KR20020065510A - ＫｉＳＳ-1 펩티드의 제조 방법 - Google Patents

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KR20020065510A
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마사또 스에나가
다까오 야마다
오사무 니시무라
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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 펩티드를 시스테인 잔기의 아미노산측 펩티드 결합의 절단반응에 제공함으로써, KiSS-1 펩티드 또는 그 염을 공업적으로 대량 제조할 수 있다.

Description

ＫｉＳＳ-1 펩티드의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING KiSS-1 PEPTIDE}
유전자 재조합 기술을 이용해서 펩티드를 제조할 때에는 펩티드가 세포내에서 분해되기 쉽기 때문에, 융합단백질의 형태로 발현시키는 것이 종종 행해지고 있다. 융합단백질로부터의 목적 펩티드의 제거에는 브롬시안을 사용해서 화학적으로 절단하는 방법 (이타쿠라 등, Science,198, 1056 (1977)), 팩터 Xa 를 사용해서 효소적으로 절단하는 방법 (나가이 등, Methods in Enzymology,153, 46(1987)) 이 알려져 있다.
그리고, 단백질 중의 펩티드 결합을 절단하는 방법으로서, 2-니트로-5-티오시아노벤조산에 의한 아실시스테인 결합의 절단이 알려져 있다 (「생화학 실험강좌」1, 단백질 화학 Ⅱ, 일본생화학회편, 동경화학동인 발행, 247 ∼ 250 페이지 1976 년). 그러나, 단백질로부터의 목적 펩티드의 제거에 대해서는 개시되어 있지 않다.
종래 알려져 있는 기술에 있어서, 융합단백질로부터의 목적 펩티드의 제거시에 브롬시안을 사용하는 경우에는, 메티오닌을 함유하는 펩티드의 제조에는 적용할 수 없어 제거시의 수율 등에 문제가 많다.
이와 같이 융합단백질 또는 폴리펩티드로부터 목적으로 하는 펩티드를 효율적으로 제거하는 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 융합단백질 또는 폴리펩티드를 제조하고, 이어서 이 융합단백질 또는 폴리펩티드를 펩티드 결합의 절단반응에 제공함으로써, KiSS-1 펩티드 또는 그 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명의 개시
본 발명자들은 신규 생리활성 펩티드인 KiSS-1 펩티드 또는 그 염을 효율적으로 제조하는 방법에 대해 예의 검토를 거듭한 결과, N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에 KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 폴리펩티드를 제조하고, 이어서 이것을 펩티드 결합을 절단하는 반응에 제공함으로써, KiSS-1 펩티드 또는 그 염을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하였다.
즉, 본 발명은
(1) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 상기 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공하는 것을 특징으로 하는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염의 제조 방법,
(2) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 갖는 벡터를 보유하는 형질전환체를 배양하여 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 발현시키고, 발현된 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 상기 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공하는 것을 특징으로 하는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염의 제조 방법,
(3) KiSS-1 펩티드의 C 말단이 아미드인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(4) 절단반응이 S-시아노화 반응, 이어서 가암모니아분해 또는 가수분해 반응을 실시하는 반응인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(5) KiSS-1 펩티드가 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(6) KiSS-1 펩티드가, ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 40 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 45 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 46 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 ④ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(7) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가, N 말단에 시스테인을 갖는 인터페론류, 인터루킨류, 섬유아세포 성장인자, (프로)유로키나아제류, 림포톡신, Tumor Necrosis Factor (TNF), β-갈락토시다아제, 저장 단백질류, 스트렙토아비신, 프로테인 A, 프로테인 G, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 또는 그 뮤테인 또는 단편인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(8) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가, 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질 또는 펩티드인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(9) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하며 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질이고, KiSS-1 펩티드가 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고, 제조되는 KiSS-1 펩티드가 C 말단이 아미드인 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 제 (1) 항 또는 제 (2) 항에 기재된 제조 방법,
(10) N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에 KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질, 펩티드 또는 그 염,
(11) 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질의 N 말단에, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 KiSS-1 펩티드를 연결한 제 (10) 항에 기재된 융합단백질, 펩티드 또는 그 염,
(12) 제 (10) 항에 기재된 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 DNA,
(13) ① 서열번호 : 4 로 표시되는 염기 서열 또는 ② 서열번호 : 5 로 표시되는 염기 서열을 갖는 제 (12) 항에 기재된 DNA,
(14) 제 (12) 항에 기재된 DNA 를 갖는 벡터,
(15) 제 (14) 항에 기재된 벡터를 함유하는 형질전환체 및
(16) FERM BP-6907 로 표시되는 대장균 MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1 을 제공한다.
그리고 본 발명은
(17) 다음 ① ∼ ④ 의 공정 ;
① N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단 시스테인에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 제작한다,
② 상기 DNA 를 갖는 벡터를 제작한다,
③ 상기 벡터를 보유하는 형질전환체를 배양하여 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 발현시킨다,
④ 발현된 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 상기 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공한다,
로 이루어진 제 (2) 항에 기재된 제조 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 본 발명의 반응공정에 있어서의 반응 메커니즘을 나타낸다.
도 2 는 실시예 1 에서 사용된 DNA 프래그먼트를 나타낸다.
도 3 은 실시예 1 에서 얻어진 2 중 사슬 구성의 인간 KiSS-1 펩티드를 제조하는 모식도를 나타낸다.
도 4 는 실시예 2 에서 얻어진 플라스미드 pTFC-KiSS-1 의 구축도를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 방법에 사용되는 KiSS-1 펩티드로서는, 예컨대 WO 00/24890 (국제특허출원 PCT/JP99/05905호) 에 기재된 인간 KiSS-1 펩티드가 사용되고, 구체적으로는 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 내지 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 등을 들 수 있다.
「본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 내지 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드」로서는, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 또한 8 내지 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이면 어떠한 것이어도 되는데, 펩티드 활성 (예컨대, 펩티드와 수용체의 결합활성, 펩티드에 의해 야기되는 수용체 발현 세포의 세포자극활성 등) 등이 실질적으로 동일한 것을 의미한다. 구체적으로는 ① 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ② 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 C 말단에 갖고, 8 내지 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 등이 사용된다.
보다 구체적으로는, KiSS-1 펩티드로서, ① 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ② 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 40 ∼ 54 번째 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ③ 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 45 ∼ 54 번째 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ④ 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 46 ∼ 54 번째 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ⑤ 본원의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 등을 들 수 있다.
상기 KiSS-1 펩티드는 WO 00/24890 (국제특허출원 PCT/JP99/05905호) 에 기재된 리셉터 단백질 OT7T175 에 대해 리간드 활성을 갖는다.
본 명세서에 있어서의 펩티드는 펩티드 표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노 말단), 우단이 C 말단 (카르복실 말단) 이다. 서열번호 : 1 로 표시되는 펩티드의 C 말단은 아미드(-CONH2), 카르복실기(-COOH), 카르복실레이트(-COO-), 알킬아미드(-CONHR) 또는 에스테르(-COOR) 여도 된다. 에스테르 또는 알킬아미드의 R 로서는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C1-6알킬기, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3-8시클로알킬기, 페닐, α-나프틸 등의 C6-12아릴기, 벤질, 페네틸, 벤즈히드릴 등의 페닐-C1-2알킬, 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1-2알킬 등의 C7-14아르알킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다.
본 발명의 KiSS-1 펩티드의 염으로서는, 생리학적으로 허용되는 염기 (예컨대 알칼리금속 등) 나 산 (유기산, 무기산) 과의 염이 사용되는데, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로서는, 예컨대 무기산 (예컨대 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.
본 발명의 방법에 사용되는 N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드는 특정되는 것은 아니다. 그 N 말단에 시스테인을 갖지 않는 단백질 또는 펩티드의 경우에는, 자체 공지의 방법에 의해 N 말단에 시스테인을 갖도록 하면 된다.
상기 N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드로서는, 분자량이 100 ∼ 100000 인 것이 바람직하고, 분자량이 300 ∼ 50000 인 것이 더욱 바람직하다. 또한, N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드로서는, 1 ∼ 1000 개의 아미노산을 갖는 것이 바람직하고, 3 ∼ 500 개의 아미노산을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
상기 단백질 또는 펩티드로서는, 예컨대 인터페론류, 인터루킨류, 섬유아세포 성장인자 (aFGF, bFGF 등) 등 각종 성장인자류, (프로)유로키나아제류, 림포톡신, 종양괴사인자 (TNF), β-갈락토시다아제 등의 효소 단백질류, 저장 단백질류, 스트렙토아비신, 프로테인 A, 프로테인 G, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 이들의 뮤테인 또는 이들의 일부 (단편) 등의 N 말단에 시스테인을 갖는 것을 들 수 있다. 그 중에서도 섬유아세포 성장인자 (aFGF, bFGF 등) 또는 그 뮤테인 또는 이들의 일부 (단편) (예컨대, bFGF CS23 뮤테인 등) 등이 바람직하게 사용된다.
bFGF CS23 뮤테인으로서는 예컨대
으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 융합단백질 (융합 펩티드를 포함함) 을 코딩하는 DNA 는, (1) 전체 염기 서열을 화학적으로 합성해도 되고, (2) 단백질을 코딩하는 염기 서열의 N 말단측에 시스테인을 코딩하는 염기 서열을 배치하고, 추가로 그 N 말단측에 KiSS-1 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 배치함으로써 상기 DNA 를 구축해도 된다. 또한, (3) 상기 펩티드의 프래그먼트를 얻는 것이 목적인 경우에는, 원하는 프래그먼트 직후의 아미노산 잔기를 특정부위 지향성 변이유발기술 (site-directed mutagenesis) 등의 수법으로 시스테인으로 치환한 상기 DNA 를 구축하면 된다.
상기 (1) 의 경우의 제조 방법으로서는, 예컨대 자체 공지의 포스포아미다이드법, 인산트리에스테르법, 디에스테르법, 하이드로겐 포스포네이트법 등을 이용해서 짧은 것이면 한번에 긴 것이면 분할해서 합성한 후에 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결해서 작성할 수 있다.
상기 (2) 의 경우의 제조 방법으로서는, 예컨대 C 말단측의 단백질을 코딩하는 DNA 는, 염색체 또는 cDNA 에서 적당한 제한효소로 절단하고 벡터에 연결해서 얻거나 또는 cDNA 를 취득한다. 그 후에 N 말단이 시스테인이 되도록 제한효소로 절단하거나 또는 합성 DNA 를 전체 단백질 또는 그 일부의 DNA 의 5'-말단에 결합하여 N 말단이 시스테인이 되도록 개변한다. 그 5'-말단에 목적 단백질을 코딩하는 DNA (화학합성한 것이나 생체에서 클로닝해 온 것이어도 됨) 를 연결한다.
이와 같이 하여 얻어진 융합단백질을 코딩하는 DNA 의 구체예로서는, 예컨대 식
또는
TGT-R [식중, R 은
(bFGFCS23 뮤테인의 단편) 로 이루어진 염기 서열을 나타냄] 로 표시되는 DNA 등을 들 수 있다.
상기 화학식 Ⅰ 은 인간 (human) KiSS-1 펩티드를 함유하는 펩티드를 코딩하는 DNA 염기 서열 (서열번호 : 2) 에, 시스테인을 코딩하는 염기 서열을 통해 R 로 표시되는 염기 서열이 결합하고 있음을 나타낸다.
KiSS-1 펩티드를 코딩하는 DNA 는, 상기 화학식 Ⅰ 로 표시되는 DNA 나 서열번호 : 15 로 표시되는 KiSS-1 펩티드 성숙체를 코딩하는 DNA 또는 그 개변 DNA (예컨대, J. Natl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996 ; WO 98/39448) 를 사용해서 자체 공지의 방법에 따라 제조할 수도 있다.
5' 말단에 ATG 를 갖고, 그 하류에 상기 융합단백질을 코딩하는 영역, 이어서 번역 정지 코돈을 갖는 DNA (플라스미드) 는, 화학합성으로 또는 유전자공학적으로 제조된 공지의 상기 단백질의 cDNA 또는 염색체 유래의 상기 단백질의 DNA 를 가공함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에 KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를, 종래의 DNA 기술, 예컨대 특정부위 지향성 변이유발기술을 이용해서 목적 뮤테인을 코딩하는 DNA 로 변환할 수 있다.
특정부위 지향성 변이유발기술은 주지되어 있고, [Lather, R. F. 및 Lecoq, J. P., Genetic Engineering, 아카데믹프레스사 (1983 년) 31-50 페이지] 에 나타나 있다. 올리고뉴클레오티드에 지시된 변이유발은 [Smith, M. 및 Gillam, S.,Genetic Engineering : 원리와 방법, 프레남프레스사 (1981 년) 3 권 1-32 페이지] 에 나타나 있다.
상기 융합단백질을 코딩하는 영역을 갖는 DNA 를 갖는 플라스미드를 제조할 때에, 벡터로 사용되는 플라스미드로서는 예컨대 대장균 (Escherichia coli) 유래의 pBR322 [Gene,2, 95 (1977)], pBR313 [Gene,2, 75 (1977)], pBR324, pBR325 [Gene,4, 124 (1978)], pBR327, pBR328 [Gene,9, 287 (1980)], pBR329 [Gene,17, 79 (1982)], pKY2289 [Gene,3, 1 (1978)], pKY2700 [생화학,52, 770 (1980)], pACYC177, pACYC184 [Journal of Bacteriology,134, 1141 (1978)], pRK248, pRK646, pDF [Methods in Enzymology,68, 268 (1979)], pUC18, pUC19 [야니슈 페론 등, Gene,33, 103 (1985)] 등을 들 수 있다. 또한, 박테리오파지, 예컨대 λ파지를 사용한 λgt 계의 λgt·λC [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,71, 4579 (1974)], λgt·λB [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,72, 3461 (1975)], λDam [Gene,1, 255 (1977)] 이나 샤론벡터 [Science,196, 161 (1977) ; Journal of Virology,29, 555 (1979)], 섬유상 파지를 사용한 mp 계의 mp18, mp 19 [야니슈 페론 등, Gene,33, 103 (1985)] 벡터 등도 들 수 있다.
상기 DNA 는 ATG 의 상류에 프로모터를 갖고 있는 것이 바람직하고, 이 프로모터는 형질전환체의 제조에 사용하는 숙주에 대응해서 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다.
예컨대 대장균 (Escherichia coli) 에서는 trp 프로모터, lac 프로모터, rec A 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등, 고초균 (Bacillussubtilis) 에서는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 효모 (Saccharomyces cerevisiae) 에서는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등, 동물세포에서는 SV40 유래의 프로모터 등을 들 수 있다. 필요에 따라 SD (샤인 앤드 달가노) 서열을 프로모터의 하류에 삽입해도 된다.
T7 프로모터계를 사용하는 경우에는, T7 프로모터로서 T7 DNA 상에서 발견된 17 종의 프로모터 [J. L. Oakley 등, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A.,74: 4266-4270 (1977), M.D. Rosa, Cell16: 815-825 (1979), N. Panayotatos 등, Nature,280: 35 (1979), J.J. Dunn 등, J. Mol. Biol.,166: 477-535 (1983)] 중 어느 하나여도 되는데, φ10 프로모터 [A.H. Rosenberg 등, Gene,56: 125-135 (1987)] 가 바람직하다.
전사 터미네이터로서는 대장균계에서 작용하는 터미네이터, 바람직하게는 Tφ터미네이터 [F.W. Studier 등, J. Mol. Biol.,189: 113-130 (1986)] 가 사용된다.
T7 RNA 폴리머라아제 유전자로서는 T7 유전자 [F.W. Studier 등, J. Mol. Biol.,189: 113-130 (1986)] 를 들 수 있다.
벡터는 상기 벡터에 T7 프로모터, T7 터미네이터를 짜넣어 구축되는 것이 바람직하고, 이와 같은 벡터로서는 pET-1, pET-2, pET-3, pET-4, pET-5 [A.H. Rosenberg, Gene56: 125-135 (1987)], pTB960-2 [EP-A-499990] 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 pTB960-2 가 사용된다.
본 발명의 형질전환체는, 상기 방법으로 얻어지는 발현용 플라스미드를 자체공지의 방법 [예, 코엔 S, N, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,69, 2110 (1972)] 으로 숙주를 형질전환함으로써 제조할 수 있다.
형질전환되는 미생물의 숙주로서는, 예컨대 에쉐리키아 (Escherichia) 속 균, 바실루스 (Bacillus) 속 균, 효모, 동물세포 등을 들 수 있다.
상기 에쉐리키아속 균의 예로서는, 대장균 (E. coli) 을 들 수 있으며, 구체적으로는 대장균 K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,60, 160 (1968)], JM-103 [Nucleic Acids Research,9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology,120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology,41, 459 (1969)], C600 [Genetics,39, 440 (1954)], N4830 [Cell,25, 713 (1981)], K-12MM294 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,73, 4174 (1976)], BL-21 등을 들 수 있다.
상기 바실루스속 균으로서는, 예컨대 고초균 (Bacillus subtilis) 을 들 수 있으며, 구체적으로는 고초균 MI114 (Gene,24, 255 (1983)), 207-21 [Journal of Biochemistry,95, 87 (1984)] 등을 들 수 있다.
상기 효모로서는, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 를 들 수 있으며, 구체적으로는 사카로마이세스 세레비시아에 AH22 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,75, 1929 (1978)], XSB5 2-23C [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,77, 2173 (1980)], BH-641A (ATCC 28339), 20B-12 [Genetics,85, 23 (1976)], GM3C-2 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,78, 2258 (1981)] 등을 들 수 있다.
동물세포로서는, 예컨대 원숭이 세포 COS-7 [Cell,23, 175 (1981)], Vero [(일본임상21, 1209 (1963)], 차이니스 햄스터 세포 CHO [J. Exp. Med.,108, 945 (1985)], 마우스 L 세포 [J. Nat. Cancer Inst.,4, 165 (1943)], 인간 FL 세포 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,94, 532 (1957)], 햄스터 C 세포 등을 들 수 있다.
T7 프로모터계를 사용하는 경우에는, 그 형질전환체의 숙주로서 T7 RNA 폴리머라아제 유전자 (T7 유전자 1) [F.W. Studier 등, J. Mol. Biol.189: 113-130 (1986)] 를 삽입한 대장균주, 예컨대 MM294, DH-1, C600, JM109, BL21 또는 T7RNA 폴리머라아제 유전자 (T7 유전자 1) 를 다른 플라스미드와 함께 삽입한 대장균 등이 사용된다. 바람직하게는 T7 유전자 1 을 삽입한 λ파지가 용원화(溶原化)된 MM294 주 및 BL21 주가 사용된다. 이 경우 T7 유전자 1 의 프로모터로서는 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드 (IPTG 라 약칭하는 경우가 있음) 로 발현이 유도되는 lac 프로모터가 사용된다.
에쉐리키아속 균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69 권, 2110 (1972)] 나 [Gene, 17 권, 107 (1982)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
바실루스속 균을 숙주로서 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Molecular and General Genetics,168, 111 (1979)] 등 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.
효모균을 숙주로서 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,75, 1929 (1978)] 등의 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.
동물세포를 숙주로서 형질전환하기 위해서는, 예컨대 [Virology,52, 456(1973)] 등의 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.
융합단백질은 상술한 형질전환체를 배지에 배양하고, 생산된 융합단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다.
배지의 pH 는 약 6 ∼ 8 이 바람직하다.
에쉐리키아속 균을 배양할 때의 배지로서는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유하는 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작용시키기 위해, 예컨대 3β-인돌릴 아크릴산이나 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 와 같은 약제를 첨가할 수 있다.
숙주가 에쉐리키아속 균인 경우, 배양은 통상 약 15 ∼ 43 ℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.
숙주가 바실루스속 균인 경우, 배양은 통상 약 30 ∼ 40 ℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.
숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예컨대 Burkholder 최소배지 [Bostian, K.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,77, 4505 (1980)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20 ∼ 35 ℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.
숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예컨대 약 0.2 ∼20 %, 바람직하게는 약 5 ∼ 20 % 의 태아 소 혈청을 함유하는 MEM 배지 [Science,122, 501 (1952)], DME 배지 [Virology,8, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association,199, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73, 1 (1950)] 등을 들 수 있다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 ∼ 40 ℃, 배양시간은 약 15 ∼ 60 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.
융합단백질은 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물 중에 상기 융합단백질을 생성, 축적시키고, 이것을 채취함으로써 제조할 수 있다.
배지로서는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유하는 M9 배지 [Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring Horbor Laboratory, New York 1972)], 2 ×YT 배지 [메싱, Methods in Enzymology,101, 20 (1983)], LB 배지 등을 들 수 있다.
배양은 통상 약 15 ∼ 43 ℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가해도 된다.
λcIts 리프레서와 λPL-프로모터를 함유하는 발현벡터를 갖는 재조합체를 사용하는 경우에는, 배양은 약 15 ∼ 36 ℃, 바람직하게는 약 30 ∼ 36 ℃ 의 온도에서 실시하고, λcIts 리프레서의 불활화는 약 37 ∼ 42 ℃ 에서 실시하는 것이 바람직하다. 또한, recA 프로모터를 보다 효율적으로 작용시키기 위해, 즉 recA 유전자 발현 억제기능을 저하시키기 위해, 필요에 따라 마이토마이신 C, 나르지키신산 등과 같은 약제를 첨가하거나 자외선을 조사하거나 또는 배양액의 pH 를알칼리측으로 변화시켜도 된다.
T7 프로모터계를 사용한 경우에는, (1) lac 프로모터의 하류에 연결되어 있는 T7 유전자 (RNA 폴리머라아제 유전자) 를 발현시킬 때에는 IPTG 등을 첨가하거나 또는 (2) λPL 프로모터의 하류에 연결되어 있는 T7 유전자 (RNA 폴리머라아제 유전자) 를 발현시킬 때에는 배양의 온도를 상승시키거나 하여 생성되는 T7 파지 RNA 폴리머라아제 1 에 의해 특이적으로 T7 프로모터를 작동시킨다.
배양후, 공지의 방법으로 균체를 모으고, 예컨대 완충액으로 현탁한 후, 예컨대 단백질 변성제 처리, 초음파 처리나 라이소자임 등의 효소 처리, 글라스비즈 처리, 프렌치프레스 처리, 동결융해 처리 등을 실시하여 균체를 파쇄하고 원심분리 등 공지의 방법에 의해 상청을 얻는다.
상기한 바에 의해 얻어진 상청으로부터 융합단백질을 단리하기 위해서는, 통상 알려져 있는 단백질의 정제법에 따르면 된다. 예컨대, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 전기영동 등을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질은 정제하지 않거나 또는 부분정제의 상태로 다음 반응공정으로 진행해도 된다.
이어서, 이와 같이 하여 얻어지는 융합단백질이나 펩티드를 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공한다. 상기 절단반응으로서는 예컨대 S-시아노화 반응 이어서 가수분해 반응을 들 수 있다. KiSS-1 펩티드의 아미드 또는 그 염을 최종물로서 얻는 경우에는, 상기 절단반응으로서 예컨대 S-시아노화 반응, 이어서 가암모니아분해를 실시하는 것을 들 수 있다. 상기 S-시안화 반응은 원료 화합물에 S-시아노화 시약을 작용시킴으로써 실시한다.
S-시아노화 시약으로서는 예컨대 2-니트로-5-티오시아노벤조산 (NTCB), 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염 (DMAP-CN), CN-이온 등을 들 수 있다. 상기 S-시아노화 시약의 양은 몰수로 전체 티올기의 약 2 배 내지 50 배량이면 되고, 바람직하게는 약 5 배 ∼ 10 배량이다.
반응 온도는 약 0 ∼ 80 ℃ 사이이면 무방하며, 약 0 ∼ 50 ℃ 사이가 보다 바람직하다. 사용하는 용매로서는 S-시아노화 시약과 반응하지 않는 것이라면 어떤 완충액이어도 되는데, 예컨대 트리스-염산 완충액, 트리스-아세트산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 유기용매는 S-시아노화 시약과 반응하지 않는 것이라면 존재하고 있어도 된다.
상기 반응은 pH 1 ∼ 12 의 사이에서 실시하는 것이 바람직하다. 특히, NTCB 를 사용하는 경우에는 pH 7 ∼ 10, DMAP-CN 을 사용하는 경우에는 S-S 교환반응을 방지하기 위해 pH 2 ∼ 7 의 사이가 바람직하다. 또한, 반응액 중에는 염산구아니딘 등의 변성제가 존재하고 있어도 된다.
상기 가암모니아분해 또는 가수분해 반응으로서는 예컨대 알칼리 처리를 실시하는 것을 들 수 있다.
상기 알칼리 처리로서는, 원료 화합물을 함유하는 수용액의 pH 를 7 ∼ 14 로 조정함으로써 실시된다.
상기 pH 의 조정은 예컨대 암모니아, 수산화 나트륨, 후술하는 아미노 화합물, 트리츠마베이스 (트리스[히드록시메틸]-아미노메탄), 인산 제 2 나트륨, 수산화칼륨, 수산화발륨 등의 용액을 원료 화합물을 함유하는 수용액에 적당량 첨가하여 실시하는데, 특히 암모니아 등이 바람직하다.
상기 반응시 용액의 농도로서는, 예컨대 암모니아 또는 아미노 화합물의 경우에는 약 0.01 ∼ 15 N, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 3 N, 수산화나트륨의 경우에는 약 0.01 ∼ 2 N, 바람직하게는 약 0.05 ∼ 1 N, 트리츠마베이스의 경우에는 약 1 mM ∼ 1 M, 바람직하게는 약 20 mM ∼ 200 mM, 인산 제 2 나트륨의 경우에는 약 1 mM ∼ 1 M, 바람직하게는 약 10 mM ∼ 100 mM, 수산화칼륨의 경우에는 약 0.01 ∼ 4 N, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 2 N 을 들 수 있다. 반응 온도는 약 -20 ∼ 80 ℃ 사이이면 무방하며, 약 -10 ∼ 50 ℃ 사이가 보다 바람직하다.
반응 시간은, 바람직하게는 S-시아노화 반응은 약 1 ∼ 60 분, 바람직하게는 약 15 ∼ 30 분이, 가수분해 반응은 약 5 분 ∼ 100 시간, 바람직하게는 10 분 ∼ 15 시간이, 가암모니아분해는 약 5 분 ∼ 24 시간, 바람직하게는 약 10 ∼ 180 분을 들 수 있다.
상기 아미노 화합물로서는 예컨대 식 R1-(NR2)-H (식중, R1및 R2는 동일 또는 상이하며 (ⅰ) 수소원자, (ⅱ) C1-20알킬기, C3-8시클로알킬기, C6-14아릴기 또는 C6-14아릴-C1-3알킬기 (이들은 치환기를 갖고 있지 않거나 또는 1 ∼ 3 개의 아미노기, 수산기 등을 탄소원자상에 갖고 있어도 됨), (ⅲ) 치환되어 있어도 좋은 아미노기, (ⅳ) 수산기 또는 C1-6알콕시기를 나타냄) 로 표시되는 화합물 등을 들 수 있다.
상기 S-시아노화 및 가암모니아분해 또는 가수분해에 의해, 도 1 에 나타낸 반응이 일어난다고 생각된다.
본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 KiSS-1 펩티드의 C 말단은, 상기한 바와 같이 아미드(-CONH2), 카르복실기, 카르복실레이트(-COO-), 알킬아미드(-CONHR) 또는 에스테르(-COOR)여도 되고, 그 중에서도 아미드, 카르복실기(-COOH) 또는 알킬아미드가 바람직하고, 특히 아미드 또는 알킬아미드가 적합하다. 구체적으로는 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 KiSS-1 펩티드의 C 말단은 도 1 에 나타낸 -CO-X 여도 된다. X 는 R1-(NR2)- (식중, 각 기호는 상기한 바와 동일한 의미를 가짐) 또는 OH 를 나타낸다.
상기 C1-20알킬의 예로서는, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 1-에틸펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 옥틸, 노나닐, 데카닐, 운데카닐, 도데카닐, 테트라데카닐, 펜타데카닐, 헥사데카닐, 헵타데카닐, 옥타데카닐, 노나데카닐 및 에이코사닐 등을 들 수 있다.
상기 C3-8시클로알킬의 예로서는, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등을 들 수 있다.
상기 C6-14아릴의 예로서는, 페닐, 나프틸, 안트릴, 페난트릴, 아세나프틸레닐 등을 들 수 있다.
상기 C6-14아릴-C1-3알킬의 예로서는, 예컨대 벤질, 페네틸, 3-페닐프로필, (1-나프틸)메틸, (2-나프틸)메틸 등을 들 수 있다.
상기 C1-6알콕시의 예로서는, 예컨대 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 펜틸옥시, 헥실옥시 등을 들 수 있다.
상기 (ⅲ) 의 치환되어 있어도 좋은 아미노의 치환기의 예로서는, 예컨대 아미노산, 2 ∼ 10 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 등을 들 수 있다.
상기 아미노산으로서는 L-체나 D- C체여도 되며, 그 예로서는 예컨대 Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 등을 들 수 있다.
상기 펩티드의 예로서는, 예컨대 H-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5, H-Val-Ala-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH 등을 들 수 있다.
상기한 것 중에서도 R2로서는 수소원자, R1으로서는 수소원자 또는 C1-20알킬기가 바람직하다.
상기 가암모니아분해 반응에 있어서, 암모니아 또는 아미노 화합물을 사용한 경우에는 대응하는 아미드체를 얻을 수 있다.
제거된 목적 펩티드를 단리하기 위해서는, 통상 알려져 있는 펩티드의 정제법을 따르면 된다. 예컨대, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피, 고속 액체크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 전기영동 등을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어지는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염은, 공지의 정제수단, 예컨대 추출, 염석, 분배, 재결정, 크로마토그래피 등에 의해 반응용액으로부터 단리·정제할 수도 있는데, 바람직한 예로서 예컨대 SP-세파로스 (파마시아 바이오테크(주)), DEAE-5PW (도소(주)) 또는 SP-5PW (도소(주)) 를 매개로 한 이온 교환 크로마토그래피 등에 의한 정제법을 들 수 있다.
얻어지는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염은, 필요에 따라 이것을 동결건조에 의해 분말로 할 수도 있다. 동결건조 시에는 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 말토스, 트레할로스, 글리세롤 등의 안정화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염은 멸균수, 인간 혈청 알부민 (HSA), 생리식염수, 그 외 공지의 생리학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있고, 포유동물 (예, 인간) 에 대해 비경구적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예컨대, 그 1 일 투여량은 1 인당 약 0.01 ㎎ ∼ 50 ㎎, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 을 정맥주사 또는 근육주사 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염을 함유하는 제제는, 염, 희석제, 아주반트, 다른 담체, 버퍼, 결합제, 계면활성제, 보존제와 같은 생리적으로 허용되는 다른 활성성분도 함유하고 있어도 된다. 비경구적 투여제제는, 멸균 수용액 또는 생리학적으로 허용되는 용매와의 현탁액 앰풀, 또는 생리학적으로 허용되는 희석액으로 사용시 희석하여 사용할 수 있는 멸균 분말 (통상 펩티드 용액을 동결건조하여 얻어짐) 앰풀로서 제공된다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염은 암 전이 억제활성을 갖기 때문에, 모든 암 (예컨대, 폐암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 유방암 등) 의 예방 또는 치료약으로서 유용하다.
또한, KiSS-1 펩티드 또는 그 염은 태반기능 조절작용을 갖기 때문에, 융모암, 포상기태, 침입기태, 유산, 태아의 발육부전, 당대사 이상, 지질대사 이상 또는 분만유발의 예방 또는 치료약으로서 유용하다.
본 명세서 및 도면에 있어서, 아미노산, 펩티드, 보호기, 활성기, 그 외의 것에 관해 약호로 표시하는 경우, 이들은 IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature) 에 의한 약호 또는 해당 분야에서의 관용 약호에 기초하는 것으로서, 그 예를 다음에 든다. 또한, 아미노산 등에 관해 광학이성질체가 있을 수 있는 경우에는 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.
DNA : 데옥시리보핵산
A : 아데닌
T : 티민
G : 구아닌
C : 시토신
RNA : 리보핵산
EDTA : 에틸렌디아민4아세트산
Gly : 글리신
Ala : 알라닌
Val : 발린
Leu : 류신
Ile : 이소류신
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Met : 메티오닌
Glu : 글루타민산
Asp : 아스파르트산
Lys : 리신
Arg : 아르기닌
His : 히스티딘
Phe : 페닐알라닌
Tyr : 티로신
Trp : 트립토판
Pro : 프롤린
Asn : 아스파라긴
Gln : 글루타민
Cys : 시스테인
Asx : 아스파라긴 또는 아스파르트산
Glx : 글루타민 또는 글루타민산
ATP : 아데노신3인산
본원 명세서의 서열목록의 서열번호는 다음 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 1]
KiSS-1 펩티드의 아미드산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 2]
KiSS-1 펩티드를 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 3]
bFGF CS23 뮤테인의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 4]
화학식 Ⅰ 로 표시되는 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 5]
화학식 Ⅰ 로 표시되는 융합단백질을 코딩하는 DNA 단편의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 6]
bFGFCS23 뮤테인의 단편을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 7]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 8]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 9]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 10]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 11]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 12]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 13]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 14]
실시예 1 에 있어서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자의 제조에 사용한 올리고머의 염기 서열을 나타낸다.
[서열번호 : 15]
KiSS-1 펩티드 성숙체의 아미노산 서열을 나타낸다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 KiSS-1 펩티드를 코딩하는 DNA 의 제조
(a) DNA 단편의 합성
도 2 에 나타내는 8 종의 DNA 단편 (#1, #4, #5, #8 : 아마샴·파마시아·바이오테크사, #2, #3, #6, #7 : 깁코테크사) (서열목록 중, 서열번호 : 7 ∼ 14) 을 사용해서 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자를 제조하였다 (도 3).
(b) DNA 올리고머의 인산화
5' 가 되어야 하는 #1 (서열번호 : 7) 및 #8 (서열번호 : 14) 을 제외한 6 종의 DNA 올리고머 (#2 ∼ #7) (서열번호 : 8 ∼ 13) 각각을, 25 ㎕ 의 인산화 반응액 [DNA 올리고머 10 ㎍, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM 스페르미딘, 10 mM 디티오트레이톨 (이후, DTT 라 약기함), 0.1 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민 (이후, BSA 라 약기함), 1 mM ATP, 10 유닛 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (다카라슈조)] 중에서 37 ℃ 1 시간 반응시켜, 각 올리고머의 5' 말단을 인산화하였다. 페놀 처리를 실시한 후, 2 배량의 에탄올을 첨가하여 -70 ℃ 로 냉각한 후, 원심으로 DNA 를 침전시켰다.
(c) DNA 프래그먼트의 연결
상기 (a) 에서 얻은 DNA 프래그먼트와 #1 및 #8 을 합하여 120 ㎕ 로 하였다. 이 혼합액을 90 ℃ 에서 10 분간 유지한 후, 실온까지 서서히 냉각하여 어닐링을 실시하였다. TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 (다카라슈조) 를 사용하여 라이게이션 반응을 실시하였다. 어닐링액 30 ㎕ 에 Ligation Kit Ⅱ 액 30 ㎕ 을 첨가하여 잘 혼합한 후, Ligation Kit Ⅰ 액 60 ㎕ 을 첨가하고, 37 ℃, 1 시간 반응시켜 라이게이션을 실시하였다. 페놀 처리를 실시한 후, 수층을 회수하여 2 배량의 에탄올을 첨가하고, -70 ℃ 로 냉각한 후, 원심으로 DNA 를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 프래그먼트를 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (다카라슈조) 에 의한 인산화를 실시한 후, 이하의 (d) 에 제공하였다.
(d) KiSS-1 펩티드 발현 벡터의 구축 [도 4]
발현용 벡터로서는 pTFC (일본 공개특허공보 2000-270871호, 일본 특허출원 평11-080303호) 를 NdeI 및 AvaI (다카라슈조) 로 37 ℃, 4 시간 소화한 후, 1 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 4.4 kb 의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit (퀴아겐사) 를 사용하여 추출하고, 25 ㎕ 의 TE 완충액에 용해하였다. 이 pTFC 의 NdeI, AvaI 단편과 상기에 의해 제조한 KiSS-1 펩티드의 구조 유전자를 TaKaRa DNA ligation kit ver.2 (다카라슈조) 를 사용하여 라이게이션 반응을 실시하였다.
이 반응액을 10 ㎕ 사용하여 대장균 JM109 컴피턴트셀 (도요보세키) 을 형질전환하고, 10 ㎍/㎖ 의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천배지 상에 파종하고 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하여, 발생한 테트라사이클린 내성 콜로니를 선택하였다. 이 형질전환체를 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIAprep8 Miniprep Kit (퀴아겐사) 를 사용하여 플라스미드 pTFC-KiSS-1 을 제조하였다. 이 KiSS-1 구조 유전자 부분의 염기 서열을 어플라이드바이오시스템즈사 모델 377 DNA 시퀀서를 사용해서 확인하였다. 플라스미드 pTFC-KiSS-1 으로 대장균 MM294 (DE3) 를 형질 전환하고, KiSS-1 펩티드-CE23 융합단백질 발현주 M294(DE3)/pTFC-KiSS-1 을 얻었다 (도 4).
대장균 MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1 은 수탁번호 FERM BP-6907 로 1999 년 10 월 4 일자로 일본통산성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소에 기탁되었다. 또한, 1999 년 9 월 16 일자로 수탁번호 IFO16321 로서 재단법인 발효연구소 (IFO) 에 기탁되었다.
(d) KiSS-1 펩티드의 제조
MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1 을 5.0 ㎎/ℓ의 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지에 1 ℓ (1 % 펩톤, 0.5 % 효모 엑기스, 0.5 % 염화나트륨) 를 사용하여 2 ℓ용량 플라스크 중에서 37 ℃, 8 시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액을 19 ℓ의 주발효 배지 (1.68 % 인산 1 수소나트륨, 0.3 % 인산 2 수소칼륨, 0.1 % 염화암모늄, 0.05 % 염화나트륨, 0.025 % 황산마그네슘, 0.02 % 소포제, 0.00025 % 황산 제 1 철, 0.0005 % 염산티아민, 1.5 % 포도당, 1.5 % 카자미노산) 를 넣은 50 ℓ용량 발효조에 이식하고 30 ℃ 에서 통기 교반을 개시하였다. 배양액의 탁도가 500 크렛 단위로 된 시점에서, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 최종 농도가 12 ㎎/ℓ가 되도록 첨가하고, 추가로 6 시간 배양을 실시하였다. 배양종료 후, 배양액을 원심 분리하여 약 600 g 의 습균체를 취득하여 -80 ℃ 에서 보존하였다.
실시예 2
실시예 1 에서 얻은 균체 100 g 에 10 mM EDTA (pH 6.0) 용액 300 ㎖ 를 첨가하고, 초음파 처리 (BRANSON SONIFIER MODEL 450) 한 후, 원심분리 (10000 rpm, 60 분) 를 실시하였다. 상청액은 풀 (pool) 하고, 침전물을 사용하여 다시 동일한 조작을 실시하였다. 풀한 상청액은 pH 6.0 으로 조정하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 AF-Heparin Toyopearl 650 M 칼럼 (11.3 cmID ×13.5 cmL, 도소) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 0 ∼ 100 % B (B = 50 mM 인산 완충액 + 2 M NaCl, pH 6.0) 의 단계 구배로 용출을 실시하여 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질 분획을 얻었다 (100 분간의 구배로 용출시간 약 100 분의 분획). 이 용출액을 팰컨미니카세트 (밀리포어사) 으로 농축한 후, 다시 0.1 M 아세트산을 첨가하면서 농축을 실시하여 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질의 0.1 M 아세트산 용액을 얻었다. 이 용액에 최종 농도 6 M 이 되도록 요소를 첨가한 후, DMAP-CN (1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트) 약 100 ㎎ 을 첨가하여 실온에서 15 분간 반응하였다. 반응종료 후, 반응액을 50 mM 인산 1 칼륨으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL, 파마시아) 에 통과시키고, 평형화에 사용된 50 mM 인산 1 칼륨을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하여, S-시아노화된KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질 분획을 얻었다. 이 용출액을 팰컨미니카세트 (밀리포어사) 로 농축·탈염을 실시하여 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질의 탈염액을 얻었다. 이 탈염액에 최종 농도 6 M 이 되도록 요소를 첨가한 후, 다시 3 M 암모니아 농도가 되도록 25 % 암모니아수를 첨가하여 실온에서 15 분간 반응하였다. 반응종료후, 아세트산으로 pH 6.0 으로 조정하여 KiSS-1 펩티드 (아미드체) 를 얻었다. 이 반응액을 50 mM 인산 1 칼륨으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL) 에 통과시키고, 평형화에 사용된 50 mM 인산 1 칼륨을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 KiSS-1 펩티드 분획 (아미드체) 을 얻었다. 이 분획을 3 M 요소를 함유하는 50 mM MES + 3 M 우레아 (pH 4.5) 로 평형화한 SP-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 0 ∼ 30 % B (B = 50 mM 인산 완충액 + 1 M NaCl + 3 M 요소, pH 4.5) 의 단계 구배로 용출을 실시하여 KiSS-1 펩티드 (아미드체) 분획을 얻었다 (60 분간의 구배로 용출시간 약 30 분의 분획). 이 분획을 추가로 0.1 % 트리플루오로아세트산으로 평형화한 C4P-50 (21.5 ㎜ID ×300 ㎜L, 쇼와덴코) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 20 ∼ 50 % B (B : 80 % 아세토니트릴/0.1 % 트리플루오로아세트산) 의 단계 구배로 용출을 실시하고, KiSS-1 펩티드 (아미드체) 분획 (60 분간의 구배로 용출시간 약 45 분의 분획) 을 풀한 후, 동결건조를 실시하여 KiSS-1 펩티드 (아미드체) 동결건조 분말 약 40 ㎎ 을 얻었다.
실시예 3 (KiSS-1 펩티드 특징의 결정)
a) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (히타치 L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용해서 결정하였다. 그 결과, KiSS-1 펩티드의 DNA 염기 서열로부터 예상되는 아미노산 조성과 일치하였다 [표 1].
아미노산 1 몰당 잔기수 KiSS-1 펩티드의 염기 서열로부터 예상되는 값
Asx 3.5 4
Thr*) 0.9 1
Ser*) 7.3 8
Glx 7.0 7
Pro 8.1 8
Gly 4.9 5
Ala 2.9 3
Cys 0 0
Val 2.0 2
Met 0 0
Ile 0.9 1
Leu 5 5
Tyr 1.0 1
Phe 1.9 2
His 1.1 1
Lys 1.0 1
Arg 3.8 4
Trp 0.4 1
산 가수분해 (6N HCl-4% 티오글리콜산 24-48 hr 가수분해의 평균치)*) 0 시간에 외삽한 값
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (PE 어플라이드바이오시스템즈 모델 492) 를 사용해서 결정하였다. 그 결과, KiSS-1 펩티드의 DNA 염기 서열으로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 [표 2].
N 말단 아미노산 서열 분석
잔기 No. 검출된 PTH*)-아미노산 KiSS-1 펩티드의 염기 서열로부터 예측되는 아미노산
1234567891011 Gly(28)Thr(24)Ser(12)Leu(14)Ser(9)Pro(16)Pro(17)Pro(14)Glu(7)Ser(4)Ser(6) GlyThrSerLeuSerProProProGluSerSer
100 pmol 을 사용함.*) 페닐티오히단토인
c) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (히다치 L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용해서 분석하였으나, C 말단은 아미드화되어 있기 때문에 검출되지 않았다 [표 3].
C 말단 아미노산 분석
KiSS-1 펩티드 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Phe -
기상 히드라진 분해법 (100 ℃, 3.5 hr)
실시예 4 (생물활성 측정)
실시예 2 에서 취득한 인간 KiSS-1 펩티드를 사용해서 WO 99/33976 의 실시예 3 에 기재된 방법 (세포내 칼슘이온농도 상승 활성) 으로 활성을 측정하여, 인간 태반 추출액으로부터 정제한 표품과 동등한 활성을 가짐을 확인하였다.
실시예 5 (KiSS-1 펩티드 (비아미드체) 의 제조)
실시예 1 에서 얻은 균체 100 g 에 10 mM EDTA (pH 6.0) 용액 300 ㎖ 를 첨가하고, 초음파 처리 (BRANSON SONIFIER MODEL 450) 한 후, 원심분리 (10000 rpm,60 분) 를 실시하였다. 상청액은 풀하고, 침전물을 사용해서 다시 동일한 조작을 실시하였다. 풀한 상청액은 pH 6.0 으로 조정하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 AF-Heparin Toyopearl 650 M 칼럼 (11.3 cmID ×13.5 cmL, 도소) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 0 ∼ 100 % B (B = 50 mM 인산 완충액 + 2 M NaCl, pH 6.0) 의 단계 구배로 용출을 실시하여 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질 분획을 얻었다 (100 분간의 구배로 용출시간 약 100 분의 분획). 이 용출액을 팰컨미니카세트 (밀리포어사) 로 농축한 후, 추가로 0.1 M 아세트산을 첨가하면서 농축하여 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질의 0.1 M 아세트산 용액을 얻었다. 이 용액에 최종 농도 6 M 이 되도록 요소를 첨가한 후, DMAP-CN 약 100 ㎎ 을 첨가하여 실온에서 15 분간 반응하였다. 반응종료 후, 반응액을 50 mM 인산 1 칼륨으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL, 파마시아) 에 통과시키고, 평형화에 사용된 50 mM 인산 1 칼륨을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하여, S-시아노화된 KiSS-1 펩티드-CS23 융합단백질 분획을 얻었다. 이 용출액을 팰컨미니카세트 (밀리포어사) 로 농축·탈염을 실시하여 KiSS-1 펩티드-C23 융합단백질의 탈염액을 얻었다. 이 탈염액에 최종 농도 6 M 이 되도록 요소를 첨가한 후, 추가로 0.05 N NaOH 농도가 되도록 1N NaOH 를 첨가하여 0 ℃ 에서 15 분간 반응하였다. 반응종료후, 아세트산으로 pH 6.0 으로 조정하여 KiSS-1 펩티드 (비아미드체) 를 얻었다. 이 반응액을 50 mM 인산 1 칼륨으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼 (46 mmID ×600 mmL) 에 통과시키고, 평형화에 사용된 50 mM 인산 1 칼륨을 6 ㎖/min 의 유속으로 전개하여 KiSS-1 펩티드 분획 (비아미드체) 을 얻었다. 이 분획을3 M 요소를 함유하는 50 mM MES + 3 M 요소 (pH 4.5) 로 평형화한 SP-5PW (21.5 mmID ×150 mmL, 도소) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 0 ∼ 30 % B (B = 50mM 인산 완충액 + 1 M NaCl + 3 M 요소, pH 4.5) 의 단계 구배로 용출을 실시하여 KiSS-1 펩티드 (비아미드체) 분획을 얻었다 (60 분간의 구배로 용출시간 약 30 분의 분획). 이 분획을 추가로 0.1 % 트리플루오로아세트산으로 평형화한 C4P-50 (21.5 mmID ×300 mmL, 쇼와덴코) 에 통과시키고, 흡착, 세정한 후, 20 ∼ 50 % B (B : 80 % 아세토니트릴 / 0.1 % 트리플루오로아세트산) 의 단계 구배로 용출을 실시하여 KiSS-1 펩티드 (비아미드체) 분획 (60 분간의 구배로 용출시간 약 45 분의 분획) 을 풀한 후, 동결건조시켜 KiSS-1 펩티드 (비아미드체) 동력건조 분말 약 30 ㎎ 을 얻었다.
실시예 6 (KiSS-1 펩티드의 특징 결정)
a) 아미노산 조성 분석
아미노산 조성을 아미노산 분석계 (히다치 L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용해서 결정하였다. 그 결과, KiSS-1 펩티드의 DNA 염기 서열로부터 예상되는 아미노산 조성과 일치하였다 [표 4].
아미노산 조성 분석
아미노산 1 몰당 잔기수 KiSS-1 펩티드의 염기 서열로부터 예상되는 값
Asx 3.3 4
Thr*) 0.9 1
Ser*) 7.0 8
Glx 7.0 7
Pro 7.8 8
Gly 4.7 5
Ala 2.8 3
Cys 0 0
Val 1.9 2
Met 0 0
Ile 0.9 1
Leu 5 5
Tyr 1.0 1
Phe 1.9 2
His 0.9 1
Lys 0.9 1
Arg 3.7 4
Trp 0.4 1
산 가수분해 (6N HCl-4% 티오글리콜산 24-48 hr 가수분해의 평균치)*) 0 시간에 외삽한 값
b) N 말단 아미노산 서열 분석
N 말단 아미노산 서열을 기상 프로테인 시퀀서 (PE 어플라이드바이오시스템즈 모델 492) 를 사용해서 결정하였다. 그 결과, KiSS-1 펩티드의 DNA 염기 서열로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다 [표 5].
N 말단 아미노산 서열 분석
잔기 No. 검출된 PTH*)-아미노산(pmol) KiSS-1 펩티드의 염기 서열로부터 예측되는 아미노산
12345678910 Gly(17)Thr(13)Ser(11)Leu(15)Ser(8)Pro(10)Pro(11)Pro(10)Glu(5)Ser(5) GlyThrSerLeuSerProProProGluSer
100 pmol 을 사용함.*) 페닐티오히단토인
c) C 말단 아미노산 분석
C 말단 아미노산을 아미노산 분석계 (히다치 L-8500A Amino Acid Analyzer) 를 사용해서 분석하였다 [표 6].
C 말단 아미노산 분석
KiSS-1 펩티드 C 말단 아미노산 회수율 (%)
Phe 48.5
기상 히드라진 분해법 (100 ℃, 3.5 hr)
본 발명의 제조방법을 이용하면, 예컨대 모든 암 (예컨대, 폐암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 유방암 등), 나아가 융모암, 포상기태, 침입기태, 유산, 태아의 발육부전, 당대사 이상, 지질대사 이상 또는 분만유발의 예방 또는 치료약 등으로서 사용할 수 있는 펩티드를 공업적으로 대량으로 제조할 수 있다.

Claims (16)

  1. N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 상기 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공하는 것을 특징으로 하는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염의 제조 방법.
  2. N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에, KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 갖는 벡터를 보유하는 형질전환체를 배양하여 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 발현시키고, 발현된 융합단백질, 펩티드 또는 그 염을 상기 시스테인 잔기의 아미노기측 펩티드 결합의 절단반응에 제공하는 것을 특징으로 하는 KiSS-1 펩티드 또는 그 염의 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, KiSS-1 펩티드의 C 말단이 아미드인 제조 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 절단반응이 S-시아노화 반응, 이어서 가암모니아분해 또는 가수분해 반응을 실시하는 반응인 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, KiSS-1 펩티드가 서열번호 : 1 로 표시되는아미노산 서열을 함유하는 펩티드인 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, KiSS-1 펩티드가, ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 40 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 45 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 46 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 ④ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에서 제 47 ∼ 54 번째 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 제조 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가, N 말단에 시스테인을 갖는 인터페론류, 인터루킨류, 섬유아세포 성장인자, (프로)유로키나아제류, 림포톡신, 종양괴사인자 (TNF), β-갈락토시다아제, 저장 단백질류, 스트렙토아비신, 프로테인 A, 프로테인 G, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 또는 그 뮤테인 또는 단편인 제조 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가, 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질 또는 펩티드인 제조 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드가 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질이고, KiSS-1 펩티드가 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고, 제조되는 KiSS-1 펩티드가 C 말단이 아미드인 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인 제조 방법.
  10. N 말단에 시스테인을 갖는 단백질 또는 펩티드의 N 말단에 KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질, 펩티드 또는 그 염.
  11. 제 10 항에 있어서, 서열번호 : 3 으로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 그 N 말단에 시스테인 잔기가 부가된 단백질의 N 말단에, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 KiSS-1 펩티드를 연결한 융합단백질, 펩티드 또는 그 염.
  12. 제 10 항에 기재된 융합단백질 또는 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 DNA.
  13. 제 12 항에 있어서, ① 서열번호 : 4 로 표시되는 염기 서열 또는 ② 서열번호 : 5 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA.
  14. 제 12 항에 기재된 DNA 를 갖는 벡터.
  15. 제 14 항에 기재된 벡터를 함유하는 형질전환체.
  16. FERM BP-6907 로 표시되는 대장균 MM294(DE3)/pTFC-KiSS-1.
KR1020027005950A 1999-12-17 2000-12-14 ＫｉＳＳ-1 펩티드의 제조 방법 KR20020065510A (ko)

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