, 이러한 수법에 의해 상기 기록 매체를 제조했다고 하는 보고는 전혀 없다.
또한, 본 발명의 구조체 및 그 이용 방법 및 그 제조 방법은, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시에에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명한다. 단, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 가장 좋은 실시형태의 일예이기는 하나, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 이하에 있어서의 「%」는 특별히 포기한 이외는 중량 기준이다.
(참고예 1) PHA 합성 효소 생산능을 가지는 형질 전환체의 제작
YN2주를 100ml의 LB배지(1% 폴리 펩톤(일본 제약(주) 제), 0.5%효모 엑기스(Difco 사제), 0.5%염화 나트륨, pH7.4)로 30베℃, 하룻밤 배양 후, 마마등의 방법에 의해 염색체 DNA를 분리 회수했다. 얻을 수 있던 염색체 DNA를 제한 효소 HindⅢ 오나전 분해 단편을 연결했다. 이 염색체 DNA 단편을 짜넣은 플라스미드 벡터를 이용해, 대장균(Escherichia coli) HB101주를 형질 전환해, YN2주의 DNA라이브러리를 제작했다. 다음에, Y N균주의 PHA 합성 효소 유전자를 포함한 DNA 단편을 선택하기 위해, 콜로니·하이브리다이즈용의 프로브 조제를 행하였다. 배열 번호:2 및 배열 번호:3의 염기 배열로 이루어진 올리고 튜클레오티드를 합성해(아마추어 샴 활마시아·바이오 텍(주)), 이 올리고 누클레오티드를 프라이머에 이용해, 염색체 DNA를 템플레이트로서 PCR을 실시했다. PCR증폭되어 온 DNA 단편을 프로브로서 이용했다. 프로브의 표식화는, 시판하는 표식 효소계 AlkPhosDirect(아마추어 샴 활마시아·바이오 텍(주) 제)를 이용해서 행하였다. 얻을 수 있던 표식화 프로브를 이용해,
YN2주의 염색체 DNA라이브러리로부터 코로니하이브리다이제이션법에 의해서 PHA 합성 효소 유전자를 포함한 재조합 플라스미드를 가지는 대장균 균주를 선발했다. 선발한 균주로부터, 알칼리법에 의해서 플라스미드를 회수하므로서, PHA 합성 효소 유전자를 포함한 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 여기서 취득한 유전자 DNA 단편을, 불화성 그룹인 IncP, IncQ, 또는 IncW의 어느 쪽에도 속하지 않는 광숙주역 복제 영역을 포함한 벡터 pBBR122(Mo Bi Tec)에 재편성하였다. 이 재편성 플라스미드를 슈드모나스·치코리아이(PHA합성능결손주)에 메렉트로포테슘법에 의해 형질전환한 바, YN2ml주의 PHA 합성능이 복귀해, 상보성을 나타냈다. 따라서, 선발된 유전자 DNA 단편은, 슈드모나스·테코리아이 YN2ml주내에 있어서, PHA 합성 효소로 번역 가능한, PHA 합성 효소 유전자 영역을 포함하는 것이 확인된다.
이 DNA 단편에 대해, 산가법에 의해 염기 배열을 결정했다. 그 결과, 결정된 염기 배열중에는, 각각 펩티드사슬을 코드하는, 배열번호;4 및 배열번호;5로 나타나는 염기 배열이 존재하는 것이 확인되었다. 이들의 PHA 합성 효소 유전자에 대해, 염색체 DNA를 템플릿으로서 PCR을 실시해, PHA 합성 효소 유전자의 완전길이를재조제하였다. 즉, 배열번호;4로 나타나는 염기 배열의 PHA 합성 효소 유전자에 대한, 상류측 프라이머(배열번호;6) 및 하류측 프라이머(배열번호;7), 배열번호;5로 나타나는 염기 배열의 PHA 합성 효소 유전자에 대한, 상류측 프라이머(배열번호;8) 및 하류측 프라이머(배열번호;9)를 각각 합성했다(아마추어 샴 활마시아·바이오 텍(주).
이들의 프라이머를 이용해, 배열번호;4 및 배열번호;5로 나타나는 염기 배열 각각에 대해서 PCR을 실시해, PHA 합성 효소 유전자의 완전길이를 증폭한 (LA-PCR 킷;타카라주조(주) 제) 다음에, 얻을 수 있던 PCR 증폭 단편 및 발현 벡터 pTrc99A를 제한 효소 HindⅢ로 절단 해, 탈인산화 처리(Molecular Cloning, 1 권, 572페이지, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory 출판)한 후, 이 발현 벡터 pTrc99A의 절단 부위에, 양말단의 소용없는 염기 배열을 제외한 PHA 합성 효소 유전자의 완전길이를 포함한 DNA 단편을, DNA 라이게이션킷트 Ver. Ⅱ(타카라주조(주) 제)를 이용해 연결했다.
얻을 수 있던 재조합 플라스미드로 대장균(Escherichia coli) HB101 ;타카라주조)을 염화 칼슘법에 의해 형질 전환했다. 얻을 수 있던 재조합체를 배양해, 재조합 플라스미드의 증폭을 실시해, 재조합 플라스미드를 각각 회수했다. 배열 번호;4의 유전
자 DNA를 유지하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C1, 서열번호: 5의 유전자 DNA를 유지하는 재조합 플라스미드를 pYN2-C2로 했다. pYN2-C1, pYN2-C2로 대장균(Escher ichia coli HB101fB fadB 결손주)을 염화 칼슘법에 의해 형질 전환해, 각각의 재조합 플라스미드를 유지하는 재조합 대장균주, pYN2-C1 재조합주, pYN2-C2재조합주를 얻었다.
(참고예 2) PHA 합성 효소의 생산1
pYN2-C1에 대해서, 상류측 프라이머가 되는 올리고누클레오타드(서열 번호 10) 및 하류측 프라이머가 되는, 올리고누클레오티드(서열 번호 11)를 각각 설계 합성했다(아마샴팔마샤·바이오 텍(주)). 이 올리고누클레오티드를 프라이머로서 pYN2-C1를 텐플레이트로서 PCR를 실시해, 상류에 BamHI 제한 부위, 하류에 Xhol 제한 부위를 가지는 pha 합성 효소 유전자의 완전장을 증폭한 (LA-PCR 키트; 타카라주조(주) 제).
마찬가지로 pYN2-C2에 대해서, 상류측 프라이머가 되는, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호: 12) 및 하류측 프라이머가 되는, 올리고누클레오티드(서열 번호: 13)를 각각 설계·합성했다(아마샴팔마샤·바이오 텍(주)). 이 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 pYN2-C2를 텐플레이트로서 PCR를 실시해, 상류에 BamHI 제한 부위, 하류에 Xhol 제한부위를 가지는 PHA 합성 효소 유전자의 완전장을 증폭한(LA-PCR 키트:타카라주조(주) 제).
정제한 각각의 PCR 증폭 산물을 BamHI 및 Xhol에 의해 소화해, 플라스미드 pGEX-6P-1(아마샴팔마샤·바이오 텍(주)제)의 대응하는 부위에 삽입했다. 이것들 백터를 이용해 대장균(JM109)을 형질 전환해, 발현용 균주를 얻었다. 균주의 확인은, Miniprep (Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA 사제)를 이용해 대량으로 조제한 플라스미드 DNA를 BamHI, Xhol로 처리해 얻을 수 있는 DNA단편에 의해 실시했다. 얻을 수 있던 균주를 LB-Amp 배지 10ml로 하룻밤 프레·칼차한 후, 그 0.1ml를, 10ml의 LB-Amp 배지에 첨가해, 37℃, 170 rpm로 3시간 진탕 배양했다. 그 후 IPTG를 첨가 (종농도 1mM)해, 37℃에서 4-12시간 배양을 계속했다.
IPTG 유도한 대장균을 집균(8,000×g, 2분, 4℃)해, 1/10양의 4℃ 인산완충 생리 식염수(PBS; 8g NaC1, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4,0.2g KC1, 1,000ml 정제수)에 재차현탁했다. 동결 융해 및 소니케이션에 의해 균체를 파쇄 해, 원심 (8,000×g, 10분 , 4℃)해, 고형협잡물을 없앴다. 목적의 발현 단백질이 상청에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 유도되고 발현된 GST 융합 단백질을 글루타치온·세파로스 4B(아마샴팔마샤·바이오 텍(주)제)으로 정제 했다. 사용하는 그르타치온세파로스는, 미리 비특이적 흡착을 억제하는 처리를 실시했다. 즉, 그르타치온세파로스를 동량의 PBS 로 3회 세정(8,000×g, 1분 , 4℃)한 후, 4% 소 혈청알부민 함유 PBS를 동량 더해 4℃로 1시간 처리했다. 처리 후 동량의 PBS로 2회 세정해, 1/2양의 PBS에 재차 현탁했다. 사전 처리 한 그르타치온세파로스 40㎕을, 무세포 추출액 1 ml에 첨가해, 4℃ 로 조용하게 교반 했다. 이것에 의해, 융합 단백질 GST-YN2-C1 및 GST-YN2-C2를 그르타치온세파로스에 흡착시켰다. 흡착 후, 원심(8,000×g, 1분 , 4℃)해 그르타치온세파로스를 회수해, 400㎕의 PBS로 3회 세정했다. 그 후, 10mM 그르타치온 40μ 1을 첨가해, 4℃로 1시간 교반해서, 흡착한 융합 단백질을 용출했다. 원심 (8,000×g, 2분 , 4℃)해 상청을 회수한 후PBS 에 대해서 투석해, GST 융합 단백질을 정제 했다. SDS-PAGE 에 의해, 싱글 밴드를 확인했다.
각 GST 융합 단백질 500μ g를 PreScisson 프로테아제(아마샴팔마샤·바이오 텍(주)제, 5U)으로 소화한 후, 글르타치온·세파로스에 통해 프로테아제와 GST를 제거했다. 플로스루우 분획을 또 PBS로 평형화한 세파덱스 G200 컬럼에 걸쳐 발현 단백질 YN2-C1 및 YN 2-C2 의 최종 정제물을 얻었다. SDS-PAGE에 의해 각각 60.8 kDa, 및 61.5 kDa 의 싱글 밴드를 확인했다.
상기 효소를 생체 용액 시료 농축제(미즈브토리군 AB-1100, 아토(주) 제)를 이용해 농축해, 10U/ml 의 정제 효소 용액을 얻었다.
각 정제 효소 활성은 전술의 방법으로 측정했다. 또, 시료중의 단백질 농도는, 마이크로 BCA 단백질 정량 시약 킷(파아스 케미컬 사제)에 의해 측정했다. 각 정제 효소의 활성 측정의 결과를 표 1에 나타냈다.
비활성화
pYN2-C1 4.1U/mg 단백질
pYN2-C2 3.6U/mg 단백질
(참고예 3) PHA 합성 효소의 생산 2
p91주, H45주, YN2주 또는 P161주를, 효모 엑스(Difco 사제) 0.5%, 옥탄산 0.1%를 포함한 M9배지 200ml 식균 해, 30℃, 125 스트로크/분에 진탕배양했다. 24시간 후, 균체를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 0.1M트리스 염산 버퍼(pH8.0) 200ml 에 재현탁해서 재차 원심분리하는 것에 의해 세정했다.균체를 0.1M트리스 염산버퍼(pH 8.0), 2.0ml에 재현탁하고, 초음파 파쇄기로 파쇄한 후, 원심분리(12,000×g, 4℃ 10분간)해 상청을 회수해 거칠은 효소를 얻었다.
각 정제 효소 활성은 전술의 방법으로 측정해, 그 결과를 표 2에 표시했다.
활성
P91주 0.1U/ml
H45주 0.2U/ml
YN2주 0.4U/ml
P161주 0.2U/ml
(실시예 1) 캡슐 구조체의 제작 1
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액 (10U/ml) 10 질량부에 알미나입자(입자직경 0.12㎛ ~ 135㎛) 1 질량부, PBS 39 질량부를 첨가하고 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해서 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리 (10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1M 인산 버퍼(pH 7.0) 48질량부에 현탁하고 (R)-3-히드로키시오크타노일 CoA (Eur. J. Biochem. , 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1 질량부, 소 혈청알부민(Si gma 사제) 0.1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕했다.
상기 반응액 10μl를 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl을 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어 형광현미경(330~380 ㎚ 여기 필터, 420 ㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다. 대조로서 0.1 M 인산 버퍼(pH 7.0) 49 질량부에 알루미나 입자 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2.5 시간 완만하게 진탕 한 후, 똑같이 Nile 블루 A로 염색해 형광 현미경 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면은 전혀 형광을 발하지 않았다.
게다가 해입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0.45μm 의 멘브렌필터로 여과 해, 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석 장치(GS-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르 화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 도 1에 나타내는 대로, 해 PHA 는 3-히드록시 옥탄산유닛으로부터 이루어진 PHA 인 것이 확인되었다.
게다가 상기 PHA 의 분자량을 게르파미에이션크로마트그라피(GPC: 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 연구실 PLgel MIXED-C (5μm), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도: 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=21,000, Mw=40,000 이었다.
(실시예 2) 캡슐 구조체의 제작 2
pYN2-C2 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10U/ml) 10 질량부에 알루미나 입자(입자직경 0.12μm ~ 135μm) 1질량부, PBS 39 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕 해 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차원심분리(10,000×g, 4℃, 10분간)해서 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1 M인산 버퍼(pH 7. 0) 48질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시오크타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
상기 반응액 10μl을 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl을 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다.
게다가, 상기 입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0. 45μm 의 멘브렌필터로 여과 해, 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석 장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유닛의 메틸에스테르화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 실시예 1의 결과와 같게, 상기 PHA는 3-히드록시 옥탄산유닛으로 이루어진 PHA 인 것이 확인되었다.
(실시예 3) 캡슐 구조체의 제작 3
YN2, H45주, P91주 또는 P161주 유래의 PHA 합성 효소의 거칠은 효소 99 질량부에 알루미나 입자(입자직경 0.12μm ~ 135μm) 1 질량부를 첨가해, 30℃에서30분간 완만하게 진탕 해 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차원심 분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기의 각 고정화 효소를 0. 1 M 인산버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시오크타노일 CoA (Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해 각각 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
상기 반응액 10μl를 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl를 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 어느 고정화 효소의 반응액에 대해서도, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 모두, PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다.
게다가, 상기 입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해 외피를 이룬 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0. 45μm 의 멘브렌필터로 여과해, 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석 장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유니트의 메틸 에스테르 화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 실시예 1의 결과와 같게, 상기 PHA는 3-히드록시 옥탄산 유닛으로 이루어진 PHA인 것이 확인되었다.
(실시예 4) 캡슐 구조체의 제작 4
pYN2-C1재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10 U/ml) 10 질량부에 알루미나 입자(입자직경 0.12μm ~ 135μm) 1 질량부, PBS 39 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕 해 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R) -3-히드록시-5-페닐바레릴 CoA(Reformatsky 반응에 의해 얻을 수 있던 3- 히드록시 페닐발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록시-5-페닐발레르산을 얻은 후, (Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
상기 반응액 10μl를 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl를 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다.
게다가, 상기 입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0. 45μm 의 멘브렌필터로 여과 해, 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석 장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르 화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 도 2에 나타내는 대로 상기 PHA는 3-히드록시-5-페닐발레르산유닛으로 이루어진 PHA 인 것이 확인되었다.
게다가, 상기 PHA의 분자량을 겔투과크로마트그래피(GPC: 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 연구실 PLgel MIXED-C (5μm), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn= 16, 000, Mw= 36, 000 이었다.
(실시예 5) 캡슐 구조체의 제작 5
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 10 질량부에 알루미나입자(입자직경 0.12μm ~ 135μm) 1 질량부, PBS 39 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕 해 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리 (10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐) 바레릴 CoA (ReformatskY 반응에 의해 얻을 수 있던 3-히드록시 페닐발레르산 에스테르를 가수분해 해 3-히드로시 5-(4-플루오르 페닐)발레르산을 얻은 후, (Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
상기 반응액 10μl을 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl를 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어, 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다.
게다가, 상기 입자의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0. 45μm 의 멘브렌필터로 여과 해, 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석 장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유닛의 메틸 에스테르 화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 도 3에 나타내는 대로 당해 PHA는 3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐)발레르산을 모노머 유닛으로 하는 PHA 인 것이 확인되었다.
(실시예 6) 캡슐 구조체의 제작 6
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 10 질량부에 침강법에 따라 입자직경을 갖춘 알루미나 입자(체적 평균 입자 지름 1. 45μm) 1질량부, PBS 39 질량부를 첨가해 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해서 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드로키시옥타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해 각각 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
반응 후, 상기 반응액 10μl을 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl를 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어, 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복 되고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 이 캅셀 구조체를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 건조 처리 후, 이 입자상체의 표면에 형성된 폴리머의 질량을, 비행 시간형 2차 이온 질량 분석 장치(TOF-SIMS I V, CAMECA)에 의해 측정했다. 얻을 수 있던 매스 스펙트럼으로부터, 캡슐 구조체 표면은 폴리 히드록시 옥타노에이트의 호모폴리머로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 또, 이온 스패터링에 의해 캡슐 구조체 표면을 조금씩 깎으면서 똑같이 TOF-SIMS 에 의해 매스 스펙트럼을 측정해 갔지만, 모두 폴리 히드록시 옥타노에이트의 호모폴리머로 구성되어 있었다. 이에 의해, 본 비교예의 캡슐 구조체는, 친수성의 무기 입자를 직접 소수성의 폴리 히드록시 옥타노에이트의 호모폴리머로 피복 한 캡슐 구조체인 것을 알 수 있었다.
여기서, 상기 PHA의 분자량을 겔투과크로마트그래피(GPC: 토소 HLC-8020, 컬럼; 폴리머 연구실 PLgel MIXED-C (5μm), 용매; 클로로포름, 컬럼 온도; 40℃, 폴리스티렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn= 23, 000 Mw= 42, 000 이었다.
(실시예 7) 캡슐 구조체의 제작 7
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 10 질량부에 침강법에 따라 입자직경을 갖춘 알루미나 입자(체적 평균 입자 지름 1. 45μm) 1질량부, PBS 39 질량부를 첨가해 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해서 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)하며, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시피메릴 CoA (J. Bacteriol., 182, 2753~2760(2000)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 첨가해 각각 30℃에서 10분간 완만하게 진탕 했다. 그 다음에, 30℃에서 완만하게 진탕하면서 이 반응액에 (R)-3-히드록시오크타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 포함한 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)을 마이크로 튜브펌프(토쿄리카기가이사제 MP-3N)를 이용해 1분간에 1질량부의 비율로 첨가했다. 게다가 1시간 30분 후, 생성한 입자상체를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 상청을 제거한 후, 이 입자상체에 (R)-3-히드록시오크타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 1질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 0.1 질량부를 포함한 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)을 25 질량부 첨가해, 30℃에서 20분간 완만하게 진탕 했다.
반응 후, 상기 반응액 10μl을 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A수용액 10μl를 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어, 형광 현미경(330~380㎚ 여기필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복되고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 이 캡슐 구조체를 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)에 의해 회수해, 건조 처리 후, 이 입자상체의 표면에 형성된 폴리머의 질량을, 비행 시간형 2차 이온 질량 분석 장치(TOF-SIMS I V, CAMECA제)에 의해 측정했다. 얻을 수 있던 매스 스펙트럼으로부터, 캡슐 구조체 표면은 폴리 히드록시 옥타노에이트의 호모폴리머로 구성되어 있는 것을 알 수 있었다. 또, 이온 스패터링에 의해 캡슐 구조체 표면을 조금씩 깎으면서 똑같이 TOF-SIMS 에 의해 매스 스펙트럼을 측정해 갔던바, 3-히드록시 옥탄산과 3-히드록시피메린산의 공중합체(몰비 21:1)가 나타나, 입상 체내부에 가는 것에 따라 상기 공중합체에 있어서의 3-히드록시 옥탄산의 조성 비율이 점차 감소하고, 반대로 3-히드록시피메린산의 조성 비율이 증가해 최종적으로 포리히드록시피메레이트의 호모폴리머로 변화하는 것이 확인 되었다. 이에 의해, 본 실시예의 캡슐 구조체는, 친수성의 입자상 베이스재를, 친수성 관능기를 가지는 포리히드록시피메레이트로 피복 해, 그 위를 친수성 관능기를 가지는 3-히드록시피메린산과 소수성 관능기를 가지는 3-히드록시 옥탄산의 공중합체에 의해, 표층에 이르는 것에 따라 3-히드록시 옥탄산의 조성 비율을 높이면서 피복 해, 한층 더 최표층을 폴리 히드록시 옥타노에이트의 호모 폴리머-로 피복 한 캡슐 구조체인 것을알 수 있었다.
여기서, 상기 PHA 의 평균 분자량을 겔투과 크로마트그라피(Gp C: 토소 HLC-8020, 컬럼: 폴리머 연구실 PLgel MIXED-C(5μm), 용매: 클로로포름, 컬럼 온도: 40℃, 폴리스테렌 환산)에 의해 평가한 결과, Mn=21, 000, Mw=40,000 이었다.
(실시예 8) 실시예 6 및 실시예 7의 평가
실시예 6, 실시예 7의 캡슐 구조체와, 비교예로서 침강법에 따라 입자직경을 갖춘 알루미나 입자(체적 평균 입자 지름 1.45μm) 각각 1질량부를 순수한 물 10 질량부에 첨가해, 그대로 정치 했을 경우와 소용돌이·믹서에 의해 5분간 격렬하게 교반했을 경우로, 캡슐 구조체의 체적 평균 입자 지름 및 30일간 실온으로 저장한 후의 체적 평균 입자 지름을 측정했다. 측정은 레이저 토플러 방식 입도 분포 측정기(UPA-150: 닛키소 사제)를 이용해 실시해, 교반을 실시하지 않고 정치 했을 경우의 결과를 표 3에, 교반했을 경우의 결과를 표 4에 나타냈다.
실시예6 실시예7 비교예
체적평균입자지름(저장전) 1.58 1.68 1.45
체적평균입자지름(저장후) 1.60 1.71 3.42
(㎛)
실시예6 실시예7 비교예
체적평균입자지름(저장전)체적평균입자지름(저장후 1.472.05 1.651.17 1.413.56
(㎛)
그 결과, 교반을 실시하지 않았던 경우, 실시예 6, 실시예 7의 캡슐 구조체의 체적 평균 입자 지름은, 저장 전후에서 거의 동등한 값을 나타내고, 저장 안정성이 뛰어난 것이 알게 되었다. 한편, 비교 예의 캡슐 구조체의 저장 후의 체적 평균 입자 지름은, 저장전과 비교해 증대했다.
또, 교반을 실시했을 경우는, 실시예 7의 캡슐 구조체의 체적 평균 입자 지름은, 저장 전후에서 거의 동등한 값을 나타냈지만, 실시예 6의 캡슐 구조체의 저장 후의 체적 평균 입자 지름은, 저장전과 비교해 약간 증대했다. 비교예는 교반을 실시하지 않았던 경우와 같은 결과를 나타냈다.
또, 실시예 6, 실시예 7의 교반을 실시했을 경우의 저장 후의 캡슐 구조체를 광학 현미경으로 관찰했던 바, 실시예 7에서는 각 캡슐 구조체가 양호하게 분산하고 있는 모습을 볼 수 있었지만, 실시예 6에서는 캡슐 구조체의 응집을 볼 수 있어, 한층 더 피복한 PHA 가 박리하고 있는 캡슐 구조체가 관찰되었다.
이상으로, 무기 베이스재를 무기 베이스와 친화성의 높은 친수성의 관능기를 가지는 PHA 로 피복 해, 게다가 친수성의 PHA 모노머 유닛과 소수성의 PHA 모노머 유닛의 공중합체에 의해. 표층에 이르는 것에 따라 소수성의 PHA 모노머 유닛의 조성 비율을 높이면서 피복 함으로써, 무기 베이스재를 보다 안정적으로 내포할 수 있는 소수성 PHA 캡슐을 제작할 수 있는 것을 알 수 있었다.
(실시예 9) 캡슐 구조체의 제작 8
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 10 질량부에 알루미나 입자(입자직경 0. 12μm ~ 135μm) 1 질량부, PBS 39 질량부를 첨가해 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해서 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해서 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R,S)-3-히드록시-5-페녹시바레릴 CoA (3-페녹시 프로 파놀과 브로모 아세트산에틸과의 Reformatsky 반응으로 얻을 수 있던 3-히드록시-5-페녹시발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록 -5-페녹시발레르산을 얻은 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제)0.8 질량부, (R, S)-3-히드록시-7, 8-에폭시옥타노일 CoA (Int. J. Biol, Macromol., 12, 85-91 (1990)에 기재의 방법으로 합성한 3-히드록시 7-옥텐산의 불포화 부분을 3-클로로 벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 0.2 질량부, 소 혈청알부민(SiGma 사제) 0. 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2 시간 완만하게 진탕해서 시료 1을 얻었다.
비교 대조로서 (R, S)-3-히드록시-7,8-에폭시옥타노일 CoA를 3-히드록시옥타노일 CoA로 변경하는 이외는, 상기와 같은 방법으로 시료 2를 얻었다.
상기의 시료 10μl를 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl을 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어, 형광 현미경(330-380㎚ 여기 필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 어느 시료에 있어어도, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복되고 있는 것을 알 수 있었다.
대조로서 0. 1M 인산 버퍼 (pH 7. 0) 49질량부에 알루미나 입자 1질량부를 첨가해, 30℃에서 2.5 시간 완만하게 진탕 한 후, 똑같이 Nile 블루 A 로 염색 해 형광 현미경 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면은 전혀 형광을 발하지 않았다.
또, 시료의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 이 추출액에 대해1H-NMR 분석을 실시했다(사용 기기: FT-NMR : B ruker DPX400, 측정 핵종 :1H , 사용 용매 : 중클로로포름(TMS 들이)). 여기로부터 계산한 각 곁사슬유닛의 유닛%를 표 5에 나타낸다.
캡슐 구조체의 외피 PHA 의 조성(1H-NMR, 유닛%)
모노머유닛 시료 1 시료 2
3-히드록시-5-페녹시발레르 83% 77%
3-히드록시-7, 8-에폭시 옥탄산 17% -
3-히드록시 옥탄산 - 23%
상기의 시료 1을 50 질량부 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분간)해서 캡슐 구조체를 회수해, 정제수 50 질량부에 현탁 하는 조작을 3회 반복 후, 상기 현탁액에 가교제로서 헥사메틸렌디아민 0.5 질량부를 용해시켰다. 용해를 확인 후, 동결건조에 의해 물을 제거했다(이것을 시료 3으로 한다). 또, 시료 3을 70℃에서 12시간 방응시켰다(이것을 시료 4로 한다).
상기 시료 3 및 시료 4를 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서외피를 이루는 PHA를 추출하고, 진공 건조에 의해 클로로포름을 제거하고, 시차주사 열량계(DSC; 파킨에르마 사제, PYris 1, 온도상승; 10℃/분) 장치로 측정을 실시했다. 그 결과, 시료 3에서는 90℃ 부근에 명확한 발열 피크가 보여져, 폴리머중의 에폭시기와 헥사 메틸렌디아민과의 반응이 일어나, 폴리머끼리의 가교가 진행되고 있는 것이 나타난다. 한편, 시료 4에서는 명확한 히트 플로우는 보지 못하고, 가교 반응이 거의 완료하고 있는 것이 나타난다.
또, 마찬가지의 샘플레 대해, 적외 흡수를 측정했다( FT-IR; 파킨에르마, 사제, 1720X). 그 결과, 시료 3으로 볼 수 있던 아민(3340 ㎝-1부근) 및 에폭시(822 ㎝-1부근)의 피크가 시료 4에서는 소실하고 있다.
이상의 결과에서, 곁사슬에 에폭시유닛을 가지는 PHA 와 헤사메틸렌디아민을 반응시킴으로써, 가교 폴리머를 얻을 수 있는 것이 분명해졌다.
한편, 비교 대조로서 시료 2에 대해 같은 평가를 실시했지만, 상기와 같은 폴리머끼리의 가교를 명확하게 가리키는 평가 결과는 얻을 수 없었다.
(실시예 10) 캡슐 구조체의 제작 9
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 10 질량부에 알루미나 입자(입경 0. 12μm ~ 135μm) 1 질량부, PBS 39 질량부를 첨가해 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해서 PHA 합성 효소를 알루미나 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해서 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 48 질량부에 현탁하고, (R,S)-3-히드록시-5-페녹시바레릴 CoA (3-페녹시 프로 파놀과 브로모 아세트산에틸과의 Reformatsky 반응으로 얻을 수 있던 3-히드록시-5-페녹시발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록 -5-페녹시발레르산을 얻은 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제)0.8 질량부, (R, S)-3-히드록시-7, 8-에폭시옥타노일 CoA (Int. J. Biol, Macromol., 12, 85-91 (1990)에 기재의 방법으로 합성한 3-히드록시 7-옥텐산의 불포화 부분을 3-클로로 벤조산으로 에폭시화한 후, Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에 기재의 방법으로 조제) 0.2 질량부, 소 혈청알부민(SiGma 사제) 0. 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2 시간 완만하게 진탕해서 시료 5을 얻었다.
상기의 시료 5의 10μl를 슬라이드 글래스상에 채취해, 1% Nile 블루 A 수용액 10μl을 첨가해, 슬라이드 글래스상에서 혼합한 후, 커버 글래스를 실어, 형광 현미경(330-380㎚ 여기 필터, 420㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 어느 시료에 대해도, 알루미나 입자 표면이 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 알루미나 입자는 PHA 에 의해 표면을 피복되고 있는 것을 알 수 있었다.
대조로서 0. 1M 인산 버퍼 (pH 7. 0) 49질량부에 알루미나 입자 1질량부를 첨가해, 30℃에서 2.5 시간 완만하게 진탕 한 후, 똑같이 Nile 블루 A 로 염색 해 형광 현미경 관찰을 실시했다. 그 결과, 알루미나 입자 표면은 전혀 형광을 발하지 않았다.
또, 시료 5의 일부를 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분간)에 의해 회수해, 진공 건조한 후, 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 외피를 이루는 PHA를 추출했다. 이 추출액에 대해1H-NMR 분석을 실시했다(사용 기기: FT-NMR : B ruker DPX400, 측정 핵종 :1H , 사용 용매 : 중클로로포름(TMS 들이)). 여기에서 계산한 각 곁사슬의 유닛%는, 3-히드록시-5-페녹시발레르산 83%, 3-히드록시-7,8-에폭시옥탄산 17% 였다.
상기의 시료 5를 50질량부 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분간)해서, 캡슐 구조체를 회수해, 정제수 50 질량부에 현탁하는 조작을 3회 반복 후, 동결 건조에 의해 물을 제거했다. 여기에, 말단 아미노 변성 폴리실록산(변성 실리코운 오일 TSF4700, GE 토시바 실리콘 (주) 제)을 10 질량부 첨가해, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 이것을 메타놀에 현탁하고, 원심분리(10,000×g, 4℃, 20분간)하는 조작을 반복함으로써 세정해 건조하는 것으로, 폴리실록산의 그라프트 사슬을 가지는 캡슐 구조체를 얻었다.
(실시예 11) 적층 구조체의 제작
세로 10㎜ × 옆 10㎜ × 두께 1㎜ 의 다공질 율 시트를 1% 글루타르 알데히드에 1시간 침지하고 순수한 물 세정 후, pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 에 30℃에서 30분간 침지 해, 해효소를 고정화 했다. 미 반응의 PHA 합성 효소를 PBS 로 세정해 제거해, 고정화 효소를 얻었다.
30mM (R)-3- 히드록시옥타노일 CoA Eur. J. Biochem. 250, 432-439(1997)에기재의 방법으로 조제) 0.1% 소 혈청알부민(Sigma 사제)를 함유하는 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)에 상기 고정화 효소를 침지 해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕했다. 반응 종료 후, 0. 1 M 인산 버퍼(DH 7. 0)으로 세정해, 미반응물등을 제거했다.
반응 후의 유리 시트를 1% Nile 블루 A 수용액으로 염색해, 형광 현미경(330~380㎚ 여기 필터, 420 ㎚ 롱 패스 흡수 필터, (주) 니콘제) 관찰을 실시했다. 그 결과, 유리 시트의 표면에 형광이 인정된 것으로부터, 상기 입자는 유리 시트로 이루어진 베이스재가 PHA 로 이루어진 막으로 피복 된 적층 구조체인 것을 알 수 있었다.
또, 상기 적층 구조체를 진공 건조한 후, 클로로포름에 침지 해, 60℃에서 20시간 교반해서 피복층을 이루는 PHA를 추출했다. 추출액을 구멍 지름 0.45μm 의 멘브렌필터로 여과 해. 로터리 증발기-로 감압 농축한 후, 상법에 따라 메타노리시스를 실시해, 가스 크로마토그래피-질량 분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석해, PHA 모노머 유닛의 메틸에스테르 화물의 분류를 실시했다. 그 결과, 도 4에 나타내는 대로, 해당 PHA 는 3-히드록시 옥탄산을 모노머 유닛으로 하는 PHA 인 것이 확인되었다.
(실시예 12) 캡슐 토너의 제조
우선, 코어로서 아래와 같은 방법으로 중합체 미립자를 제조했다. 이온 교환수 710 질량부에 0.1M Na3PO4 수용액 450 질량부를 투입해, 60℃ 에 가온한 후, TK 식 호모믹서(토쿠슈키가코 (주) 제)를 이용해, 12,000 rpm에서 교배 했다. 이것에, 1. OM CaCl2수용액 68 질량부를 서서히 첨가해, Ca3(PO4)2를 포함한 수계 매체를 얻었다. 다음에, 스티렌모노머 165 질량부, n-부틸아크릴레이트 35 질량부, 구리프탈로시아닌 안료 12 질량부, 불포화 폴리에스텔(푸마르산-프로필렌 옥사이드 변성 비스페놀 A) 10 질량부, 에스테르 왁스 60 질량부, 이것에 중합 개시제 2, 2'-아조비스(2, 4-디메틸바레로니트릴) 10질량부를 용해해, 중합성 단량체 조성물을 조제해, 이것을 60℃에서 가온 해, TK 식 호모 믹서 (토쿠슈키가코 (주) 제)을 이용해, 12,000 rpm 로 균일하게 용해, 분산했다. 상기 수계 매체중에 상기 중합성 단량체 조성물을 투입해, 60℃, N2분위기 아래에 있어서 TK 식 호모 믹서에서 10,000 rpm 로 10분간 교반하여 입자조성 했다. 그 후, 패들교반 날개로 교반하면서, 80℃ 에 온도 상승해, 10 시간 반응시켰다. 중합 반응 종료 후, 상기 중합체의 현탁액을 냉각해, 3.6 질량부의 Na2CO3을 첨가해 pH 11로 했다. 그 다음에, 스티렌모노머 82 질량부, n-부틸아크릴레이트 12 질량부, 불포화 폴리에스텔,(푸마르산-프로필렌 옥사이드 변성 비스페놀 A) 0.05 질량부로 이루어진 중합성 단량체계에 중합 개시제로서 과황산칼륨 0.3 질량부를 첨가 용해시킨 용액을 적하한 후, 80℃ 에 온도 상승 해 다시 6시간 중합 시켰다. 다음에, 이것을 상온까지 냉각하고, 염산을 더해 인산 칼슘 용해 제거시킨 후, 여과 건조의 공정을 거쳐 토너의 코어 성분 미립자를 얻었다.
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 100 질량부에 대해, 상기 미립자 10 질량부, PBS 390 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕해 PHA 합성 효소를 그 미립자 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)하고, 침전을 PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해서 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소 10 질량부를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)480 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐)바레릴 CoA (Refor matsky 반응에 의해 얻을 수 있었던 3-히드록시 페닐발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐)발레르산을 얻은 후, Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제) 10 질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕했다.
반응 종료 후, 10,000 × g 로 10분간 원심분리해, 침전을 0, 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 1000 질량부에 현탁하고, 다시 원심분리하는 조작을 3회 반복해, 침전을 회수했다. 여기서부터, 여과, 건조의 각 공정을 거쳐 캡슐 구조체를 얻었다. 얻을 수 있었던 캡슐 구조체 10 질량부에 대해서, 소수성 산화 티탄미세분말 0.12 질량부를 밖에 첨가하고, 캡슐 구조체 표면에 산화 티탄 미세분말을 가지는 캡슐 토너 A를 얻었다.
한편, 대상으로서, 상기 코어 성분 미립자 10 질량부에 대해서, 소수성 산화 티탄 미세분말 0.12 질량부를 밖에 첨가하고, 토너 표면에 산화 티탄 미세분말을 가지는 토너 B를 얻었다.
각각의 캡슐 토너 6 질량부에 대해서, 아크릴 수지로 피복 한 페라이트 캐리어 144 질량부를 혼합해 2성분 현상제로 했다.
상기의 현상제를 이용해, 시판하는 복사기 NP 6000 (캐논 (주) 제)에서 23℃, 60% RH 환경하, 화상을 복사해, 그 화상 내구성, 토너 비산, 바램등에 대해 평가했다. 그 결과, 표 6에 나타내는 대로, 캡슐 토너 A를 사용해 조제한 현상제에서는, 100,000 매의 내구에 대해도 화상 농도 저하, 토너 비산, 바램등의 화상 결함의 발생은 인정되지 않고 양호한 화질 내구성을 나타냈다. 또, 대전성에 대해 트리보 값을 측정했는데, 초기 -33mC/㎏, 내구 후 -31mC/㎏ 로 안정되어 있었다. 또, 정착에 관해서도 문제는 인정되지 않았다. 한편, 캡슐 토너 B를 사용해 조제한 현상제에서는, 200 매의 내구에 대해도 화상 농도 저하, 토너 비산, 바램등의 화상 결함의 발생이 인정되어, 오리지날 원고에 충실한 고정밀 화질은 얻을 수 없었더, 또, 트리보 값을 측정했는데, 초기 -24mC/㎏, 내구 후 -18mC/㎏ 로 불균일하고, 안정이 없는 대전성을 나타내고 있었다. 또, 정착성 시험에 있어서는, 내고온 오프셋(offset)성에 뒤떨어지는 것이었다.
제조성 화상농도 화질 대전성 정착성
캡슐토너A ○ ○ ○ ○ ○
캡슐토너B ○ △ △ ○ △
(실시예 13) 캡슐 토너의 제조
pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10u/ml) 100 질량부에 대해, 실시예 12와 마찬가지의 방법으로 제작한 토너의 코어 성분 미립자 10 질량부, PBS 390 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕 해 PHA 합성 효소를 그 미립자 표면에 흡착시켰다. 이것을 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)하고, 침전을PBS 용액에 현탁하고, 재차 원심분리(10,000×g, 4℃ 10분간)해서 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소 10 질량부를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)480 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐)바레릴 CoA (Refor matsky 반응에 의해 얻을 수 있었던 3-히드록시 페닐발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록시-5-(4-플루오르 페닐)발레르산을 얻은 후, Eur. J. Bio chem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제) 10 질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕했다. 반응 종료 후, 10,000 × g 로 10분간 원심분리해, 침전을 회수했다.
그 다음에, 이 침전을 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)480 질량부에 현탁하고, (R)-3-히드록시-5-페녹시바레릴 CoA (J. Org. Chem., 55, 1490-1, 492(1990)에 기재의 방법으로 합성한 3-페녹시 프로파널 및 브로모 아세트산에틸을 원료로 하고, 아연에 의한 Reformatsky 반응으로 얻을 수 있었던 3-히드록시 -5- 페녹시발레르산에스테르를 가수분해해 3-히드록시-5-페녹시발레르산을 얻은 후, Eur. J. Bio chem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제) 5 질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 1 질량부를 첨가해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕했다.
반응 종료 후, 10,000 × g 로 10분간 원심분리해, 침전을 0, 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 1000 질량부에 현탁하고, 다시 원심분리하는 조작을 3회 반복해, 침전을 회수했다. 여기서부터, 여과, 건조의 각 공정을 거쳐 캡슐 구조체를 얻었다.
이 캡슐 구조체의 표면에 형성된 폴리머의 질량을, 비행 시간형 2차 이온질량 분석 장치(TOF-SIMS I V, CAMECA 제)에 의해 측정했다. 얻을 수 있었던 매스 스펙트럼으로부터, 캡슐 구조체의 표면은 폴리 -3-히드록시-5-페녹시발레르산으로 구성되어 있는 것이 확인되었다. 또, 이온 스패터링에 의해 캡슐 구조체의 표면을 조금씩 깎으면서 똑같이 TOF-SIMS 에 의해 매스 스펙트럼을 측정해 갔던 바, 어떤 시점에 캡슐 구조체를 구성하는 폴리머가 폴리 -3-히드록시 5-(4-플루오르 페닐)발레르산에 치환되는 거서이 확인되었다. 이에 의해, 본 실시예의 캡슐 구조체는, 코어 미립자를 피복 한, 유리 전이 온도의 낮은 폴리-3-히드록시-5- (4-플루오르 페닐)발레르산 위를 , 유리 전이 온도의 비교적 높은 폴리-3-히드록시-5-페녹시발레르산이 피복 한, 소망하는 캡슐 구조체인 것을 알 수 있었다.
이 캡슐 구조체 10 질량부에 대해서, 소수성 산화 티탄 미세분말 0.12 질량부를 밖에 첨가하고, 캡슐 구조체 표면에 산화 티탄 미세분말을 가지는 캡슐 토너 C를 얻었다.
이 캡슐 토너 6질량부에 대해서, 아크릴 수지로 피복한 페라이트 캐리어 144 질량부를 혼합해 2성분 현상제로 했다.
상기의 현상제를 이용해, 실시예 7과 같게 해 시판하는 복사기 NP6000 (캐논 (주) 제)에서 23℃, 60%RH 환경하, 화상을 복사해, 그 화상 내구성, 토너비산, 바램등에 ??해 평가 했는데, 실시예 7의 캡슐 토너 A 와 마찬가지로 양호한 성능을 나타냈다.
또, 캡슐토너 A, 캡슐 토너 C의 저온 정착성의 평가를 실시하기 위해서NP6000 와 같은 정착기 구성을 가지는 외부 정착기에 의한 정착 시험을 실시 했다. 정착 시험의 방법으로서는, 폭 2㎝, 길이 10㎝의 단책을 만들어, 그 위에 미정착 화상을, 외부 정착기의 상부 롤러의 온도를 모니터 하면서 단책의 길이 방향을 따라 롤러를 통과시키는 것에 의해 정착시켜, 얻을 수 있었던 정착 화상에 대해, 단책의 후부에 오프셋(offset)를 볼 수 있는지 아닌지로 정착성을 판단했다. 그 결과, 캡슐 토너 A, 캡슐 토너 C 다같이 정착 개시 온도가 95℃ 로 낮고, 저온 정착성에 뛰어나는 것을 알 수 있었다.
또, 캡슐토너 A, 캡슐토너 C 의 내블로킹성의 평가를 실시하기 위해서 50~70℃ 까지 1℃ 걸려서 설정한 온도하에, 상기 캡슐 토너를 각각 3일간 방치한 후의 응집성을 관찰해, 각 캡슐 토너를 상기와 마찬가지로 현상화해 화상 평가를 실시했다. 그리고, 하이라이트 영역의 거칠음 상태의 변화하는 점을 내블로킹 온도로 했다. 그 결과, 캡슐토너 C의 내블로킹 온도는 61℃, 캡슐토너 A의 내블로킹 온도는 58℃ 이고, 캡슐토너 C는 내블로킹성에 있어서 뛰어난 것을 알 수 있었다.
이상으로부터, 유리 전이 온도의 낮은 PHA 에 의해 토너를 캡슐화하는 것으로 저온 정착성을 실현할 수가 있어, 한층 더 유리 전이 온도의 낮은 PHA로 피복된 캡슐을 유리 전이 온도의 높은 PHA로 피복함으로써, 저온 정착성과 내블로킹성을 동시에 실현될 수 있는 것을 알 수 있었다.
(실시예 14) 캡슐 토너의 제조
3리터의 4구 세파라브르후라스코에, 환류 냉각관, 온도계, 질소 도입관, 교반기를 장칙하고, 이 플라스크중에, 이온 교환수 1200부, 폴리비닐 알코올 15부,도데실 황산나트륨 0.1 부, 스틸렌 모노머 75부, 아크릴산 1 n-부틸 25부, 디 tert-부틸 살칠산 크롬 착염 5부, 동프탈로시아닌 5부, 2,2-아조비스(2,4-지메틸바레로니트릴) 6부로 이루어진 혼합물을 투입해, 고속교반장치 TK-호모 믹서로 10,000 rpm, 10분간 교반하고 입자 조성한 후, 회전수를 1,000 rpm 에 감속해, 질소 가스에 의한 바브 링을 충분히 실시했다. 다음에, 교반장치를 초승달 형상의 교반 날개로 변경해, 완만한 교반과 함께, 80℃ 에 가열한 오일배스 중에서 16시간 중합했다.
중합 반응 종료후, 반응 용기를 실온까지 냉각한 후, 분산액을 5회의 디캔테이션에 의해 세정해, 여과, 수세, 건조해서 청색의 분체인 코어 입자를 얻었다. 전기 코어 입자에 실시예 12와 같은 방법으로 pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소를 고정화해 고정화 효소를 얻었다.
상기 고정화 효소 10질량부를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)480 질량부에 현탁하고, (R, S) -3-히드록시-5-페녹시바레릴 CoA (3-페녹시 프로퍼널과 브로모아세트산에틸과의 Reformatsky 반응으로 얻을 수 있었던 3-히드록시-5-페녹시발레르산에스테르를 가수분해 해 3-히드록시-5-페녹시발레르산을 얻은 후 Eur. J. Bio chem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제) 8 질량부, (R, S)-3-히드록시-7, 8-에폭시옥타노일 CoA (Int J. Biol. Macromol., 12,85-91 (1990)에 기재의 방법으로 합성한 3-히드록시 -7-옥텐산의 불포화 부분을 3-클로로 벤조산으로 엑폭시화한 후 ,Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제) 2 질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사 제) 1질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕했다.
반응 종료후, 상기 반응액을 원심분리 (10,000×g, 4℃ 10분간)해서 캡슐 구조체를 회수해, 정제수 100 질량부에 현탁하는 조작을 3회 반복, 침전을 회수했다. 여기서부터, 여과, 건조의 각 공정을 거쳐 청색의 캡슐 구조체 D를 얻었다. 캡슐 수조체 D 10 질량부에 대해, 해체분쇄 처리한 BET 값 360m2/g 의 소수성 실리카 0.2 질량부를 헨셸 믹서로 혼합해, 밖에 첨가해서 토너 D로 했다.
또, 상기 캡슐 구조체 D 10 질량부를 정제수에 현탁하고, 가교제로서 헥사메치렌디아민 5 질량부를 용해시켰다. 용해를 확인 후, 동결건조에 의해 물을 제거하고, 70℃에서 12시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 10.000×g 로 10분간 원심 분리해, 침전을 0.1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 1000 질량부에 현탁하고 다시 원심분리하는 조작을 3회 반복해, 침전을 회수했다. 여기서부터, 여과, 건조의 각 공정을 거쳐 청색의 캡슐 구조체 E를 얻었다. 캡슐 구조체 E10 질량부에 대해, 해체분쇄 처리한 BET 값 360m2/g 의 소수성 실리카 0.2 질량부를 헨셸 믹서로 혼합해, 밖에 첨가해서 토너 E로 했다.
제작한 토너의 화상 평가를 실시하기 위해 상기에서 얻은 토너 6부에 대해서, 평균 입경이 35μm 의 ferrite cord 에 실리콘 수지를 코트 한 캐리어 94 부를 폴리병에 넣어 터블러 믹서에 의해 혼합교반 해 2 성분 현상제를 제작했다. 그리고, 이 현상제를 칼라 레이저 복사기 CLC-500 (캐논 (주)제) 개조기에 탑재해, 23℃ , 60%RH 환경하, 초기 및 1만매 복사 후의 화상에 대해 SEM 로 관찰해, 화질의평가 및 현상제의 열화 상태의 평가를 실시했다.
화질의 평가로서는, 1 화소내에서의 레이저의 펄스폭변조(PWM)에 의한 많은 값의 기록에 의해, 극소 스포트의 재현성을 현미경 관찰에 의해 평가했다. 또, 1만매 복사 후의 현상제를 주사 전자현미경으로 관찰했다.
또, 토너의 내블록킹성의 평가를 행하기 위해, 각종 온도 조건하에, 상기에서 얻은 토너를 3일간 방치한 후의 응집성을 관찰하고, 각 토너 조성물을 상기한 캐리어를 이용해 똑같이 현상화해서 화상 평가를 실시했다.
또, 정착성의 평가로서는, CLC-500 과 같은 정착기 구성을 가지는 외부 정착기에 의한 정착 시험을 실시했다. 정착 시험의 방법으로서는, 폭 2㎝, 길이 10㎝ 의 단책을 만들어, 그위의 미정착화상을, 외부 정착기의 상부 롤러의 온도를 모니터 하면서 단책의 길이 방향을 따라 롤러를 통과시키는 것에 의해 정착시켜, 얻을 수 있었던 정착 화상에 대해, 단책의 후부에 오프셋(offsit)를 볼 수 있는지 아닌지로 정착성을 판단했다.
또, 상기 캡슐 구조체 대신에, 상기 코어 입자를 캡슐화 하지 않고, 그대로 이용한 토너 F를 사용해, 상기와 같은 평가를 실시했다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
화질 내블로킹성 정확성
토너D ◎ ○ ◎
토너E ◎ ◎ ◎
토너D ○ ○ △
※ 비고 : 표중의 기호 ◎: 매우 양호, ○: 양호, △: 약간 불량, ×: 불량
(다만, 상기의 0, △, ×는 상기 실시예 12에 있어서의 0, △, × 와는 대응하지 않음.)
(실시예 15) 캡슐 토너의 제조 3
실시예 14와 같은 방법으로 코어 입자를 제조해, pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성효소를 고정화해 고정화 효소를 얻었다. 이 고정화 효소 10 질량부를 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)480 질량부에 현탁하고, (R, S)-3-히드록시-5-페녹시바레릴 CoA (실시예 14와 같은 방법으로 조제) 8 질량부, (R, S)-3-히드록시-7,8-에폭시 옥타노일 CoA (실시예 14와 같은 방법으로 조제) 2 질량부, 소 혈청알부민(Sigma 사제) 1질량부를 첨가해, 30℃에서 2시간 완만하게 진탕 했다.
반응 종료 후, 상기 반응액을 원심분리(10.000×g 로 10분간)하고, 캡슐구조체를 회수해, 정제수 100질량부에 현탁하는 조작을 3회 반복, 침전을 회수했다. 여기서부터, 여과, 건조의 각 공정을 거쳐 청색의 캡슐 구조체 G를 얻었다. 캡슐 구조체 G 10 질량부에 대해, 해체분쇄 처리한 BET 값 360m2/g 의 소수성 실리카 0.2 질량부를 헨셸믹서로 혼합해, 밖에 첨가해서 토너 G로 했다.
또, 캡슐 구조체 G 10 질량부에 말단 아미노 변성 폴리실록산(변성 실리콘 오일 TSF 4700, GE 토시바 실리콘 (주) 제) 100 질량부를 첨가해, 70℃에서 2시간 반응시켰다. 이것을 메타놀에 현탁하고, 원심분리(10.000×g 로 4℃,20분간)하는 조작을 반복함으로써 세정해 건조하는 것으로, 폴리실록산의 그라프트 사슬을 가지는 청색의 캡슐 구조체 H를 얻었다. 캡슐 구조체 H10 질량부에 대해, 해체분쇄처리한 BET 값 360m2/g 의 소수성 실리카 0.2 질량부를 헨셸 믹서로 혼합해, 밖에 첨가해서 토너 H로 했다.
상기 토너는, 실시예 14와 같은 방법으로 화질의 평가 및 현상제의 열화 상태의 평가를 실시했다.
또, 상기 캡슐 구조체 대신에, 상기 코어 입자를 캡슐화 하지 않고 그대로 이용한 토너 1를 사용해, 상기와 같은 평가를 실시했다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
화질 내블로킹성 정확성
토너G ◎ ○ ◎
토너H ◎ ◎ ◎
토너I ○ ○ △
※ 비고 : 표중의 기호 ◎: 매우 양호, ○: 양호, △: 약간 불량, ×: 불량
(다만, 상기의 0, △, ×는 상기 실시예 12에 있어서의 0, △, × 와는 대응하지 않음.)
(실시예 16) 기록 매체의 제작
PET 필름 (100Q80D, 토오레 (주) 제)를 1% 그루탈 알데히드 용액에 1시간 침지 해, 순수한 물 세정 후, pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10U/ml)에 30℃에서 30분간 침지 해, 상기 효소를 고정화 했다. 미반응의 PHA 합성 효소를 PBS로 세정해서 제거하고, 고정화 효소를 얻었다.
30mM (R) -3-히드록시피메릴 CoA (J. Bacteriol., 1982, 2753-2760 (2000) 에 기재의 방법으로 조제), 0. 1 % 소 혈청알부민(Sigma 사제)을 함유한 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 에 상기 PET 필름을 침지 해, 30℃에서 30분간 완만하게 진탕 했다. 반응 종료 후, 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0)로 세정해서, 미반응물등을 제거해 통풍 건조함에 따라서, 이온성 폴리머인 폴리-(R)-3-히드록시피메린산을 잉크 수용층으로 하는, 소망한 기록 매체를 얻었다. 비교 대조로서 pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소만을 함유하지 않는 계에서 같은 처리를 가한 PET 필름을 제작했다.
이러한 기록 매체에 대해, 잉크젯 프린터(BJC-4301, 캐논(주) 제)를 이용한 블랙 및 칼라의 화상을 인자해, 각각 잉크의 번짐,비딩의 유무를 확인했다. 그 결과, 비교 대조에 대해, 번짐이나 비딩이 지극히 많이 인정된 것에 대해, 본 발명의 기록 매체에는 번짐이나 비딩이 거의 인정되지 않고, 뛰어난 화상을 얻을 수 있었다.
(실시예 17) 기록 매체의 제작
실시예 16과 같게 PET 필름(100Q80D, 토오레 (주) 제)를 1% 그루탈 알데히드 용액에 1시간 침지 해, 순수한 물 세정 후, pYN2-C1 재조합주 유래의 PHA 합성 효소 용액(10U/ml) 에 30℃에서 30분간 침지 해, 상기 효소를 고정화 했다. 미반응의 PHA 합성 효소를 PBS 로 세정해 제거하고, 고정화 효소를 얻었다.
이 효소를 고정화한 PET 필름을 30mM (R)-3- 히드록시옥타노일 CoA (Eur. J. Biochem., 250, 432-439 (1997)에 기재의 방법으로 조제), 0.1% 소 혈청알부민(Sigma 사제)을 함유한 0. 1 M 인산 버퍼(pH 7. 0) 100 질량부에 침지 했다. 그 다음에, 30℃에서 완만하게 진탕 하면서 이 반응액에 30mM (R)-3-히드록시피메릴 CoA (J. Bacteriol, 182, 2753-2760(2000)에 기재된 방법으로 조제), 0.1% 소혈청알부민(Sigma 사 제품)을 함유한 0.1 M 인산버퍼(pH 7.0)를 마이크로튜브펌프(토쿄리카기카이사 제품 MP-3N)를 사용해서 1분간에 25질량부의 비율로 첨가했다.
30분간 진탕 후, 0.1M 인산버퍼(pH 7.0)로 세정하고, 미반응물등을 제거해서 풍건(風乾)함으로써, 기록매체를 제작하였다.
이 기록매체의 표면에 형성된 폴리머의 질량을, 비행시간형 2차 이온질량분석장치(TOF-SIMS IV, CAMECA 제품)에 의해 측정하였다. 얻어진 마스크 벡터로부터, 기록매체 표면은 3-히드록시피멜산과 3-히드록시옥탄산의 공중합체(몰비 17:1)로 구성되어 있는 것을 알게 되었다. 또, 이온 스퍼터링에 의해 유리시트 표면을 조금씩 깎아 내면서 마찬가지로 TOFR-SIMS 에 의해 마스크벡터를 측정해 갔던 바, 상기 공중합체에 있어서의 3-히드록시피멜산의 조성 비율이 차츰차츰 감소하고, 3-히드록시옥탄산의 조성비율이 증가하였다. 이로부터, 본 실시예의 기록매체는, 표면을 친수성 관능기를 가진 폴리히드록시피멜레이트로 피복하고, 그 아래를 친수성관능기를 가진 3-히드록시피멜산과 소수성 관능기를 가진 3-히드록시옥탄산의 공중합체에 의해서, 하층으로 도달함에 따라서 3-히드록시옥탄산의 조성비율을 높이면서 피복한 층을 잉크 수용층으로 하는, 소망의 기록매체인 것을 알게 되었다.
이 기록매체에 대해서, 실시예 16과 마찬가지로 잉크젯 프린터(BJC-4301, 캐논(주) 제품)를 사용해서, 블랙 및 컬러의 화상을 인자하고, 각각 잉크의 번짐, 비딩의 유무를 확인하여, 실시예 16에서 제작한 기록매체와 비교하였다. 그 결과,본 실시예의 기록매체는, 실시예 16의 기록 매체와 비교해서, 잉크수용층 내부에 있어서 더욱 번짐이 적고, 보다 선명한 화상을 얻을 수 있는 것을 알게 되었다. 이것은, 본 실시예의 기록 매체에서는, 하층에 도달함에 따라서 PHA 피막이 소수적으로 되기 때문에, 표면에서 흡수된 잉크의 잉크 수용층 내부에의 확산이 서서히 억제되기 때문이라고 생각된다.
본 발명의 구조체는, 입자형상의 구조체이면, 예를 들면 전자사진용 토너 등에 사용하면 번짐이 적고 정착성이 양호한 고품질의 화상을 얻을 수 있다. 한편, 평판 또는 필름형상의 구조체를 기록매체로서 사용하면 번짐이 없는 양호한 화상을 얻을 수 있다.

Claims (46)

  1. 기재와 폴리히드록시알카노에이트를 가진 구조체에 있어서, 상기 기재의 적어도 일부는 상기 폴리히드록시알카노에이트로 피복되고, 상기 폴리히드록시알카노에이트는 3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛, 및 3-히드록시-n-길초산유닛을 제외한 3-히드록시알칸산유닛을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트가 하기 화학식[1] 내지 화학식[10]에 표시하는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는 폴리히드록시알카노에이트인 구조체.
    (단, 이 모노머유닛은 식중 R1 및 a의 조합이 하기의 어느 하나인 모노머 유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
    R1이 수소원자 (H)이며, a가 3 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머 유닛;
    R1이 할로겐원자이며, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
    R1이 발색단이며, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
    R1이 카르복시기 또는 그 염이고, a가 1 내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머 유닛;
    R1이
    이며, a가 1 내지 7의 정수의 어느 하나인 모노머유닛.)
    (단, 식중 b는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, NO2, -CF3-C2F5,-C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 C는 1 내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 d는 0내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R4는 수소 원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 e는 1내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7, -CH3, -C2H5, -C3H7로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 f는 0 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 g는 1 내지 8의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 h는 1 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R6은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR’, -SO2R”, -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
    여기서 R’는 수소원자(H), Na, K, -CH3,-C2H5의 어느 하나이며, R”는 -OH,-ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
    (단, 식중 i는 1 내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR’, -SO2R”로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
    여기서 R’는 수소원자(H), Na, K, -CH3, -C2H5의 어느 하나이고, R”는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
    (단, 식중 j는 1 내지 9의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
  3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부가 화학수식된 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 구조체.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 화학수식이 그라프트쇄인 것을 특징으로 하는 구조체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 그라프트쇄가 폴리히드록시알카노에이트의 에폭시기를 가진 모노머유닛을 적어도 포함하는 폴리히드록시알카노에이트의 화학수식에 의한 그라프트쇄인 것을 특징으로 하는 구조체,
  6. 제 4항에 있어서, 상기 그라프트쇄가 아미노기를 가진 화합물의 그라프트쇄인 것을 특징으로 하는 구조체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 아미노기를 가진 화합물이 말단 아미노 변성 화합물인 것을 특징으로 하는 구조체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 말단 아미노변성 화합물이 폴리비닐아민, 폴리에틸렌이민, 및 말단아미노 변성폴리실록산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구조체.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부가 가교화된 폴리히드록시알카노에이트인 것을 특징으로 하는 구조체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트가 에폭시기를 가진 모노머 유닛 사이에 가교화되어 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 기재가 입상체인 것을 특징으로 하는 구조체.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 기재가 착색제를 함유하고 있는 특징으로 하는 구조체.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 착색제가 안료를 함유하고 있는 특징으로 하는 구조체.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 착색제가 염료를 함유하고 있는 특징으로 하는 구조체.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 기재는 안료인 것을 특징으로 하는 구조체.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 기재는 평판형상 또는 필름형상인 것을 특징으로 하는 구조체.
  17. 제 11항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 모노머유닛 조성이 상기 구조체의 안쪽으로부터 바깥쪽을 향하는 방향으로 변화하고 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 모노머유닛 구성이 상기 구조체의 표면에 대해서 수직방향으로 변화하고 있는 특징으로 하는 구조체.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 분자량이 1,000 내지 10,000,000인 것을 특징으로 하는 구조체.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트의 분자량이 3,000 내지 1,000,000 인 것을 특징으로 하는 구조체.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 기재에 폴리히드록시알카노에이트합성효소가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 구조체.
  22. 중쇄장 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 기재에 고정하는 공정;
    이 효소에 의해 3-히드록시아실보효소A를 중합시켜서 폴리히드록시알카노에이트를 합성함으로써 상기 기재의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 공정;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트가 화학식[1] 내지 화학식[10]에 표시하는 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는 폴리히드록시알카노에이트이며, 상기 유닛의 각각에 대해서 대응하는 3히드록시아실 보효소A가 순서대로 화학식[11] 내지 화학식[20]에 표시하는 3-히드록시아실보효소 A인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
    (단, 이 모노머유닛은, 식중 R1 및 a의 조합이 하기의 어느 하나인 모노머유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
    R1이 수소원자(H)이며, a가 3내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
    R1이 할로겐 원자이고, a가 1내지 10의 정수의 어느 하나인 모노머유닛;
    R1이 발색단이고, a가 1내지 10의 정수의 어느 하나의 모노머유닛;
    R1이 카르복시기 또는 그 염이고, a가 1내지 10의 정수의 하나인 모노머유닛;
    R1이
    이며, a가 1내지 7의 정수의 어느 하나인 모노머유닛.)
    (단, 식중 b는 0내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R2는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2H5, -C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 C는 1내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R3는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 d는 0내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R4는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5, -C3F7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 e는 1내지 8의 정수의 어느 하나를 표시하고, R5는 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -CF3, -C2F5,-C3F7, -CH3, -C2H5, -C3H7으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시한다.
    (단, 식중 f는 0내지 7의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 g는 1내지 8의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 식중 h는 1내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R6은 수소원자(H),할로겐원자 , -CN, -NO2, -COOR’, -SO2R”, -CH3, -C2H5, -C3H7, -CH(CH3)2, -C(CH3)3로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
    여기서 R’는 수소원자(H), Na, K, -CH3, -C2H5의 어느 하나이며, R”는 -OH, -ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
    (단, 식중 i는 1내지 7의 정수의 어느 하나를 표시하고, R7은 수소원자(H), 할로겐원자, -CN, -NO2, -COOR’, -SO2R”로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 표시하고,
    여기서 R’는 수소원자(H), Na, K, -CH3, -C2H5의 어느 하나이며, R”는 -OH,-ONa, -OK, 할로겐원자, -OCH3, -OC2H5의 어느 하나이다.)
    (단, 식중 j는 1내지 9의 정수의 어느 하나를 표시한다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R1 및 a는 화학식[1]과 같다.)
    (단, 식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R2 및 b는 화학식[2]와 같다.)
    (단, 상기 식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R3 및 c는 화학식[3]에서 정의하는 것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R4 및 d는 화학식[4]로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R5 및 e는 화학식[5]로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, f는 화학식[6]으로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, g는 화학식[7]로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R6 및 h는 화학식[8]로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, R7 및 i는 화학식[9]로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
    (단, 상기 화학식 중 -SCoA는 알칸산에 결합된 보효소 A를 표시하고, j는 화학식[10]으로 표시되는 모노머유닛에서의 그것과 같다.)
  24. 제 22항에 있어서, 상기 기재를 피복하는 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부에 화학수식을 실시하는 공정을 더 가진 것을 특징으로 하는 구조체의제조방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 화학수식을 실시하는 공정이 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부에 그라프트쇄를 부가하는 공정인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 그라프트쇄를 부가하는 공정이 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부와, 말단에 반응성관능기를 가진 화합물을 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 화학수식을 실시하는 공정이 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부를 가교화하는 공정인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 가교화공정이 상기 폴리히드록시알카노에이트의 적어도 일부와 가교제를 반응시키는 공정인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 가교제가 디아민화합물, 무수호박산, 2-메틸-4-메틸이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 디아민화합물이 헥사메틸렌디아민인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 가교화공정이 상기 폴리히드록시알카노에이트에 전자선을 조사하는 공정인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  32. 제 22항에 있어서, 상기 3-히드록시아실보효소A의조성을 경시적으로 변화시킴으로써 상기 폴리히드록시알카노에이트의 모노머유닛조성을 상기 구조체의 안쪽으로부터 바깥쪽을 향하는 방향으로 변화시키는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  33. 제 22항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 이 효소의 생산능을 가진 미생물을 사용해서 생산하는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  34. 제 22항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 이 효소의 생산능에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환체에 의해 생산하는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 유전자는 폴리히드록시알카노에이트합성효소의 생산능을 가진 미생물로부터 얻어진 유전자인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  36. 제 33항에 있어서, 상기 미생물이 슈도모나스 속(Pseudomonas Sp.)인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 슈도모나스 속(Pseudomonas Sp.)에 속하는 미생물이 슈도모나스 푸티다 P91주(Pseudomonas putida P91, FERM BP-7373), 슈도모나스 치코리아이 H45주(Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374), 슈도모나스 치코리아이 YN2주(Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375),슈도모나스 젯세니 P161주(Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  38. 제 33항에 있어서, 상기 미생물은 버크홀데리아 속 (Burkholdreia sp.)에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 버크홀데리아 속의 미생물이 버크홀데리아 속 OK3주(Burkholdreia sp. OK3, FERM P-17370), 버크홀데리아 속 OK4주(Burkholdreia sp. OK4, FERM P-17371)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  40. 제 34항에 있어서, 상기 폴리히드록시알카노에이트합성효소의 생산능을 가지는 형질전환체의 숙주미생물이 대장균(Escheichia coli)인 것을 특징으로 하는 구조체의 제조방법.
  41. 안료를 함유하는 기재; 및
    3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛, 3-히드록시-n-길초산유닛을 제외한 3-히드록시알칸산을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 가지고,
    상기 기재는 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 토너.
  42. 안료를 함유하는 기재; 및
    3-히드록시프로피온산유닛, 3-히드록시-n-낙산유닛, 3-히드록시-n-길초산유닛을 제외한 3-히드록시알칸산을 함유하는 폴리히드록시알카노에이트를 가지고,
    상기 기재는 적어도 일부가 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 기록매체.
  43. 입상체 기재를 준비하는 공정;
    입상체 구조체를 얻기 위하여 상기 기재의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 공정; 및
    상기 입상구조체를 사용해서 토너를 제조하는 공정;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 토너의 제조방법.
  44. 평판형상체 또는 필름형상체인 기재를 준비하는 공정; 및
    평판구조체를 제조하기 위하여 상기 기재의 적어도 일부를 폴리히드록시알카노에이트로 피복하는 공정;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 기록매체의 제조방법.
  45. 제 41항에 의한 토너를 기록매체에 도포하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 화상형성방법.
  46. 제 41항에 의한 토너를 기록매체에 도포해서 화상을 형성하는 수단을 포함하는 화상형성장치.
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