KR20020030780A - 플라스미드 서열의 전사 동안 비정상적인 ｒｎａ 형성을예방하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

플라스미드 서열의 전사 동안 비정상적인 ｒｎａ 형성을예방하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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이곤 이 버그
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Abstract

일본쇄 DNA 또는 RNA, 부분적인 이본쇄 DNA, 및 이본쇄 DNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 숙주 세포에 형질감염되는 경우 이러한 분자로부터 바람직하지 않은 폴리뉴클레오타이드 종의 생산을 억제하는 종결인자 서열 및/또는 다른 변형을 함유한다. 이러한 분자들은 형질감염된 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 효율을 증강시키고, 바람직하지 않은 전사체의 생성 가능성을 감소시키는 방법에 유용하다. 추가로, 본 발명의 방법은 숙주 세포 또는 숙주에 존재하는 특정 폴리뉴클레오타이드의 발현을 종결시키거나 저발현 조절하는 것을 회피하는데 유용하다. 이러한 조성물 및 방법은 치료, 백신, 진단 및 연구 분야에서 유용하다.

Description

플라스미드 서열의 전사 동안 비정상적인 ＲＮＡ 형성을 예방하기 위한 방법 및 조성물 {Methods and compositions for preventing the formation of aberrant RNA during transcription of a plasmid sequence}
폴리뉴클레오타이드 조성물은 주로 포유동물에서 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 용도, 뿐만 아니라 상기 분야에서의 연구에서의 용도에 대해서 기술되어져 왔다. 특히, 현재의 대부분의 활동이 바이러스, 세균, 진균 감염 같은 병원성의 세포외 및 세포내 감염의 치료에서의 폴리뉴클레오타이드 조성물의 용도에 집중되고 있다. 한 가지 예로서, DNA 백신은 포유동물 면역계를 조절함으로써 병원체와 싸우게 되는 시약을 생체내 포유동물 세포내로 전달하는 것으로 기술된다.따라서, 상기 백신은 예를 들면, 바이러스성 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하고 감염제의 의한 감염시 체액성 또는 세포성 면역 반응을 유도하도록 디자인된다. 한편, 유전자요법용 벡터는 일반적으로 포유동물에서 발현되지 않거나 부적절하게 발현되거나 저발현되는 단백질을 포유동물 세포내로 전달하도록 디자인된다. 상기 벡터는 종종 항원성으로 인식되거나, 바람직하지 않은 세포성 면역 반응을 유발시키는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 종 특이적인 면역 반응을 야기한다. 폴리뉴클레오타이드 조성물의 다른 치료학적 용도는 질환에 걸린 포유동물 환자에게 결여되거나 저발현되는 단백질을 전달하기 위한 것이다. 추가로, 폴리뉴클레오타이드는 그자체로 진단/영상화 프로토콜에서 생체내 시약으로서, 유전자요법에서, 안티센스 프로토콜에서, 백신 적용에서 시약으로서 유용하거나, 그밖에 유전자 결함, 감염성 질환, 암, 및 자가면역질환 같은 다양한 질병을 치료 또는 예방하는데 사용되는 약제로서 유용하다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 생물학적 연구 분석, 의학적, 진단학적, 스크리닝 및 오염 검출 분석 같은 분석에서 시험관내 시약으로서 유용하다.
당해 분야에 숙지된 수 많은 문제점들로 인해 수 많은 폴리뉴클레오타이드 조성물이 유용한 약제로서 광범위하게 수용되지 못하고 있다. 따라서, 의학계에서 포유동물에서 질환을 치료하기 위한 치료법으로서 받아들여진 DNA 백신 또는 치료제는 소수에 불과하다.
폴리뉴클레오타이드 조성물에 의해 매개되는 현상들이 식물, 선충 및 드로소필라에서 관찰되어져 왔으며, 전사후 유전자 침묵 및 전사적 침묵으로서 인용된다.이러한 현상은 식물, 선충 또는 드로소필라를 세포내에서 프로모터 같은 조절 인자 또는 이미 발현된 천연 유전자 또는 이의 일부와 상당한 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현하는 바이러스, 비로이드, 플라스미드 또는 RNA로 형질감염 또는 감염시켜 내인성 조절 인자 및/또는 유전자 및 외인성 서열 모두의 발현을 영구적으로 억제시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이러한 침묵 효과(silencing effect)는 유전자 특이적인 것으로 나타났다. 예를 들면, 문헌 참조[L. Timmons and A. Fire, Nature, 395:354 (Oct. 29, 1998); A. Fire et al., Nature, 391: 806-810 (Feb. 19, 1998); R. Jorgensen et al, Science, 279: 1486-1487 (March 6, 1998); J. R. Kennerdell and r. W. Carthew, Cell, 95: 1017-1026 (Dec. 1998); L. Misquitta and B. M. Paterson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96: 1451-1456 (Feb. 1999); M. K. Montgomery et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 15502-15507 (Dec. 1998)]. 전장 프로-알파 1 콜라겐 유전자를 암호화하는 DNA 플라스미드를 설치류 섬유아세포 조직 세포주내로 일시적으로 형질감염시키고 천연 콜라겐 유전자 및 일시적으로 발현된 유전자에 대해 "침묵 효과"가 관측되었다[Bahramian and Zarbl, Mol. Cell. Biol., 19(1): 274-283 (Jan. 1999)].
폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하는 또 다른 문제점은 의도된 유전자-함유 전사체 대신에, 비정상적인 RNA 또는 DNA가 형성된다는 것이다. 비정상적인 RNA 또는 DNA의 형성이 임의의 형질감염된 플라스미드 또는 폴리핵산 분자의 사용시 발생되어 표적 유전자 발현의 효율을 감소시킬 것이라고 가정되어져 왔다. 변형된 또는 비정상적인 RNA의 형성은 상기 주지된 침묵 효과의 한 가지 원인일 수 있다.
전사를 종결시키는 작용을 하는 많은 서열들이 당해 분야에서 유용하며 공지되어져 있다. 예를 들면, RNA 폴리머라제 II에 대한 중지 부위는 전사의 종결과 관련이 있으며, 특히 상기 부위가 일시적인 발현 시스템에서 강력한 폴리아데닐화 시그날의 바로 하류에 위치하는 경우 전사의 종결과 관련된다[P. Enriquez-Harris et al, EMBO J., 9(7): 1833-1842 (1991); G. W. Hatfield et al, Mol. Cell. Biol., 3(10): 1687-1693 (1983)].
그러나, 최근까지, 약제, 백신, 유전자요법 및 진단 분야에서 폴리뉴클레오타이드 발현의 효율을 증가시키는데 사용하기 위하여 종결 메카니즘을 조절하는 효과적이고 기능적인 조성물 또는 방법을 고안하고자 하는 어떠한 제안도 없었다. 당해 분야에는 숙주 세포에서 비정상적인 RNA 또는 DNA의 형성을 억제하고 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 증가시키기 위해 사용하는 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
한 가지 양태에서, 본 발명은 제1 암호화 쇄 및 제2 전사 주형 쇄를 포함하는 이본쇄 폴리뉴클레오타이드(바람직하게는 데옥시리보핵산) 분자를 제공한다. 제1쇄는 (i) 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 프로모터에 의해 발현이 조절되는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 카셋트 서열 하나 이상, 및 (ii) 제1쇄 종결인자 서열 하나 이상을 포함한다. 상기 발현 카셋트의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 세포내에서 발현되어 생물학적 기능을수행하도록 요망되는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 제1쇄 종결인자 서열은 바람직하게는 프로모터의 5'쪽에, 폴리아데닐화 부위의 3'쪽에, 제1쇄 상의 발현 카셋트 서열의 외부, 또는 발현 카셋트 서열의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열 내부에 위치한다. 제1쇄 종결 인자는 발현 카셋트 서열에 상보적인 제2쇄 상의 서열로부터의 전사를 방해하지 않으며, 발현시키고자 하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 기능에 영향을 미치지 않는 위치에 위치한다. 제2쇄는 제1쇄에 상보적이다. 제1쇄 종결인자 서열에 상보적인 제2쇄 서열의 부분은 제1쇄 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄 서열로부터의 전사를 방해하지 않는다. 추가로, 제2쇄는 제2쇄 상에서 개시된 전사를 종결시키는 제2쇄 종결인자 서열 하나 이상을 포함한다. 제2쇄 종결인자 서열은 바람직하게는, 제1쇄의 발현 카셋트에 상보적인 서열 외부에서 및 발현 카셋트 서열에 상보적인 서열로부터의 전사를 방해하지 않으며 발현되는 경우 폴리뉴클레오타이드 서열의 생물학적 기능을 손상시키지 않는 위치에서 제2쇄 상에 위치한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 확인된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, DNA) 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 바이러스 같은 세포내 병원성 감염을 치료하는데 유용하다. 이러한 다른 조성물은 특정 암을 치료하는데 유용하다. 이러한 다른 조성물은 특정 세포외 병원체를 치료하는데 유용하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1쇄 또는 제2쇄로부터 선택되는 일본쇄 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 확인된 일본쇄 폴리뉴클레오타이드 서열, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, DNA) 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은, 숙주 세포를 상기 기술된 이본쇄 DNA 분자 또는 이의 일본쇄로 형질감염시키는 단계, 및 이로써 숙주 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 전사되는 비정상적인 폴리뉴클레오타이드 서열의 형성을 억제시키는 단계를 포함하여, 숙주 세포내에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현 효율을 증강시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 영역의 형성을 예방하도록 변형된, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 리보핵산의 서열을 포함하는 일본쇄 RNA 분자를 제공한다. 한 가지 구체적인 양태에서, 상기 분자는 5' 캡을 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 상기 분자를 캡을 갖지 않는다. 또 다른 구체적인 양태에서, 상기 분자는 3' 폴리A 꼬리를 갖는다. 또 다른 구체적인 양태에서, 상기 분자는 폴리A 꼬리를 갖지 않는다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 확인된 일본쇄 RNA 분자, 세포내에서 RNA 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 상기 기술된 일본쇄 RNA 분자로 형질감염시키는 단계, 및 이로써 숙주 세포내에서 비정상적인 RNA의 형성을 억제시키는 단계를 포함하여, 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현 효율을 증강시키는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드 분자 중 하나, 세포내에서 DNA 또는 RNA 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여함을 포함하여, 포유동물 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 상동성인 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자로 형질감염시킨 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 의도하지 않은 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방하는 방법을 제공한다.
한 가지 구체적인 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 조성물 또는 분자는 시험관내 효소적 합성법 또는 화학적 합성법으로 제조된다. 또 다른 구체적인 양태에서, 상기 조성물 또는 분자는 재조합체 배양물, 예를 들면, 세균 세포에서 생성시키고 이로부터 분리시키며, 하기 논의되는 방법에서 사용할 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, 상기 조성물은 숙주 세포로 전달 후 생체내에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 생성시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 또는 다른 연구 분석에서의 사용을 위해서 시험관내에서, 또는 치료 또는 다른 의학적 용도를 위해서 숙주 환자에게 복귀시키기 위해 생체외에서, 숙주 세포 또는 조직에서 바람직하지 않은 폴리뉴클레오타이드 발현을 감소 또는 억제시키기 위한 시약으로서와 같이, 연구 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태들은 이의 바람직한 구체적인 양태에 대한 하기 상세한 설명에서 추가로 기술된다.
본 발명은 바람직하지 않은 폴리핵산 서열의 발현을 감소시킴으로써 숙주 세포에서 폴리핵산 서열 발현의 효율을 증강시키는데 유용한 방법 및 폴리뉴클레오타이드 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상기 조성물을 사용함으로써 비정상적인 DNA 및 RNA 서열의 발현을 예방하기 위한 신규한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1A는 5' 종결인자 서열(T1), 프로모터(P), 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열(PN), 폴리아데닐화 서열(pA), 3' 종결인자 서열(T2)를 갖는 제1 "센스" 쇄, 및 본원의 경우에 센스 쇄 상의 폴리A 서열에 대해서 3'쪽에 위치하는 제2쇄 종결인자 서열(T3)을 함유하는 제2 상보쇄를 함유하는 본 발명의 이본쇄 DNA 분자의 예시이다. 제1 또는 제2쇄 중 하나를 본 발명의 일본쇄 DNA 분자로서 사용할 수 있다.
도 1B는 두 개의 5' 종결인자 서열(T1및 T2), 프로모터(P), 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열(PN), 폴리아데닐화 서열(pA), 3' 종결인자 서열(T3) 및 RNA 불안정성 서열(RIS)을 갖는 제1 "센스" 쇄, 및 제1쇄 상의 발현 카셋트에 상보적이지 않은 영역내에 점재하는 다수의 제2쇄 종결인자 서열(T4내지 T8)을 함유하는 제2 상보쇄를 함유하는 본 발명의 또 다른 이본쇄 DNA 분자의 예시이다. 이러한 경우, 종결인자 T4및 T5는 센스 쇄 상의 폴리A 서열에 대해서 하류 위치에 위치하며, 종결인자 T6내지 T8은 센스 쇄 상의 프로모터(P)에 대해서 상류 위치에 위치한다. 제1 또는 제2쇄 중 하나는 본 발명의 일본쇄 DNA 분자로서 사용할 수 있다.
도 1C는 프로모터(P)의 5'쪽에 위치하는 자물쇠(padlock) 종결인자(PT) 및 또 다른 종결인자(T2), 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 폴리아데닐화 서열(pA), 3' 종결인자 서열(T3)을 갖는 제1 "센스" 쇄, 및 제1쇄 상의 발현 카셋트 영역에 상보적이지 않은 영역에 점재하는 다수의 제2쇄 종결인자 서열(T4내지 T6)을 함유하는 제2 상보쇄를 함유하는 본 발명의 또 다른 이본쇄 DNA 분자의 예시이다. 이러한 경우, 종결인자 T4및 T5는 센스 쇄 상의 폴리A 서열에 대해 하류 위치에 위치하며, 종결인자 T6은 센스 쇄 상의 프로모터(P)에 대해서 상류 위치에 위치한다. 제1 또는 제2쇄 중 하나를 본 발명의 일본쇄 DNA 분자로서 사용할 수 있다.
도 1D는 자물쇠 종결인자(PT)가 선택된 폴리뉴클레오타이드(PN) 서열 내부에서 센스 쇄 상에 위치한다는 것을 제외하고는, 도 1C에서 기술된 바와 같이 위치된 다수의 종결인자를 갖는 본 발명의 또 다른 이본쇄 DNA 분자의 예시이다.
도 2A는 서열 A의 역위된 상보적인 반복체(서열 B)를 함유하는 시험관내 제조된 RNA 분자를 예시하는 도식이며, 이는 그 자체로 염기쌍을 형성하고 다시 폴딩되어 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 RNA를 형성할 수 있다. 이러한 도식에서, 코돈 GCC는 Ala를 암호화하며, AAG는 Lys를 암호화하며, CUU 및 UUG 모두는 Leu를 암호화하며, GGC 및 GGA 모두는 Gly를 암호화한다.
도 2B는 역위된 상보적인 반복체를 제거하도록 워블 염기(wobble bases, 즉, 변형되는 경우, 코돈을 변화시키지만 암호화된 아미노산은 변화시키지 않는 코돈내 뉴클레오타이드들)를 변화시키는 것을 예시하는 도식이다. 이러한 도식에서, 코돈 GCC는 Ala를 암호화하고, AAG는 Lys를 암호화하고, CUU 및 UUG 모두는 Leu를 암호화하며, GGC 및 GGA 모두는 Gly를 암호화한다. 하나의 상보적인 역위된 반복체 서열을 워블링시킴으로써, 염기쌍은 불완전해지며 안정한 이본쇄 분자를 형성하지 않게 한다.
도 3A는 작은 헤어핀 구조를 갖는 RNA 분자 및 내인성 RNA 의존성 RNA 폴리머라제의 작용 결과를 예시하는 도식이다.
도 3B는 3' 쇄 종결인자(*)를 갖는 변형된 동일한 분자 상에서의 효과를 예시하는 도식이다. 내인성 RNA 의존성 RNA 폴리머라제에 의한 헤어핀 구조의 어떠한 신장도 가능하지 않다.
도 4A는 DNA 이본쇄 플라스미드를 예시하는 도식이다.
도 4B는 종결인자 서열의 부재하에서 전사체가 도 4A의 플라스미드로부터 형성되는 방식을 예시하는 도식이다. 비정상적인 RNA 쇄가 플라스미드의 둘 모두의 쇄로부터 유도된다. 각각의 화살표는 전사 방향을 나타낸다. 이러한 전사체의 일부는 다른 전사체와 염기쌍을 형성하여 이본쇄 RNA를 형성할 수 있다.
도 4C는 둘 모두의 쇄 상에 종결인자를 갖는 이본쇄 DNA 플라스미드로부터 생성되는 전사체를 예시하는 도식이다. 암호화 쇄 상의 종결인자는*로 나타낸다. 비암호화 쇄 상의 종결인자는 0으로 나타낸다. 화살표는 전사 방향을 나타낸다.
도 5는 플라스미드의 제1(암호화) 쇄의 신장된 영역의 도식이다. 암호화 쇄 상의 종결인자는*로 나타낸다. 전사체가 플라스미드 DNA 상의 다양한 잠적 부위 (cryptic site)에서 개시될 수 있지만, 플라스미드 전역에 위치한 종결인자의 존재는 개시된 전사체가 종결인자를 통과하여 신장되는 것을 예방하며 결과적으로 DNA 이본쇄 플라스미드로부터 비정상적인 RNA 형성을 예방한다.
도 6은 실시예 1 내지 4에서 사용되는 플라스미드를 예시하며, 이는 호흡기 세포융합 바이러스 인핸서(RSVenh) 및 사람 사이토메갈로바이러스 프로모터(HCMV), 쥐 IL-12 p40 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 SV40 폴리아데닐화(polyA) 부위를 함유하는 발현 카셋트를 갖는다. 상기 플라스미드는 또한 카나마이신 내성 유전자(KanR) 및 복제 오리진(ori)을 함유한다. 제한 엔도뉴클레아제 효소 제한 부위는 각각의 뉴클레오타이드 위치 번호와 함께 나타낸다. 상기 플라스미드는 각각의 쇄에 대해서 4709 염기 길이이다.
도 7은 실시예 5에서 사용된 이본쇄 플라스미드를 예시하며, 이는 두 개의 프로모터, 즉 제1쇄로부터 한 방향으로 전사를 지시하는 원숭이 사이토메갈로바이러스(SCMV) 프로모터 및 제2쇄로부터 반대 방향으로 전사를 지시하는 HCMV 프로모터를 함유한다. 화살표는 전사 방향을 나타낸다. 종결인자 및 RNA 불안정성 서열은으로 나타내며, 제2쇄 상의 종결인자는 1이고, 제1쇄 상의 종결인자는 2이다. 영역 A는 도시된 바와 같이, 1및 2사이에 위치한다.
본 발명은 무척추 및 척추동물 종, 특히 포유동물 종에 영향을 미치는 질환 및 질병의 치료, 예방, 연구 및 진단을 위한 신규한 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 방법을 제공하며, 이의 목적은 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현 효율을 증강시키고 바람직하지 않은 또는 비정상적인 폴리뉴클레오타이드 종의 형성을 감소 또는 억제시키는 것이다. 이러한 조성물 및 방법은 또한 숙주 세포에서 천연적으로 생성되거나 이에 삽입되었을 수도 있는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열의 의도되지 않은 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방하고자 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 무척추 또는 척추동물 세포 또는 이러한 세포로 구성된 살아있는 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 사람, 가축(예를 들면, 돼지, 고양이 및 말), 동물원 동물들, 농장 및 연구실 동물, 뿐만 아니라 다른 척추동물, 예를 들면, 조류 종 및 어류, 및 이들의 세포에서의 효율에 대해서 의도된다. 본 발명은 또한 특히, 진핵 세포, 원핵 세포, 다른 무척추동물 세포에서 효율을 갖는다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 식물 세포, 및 가능하게는 다른 유기체에서 유용할 수 있다.
이러한 조성물 및 방법은 시험관내, 생체외 및 생체내에서의 용도를 갖는다.예를 들면, 본 발명이 특히 시험관내에서 유용한 세포는 간 세포(stem cell), 안정한 세포주 및 일차 세포(primary cell)를 포함한다. 본 발명이 특히 생체외에서 유용한 세포는 간 세포 및 일차 세포를 포함한다. 상기 세포 유형 모두가 본원의 방법 및 조성물의 생체내 적용을 위해서 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 방법은 추가로 치료학적, 백신, 진단 또는 연구 목적을 달성하기 위해서 세포의 분자 메카니즘을 조절할 수 있다.
I. 본 발명의 DNA 분자
본 발명의 목적을 달성하는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 분자의 한 가지 구체적인 양태는 제1 "암호화" 쇄 및 상보적인 "전사 주형" 제2쇄로 형성된 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 DNA 분자이며, 이들은 하기 상세히 기술된다. 본원에서 사용된 바와 같고 특별히 언급되지 않는 한, 용어 "상보적인"이란 이본쇄 DNA를 인용하는 이의 통상적인 의미이며, 즉, 제1쇄의 모든 퓨린, 아데닌(A) 및 구아닌(G)에 있어서, 제2쇄는 상응하는 위치에서 피리미딘, 즉 제1쇄의 모든 A와 수소 결합하는 티미딘(T) 또는 유리딘(U), 또는 제1쇄의 모든 G와 수소 결합하는 시토신(C)을 갖는다.
이러한 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 분자는 세포내에서 발현시키기 위해 세포내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하도록 디자인된 DNA 벡터, DNA 플라스미드 또는 모든 이본쇄 DNA 작제물일 수 있다. 이러한 이본쇄 분자는 한 가지 구체적인 양태에서는 선형이며, 또 다른 구체적인 양태에서는, 이러한 이본쇄 분자는 환형이다. 본 발명의 DNA 분자는 RNA polI, RNA polII 또는 RNA polIII의 조절하의 서열을 함유하는 이본쇄 플라스미드 또는 벡터일 수 있으며, 이는 본 발명에 따라서 세포내에서 RNA 분자로 전사될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터가 RNA polII 프로모터인 경우, RNA 분자를 암호화하는 서열은 넌센스 mRNA 감시 분해 메카니즘을 통한 핵내에서의 분해를 회피하기 위해서 약 300개 뉴클레오타이드 이상의 개방 판독 프레임을 가진다. 상기 플라스미드 또는 벡터는 세균, 바이러스 또는 파아지로부터의 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 염색체성, 에피솜성 및 바이러스 유도된 벡터, 예를 들면, 세균 플라스미드, 박테리오파아지, 효모 에피솜, 효모 염색체 요소 및 바이러스로부터 유도된 벡터, 이의 조합물로부터 유도된 벡터, 예를 들면, 플라스미드 및 박테리오파아지 유전자 요소, 코스미드 및 파아지미드로부터 유도된 벡터를 포함한다. 따라서, 한 가지 예시적인 벡터는 이본쇄 DNA 파아지 벡터이다. 또 다른 예시적인 벡터는 이본쇄 DNA 바이러스 벡터이다.
본 발명의 DNA 분자의 또 다른 구체적인 예는 예를 들면, 이본쇄 DNA 분자의 제1 또는 제2쇄 중 하나를 포함하는 일본쇄 DNA 서열이다. 이러한 쇄들은 하기에서 상세히 기술된다. 일본쇄 DNA 분자는 또한 합성할 수 있으며, 상기 일본쇄가 제2 상보쇄 상에 존재하는 모든 종결인자 서열의 상보체를 형성하는 서열을 포함하여, 하기 상세히 기술되는, 제1 암호화 쇄에 대한 모든 정보를 암호화하도록 디자인된다. 대안으로, 일본쇄 DNA 분자는 또한 비암호화 또는 전사 주형 제2쇄로서 합성될 수 있다. 이러한 제2쇄는 상기 일본쇄가 제1쇄의 일부를 형성하는 종결인자 서열의 상보체 뿐만 아니라 이러한 비암호화 서열 상에 존재하는 종결인자 서열을 형성하는 서열을 포함하여, 하기 상세히 기술되는, 제1(암호화) 쇄에 대한 모든 상보적인 정보를 암호화하도록 디자인된다. 상기 일본쇄 분자는 DNA 벡터, 박테리오파아지 M13으로부터 분리된 것 같은 환형 일본쇄 DNA, 또는 세포내에서 발현되도록 세포내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하도록 디자인된 모든 일본쇄 DNA 작제물일 수 있다. 이본쇄 분자에 대해서 상기 언급된 바와 같이, 일본쇄 플라스미드 또는 벡터는 세균, 바이러스 또는 파아지로부터의 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 한 가지 예시적인 분자는 일본쇄 DNA 파아지 벡터이다. 또 다른 예시적인 분자는 일본쇄 DNA 바이러스 벡터이다. 이러한 일본쇄 분자는 한 가지 구체적인 양태에서는 선형이며, 또 다른 구체적인 양태에서는, 이러한 일본쇄 분자는 환형이다.
이러한 DNA 분자는 상기 작제물로부터 바람직하지 않은 서열의 발현을 감소시키는 반면, 효과적인 방식으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 생체내, 생체외 및 시험관내 발현을 위해서 사용될 수 있다.
A. 제1쇄
본 발명의 이본쇄, 부분적인 이본쇄 또는 일본쇄 분자는 발현 카셋트 서열 하나 이상을 포함하는 제1쇄(또한 센스 또는 암호화 쇄로서 인용됨)를 포함한다. 제1쇄가 비시스트론성(bicistronic)인 경우, 이는 하나 이상의 발현 카셋트 서열을 함유한다. 통상적으로, 상기 발현 카셋트 서열은 숙주 세포내에서 이의 전사를 가능하게 하는 방식으로 조절 성분에 작동적으로 결합된 선택된 폴리뉴클레오타이드서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "작동적으로 결합된" 서열은 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열과 인접하는 발현 조절 서열 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 조절하는 트랜스적으로 또는 먼 거리에 떨어져서 작용하는 발현 조절 서열 모두를 포함한다. 따라서, 발현 카셋트는 최소한, 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 폴리아데닐화(polyA) 부위를 함유한다.
다른 발현 조절 서열은 적합한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 시그날 같은 효과적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질성 mRNA를 안정화시키는 서열; 전사 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 바람직한 경우, 암호화된 생성물의 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 바람직하게는, DNA 작제물의 제1쇄는 추가로 핵 국재화 시그날을 제공하며, 이는 전사되는 경우, 상기 분자로 형질감염시킨 세포의 핵으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 표적화시킨다. 적합한 핵 국재화 시그날은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있으며, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다[참조, 예를 들면, D. A. Dean, Exp. Cell Res., 230(2): 293-302 (Feb. 1, 1997)].
본 발명의 목적을 위해서, 적합한 프로모터는 본 발명에서 사용하기 위해서, 당해 분야에 공지된 구성성, 유도성 및/또는 조직-특이적인 프로모터 중에서 선택된다. 본 발명의 한 가지 구체적인 양태에서, 발현 카셋트에서 사용되는 프로모터는 바람직하게는 약한 프로모터, 예를 들면, 선택된 숙주 세포에서 천천히 개시되는 프로모터이며, 한 가지 예로서, 특정 경우에 아데노-관련된 바이러스 LTR에서의약한 프로모터이다. 유용한 구성성 프로모터의 예는 레트로바이러스성 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인해서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)[참조, 예를 들면, Boshart et al, Cell, 41: 521-530 (1985)], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EF1α프로모터 (제조원: Invitrogen)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유도성 프로모터는 외인성으로 공급된 화합물에 의해 조절되며, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7폴리머라제 프로모터 시스템[국제 특허원 WO 제98/10088호], 엑디손 곤충 시스템[No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], 테트라사이클린-억제성 시스템[Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)], 테트라사이클린-유도성 시스템[Gossen et al, Science, 268: 1766-1769 (1995), 또한 참조: Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)], RU486-유도성 시스템[Wang et al, Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) and Wang et al, Gene Ther., 4: 432-441 (1997)], 및 라파마이신-유도성 시스템[Magari et al, J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]을 포함한다.
발현 카셋트의 모든 성분은 유전공학 분야에서 사용되는 통상적으로 사용되는 프로모터 및 조절 서열 중에서 용이하게 선택할 수 있다. 문헌 참조[Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual.", Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 및 당해 분야의 다른 교재들]. 발현 카셋트 성분의 선택은 본 발명을 제한하지 않는다.
유사하게 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료학적 용도, 예방학적 용도, 유전자요법 용도, 또는 연구 또는 진단 용도를 위해서 관심있는 폴리펩타이드, 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하고, 관심있는 생물학적 기능을 수행하며 세포내에서 시험관내, 생체외 또는 생체내적으로 우선적으로 및 효과적으로 발현되도록 요망되는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 수 많은 상기 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 치료 또는 예방하고자 하는 조건에 따라서 당해 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 선택은 수득된 분자의 사용처에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 한 가지 유형의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 리포터 서열을 포함하며, 이는 발현시 검출가능한 시그날을 생성시킨다. 상기 리포터 서열은 β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 막 결합 단백질(예를 들면, CD2, CD4, CD8 포함), 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 및 당해 분야에 공지된 다른 것들을 암호화하는 DNA 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않으며, 이에 대해 지시된 고친화도 항체가 존재하거나 통상적인 수단으로 생성될 수 있으며, 특히 헤마글루티닌 또는 Myc로부터의 항원 태그 도메인에 적합하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질이 있다.
이의 발현을 구동시키는 조절 인자와 결합되는 경우, 이러한 서열들은 효소적, 방사선사진술적, 비색계적, 형광적 또는 다른 분광사진술적 분석, 형광 활성화세포 분류 분석 및 면역학적 분석[효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사능 면역 분석(RIA) 및 면역조직화학 분석 포함]을 포함하는 통상적인 방법으로 검출가능한 시그날을 생성시킨다. 예를 들면, 마커 서열이 LacZ 유전자인 경우, 헬퍼 바이러스의 존재는 베타-갈락토시다제 활성에 대한 분석으로 검출된다. 선택된 폴리뉴클레오타이드가 루시퍼라제인 경우, 헬퍼 바이러스는 발광계에서 빛 생성으로 측정할 수 있다.
그러나, 바람직하게는, 선택된 폴리뉴클레오타이드는 생물학 및 의학에서 유용한 생성물, 예를 들면, 단백질, 펩타이드, 안티센스 핵산(예를 들면, RNA), 효소, 또는 촉매적 RNA를 암호화하는 비-마커 서열이다. 선택된 폴리뉴클레오타이드는 유전자 결함을 교정하거나 경감시키기 위해서 사용할 수 있으며, 이러한 결함은 정상적인 유전자가 정상적인 수준 미만으로 발현되는 결함 또는 기능적인 유전자 생성물이 발현되지 않는 결함을 포함할 수 있다. 바람직한 유형의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포에서 발현되는 치료학적 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화한다. 본 발명은 추가로 예를 들면, 다중-서브유니트 단백질에 의해 야기되는 유전자 결함을 교정하거나 경감시키기 위해서 다수의 선택된 폴리뉴클레오타이드를 사용함을 포함한다. 특정 상황에서, 상이한 선택된 폴리뉴클레오타이드를 단백질의 각각의 서브유니트를 암호화하거나 상이한 펩타이드 또는 단백질을 암호화하기 위해서 사용할 수 있다. 이는 단백질 서브유니트를 암호화하는 DNA의 크기가 큰 경우, 예를 들면, 면역글로불린, 혈소판-유래 성장 인자 또는 디스트로핀 단백질의 경우 바람직하다. 세포가 다중-서브유니트 단백질을 생성하게 하기 위해서, 세포를 상이한 서브유니트 각각을 함유하는 재조합 바이러스로 감염시킨다. 대안으로, 단백질의 상이한 서브유니트를 동일한 선택된 폴리뉴클레오타이드로 암호화할 수 있다. 이러한 경우, 단일의 선택된 폴리뉴클레오타이드는 내부 리보솜 도입 부위(IRES)에 의해 분리되는, 서브유니트 각각을 암호화하는 DNA를 포함한다. 이는 서브유니트 각각을 암호화하는 DNA의 크기가 작은 경우, 예를 들면, 서브유니트 및 IRES를 암호화하는 전체 DNA가 5 킬로염기 미만인 경우 바람직하다. 그러나, 선택된 폴리뉴클레오타이드는 연구에 바람직한 모든 생성물을 암호화할 수 있다. 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 선택은 본 발명을 제한하지 않는다.
선택된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 다른 유용한 생성물은 호르몬, 성장인자 및 분화인자, 예를 들면, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출인자(GRF), 여포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 사람 융모막 고나도트로핀(hCG), 혈관 내피 성장인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 결장 자극 인자(GCSF), 에리트로포이에틴(EPO), 결합조직 성장인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF), 표피 성장인자(EGF), 전환 성장인자 α(TGFα), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGFβ를 포함하는 전환 성장인자 β슈퍼패밀리 중 하나, 액티빈, 인히빈, 또는 골 형태형성 단백질(BMP) BMP1 내지 15 중 하나, 성장인자의 헤레귤린/뉴레귤린/ARIA/neu 분화 인자(NDF) 패밀리 중 하나, 신경 성장인자(NGF), 뇌-유래 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 모양체 향신경성 인자(CNTF), 신경교 세포주 유래 향신경성 인자(GDNF), 뉴튜린, 아그린, 세마포린/콜라프신 패밀리 중 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 호저 및 티로신 하이드록실라제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 유용한 선택된 폴리뉴클레오타이드 생성물은 면역계를 조절하는 단백질, 예를 들면, 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨(IL) IL-1 내지 IL-17, 단핵구 화학주성 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 결장 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β및 γ, 간 세포 인자, flk-2/flt3 리간드 같은 사이토킨 및 림포카인을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 면역계에 의해 생성되는 유전자 생성물이 또한 본 발명에 유용하다. 이는 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 사람화된 항체, 단일쇄 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일쇄 T 세포 수용체, MHC I형 및 II형 분자, 뿐만 아니라 유전자 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유용한 유전자 생성물은 또한 보체 조절 단백질, 예를 들면, 보체 조절 단백질, 막 조인자 단백질(MCP), 붕괴 촉진 인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59를 포함한다.
또 다른 유용한 선택된 폴리뉴클레오타이드는 호르몬, 성장인자, 사이토킨, 림포카인, 조절 단백질 및 면역계 단백질의 수용체 중 하나 같은 생성물을 생산할 수 있다. 선택된 폴리뉴클레오타이드는 저밀도 지단백질(LDL) 수용체, 고밀도 지단백질(HDL) 수용체, 초저밀도 지단백질(VLDL) 수용체, 스캐빈져 수용체를 포함하는, 콜레스테롤 조절을 위한 수용체일 수 있다. 본 발명에서 유용한 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한, 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 다른 핵 수용체를 포함하는 스테로이드 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 구성원 같은 생성물을 암호화한다. 또한, 유용한 폴리뉴클레오타이드 서열은 jun, fos, max, mad, 혈청 반응 인자(SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD 및 마이오게닌 ETS-box 함유 단백질들, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자(IRF-1), 윌름스 종양 단백질, ETS-결합 단백질, STAT, GATA-박스 결합 단백질, 예를 들면, GATA-3, 및 익상 헬릭스 단백질의 포크헤드 패밀리를 암호화하는 서열을 포함한다.
발현 카셋트의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있는 다른 유용한 생성물은 카바모일 신테타제 I, 오르니틴 트랜스카브아밀라제, 아르기노석시네이트 신테타제, 아르기노석시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 하이드롤라제, 페닐알라닌 하이드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 측쇄 케토산 데카복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카복실라제, 메틸 말로닐 CoA 무타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카복실라제, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 트랜스막 조절인자(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열을 포함한다.
또 다른 유용한 폴리뉴클레오타이드-암호화된 생성물은 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 함유하는 비천연 아미노산 서열을 갖는 키메라 또는 하이브리드 폴리펩타이드 같은 비천연 폴리펩타이드, 예를 들면, 단일쇄 유전자 조작된 면역글로불린, 안티센스 분자 및 촉매적 핵산(예를 들면, 리보자임)을 포함한다. 또 다른 적합한 폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 선택은 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 하기 실시예에서 나타낸 바와 같이, 예시적인 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 쥐 인터류킨-12를 암호화하는 서열이다.
제1쇄의 일부로서 하나 이상의, 및 바람직하게는 두 개 이상의, 및 바람직하게는 세 개 이상의 전사 종결인자 서열을 갖는다. 전사 종결인자는 전사가 DNA 주형("제2") 쇄 상의 발현 카셋트내에서 방해되지 않고 진행될 수 있으며 발현 카셋트내 폴리뉴클레오타이드 서열의 생물학적 기능이 발현시 악영향을 받지 않는 한, 발현 카셋트 서열내를 포함하여, DNA 암호화(즉, 비-전사된) 쇄 상의 모든 부위에 위치할 수 있다. 본질적으로, 전사가 제2 "주형" 쇄의 하나 이상의 발현 카셋트 상보적인 영역(들)로부터 일어날 수 있으며 발현된 단백질 또는 펩타이드가 이의 생물학적 기능을 유지하는 한, 전사 종결인자를 도입하기 위하여 제1쇄에 어떠한 변형도 가능할 수 있다. 바람직한 전사 종결인자는 주형 쇄의 전사를 방해하는 어떠한 2차 구조도 생성시키지 않는다. 이러한 종결인자 서열의 기능은, DNA 분자의 이러한 쇄들이 숙주 세포내에 존재하는 경우, 제1쇄로부터 생성되는 바람직하지 않은 전사 및 또한 상보적인 제2 전사 주형 쇄로부터의 바람직하지 않은 전사를 예방하는 것이다. 중요하게, 이러한 제1쇄 전사 종결인자는 제2 주형 쇄로부터 또는 비시스트론성 분자의 제1쇄로부터 전사시키고자 하는 발현 카셋트로부터의 필요한전사를 방해하거나 혼란시킬 수 없다. 예를 들면, 이러한 종결인자 서열의 기능은 숙주 세포내에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 상동성인 경우, 숙주 세포내에서 이의 정상적인 전사를 종결시키거나 저발현 조절할 수 있는 바람직하지 않은 전사체의 형성을 예방하는 것이다. 추가로, 이러한 종결인자의 기능은 프로모터의 물리적인 폐쇄를 예방하여, 이로써 선택된 폴리뉴클레오타이드의 발현 효율을 증가시키는 것이다. 제1쇄가 비시스트론성(즉, 두 개 이상의 발현 카셋트를 함유하거나, 각각의 쇄가 발현 카셋트를 함유한다)인 경우, 동일한 제약이 종결인자 서열(들)의 확인 및 배치시 야기된다.
각각의 제1쇄에서 사용되는 종결인자 서열의 수에 따라서, 각각의 종결인자 서열은 동일하거나 상이한 종결인자 서열일 수 있다. 한 가지 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 세균성 종결인자, 예를 들면, 5S 리보솜성 RNA 종결인자, rrnB일 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 세균성 종결인자, 예를 들면, 트립토판 오페론 종결인자, trpA일 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 박테리오파아지 종결인자, 예를 들면, 람다 5S RNA 종결인자 또는 박테리오파아지 P1 헤드 단백질 종결인자일 수 있다. 폴리A 부위의 3'쪽에 위치하는 사용될 수 있는 또 다른 바람직한 종결인자 서열은 문헌[P. Enriquez-Harris et al, EMBO J., 10(7): 1833-1842 (1991)]에 기술된 바와 같은 RNA polII에 대한 진핵성 정지 부위이다. α-글로빈 종결인자는 RNA polII에 대한 종결인자의 한 예이며, 또한 상기 분자의 제1쇄에서 종결인자 서열로서 사용될 수 있다. 추가로, 문헌[N. Chodchoy et al, Mol. Cell Biol., 11(1): 497-509 (Jan. 1991)]에 기술된바와 같은 히스톤 mRNA 프로세싱 시그날이 제1쇄를 위한 유용한 종결인자 서열이다. 유사하게, 포유동물 가스트린 유전자에 대한 종결인자, 가스트린 종결인자가 또한 유용하다. 또 다른 유용한 종결인자 서열은 상기 기술된 바와 같은, 리보자임 절단 부위 및 뒤이은 종결 부위 종결인자 서열을 제공하는 폴리핵산 서열이다. 제1쇄에서 사용하기 위한 다른 종결인자 서열은 리보핵산 절단 부위 및 뒤이은 3'쪽 종결 부위 종결인자 서열을 포함한다. rho-의존성 종결인자[예를 들면, C.E. Bogden et al, Mol. Cell. 3: 487-493 (Apr. 1999)] 및 rho-비의존성 종결인자[예를 들면, I. Gusarov and E. Nudler, Mol. Cell. 3: 495-504 (Apr. 1999)] 모두가 또한 제1쇄에서 상기 목적으로 사용될 수 있는 서열이다.
부가적으로, 문헌[M. Nilsson et al, Science, 265:2085-2088 (1994)]에 기술된 소위 "자물쇠 프로브"가 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 DNA 분자에 있어서 유용한 종결인자이다. 자물쇠는 자물쇠의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 및 제1쇄의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 사이에서의 하이브리드화에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 분자에 부분적으로 결합된 환형 일본쇄 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 도 1C 및 1D를 참조한다.
DNA 분자의 상기 제1쇄에서, 상기 기술된 종결인자 서열 하나 이상은 바람직하게는 프로모터의 5'쪽에 위치한다. 바람직하게는, 이러한 제1쇄 종결인자 서열은 프로모터의 5'쪽 1 내지 50번째 염기 사이에 위치한다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 이러한 제1쇄 종결인자 서열은 프로모터의 5'쪽 20 내지 40번째 뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 이러한 제1쇄 종결인자 서열은 프로모터의 5'쪽 10 내지 30번째 뉴클레오타이드 사이에 위치한다. 따라서, 한 가지 구체적인 양태에서, 자물쇠 종결인자(또는 다른 적합한 종결인자 또는 리보핵산 가수분해적 또는 촉매적 부위의 상보체)는 제1쇄의 5' 비해독 영역내에 존재할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 상기 목록으로부터 독립적으로 선택된, 제1쇄 종결인자 서열은 발현 카셋트 외부에서 폴리A 부위의 3'쪽에 위치한다. 이러한 제1쇄 종결인자 서열은 바람직하게는 발현 카셋트의 폴리A 부위로부터 3'쪽으로 적어도 100 내지 150번째 뉴클레오타이드에 위치하거나, 폴리A 서열의 말단 바로 뒤에 위치한다. 따라서, 또 다른 구체적인 양태에서, 자물쇠 종결인자(또는 다른 적합한 종결인자 또는 리보핵산 가수분해적 또는 촉매적 부위의 상보체)는 제1쇄의 3' 비해독 영역내에 존재할 수 있다.
추가로, 또 다른 구체적인 양태에서, 5' 및 3' 종결인자 서열은 제1쇄 상의 발현 카셋트에 인접하여 사용된다.
DNA 분자의 제1쇄의 또 다른 구체적인 양태에서, 발현 카셋트에 인접한 5' 및 3' 종결인자 서열에 부가하여, 부가적인 선택적인 종결인자 서열이 발현 카셋트 서열의 외부에서 제1쇄 상에 위치한다. 본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 하나 이상의 RNA 불안정성 서열[예를 들면, 참조: A.M. Curatola et al, Mol. Cell. Biol., 15(11): 6331-6340 (Nov. 1995); A.M. Zubiaga et al, Mol. Cell. Biol., 15(4): 2219-2230(Apr. 1995)]이 제1쇄 상에, 바람직하게는 발현 카셋트 서열 외부에 위치한다. 바람직하게는, RNA 불안정성 서열의 상보체는 3' 인접 종결인자 서열의 3'쪽에 또는 5' 인접 종결인자 서열의 5'쪽에 위치한다. 도 1A 내지 1D는 바람직한 구체적인 양태들의 몇몇 예를 도시한다.
또 다른 구체적인 양태에서, 자물쇠 종결인자(또는 다른 적합한 종결인자 또는 리보핵산 가수분해적 또는 촉매적 부위의 상보체)는 발현 카셋트내에 위치하며, 보다 특히 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열내에 위치한다. 예를 들면, 도 1D에서, 자물쇠 종결인자는 폴리뉴클레오타이드 서열의 암호화 서열내에 위치한다. 이러한 위치에 존재하는 경우, 종결인자 서열은 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄의 부분으로부터의 전사를 방해하지 않거나, 발현된 단백질의 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는다. 다시 말해, 제1쇄내 종결인자 서열의 존재는 제2쇄로부터의 전사를 방해 또는 지체시킬 수 없으며, 결과적으로 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은, 제1쇄 종결인자 서열의 위치에 관계없이, 항상 정확하게 전사되고 발현되며, 이의 생물학적 기능을 유지한다. 이러한 위치에서, 제2쇄로부터의 전사를 방해하지 않거나 발현된 단백질의 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는다는 조건하에서, 암호화 영역내 종결인자 서열은 상기된 자물쇠 프로브를 포함하여 상기 확인된 종결인자 중 어느 하나일 수 있다.
선택적인 또는 부가적인 구체적인 양태로서, 제1쇄는 ATG(개시 코돈) 또는 코작 영역의 도입을 초래하는 어떠한 변형도 회피한다. 상기 변형은 단독으로 또는 협력적으로, 안티센스 RNA의 바람직하지 않은 전사를 이상적으로 예방할 것이다. 그러나, 가능하다면, ds RNA의 형성에 대한 부가된 보증은 암호화 쇄내 하나 이상의 부위에서 RNA 불안정성 서열의 상보체를 부가함으로써 달성시킬 수 있다.이러한 쇄로부터 부적절하게 형성된 모든 바람직하지 않은 안티센스 RNA는 RNA 분해를 촉진하는 불안정성 서열을 함유하게 되어 센스 RNA와 하이브리드화되는데 사용될 수 없게 될 것이다.
한 가지 바람직한 변형으로서, DNA 분자의 제1쇄는 쇄 상의 임의의 부위에 위치된 7개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드의 모든 역위된 상보성 반복체 서열이 결여된다. 한 가지 예로서, 제1쇄가 예를 들면, ATGCTTA의 서열을 함유하는 경우, 제1쇄 상의 어떤 부위에서도 TAAGCAT의 역위된 상보적인 서열은 존재하지 않는다. 역위된 상보적인 반복체 서열의 이러한 결여는 포유동물 숙주 세포의 정상적인 체온인 37℃에서 동일한 쇄 상의 서열의 바람직하지 않은 내부 염기쌍 형성을 회피한다. 이는 DNA 분자가 숙주 세포내에서 RNA로 전사되거나 제1쇄가 일본쇄 DNA 분자인 경우 특히 중요하다. 또 다른 선택적인 구체적인 양태에서, DNA 분자의 제1쇄는 쇄 상의 임의의 위치에서 4개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드의 모든 역위된 상보적인 반복체 서열이 결여된다. 역위된 상보적인 반복체 서열의 이러한 결여는 특정 무척추동물 종의 숙주 세포의 저체온에서 동일한 쇄 상의 서열의 바람직하지 않은 내부적 염기쌍 형성을 회피한다.
본 발명의 DNA 분자의 제1쇄의 또 다른 구체적인 양태로서, 제1쇄내의 "워블" 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열을 변형시키며 서열내의 역위된 상보적인 반복체를 예방 또는 제거하기 위해서 조작될 수 있다. 상기 워블 뉴클레오타이드는 일반적으로 대부분의 코돈의 제3 염기 위치에 존재하지만, 제1 또는 제2 위치에 위치할 수도 있다. 이러한 방식의 상기 반복체의 제거는 DNA가 안정한 이본쇄영역을 형성하거나 본질적인 숙주 폴리뉴클레오타이드 서열에 상동성이거나 역위된 상보적인 반복체를 나타내게 되는 비정상적인 RNA 구조로 전사되는 것을 회피하게 한다. 선택적으로, 본 발명의 DNA 분자의 제1쇄의 구체적인 양태는, 분자내 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포내에 이미 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 매우 상동성일 가능성이 있는 경우, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1쇄의 부분에서, 실질적으로 모든 코돈의 워블 뉴클레오타이드를 변형시키는 것과 관련된다. 암호화된 아미노산을 변화시키지 않고 코돈을 변화시키는 그러한 염기를 변화시킴으로써, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 동일한 아미노산 서열을 암호화하게 되지만, 숙주 세포 또는 숙주 유기체내에서 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동성이 아닌 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. "워블된" 코돈내 이러한 비상보성 영역은 숙주 세포내 DNA 분자로부터 제조된 전사체가 형질감염된 숙주 세포의 천연 또는 본질적인 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열을 바람직하지 않게 또는 의도하지 않는 바대로 전사 종결 또는 저발현 조절하게 되는 것을 예방한다. 도 2A 및 2B를 참조한다. "실질적으로 모든" 워블 염기라는 것은 선택된 폴리뉴클레오타이드 및 숙주 세포내 모든 폴리뉴클레오타이드 사이에서 상동성을 파괴하여 숙주 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 종결을 예방하기에 충분하게 코돈을 워블링(wobbling)시킴을 의미한다.
DNA가 재조합적으로 생성되는 경우, 워블 염기는 숙지된 돌연변이 기술로 변형시킬 수 있다. DNA가 합성되는 경우, 워블 코돈 염기들은 정교하게 제조되어 의도된 숙주 세포 또는 유기체내 천연 서열과의 일치를 회피하게 된다. 상기 논의된비정상적인 RNA 구조가 회피되는 한, 워블 염기는 선택된 숙주 세포내에서 발현하기 위한 코돈을 최적화시키기 위해서 바람직한 코돈을 도입하도록 선택할 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,786,464호, 이는 바람직한 코돈의 선택을 교시한다]을 참조한다.
본원에서 사용되고 당해 분야에 공지된 바와 같이, 용어 "상동성" 또는 "상동성의"는 두 개의 길이의 상기 서열 사이에서 일치성을 확인함으로써 측정되는 바와 같이, 두 개의 폴리펩타이드 또는 두 개의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에서의 서열 연관도를 의미한다. 동일성 및 상동성 모두는 선행 기술에서 현존하는 방법들로 용이하게 측정할 수 있다[예를 들면, 참조: COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, (1988); BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academics Press, New York, (1993); COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Griffin, A. M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, (1994); SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, (1987); and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, (1991)]. 두 개의 서열 사이에서 동일성 또는 상동성을 측정하기 위해서 흔히 사용되는 방법은 문헌[GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and H. Carillo and D. Lipton, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1998)]에 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 동일성 또는 상동성을 측정하는 바람직한 방법은 시험된 두 개의 서열 사이에서 최대의 일치를 제공하도록 디자인된다. 두 개의 서열 사이에서 동일성 또는 상동성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지로부터의 알고리듬 BESTFIT[J. Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12(1): 387 (1984)], 관련된 MACVECTOR 프로그램(Oxford), 및 FASTA(Pearson) 프로그램을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 컴퓨터 프로그램을 사용하여 본 발명에 사용하기에 바람직한 적합한 DNA 및 RNA 분자를 디자인할 수 있다. 특정 DNA 또는 RNA 분자에 있어서 필요한 상기 알고리듬 및/또는 상동성 정도는 당해 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 본 명세서의 교시 및 과학 문헌의 지식 범위를 고려하면, 필요한 상동성의 선택, 프로그램에 대한 디폴트 선택 및 상동성을 측정하는데 사용되는 프로그램의 선택은 당해 기술내에 속한다.
B. 제2쇄
본 발명의 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 DNA 분자, 또는 본 발명의 선택적인 일본쇄 DNA 분자는 바람직하게는 제2 "전사 주형" 쇄를 포함한다. 제2쇄는 세균내에서 생성된 플라스미드내에서 제1쇄에 통상적으로 100% 상보적이며, 이는 예를 들면, 쇄 중 하나 이상이 합성적으로 생성되고 실질적으로 상동성인 쇄와 혼합되는 경우와 같이, 필수적이지는 않다. 적합한 조건하에서 Tm이 두 쇄를 함께 위치시키기에 충분하게 두 쇄 사이에 상동성이 존재하는 경우, 제1쇄와 비상동성인 특정 영역이 제2쇄에 존재할 수 있다.
제2쇄는 제2쇄 상에서 개시되는 모든 전사를 종결시키는 제2쇄 종결인자 서열 하나 이상을 포함한다. 제2쇄 종결인자 서열은 발현 카셋트 서열에 상보적이지 않은 제2쇄의 서열내에서 제2쇄 상에 위치한다. 바람직하게는, DNA 분자의 제2쇄는 제2쇄 종결인자 서열 하나 이상을 함유한다. 보다 바람직하게는, 제2쇄는 발현 카셋트에 상보적인 서열 외부에서 제2쇄의 매 100개 뉴클레오타이드 마다 두 개 내지 한 개의 종결인자 서열을 함유한다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태는 제1쇄의 발현 카셋트에 상보적이지 않은 영역내에서 제2쇄의 매 500개 뉴클레오타이드 마다 하나의 종결인자 서열을 갖는다. 하나 이상의 제2쇄 종결인자 서열을 사용하는 경우, 다중 종결인자 서열은 상기 기술된 바와 같이, 발현 카셋트에 상보적이지 않은 제2쇄의 영역내에 산재할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 시스트론 또는 발현 카셋트내, 심지어 관심있는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드내를 포함하여, 제1 센스 쇄 상의 하나 이상의 위치에서 종결인자 서열을 포함하는 것이 바람직한 경우, 제2 안티센스 DNA 쇄는 mRNA로 전사될 필요가 있는 어느 정도의 비상동성을 가질 수 있다. 또 다른 구체적인 앙태는 제1쇄 상의 암호화 영역에 상보적인 영역의 외부에서 하나 이상의 전사 종결인자 또는 RNA 불안정성 서열을 함유하는 제2쇄이다. 제2 안티센스 쇄내의 변화는, 상기 변화가 기능적인 폴리펩타이드를 생성시키고 전사에 악영향을 미치지 않는 한, 통상적으로 가능할 수 있다. 시스 종결인자 또는 불안정성 서열이 플라스미드의 센스 쇄내에서 암호화될 수 있는 반면, 제2, 안티센스 또는 전사된 쇄 상의 뉴클레오타이드는 수득되는 아미노산 서열을 변화시키지 않거나 이에 악영향을 미치지 않는 보존적인 또는 넌센스 돌연변이 또는 다른 돌연변이만을 포함해야 한다. 상기 구체적인 양태에서, 모든 발현된 단백질의 기능은 악영향을 받지 않아야 한다.
제2쇄 상의 각각의 종결인자 서열은 동일할 수 있거나 각각은 상이한 종결인자 서열일 수 있다. 이러한 종결인자 서열은 제1쇄 종결인자 서열로서 상기 확인된 서열들을 포함한다. 한 가지 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 세균성 종결인자, 예를 들면, rrnB 또는 trpA일 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 박테리오파아지 종결인자, 예를 들면, 람다 5S RNA 종결인자 또는 박테리오파아지 P1 헤드 단백질 종결인자일 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 바람직한 종결인자 서열은 진핵세포성 종결 부위, 예를 들면, RNA polII의 종결 부위 또는 α-글로빈 종결인자가 3'쪽에 존재하는, 리보자임 절단 부위 또는 리보핵산 절단 부위를 제공하는 폴리핵산 서열이다. 추가로, 히스톤 mRNA 프로세싱 시그날은 제2쇄에 대한 유용한 종결인자 서열이다. 유사하게, 포유동물 가스트린 유전자를 위한 종결인자, 가스트린 종결인자가 또한 유용하다. rho-의존성 종결인자 및 rho-비의존성 종결인자 모두는 또한 제2쇄에서 상기 목적을 위해서 사용될 수 있는 서열이다. 부가적으로, 상기 기술된 바와 같이 자물쇠 종결인자 서열은 이것이 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 DNA 분자의 일부인 경우 제2쇄를 위한 유용한 종결인자이다.
본 발명의 제2쇄의 한 가지 구체적인 양태에서, 종결인자 서열은 발현 카셋트에 상보적이지 않은 제2쇄의 영역내에 위치하며, 제1쇄 폴리A 부위와 관련하여 3'쪽 바로뒤에 위치한다(도 1B 참조). 본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 제2쇄 종결인자 서열은 발현 카셋트 서열에 상보적이지 않은 제2쇄의 영역내에서 폴리A 부위로부터 200개 뉴클레오타이드 미만내 위치한다(도 1C 참조). 제2쇄의 선택적인 구체적인 양태는 제1쇄 프로모터 서열과 관련하여 5'쪽에 위치하는 종결인자 서열을 함유한다(도 1A 내지 1C 참조). 바람직한 구체적인 양태는 제1쇄의 발현 카셋트에 상보적이지 않은 제2쇄의 전 영역에 산재하는 다수의 종결인자 서열을 함유한다(도 1B 및 1C 참조).
DNA 분자의 제2쇄의 부가적인 구체적인 양태는 발현 카셋트 서열에 상보적이지 않은 제2쇄 서열의 영역 상에 위치하는 하나 이상의 RNA 불안정성 서열을 추가로 함유하는 제2쇄에 관한 것이다. 바람직하게는, 하나 이상의 불안정성 서열이 제2쇄의 영역내에 존재한다. 추가로, 제1쇄와 마찬가지로, 제2쇄는 바람직하게는 포유동물 세포 또는 세포동물에서 사용하기 위한 7개 뉴클레오타이드 이상, 또는 무척추동물 세포 또는 유기체에서 사용하기 위한 4개 뉴클레오타이드 이상의 상보적인 역위된 반복체 서열을 전혀 함유하지 않는다.
본 발명의 DNA 분자의 제2쇄의 또 다른 구체적인 양태로서, 제2쇄내의 "워블" 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열을 변형시키고 서열내 역위된 상보적인 반복체를 예방하거나 제거하기 위해서 조작될 수 있다. 이러한 방식의 상기 반복체의 제거는 DNA가 이본쇄 영역을 형성하게 될 RNA로 전사되는 것을 회피하게 한다. 대안으로, 본 발명의 DNA 분자의 제2쇄의 한 가지 구체적인 양태는 분자내 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에 이미 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 매우 상동성일 가능성이 존재하는 경우, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에상보적인 제2쇄의 부분에서 실질적으로 모든 코돈내 워블 뉴클레오타이드를 변화시키는 것과 관련된다. 암호화되는 아미노산을 변화시키지 않고 코돈을 변화시키는 염기만을 변형시킴으로써, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만, 숙주 세포 또는 숙주 유기체내 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 비상동성인 뉴클레오타이드 서열을 제공하게 된다. "워블된" 코돈내 이러한 비상보적인 영역은 숙주 세포내 DNA 분자로부터 제조된 전사체가 형질감염된 숙주 세포에 천연적이거나 필수적인 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열을 바람직하지 않거나 의도하지 않은 바대로 전사 종결시키거나 저발현 조절시키는 것을 예방한다. 도 2A 및 2B를 참조한다. "실질적으로 모든" 워블 염기란 선택된 폴리뉴클레오타이드 및 숙주 세포내 폴리뉴클레오타이드 사이의 상동성을 파괴하여 숙주 세포내 폴리뉴클레오타이드 서열을 전사 종결시키는 것을 예방하기에 충분하게 코돈을 워블링시킴을 의미한다. DNA가 재조합적으로 제조되는 경우, 워블 염기는 숙지된 돌연변이 기술로 변형시킬 수 있다. DNA가 합성되는 경우, 워블 염기는 정교하게 제조되어 의도된 숙주 세포 또는 유기체내 천연 서열과 일치하는 것을 회피하게 한다.
이본쇄 또는 부분적으로 이본쇄이며, 상기 기술된 바와 같이 제1 및 제2쇄, 또는 상기 기술된 바와 같이 제1 또는 제2쇄 중 하나로 형성된 일본쇄인, 본 발명의 DNA 분자는 세포내에서 전사된 뉴클레오타이드 서열이 유의한 이본쇄화를 형성하는 능력이 결여된 일본쇄 RNA 센스 또는 안티센스 쇄가 되게 한다. DNA 분자는 비염기쌍 형성된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 임의로 분리된, 센스 폴리뉴클레오타이드 서열 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드 서열 모두를 포함하는 일본쇄 RNA 서열을 제공할 수 있다.
본 발명의 이러한 DNA 분자는 하기 상세히 기술된 방법에서 제조되고 사용될 수 있다.
II. 본 발명의 RNA 분자
본 발명에 따른 또 다른 조성물은 숙주 세포내에서 안정한 이본쇄 RNA 또는 부분적인 이본쇄 RNA 분자의 형성을 예방하기 위해서 디자인된, 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 리보핵산의 서열을 포함하는, 실질적으로 일본쇄 RNA 분자이다. 선택적으로, 이러한 분자는 5' ATG 코돈을 함유할 수 있다. RNA가 해독용으로 의도되지 않는 경우, 예를 들면, 리보자임 또는 안티센스 RNA 같은 촉매적 RNA 분자의 경우, 5' ATG는 필요없다. 선택적으로, 코작 서열 같은 조절 영역은 5' ATG 코돈에 선행한다. 이러한 일본쇄 RNA 분자는 선형 분자일 수 있다. 대안으로, 이러한 일본쇄 RNA 분자는 환형일 수 있다.
이러한 일본쇄 RNA 분자는 숙주 세포에서 해독되는 경우 선택된 생물학적 기능을 갖는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 암호화 서열일 수 있으며, 즉, 이는 단백질 또는 이의 기능적인 단편으로 해독된다. 대안으로, 선택된 서열은 비암호화 서열일 수 있지만, 조절 기능 또는 다른 생물학적 기능을 가질 수 있다. 생물학적 기능을 갖는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 분자의 제1쇄에 대해서 상기 기술된 서열로부터 선택될 수 있다.
이러한 일본쇄 RNA 폴리뉴클레오타이드 서열은 길이가 약 100 내지 10000개 폴리뉴클레오타이드 정도이다. 존재시, 서열은 가장 바람직하게는 약 200개 폴리뉴클레오타이드 길이 이상이지만, 한 가지 구체적인 양태에서 이는 200 내지 8000개 폴리뉴클레오타이드 길이의 범위일 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, RNA 분자는 길이 7500개 미만의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, RNA 분자는 약 5000개 미만의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 가질 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, RNA 분자는 약 2000개 폴리뉴클레오타이드 미만의 서열을 가질 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, RNA 분자는 약 1000개 미만의 폴리뉴클레오타이드 길이의 서열을 가질 수 있다. 또 다른 구체적인 양태에서, RNA 분자는 약 750개 미만의 폴리뉴클레오타이드 길이의 서열을 가질 수 있다.
한 가지 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 3' 말단에 작은 헤어핀 서열, 즉 5개 뉴클레오타이드 이하의 이본쇄화 서열을 가질 수 있다. 다른 구체적인양태에서, RNA 분자의 일부로서 원래 존재할 수 있는 헤어핀 서열은 모두 분자로부터 결실된다.
본 발명의 RNA 분자의 한 가지 구체적인 양태로서, RNA 서열은 쇄 상의 임의의 위치에 위치한 7개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드의 모든 역위된 상보적인 반복체 서열이 완전히 결여된다. 한 가지 예로서, 제1쇄가 예를 들면, AUGCUUA의 서열을 함유하는 경우, RNA 쇄 상의 어디에서도 UAAGCAU의 역위된 상보적인 서열은 존재하지 않는다. 이러한 역위된 상보적인 반복체 서열의 결여는 포유동물 숙주세포의 정상적인 체온인, 37℃에서 동일한 쇄 상에서 바람직하지 않은 내부 염기쌍 형성을 회피하게 한다. 또 다른 선택적인 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 쇄 상의 어디에서도 4개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드의 모든 역위된 상보적인 반복체 서열이 결여된다. 이러한 역위된 상보적인 반복체 서열의 결여는 특정 무척추동물 종의 숙주 세포의 저체온에서 동일한 쇄 상의 바람직하지 않은 내부 염기쌍 형성을 회피하게 한다.
본 발명의 일본쇄 RNA 분자의 또 다른 구체적인 양태로서, 쇄 내의 "워블" 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열을 변형시키고 서열내의 역위된 상보적인 반복체를 예방하거나 제거하기 위해서 조작될 수 있다. 이러한 방식의 상기 반복체의 제거는 비정상적인 이본쇄 RNA 영역의 형성을 예방한다. 대안으로, 본 발명의 RNA 분자의 한 가지 구체적인 양태는 분자내 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포내에 이미 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 매우 상동성일 가능성이 존재하는 경우, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열로 해독되는 쇄의 부분에서 실질적으로 모든 코돈내 워블 뉴클레오타이드를 변형시키는 것과 관련된다. 암호화된 아미노산을 변화시키지 않고 코돈을 변화시키는 염기만을 변형시킴으로써, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만, 숙주 세포 또는 숙주 유기체내에서 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동성이 아닌 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. "워블된" 코돈내 이러한 비상보적인 영역은 형질감염된 숙주 세포에 천연적인 또는 필수적인 상동성 폴리뉴클레오타이드의 바람직하지 않거나 의도되지 않은 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방한다. "실질적으로 모든" 워블 염기는 선택된 폴리뉴클레오타이드 및 숙주 세포내 폴리뉴클레오타이드 사이의 상동성을 파괴하여 숙주 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 종결을 예방하기에 충분하게 코돈을 워블링시키는 것을 의미한다. RNA가 재조합적으로 생산되는 경우, 워블 염기는 숙지된 돌연변이 기술로 변형시킬 수 있다. RNA가 합성되는 경우, 워블 염기는 정교하게 제조되어 의도된 숙주 세포 또는 유기체내 천연 서열과의 일치성을 회피하게 된다.
또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자가 의도된 숙주 세포내 유전자의 염색체 복사체를 함유하는 경우, 일본쇄 RNA는 염색체성 RNA로부터 구별되도록 제조된다. 상기 분자는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 인접하는 이종성 서열을 전혀 함유하지 않으며, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 서열과 리보핵산 서열에서 동일하다. 이러한 분자는 이종성 인접 서열과의 비정상적으로 생성된 부분적인 이본쇄 RNA를 회피하도록 디자인되며, 상기 비정상적으로 생성된 부분적인 이본쇄 RNA는 세포가 염색체성 유전자의 전사를 종결하게 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 분자의 5' 말단에서 캡을 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 서열의 5' 말단에서 어떠한 캡도 갖지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 분자의 3' 말단에서 폴리A 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 서열의 3' 말단에서 어떠한 폴리A 서열도 갖지 않는다.
또 다른 구체적인 양태에서, 일본쇄 RNA 분자는 3' 하이드록시 그룹에 부착되며, 이는 쇄 종결인자로서 헤어핀(이본쇄 영역)의 신장을 차단하는 기능을 하는 변형이다. 상기 화학적 잔기 중에는 디데옥시뉴클레오타이드(dNTP), 3' 아미노 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 3' 메틸 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 및 3' 포스포릴티오에이트 뉴클레오타이드 트리포스페이트가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 쇄 종결인자는 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
본 발명의 일본쇄 RNA 분자의 다른 구체적인 양태는 3' 말단에서 위상학적 매듭 또는 올가미를 제공하는 RNA 서열을 포함하며, 이는 또한 쇄 신장을 예방하는 기능을 한다. 이러한 구조들은 문헌[Smith and Nikonowicz, Biochem., 37: 13486-13498 (1998)]에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 일본쇄 RNA 분자의 다른 구체적인 양태는 상기 변형 두개 이상을 함유하는 RNA 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 RNA 분자는 5' 캡 및 3' 폴리A 꼬리를 가질 수 있거나, 5' 캡, 역위된 반복체를 갖지 않고 폴리A 꼬리를 가질 수 있다. 또 다른 구체적인 양태는 역위된 반복체가 없고, 3' 말단 상에 쇄 종결인자를 가지며 폴리A 꼬리를 갖지 않는다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 RNA 분자를 제조하기 위해서 상기 기술된 그밖의 변형들을 배합할 수 있다.
숙주 세포에 천연적인 또는 숙주 세포 또는 유기체에 필수적인 상동성 폴리뉴클레오타이드 서열의 부적절한 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방하기 위해서 이본쇄 또는 부분적으로 이본쇄인 RNA 분자를 회피하는 것이 바람직하다. 본 발명의 이러한 RNA 분자는 하기 상세히 기술되는 방법 및 조성물에서 제조되고 사용될수 있다.
III. DNA 및 RNA 분자의 제조
상기 기술된 DNA 및 RNA 분자는 당해 분야의 공지된 교시를 사용하여 디자인 및 제조할 수 있다. 이러한 분자 모두는 상기 기술된 바와 같이 변형시켜 선택된 서열의 발현을 증강시키고 바람직하지 않은 또는 비정상적인 폴리뉴클레오타이드 종의 전사를 예방하여, 숙주 세포 또는 숙주 유기체의 폴리뉴클레오타이드 서열의 의도되지 않은 전사 종결을 회피할 수 있다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 분자를 문헌[상기 인용된 Sambrook, 또는 Promega Protocols and Applications Guide(3rd ed, 1996), eds. Doyle, ISBN No. 1-882274-57-1]에 기술된 것과 같은 통상적인 기술로 재분류하여 디자인할 수 있다. 예를 들면, 이러한 분자는 시험관내 효소적 합성법 또는 화학적 합성법으로 생성시킬 수 있다.
한 가지 구체적인 양태에서, RNA 분자는 예를 들면, 상기 인용된 교재에 기술된 통상적인 방법에 따라서 박테리오파아지 T7, T3, 또는 SP6 RNA 폴리머라제를 사용하는 통상적인 효소적 합성법으로 시험관내에서 제조된다. 예를 들면, 한 가지 구체적인 양태에서, 본 발명의 RNA 또는 DNA 분자는 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드 및 T7 RNA 폴리머라제를 함유하는 또 다른 플라스미드로 형질감염된 세포에서 제조할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 이러한 분자들은 시험관내에서 화학적 합성법으로 제조할 수 있다[예를 들면, 참조: Q. Xu et al, Nucl. Acids Res., 24(18): 3643-4 (Sept. 1996); N. Naryshkin et al, Bioorg. Khim., 22(9): 691-8 (Sept. 1996); J. A. Grasby et al, Nucl. Acids Res., 21(9): 4444-50 (Sept. 1993); C. Chaix et al, Nucl. Acids Res., 17(18): 7381-93(1989); S.H. Chou et al, Biochem., 28(6): 2422-35 (Mar. 1989); O. Odai et al, Nucl. Acids Symp. Ser., 21:105-6 (1989); N.A. Naryshkin et al, Bioorg. Khim, 22(9): 691-8 (Sept. 1996); S. Sun et al, RNA, 3(11): 1352-1363 (Nov. 1997); X. Zhang et al, Nucl. Acids Res., 25(20): 3980-3 (Oct. 1997); S. M. Grvaznov et al, Nucl. Acids Res., 26(18): 4160-7 (Sept. 1998); M. Kadokura et al, Nucl. Acids Symp Ser, 37:77-8 (1997); A. Davison et al, Biomed. Pept. Proteins. Nucl. Acids, 2(1): 1-6 (1996); and A. V. Mudrakovskaia et al, Bioorg. Khim., 17(6): 819-22 (Jun. 1991)].
대안으로, 이러한 분자들은 숙주 세포 배양물내에서 재조합 방법으로 생성시키고 이로부터 분리시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 DNA 또는 RNA 분자는 재조합 미생물, 예를 들면, 세균 및 효모에서 또는 재조합 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물 세포에서 제조하고, 통상적인 기술로 이의 배양물로부터 분리시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, 상기 인용됨, 이는 이러한 기술들을 상세히 기술하는 연구실 매뉴얼의 예시이다]에 기술된 기술 및 본원에 참조로 도입되는 문헌[미국 특허 제5,824,538호, 제5,877,159호 및 제5,643,771호]에 기술된 기술을 참조한다.
환형 RNA 분자는 문헌에 기술된 방법에 따라서 제조할 수 있다[S. Wang etal, Nucl. Acids Res., 22(12):2326-33 (June 1994); Y. Matsumoto et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87(19) 7628-32 (Oct. 1990); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(8): 3117-21 (Apr. 1994); M. Tsagris et al, Nucl. Acids Res., 19(7): 1605-12 (Apr. 1991); S. Braun et al, Nucl. Acids Res., 24(21): 4152-7 (Nov. 1996); Z. Pasman et al, RNA, 2(6): 603-10 (Jun. 1996); P.G. Zaphiropoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93(13):6536-41 (Jun. 1996); D. Beaudry et al, Nucl. Acids Res., 23(15):3064-6 (Aug. 1995), 이들 모두는 참조 문헌으로 본원에 도입된다].
상기 참조 문헌은 당해 분야의 숙련자에게 하기 특정 양태들 중 하나를 제조하는데 필요한 본원에서 제공된 교시를 제공한다.
시험관내에서 제조되거나 합성된 상기 DNA 및/또는 RNA 분자는 폴리뉴클레오타이드 분자로서 숙주 세포 또는 숙주 유기체내로 직접적으로 전달할 수 있다. 대안으로, 바람직한 DNA 또는 RNA 분자는 본 발명의 요구되는 DNA 또는 RNA 분자에 필요한 서열을 함유하도록 디자인된 살아있는, 약독화된 또는 사멸된, 불활성화된 재조합 세균내에서 숙주 세포로 제공될 수 있다. 상기 재조합 세균 세포, 진균 세포 등은 문헌[미국 특허 제5,824,538호, 제5,877,159호 및 제65,643,771호, 이는 본원에 참조 문헌으로 도입된다]에 기술된 바와 같은 통상적인 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 전달제를 제조하는데 유용한 미생물은 에스케리치아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움, 및 다양한 종의 슈도모나스, 스트렙토마이세스, 스타필로코커스 및 시겔라를 포함하여, 상기 인용된 문헌에서 목록화된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
DNA 또는 RNA 분자는 상기 논의된 요구되는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 살아있는, 약독화된 또는 사멸된, 불활성화된 바이러스, 및 특히 재조합 바이러스에 의해 숙주 세포 또는 숙주내에서 형성될 수 있다. 상기 바이러스는 유전자요법 등을 위해서 세포내로 유전자를 전달하는데 현재 사용되는 재조합 바이러스와 유사하게 디자인될 수 있다. 생체내에서 숙주 세포에 DNA 또는 RNA 분자를 제공하도록 조작될 수 있는 유용한 바이러스 또는 바이러스성 서열에는, 알파바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 배큘로바이러스, 델타 바이러스, 폭스 바이러스, 간염 바이러스, 포진 바이러스, 파포바바이러스(예를 들면, SV40), 폴리오바이러스, 위광견병 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 포지티브 및 네가티브 쇄 RNA 바이러스, 비로이드, 및 바이러소이드 또는 이의 일부를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 다양한 바이러스는 본 발명의 교시와 함께, 특히 문헌[M. Di Nocola et al., Cancer Gene Ther., 5(6):350-6 (1989)]에 기술된 것과 같은 통상적인 기술을 적용하여 디자인될 수 있다.
바람직한, 상기 기술된 DNA 또는 RNA 분자의 숙주 세포내 형성은 상기 기술된 바와 같은 합성 RNA 분자 또는 DNA 분자 또는 재조합 바이러스로 시험관내 형질감염 또는 감염된 살아있는, 약독화된 또는 사멸된, 불활성화된 공여체 세포에서 야기시킬 수 있다. 이후, 이러한 공여체 세포는 하기 상세히 기술되는 바와 같이, 숙주내로 투여될 수 있다. 이러한 공여체 세포는 바람직하게는, 이들이 전달되도록 의도된 숙주, 예를 들면, 포유동물 세포, 예를 들면, C127, 3T3, CHO, HeLa, 사람 신장 293, BHK 세포주, 및 COS-7 세포가 포유동물에 대한 유용한 숙주 세포이기 때문에, 숙주 종의 세포이다. 상기 공여체 세포는 예를 들면, 문헌[Emerich et al, J. Neurosci., 16: 5168-81 (1996)]에 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 공여체 세포는 문헌[D.B. Kohn et al, Nature Med., 4(7):775-80 (1998)]에서 기술된 것과 같은 선택적인 전달 기술과 유사하게, 생체외 조작에 의해 치료하고자 하는 및 공여체 세포로 만들고자 하는 특정 숙주로부터 회수할 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 분자들은 상기 기술된 바와 같은 합성 RNA 분자 또는 합성 DNA 전달 분자의 혼합물로, 또는 재조합 세균, 세포 및 바이러스로서 또는 이들내로 제조할 수 있다. 혼합물의 조성물은 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
IV. 본 발명의 약제학적(치료학적 또는 예방학적), 진단학적 또는 연구 조성물 및 방법
본 발명의 조성물은 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현의 효율을 증강시키기 위한 시험관내 또는 조직 배양 방법에서 유용하거나, 동일한 방법(회수 단계를 제외하고)이 생체내 또는 생체외에서 효과적으로 선택된 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용되는 경우 유사하게 유용하다. 상기 방법의 한 가지 구체적인 양태는 숙주 세포를 상기 기술된 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 DNA 분자 또는 RNA 분자로 형질감염시키고, 이로써 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드분자로부터 전사되거나 해독되는 비정상적인 폴리뉴클레오타이드 종의 형성을 억제시키는 단계를 포함한다. 숙주 세포가 시험관 또는 조직 배양 중인 경우의 본 발명의 한 가지 구체적인 양태에서, 이러한 방법은 숙주 세포로부터 폴리뉴클레오타이드 생성물에 의해 암호화된 생성물의 최대량의 발현 및 회수를 가능하게 한다. 예를 들면, 숙주 세포는 통상적으로 용해되어 생성물을 수집할 수 있으며, 또는 생성물이 분비되는 경우, 이를 통상적인 기술로 배지로부터 수집할 수 있다.
숙주가 살아있는 포유동물인 경우, 상기 방법은 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 포유동물 환자에게 투여하는 것과 관련된다. 약제학적 용도를 위한 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 약제학적 전달을 위한 부가적인 임의 성분과 함께, 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 DNA 또는 RNA 분자, 또는 이의 혼합물을 함유한다. 약제학적 조성물의 특정 제형은 활성제의 형태에 따라서 결정된다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물의 투여를 촉진시키지만, 생리학적으로 불활성이고/이거나 무해한 것이다. 담체는 당해 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있다. 상기 담체는 멸균 염수, 인산 완충된 염수, 덱스트로스, 멸균수, 글리세롤, 에탄올, 락토오스, 슈크로오스, 인산칼슘, 겔라틴, 덱스트란, 아가, 펙틴, 낙화생유, 올리브유, 참깨유, 및 물과 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 부가적으로, 담체 또는 희석제는 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트 단독 또는 왁스와의 혼합물 같은 시간 지연 물질을 포함할 수 있다. 또한, 서방성 중합체 제형을 사용할 수 있다. 제형은 또한 투여 형태에 적합해야 한다. 투여 형태에 따라서 적합한 담체의 선택은 당해 분야의 숙련자에 의해 일상적으로 수행된다.
본 발명의 상기 분자는 DNA를 세포내로 도입하는 숙지된 기술에 의해 폴리뉴클레오타이드로서 세포내로 도입될 수 있다. 파아지 및 바이러스 벡터의 경우, 상기 분자는 또한 감염 및 형질도입을 위한 숙지된 기술에 의해 팩키지된 또는 캡슐화된 DNA 또는 RNA 바이러스로서 존재하거나 바람직하게는 세포내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 수용능이거나 복제 결함성일 수 있다. 복제 결함성인 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보완성 숙주 세포에서만 일어날 것이다.
조성물이 상기 기술된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 분자, 예를 들면, DNA 분자, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 또는 재조합 바이러스, 또는 다수 복사체의 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 경우, 상기 조성물은 바람직하게는 단지 담체와의 "나출된" 폴리뉴클레오타이드로서 제형화될 수 있다. 대안으로, 상기 조성물은 바람직하게는 국부 마취제, 펩타이드, 지질 함유 양이온성 지질, 리포좀 또는 지질성 입자, 폴리라이신 같은 폴리양이온, 덴드리머 같은 측쇄화된 3차원 폴리양이온, 탄수화물, 양이온성 양친매성 물질, 세제, 벤질암모늄 계면활성제 또는 세포내로 폴리뉴클레오타이드 전달을 촉진하는 다른 화합물 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드 촉진제 또는 "보조-시약"을 함유한다. 본 발명에 유용한 상기 촉진제 또는 보조-시약의 비제한적인 예는 문헌[미국 특허 제5,593,972호, 제5,703,055호, 제5,739,118호, 제5,837,533호, 및 국제 특허원 WO제96/10038호(1996년 4월 4일자로 공개됨), 및 국제 특허원 WO 제94/16737호(1994년 8월 8일자로 공개됨), 이들은 각각 본원에 참조 문헌으로 도입된다]에 기술되어져 있다.
사용되는 촉진제가 국부 마취제, 바람직하게는 부피바카인인 경우, 폴리뉴클레오타이드 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.1 중량% 내지 약 1.0 중량%의 양이 바람직하다. 또한 문헌[소포성 착물로의 전달에 대해서는 국제 특허원 제PCT/US98/08799호, 및 국제 특허원 제PCT/US98/22841호]를 참조하며, 이는 보조-시약으로서 약 0.001 내지 0.03 중량% 정도의 양으로 투여되는 벤질암모늄 계면활성제의 도입을 교시하며, 이의 교시는 본원에 참조로 도입된다.
조성물이 폴리뉴클레오타이드 이외, 즉 상기 기술된 바와 같은 형질감염된 공여체 세포 또는 세균인 경우, 조성물은 문헌[미국 특허 제5,824,538호, 제6,543,771호, 제5,877,159호, 이는 본원에 참조 문헌으로 도입됨]에서 논의된 바와 같이, 다른 부가제를 또한 함유할 수 있다.
조성물 중 하나에서 존재할 수 있는 부가 성분은 애주번트, 보존제, 화학적 안정화제, 또는 다른 항원성 단백질이다. 전형적으로, 안정화제, 애주번트 및 보존제는 표적 사람 또는 동물에서 효율에 대한 최적의 제형을 결정하는데 가장 효과적이다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 칼륨 솔베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 안정화 성분은 예를 들면, 카스아미노산, 슈크로오스, 겔라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 이인산일칼륨, 락토오스, 락트알부민 하이드롤라이세이트 및 분유를 포함한다. 통상적인 애주번트를 사용하여 백혈구를 유인하고 면역 반응을 증강시킨다. 상기 애주번트는 특히, Ribi, 광유 및 물, 수산화알루미늄, 암피겐, 아브리딘, L121/스쿠알렌, D-락타이드-폴리락타이드/글리코시드, 플루론산 플리오이스, 무라밀 디펩타이드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 및 Quil A 같은 사포닌을 포함한다.
또한, 형질감염제 및/또는 복제제 및/또는 염증제로서 기능할 수 있고 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 기타 제제는 성장인자, 사이토킨 및 림포카인, 예를 들면, 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 결장 촉진 인자(예를 들면, G-CSF, GM-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 표피 성장 인자(EGF), 및 인터류킨, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 및 IL-12를 포함한다. 추가로, 섬유아세포 성장 인자, 면역-자극 복합체(ISCOMS) 같은 표면 활성제, 프로인트 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A(MPL)을 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포성 복합체(예를 들면, 스쿠알렌 및 히알루론산)을 또한 본 발명의 조성물과 연계하여 투여할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 조성물의 선택된 투여 형태에 적합한 기타 부가제를 함유할 수 있다. 따라서, 이러한 조성물은, 비경구적 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피내 투여, 경구 투여, 국소적 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 질내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 모든 통상적인 투여 경로를 통해 투여하기에 적합한 부가제를 함유할 수 있다. 상기 모든 경로는 이러한 조성물의 투여에 적합하며, 사용되는 시약, 환자, 치료하고자 하는 상태 및 유사한 인자들에 따라서 주치의에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 동결건조된 폴리뉴클레오타이드와 관련될 수 있으며, 이는 비내 또는 폐내 적용을 위한 것들을 포함하여 분말, 액체 또는 현탁제 투여 형태를 개발하기 위한 다른 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19thedition (1995), 예를 들면, Chapter 95 Aerosols; 및 국제 특허원 제PCT/US99/05547호]을 참조하며, 이의 교시는 본원에 참조로 도입된다. 이러한 조성물의 투여 경로는 바람직한 경우 혼용되거나 조절될 수 있다.
특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 액체, 분말, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용 제피된 정제 또는 캡슐제, 또는 좌제의 형태로 포유동물 환자에게 투여하기 위해 제조된다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로서 사용되는 경우, 폴리뉴클레오타이드 분자, 예를 들면, 합성 RNA 분자 또는 DNA 분자, 플라스미드, 바이러스성 벡터, 재조합 바이러스 및 이의 혼합물 약 1ng 내지 약 20㎎을 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본 조성물은 폴리뉴클레오타이드 서열 약 10ng 내지 약 10㎎을 함유한다. 다른 구체적인 양태에서, 약제학적 조성물은 폴리뉴클레오타이드 서열 약 0.1 내지 약 500㎍을 함유한다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, 조성물은 폴리뉴클레오타이드 서열 약 1 내지 약 350㎍을 함유한다. 또 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 약제학적 조성물은 폴리뉴클레오타이드 서열 약 25 내지 약 250㎍을 함유한다. 특정 바람직한 양태에서, 백신 및 치료제는 폴리뉴클레오타이드 서열 약 100㎍을 함유한다.
DNA 또는 RNA 분자가 공여체 세포 또는 세균내로 전달되는 본 발명의 조성물은 약 1 내지 약 107세포/1회 정도의 투여량으로 전달될 수 있다. 유사하게, 전달제가 살아있는 재조합 바이러스인 경우, 적합한 벡터-기초 조성물은 투여 당 1 x 102pfu 내지 1 x 1012pfu를 함유한다.
상기 투여량 범위는 단지 지침일 뿐이다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 목적한 질환, 질병 또는 감염을 치료 또는 예방하는데 유효량으로 투여된다. 사용되는 투여량 단위내에서 약제학적 조성물의 양은 본 발명의 조성물에 대한 시험관내 세포 반응 및 실험 동물의 반응을 기초로, 경험적으로 결정될 것이다. 최적 투여량은 각각의 치료 양식 및 징후에 대한 표준 방법으로 결정될 것이다. 따라서, 이러한 조성물의 투여량, 투여시기, 투여 경로 및 재투여 필요성은 치료하고자 하는 상태, 이의 중증도, 합병증 상태, 및 연령 같은 인자, 및 포유동물 환자의 물리적 상태, 다른 활성 화합물의 사용 등을 고려하여, 당해 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태는 숙주 세포에 천연적인 폴리뉴클레오타이드 서열과 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자로 형질감염된 숙주 세포에서 필수적이거나 바람직한 폴리뉴클레오타이드 서열의 의도하지 않거나 바람직하지 않은 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방하기 위해 본 발명의 DNA 및 RNA 분자를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 기술된 분자내에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 동일성에 따라서, 상기 기술된 조성물, 약제학적 조성물, 투여량 및 투여 형태는 세포외 또는 세포내 병원체 중 하나인 이종성 병원성 유기체에 의한 감염을 포함하여, 척추동물, 특히 포유동물, 조류 및 다른 가금류, 뿐만 아니라 어류 같은 무척추동물을 괴롭히는 다양한 질환을 치료하는데 특히 바람직하다. 부가적으로, 본 발명의 조성물은 병원체의 숙주 감염을 예방하거나 암을 치료하는데 유용하다. 추가로, 이러한 조성물은 숙주에 결함이 있는 폴리뉴클레오타이드 단백질 또는 기능을 효과적으로 발현시킴으로써, 유전성 또는 유전자 질환을 치료하는데 유용하다.
당해 분야의 숙련자는 상기 기술들을 근거로, 바이러스 과 및 속, 또는 원핵성 및 진핵성 원생동물 뿐만 아니라 다세포성 기생충을 포함하는 병원체를 용이하게 선택할 수 있으며, 이를 위한 본 발명에 따른 치료학적 또는 예방학적 조성물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[일반 면역학 교재들 및 미국 특허 제5,593,972호내의 상기 병원체에 대한 표들, 이들은 본원에 참조 문헌으로 도입된다]을 참조한다. 당해 분야의 숙련자는 상기 기술된 질환들을 용이하게 선택할 수 있으며, 또한 질환의 치료, 또는 예방 용도를 위한 적절하게 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.
V. 본 발명의 다른 방법들
숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 증강시켜 비정상적인 서열의 생산 또는 전사를 감소시키기 위한 상기 기술된 조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 일반 방법은 또한 상기 충분한 발현이 필수적인 다양한 연구 및 시험관내 적용에 적용될 수 있다. 이러한 조성물 및 방법은 또한 식물 세포 및 곤충 세포를 조작하는데 적용될 수 있으며, 숙주 세포는 상기 언급된 다른 유기체 중에서, 유사하게 식물 및 곤충일 수 있다.
유사하게, 상기 방법의 적용은 선택된 폴리뉴클레오타이드 생성물을 효과적으로 생산하는 포유동물, 세균, 효모, 진균, 곤충, 식물 및 다른 기원의 세포주를 제조하는데 사용할 수 있다. 이러한 분자들은 또한 특정 폴리뉴클레오타이드 암호화된 생성물을 제조하는데 사용된 안정한 세포주의 효율을 증가시키는데 사용할 수 있다. 상기 조작된 세포들은 동물에서 약제학적 용도, 동물에서 백신 용도, 뿐만 아니라 농경 분야에서 다양한 용도를 위한 재조합 단백질을 제조하는데 사용할 수 있다. 상기 세포들은 또한 드럭 또는 다른 유용한 화합물의 통상적인 시험 분석법, 또는 드럭 스크리닝 및 개발 분석법 등에서 사용할 수 있다. 또한, 다른 용도가 본원의 교시에 기초하여 당해 분야의 숙련자에게는 명백하게 예견된다.
하기 실시예는 본 발명의 조성물을 제조하고, 본 발명의 조성물을 사용하여 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 및 발현 효율을 증가시키고, 비정상적인(의도하지 않은) 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 감소 또는 억제시키는 방법을 예시한다. 당해 분야의 숙련자는, 본 조성물의 다양한 선택된 폴리뉴클레오타이드, 및 RNA 및/또는 DNA 분자에 대한 다른 선택들이 본 명세서에 의해 교시된 바와 같이 용이하게 수행될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 단지 예시하는 것이며 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
선택된 폴리뉴클레오타이드로서 마우스 인터류킨 12(mIL-12) p40을 사용하는 암호화 쇄 상에 종결인자 서열을 함유하는 DNA 플라스미드
DNA 플라스미드 작제물로부터 쥐 IL12 p40의 발현을 사용한 실험은 문헌에서 보고되어져 왔다. 면역 반응 부재시(마우스에서 비항원성), 혈청내 IL12 p40의 발현은 8일째 정점에 도달했다가 50일째 정도에 기저(내인성) 수준으로 감소된다.
하기 실시예에서, 플라스미드 서열은 비정상적인 RNA 형성을 예방하기 위해 종결인자 서열을 삽입함으로써 변형된다. mIL12 발현 벡터내 클로닝 부위는 도 6에서 nt# 4700에서 HpaI 부위(폴리A 부위의 하류), 및 nt# 2568에서 SphI 부위(CMV 프로모터/인핸서/RSV 인핸서 모듈의 상류)로서 나타낸다. mIL12를 암호화하는 플라스미드(도 6)는 신장 종결을 야기하는 서열(인자들)을 함유하도록 변형된다. 하기 확인된 종결인자 서열은 프로모터 클로닝 부위에서 사람 CMV 프로모터 상부 및 SV40 폴리아데닐화 서열의 150개 염기 하류에서 위치한다. 상기 종결인자가 프로모터의 상류에서 사용되는 경우, 폴리아데닐화 서열은 또한 종결인자 서열의 150개 염기 상류에서 클로닝되며, 이는 특정 종결인자 서열은 폴리A 부위와 연계하는 경우에만 효과적으로 작동하기 때문이다.
플라스미드내로 삽입된 종결인자 서열은 다음을 포함한다: rho 의존성 및 rho 비의존성인 세균 폴리머라제 종결인자는 각각, trpA(진뱅크 승인번호 #E02304) 및 rmBT1T2(제조원: Amersham-Pharmacia Biotech catalog #27-4925-01, Brosius, J., Gene, 27: 151 (1984), 진뱅크 승인번호 #U13859)이다. 이러한 서열은 제조원(Pharmacia Biotech)로부터 이용가능한 현존하는 벡터로부터 분리하거나 이러한 서열은 용이하게 합성된다(진뱅크 승인번호 #E02304). 히스톤 종결인자[진뱅크 승인번호 #Z46261, nt 750 내지 765, Mol. Cell. Biol., 497-509 (Jan. 1991)] 및 글로빈 종결인자[진뱅크 승인번호 #U89937, nt 4517 내지 4565] dsDNA는 합성된다. 33염기쌍 trpA dsDNA 서열은 합성되며(진뱅크 승인번호 #E02304), rmBT1T2 종결인자 단편을 함유하는 1139염기쌍 PvuII 단편은 pKK232-8 벡터(제조원: Amersham-Pharmacia Biotech)로부터 분리시킨다. 이러한 핵산 단편들은 mIL12 벡터내 제한 부위들 중 하나 또는 SphI 및 HpaI 부위 둘 모두내로 클로닝시킨다(도 6).
이러한 플라스미드 작제물 각각을 정제한다. 시험 플라스미드 각각 100㎍을 마우스 뒷다리 근육 조직내로 주사한다. 두 개의 대조군 마우스 세트를 또한 사용하며, 대조군 마우스 세트 중 하나는 유사한 양의 출발 플라스미드를 주사하고, 다른 하나는 p40 cDNA 서열을 함유하지 않는 골격 플라스미드를 주사한다.
mIL12/p40 쇄의 발현을 퀀티킨(Quantikine) M-IL-12 p40 ELISA 분석법(제조원: Genzyme)을 사용하여 접종된 마우스 혈청에서 분석한다. 종결인자를 함유하는 플라스미드는 대조군 플라스미드 보다 혈청에서 IL12p40을 보다 높은 수준으로 생성시키는 반면, 발현 카셋트 양쪽 모두에서 종결인자를 함유하는 플라스미드는 IL12p40를 최대로 발현할 것으로 예견된다. 암호화 쇄 상에 종결인자 서열을 함유하는 플라스미드는 선행기술 플라스미드와 비교하여 IL-12의 증가된 발현 및 IL-12의 발현의 증가된 기간을 초래할 것으로 예견된다.
실시예 2
비암호화 쇄 상의 종결인자 서열
실시예 1에서 기술된 바와 같이, mIL12 암호화 플라스미드(도 6)는 비암호화 쇄 상에서 신장의 종결을 야기하는 서열(인자)을 함유하도록 유사하게 변형시킨다. 이러한 인자들은 SphI 클로닝 부위에서 CMV 프로모터 상류 및 HpaI 클로닝 부위에서 SV40 폴리아데닐화 서열의 약 150개 염기 하류에 위치하는 비암호화 쇄 상에 위치한다.
실시예 1에서 확인된 동일한 종결인자 서열의 뉴클레오타이드 단편은 mIL12 벡터내 비암호화 쇄 상의 제한 부위들 중 하나 또는 SphI 및 HpaI 부위 둘 모두내로 클로닝된다. 이러한 작제물 각각은 정제될 것이다. 플라스미드 각각 100㎍을 마우스 뒷다리 근육 조직내로 주사한다. mIL12/p40 쇄의 발현은 실시예 1에서 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 접종된 마우스의 혈청에서 분석한다. 본 실시예는 두 개의 마우스 대조군 세트를 사용한다: 대조군 마우스의 하나의 세트는 유사한 양의 출발 플라스미드를 주사하고, 또 다른 하나에는 p40 cDNA 서열을 함유하지 않는 골격 플라스미드를 주사한다.
비암호화 쇄 상에 임의의 하나의 종결인자를 함유하는 플라스미드는 대조군 플라스미드에 비해 혈청에서 보다 높은 수준의 IL12p40을 생성시킬 것으로 예견되는 반면, 비암호화 쇄 상의 발현 카셋트 둘 모두에서 종결인자를 함유하는 플라스미드는 IL12p40을 최대로 발현할 것으로 예견된다. 비암호화 쇄 상에 종결인자를 함유하는 플라스미드 작제물은 대조군과 비교하여, 선행 기술의 플라스미드 보다 긴 기간 동안 IL12의 증가된 발현을 초래한다.
실시예 3
암호화 및 비암호화 쇄 상의 종결인자 서열
mIL12를 암호화하는 실시예 1 및 2의 플라스미드(도 6)를 이본쇄 DNA 분자의 암호화 쇄 및 비암호화 쇄 모두에서 신장의 종결을 야기하는 서열(인자)을 함유하도록 추가로 변형시킨다. 두 개의 상기 인자들은 프로모터 클로닝 부위(SphI 부위)에서 CMV 프로모터의 상류에 위치하며, 두 개의 인자는 SV40 폴리아데닐화 서열(HpaI 부위)의 약 150개 염기 하류에 위치하도록 하여, 하나의 인자는 암호화 쇄 상에서 효과적이며 다른 인자는 비암호화 쇄 상에서 효과적이도록 한다. 클로닝 부위 및 종결인자 서열은 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 것이다.
실시예 1 및 2의 플라스미드는 추가로 암호화 영역 내를 포함하여, 시스트론내 센스 또는 암호화 쇄 상의 하나 이상의 부위에서 문헌[Nilsson et al., Science, 265: 2085-2088 (1994)]에 기술된 바와 같은, 자물쇠 종결인자를 부가하여 추가로 변형시킨다. 예를 들면, 자물쇠 종결인자가 IL-12 암호화 서열내 하나,둘 또는 그 이상의 부위에서 부가된다. 부가적인 임의의 자물쇠는 5' 또는 3' 비해독 영역 중 하나에서 안티센스 내에 부가될 수 있다.
이러한 뉴클레오타이드 단편들은 mIL12 벡터(도 6)내 제한 부위 중 하나 또는 SphI 및 HpaI 부위 모두에서 클로닝된다. 이러한 작제물 각각은 정제된다.
발현 카셋트의 양쪽 상에서 양 쇄 상에서 종결인자를 갖는 플라스미드 각각 100㎍을 마우스 뒷다리 근육 조직내로 주사한다. mIL12/p40 쇄의 발현은 상기 기술된 바와 같은 표준 ELISA에 의해 접종된 마우스의 혈청에서 분석된다. 마우스의 두 개의 대조군 세트를 사용한다: 하나의 대조군 마우스 세트는 암호화 쇄 상의 발현 카셋트의 양쪽 모두에서 종결인자를 함유하는 유사한 양의 플라스미드를 주사한다. 또 다른 세트는 비암호화 쇄 상의 발현 카셋트의 양쪽 모두에서 종결인자를 함유하는 유사한 양의 플라스미드와 함께 골격 플라스미드를 주사한다.
암호화 쇄 및 비암호화 쇄 모두에서 종결인자를 함유하는 작제물은 대조군 플라스미드 보다 긴 시간 동안 최대량의 IL-12를 발현할 것으로 예견된다.
실시예 4
RNA 불안정성 서열의 용도
RNA 불안정성 서열, UUAUUUAUU[A. M. Curatola et al, Mol. Cell. Biol., 15(11): 6631-6340 (Nov. 1995); A. M. Zubiaga et al., Mol. Cell. Biol., 15(4): 2219-2230 (Apr. 1995)]을 dsDNA로서 합성하고 도 6 및 실시예 1의 플라스미드의 암호화 쇄 또는 비암호화 쇄, 또는 둘 모두내로 폴리A 부위로부터 하류의 HpaI 부위에서 및/또는 프로모터의 상류의 SphI 부위에서 클로닝시킨다. 상기 불안정성 서열을 함유하는 RNA 분자는 신속하게 분해된다.
이러한 작제물 각각을 정제한다. 플라스미드 각각 100㎍을 마우스 뒷다리 근육 조직내로 주사한다. mIL12/p40 쇄의 발현은 상기 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 접종된 마우스의 혈청에서 분석한다. 두 개의 상기 동물의 대조군 세트를 사용한다: 하나의 대조군 마우스 세트는 유사한 양의 출발 플라스미드(RNA 불안정성 서열이 없음)를 주사하고, 다른 하나의 세트는 p40 cDNA 서열을 함유하지 않는 골격 플라스미드를 주사한다.
불안정성 서열을 함유하는 플라스미드는 대조군 플라스미드에 비해서 혈청에서 보다 더 높은 수준의 IL12p40을 생성할 것으로 예견되는 반면, 보다 더 많은 수의 RNA 불안정성 서열을 함유하는 플라스미드는 보다 많은 Il12p40을 발현할 것으로 예견된다.
실시예 5
변형된 작제물로부터의 비정상적인 RNA 합성의 부재
SCMV 프로모터 및 CMV 프로모터를 실시예 1 내지 4에서 기술된 것들과 유사한 종결인자 또는 불안정성 서열을 함유하는 플라스미드, 및 종결인자 및 RNA 불안정성 서열을 함유하지 않는 대조군 플라스미드에서 반대 방향으로 발현 카셋트 외부에 위치시킨다. 이러한 플라스미드는 사람 횡문근육종(RD) 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 이용가능한 사람 세포주)를 형질감염시키는데 사용된다.
형질감염된 세포로부터 유도된 RNA를 분석한다. 예를 들면, 노던 블롯은 영역 A내 서열 내부로부터 유도된 서열, 즉 도 7의 도식에서 두 개의 종결인자 1및 2사이의 서열로 프로빙한다. 리보뉴클레아제 A 절단 이후 전기영동시킨 RNA의 노던 블롯 분석은 영역 A 서열내로부터 유도된 프로브를 사용하여 수행한다. 리보뉴클레아제 A는 ssRNA를 절단하지만, dsRNA는 절단하지 않는다.
비정상적인 RNA 억제성 인자(종결인자 및 RNA 불안정성 서열)를 함유하는 플라스미드로 형질감염시킨 세포의 RNA 제제에서는 영역 A로부터 RNA가 전혀 검출되지 않거나 매우 감소된 양으로 검출된다. 영역 A로부터의 RNA는 대조군 플라스미드로 형질감염시킨 세포의 RNA 제제의 노던 블롯에서 검출된다. 추가로, 비정상적인 RNA 억제성 인자를 함유하지 않는 대조군 플라스미드에서만 리보뉴클레아제 절단 후 dsRNA가 검출된다.
상기 모든 주지된 출판된 참조 문헌들은 본원에 참조 문헌으로 도입된다. 본 발명의 수 많은 변형 및 변화가 상기 확인된 명세서내에 포함된다는 것은 당해 분야의 숙련자에게는 명백할 것으로 사료된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 상기 변형 및 변화는 본원에 첨부된 특허청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 생각된다.

Claims (54)

  1. (a) (i) 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 프로모터에 의해 발현이 조절되는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 카셋트 서열, 및 (ii) 하나 이상의 제1쇄 종결인자 서열을 포함하는 제1 암호화 쇄; 및 (b) 상기 제1쇄 종결인자 서열에 상보적인 제2쇄 서열의 부분이 제1쇄 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄 서열로부터의 전사를 방해하지 않으며, 제1쇄 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄 서열 외부에서 제2쇄 상에서 개시되는 전사를 종결시키는 제2쇄 종결인자 서열 하나 이상을 포함하는, 제1쇄에 상보적인 제2 전사 주형 쇄를 포함하는 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자.
  2. 제1항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 프로모터의 5'쪽에 위치하는 종결인자 서열, 폴리아데닐화 부위의 3'쪽에 위치하는 종결인자 서열, 발현 카셋트 서열의 외부에서 제1쇄 상에 위치하는 종결인자 서열, 및 발현 카셋트 서열의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열내에 위치하는 종결인자 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오타이드 분자.
  3. 제1항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 발현 카셋트 서열에 상보적이지 않은 서열내에서 제2쇄 상에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  4. 제1항에 있어서, 제1쇄가 리보핵산 가수분해 부위에 상보적인 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  5. 제1항에 있어서, 제1쇄가 촉매 부위에 상보적인 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  6. 제4항에 있어서, 리보핵산 가수분해 부위가 RNA 불안정성 서열인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  7. 제6항에 있어서, 불안정성 서열이 제2 종결인자 서열의 3'쪽에서, 제1 종결인자 서열의 5'쪽에서, 또는 암호화 서열내에서 제1쇄 상에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  8. 제2항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 프로모터의 5'쪽의 1 내지 50번째 뉴클레오타이드 사이에서 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  9. 제2항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 폴리아데닐화 부위로부터 3'쪽의 약 100개 뉴클레오타이드의 제1쇄 상에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  10. 제9항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 폴리A 부위의 3'쪽의 약 150개 뉴클레오타이드의 제1쇄 상에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  11. 제2항에 있어서, 제1쇄가 두 개 이상의 종결인자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  12. 제2항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 제1쇄 상의 바람직하지 않은 전사를 감소시키는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  13. 제1항에 있어서, 제1쇄가 7개 뉴클레오타이드 이상의 역위된 상보적인 반복체 서열을 갖지 않는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  14. 제11항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 독립적으로, 세균 종결인자, 박테리오파아지 종결인자, 폴리A 부위 이후의 진핵성 RNA 정지 부위, 폴리A 부위 이후의 α-글로빈 종결인자, 히스톤 프로세싱 시그날, 리보자임 절단 부위 이후에 상기 정지 부위를 제공하는 폴리핵산 서열, 리보핵산 절단 부위 이후의 상기 정지 부위, rho-의존성 종결인자, rho-비의존성 종결인자, 및 자물쇠(padlock)의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드와 제1쇄 상의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 사이의 하이브리드화에 의해 폴리뉴클레오타이드 분자에 부분적으로 결합된 환형 일본쇄 자물쇠 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  15. 제1항에 있어서, 제2쇄가 하나 이상의 종결인자 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  16. 제1항에 있어서, 제2쇄 서열 상에 제1쇄의 발현 카셋트 서열에 상보적인 서열 외부 부분에서 위치하는 하나 이상의 RNA 불안정성 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  17. 제1항에 있어서, 제2쇄가 7개 이상의 뉴클레오타이드의 역위된 상보적인 반복체 서열을 갖지 않는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  18. 제1항에 있어서, 제2쇄가 4개 이상의 뉴클레오타이드의 역위된 상보적인 반복체 서열을 갖지 않는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  19. 제1항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 제1쇄 폴리A 부위와 비교하여 3'쪽에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  20. 제1항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 제1쇄 발현 카셋트 서열에 상보적인 서열의 외부에서 제2 서열내의 폴리A 부위로부터 200개 뉴클레오타이드 미만내에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  21. 제1항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 제1쇄 프로모터와 비교하여 5'쪽에 위치하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  22. 제1항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 독립적으로, 세균 종결인자, 박테리오파아지 종결인자, 리보자임 또는 리보핵산 절단 부위 이후의 α-글로빈 종결인자를 포함하는 서열, 히스톤 프로세싱 시그날, 리보핵산 절단 부위 또는 리보자임 절단 부위 이후의 진핵성 RNA 정지 부위를 포함하는 서열, rho-의존성 종결인자, rho-비의존성 종결인자, 및 자물쇠의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드와 제2쇄 상의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 사이의 하이브리드화에 의해 폴리뉴클레오타이드 분자에 부분적으로 결합된 환형 일본쇄 자물쇠 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  23. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 벡터인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  24. 제23항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 분자로 형질감염되는 세포의 핵으로 폴리뉴클레오타이드 국재화를 지시하는 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  25. 제1항에 있어서, 워블(wobble) 뉴클레오타이드가 역위된 상보적인 반복체의발생을 예방하도록 변형되는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  26. 제1항에 있어서, 제1쇄 및 제2쇄 서열이 선형 분자를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  27. 제1항에 있어서, 제1쇄 및 제2쇄 서열이 환형 분자를 형성하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  28. 제1항에 있어서, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  29. 제1항에 있어서, 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열이 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  30. 제1항에 있어서, 프로모터가 약한 프로모터인 폴리뉴클레오타이드 분자.
  31. 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열 부위에서 실질적으로 모든 코돈내 워블 염기가 변형되어 동일한 아미노산을 암호화하지만 숙주 세포내에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동성이 아닌 뉴클레오타이드 서열을 제공하게 되는, 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자의 제1쇄 또는 제2쇄로부터 선택되는 일본쇄 폴리뉴클레오타이드 서열.
  34. 제33항에 있어서, 종결인자 서열이 독립적으로, 세균 종결인자, 박테리오파아지 종결인자, 리보자임 절단 부위 또는 리보핵산 절단 부위 이후에 진핵성 RNA 정지 부위 또는 α-글로빈 종결인자를 포함하는 서열, 히스톤 프로세싱 시그날, rho-의존성 종결인자, 및 rho-비의존성 종결인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  35. 제33항 또는 제34항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 5' 말단, 숙주 세포내에서 해독되는 경우 선택된 생물학적 기능을 갖는 리보뉴클레오타이드 서열, 및 3' 말단을 포함하는, 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 RNA분자를 안정하게 형성할 수 없는 실질적으로 일본쇄인 RNA 분자.
  37. 제36항에 있어서, 워블 뉴클레오타이드가 역위된 상보적인 반복체의 발생을 예방하도록 변형된 분자.
  38. 제36항에 있어서, 3' 말단에서 헤어핀의 신장을 예방하도록 변형된 분자.
  39. 제36항에 있어서, 7개 이상의 뉴클레오타이드의 역위된 상보적인 반복체 서열을 함유하지 않는 분자.
  40. 제36항에 있어서, 4개 이상의 뉴클레오타이드의 역위된 상보적인 반복체 서열을 함유하지 않는 분자.
  41. 제36항에 있어서, 분자의 5' 말단에서 캡을 포함하는 분자.
  42. 제38항에 있어서, 변형이 서열의 3' 말단에서 부착된 쇄 종결인자를 포함하는 분자.
  43. 제36항에 있어서, 5' 코돈에 대해 5'쪽 서열내에 위치된 코작 서열(Kozak sequence)을 포함하는 분자.
  44. 제36항에 있어서, 폴리A 꼬리를 포함하는 분자.
  45. 제36항에 있어서, 폴리A 꼬리를 포함하지 않는 분자.
  46. 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 서열의 부위에서 실질적으로 모든 코돈내 워블 염기가 변형되어 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만 숙주 세포내에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동성이지 않은 뉴클레오타이드 서열을 제공하게 되는, 실질적으로 일본쇄인 RNA 분자.
  47. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 RNA 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  48. (a) (i) 5'에서 3' 방향으로 프로모터, 상기 프로모터에 의해 발현이 조절되는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 발현 카셋트 서열, 및 (ii) 하나 이상의 제1쇄 종결인자 서열을 포함하는 제1 암호화 쇄; 및 (b) 상기 제1쇄 종결인자 서열에 상보적인 제2쇄 서열의 부분이 제1쇄 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄 서열로부터의 전사를 방해하지 않으며, 제1쇄 발현 카셋트에 상보적인 제2쇄 서열 외부에서 제2쇄 상에서 개시되는 전사를 종결시키는 제2쇄 종결인자 서열 하나 이상을 포함하는 제1쇄에 상보적인 제2 전사 주형 쇄를 포함하는 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자로 숙주 세포를 형질감염시키고, 이로써 숙주 세포내에서 상기 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 전사되는 비정상적인 폴리뉴클레오타이드 서열의 형성을 억제시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 숙주 세포내에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현 효율을 증강시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 제1쇄 종결인자 서열이 프로모터의 5'쪽에 위치한 종결인자 서열, 폴리아데닐화 부위의 3'쪽에 위치한 종결인자 서열, 발현 카셋트 서열의 외부에서 제1쇄 상에 위치한 종결인자 서열, 및 발현 카셋트 서열의 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열내에 위치한 종결인자 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 제2쇄 종결인자 서열이 제1쇄 발현 카셋트 서열에 상보적이지 않은 서열내에서 제2쇄 상에 위치하는 방법.
  51. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포내에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여함을 포함하여, 숙주 환자를 치료하는 방법.
  52. 5' 말단, 숙주 세포에서 해독시 선택된 생물학적 기능을 갖는 리보뉴클레오타이드 서열, 및 3' 말단을 포함하며 이본쇄 또는 부분적인 이본쇄 RNA 분자를 안정하게 형성할 수 없는 실질적으로 일본쇄인 RNA 분자로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하여, 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현 효율을 증강시키는 방법.
  53. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포에서 RNA 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여함을 포함하는 숙주 환자의 치료 방법.
  54. 제1항 내지 제31항 및 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자, 세포에서 폴리뉴클레오타이드 흡수를 촉진시키는 임의의 제제, 및 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 상동성인 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분자로 형질감염된 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 부적절한 전사 종결 또는 저발현 조절을 예방하는 방법.
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