KR20020012169A - 프로스타글란딘 화합물, 조성물 및 말초혈관질병 및폐고혈압증의 치료방법 - Google Patents

프로스타글란딘 화합물, 조성물 및 말초혈관질병 및폐고혈압증의 치료방법 Download PDF

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마틴 로쓰브라트
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Abstract

말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료를 위해 온혈동물에 투여하기 위한, 약제학적으로 수용가능하고 활성기의 대사율을 늦출 수 있는 하나 이상의 위치에 결합된 보호기를 포함하는 프로스타글란딘 및 이것의 동족체. 사실, 도1은 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 양(sheep)에 정맥 주입된, mPEG20kDa-아미드-화합물X의 투약이 폐동맥압에 미치는 효과를 그래픽적으로 보여준다.

Description

프로스타글란딘 화합물, 조성물 및 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료방법{PROSTAGLANDIN COMPOUNDS, COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING PERIPHERAL VASCULAR DISEASE AND PULMONARY HYPERTENTION}
체내의 거의 모든 조직들은 프로스타글란딘을 생산한다. 어떤 다른 오타코이드(autacoid) 또는 호르몬들도 프로스타글란딘보다 더 풍부하고 다양한 효과를 나타내지는 못한다. 혈액 및 폐내의 효소에 의한 빠른 분해로 인해, 대부분의 프로스타글란딘의 유효 작용시간은 단지 약 3-10분이다.
체내에서 생성된 프로스타사이클린(prostacyclin), 프로스타글란딘 동족체를 포함하는 프로스타글란딘은 혈관벽의 적절한 작용을 유지하는데 관여한다. 변형되지 않은 프로스타글란딘은 약 6분보다 작은 유효시간을 가지며, 본질적으로 불안정하다. 프로스타사이클린을 포함하는 프로스타글란딘은 적절하게 혈관작용을 유지하도록 3가지 방법으로 작용하는 것으로 여겨진다. 1) 이들은 필요한 경우 적절한 혈액 흐름이 가능하도록 혈관을 이완시킨다; 2) 이들은 혈소판 응집을 방지한다; 그리고 3) 이들은 혈관벽을 둘러싸는 평활근 세포 증식의 조절에 기여하는데, 그렇지 않을 경우 혈관이 수축되고 혈액 흐름이 방해된다.
어떤 혈관질병들은 혈관벽 내막의 퇴화, 혈소판의 응집 및 평활근의 세포작용의 혼란 등의 특징을 나타낸다. 이러한 이상상태들은 혈관을 봉쇄하게 되고, 순환계를 통한 혈액의 방해 없는 흐름을 제공하는 능력에 영향을 미친다. 이러한 이상 상태들의 하나 이상을 포함하는 질병은 말초혈관질병 및 폐고혈압증이다. 각 질병들이 혈관의 특정부위에 영향을 미친다고 하지만, 이들 모두는 혈관의 비정상적인 수축을 일으켜서 혈액흐름을 감소시키고, 혈압 및 혈관저항을 증가시키는 혈관수축 특징이 있다. 뿐 만아니라, 이러한 질병들은 프로스타사이클린과 같은 변형되지 않은 프로스타글란딘의 생성감소를 유발한다.
폐고혈압증은 진단 및 치료가 어렵고, 현재까지 불치의 진행성이며, 생명을 위협하는 혈관질병이다. 이는 몸의 다른 부분에서는 정상혈압을 나타내지만, 폐혈관으로 알려진 심장과 폐 사이의 혈압이 상승하는 특징이 있다. 고혈압은 폐혈관의 협소함에 기인한다. 이 이상 상태는 영향받은 혈관에서의 프로스타사이클린의 생성 감소와 일치한다.
상승된 폐혈관의 압력은 심장이 폐로 혈액을 펌프질 할 때, 전형적으로 오른쪽 심장에 손상을 일으키게 한다. 초기 폐고혈압증을 가진 환자들은 전형적으로 그들이 질병을 가지고 있는지 알아채지 못한다. 그러나, 병이 진행함에 따라, 환자들은 호흡 곤란, 졸도 및 정상적인 일상활동을 수행하는데 어려움을 겪게 된다. 치료되지 않은, 진행된 폐고혈압증을 가진 환자는 종종 불구가 되고, 심장마비로 사망할 수 있다.
전통적으로, 폐고혈압증은 2가지의 명확한 증상으로 구성되는 것으로 여겨진다: 원발성 폐고혈압증 및 속발성 폐고혈압증. 원발성 폐고혈압증은 확인된 구체적 원인이 없는 폐고혈압증으로 정의된다. 속발성 폐고혈압증은 심장, 폐 또는 간 기능장애 또는 경피증(scleroderma), 연결조직 질병과 같은 알려진 원인을 가진 폐고혈압으로 정의된다. 여기에서의 "폐고혈압증"이라는 용어는 원발성 및 속발성 폐고혈압증 모두를 포함하여 사용된다.
미국의 수 많은 사람들이 원발성 폐고혈압증으로 진단되어 왔지만, 더 많은 사람들이 진행성 속발성 폐고혈압증으로 진단되어 오고 있다. 1989년, 흉부의사의 미국 대학의 공식 간행물인 "체스트(Chest)"에 게재된 보고서에 의하면, 미국 남성에서의 폐고혈압증의 유병율(prevalence)은 35-44세 남성의 경우 8-13%이다. 또한 65세 이상의 남성의 경우 폐고혈압증의 유병율은 20%를 넘는다고 보고했다. 원발성 폐고혈압증 및 진행된 속발성 폐고혈압증은 프로스타사이클린의 존재에 반응을 보인다는 것을 보고했다.
혈관 및 림프관이 폐 기관의 바깥에서 영향을 받을 때, 그 증상은 일반적으로 말초혈관질병으로 정의된다. 이 질병은 다음의 경우에 제한되지 않고, 허혈성 뇌혈관질병, 동정맥루, 허혈성 다리궤양, 정맥염, 정맥부전, 괴저, 간신증후군, 비동맥관개존증, 비장애성장간막허혈, 동맥염, 림프관염 등을 포함한다. 말초혈관질병의 정확한 원인은 알려져 있지 않지만, 당뇨, 비만, 아테롬경화증, 흡연, 운동부족 및 심혈관이상 등이 이 질병과 관련되어 있다. 이 질병의 초기단계에서, 환자는증상을 나타내지 않다가 보행 중에 가벼운 통증에서 심한 통증을 경험한다. 이 질병이 진행됨에 따라, 환자는 휴식시 다리통증을 느끼고 상처치료의 지연을 겪게 되는데, 때때로 이는 궤양, 괴저 및 절단으로 이끌어가게 된다. 말기 말초혈관질병 환자의 평균 생존기간은 약 6년이다.
말초혈관질병은 미국에서 약 6백만의 사람들에게 영향을 미치고 있다. 뿐 만아니라, 미국에서 말초혈관질병으로 확인된 약 350,000의 새로운 케이스가 있다. 또한 말초혈관질병은 프로스타사이클린을 포함하는 프로스타글란딘의 존재에 반응을 보인다.
프로스타글란딘은 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 질병에 유용한데, 이들이 혈관의 비정상적인 수축을 방지하여 혈액흐름에 긍정적인 효과를 가지기 때문이다. 그러나, 많은 프로스타글란딘 및 프로스타사이클린을 포함하는 프로스타글란딘 동족체들은 아주 짧은 작용기를 가져서, 환자들이 효과적으로 치료되기 위해서는 계속적이고 지속적인 치료가 요구된다. 지금까지, 프로스타글란딘 및 이것의 동족들의 사용은 화학적 불안정, 짧은 유효기(effective life) 및 투여의 제한된 방식때문에 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료에 심한 제한이 있었다.
프로스타글란딘의 짧은 유효기는 a) 효소에 의한 분자의 활성기(active group)의 빠른 불활성화, b) 체내에서 쉽게 제거되고 배출되는 작은 분자량에 기인한다.
프로스타글란딘은 전형적으로 하이드록실 및 카르복실기의 형태에서 활성부위를 가진다. 효소는 빠르게 활성기를 불활성화시켜서 화합물을 효과가 없게 만들어 버린다. 이 문제를 극복하기 위해, 즉 치료학적으로 유효한 화합물의 수준을 유지하기 위해 환자에게 고용량 프로스타글란딘의 계속적인 투입, 또는 빈번하게 주입하는 방법들을 시행해 왔다. 그러나, 이런 용량요법은 치료비용이 많이 들고, 원하지 않는 부작용 가능성이 높기 때문에 바람직하지 않다. 몇몇 부작용은 구역질, 부종, 위장이상, 턱통증, 발진 및 두통을 포함한다. 어떤 환자에 있어서는 심한 부작용으로 치료가 중단되기도 하였다.
수 많은 프로스타글란딘 및 프로스타사이클린과 같은 프로스타글란딘의 동족체들은 향상된 안정성, 광범위한 투여방법, 더 효과적인 활성 및/또는 더 긴 유효기를 제공하는, 약제학적으로 수용할 수 있는 제제를 발견하려는 목적으로 제조되어오고 있다. 연구자들은 침해가 적으며 더 편리한 의학치료를 제공하기 위해, 경구를 통해 효과적으로 투여될 수 있는 프로스타글란딘 및 이것의 동족체를 연구해오고 있다. 현재의 프로스타글란딘 및 이것의 동족체의 경구형태는 전형적으로 약 1.5시간, 어떤 경우에는 단지 수 분의 유효기를 가진다. 이 짧은 유효기는 환자들에 빈번한 투약을 하게 해서, 환자들, 특히 만성질병을 겪고 있는 환자에게 투여 상의 문제를 일으키게 한다.
단백질, 효소 등과 같은 생물학적으로 활성물질의 폴리머와의 결합은 유효기, 생체 내에서의 활성물질의 수용성 또는 항원성을 증가시키는 것으로 제시하고있다. 예로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 유사한 수용성 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)에의 결합은 여기의 참고문헌으로 도입된 미국 특허 제 4,179,337호에 설명되어 있다. 또한, 누시 엠(Nucci M.), 쇼르 알지엘(ShorrRGL) 및 아부코우스키 에이(Abuchowski A.), "향상된 약물 전달 고찰(Advanced Drug Delivery Reviews)", 6: 133-151: 1991; 해리스 제이엠(Harris JM)(de.); 및 "폴리에틸렌 글리콜 화학(Polyethylene Glycol Chemistry): 생물기술 밍 생의학 응용(Biothechnical and Biomedical Application):, Plenum Press, NY, 1992을 보라. 콘쥬게이트(conjugates)들은 일반적으로 치료제를 예를 들면, 말단 연결기를 포함하도록, 변형된 폴리머의 몇 배 수의 몰랄농도와 반응시킴으로써 형성된다. 연결기는 활성물질을 폴리머에 연결할 수 있게 한다. 이런 방식으로 변형된 폴리펩타이드는 감소된 면역원성 및 항원성을 나타내고, 변형되지 않는 형태와 비교하여 혈액흐름 내에서 더 높은 유효기를 가지는 경향이 있다.
폴리알킬렌 옥사이드를 활성물질과 결합시키기 위해, 말단 하이드록실기의 적어도 하나가 반응성의 작용기로 변환된다. 이 과정은 종종 "활성화"라고 불리고, 생성물은 "활성화 폴리알킬렌 옥사이드"라고 불린다. 다른 실질적 비-항원성 폴리머는 유사하게 "활성화" 또는 "기능성화"된다.
활성화 폴리머는 결합부위로 작용하는 친핵성 작용기를 가진 치료제와 반응된다. 일반적으로 결합부위로 사용되는 하나의 친핵성 작용기는 라이신의 e-아미노기이다. 유리 카르복실기, 적당하게 활성화된 카르보닐기, 산화된 카르보하이드레이트 성분, 멀캅토기(mercapto group)들은 또한 결합부위로 사용되어 오고있다.
생물학적으로 활성인 폴리머 콘쥬게이트들은 프로드러그(prodrug)(여기의 모체 성분들은 결국은 생체 내에서 유리된다)를 생산하기 위해, 폴리머 및 모체가 되는 생물학적-활성성분 사이에 가수분해되는 결합을 가지도록 형성될 수 있다. 또한프로드러그를 제조하기 위한 몇 가지 방법들이 제시되어 오고있다. 프로드러그는 투여시에, 생체 내에서 결국은 활성 모체 화합물을 유리시킬 생물학적-활성 모체 화합물의 화학 유도체를 포함한다. 프로드러그는 생체 내에서 생물학적으로 활성인 화합물의 작용의 개시 및/또는 지속을 변경시킬 수 있도록 하기 때문에 이점을 가진다. 프로드러그는 종종 생물학적으로 불활성이거나, 활성 화합물의 실질적인 불활성 형태이다. 활성 약물의 릴리스율은 생물학적으로 활성인 화합물을 프로드러그 캐리어(예, 폴리머)에 결합시키는 연결체(linker)의 가수분해율을 포함하여 몇 가지 요소들에 의해 영향을 받는다.
프로스타글란딘 및 프로스타사이클린과 같은 이들의 동족체들은 치료제로 신뢰성을 가지고 있음에도 불구하고, a) 이런 화합물의 안정성을 향상시킬 필요, b) 이 화합물의 유효기를 연장시킬 필요, 및 c) 이 화합물을 현재 이용할 수 있는 것보다 더 많은 환자에게 친숙한 용량요법으로 투여될 수 있게 할 필요가 있다.
따라서, 만일 프로스타글란딘 및 이의 동족체 및 이들을 포함하는 조성물들이, 안정성의 향상, 프로스타글란딘 및 이것의 동족체를 사용하는 현재의 치료보다 더 환자 친화성이 큰 방식, 및 합리적인 빈도로 투여할 수 있는 충분한 지속 유효기를 가지도록 발전될 수 있다면, 이는 약물치료 분야, 특히 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료에 있어서 현저한 발전이라 할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 일반적으로 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료에 적합한 활성을 가진 신규한 프로스타글란딘 화합물 및 이것의 동족체에 관한 것이다.
본 발명은 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 이 화합물 및 조성물의 투여방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은, 약제학적으로 수용 가능한 조성형태로 말초혈관질병 및 폐고혈압의 치료를 위해 화합물의 전달을 향상시키는 온혈동물에서 향상된 화학 안정성 및 유효기를 가진다. 공지된 프로스타글란딘 화합물의 하나 이상의 활성부위를 변경시킴으로써 안정성, 유효기의 향상, 그리고 투여 및 용량 요법의 더 수용가능한 방식이 가능하게 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태에 의하면, 본 발명의 프로스타글란딘 화합물 또는 이의 동족체의 하나 이상의 활성 부위에 화합물의 대사율을 지연시키는 약제학적으로 수용가능한 기(group)가 제공된다. 대사율의 감소는 a) 활성 화합물의 더 유효한 투여를 제공하고, b) 더 많은 환자-친화성 용량요법을 가능하게 하는 활성 화합물의 유효기의 연장이 가능하게 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명의 변형된 프로스타글란딘 화합물 및 이것의 동족체의 치료적으로 유효량의 동물에의 투여를 포함하는, 폐고혈압 및/또는 말초혈관질병을 나타내는 온혈동물의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 아래에서 나타낸 바와 같이, 식 Ⅰa 및 Ⅰb를 가지는 화합물 및 약제학적으로 수용가능한 이것의 염이 제공된다.
[P-T]n-Z Ⅰa
P-[T-Z]nⅠb
상기 식의 P는 프로스타글란딘 화합물 또는 이의 동족체이고, T는 P의 변형된 활성기을 나타내고, Z는 T에 결합된 약제학적으로 수용가능한 기이며 상기 화합물의 대사율을 지연시키고;
n은 1이상의 정수이다;
본 발명은 변형된 프로스타글란딘(prostaglandin), 특히 말초혈관질병 및 폐고혈압증의 치료에 사용하기 위한, 장기간 작용하는 프로스타글란딘을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도1은 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 양(sheep)에 정맥주입된 mPEG20kDa-아미드-화합물 X의 투약이 폐동맥압에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다;
도2는 볼루스(bolus) 투여된, mPEG20kDa-에스테르-화합물 X의 투약이 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 양의 폐동맥압에 미치는 영향을 설명하는 그래프이다;
도3은 분무제로 투여된, mPEG20kDa-에스테르-화합물 X의 투약이 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 양의 폐동맥압에 미치는 영향을 설명하는 그패프이다;
도4은 정맥내 볼루스 투여된, mPEG20kDa-에스테르-화합물 X의 투약이 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 양의 폐동맥압에 미치는 영향을 설명하는 그패프이다; 및
도5은 분무제롤 각각 투여된, mPEG20kDa-에스테르-화합물 X 및 변형되지 않은 화합물 X의 폐고혈압제로 고혈압이 유도된 각각의 양의 폐동맥압에 미치는 영향을 나타내는 그패프이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 인간을 포함하는 온혈동물에 투여되었을 때, 활성부위를 보호하는 구조를 가지는 불활성, 비-항원성, 비-면역성기(group)가 적어도 하나의 활성부위에 결합되어, 화합물의 더 장기간의 유효기를 제공하는 신규한 프로스타글란딘 및 이의 동족체들에 관한 것이다. 그 결과로, 더 많은 화합물이 더 장기간 목표부위(예를 들면, 상처부위 및 폐동맥과 같은 맥관구조 부위)를 치료하게 함으로써 혈관질병 치료에 유용할 수 있다. 더 많은 활성 화합물이 이용 가능하기 때문에, 투약요법은 환자의 부담을 덜게 된다. 여기서 사용된 바와 같이, "유효기"라는 용어는 온혈동물에서 본 화합물이 그들의 활성형태로 존재하는 동안의 시간을 의미한다.
활성기의 적어도 하나의 보호(protection)는 일반적으로 프로스타글란딘 화합물의 유효기를 증가시켜서, 프로스타글란딘 화합물의 변형되지 않은 또는 보호되지 않는 형태와 비교하여 투여의 다양한 방식에 더 적합하도록 한다.
여기서 사용된, 이하 집합적으로 "프로스타글란딘 화합물"이라 언급될 "프로스타글란딘 화합물 및 이의 동족체"라는 용어는, 모든 프로스타글란딘 화합물 및 적어도 하나의 활성기(예, COOH기 및/또는 OH기)를 가지고 온혈동물에서 말초혈관질병 및 폐고혈압 치료에 적어도 최소한 효과를 가지는 이것의 변이체를 의미한다. 여기서 사용된, "본 프로스타글란딘 화합물"이라는 용어는 본 발명에 따라 변형된, 정의된 것과 같은 프로스타글란딘 화합물을 의미한다. 여기서 사용된, "활성기(active group)"라는 용어는 혈관조직과 같은 목표조직에 결합 또는 기타 맞물릴 수 있는 프로스타글란딘 화합물상의 자리를 의미한다.
본 발명은 모든 종류의 본 프로스타글란딘(PG) 화합물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 사용된 본 프로스타글란딘 화합물은 전술한 모든 서브타입뿐 만아니라 변형된 PGA, PGB, PGC, PGD, PGE, PGF 및 PGI 타입 화합물을 포함한다. 프로스타글란딘 화합물들은 온혈동물로부터 분리되거나 추출될 수 있고, 또는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 공지된 기술로 합성,제조될 수 있다.
바람직한 본 프로스타글란딘 화합물은 식Ⅱ으로 표현된다.
여기의 Z1및 Z2는 수소 및, Z1및 Z2의 적어도 하나가 수소가 아닌 경우 식Ⅰ에서 앞서 Z에 대해 정의된 기(group)로부터 독립적으로 선택되고;
X는 O 또는 NH로부터 선택된다.
식Ⅱ의 더 바람직한 화합물은 아래에서 정의한 그룹1, 2 및 3의 화합물들인데, 여기서;
그룹1 화합물의 경우:
Z1는 X에 결합하고 화합물의 대사율을 늦추는 약제학적으로 수용가능한 폴리머이이고;
X는 O 또는 NH로부터 선택되고, Z2는 H 및 아세틸기(acetyl group)로부터 선택된다;
그룹2 화합물의 경우:
Z1는 수소이고;
X는 O 이고, Z2는 화합물의 대사율을 늦추고 에스테르기(ester group)를 통하여 산소에 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머이다;
그룹3 화합물의 경우:
Z1는 그룹1에서 정의된 것과 같은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고;
X는 O 또는 NH이고, Z2는 에스테르기를 통하여 산소에 결합된 그룹2에서 정의된 것과 같은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이다.
또한 바람직한 화합물은 식Ⅲ으로도 표현된다.
여기의 Z1및 Z2는 식Ⅱ에서 앞서 정의된 것과 같은 기를 포함한다;
f는 1에서 3까지의 정수이다;
X는 O 및 NH로부터 선택된다;
R은 수소 및 바람직하게 1-6탄소원자를 가지는 알킬기(alkyl group)로부터 선택된다.
식Ⅲ의 보다 바람직한 화합물은 그룹4, 5 및 6의 화합물들인데, 여기서;
그룹4 화합물의 경우:
Z1는 X에 결합하고 화합물의 대사율을 늦추는, 약제학적으로 수용가능한 폴리머이다;
X는 O 또는 NH로부터 선택되고, Z2는 H 및 아세틸기(acetyl group)로부터 선택된다;
그룹5 화합물의 경우:
Z1는 수소이고, X는 O 이고, Z2는 아세틸기 또는 화합물의 대사율을 늦추고 에스테르기 또는 에테르기(ether group)를 통하여 산소에 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머이다;
그룹6 화합물의 경우:
Z1는 그룹4에서 정의된 것과 같은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고, X는 O 및 NH로부터 선택되고, Z2는 그룹5에서 정의된 것과 같은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이다.
아주 바람직한 화합물은, Z1및/또는 Z2기들이 a가 1에서 약 1000까지의 정수인 식 CH3OCH2CH2(OCH2CH2)a를 가지는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)인 화합물이다.
본 프로스타글란딘 화합물의 특히 바람직한 그룹들은 식Ⅳ를 가지는 그룹들이다.
여기서 a 및 X는 위에서 정의한 것과 같다. 바람직하게는 a는 약6에서 600까지고, 가장 바람직하게는 약6에서 460이다.
또한, 본 발명은 식Ⅰ 화합물의 유효량을 온혈동물에 투여하는 것을 포함하는, 말초혈관질병 및/또는 폐고혈압으로 고통받는 온혈동물의 치료방법을 제공한다. 상기 목적을 위해 온혈동물에 투여하기에 적합한 상기 화합물을 포함하는 조성물들은 본 발명의 일부분이다.
말초혈관질병은 다리 및 발 쪽으로의 혈액 흐름을 감소시켜 허혈(ischemia)을 동반하는 것을 특징으로 한다. 혈관의 내벽에 프라그(plaque)의 침착 및 주요 동맥의 진행성 비후 및 경화가 이 질병의 특징이다. 기관의 말초혈관질병은 또한 염증 및 조직 손상을 수반한다. 만성적인 가벼운 통증에서부터 심한 통증, 운동성의 상실, 괴저, 허혈성 궤양, 상처치료의 지연 및 사지의 상실들은 전형적으로 말초혈관질병과 관련된다.
폐고혈압은 폐혈관의 협소화 및 폐동맥의 위험스러운 높은 압력을 특징으로 한다. 내피 세포 및 평활근세포의 비정상적인 상호작용이 평활근을 수축하게 하는 것이 이 질병의 특징이다. 또한 기관 폐고혈압은 염증, 및 혈관을 더 좁게하고 벽을 두껍게 하는 반흔조직(scar tissue)을 생성하게 하는 조직손상을 수반한다. 만성적인 가벼운 통증에서부터 심한 통증, 운동성의 상실, 언젠가 발생할 심장마비 및 죽음은 폐고혈압과 관련된다.
양 혈관질병은 혈액흐름을 감소시키고 혈관저항을 증가시키는 혈관의 비정상적인 수축을 특징으로 한다. 말초혈관질병으로 고통받는 환자에의 본 프로스타글란딘 화합물의 투여는 상처받은 혈관을 통하여 혈액흐름의 증가를 촉진시켜 허혈조직으로의 산소투여를 증가시킨다. 더욱이, 본 프로스타글란딘 화합물의 항-혈소판 응집 및 세포보호 활성은 손상된 조직의 염증반응을 억제하여 상처치료를 촉진하는 것으로 여겨진다.
폐고혈압에 관련하여, 혈관확장은 본 프로스타글란딘 화합물에 의해 유발되고, 폐의 소동맥 내의 평활근의 이완, 확장기 혈압의 저하, 응고형성의 방지 및 폐내의 반흔의 소실을 일으키는 것으로 여겨진다. 이들 효과들은 폐동맥압 및 폐혈관 저항의 실질적인 감소를 유도한다. 더욱이, 말초혈관질병의 경우와 같이, 프로스타글란딘 화합물의 고유한 항-혈소판 응집 및 세포보호 활성은 손상된 조직에서의 염증반응을 억제시킴으로써 또한 상처치유를 촉진하는 것으로 여겨진다.
본 발명의 하나의 양태에서, 프로스타글란딘 화합물의 하나 이상의 활성기(예를 들면, COOH 및 OH)들은 직선쇄, 가지쇄 및/또는 원형 폴리머 및 불활성, 비-항원성 및 비-면역성인 코폴리머에 결합된다. 뿐만 아니라, 폴리머는 온혈동물의 목표 부위에 본 프로스타글란딘 화합물의 전달에 적합한 비율로 프로스타글란딘 화합물로부터 분리될 수 있어야 한다. 어떤 폴리머가 프로스타글란딘 화합물에 결합된 채로 남아서 말초혈관질병 및 폐고혈압의 치료에 역효과를 미쳐서는 안된다.
프로스타글란딘을 폴리알킬렌 옥사이드와 같은 폴리머에 결합시키기 위해, 폴리머의 하나 이상의 하이드록실기가 결합을 허용하는 반응성의 작용기로 전환된다.
활성화된 폴리머는, 유리(free) 카르복실산기 및/또는 하이드록실기에서 결합이 바람직하게 일어나도록 프로스타글란딘 화합물과 반응한다. 프로스타글란딘 화합물상에 이용가능하거나 또는 이용가능하도록 만들어지면, 적합하게 활성화된 카르보닐기, 산화된 카르보하이드레이트 분자 및 멀캅토기(mercapto group)들은 또한 결합부위로 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 아미드 또는 에스테르 결합이 카르복실릭기 또는 하이드록실기 및 활성화된 폴리알킬렌 옥사이드 사이에서 형성된다. 우레탄-형성 링커(linker) 등으로 할성화된 폴리머, 및 카르복실릭기 또는 다른 기를 경유하여 폴리머의 프로스타글란딘 화합물에의 결합을 용이하게 하는 다른 작용기들은 본 발명의 범위에 든다.
실질적인 비-항원성 폴리머 중에는, 폴리알킬렌 옥사이드(PAO's), 특히 모노-활성화된 것, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 특히 모노메틸-말단 폴리에틸렌 글리콜(mPEG's)과 같은 알킬-말단 폴리알킬렌 옥사이드들이 있다. 또한, 비스-활성폴리에틸렌 옥사이드는 프로스타글란딘 화합물을 가교할 목적, 또는 폐 또는 사지말단의 혈관과 같은 목표 부위에 폴리머-프로스타글란딘 결합을 위치시키기 위해 타켓팅 제제와 같은 다른 분자들을 결합시키는 수단을 제공할 목적을 위해 고려된다.
적합한 폴리머, 특히 PEG 또는 mPEG는 실질적으로 분자량에 의해 변할 것이다. 약 200에서 약80,000 달돈(daltons) 범위의 분자량을 가지는 폴리머는 전형적으로 본 발명에 사용된다. 약 2,000에서 약 42,000 달톤까지의 분자량이 바람직하며, 약 5,000에서 약 28,000까지의 분자량이 특히 바람직하다.
보호기(protective group)로 본 발명에 바람직하게 사용된 폴리머들은 상온에서 수용성이다. 이러한 폴리머들의 제한되지 않은 리스트는 PEG 및 mPEG와 같은 폴리알킬렌 옥사이드 호모폴리머(homopolymer) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 이것의 코폴리머 및 이것의 블럭(block) 코폴리머를 포함한다. mPEG뿐 아니라, C1-4알킬-말단 폴리머도 또한 유용하다.
PAO-계 폴리머의 대안으로, 덱스트란(dextran), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidones), 폴리아크릴아미드(polyacrylamides), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohols), 카보하이드레이트-계 폴리머(carbohydrate-based polymers) 등과 같은 효과적인 비-항원성 물질들이 사용될 수 있다. 프로스타글란딘 화합물의 변형은 다음에 제한되지 않고, 아세틸화, 카르복시화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화 반응을 더 포함한다. 이 분야의 통상의 기술을 가진 자는전술한 리스트가 단지 예시적이고, 여기의 특성을 가지는 모든 폴리머 물질들이 고려된다는 것을 깨닫게 될 것이다.
프로스타글란딘 화합물은 활성 화합물을 목표 부위에 효과적으로 전달하는 본 프로스타글란딘 화합물을 제공하고, 공지된 프로스타글란딘 화합물보다 더 장기간 목표 부위 내에 본 프로스타글란딘 화합물을 유지하기 위해 전술한 바와 같이 보호기에 결합된다. 따라서 본 프로스타글란딘 화합물은 말초혈관질병 및 폐고혈압의 치료에 특히 적합하다.
앞서 지적된 바와 같이, 말초혈관질병 및 폐고혈압 치료에 사용된 많은 공지된 프로스타글란딘 화합물들은 온혈동물 내에서 아주 짧은 유효기, 특히 1시간 이내의 유효기를 가진다. 본 발명에 따라, 수 시간까지 지속되는 향상된 유효기를 가지는 본 프로스타글란딘 화합물이 제공된다. 더 긴 유효기는 본 프로스타글란딘 화합물이 투여되는 회수를 줄이게 되고, 따라서 본 프로스타글란딘 화합물이 더 낮은 투약단위 및 적은 빈도로 투약되게 할 수 있다.
본 프로스타글란딘 화합물의 활성기는 COOH 및 OH기를 포함한다. 하나 이상의 이들 활성기들은 이하에서 더 상세하게 설명한 바와 같이 보호기에 의해 보호된다. 이 보호기들은 일반적으로 500,000 또는 그 이상의 분자량을 가진다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 적어도 5,000달톤, 더 바람직하게는 적어도 20,000달톤의 분자량을 가지는 기는 OH기가 보호되지 않을 때 COOH에 결합되어야 한다. 또한, 적어도 5,000달톤의 분자량의 보호기는 화합물의 분비를 늦출 수 있고, 따라서 온혈동물에서 유효기를 향상시키는데 기여할 수 있다는 것이 관찰되었다.
보호기는 이른 대사로부터 활성기(COOH 및 OH)를 보호하도록 작용하지만, 그러나 조절된 방식에서 활성기로부터 쉽게 분리되고 및/또는 화합물의 작용에 역효과를 미치지 않고 활성기에 결합될 수 있는 어떤 기를 말한다. 이런 보호기들은, 예를 들면, 폴리머, 직쇄 및 가지쇄 알킬기(alkyl groups), 아랄킬기(aralkyl groups), 아릴기(aryl groups), 아킬기(acyl groups), 헤테로사이클릭기(heterocyclic groups), 예로, 알킬, 아릴 및 아랄킬기 등으로부터 선택된 치환체로 치환될 수 있는 모든 아킬렌기(alkylene groups)를 포함한다.
활성기에 결합될 수 있는 폴리머들 중에는 폴리글리콜, 폴리비닐 폴리머, 폴리에스테르, 폴리아미드, 다당류 및 폴리메릭산, 지방, 아미노산, 핵산 , 탄수화물 및 이들의 조합을 포함하는 것들이 있다.
바람직한 폴리글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다.
바람직한 다당류는 다당류B로부터 선택된 것들이다.
본 발명에 따라 바람직하게 사용될 수 있는 폴리산들 중에는 폴리아미노산 및 폴리아틱산이 있다.
상기에서 설명한 폴리머의 분류 중에서 바람직한 폴리머들은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이었다.
상기 설명한 폴리머뿐 아니라, 덱스트란, 셀룰로우스 폴리머 및 전분과 같은 폴리머들이 본 발명에 따라 또한 사용될 수 있다.
폴리머들은 예로, 아미드기, 에스테르기 등과 같은 기를 통하여 활성 COOH또는 OH기에 결합될 수 있다.
식Ⅰ의 화합물은 전형적으로 말초혈관질병 및 폐고혈압을 포함하는 혈관질병 치료를 위해 약제학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약제적 조성물의 일부분으로 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 사용된 화합물은 전형적으로 0.5에서 100mg/kg/day, 바람직하게는 약 25에서 35mg/kg/day까지의 양으로 투여된다.
식Ⅰ의 적어도 하나의 화합물을 포함하는 약제 조성물은 약제 제형분야에 공지된 기술에 따라 요구되는 투여 형태(예를 들면, 부형제, 고착제, 보존제, 안정제, 착향제 등)에 적합한 타입의 약제 첨가제뿐 아니라, 전통적인 고체 또는 액체 부형제 또는 희석제를 사용함으로써 제형될 수 있다.
식Ⅰ의 화합물은 어떤 적합한 수단들, 예를 들면, 정제, 캡슐, 과립 또는 파우더 형태와 같은 경구적 방법; 설하투여 방법; 볼투여 방법 ; 피하, 정맥내, 근육내 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술들(예를 들면, 살균한 주사가능한 수용성 또는 비-수용성 용액 또는 현탄액으로)과 같은 비경구적 방법; 흡입 스프레이와 같은 코를 통한 방법; 크림 또는 연고의 형태와 같은 국소적 방법; 또는 좌약 형태와 같은 직장 투여방법; 비-독성, 약제학적으로 수용가능한 부형제 또는 희석제를 포함하는 투여량 단위 제형에 의해 투여될 수 있다. 본 프로스타글란딘 화합물은 본 화합물을 포함하는 적당한 약제 조성물의 사용에 의한 즉각적인 릴리스(release) 또는 연장된 릴리스를 위해 기초될 수 있다. 특히 연장된 릴리스의 경우 피하 임플란트 또는 삼투펌프와 같은 장치를 사용에 의한다. 본 발명은 또한 리포솜을 통한 투여가 가능하다.
경구 투여을 위한 전형적인 조성물은 예를 들어, 부피를 주기 위한 미정질 셀룰로우즈(microcrystalline cellulose), 부유제로 알긴산 또는 소듐 알기네이트, 점성 향상제로 메틸셀룰로우즈 및 이 분야의 기술에 공지된 것과 같은 감미료 또는 착향제를 함유하는 현탄액; 그리고 예를 들어, 미정질 셀룰로우즈, 인산이칼슘, 전분, 스테아르산 마그네슘 및/또는 젖당 및/또는 이 기술분야에서 잘 알려진 것과 같은 다른 부형제, 고착제, 증량제, 붕괴제, 희석제 및 윤활제을 포함한다. 또한, 본 화합물은 설하 및/또는 볼(buccal) 투여로 구강을 통하여 전달될 수 있다. 주형된 정제 또는 냉동-건조된 정제들은 사용될 수 있는 전형적인 형태이다. 전형적인 조성물은 만니톨, 젖당, 수크로오스, 및/또는 사이클로덱스트린과 같은 빠른 용해 희석제로 본 화합물을 제형하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 제형에 포함된 것은 셀룰로우즈(아비셀(avicel))와 같은 고분자량의 부형제가 될 수 있다. 또한, 이런 제형들은 점막 부착을 돕기 위해 하이드록실 프로필 셀룰로우즈(HPC), 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로우즈(HPMC), 소듐 카르복실 메틸 셀룰로우즈(SCMC), 말레익 안하이드라이드 코폴리머(예로, Gantrez)와 같은 부형제, 및 릴리스를 조절하기 위해 폴리아크릴릭 코폴리머(예로, Carbopol 934)와 같은 제제를 포함할 수 있다. 쉬운 제작 및 사용을 위해 윤활제, 글리던트(glidants), 착향제, 착색제 및 안정제들이 또한 첨가될 수 있다.
비강 분무제 또는 흡입 투여를 위한 전형적인 조성물은 예를 들어, 벤질 알콜 또는 다른 적당한 보존제, 생체이용율을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 이 분야기술에 공지된 다른 용해제 또는 분산제를 포함하는 염수 내의 용액을 포함한다.
비경구 투여를 위한 전형적인 조성물은 예를 들어, 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거 용액, 등장성의 소듐 클로라이드 용액과 같은 적당한 비-독성, 비경구적으로 수용가능한 희석제 또는 용매, 또는 합성 모노-또는 디글리세리드 및 올레산을 포함하는 지방산을 포함하는 다른 적당한 분산제 또는 전착제 및 현탄제를 포함하는 주입가능한 용액 또는 현탄액을 포함한다.
직장 투여를 위한 전형적인 조성물은 예를 들어, 코코아 버터 또는 합성 글리세리드 에스테르와 같은, 상온에서 고체이며, 약물을 릴리스하기 위해 직장강에서 액체화 및/또는 용해되는 적당한 비-자극성 부형제를 포함하는 좌약을 포함한다.
국소 투여를 위한 전형적인 조성물은 플라스티베이스(Plastibase)(폴리에틸렌으로 교질화된 미네랄 오일)와 같은 국소 캐리어를 포함한다.
본 프로스타글란딘 화합물의 유효량은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 것이고, 성인의 경우 본 프로스타글란딘 화합물을 1일, 체중당 약 0.5에서 100mg/kg까지의 전형적인 투약을 포함하는데, 단일 투약 또는 1일 1-4회와 같이 각각 나눠진 투약의 형태로 투여될 수 있다. 어떤 특정 대상에 대한 구체적인 투약 수준 및 투여 빈도는 변경될 수 있고, 구체적 화합물의 활성, 종(species), 나이, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 대상의 식사법, 투여의 형태 및 시간, 분비율, 약물 조합 및 특정 조건의 심함을 포함하는 다양한 인자들에 따라 변할 것이라는 것이 이해될 것이다. 치료를 위한 바람직한 대상은 동물, 가장 바람직하게는 사람과 같은 포유류, 개, 고양이 등의 가축, 혈관질병이 있는 대상을 포함한다.
일반적으로, 공지된 변형되지 않은 또는 결합되지 않은 프로스타글란딘 화합물과 비교되었을 때, 원하는 효과 즉, 질병에 걸린 혈관의 확장을 얻기위해 본 프로스타글란딘 화합물의 현저하게 낮은 투약이 요구된다. 공지된 변형되지 않은 또는 결합되지 않은 공지된 프로스타글란딘 화합물의 생체 내에서의 빠른 대사 때문에, 치료받는 환자의 유효 혈중 수준을 유지하기 위해 이들 약물들이 상대적으로 큰 용량으로 장기간의 연속적인 투여가 요구되어 왔다. 하지만, 공지된 프로스타글란딘 화합물의 높은 혈중 수준에 의해 생긴 다른 부작용 중에 저혈압증, 빈맥 및 설사는 투여될 수 있는 공지된 프로스타글란딘 화합물 용량에 제한을 두게 하였다. 더욱이, 프로스타글란딘 화합물의 높은 비용은 이런 많은 용량의 정맥내 투여에 엄청난 비용이 들게한다. 본 발명의 방법은 감소된 비용 및 부작용으로 본 프로스타글란딘 화합물의 효과적인 투여를 제공한다.
본 발명의 본 프로스타글란딘 화합물은 액상의 재구성된 형태, 보존제, 완충용액, 분산제 등을 추가적으로 포함하는 동결건조된 파우더 형태로 피하에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 프로스타글란딘 화합물은 정맥주사를 위해 정상적으로 이용된 메디움, 예를 들면, 보존제가 없는 살균한 물로 재구성된다. 투여는 연속적인 정맥내 또는 피하주입 또는 정맥주사에 의해 수행될 수 있다. 연속적인 주입의 경우, 1일 용량은 정상적인 샐라인(saline) 또는 다른 용액 및 기계적인 펌프 또는 중역에 의해 주입된 용액에 첨가될 수 있다.
다음의 예들은 본 발명의 실시예를 예시한다. 이 분야의 통상의 기술을 가진자는, 출원서의 일부분을 형성하는 청구범위에 정의된 것과 같은 본 발명의 정신 및 범위에 벗어나지 않고 변화, 변경 및 변형들이 가능하다는 것을 곧 깨닫게 될 것이다.
실시예1
이하에서는 "화합물 1"로 언급되는 mPEG-5kDa-아미드-화합물X의 합성
Z1이 약 5,000달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 NH이며 Z2가 수소인 그룹4의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
아래의 식을 가진 화합물X 200mg이 mPEG5k 아민(2.5g), 2-하이드록시벤질트리아졸(HOBT, 67mg), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 61mg),
및 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 140mg)과 함께 둥근바닥 플라스크에 놓였다. 이 물질들은 60ml의 무수 메틸렌 클로라이드와 함께 혼합되었다. 이 혼합물은 상온에서 밤새 교반되었고, 그 후 증발에 의해 용매가 제거되었다. 잔여물은 25ml의 1,4디옥산에서 용해되었고 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었다. 이 용매는 응축되었고, 그 후 100ml의 50:50/에테르:이소프로판올내로 침전되었다. 이 침전물은 여과를 통해 수집되었고 진공 하에 건조되었다. 결과 산물은 2.5g(93%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 7.897(t,-PEGNH-CO-(화합물X)), 4.49(d,(화합물X)-OH 1), 4.24(d,(화합물X)-OH 2), 0.864(t,(화합물X)-CH 3), 4.436(s,(화합물X)-CH 2CONHPEG), 7.045(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예2
이하에서는 "화합물 2"로 언급되는 mPEG-5kDa-에스테르-화합물X 디아세테이트의 합성
Z1이 약 5,000달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 O이며 각 Z2가 아세틸기인 그룹4의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(400mg) 및 피리딘(200㎕)가 35ml의 무수 메틸렌 클로라이드에서 혼합되었다. 500㎕의 아세트산무수물이 현탄액에 첨가되었다. 혼합물은 수 시간 내에 균질화되었고 이 용액은 상온에서 밤새 교반되었다. 용매는 응축되었고 인산염 완충용액(0.1M, pH 7.4)인 잔여물에 첨가되었다. 이 혼합물은 곧 30분간 교반되었고, 메틸렌 클로라이드로 3회 추출되었다. 혼합된 유기상은 황산나트륨으로 건조되었고 용매는 증발에 의해 제거되었다. 기름성분의 산물,화합물X디아세테이트가 얻어졌다. 결과 산물은 340mg(80%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):1.91(s,(화합물X)-01COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-02COCH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3).
둥근 바닥 플라스크에서, mPEG5k(3.8g), 전단계로부터의 화합물X디아세테이트(320mg), 2-하이드록시벤질트리아졸(HOBT, 103mg), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 93mg) 및 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 238mg)들이 50ml의 무수 메틸렌 클로라이드와 함께 용해되었다. 이 용액은 상온에서 밤새 교반되었고, 증발에 의해 용매가 제거되었다. 잔여물은 35ml의 1,4디옥산에서 용해되었고 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었다. 이 용매는 응축되었고, 그 후 100ml의 50:50/에테르:이소프로판올 내로 침전되었다. 이 침전물은 여과를 통해 수집되었고 진공 하에 건조되었다. 결과 산물은 3.2g(78%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 4.23(t,-PEGOCH2CH 2O-CO-(화합물X)), 1.91(s,(화합물X)-O1COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-O2COCH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3), 4.77(s,(화합물X)-CH 2COOPEG), 7.03(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예3
이하에서는 "화합물 3"로 언급되는 mPEG20kDa-에스테르-화합물X의 합성
각 Z2가 -CO-(CH2)2-O-기를 통하여 결합된 약 20,000달톤의 분자량을 가진mPEG인 그룹5의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(200mg) 및 수산화 나트륨(21mg)이 40ml의 무수 아세토니트릴에서 혼합되었다. 90mg의 벤질 브로마이드가 현탄액에 첨가되었고 혼합물은 2일간 환류되었다. 고체는 여과에 의해 제거되었고, 용매는 농축되고, 잔여물은 진공 하에서 건조되었다. 기름성분의 산물, 화합물X-벤질 에스테르가 얻어졌다. 결과 산물은 210mg(100%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ7.37(s,C6 H 5-CH2-OCO-(화합물X)), 5.19(s,C6H5-CH 2-OCO-(화합물X)), 4.83(s,(화합물X)-CH 2COOBz), 4.49(d,(화합물X)-OH 1), 4.24(d,(화합물X)-OH 2), 0.864(t,(화합물X)-CH 3), 7.025(t, 화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
둥근 바닥 플라스크에서, mPEG20k(3g), 화합물X-벤질 에스테르(전단계에서 제조된, 100mg), HOBT(3mg), DMAP(25mg) 및 DCC(42mg)들이 40ml의 무수 메틸렌 클로라이드에서 용해되었다. 이 용액은 상온에서 밤새 교반되었고, 용매는 증발에 의해 제거되었다. 잔여물은 35ml의 1,4디옥산에서 용해되었고 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었다. 이 용매는 응축되었고, 그 후 100ml의 50:50/에테르:이소프로판올 내로 침전되었다. 이 침전물은 여과를 통해 수집되었고 진공 하에 건조되었다. 결과 산물은 2.7g(90%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 2.48(t,mPEG-OCH2CH 2COO-(화합물X)), 7.35(s,C6 H 5-CH2-OCO-(화합물X)), 5.17(s,C6H5-CH 2-OCO-(화합물X)), 4.83(s,(화합물X)-CH 2COOBz), 0.857(t,(화합물X)-CH 3), 7.025(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
1,4-디옥산(30ml)내의 mPEG-화합물X 벤질 에스테르(전단계에서 얻어진, 2.7g)의 용액이 H2(2기압) 및 1그램의 Pd/C(10%)로 밤새 수소화되었다. 여과에 의해 촉매는 제거되었고, 촉매는 신선한 메틸렌 클로라이드로 세척되었다. 혼합된 용액은 회전증발에 의해 응축되었고 잔여 시럽이 300ml의 에틸 에테르 내로 첨가되었다. 여과에 의해 산물이 수집되었고 진공 하에서 건조되었다. 산물은 2그램이었다(74%).1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 2.48(t,mPEG-OCH2CH 2COO-(화합물X)), 4.61(s,mPEG-(화합물X)-CH2COOH), 0.857(t,(화합물X)-CH 3), 7.025(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예4
생체 외에서 화합물X 및 화합물 1-3의 인간 혈장에
미치는 항-혈소판 효과
서론
건강한 사람으로부터의 인간 혈장에 대한 본 발명 화합물X 및 화합물 1-3의 항-혈소판 활성은 다음의 방법으로 측정되었다. 뿐만 아니라, 혈소판-부족-혈장(PPP) 및 수용 부형제로 배양 후 다양한 시간에 따른 각 화합물의 항-혈소판 반응들이 측정되었다.
방법
혈소판-풍부 혈장(PRP)의 제조
적어도 14일간 어떤 약도 복용하지 않은 건강한 사람으로부터의 혈액이 정맥천자(venipuncture)에 의해 3.15%(w/v) 트리-소듐 사이트레이트(9:1 v/v)내로 수집되었다. 혈액은 PRP를 얻기 위해 15분간 800g로 원심분리되었다. PRP는 PPP를 얻기 위해 1분간 12,000g로 더 원심분리되었다.
혈소판 응집의 광도측정
혈소판 응집은 PRP(0%) 및 PPP(100%)로 보정된 이중 채널 페이톤 애그리고미터(dual channel Payton aggregometer)를 사용하여 광투과 정도에 관하여 측정되었다. PRP(500㎕)의 일부가 실리콘화된 큐벳에 첨가되어, 교반되고(1000 revs/min) 37℃까지 데워졌다. 혈소판은 테스팅 전에 안정한 기준선을 확립하기 위해 1분간 배양되었다. 최고 농도 이하의 농도의 응집인자 콜라젠(㎕/ml)이 PRP에 첨가되었고, 혈소판 응집은 4분간에 걸쳐 측정된 광투과의 증가에 따라 모티터되었다.
항-응집 활성
응고인자 콜라젠(1㎍/ml)의 첨가 전에 화합물X(1-100 ng/ml) 및 화합물 1-3(0.1-10 mg/ml)이 1분간 PRP와 각각 배양되었다. 혈소판 응집의 억제 비율은 콜라젠의 첨가 후 4분간에 걸쳐 관찰된 광투과의 최고치 증가를 사용하여 대조군과 비교하여 계산되었다. 이 실험은 적어도 3명의 사람으로부터의 PRP를 사용하여 반복되었다.
테스트 결과는 표1에 나타내었다. 표1에서의 결과는 상기에서 설명한 테스트조건하에서 사람의 혈소판 응집에 대한 화합물X 및 화합물1-3의 농도-의존성 효과를 예시한다.
수성 부형제 및 PPP으로 배양된 후의 항-응집 반응
분리된 실험에서, 화합물X(30 및 300 ng/ml)의 샘플 및 화합물1(0.3 및 3 mg/ml); 화합물2(0.03, 0.3 및 3 mg/ml); 및 화합물3(3mg/ml)의 샘플들이 500㎕의 수성 부형제(아세테이트 완충용액)와 함께, 37℃에서 15분, 1시간 및 4시간을 포함하는 다양한 시간대 별로 배양되었다. 배양기 후에, 콜라젠을 첨가한 후의 항-응집 활성을 측정하기 위해, 대응하는 샘플 화합물과 함께 50㎕의 수성 부형제의 일부분이 신선한 PRP(450㎕)에 첨가되었다. 이 실험은 적어도 3명의 사람으로부터의 PPP를 사용하여 반복되었다. 15분, 1시간 및 4시간 동안 수성 부형제(아세테이트 완충용액)와 함께 배양한 후의 화합물X 및 화합물1-3의 사람 혈소판 응집에 미치는 영향들을 각각 표2에 나타내었다. 15분, 1시간 및 4시간 동안 PPP와 함께 배양한 후의 화합물X 및 화합물1-3의 인간 혈소판 응집에 미치는 영향들을 각각 표3에 나타내었다. 표2 및 3 모두에서의 데이타는 헌혈자 n 수의 평균값 및 표준오차로 나타내었다.
결과
화합물X의 혈소판 응집에 미치는 영향
표1에 나타낸 바와 같이, 콜라젠의 첨가 전에 PRP와 1분간 배양된 화합물X(1-100ng/ml)은 콜라젠에 유도되는 혈소판 응집의 농도-의존성 억제를 야기했다. 더 높은 농도(30 및 100 ng/ml)에서, 화합물X는 응집 반응을 완전하게 억제하였다(표1를 참조). 50%(ID50)의 응집억제를 나타내는 화합물X의 농도는 20ng/ml인 것으로 측정되었다.
표3에 관하여, 15분, 1시간 및 4시간 동안 PPP와 함께 화합물X의 배양은 항-혈소판 활성에 현저한 효과를 나타내지 않았다. 마찬가지로, 표2에서 나타낸 바와 같이, 15분, 1시간 및 4시간 동안 수성 부형제와 함께 화합물X의 배양은 항-혈소판 활성에 현저한 효과를 나타내지 않았다.
화합물1의 혈소판 응집에 미치는 영향
콜라젠의 첨가 전에 1분간 PRP와 함께 배양된 화합물1(0.1-3mg/ml)은 표1에서 나타낸 바와 같이, 혈소판 응집의 농도-의존성 억제를 유발했다. 가장 높은 농도(3mg/ml)에서, 화합물1은 콜라젠에 대한 응집 반응을 완전히 억제했다(표1 참조). 1분간의 배양 후 혈소판 응집 억제에 있어서 화합물X의 항-응집활성과 비교했을 때 화합물1의 활성은 약 105배 적었다.
표3에 나타낸 바와 같이, PPP와 각각 1시간 및 4시간 배양 후의 시간-의존 관계에서 화합물1의 항-응집 활성은 증가되었다. 따라서, 1분간 배양 후의 측정된 활성보다 1시간 후는 7배, 4시간 후에는 22배 활성이 증가되었다.
비교하면, 수성 부형제로만으로 배양된 화합물1은 어떤 시점의 테스트에서도 항-혈소판 활성에 영향을 미치지 못했다(표2참조).
화합물2의 혈소판 응집에 미치는 영향
표1에서 나타낸 바와 같이, 1분간 PRP와 배양되었을 때 최고농도에서(10mg/ml) 화합물2는 약 20%의 혈소판 응집 억제효과를 나타내었다. 낮은농도에서의 화합물2는 이 같은 1분간의 배양 후에 현저한 항-혈소판 활성을 나타내지 않았다(표1 참조).
표3에서 나타낸 바와 같이, 화합물2의 활성은 PPP와의 1시간 및 4시간의 배양 후 시간-의존 관계에서 실질적인 증가가 관찰되었다. 이 활성은 1분간의 배양과 비교되었을 때 PPP에서 1시간 동안 배양되었을때 50배가 증가되었다. 더욱이, 이 활성은 1분간이 배양 후에 관찰된 활성보다 4시간 배양 후는 적어도 3,500배 증가되었다(표3 참조).
그러나, 수성 부형제만으로 배양된 화합물2는 어떤 시점의 테스트에서도 항-혈소판 활성에 이러한 영향을 미치지 못했다(표2참조).
화합물3의 혈소판 응집에 미치는 영향
표1에서 나타낸 바와 같이, PRP와 함께 1분간 배양된 화합물3(0.3-10mg/ml)은 혈소판 응집의 농도-의존성 억제를 유발했다. 최고 농도(10mg/ml)에서, 화합물3은 응집 반응을 완전히 억제했다(표1 참조).
1분간의 배양으로 효과가 없는 농도에서, PPP와 화합물3의 4시간의 배양은 활성의 증가를 유발하였고, 40%의 혈소판 응집억제에 이르렀다(표3 참조). 이러한 기간의 배양 후라 할지라도 약한 활성 때문에 더 많은 농도들은 측정되지 않았다.
수성 부형제만으로 배양된 화합물3는 어떤 시점의 테스트에서도 항-혈소판 활성에 이러한 영향을 미치지 못했다(표2참조).
결론
화합물X 및 화합물1-3의 샘플에 의한 이러한 결과들은 아세테이트기와 함께 5,000에서 20,000달톤 분자량의 PEG분자의 함유는 화합물X의 항-응집 활성을 감소시킨다는 것을 나타내다. 그러나, 활성 화합물의 연장된 릴리스를 의미하는 이들 유도체들의 효소에 의한 가수분해의 존재를 나타내는, 완충용액만이 아닌 사람 혈장으로 4시간에 걸친 배양 동안 이들 화합물의 활성은 증가한다.
화합물X 및 화합물1-3의 사람 혈소판응집에 미치는 농도-의존성 효과
화합물 농도(최종) 혈소판 응집(대조군에 대한 %)
화합물X 화합물1 화합물2 화합물3
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
1 ng/ml 101 1 3
3 ng/ml 98 1 3
10 ng/ml 60 24 3
30 ng/ml 1 1 3
100ng/ml 1 1 3
****
100㎍/ml 94 7 3
300㎍/ml 95 4 3 100 1 3
1 mg/ml 90 7 3 100 3 3 98 2 3
3 mg/ml 1 1 3 95 2 3 80 8 3
10 mg/ml 78 10 3 1 1 3
수성 부형제(아세테이트 완충용액)와 함께 배양 후의 화합물X 및 화합물1-3의 사람 혈소판 응집에 미치는 영향
화합물의 농도(최종) 혈소판 응집(대조군에 대한 %)
15분 1시간 4시간
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
화합물X(3 ng/ml) 98 2 3 107 2 3 94 3 3
화합물X(30 ng/ml) 3 3 3 8 8 3 8 8 3
화합물1(30 ㎍/ml) 102 3 3 105 4 3 98 3 4
화합물1(300㎍/ml) 105 3 3 104 3 3 97 3 4
화합물2(3 ㎍/ml) 105 1 4 107 3 4 99 2 4
화합물2(30 ㎍/ml) 102 2 4 104 5 4 97 3 4
화합물2(300㎍/ml) 103 3 3 104 4 3 98 2 3
화합물3(300㎍/ml) 103 2 3 103 2 3 91 2 4
사람 PPP와 함께 배양 후의 화합물X 및 화합물1-3의 사람 혈소판 응집에 미치는 영향
화합물의 농도(최종) 혈소판 응집(대조군에 대한 %)
15분 1시간 4시간
평균 SEM n 평균 SEM n 평균 SEM n
화합물X(3 ng/ml) 101 2 3 100 3 3 91 5 3
화합물X(30 ng/ml) 1 1 3 1 1 3 1 1 3
화합물1(30 ㎍/ml) 101 2 3 107 3 3 84 4 4
화합물1(300 ㎍/ml) 95 5 3 45 23 3 1 1 4
화합물2(3 ㎍/ml) 102 3 4 105 2 4 78 5 4
화합물2(30 ㎍/ml) 99 3 4 102 2 4 1 1 4
화합물2(300 ㎍/ml) 101 4 4 75 12 3 1 1 4
화합물3(300 ㎍/ml) 97 7 3 101 2 3 69 6 4
실시예5
마비된 랫트의 생체 내에 정맥투여된
화합물X 및 화합물1-3의 전신 혈류역학적 효과
서론
이 연구는 티오펜톤으로 마취된 랫트에서 화합물X와 비교하여 화합물1-3의 생물학적 활성의 효능, 활성화 및 지속에 대하여 보고한다. 볼루스(bolus) 정맥주사 후의 혈압(BP) 및 맥박에 미치는 이들 화합물의 영향이 각 화합물에 대하여 관찰되었다. 유효기를 비교하기 위해, 기준값의 50%로 되돌리기 위한 반응에 걸린 시간뿐 아니라 개시 및 최대 반응에 필요한 시간이 측정되었다.
재료 및 방법
수컷 위스타(Wistar)랫트가 티오펜톤 소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취되었다. 기관에 호흡을 용이하게 하기 위해 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 약물의 투여를 위해 좌대퇴정맥 또는 우경정맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다. 15분간의 안정화기 후에, 동물들은 각 화합물의 선택된 용량으로 1회 정맥주사되었고, 연구 중인 화합물작용의 지속을 확인하기 위해 열류학 변수들은 3시간동안 계속하여 모니터되었다.
결과
0.1mg/kg 및 1mg/kg의 정맥내 용량으로 화합물X의 투여는 맥박에서의 용량-관련 증가와 함께 MAP에서 즉각적인, 용량-관련 감소를 유발하였다. MAP에서 약 70mmHg의 최대감소가 화합물X의 투여 후 최초 분내에 일어났다. 기준값의 50%까지 되돌리는 MAP 반응과 직접 관련되는 화합물X의 유효기가 화합물X의 0.1mg/kg용량의 경우 약 15분, 1.0mg/kg용량의 경우 약 30분이 된다는 것을 발견했다.
화합물1의 0.1mg/kg 및 1.0mg/kg용량의 정맥내 투여는 MAP의 즉각적이고, 용량-관련 감소를 유발하였는데, 맥박의 용량-관련 증가가 함께 있었다. MAP에서 약 60mmHg의 최대감소가 화합물1의 투여 후 최초 분내에 일어났다. 기준값의 50%까지 되돌리기 전에 MAP감소의 지속의 작용인 유효기는 화합물1의 10mg/kg 및 30mg/kg용량의 경우 각각 약 15분 및 약 30분이었다.
화합물2의 10mg/kg 및 30mg/kg용량의 투여시에 맥박의 용량-관련 증가와 함께 MAP의 즉각적인 감소가 일어났다. 화합물2의 10mg/kg의 주사 후에 MAP에서 30mmHg의 최대감소가 화합물의 투여 후 10분내에 일어났다. 화합물2의 10mg/kg에 의한 MAP감소의 지속의 작용인 유효기는 약 125분이었다. 화합물2의 30mg/kg의 주사 후에 MAP에서 30mmHg의 최대감소가 화합물의 투여 후 5분내에 일어났다. 그 이후에 MAP는 기준선을 향해 돌아가는 것으로 여겨진다. 그러나, (첫번째 것으로 언급된)약 30분에 MAP에서 제2 감소가 있었다. 화합물2의 30mg/kg에 의한 MAP에 관찰된 2개의 낙차의 유효기는 각각 105-160분이었다.
30mg/kg용량으로 화합물3의 투여는 작지만 즉각적인 MAP의 감소가 관찰되었다. 그러나, 화합물3의 주사 후 45 및 120분 후에 MAP의 점차적인 감소가 있었다. 이는 화합물3의 주사 후 135-165분 사이에 기준선을 향해 되돌아간 MAP의 감소를 지연시켰다. 화합물의 투여 후 75분 이내에 약 30mmHg의 MAP의 최대감소가 일어났다. 30mg/kg에 의한 MAP감소의 유효기는 약 105분 이상이었다.
결론
화합물X가 MAP에서 실질적인 용량-관련 감소를 유발한다는 것이 확인되었다. 화합물X와 유사하게, 화합물1은 MAP에서 유사한 크기 및 지속의 용량-관련 감소를 유발한다. 화합물2 및 3은 MAP에서 유사한 감소를 나타내었지만, 그들 각각의 작용지속은 상대적으로 길었다. 화합물2는 혈압에서 현저한, 더 장기간-지속되는 감소를 유도했는데, 10mg/kg의 용량에서는 맥박에서 현저한 증가를 가져오지 않았다. 화합물2에 의한 생긴 MAP의 즉각적인 감소는 화합물X 및 화합물1에 의해 생긴 것보다 크지 않았다는 조사는 더 나은 세이프티 프로화일(safety profile)에 관련하여이점을 제공한다.
실시예6
이하에서는 "화합물 4"로 언급되는 화합물X 디아세테이트의 합성
Z1이 수소이고, X는 O이며 각 Z2가 아세틸기 그룹5의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(400mg) 및 피리딘(200㎕)가 35ml의 무수 메틸렌 클로라이드에서 혼합되었다. 500㎕의 아세트산무수물이 현탄액에 첨가되었다. 혼합물은 수 시간내에 균질화되었고 이 용액은 상온에서 밤새 교반되었다. 용매는 응축되었고 인산염 완충용액(0.1M, pH 7.4)인 잔여물에 첨가되었다. 이 혼합물은 곧 30분간 교반되었고, 메틸렌 클로라이드로 3회 추출되었다. 혼합된 유기상은 황산나트륨으로 건조되었고 용매는 증발에 의해 제거되었다. 기름성분의 산물, 화합물X디아세테이트가 얻어졌다. 결과 산물은 340mg(80%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):1.91(s,(화합물X)-01COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-02COCH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3).
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(400mg) 및 피리딘(200㎕)이 35ml의 무수 메틸렌 클로라이드에서 혼합되었다. 500㎕의 아세트산 무수물이 현탄액에 첨가되었다. 이 혼합물은 수 시간 내에 균질화되었고, 용액은 상온에서 밤새 교반되었다. 용매는 응축되었고, 인산염 완충용액(0.1M, pH 7.4)이 잔여물에 첨가되었다. 혼합물은 30분간 신속하게 교반되었고, 혼합물은 메틸렌 클로라이드로 3회 추출되었다.혼합된 유기상은 황산나트륨으로 건조되었고 용매는 증발에 의해 제거되었다. 기름성분의 산물, 화합물X 디아세테이트를 얻었다. 결과 산물은 340mg(80%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):1.91(s,(화합물X-O1COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-O2COCH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3).
실시예7
이하에서는 "화합물 5"로 언급되는
PEG20K-에스테르-화합물X 디아세테이트의 합성
Z1이 약 20,000달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 O이며 각 Z2가 아세틸기 그룹4의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, mPEG 20k달톤(5.2g), 화합물X 디아세테이트(140mg), 1-하이드록시벤질트리아졸(HOBT, 35mg), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 30mg) 및 디사이클로-헥실카르보디이미드(DCC, 75mg)가 60ml의 무수 메틸렌 클로라이드에 용해되었다. 이 용액은 상온에서 밤새 교반되었고, 증발에 의해 용매가 제거되었다. 잔여물은 35ml의 1,4디옥산과 혼합되었고 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었다. 용액은 진공 하에서 응축되었고, 그 후 200ml의 50:50/에테르:이소프로판올에 첨가되었다. 결과 침전물은 여과를 통해 수집되었고 진공 하에 건조되었다. 결과 산물: 4.8g(92%).1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 4.23(t,-PEGOCH2CH 2O-CO-(화합물X)),1.19(s,(화합물X)-OCOCH 3), 2.00(s,(화합물X)-CH 2COOPEG), 0.84(t,(화합물X)-CH3), 4.77(s,(화합물X)-CH 2COOPEG), 7.03(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예8
생체 외에서 화합물X 및 화합물4-7의
사람 혈장에 미치는 항-혈소판 효과
서론
이하에서는 화합물4 및 화합물5-7로 언급되는 본 발명 아세틸화 화합물X의 건강한 사람으로부터의 혈장에 대한 항-혈소판 활성이 다음의 방법으로 측정되었고, 변형되지 않은 화합물X의 항-혈소판 활성과 비교되었다. 또한, 혈소판-부족-혈장(PPP) 및 수성 부형제(아세테이트 완충용액)과 함께 4시간 동안 수 차례의 배양 후의 각 화합물의 항-혈소판 활성이 조사되었다.
화합물 6 및 7은 각각, mPEG 20kDa-아미드-화합물X 및 mPEG 20kDa-아미드-화합물X 디아세테이트이며, 실시예1의 화합물1과 유사하게 제조되었다. 화합물 6 및 7은 각각은 Z1이 약 20,000달톤의 분자량을 가지는 mPEG이고, X가 NH인 그룹4의 화합물이다. 화합물 6의 경우, Z2는 수소이고, 화합물 7은 Z2이 아세틸기이다.
방법
혈소판-풍부 혈장(PRP)의 제조
적어도 14일간 어떤 약도 복용하지 않은 건강한 사람으로부터의 혈액이 정맥천자에 의해 3.15%(w/v) 트리-소듐 사이트레이트(9:1 v/v)내로 수집되었다. 혈액은 PRP를 얻기 위해 15분간 800g로 원심분리되었다. PRP는 PPP를 얻기 위해 1분간 12,000g로 더 원심분리되었다. 전체12명의 지원자가 본 연구를 위해 혈액을 기증했다.
혈소판 응집의 광도측정
혈소판 응집은 PRP(0%) 및 PPP(100%)로 보정된 이중 채널 페이톤 애그리고미터(dual channel Payton aggregometer)를 사용하여 광투과 정도에 관하여 측정되었다. PRP(500㎕)의 일부가 실리콘화된 큐벳에 첨가되어, 교반되고(1000 revs/min) 37℃까지 데워졌다. 혈소판은 조사 전에 안정한 기준선을 확립하기 위해 1분간 배양되었다. 응집인자 콜라젠(㎕/ml)의 최고 이하(submaximal)농도가 PRP에 첨가되었고, 혈소판 응집은 4분간에 걸쳐 측정된 광투과의 증가에 따라 모티터되었다.
항-응집 활성
응고제인 콜라젠(1㎍/ml)의 첨가 전에 화합물X(1-100 ng/ml) 및 화합물 4(1-300 ng/ml) 및 PEG결합 유도체, 화합물 5-7(0.1-10mg/ml)이 1분간 PRP와 배양되었다. 혈소판 응집의 억제 비율은 콜라젠의 첨가 후 4분간에 걸쳐 관찰된 광투과의 최고치 증가를 사용하여, 대조군과 비교하여 계산되었다. 이 실험은 연구 중인 각 화합물의 경우에 적어도 3명의 사람으로부터의 PRP를 사용하여 반복되었다.
수성 부형제 및 PPP으로 배양된 후의 항-응집 반응
분리된 실험에서, 화합물X(30 및 300 ng/ml), 화합물4 및 화합물 5-7의 농축물들이 500㎕ PPP 또는 수성 부형제(아세테이트 완충용액)와 함께, 37℃에서, 15분, 1시간 및 4시간을 포함하는 다양한 시간대 별로 배양되었다. 배양기 후에, 항-응집 활성을 측정하기 위해, PPP일부분 또는 수성 부형제(50㎕)가 신선한 PRP(450㎕)에 첨가되었다. 이 실험은 각 화합물 당 적어도 3명의 사람으로부터의 PPP를 사용하여 반복되었다.
결과
화합물X의 혈소판 응집에 미치는 영향
PRP와 1분간 배양된 화합물X(1-100ng/ml)은 콜라젠에 의해 유도되는 혈소판 응집의 농도 의존성 억제를 야기했다. 더 높은 농도(30 및 100 ng/ml)에서, 화합물X는 응집 반응을 완전하게 억제하였다. 50%(IC50)의 응집억제를 나타내는 화합물X의 농도는 19±1 ng/ml이었다.
화합물4의 혈소판 응집에 미치는 영향
1분간 PRP와 함께 배양된 화합물4(1-300㎍/ml)은 혈소판 응집의 농도-의존성 억제를 유발했다. 가장 높은 농도(300㎍/ml)에서, 화합물4는 콜라젠에 대한 응집 반응을 완전히 억제했으며, 50%의 응집억제를 나타내는 화합물 농도는 68±2 ㎍/ml이었다. 1분간의 배양 후 혈소판 응집 억제에 있어서 화합물X의 항-응집활성과 비교했을 때 화합물4의 활성은 약 3x103배 활성이 적었다.
PPP와의 배양 후 화합물4의 항-응집 활성은 처음 15분간 증가되었다. 15분 후에는, 활성은 10배 증가하였고, IC50은 5±0.2 ㎍/ml이었다. 이 효과는 샐라인(saline)에서의 화합물의 배양 동안에도 관찰되었다. 그러나, 4시간까지 PPP에서 배양되었을 때 활성의 증가는 더 관찰되지 않았다.
화합물5의 혈소판 응집에 미치는 영향
1분간 PRP와 배양되었을 때, 최고 농도에서(10mg/ml) 화합물5는 약 10%의 혈소판 응집 억제효과를 나타내었다. 낮은 농도에서의 화합물5는 이 같은 1분간의 배양 후에 현저한 항-혈소판 활성을 나타내지 않았다.
1시간 및 4시간의 PPP와의 배양 후에 고 농도의 화합물5의 활성은 시간-의존 방식으로 증가했다. 이 활성은 PPP에서 4시간 동안 배양되었을 때 10이상 증가되었고, IC50은 513±18 ㎍/ml이었다. 그러나, 수성 부형제만으로 배양된 화합물5는 어떤 시점의 테스트에서도 항-혈소판 활성에 이러한 효과를 나타내지 않았다.
화합물6의 혈소판 응집에 미치는 영향
PRP와 함께 1분간 배양된 화합물 6(0.1-3mg/ml)은 혈소판 응집의 농도-의존성 억제를 유발했다. 최고 농도(3mg/ml)에서, 화합물 6은 응집 반응을 거의 최대로 억제했다. 화합물6의 IC50은 600±34 ㎍/ml이었다.
1분간의 배양으로 효과가 없는 농도에서, PPP와 화합물6의 4시간의 배양은 활성의 증가를 유발하였고, 85%의 혈소판 응집억제에 이르렀다 4시간 배양 후의 화합물 6의 IC50은 60±5 ㎍/ml이었다. 이러한 배양기 후라 할지라도 약한 활성 때문에 더 많은 농도들은 측정되지 않았다.
수성 부형제만으로 배양된 화합물 6은 어떤 시점의 테스트에서도 항-혈소판 활성에 이러한 영향을 미치지 못했다.
화합물7의 혈소판 응집에 미치는 영향
PRP와 함께 1분간 배양된 화합물7(10 mg/ml)은 최고 농도에서 응집반응을 현저하게 억제하지 않았다.
PPP또는 수성 부형제와 함께 화합물7의 4시간 배양은 활성 증가를 보이지 않았다. 이러한 배양기 후라 할지라도 약한 활성 때문에 더 많은 농도들은 측정되지 않았다.
결론
본 연구는 광학 응집계기(optical aggregometer)에서 측정된 바와 같이, 생체 외의 인간 혈소판-풍부 혈장에서 프로스타사이클린의 벤진덴 유도체(benzindene derivative), 화합물X의 혈소판 항-응집활성 능력을 확인하게 한다. 본 연구에서 혈소판 현탄액과 함께 1분간 배양 후의 이 화합물의 능력은 실시예4에서 보고된 것과 유사하다. 앞서의 연구에서와 같이, 혈소판이 없는 혈장 또는 수성 부형제와 생리학적 조건 하에서 화학적 안정성을 확인하는 37℃에서, 4시간 동안의 배양은 항-혈소판 활성에 영향을 주지 않았다.
본 연구의 조사결과는, 화합물X는 디아세테이트 유도체, 화합물4, 약 3,000배 활성적이지 않은 디아세테이트보다 현저하게 큰 항-혈소판 활성을 가진다는 것을 보인다. 이 아세틸화 유도체는 혈장 또는 수성 부형제와의 배양 시에 처음 10분간에 걸쳐 이것의 활성이 10배 정도 증가하였지만, 그러나 활성에 있어서의 이 증가는 4시간의 배양 후 보다 크지 않았다. 활성의 이런 초기 증가 메카니즘은 PPP 메디움에서 배양되었을 때 디아세테이트의 일시적 불안정성을 반영한다.
또한, 본 연구는 화합물X는 화합물 4-7보다 현저하게 큰 항-혈소판 활성을 가졌다는 것을 나타낸다. 화합물6은 혈소판-풍부 혈장과 함께 1분간 배양 후에 3개의 PEG결합 유도체(화합물5-7) 중에서 가장 활성적이었지만, 화합물X보다 상당히 작은, 즉 약 3x104배 적은 능력을 가졌다.
화합물 5-7의 항-혈소판 활성은 혈소판-부족 혈장(PPP)과의 4시간까지의 배양에 의해 가변적으로 영향을 받았다. 혈액 채취 후 6시간 후에는 혈소판 응집반응 급속하게 줄어들기 때문에, 4시간보다 더 많은 시간에 대하여는 사람의 혈장을 사용하여 테스트할 수 없었다. 화합물5 및 6의 활성은 4시간의 배양에 걸쳐 10배이상 증가했다. 그러나 샐라인으로 배양되었을 때는 효과가 없었다. 이러한 조사결과들은 이들 PEG결합 유도체들(화합물 5-7)의 활성 분자는, 37℃에서 4시간에 걸친 배양, 즉 사람 혈장내의 이들 분자 상에서 에스테르 및 아세테이트기 각각의 가수분해 후, 사람 혈장에 존재하는 효소에 의해 시간-의존 방식으로 릴리스된다는 것을 제시한다. 그러나, 이 화합물로 인해 측정된 증가된 활성은 실시예4에서의 연구로부터의 몇몇 화합물에 의한 것보다 낮았다.
화합물5-7에 관한 이러한 조사결과들은, 아세테이트기들과 함께 20,000달톤의 분자량의 PEG성분의 포함은 화합물X의 항-응집 활성을 감소시킨다는 것을 제시한다. 그러나, 화합물 5 및 6의 활성은 이들 치환기들의 가수분해를 의미하는 사람 혈장과의 4시간의 배양시에 증가한다. 이들 화합물의 활성에 있어서의 10배 증가는 사람 혈장으로 4시간에 걸친 배양 후에 관찰되었지만, 이들 유도체들 내의 에스테르 및 아미드 결합의 효소에 의한 가수분해를 의미하고, 활성성분을 릴리스하는 완충용액 만으로 배양된 경우에는 그렇지 않았다. 본 조사결과들은 사람 혈장에서 활성화될 수 있는 PEG치환에 기초된 화합물X의 늦은-릴리스 유도체의 제조를 확인시켜 준다.
실시예9
마비된 랫트 생체 내의 화합물X 및 화합물4-7의 전신 혈류역학적 효과
서론
이 연구에 있어서, 화합물 4-7의 심혈관 활성이 티오펜톤-마취 랫트에서 관찰되었다. 볼루스(bolus) 정맥주사 후 혈압(BP) 및 맥박에 미치는 이들 화합물의 영향이 관찰되었다. 기준선을 향해 되돌아가는 반응에 걸린 시간뿐 아니라 개시 및 최대 반응에 필요한 시간이 측정되었다.
이것의 다른 효과들 중에서, 생체 외에서 화합물 4-7은, 마취된 랫트에 정맥내로 투여되었을 때 상당한 평균 동맥압(MAP)을 유발하는 농도-의존성 장간 동맥의 이완을 유도한다. 화합물X와 비교하여 화합물 4-7의 향상된 유효기를 확인하기 위해, 출원인은 반응이 기준값의 50%까지 되돌아가는 걸린 시간으로 정의되는 화합물의 유효기를 추론하기 위해 시간대 별로 MAP의 변화를 측정하였다.
재료 및 방법
본 연구는 티오펜톤 소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취된 수컷 위스타(Wistar)랫트를 사용하였다. 기관에 호흡을 용이하게 하기 위해 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 약물의 투여를 위해 좌대퇴정맥 또는 우경정맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다.
15분간의 안정화기 후에, 동물들은 변형되지 않은 화합물X 및 화합물4-7의 각각 선택된 용량으로 1회 정맥주사되었고, 연구 중인 화합물작용의 지속을 확인하기 위해 열류학 변수들은 3시간동안 계속하여 모니터되었다.
결과
1.3 및 10 mg/kg 정맥내 용량의 화합물4의 투여는 맥박에서의 용량-관련 증가와 함께 MAP에서 빠른, 용량-관련 감소를 유발하였다. 1 mg/kg의 주사 후, MAP의 약 30mmHg의 최대감소가 화합물의 투여 후 30초 내에 일어났다. 1 mg/kg의 화합물4에 의해 유발된 MAP 감소의 유효기는 약 110분 이었다.
화합물X의(1mg/kg i.v.) 투여는 화합물4(10mg/kg i.v.)의 최대 용량과 비슷한 MAP에서의 최대감소를 유발했다. 화합물X와 비교되었을 때, 화합물4에 의한 MAP의 감소는 화합물X의 30분과 비교되는 90분에 걸친 유효기를 가진 더 긴 지속시간을 가졌다.
용량의 정맥내 투여는 MAP의 즉각적이고, 용량-관련 감소를 유발하였는데, 맥박의 용량-관련 증가가 함께 있었다. MAP에서 약 60mmHg의 최대감소가 화합물1의투여 후 최초 분내에 일어났다. 기준값의 50%까지 되돌리기 전에 MAP감소의 지속의 작용인 유효기는 화합물1의 10mg/kg 및 30mg/kg용량의 경우 각각 약 15분 및 약 30분이었다. 이 조사결과는 이 유도체에서 관찰되는 바와 같이 증가된 작용의 지속은 화합물X의 최대용량을 넘어서는 것에 의해서도 달성될 수 없다는 것을 알려준다. 더욱이, 화합물4에 의한 빈맥은 화합물X에 의한 빈맥보다 시작이 더 느렸다. 화합물4에 의한 빈맥은 화합물의 주사 후 3시간에서 여전히 현저하다는 것에 주목하여야 한다.
화합물5(3, 10 및 30mg/kg i.v.)의 투여는 화합물4 또는 mg/kg에 의해 생긴 것보다 덜 현저하며, 심한 맥박의 증가를 수반하지 않는 MAP의 용량-관련 감소를 유발했다. 반응은 아주 장기간의 작용지속을 가지며, 약 120분의 유효기를 가지며 15분 후에 최대에 도달했다.
화합물6(3,10 및 30mg/kg i.v.)의 투여는 개시가 느리고, 더 높은 용량에서는 화합물의 주사 후 3시간에 최대에 도달하는 MAP의 즉각적인 감소를 유발했다. 최대 감소는 10분 이내에 약 6030mmHg이었다. 그러나, 이 반응의 초기 지속 상(phase)은 짧았고, 기저치(resting value)를 향한 혈압 회복의 느린 상이 수반되었다. 흥미롭게도, 화합물6은 맥박에서 현저한 변화를 일으키지 않았다.
화합물4 및 화합물6 모두는 MAP에서 빠르고 상당한 감소를 나타내었다. 그러나, 화합물4의 경우에는 MAP의 감소는 또한 맥박의 현저한 증가를 동반했다. 화합물4에 의한 MAP의 감소는 장기간 지속됨에도 불구하고, MAP의 빠른 감소 및 결과로서 생기는 빈맥은 이것의 세이프티 프로파일에 불리한 점이 될 수 있다.
대조적으로, 화합물7(3,10 및 30mg/kg i.v.)은 135-165분 후에야 높은 수준에 도달하는 MAP의 점차적인 감소를 유발했다. 점차적인 감소는 진행성이었으며, 3시간의 실험시간의 끝에서 약 30mmHg의 최대에 이른다고 여겨졌다. MAP의 감소는 빈맥을 수반하지 않았다.
결론
본 화합물의 심혈관계 프로화일은 구조-활성 관계를 정의하게 하여, 장기간의 작용 지속을 나타내는 화합물X 유도체의 설계를 가능하게 한다. 뿐만 아니라, 이런 화합물들은 초기 저혈압의 위기 가능성을 최소화시키는 작용이 느리게 개시되도록 제형될 수 있는 것으로 여겨진다. 5,000 또는 20,000달톤의 PEG에 결합된 화합물의 프로화일의 비교는 PEG 크기와 관련하여 MAP 프로화일 또는 저혈압 효과의 지속의 차이가 없는 것으로 여겨짐에도 불구하고 20,000달톤의 PEG를 포함하는 화합물을 사용하여 맥박에 적게 영향을 미치는 쪽으로의 경향이 있다. 잠재적 임상의 이점 또는 반사성 빈맥의 부존재에 관련된 문제들은 더 많은 연구들을 필요로 한다.
아미드 또는 에스테르 결합를 경유하여 PEG 치환기에 결합된 화합물의 프로화일의 비교는, 아미드의 MAP 감소는 에스테르의 경우보다 개시가 느리고, 반사성 빈맥을 일으키는 것으로 관찰되지 않았음을 제시한다.
실시예10
마비된 랫트에서 화합물2의 피하투여의 전신 혈류역학적 효과
피하투여 후에 화합물2이 측정되었다. 수컷 위스타(Wistar)랫트가 티오펜톤소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취되었다. 기관에 호흡을 용이하게 하기 위해 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다. 15분간의 안정화기 후에, 화합물2가 목에 볼루스 피하 주사되었다.
화합물2(30mg/kg s.c.)의 피하주사는 MAP의 상당한 감소를 유발했는데, 개시가 느렸고 화합물의 주사 후 약 45분에 최대값에 이르렀다. 또한, 화합물2는 맥박의 증가를 일으켰다. 실시예5의 화합물2(30mg/kg i.v.)의 정맥투여와 비교되었을 때, 피하투여에 의한 MAP의 장기간-지속 감소는 더 현저하였지만, 개시는 더 느렸다. 3시간의 시점에서, 같은 화합물의 정맥내 투여에 의한 경우보다 더 큰 대규모가 생산되었다. 이것 및 다른 화합물의 피하투여에 대한 더 많은 분석이 요구된다.
실시예11
마비된 랫트의 생체 내에 피하투여된 화합물X, 화합물4, 화합물7 및
mPEG5kDa-아미노-화합물X 디아세테이트의 전신 혈류역학적 효과
화합물X, 화합물4, 화합물7 및 이하에서는 화합물8로 언급되는 mPEG5kDa-아미노-화합물X 디아세테이트가 피하투여 후 측정되었다. 수컷 위스타(Wistar)랫트가 티오펜톤 소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취되었다. 기관에 호흡을 용이하게 하기 위해 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다. 15분간의 안정화기 후에, 변형되지 않은의 화합물X, 화합물4, 화합물7 또는 화합물8이 목에 볼루스(bolus) 피하 주사되었다.
화합물8은 실시예1의 화합물1과 유사하게 제조되었다. Z1이 약 20,000달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 NH이며 Z2가 아세틸기인 그룹4의 화합물이다.
결과
1.3 및 10mg/kg의 피하 용량으로 화합물4의 투여는, 맥박에서의 용량-관련 증가와 함께 MAP에서 용량-관련 감소를 유발하였다. 10mg/kg의 주사 후에, MAP에서 약 70mmHg의 최대감소가 화합물의 투여 후 60분에 일어났는데, 이는 210분 후에 28mmHg의 또 다른 감소를 가진다. 화합물4의 3가지 각각의 용량에 의한 MAP 감소의 유효기는 각각 >300분, >330분 및 >300분 이었다(표5 참고).
화합물X(0.1, 0.3 및 1 mg/kg s.c.)의 투여는 맥박의 용량-관계 증가를 수반하는 MAP의 빠른 용량-관계 감소를 유발했다(표4 참고). 1 mg/kg의 피하 주사 후에, 약 70mmHg의 MAP의 최대치가 화합물의 투여 후 15분에 일어났다. 화합물X와 비교되었을 때, 화합물4에 의한 MAP의 감소는 상당히 장시간 지속되었다. 화합물4에의한 빈맥은 화합물4에 의한 빈맥보다 그 개시가 상당히 느렸다. 화합물4에 의한 빈맥은 10 mg/kg 투약의 경우 화합물의 주사 후 6시간에 여전히 현저하다는 것을 주의해야 한다. 낮은 용량에서는, 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 경우 각각 투여 후 약5분 및 45분에 맥박이 안정되었다.
화합물7(3, 10 및 30 mg/kg)의 투여는 주사 후 6시간에도 지속되는 MAP의 점차적이고 진행성의 용량-관계 감소를 유발했다. 활성의 크기는 변형되지 않은 화합물X 및 화합물4보다 더 작았다. MAP의 최대 감소는 3, 10 및 30 mg/kg 투약의 경우 각각 35, 29, 및 25mmHg 이었다. 최대 감소 모두는 주사 후 약 330에서 360분에서 일어났다(표6 참조)
화합물8(3, 10 및 30 mg/kg s.c.)의 투여는 MAP의 느린 용량-관련 감소를 유발했고, 최대 용량의 경우 주사 후 약 240분에 최대치 약 24mmHg에 도달하는 것으로 여겨졌다. 유효기는 120분 이상이었다(표7참조).
화합물X(피하 투여)의 경우 6시간에 걸쳐 측정된 평균 동맥압(mmHg)
시간(분) 부형제 화합물X
0.1 mg/kg 0.3 mg/kg 1 mg/kg
0 121±6 123±6 121±6 134±6
1 127±4 111±6 91 ±11 82 ±4
5 124±5 83 ±7 70 ±9 67 ±5
10 124±3 81 ±6 69 ±11 67 ±6
15 124±2 78 ±4 71 ±11 63 ±7
30 122±3 82 ±6 80 ±11 67 ±4
60 116±4 90 ±7 88 ±9 75 ±3
120 114±5 97 ±10 101±12 88 ±5
180 112±5 101±13 111±10 98 ±6
240 - 102±13 103±8 93 ±8
360 - 100±13 92 ±5 95 ±9
△최대시간 9 ±4180 46 ±515 52 ±1210 71 ±815
t1/2 - 165 80-110 135-290
n 3 5 5 5
화합물4(피하 투여)의 경우 6시간에 걸쳐 측정된 평균 동맥압(mmHg)
시간(분) 부형제 화합물4
1 mg/kg 3 mg/kg 10 mg/kg
0 121±6 115±11 119±7 128±6
1 127±4 116±9 116 ±7 116 ±7
5 124±5 110 ±9 96 ±6 107 ±7
10 124±3 104 ±8 86 ±6 92 ±8
15 124±2 99 ±6 82 ±6 95 ±5
30 122±3 93 ±4 78 ±4 86 ±6
60 116±4 90 ±5 82 ±4 83 ±5
120 114±5 91 ±5 86 ±3 82 ±6
180 112±5 92 ±5 87 ±4 86 ±5
240 - 87 ±3 86 ±4 86 ±6
360 - 94 ±3 86 ±5 81 ±9
△최대시간 9 ±4180 26±660,(28±7210) 41 ±430 45±560,(48±6150)
t1/2 - >300 >330 >300
n 3 5 5 5
화합물7(피하 투여)의 경우 6시간에 걸쳐 측정된 평균 동맥압(mmHg)
시간(분) mPEG20kDa 화합물7
3 mg/kg 10 mg/kg 30 mg/kg
0 135±5 136±9 133 136±5
1 138±4 141±7 132 136±3
5 135±6 139±6 130 138±4
10 139±3 133±7 128 134±4
15 136±5 135±8 128 134±4
30 130±8 127±9 123 130±2
60 127±9 117±6 114 131±3
120 128±15 114±7 114 127±4
180 123±10 104±9 114 117±5
240 113±7 106±11 111 115±5
360 112±10 104±7 104 111±4
△최대시간 27 ±5330 35 ±8330 29 ±5360 25 ±9360
t1/2 - - - -
n 5 5 5 5
화합물8(피하 투여)의 경우 6시간에 걸쳐 측정된 평균 동맥압(mmHg)
시간(분) mPEG5k 화합물8
3 mg/kg 10 mg/kg 30 mg/kg
0 113±11 119±11 116±6 134±8
1 111±14 124±11 117±12 133±8
5 110±13 122±10 119±7 135±8
10 109±15 121±9 115±5 132±8
15 103±14 122±9 116±4 132±7
30 105±12 119±10 105±9 127±8
60 103±13 123±11 110±1 121±8
120 97 ±8 122±11 108±2 113±8
180 98 ±10 119±9 105±2 116±9
240 - 112±7 108±6 109±5
360 - 110±15 113±5 111±5
△최대시간 - 14 ±12270 11 ±530 24 ±7240
t1/2 17 ±4120 - - >120
n 4 5 5 5
실시예12
이하에서는 "화합물 9"로 언급되는 mPEG350Da-
아미드-화합물X 디아세테이트의 합성
Z1이 약 350달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 NH이며 각 Z2가 아세틸기 그룹4의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(400mg), mPEG(350Da)아민(360mg), HOBT(15mg) 및 DCC(267mg)들이 20ml의 무수 메틸렌 클로라이드와 혼합되었고, 이 혼합물은 상온에서 밤새 교반되었다. 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었고, 유기 용액은 5 wt%의 중탄산나트륨 용액으로 세척되었다. 유기상(organic phase)은 황산나트륨으로 건조되었고 용매는 진공 하에 제거되었다. 결과 산물은 10ml의 아세토니트릴에 용해되었고 불용성의 고체는 여과에 의해 제거되었다. 이 용액에 아세트산무수물(3ml) 및 피리딘(0.3ml)이 첨가되었다. 결과 용액은 40℃에서 밤새 데워졌다. 이 용액에 300ml의 5wt%의 중탄산나트륨 용액에 첨가되었고, 혼합물은 상온에서 30분간 교반되었다. 혼합물은 메틸렌 클로라이드로 추출되었고 유기상은 인산염 완충용액(0.1M, pH2)로 세척되었고, 황산나트륨으로 건조되었다. 용매는 제거되었고 산물은 진공 하에서 건조되었다. 결과 산물은 600mg(70%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 7.897(t,-PEGNH-CO-(화합물X)), 1.91(s,(화합물X)-O1COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-O2COCH 3), 0.864(t,(화합물X)-CH 3), 4.436(s,(화합물X)-CH 2CONHPEG), 7.045(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예13
이하에서는 "화합물 10"로 언급되는 mPEG350Da-
에스테르-화합물X 디아세테이트의 합성
Z1이 약 350달톤의 분자량을 가진 mPEG이고, X는 O이며 각 Z2가 아세틸기 그룹4의 화합물은 다음의 방법으로 제조되었다.
둥근 바닥 플라스크에서, 화합물X(3g) 및 트리에틸아민(TEA, 1.5㎕)이 100ml의 무수 아세토니트릴과 혼합되었다. 이 용액에 3ml의 아세틸 클로라이드가 첨가되었다. 혼합물은 상온에서 밤새 교반되었다. 그 후 용액은 5 wt%의 중탄산나트륨 용액과 혼합되어 상온에서 30분간 교반되었다. 수성 상(aqueous phase)은 메틸렌 클로라이드로 추출되었다. 유기상은 인산염 완충용액(0.1M, pH2)으로 세척되었고, 그 후 황산나트륨으로 건조되었다. 결과 산물은 3.3g(80%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):1.9(s,(화합물X)-O1COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-O2COH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3).
둥근 바닥 플라스크에서, mPEG(350Da)(550mg), 전단계로부터의 화합물X 디아세테이트(750mg), HOBT(60mg), DMAP(150mg) 및 DCC(375mg)들이 30ml의 무수 메틸렌 클로라이드와 혼합되었다. 용액은 상온에서 밤새 교반되었다. 불용성의 고체는 여과를 통해 제거되었고, 용액은 5 wt%의 중탄산나트륨 용액 및 인산염 완충용액(0.1M, pH2)으로 세척되었다. 유기상은 황산나트륨으로 건조되었고 진공 하에 응축되었다. 결과 산물은 10ml의 아세토니트릴에 용해되었고 불용성의 고체는 여과에 의해 제거되었다. 용매는 증발에 의해 제거되었고 산물은 깨끗한 오일(oil)로 얻어졌다. 결과 산물은 1g(76%)이었다.1H NMR(DMSO-d6):δ3.5(br m,PEG), 4.23(t,-PEGOCH2CH 2O-CO-(화합물X)), 1.91(s,(화합물X)-O1COCH 3), 2.00(s,(화합물X)-O2COCH 3), 0.84(t,(화합물X)-CH3), 4.77(s,(화합물X)-CH 2COOPEG), 7.03(t,화합물X 방향성 프로톤), 6.7(d+d, 화합물X 방향성 프로톤).
실시예14
마취된 랫트의 생체 내에서 mPEG 350Da-아미드-화합물X 디아세테이트의
전신 혈류역학에 미치는 효과의 평가
이 연구에서, 화학적으로 안정한 프로스타사이클린의 벤진덴(benzindene) 동족체의 신규한, 저분자량 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 화합물X의 심혈관 활성이 랫트에 정맥 및 경구투여 후에 평가되었다. 이하에서는 화합물9라 불리는, mPEG 350Da-아미드-화합물X 디아세테이트가 경구를 통하여 효과적인 유도체를 생산하려는 시도로 합성되었다. 경구적으로 효과적인 동족체는 다수의 치료의 유틸리티에서 안정한 프로스타사이클린 동족체의 임상적 가능성을 더 발전시킨다.
종전의 연구들은 다양한 분자량의 성분에 결합된 다수의 화합물X의 유도체들을 평가했다. 이들 연구에서, 5,000 및 20,000달톤 PEG의 고분자량 폴리머는 에스테를 또는 아미드 결합으로 변형되지 않은 화합물의 다른 부위에 결합되었고, 반면에 유리 하이드록실기를 아세틸화시키는 효과가 또한 연구되었다. 그들의 전신 혈액동력학에 대한 프로화일은 볼루스(bolus)정맥 투여 후에 마취된 랫트에서 연구되었고, 나중의 연구에서는 피하 볼루스 주사 후에 연구되었다. 현재의 연구는 정맥내 또는 경구 투여 후 분자량 350의 PEG유도체의 랫트 전신 동맥압에 대한 작용을 평가하였다.
평가 화합물
본 연구에 사용된 화합물은, 350달톤 분자량의 PEG가 아미드 결합을 통하여 화합물X의 카르복실릭기에 결합되고, 화합물X의 하이드록실기가 아셀틸화된, 이하에서는 "화합물9"라 하는 아세틸화 mPEG 350 Da 화합물X-아미드(mPEG 350-NHCO-화합물X-Ac)이었다.
일반적 방법론
여기에 설명된 연구 시리즈는 티오펜톤으로 마취된 랫트에서 이들 화합물들의 심혈관 활성에 대한 것이다. 이들 연구에 있어서, 화합물9의 볼루스(bolus)정맥 내 및 경구 투여 후에 혈액(BP) 및 맥박에 미치는 효과가 측정되었다. 기준값의 50%를 향해 반응이 되돌아가는데 걸리는 시간 뿐 아니라, 반응의 개시 및 최대반응 시간이 측정되었다. 각 화합물은, 용량-반응 관계 및 정맥투여 후 3시간 및 경구투여 후6시간 동안 측정된 심혈관 변수들을 확립하기 위해 그룹의 각 동물들에게 단일 용량으로 투여되었다.
수컷 위스타(Wistar)랫트(250-330g)가 티오펜톤 소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취되었다. 기관에 호흡을 용이하게 하기 위해 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 약물의 투여를 위해 좌대퇴정맥 또는 우경정맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다.
정맥내 투여를 위한 방법론
화합물9가 순수한 에탄올에 용해되어, -20℃ 냉동기 내에 저장된 200mg/ml의 모액(stock solution)을 가했다. 사용 전에 모액 부분이 즉시 제거되었고, 샐라인에 용해되었다. 3, 10 및 30mg/kg의 화합물9를 받는 랫트는 따라서, 0.3ml내에1.5%, 5% 및 15%의 에탄올을 받았다. 대조 그룹에서는, 랫트는 에탄올 최고농도, 15%의 에탄올 용액 0.3ml i.v.를 받았다.
15분간의 안정화기 후에, 화합물9(3, 10 및 30mg/kg)이 정맥 볼루스로 투여되었다.
경구투여를 위한 방법론
경구투여를 용이하게 하기 위해 고무 카테터를 위(식도를 경유하여)에 위치시켰다. 20분간의 안정화기 후에, 화합물9가 이 튜브를 따라 전체 1ml 볼루스로 투여되었다.
화합물9가 순수한 에탄올에 용해되어, -20℃ 냉동기 내에 저장된 200mg/ml의 모액(stock solution)을 가했다. 사용 전에 모액 부분이 즉시 제거되었고, 샐라인에 용해되었다. 30mg/kg의 화합물9를 받는 랫트는 따라서, 1ml내에 15%의 에탄올을 받았다. 대조 그룹에서는, 랫트는 15%의 에탄올 용액 1ml을 받았다.
연구는 사후 검토에서 위에 음식물을 가지는 절식시키지 않은 동물, 또는 조사 15시간 전에 음식물이 제거된 랫트에서 행해졌다.
정맥투여의 결과
마취된 랫트에서, 화합물9(3, 10 및 30mg/kg i.v.)의 정맥 주사는 MAP에서 급한 용량-의존성 감소를 유발했지만(표8A 참고), 맥박에는 현저한 효과가 없었다. 최대 용량으로, 이 저혈압적 반응은 15분 이내에 이것의 최고치에 이르렀지만, 적어도 120분의 유효기를 가진 장기의 작용 지속을 가졌다. 화합물9의 고용량은 맥박의 일시적인 감소를 유발하는 것으로 여겨짐에 유의해야 한다.
경구투여의 결과
마취된 랫트에서, 급식된 또는 절식된 랫트에의 화합물9(30mg/kg)의 경구투여는 개시가 느리고, 진행성의 긴 지속을 나타내는 MAP의 감소를 유발했다(표9A를 참조). MAP의 감소는 120분 후에 최대값에 이르렀는데, 관찰 6시간의 끝 시점에 MAP가 저하된 채로 유지되었다. 약 33mgHg의 MAP 최대 감소는 6시간의 끝 시점에서 관찰되었다. 그러나, 엔탄올(15% 에탄올 0.3 ml)을 포함하는 부형제도 또한 MAP의 작고, 점진적인 감소를 유발하는데, 개시가 느리고 6시간 후에 최대치 20mmHg에 이른다는 것에 유의해야 한다(표9A 참조). 급식된 또는 절식된 랫트내에서의 화합물9의 혈관억제성 반응에는 차이가 없는 것으로 여겨진다.
에탄올 부형제는 또한 진행성의 맥박 감소를 유발했는데(표9B 참조), 테스트 약물 자체에 의한 어떤 맥박 감소보다 더 현저하였다(표9B 참조).
결론
화합물9의 정맥투여 후의 랫트에서의 이러한 조사결과들은, 이 분자는 긴 작용 지속을 가진, 빠른 작용의 개시를 가진다는 것을 나타내었다. 그러나, 10배 낮은 분자량을 가지고 있음에도 불구하고, 혈관억제제로서의 화합물9의 효력은 앞의 연구에서 보고된 mPEG 5kDa-아미드 화합물X(화합물1)의 그것과 비교할 수 있었다. 이에 대한 이유는 즉시 식별할 수 있는 것이 아니라, 활성 종(species)으로의 더느린 변형을 반영할 수 있다. 이러한 가능성은 PEG유도체에 대한 현재의 지식으로 설명하는 것은 어려울 것이지만, 하이드록실기로 보호 아세틸 성분의 제거뿐 아니라 아미드 결합의 효소에 의한 가수분해의 중요한 특징을 설명할 수 있다. 저분자량의 PEG는 더 경직된 고분자 크기의 PEG그룹보다 더 강제적일 수 있고, 분자를 활성 종의 공격 및 릴리스에 잘 따르지 않도록 하는 화합물X 상의 아미드 결합의 적당한 노출을 허락하지 않을 수 있다. 어떻게 다른 크기의 치환체들이 화합물X 벤진덴 화학 주 사슬상의 정전하 분포에 영향을 미치는지는 알려져 있지 않지만, 만일 이것이 저혈압적 반응을 끌어내는 활성종이라면, 이것은 또한 PEG동족체 또는 그 후에 릴리스된 유리(free) 변형되지 않은 화합물X의 가수분해율을 조절할 수 있다.
아미드 결합을 통하여 5,000달톤 또는 20,000달톤의 PEG에 결합된 디-아세틸화 화합물의 정맥내 투여에 대한 종전의 연구들은, 아세틸화는 분자들로 하여금 느린 회복율을 가진 MAP의 작은, 점진적인 감소를 유발하게 한다는 것을 보여주었다. MAP에 있어서의 이런 점진적인 감소는 반사성 빈맥을 수반하지는 않았다. 반대로, 본 연구에서는, 화합물9는 작용의 빠른 개시를 보였고, 맥박의 초기 감소를 수반했다. 따라서, 에스테르 또는 아미드기에 의해 결합된 분자량 5,000 또는 20,000의 PEG에서 아세틸화에 의한 하이드록실기의 보호는 낮은 분자량의 화합물에서는 활성종의 릴리스를 조절하지 않다는 것으로 여겨진다. 이것이 낮은 분자량의 아세틸화된 에스테르 유도체에도 또한 적용될지 여부는 더 많은 연구를 기다려야 할 것이다. 그러나, 화합물X의 PEG에 결합되지 않고, 아세틸화된 형태는 마찬가지로 작용은 빠른 개시를 주었다는 것은 타당하다. 이것은 비경구 투여 후의 작용의 빠른 개시를 줄이기 위한 화학적인 접근은 단지 350달톤 이상의 PEG유도체에서 작동할 것이라는 것을 제시한다.
경구투여 후, 화합물9의 최고용량은, 에탄올, 제공된 오일을 용해되기 쉽도록 하는데 필요되는 용매가 포함된 부형제인 경우의 작고 점진적인 MAP의 감소에 의해 이 효과의 중요성이 불명확해짐에도 불구하고, MAP의 점진적인 감소를 나타내게 했다. 이 작용의 크기 때문에 낮은 용량은 조사되지 않았다. 그러나, 이 혈관억제성 작용은 절식 및 급식된 랫트 모두에서 비교되었는데, 그 데이타는 이들 양 조건하에서 비교할 수 있는 생체이용율이 있었다는 것을 제시한다. 정맥 및 경구 투여 후 화합물9의 혈압 프로화일의 비유사한 특성 때문에, 이들 연구에서 경구투여에 의한 순수한 생체이용율을 측정하는 것이 어렵다.
아세틸화된 mPEG 5,000 또는 20,000달톤 화합물X 아미드 유도체의 혈류역학적 프로화일이 정맥 또는 피하투여 후에 유사하였다는 이전의 조사결과는 느린 활성, 그 후 이들 동족체의 느린 대사 또는 제거가 수반된다는 것을 제시한다. 반대로, 화합물9에 대한 현재의 연구는, 이들 화합물은 낮은 분자량에 불구하고 증가된 효능 또는 비경구 투여 후의 심혈관계 증상에 대한 느린 작용 개시의 잠재적인 이익을 제공하지 않는다는 것을 제시한다. 그러나, 저분자량 PEG유도체의 사용은 신규의, 오랜 작용의 경구로 흡수된 프로스타사이클린 유도체의 발전을 위한 합리적인 화학적 접근을 제공할 것이다.
실시예15
마취된 랫트의 생체 내에서 mPEG 350Da-에스테르-화합물X 디아세테이트의
전신 혈류역학에 미치는 효과의 평가
이 연구에서, 화학적으로 안정한 프로스타사이클린의 벤진덴(benzindene) 동족체의 신규한, 저분자량 폴리에틸렌 글리콜(PEG)유도체, 화합물X의 심혈관 활성이 랫트에 정맥투여 후에 평가되었다. 이하에서는 화합물10이라 하는, mPEG 350Da-에스테르-화합물X 디아세테이트가 화합물의 전신 혈류역학에 미치는 효과를 조사하려는 시도로 합성되었다.
평가 화합물
테스트된 화합물은, 350달톤 분자량의 mPEG가 에스테르 결합을 통하여 화합물X의 카르복실릭기에 결합되고, 화합물X의 하이드록실기가 아셀틸화된, 이하에서는 "화합물10"라 하는 아세틸화 mPEG 350 Da 화합물X-에스테르-화합물X이었다.
방법
수컷 위스타(Wistar)랫트(250-330g)가 티오펜톤 소듐(INTRAVAL?, 120mg kg-1i.p)으로 마취되었다. 호흡을 용이하게 하기 위해 기관에 캐뉼라를 삽입하였다. 4-채널 글라스 7D 폴리그래프 기록기(Grass, Mass., USA)에 연속적으로 기록되는 평균 동맥압(MAP) 및 맥박(HR)의 측정을 위해, 우측 경동맥에 캐뉼라를 삽입하여 압력전환기(Spectramed P23XL)에 연결하였다. 약물의 투여를 위해 좌대퇴정맥 또는 우경정맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 항온성 블랭킷 조절 유닛(Harvard Apparatus Ltd)에 결합된 직장 탐지 온도계를 사용하여 실험 동물의 체온을 37±1℃에 유지하였다.
15분간의 안정기 후에, 화합물10(0.3, 3, 10 및 30 mg/kg)이 정맥 볼루스(bolus)로 투여되었다.
화합물10은 -20℃저장을 위해 에탄올에 용해되었다. 사용전 수성 부형제에서의 희석을 위해 모액 부분은 제거되었다.
결과
화합물10(0.3, 3, 10 및 30mg/kg i.v.)의 정맥 투여는 MAP에서 용량-관계 감소를 유발했다(표10A 참고). 화합물10의 고용량(10 및 30mg/kg)은 화합물10의 투여 후 45분에서 최대를 나타내는, 맥박의 작은 증가 또는 반사성 빈맥을 일으켰다(표10B 참고).
화합물10의 전신 혈류역학 효과가 실시예12의 화합물9에 의해 유도된 효과와 비교되었다.
3mg/kg의 용량에서, 화합물10에 의한 MAP의 감소는 화합물9에 의한 감소(최대: 약 15mmHg)보다 더 현저하였다(약 30mmHg). 양 화합물의 맥박에 미치는 효과는 유사하였다.
10mg/kg의 용량에서, 화합물10에 의한 MAP의 감소는 화합물9에 의한 감소(최대: 약 25mmHg)보다 더 현저하였다(약 33mmHg). 화합물10은 맥박에 작은 증가를 일으키게 하였지만, 반면에 화합물9는 맥박에 작은 감소를 일으키는 것으로 여겨졌다. 화합물9에 의한 맥박의 감소효과는 화합물10의 부형제로 사용된 에탄올의 최종농도(2.5% v/v)보다 더 큰 화합물9의 부형제내의 에탄올 최종 농도(4.5% v/v)에 기인할 수 있다.
30mg/kg의 용량에서, 화합물10 및 화합물9에 의한 MAP의 최대감소는 비스하였다(약 45mmHg). 화합물10은 맥박의 작은 증가를 일으켰지만, 반면에 화합물10은 맥박의 작은 감소를 일으키는 것으로 여겨졌다. 맥박 감소 효과는 화합물10의 부형제내의 에탄올 농도(8.5% v/v)및 화합물9의 부형제 내의 에탄올 농도(15% v/v)의 차이에 기인할 수 있다.
또한, 화합물10의 전신 혈류역학적 효과는 mPEG 5kDa-에스테르-화합물X 디아세테이트(화합물2) 또는 mPEG 20kDa-에스테르-화합물X 디아세테이트(화합물5)에 의해 유도된 효과와 비교되었다. 명백히, 이 결과에 의하면, MAP의 감소는 최소 PEG분자량을 가지는 화합물이 MAP의 최대 감소를 유발하는, PEG-분자의 크기에 의존하였다. 예를 들면, 10mg/kg에서, 화합물10에 의해 유도된 MAP의 최대감소는 35mmHg였지만, 반면에, 화합물5에 의한 MAP의 감소는 20mmHg이었다. 최소 분자량의 PEG를 포함하는 유사한 화합물은 최대 반사성 빈맥을 또한 유발했다.
30mg/kg의 용량에서, 화합물10에 의해 유도된 MAP의 최대 감소는 약 40mmHg이었고, 반면에, 화합물5에 의한 MAP의 감소는 약 30mmHg이었다. 맥박에 대한 모든 화합물의 효과는 유사하였다.
또한, 화합물9의 전신 혈류역학적 효과는 mPEG 5kDa-아미드-화합물X 디아세테이트(화합물8) 또는 mPEG 20kDa-아미드-화합물X 디아세테이트(화합물7)에 의해 유도된 효과와 비교되었다.
MAP의 감소는, 최소 분자량의 PEG를 포함하는 호합물이 MAP의 가장 빠른 감소를 유도한 바와 같이, PEG-분자의 크기에 좌우되었다. 예를 들면, 10mg/kg에서, 화합물9에 의해 유도된 MAP의 최대감소는 1분 이내에 약 20mmHg(최대: 60분인 시점에서 약 25mmHg)였지만, 반면에, 화합물7에 의한 MAP의 감소는 1분 이내에는 무시해도 좋을 정도였다(최대: 180분인 시점에서 약 30mmHg). 에탄올(4.5%)내에 용해되었던 화합물9는 맥박의 작은 감소를 일으킨 반면, 다른 것들( 아세테이트 완충용액에 용해됨)은 맥박에 영향을 미치지 않았다.
30mg/kg의 용량에서, 화합물9에 의한 1분 이내의 MAP의 감소는 약 45mmHg(최대; 1분인 시점에서 약 45mmHg)인 반면에, 화합물7에 의한 1분 이내의 MAP의 감소는 거의 무시할 수 있는 정도(최대: 180분인 시점에서 약 30mmHg)였다. 에탄올(15%)에 용해되었던 화합물9는 맥박의 현저한 감소를 유발하였지만, 다른 것들(아세테이트 완충용액에 용해됨)은 맥박에 영향을 미치지 않았다.
실시예16
양의 생체 내에서 화합물X 및 PEG 결합-화합물X의
폐혈압에 미치는 영향
각 양은 폐동맥압(PPA), 좌동맥압(PLA), 전신동맥압(PSA), 심박출량(CO) 및 맥박(HR)의 측정을 위해 모티터되었다. 실험 동안 혈액 내 약물 수준을 측정하기위해 양으로부터 혈장 샘플을 채취하였다. 실험은 공지된 폐동맥 고혈압 유도제를 통상의 방법으로 정맥 주입함으로써 시작하였다. 폐혈관 저항(PVR)을 일으키게 하여 초기 기준값 PVR를 3-4배 증가시키도록 유도율이 조정되었다. PVR은 PPA 및 PLA의 차이를 CO로 나눔으로써 계산된다. 안정기 후에, 본 프로스타글란딘 화합물의 샘플이 MEDICATOR?분무제 전달 시스템(Healthline Medical Inc., Baldwin Park. CA)을 사용하는 외과수술적으로 준비된 기관절제술 또는 정맥 주입을 통하여 투여되었다.
실험들은 정맥으로 주입된, 실시예1의 화합물1과 유사하게 제조된 mPEG 20kDa-아미드-화합물X, 및 실시예3의 화합물3이라 불리는 mPEG 20kDa-에스테르-화합물X, 및 폐 고혈압 유도 동안의 연무된 mPEG 20kDa-에스테르-화합물X(화합물3)의 효과를 측정하기 위해 수행되었다. 도1에 관하여, 약15분 후에 기준선이 설정되었고, 폐 고혈압은 공지된 약물( PGH2동족체, U44069 또는 9,11-디데옥시,9α,11α-에폭시메타노프로스타글란딘 F2α)을 양으로 정맥투여 함으로써 유도되었다. 양을 약 85분간 안정된 상태에 이르도록 한 후에, mPEG 20kDa-아미드-화합물X(1.25g I.V.)가 양으로 정맥 주입되었다. mPEG 20kDa-아미드-화합물X의 주입 약 75분 후에, 폐동맥 고혈압의 완전한 역전이 실험의 나머지 기간 동안 관찰되었다.
도2에 관하여, mPEG 20kDa-에스테르-화합물X(1.25g I.V.)의 정맥 볼루스 투여는 약 30분간 양이 안정된 상태에 이르도록 하여 행해졌다. PPA-PLA 기록은 투여 후 30분 이내에 약 28cmH2O에서부터 약 17cmH2O까지 떨어졌다. 여기서부터 약 5시간동안 압력은 같은 수준으로 저하되어 유지되었고, 그 후 점차적으로 약 25cmH2O까지 증가하였다.
도3에 관하여, U44069의 주입 후 양을 약 30분간의 안정된 상태에 이르게 한 후, mPEG 20kDa-에스테르-화합물X(0.625g)이 약 1시간 동안 연무제로 투여되었다. PPA-PLA은 약 32.5cmH2O에서부터 약 21cmH2O까지 급하게 떨어졌다. 압력은 연무제 주입이 불연속이 되기 전에 약 22.5cmH2O까지 약간 상승하였다. 압력은 약 135분 동안 약 22.5cmH2O에서 안정을 유지했고, 그 후 105분에 걸쳐 약 32.5cmH2O까지 아주 점진적으로 증가했다.
도4에 관하여, U44069의 주입 후 양을 약 30분간의 안정된 상태에 이르게 한 후, mPEG 20kDa-에스테르-화합물X(0.625g I.V.)이 소량 정맥 볼루스 투여되었다. PPA-PLA은 1시간 동안 약 37.5cmH2O의 최고 기록에서부터 약 31cmH2O까지 떨어졌다. 압력은 이후 약 90분 동안 안정되게 유지되다가, 그 후 시간동안 약 35cmH2O까지 느리게 증가하였다.
U44069가 주입된 양을 약 90분간 안정된 상태에 이르게 한 후에, 1mg/kg으로 mPEG 5kDa-에스테르-화합물X이 15분간의 기간에 걸쳐 분무제형으로 투여되었다. 주입이 끝난 후 30분에 약 18.25cmH2O로부터 약 1cmH2O아래 기준선 기록까지 상당하고 극적인 압력감소가 있어났다. 그 이후에는 약 1.5cmH2O에서 저하된 상태로 유지되었다. 압력은 이 시간 이후 다음 2.5시간에 걸쳐 약 7.5cmH2O까지 아주 점진적으로 증가되었다. 압력은, mPEG 5kDa-에스테르-화합물X의 분무화된 주입의 말단 후에 전체 240분간에 걸쳐 최대기록의 50%아래에 머물렀다.
실시예17
양의 생체 내에서 본 프로스타글란딘 화합물의 분무화한
투여로부터의 전신 혈류역학적 효과
일반적 프로토콜
본 프로스타글란딘 화합물의 양에 대한 분무제 투여는 전신 혈류역학에 대하여 이런 화합물들이 미치는 효과를 측정하기 위해 행해진다.
각 양은 폐동맥압(PPA), 좌동맥압(PLA), 전신동맥압(PSA), 심박출량(CO) 및 맥박(HR)의 측정을 위해 모티터된다. 실험 동안 혈액내 약물 수준을 측정하기 위해 양으로부터 혈장 샘플이 채취된다. 실험은 인위적으로 폐동맥 고혈압 유도하기 위해 U44069(9,11-디데옥시,9α,11α-에폭시메타노프로스타글란딘 F2α,PGH2동족체)를 정맥내 주입함으로써 시작한다. 폐혈관 저항(PVR)을 일으키게 하여 초기 기준값 PVR의 3-4배 증가시키도록 U44069 주입율이 조정되었다. PVR은 PPA 및 PLA의 차이를 CO로 나눔으로써 계산된다. 안정기 후에, 본 프로스타글란딘 화합물의 샘플이 MEDICATOR?분무제 전달 시스템(Healthline Medical Inc., Baldwin Park. CA)을 사용하는 외과수술적으로 준비된 기관절제술 또는 정맥 주입을 통하여 투여되었다.
구체적인 프로토콜
A. 실험의 제1 시리즈는 U44069-유도 폐동맥 고혈압을 역전시키는 본 프로스타글란딘 화합물의 합리적인 유효량을 측정하기 위해, 그리고 투여된 본 프로스타글란딘 화합물의 특정한 요량의 유효기를 확인하기 위해 행해진다.
20분간 모든 리스트된 변수들의 기준선을 측정한 후에, PVR이 기준값의 3-4배 증가하도록 충분한 비율로 U44069이 정맥 주입된다. 각각 안정한 반응에 이르게 10분을 경과한 후에, 본 프로스타글란딘 화합물의 하나가 60분간 분당, kg당 3000ng의 비율(즉, 30kg의 양의 경우: 3000ng*30*60=5.4mg의 약물 또는 270mg의 약물/PEG)로 분무되어 투입된다. 만일 본 프로스타글란딘 화합물이 증가된 PVR에 예측할 수 있는 효과를 준다면, U44069이 안정된 반응이 관찰될 때까지 연속적으로 주입된다. 안정된 반응에 다다르게 되면, U44069는 20분간 불연속되고 또 10분간 다시 주입된다. 이 과정은 U44069로 유된 PVR의 증가가 본 프로스타글란딘 화합물의 샘플에 의해 더 이상 약화되지 않을 때까지 반복된다.
만일 샘플 화합물의 용량이 투여의 30에서60분까지 효과를 보이지 않으면, 용량은 3-4배 증가된다. 만일 샘플 화합물의 용량이 유효하면, 새로운 대상 양이 사용되고 실험은 종전 용량의 1/3의 새로운 용량으로 반복된다. 이 과정은 최소 유효 용량 및 대응하는 유효량이 측정될 때까지 반복된다.
B. 실험의 제2 시리즈는 대조군의 양에 대한 본 프로스타글란딘 화합물의 효과를 측정하기 위해 행해진다. 추가 실험을 위해 본 프로스타글란딘 화합물의 3가지 용량이 준비된다. 제1 용량은 실험의 제1 시리즈로부터의 최소 유효용량으로 결정된 용량이다. 본 프로스타글란딘 화합물의 제2 용량은 최소 유효 용량의 2배이고, 제3 용량은 최소 유효 용량의 5배이다. 대응하는 용량으로 투여된 양은 용량 투여당 최소2시간 동안 모니터된다.

Claims (43)

  1. 하기 식 Ⅰa 또는 Ⅰb의 화합물 및 이것의 약제학적으로 수용가능한 염.
    [P-T]n-Z ------- Ⅰa
    P-[T-Z]n------- Ⅰb
    여기에서, P는 프로스타글란딘 화합물 또는 이것의 동족체이고, T는 P의 활성기이며, 그리고 Z는 T에 결합되어 상기 화합물의 대사율을 늦추는 약제학적으로 수용가능한 기이며; n은 1이상의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    T가 카르복실기, 하이드록실기, 카르보닐기, 산화 카보하이드레이트 및 메르캅토기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    T가 카르복실기 또는 하이드록실기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    Z가 약제학적으로 수용가능한 폴리머 또는 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제4항에 있어서,
    약제학적으로 수용가능한 폴리머가 폴리알킬렌 옥사이드, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알콜 및 카르보하이드레이트계 폴리머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제5항에 있어서,
    약제학적으로 수용가능한 폴리머가 폴리알킬렌 옥사이드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제6항에 있어서,
    폴리알킬렌 옥사이드가 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제7항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 약 200에서 약 80,000인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제7항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 약 2,000에서 약 42,000인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 약 5,000에서 약 25,000인 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 하기식 Ⅱ를 갖는 화합물.
    여기에서, Z1및 Z2는 수소, 약제학적으로 수용가능한 폴리머 및, Z1및 Z2의 적어도 하나가 수소가 아닌 경우 아세틸기로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고, X는 O 및 NH로부터 선택된다.
  12. 제11항에 있어서,
    Z1은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고, X는 O 및 NH로부터 선택되며,그리고 각 Z2는 수소 및 아세틸기로부터 독립적으로 선택되는 그룹1 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제11항에 있어서,
    Z1은 수소이고, X는 O로부터 선택되며, 그리고 적어도 하나의 Z2가 에스테르기를 통하여 산소원자와 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머인 그룹2 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제11항에 있어서,
    Z1은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고, X는 O 및 NH로부터 선택되며, 그리고 적어도 하나의 Z2가 에스테르기를 통하여 산소원자와 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머인 그룹3 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 하기식 Ⅲ을 갖는 화합물.
    여기에서, Z1및 Z2는 수소, 약제학적으로 수용가능한 폴리머 및 아세틸기로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되고,
    f는 1에서 3까지의 정수이며;
    X는 O 및 NH로부터 선택되며; 그리고
    R은 수소 및 알킬기로부터 선택된다.
  16. 제15항에 있어서,
    R이 1-6탄소 원자를 가지는 알킬기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제15항에 있어서,
    Z1은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고, X는 O 및 NH로부터 선택되며, 그리고 각 Z2는 수소 및 아세틸기로부터 독립적으로 선택되는 그룹4 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제15항에 있어서,
    Z1은 수소이고, X는 O이며, 그리고 각 Z2는 아세틸기, 또는 에스테르 또는 에테르기를 통해 산소원자에 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머인 그룹5 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제15항에 있어서,
    Z1은 약제학적으로 수용가능한 폴리머이고, X는 O 및 NH로부터 선택되며, 그리고 각 Z2는 에스테르 또는 에테르기를 통해 산소원자에 결합된 약제학적으로 수용가능한 폴리머인 그룹6 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제11항에 있어서,
    약제학적으로 수용가능한 폴리머가 약 200에서 80,000의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제20항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 약 2,000에서 42,000인 것을 특징으로 하는화합물.
  22. 제15항에 있어서,
    약제학적으로 수용가능한 폴리머가 약 200에서 80,000의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제22항에 있어서,
    폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 약 2,000에서 42,000인 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제15항에 있어서, 하기 식Ⅳ를 갖는 화합물.
    여기에서, a는 약 6에서 600이다.
  25. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 5,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 NH이며, 그리고 각 Z2가 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 5,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 O이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제15항에 있어서,
    Z1은 수고이고, 각 Z2가 -O(CH2)2-CO-기를 통하여 산소원자에 결합된 약 20,000의 분자량을 가진 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제15항에 있어서,
    Z1은 수소이고, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 20,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 O이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 20,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 NH이며, 그리고 각 Z2가 수소인 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 20,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 NH이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 5,000의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 NH이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 350의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 NH이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제15항에 있어서,
    Z1은 약 350의 분자량을 가지는 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜이고, X는 O이며, 그리고 각 Z2가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 화합물.
  35. 유효량의 제1항의 화합물 및 약제학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 유효량의 제11항의 화합물 및 약제학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 유효량의 제15항 화합물 및 약제학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 제35항의 조성물을 온혈동물에게 투여하는 것을 포함하는, 말초혈관질병 및 폐고혈압증 중의 하나 이상을 치료하기 위한 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 온혈동물에게 약 0.5에서 100mg/kg/1일을 제공할 수 있는 충분한 양의상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 온혈동물에게 상기 조성물을 정맥 내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제35항에 있어서,
    상기 온혈동물에게 상기 조성물을 피하로 투여하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제35항에 있어서,
    상기 온혈동물에게 상기 조성물을 흡입 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제35항에 있어서,
    상기 온혈동물에게 상기 조성물을 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.
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