KR20010080625A - 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기 위한배합물과 방법 그리고 복합한 유전자 분석법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 임의의 복잡한 출발물질로부터 고상에 결합시키는 것을 통하여 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한, 카오트로픽 성분을 함유하지 않는 배합물에 있어서, 하나 이상의 항카오트로픽 염 성분을 함유하는 세포용해/결합 완충액 계, 고상 및 원래 공지된 세정 및 용출 완충액을 함유하는 것을 특징으로 하는 배합물에 관한 것이다. 세포용해/결합 완충액 계는 즉시 사용할 수 있는 반응 용기중의 수용액 또는 고상 배합물일 수 있다. 카오트로픽제를 사용하여 분리하는데 사용되는 모든 캐리어, 바람직하게는 유리 섬유 매트, 유리 막, 실리카 캐리어, 세라믹, 제올라이트 또는 음으로 작용하는 표면 또는 음전하 전위로 전환될 수 있는 화학적으로 변형된 표면을 갖는 물질이 고상으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 출발물질을 용해시키고, 핵산을 고상에 결합시키며, 캐리어 결합된 핵산을 세척해내고 핵산의 용출을 실시하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 배합물을 사용하여 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기 위한 배합물과 방법 그리고 복합한 유전자 분석법{Formulations and methods for isolating nucleic acids from any complex starting material and subsequent complex genetic analysis}
전통적인 조건하에서는 부분적으로 단백질 분해 효소를 이용하여 강한 변성 및 환원 조건하에서 핵산을 함유하는 출발물질을 분해시키고, 분해되어나온 핵산 분획을 페놀/클로로포름 추출단계에 의해 정제하며 수성상으로부터 투석 또는 에탄올 석출시키는 것에 의해 핵산을 수득하는 것에 의해 세포와 조직으로부터 DNA를 분리한다(샘브룩, 제이; 프리츠, 이. 에프; 및 마니아티스, 티., 1989, CSH, "Molecular Cloning").
세포 및 특히 조직으로부터 핵산을 분리하기 위한 전통적인 방법은 실제 현장 조건하에서는 실시될 수 없는 점은 차치하더라도 아주 시간 소모적(거의 48 시간 이상 소요)이고 장치 비용이 많이 소요된다. 또한 이러한 방법은 무시못 할 정도의 페놀 및 클로로포름과 같은 화학약품을 사용함으로 인하여 건강에 해롭다.
다양한 생물학적 출발물질로부터 핵산을 분리하는 여러 가지 대체 방법에 의해 비싸고 건강에 해로운 페놀/클로로포름을 사용한 핵산 추출과 시간 소모를 피할 수 있다.
상술한 방법은 포겔슈타인 및 길레스피에 의해 개발된 아가로오스 겔로부터 DNA 단편을 제조하여 분석 정제하는 방법을 기초로 하고 있다(Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 1979, 76, 615-619). 이 방법은 분리될 DNA 밴드를 함유하는 아가로오스를 카오트로픽 염(NaJ)의 포화액에 분해하는 것과 DNA를 유리 입자에 결합시키는 것을 포함한다. 유리입자에 고정된 DNA를 세정액(20 mM 트리스 HCl [pH 7.2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v 에탄올)으로 세척하면 캐리어 입자로부터 분해된다.
지금까지 상기 방법은 수차례 변형되었고 현재로서는 다양한 기원의 핵산을 추출하고 정제하는 다양한 방법에 적용되고 있다(마르코, 엠. 에이.; 치퍼필드, 알. 및 비른보임, 에이치. 지.; 1982, Anal. Biochem., 121, 382-387).
또한 현재 전세계에 걸쳐 주로 아가로오스 겔의 DNA 단편을 정제하고 또 세균 용해물로부터 플라스미드 DNA를 분리하기 위한 시약 계이지만 혈액, 조직 또는 세포 배양물로부터 장쇄의 핵산(게놈 DNA, 세포성 총 RNA)을 분리하기 위한 시약 계가 다수 존재한다.
이러한 모든 시판되는 키트는 충분하게 공지된 다양한 카오트로픽 염의 용액 존재하에서 핵산을 무기 캐리어에 결합시키는 원리 및 캐리어인 미세하게 분쇄된 유리 분말의 현탁액(예컨대 유리 밀크, BIO 101, 라졸라, 캐나다), 규조토(컴패니 시그마) 또는 실리카겔(디아겐, DE 41 39 664 A1)을 사용하는 것을 기초로 한다.
다수의 다양한 용도에 적용가능한 핵산을 분해하기 위한 방법이 US 특허 5,234,809호(Boom)에 개시되어 있다. 이 특허에는 출발물질을 카오트로픽 완충액과 함께 배양하는 것에 의한 핵산 및 고상 결합 DNA를 함유하는 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법이 기재되어 있다. 카오트로픽 완충액은 출발물질을 용해시킬 뿐만 아니라 핵산이 고상에 결합되게한다. 이 방법은 소량의 물질로부터 핵산을 분리하는데 적합하며, 실제로 바이러스성 핵산을 분리하는데 적용된다.
이들 방법의 특정 변형은 특정 특징에 관하여 사용상 이점을 나타내는 신규 캐리어의 사용과 관련된 것이다(Invitek GmbH WO-A 95/34569).
출발물질을 카오트로픽 완충액 및 고상과 함께 배양하는 것을 기초로한 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하는 방법의 결정적인 결점은 카오트로픽 완충액에 의해 유발되는 세포의 분해가 모든 물질에 다 적용가능한 것이 아니라, 아주 불충분하게 적용되며 다량의 출발물질을 사용한 경우에 아주 시간 소모적이라는 점이다. 그 이외에도 DNA를 조직 샘플로부터 분리할 경우에 기계적 균질화 방법이 요구된다. 또한 다양한 특징을 조사하기 위해 다양한 농도의 상이한 카오트로픽 완충액을 사용해야만 한다. 따라서 이 방법은 일반적으로 적용할 수가 없다.
출발물질을 용해시키기가 어려운 점에 기인한 문제는 핵산을 분리하기 위한(특히 복잡한 출발물질로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한) 다수의 시판 제품에 의해 해결될 수 있지만, 이들 방법은 출발물질의 용해가 단백질 분해효소를 포함한 통상의 완충액중에서 실시되기 때문에 US 특허에 따른 방법의 특징적인 고전적인 "단일 튜브"법이 아니라는 큰 단점이 있다. 핵산을 예컨대 원심분리막에 결합시키는데 필요한 카오트로픽 이온은 용해를 완료한 후 용해 뱃치에 별도로 부가되어야한다. 그러나 이들은 카오트로픽 염의 단백질 분해기능이 알려져 있고 효과적인 용해에 필요한 단백질 분해효소를 즉시 파괴할 수 있어 용해 완충액 부분을 형성할 수 없다. 이것이 카오트로픽 염을 사용하여 핵산을 분리하는 방법이 많은 결점에도 불구하고 세계적으로 널리 인정받고 시판 제품에 의해 백만번 이상 사용되는 이유이다. 이들 계는 적용하기가 아주 간단하고 언제나 다음 순서, 즉 출발물질을 용해시킨 다음 캐리어 분산액상의 원심분리 칼럼내에 있는 유리 또는 실리카막의 고상에 핵산을 결합시키고, 결합된 핵산을 미미한 이온강도를 갖는 완충액으로 세척한 다음 핵산의 용출액을 미미한 이온강도를 갖는 완충액으로 세척하는 원리를 따른다.
이들 모든 계는 카오트로픽 염의 존재하에서 각 캐리어 표면에 핵산을 결합시키는 것, 즉 하나 이상의 완충액이 카오트로픽 염을 주성분으로 함유하는 것을 기본으로 한다. 이것은 용해 완충액을 지칭하거나 또는 단백질분해 효소를 포함한 계의 경우 출발물질의 용해를 완료한 후 부가되는 결합용 완충액을 필요로한다.
음으로 하전, 중성 또는 염기성 단백질을 염석하기 위한 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈는 카오트로픽 염의 기초를 형성한다. 따라서, 카오트로픽 염은 단백질을 변성시키고, 물에서 비극성 물질의 용해도를 증가시키며 또 소수성 상호반응을 파괴하는 것을 특징으로 한다. 최신 기술에 따르면, 카오트로픽 염의 완충액계와 함께 이들 특성은 수성 매질의 우수한 구조를 파괴하여 선택한 고상에 핵산을 결합시킨다. 핵산을 분리하기 위한 가장 중요한 화합물은 과염소산 나트륨, 요오드화 나트륨, 요오드화 칼륨, 구아니딘 티오시아네이트 및 구아니딘 히드로클로라이드이다. 그러나 이들은 아주 비싸고 또 독성이거나 부식성을 갖는다.
현재까지 다수의 특허출원 및 특허는 상기 최신 기술을 기초로하고 있으며, 이러한 방법의 변형은 언제나 새로운 캐리어 또는 보다 효과적인 세척 완충액의 사용과 관련되어 있으며, 기본 원리는 실리카 물질로 구성된 고상에 결합시키기 위해 언제나 카오트로픽 염을 사용하는 것이다.
카오트로픽 염의 존재하에서 핵산을 무기 캐리어에 결합시키는 물리-화학적 원리는 국제적으로 당업자에게 공지되어 있다. 핵산을 무기 캐리어의 표면에 결합시키는 것은 수성 매질의 우수한 구조를 방해하여 핵산이 무기 물질, 특히 유리 또는 실리카 입자의 표면에 흡착되게하는 것이다. 수성 매질의 우수한 구조를 방해하는 것은 카오트로픽 이온의 존재를 언제나 필요로한다. 고농도의 카오트로픽 염의 경우, 상기 반응은 거의 정량적으로 진행한다. 이들 물리-화학적 발견으로 인하여, 전문가들은 핵산을 분리하기 위한 모든 시판되는 계는 핵산을 고상에 결합시키기 위한 고 이온강도의 카오트로픽 염과 함께 완충 조성물을 함유해야 한다는 사실을 기초로 진행한다.
본 발명은 하나 이상의 항 카오트로픽 염 성분, 고상 및 공지의 세정과 용출용 완충액을 함유하는 세포용해/결합용 완충 계를 함유하는 양의 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산을 고상에 결합시키는 것에 의해 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한 카오트로픽(chaotropic) 성분을 함유하지 않는 배합물에 관한 것이다. 세포분해/결합용 완충 계는 즉시 이용가능한 반응용기의 수용액 또는 고상 배합물로서 존재할 수 있다. 카오트로픽제를 사용하여 분리하는데 이용된 모든 캐리어, 바람직하게는 유리섬유 매트, 유리 막, 실리콘 캐리어, 세라믹, 제올라이트 또는 음으로 작용하거나 또는 음전하 전위로 변환될 수 있는 화학적으로 변형된 표면을 갖는 물질이 고상으로 작용할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 배합물을 사용하여 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한 방법에 있어서, 출발물질을 용해시키고, 핵산을 캐리어에 결합시키며, 캐리어에 결합된 핵산을 세정하고 그 핵산을 용출시키며, 필요에 따라 선택된 서열 부분을 증폭시킨 다음 필요에 따라 동일한 반응 캐비티(cavity)에서 증폭된 유전자 부분을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 적용은 법의학, 식품 진단, 의약 진단, 분자생물학, 생화학, 유전공학 및 기타 모든 인접 영역과 같은 DNA 분리를 다루는 모든 실험실에서 적용된다.
도 1은 다양한 식물물질로부터의 게놈 DNA의 분리를 도시하고,
도 2는 다양한 출발물질로부터의 게놈 DNA의 분리를 도시하며,
도 3은 구강점막 표본으로부터의 게놈 DNA의 분리를 도시하고,
도 4는 비교방법과 비교한 본 발명에 따라 전혈 샘플로부터의 DNA의 추출을 도시,
도 5는 비교방법과 비교한 본 발명에 따라 전혈 샘플로부터의 DNA의 추출을 도시,
도 6은 비교방법과 비교한 본 발명에 따라 다양한 양의 동물조직으로부터 DNA의 추출을 도시하,
도 7은 전혈 샘플로부터 DNA를 추출하여 캐리어에 핵산을 결합시킨 것을 도시,
도 8은 전혈, 타액샘플 및 파라핀 제거된 조직물질로부터 추출된 DNA의 전기영동도,
도 9는 전혈 샘플로부터 추출한 게놈 DNA의 전기영동도,
도 10은 말초혈액 림프구로부터 분리된 게놈 DNA의 아가로오스 겔 평가를 도시.
놀랍게도 본 발명에 따르면 세포용해/결합 완충액계에 항카오트로픽 염을 함유하는 배합물이 임의의, 특히 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기에 아주 우수하다는 것이 밝혀졌다.
본 발명은 첨부된 특허청구범위에 따라 실시된다. 본 발명의 주제는 핵산, 특히 DNA를 고상에 결합시켜 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기 위한 카오트로픽 성분을 함유하지 않고, 하나 이상의 항카오트로픽 염 성분, 고상 및 원래 공지된 세정 및 용출 완충액을 포함하는 세포용해/결합 완충액 계를 함유하는 배합물과 방법이다. 본 발명의 의미에서 항카오트로픽 성분은 암모늄, 세슘, 나트륨 및/또는 칼륨염, 바람직하게는 염화 암모늄이다.
또한 세포용해/완충액 계는 공지된 세정제 및 첨가제, 예컨대 트리스-HCl,EDTA, 폴리비닐 피롤리돈, CTAB, 트리톤 X-100, N-라우릴 사르코신, 나트륨 시트레이트, DTT, SDS 및/또는 Tween을 함유한다. 세포용해/결합 완충액계를 실시하기 위한 바람직한 변형은 고상에 결합시키기 위한 에탄올, 이소프로판올과 같은 알코올 및 효소, 필요에 따라서 바람직하게는 효소 분해 단백질, 예컨대 단백질분해효소를 함유한다.
본 발명에 따르면, 최신기술에 상응하는 원리는 핵산을 분리하는 특수한 문제를 해결하거나 또는 현존하는 변형을 특수한 관련 변수에 대하여 최적화하거나 효과적으로 만들기 위해 이용될 수 있다. 따라서 완전 자동화 고효율 방법으로 이용하기에 적합하다.
예기치않게, 공지 최신 기술과는 달리, 핵산, 특히 게놈 DNA는 본 발명에 따라 카오트로픽 염 성분을 함유하지 않는 세포용해/결합 완충액 계에 의해 무기 지지제에 결합되어 통상의 조건하에서 용출될 수 있다.
또한 필요에 따라 세포용해/결합 완충액 계의 성분으로서 복수의 완전히 상이한 염은 유리 또는 실리카를 기초로 한 고전적인 캐리어에 핵산을 결합시키는데 충분하다고 할 수 있다.
특히 놀랍게도, 이들의 화학적-물리적 특징 이후에 핵산을 결합시키기 위해 지금까지 사용된 카오트로픽 염에 대하여 완전히 반대되는 효과를 나타내는 염을 사용하여 가장 우수한 결과를 달성할 수 있다. 따라서, 이들 염을 항카오트로픽이라 칭한다. 세포용해/결합 완충액을 사용하여 다양한 복잡한 출발물질(예컨대 혈액, 조직, 식물)로부터 게놈 DNA를 추출하는데 있어 적어도 동량 및 동질의 결과를달성할 수 있었고, 이들중 주 성분은 예컨대 카오트로픽 염(시판되는 추출 키트) 대신 암모늄 염이며, 기타 다른 반응 성분, 통상의 캐리어를 일정하고 거의 동일한 반응 경로를 유지한다.
따라서, 암모늄 이온은 상기 시리즈의 공지 카오트로픽 이온과 완전히 반대의 화학적-물리적 특성을 나타내는 호프마이스터 시리즈중의 이온이다.
지금까지 사용된 카오트로픽 염 성분을 세포용해/결합 완충액중의 항카오트로픽 염 성분으로 대체하고 다른 변수는 일정하게 하는 것만으로도, 원래 공지된 고상 캐리어의 표면상에서 적어도 적합한 양의 핵산을 분리할 수 있다.
이것은 염에 의해 단백질을 변성시키지 않고 안정화하며, 물에서 비극성 물질의 용해도는 증가시키지 않고 감소시키며, 소수성 상호작용을 파괴시키지 않고 강화함으로써 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하고, 이들을 정제하여 통상의 용도에 적용할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 의하면, 핵산을 고상, 바람직하게는 무기 캐리어에 결합시키는 메카니즘 및 이를 기초로하여 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기 위한 통상적으로 적용가능한 신규 방법이 제공된다.
따라서, 본 발명은 실리카 또는 유리물질과 같은 다양한 고상에 핵산을 결합시키는 것을 기초로하여 핵산, 특히 게놈 DNA를 분리하기 위한 카오트로픽 염을 기초로한 세포용해/결합 완충액의 신규 조성물의 사용을 통하여 각 시험 키트(배합물)의 필수 성분으로서 다른 화학작용의 이용을 허용한다.
따라서, 항카오트로픽 염을 사용한 본 발명에 따른 방법은 실험실 규모의 통상의 방식으로부터 공지된 핵산을 분리하기 위한 방법 경로를 따르며 이하와 같은 특징을 갖는다:
1. 출발물질의 용해
2. 핵산을 고상에 결합시킨다(원심분리 칼럼 또는 현탁액)
3. 결합된 핵산을 세척
4. 핵산을 공지된 저염 완충액으로 용출시킨다.
본 발명은 임의의 및 필요에 따라 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 게놈 DNA를 고도로 효과적이고 신속하게 분리한다. 결합에 필요한 항카오트로픽 이온은 단백질분해 효소를 포함하더라도 세포용해/결합 완충액의 성분일 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 따라서 쉽게 보편적으로 적용될 수 있다.
임의의 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하는 것은 핵산을 함유하는 출발물질을 카오트로픽 물질을 사용함 없이 배양함으로써,
- 항카오트로픽 염 성분, 세제, 필요에 따라 첨가제 및 필요에 따라 효소를 함유하는 수용액을 포함하는 세포용해/결합 완충액 계,
- 및 임의의 고상, 바람직하게는 유리 섬유 매트, 유리 막, 유리, 제올라이트, 세라믹 및 기타 실리카 담체와 접촉하게됨으로써 출발물질의 용해를 유발시켜서 DNA를 고상에 결합시키는 것에 의해 실시된다. 따라서, 결합된 핵산을 공지 방법에 따라 세척하고 고상으로부터 분리한다.
특수한 추출 방법의 경우, 필요에 따라 부가적인 세제, 알코올 또는 세제/알코올 혼합물을 세포용해 뱃치에 부가할 수 있다.
바람직한 출발물질은 과일, 종자, 잎, 침상엽 등과 같은 조밀한 식물물질; 전혈, 조직, 마이크로바이오프테이트(microbiopates), 파라핀 피복된 물질, ercp-샘플, 표본과 같은 임상적으로 관련된 샘플; 물고기, 소세지, 통조림, 우유와 같은 식료품; 모근, 담배 꽁초, 혈액 흔적과 같은 법의학 샘플; 및 DNA를 함유하는 기타 샘플이다.
본 발명의 의미에서 바람직한 이온은 호프마이스터 시리즈로 대표되는 항카오트로픽 암모늄 이온, 세슘 이온 및 칼륨 이온 및 나트륨 이온 또는 이들 이온의 조합물, 바람직하게는 염화 암모늄이다. 이들은 세포용해/결합에 대해서는 0.1 내지 8 M의 이온 강도로 사용된다.
핵산, 특히 DNA를 고상 캐리어에 결합시키기 위해서는 바람직하게는 1M 이하의 낮은 염 농도가 충분하며, 특정 용도에서는 0.5M 이하의 농도에서도 충분하며, 다량의 출발물질로부터 핵산을 정량적으로 분리하기 위해서는 높은 이온 농도가 성공적이다.
본 발명의 바람직한 실시 형태로서 세포용해 완충액의 필수 성분으로서 단백질 안정화 효과를 갖는 항카오트로픽 염을 사용하는 것에 의해, 세포용해 방법을 지지하고 보다 효과적으로 하기 위해 프로테나제 K와 같은 단백질분해 효소를 부가할 수 있으며, 예컨대 5M과 같은 높은 이온 강도의 항카오트로픽염을 필요로하는 세포 분해를 위하여 부가함으로써 핵산의 정량 분리가 가능하게된다.
공지 카오트로픽 염을 사용한 최신 기술의 완충액 계는 일반적으로 핵산의 정량 분리에 필요한 높은 이온 강도의 단백질 분해효소를 함유하지 않을 수 있다.따라서, 이들은 핵산을 고상에 결합시킬 때 언제나 후속적으로 부가될 수 있다.
본 발명에 따른 세포용해 완충액/결합 완충액에서, 바람직하게는 SDS, 트리톤 X-100, Tween 또는 CTAB와 같은 음이온성, 양이온성 또는 중성의 단백질 분해 효소가 세제로 사용된다.
출발물질의 세포용해를 완료한 후 짧은 원심분리 단계로 완전히 용해되지는 않은 성분으로부터 현탁액을 분리하고, 필요에 따라서 또 결합 DNA와 함께 직접적으로 배양하거나, 상술한 바와 같이, 부가적인 세제, 알코올 또는 세제/알코올 혼합물을 부가한 후 고상과 함께 배양한다. 세포용해 완충액 계로서는 부가적인 미미한 농도(<50 mM)의 EDTA 및/또는 트리스-HCl가 있다. 아주 심하게 오염된 출발물질로부터 DNA를 분리하기 위해서는, 바람직하게는 2 내지 4%의 폴리비닐 피롤리돈 또는 기타 공지된 물질을 완충액 계에 부가하여 억제 성분을 선택적으로 결합시킨다.
예컨대 시판중인 원심분리 칼럼중의 유리섬유 매트, 다양한 입자 크기의 SiO2와 같은 실리콘 화합물은 분리될 DNA에 대한 결합물질로 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 카오트로픽 완충액을 사용하여 핵산을 분리하기 위해 사용되는 모든 물질이 사용될 수 있다.
DNA 결합물질과 함께 배양한 후, 용해물을 간단한 원심분리 단계에 의해 결합물질로부터 분리한다. 이어, 적어도 50%의 에탄올 및 저염 농도, 필요에 따라 NaCl로 구성된 세척 완충액을 사용하여 공지 방식으로 세척하며, 캐리어를 건조하고 결합된 DNA를 공지된 저염 완충액(트리스-HCl; TE; 물)을 사용하고 바람직한 50 내지 70℃의 온도에서 용출한다.
본 발명의 다른 적용변형은 조밀한 조직 샘플, 모근과 같이 분해하기 힘든 출발물질을 용해하기 위해 또는 용해의 효율을 최적화하여 필요한 용해 시간을 단축하기 위하여 단백질분해 효소, 바람직하게는 프로테나제 K와 같은 프로테나제를 부가하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명은 DNA를 함유하는 모든 출발물질 뿐만 아니라 임의 양의 대부분의 다양한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위해 보편적으로 적용가능한 방법과 용해 완충액 혼합물의 필수 성분인 항카오트로픽 염과 지금까지 사용된 모든 캐리어와 새로이 조합되어 적용할 수 있으며 이들의 변형 또한 동일하게 효과적으로 이용될 수 있으며 지금까지 적용된 핵산 분리를 제어하는 규칙도 동일하게 이용가능하다.
본 발명에 따른 방법을 이용한 가장 일반적인 적용 변형에서, 최신기술에 상응하는, 즉 신규한 보편적인 완충액 계를 이용하여 모든 선택된 복잡한 출발물질로부터 핵산의 추출, 고효율 용해에 이어 조밀한 식물물질(예컨대 과일, 종자, 잎, 침엽 등)로부터, 임상적으로 관련된 샘플(예컨대 전혈, 조직, 마이크로바이오프에이트, 파라핀 피복된 물질, ercp-샘플, 표본)으로부터, 식품(예컨대 생선, 소세시, 통조림, 우유)로부터, 법의학 샘플(예컨대 모근, 담배꽁초, 혈액 흔적)으로부터 뿐만 아니라 기타 출발물질로부터 얻은 핵산을 무기 캐리어에 결합시키는 것은 성공적으로, 아주 쉽게 그리고 매우 신속하게 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 다른 이점은 본 발명의 방법에 의해 극소량의 출발물질(예컨대 1 ㎕의 전혈, 모근, 미세생검조직으로부터 1 mg 이하의 DNA 분리)로부터뿐만 아니라 다량의 출발물질, 예컨대 50 ml의 전혈, 1g의 조직물질 및 1g 이상의 식물물질로부터 DNA를 아주 효과적으로 분리할 수 있는 것이다.
카오트로픽 염을 항카오트로픽 염으로 교체한 다른 이점은 사용된 완충액이 카오트로픽 화학제를 사용하고 있지 않아 더 이상 독성이나 부식성 효과를 갖지 않는 점이다.
가장 일반적인 실시 변형 이외에도, 특정 적용에 관련된 추출 방법의 최적화를 실시하면 출발 샘플에 함유된 DNA 양을 거의 정량적으로 분리할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면 지금까지 시중에서 구입할 수 있는 고도로 최적화된 추출 키트에 의해서 얻을 수 있었던 수율과 비교하여, 최신 기술에 따라 고농도 결합 DNA의 카오트로픽 이온을 사용함없이 본 발명에 따른 방법을 이용하여 더 높은 DNA 수율을 얻을 수 있다는 것은 놀라운 것이다.
시판되는 추출 키트를 이용하여 달성한 일련의 각 비교 결과는 실시예에 예시되어 있다. 이들 결과는 본 발명의 가능성을 분명히 보여준다.
DNA를 함유하는 모든 복잡한 출발물질로부터 DNA를 분리하는 이외에, 본 발명에 따른 방법을 적용하는 다른 변형은 플라스미드 DNA를 최신기술에 따라 무기 캐리어에 결합시키는데 필요한 카오트로픽 염을 사용함 없이 세균 용해물로부터 플라스미드 DNA를 아주 효과적으로 분리한다. 따라서, 당업자에게 공지된 기본적인 용해법에 의해 플라스미드 DNA를 분리하는 방법에 따르면, 필요한 소위 중화반응을 전통적인 용액 III(마니아티스 및 샘브룩)을 사용하는 것에 의해 실시하며 이중 기능으로 존재하는 상기 용액 III은 동시에 플라스미드 DNA를 통상의 고상 캐리어에결합시키는 작용을 한다. 따라서 플라스미드 DNA의 결합을 위해 카오트로픽 구아니디늄 히드로클로라이드의 통상적인 부가를 필요로하지 않는다.
결합된 플라스미드 DNA는 공지 방식으로 세척하고 캐리어로부터 용출시킨다. 이 방법은 모든 사용된 출발물질(미니에서부터 기가에 이르기 까지)로부터 플라스미드 DNA를 분리하는데 적합하다. 따라서, 수득한 플라스미드 DNA 수율은 전통적으로 시판되는 방법에 따라 분리된 수율과 동일하다. 그러나, 카오트로픽은 아주 비싸기 때문에, 본 발명에 따른 방법은 모든 다른 계에 비하여 그 가격면에서 알맞다.
항카오트로픽 염을 사용하는 방법은 플라스미드 분리방법을 선택하는 데 있어 가격/제법이 결정적인 기준인 플라스미드를 분리하기 위한 자동화 계를 디자인하는데 아주 적합하다.
본 발명에 따른 배합물은 놀랍게도 핵산을 분리하고 진단하는 분야에 관심을 갖고 새로이 적용할 수 있다.
본 발명을 적용하는 다른 형태로서, 적어도 하나의 항카오트로픽 염 성분을 함유하는 새로운 세포용해/결합 완충액 계는 핵산을, 음으로 하전된 표면 또는 음전하 전위를 갖는 표면을 갖는 고상에 결합시키는 위치에 존재한다.
핵산을 화학적으로 변형된 고상에 결합시키는 것에 의해 핵산을 정제하는 방법과 수단은 당분야에 공지되어 있다(미국특허 5,523,392호: 알루미늄 실리케이트 및 포스포실리케이트상에서 DNA의 정제; 미국특허 5,503,816호: 변형된 실리케이트상에서 DNA 정제; 미국특허 5,438,127호: PCl3변형된 유리섬유 막을 사용하여 고상추출에 의해 DNA 정제; 미국특허 5,606,046호: 트리플루오리메트릭산으로 세정된 유리섬유 막을 이용한 고상 추출에 의해 DNA 정제; 미국특허: 트리플루오로아세트산, 이어 플루오라이드 이온, 히드록사이드 이온 또는 BCl3로 미리 처리된 유리섬유 막을 사용한 고상 추출에 의해 DNA 정제; 미국특허 5,610,291호: SiCl3, AlCl3또는 BCl3으로 처리한 후 NaOH로 세척하는 것에 의해 DNA흡착제로 변형된 유리섬유 막; 미국특허 5,616,701호: 히드록사이드 세척된 유리 섬유 막을 사용한 고상 추출법에 의한 DNA 정제; 미국특허 5,650,506호: 고상 추출에 의해 DNA 정제하는데 유용한 변형된 유리 섬유 막).
핵산을 결합시키기 위한 전제 조건은 결합에 사용된 막을 화학적 변형반응에 의해 양이온 전하로 도핑하는 것이다. 따라서, 결합은 양으로 하전된 막 표면과 핵산의 인산 결합의 음이온 전하간의 쿨롱 상호작용에 의해 유발되는 것이 명백하다. 따라서, 핵산을 양으로 하전된 고상에 결합시키는 원리는 당업자에게 널리 공지되어 있는 바와 같이 양으로 하전된 나일론 필터상에서의 DNA/RNA 블로팅 수법과 같은 표준 적용에 오랫동안 이미 사용되고 있다.
그러나, 상기 방법의 결정적인 결점은 핵산을 분리하는데에는 적합하지 않는 것, 즉 복잡한 출발물질로부터 핵산을 완전히 분리할 수 없는 점이다. 출발물질은 상기 인용한 미국 특허 명세서에 기재된 방식으로 분리되어야할 핵산이다. 특히, 한가지 특징은 당업자에게 분명한 것이 아니다. 기재된 결합 조건(물리적 완충 조건하의 결합) 및 용출 조건은 동일하다. 핵산을 양으로 하전된 막에 결합하기 위한동일 완충액 조건을 고려할 때 핵산이 막으로부터 어떻게 다시 용해될 수 있는지는 알려져있지 않다.
마지막으로, 기재된 수단과 각 방법은 실질적으로 아주 협소한 의미로 이용될 수 있다. 합성 제조된 올리고뉴클레오타이드를 양으로 하전된 면에 결합시키는 것도 공지되어 있다. 즉, 다시 말해, 변형된 올리고뉴클레오타이드(아미노 링커 또는 포스페이트 링커와의 결합)를 통한 양전하 및 음전하의 결합을 기초로하는 쿨롱 상호작용을 이용하는 것에 의해 실시된다. 이들 변형은 복잡한 출발물질로부터 핵산의 분리를 허용하지 않는다.
상술한 바와 같이, 핵산을 분리하기 위한 방법을 나타내지 않는 충분한 양전하를 갖는 막을 정제하기 위해 핵산을 결합하는 임의 형태로 존재한다. 핵산의 결합은 양이온 전하의 막과 음이온 전하의 핵산 골격간의 상호작용을 기초로한 쿨롱력에 의해 유발된다. 따라서, 이 원리는 논리적으로 설명가능한 것으로 보인다.
본 발명에 따른 항카오트로픽 염을 사용하여 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하는 것을 기초로 한 놀라운 현상이 확인되었다. 따라서, 음전하 전위로 전환될 수 있는 음전하 표면이 본 발명에 따른 세포용해/결합 완충액 계를 이용하여 핵산을 결합시키는데 적합할 수 있다는 것이 분명하였다. 일반적으로, 우리는 그러한 확률을 에상할 수 없는데, 이는 동일한 전하 전위로 인하여 결합이 아니라 반박력이 생길 것이라 예상하기 때문이다.
본 발명에 따른 음으로 변형할 가능성이 있는 음으로 작용하는 표면은 상기와 같은 공지 방법에 따라 제조된다. 아세틸기, 카르복시기 또는 히드록시기를 반응 용기의 표면과 광화학적으로 결합시키는 것이 적합한 것으로 드러났다.
본 발명의 변형은 복잡한 핵산 분석에 대한 완전히 새로운 전망을 제공한다. 즉, 핵산은 지금까지 기술한 모든 변형에서와 같이 음 또는 음의 표면에 결합하기 위해 분리될 필요는 없음이 분명하다. 결합은 용해 반응 뱃치로부터 실시될 것이며, 즉 핵산을 함유하는 출발샘플은 용해되고 방출된 핵산은 음으로 하전된 표면에 결합될 것이다(예컨대 마이크로테스트 플레이트 캐비티 또는 에펜도르프 반응 용기).
본 발명에 따른 변형은 완전히 신규한 "단일 튜브" 및 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분위하기 위한 1공정 방법에 적용된다. 이러한 방법은 사용자의 용도 범위에서 많은 이점을 제공한다(간편성, 저렴함, 폐기 감소, 신속함, 통상의 방식에 적용가능함, 자동화 등).
또한 상기 변형의 다른 용도는 반응 캐비티에서 핵산을 추출하는 것 뿐만 아니라 동일한 반응 용기중에서타겟을 증폭하고 분석하는 것과 필요한 경우 잡종화 반응, 필요에 따라 고상에서 서열분석도 가능하다.
이를 기초로 하여, 0.5 ml 에펜도르프 PCR 용기를 당업자에게 공지된 수법을 이용하여 음으로 하전되거나 잠재적 음 작용기에 의해 변형된다. 이를 위해서는 아세틸기, 카르복시기 또는 히드록시기를 반응용기의 표면과 광화학적으로 결합하는 것이 적합하다. 이어, 핵산(예컨대 전혈)을 분리하기 위해 선택된 샘플을 반응 용기에 넣고 항카오트로픽 염 분획을 함유하는 용해 완충액과 배양하고, 염화 암모늄, 세제 및 단백질분해 효소를 부가하고 용기를 70℃에서 5분간 배양한다.
핵산의 결합을 최대로 하기 위해, 출발물질의 용해를 완료한 후 세제/알코올 혼합물을 피펫으로 부가할 수 있다. 이어, 뱃치를 간단하게 배양한 다음 반응 용기로부터 쏟아낸다. 핵산을 반응 용기의 작용성 표면에 결합시킨 다음 알코올성 세척 완충액으로 간단하게 세척한 다음 70℃에서 배양하는 것에 의해 알코올을 제거한다. 이어, 결합된 핵산의 용출은 저염 완충액(예컨대 10 mM 트리스-HCl)을 반응 용기에 부가하고 70℃에서 간단히 배양(예컨대 2분)하는 것에 의해 효과적으로 실시한다. 이렇게하여 다음에 사용할 수 있는 핵산을 수득한다.
상술한 바와 같이, 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하는 모든 반응은 1개 반응 용기내에서 실시되며, 즉 출발물질의 용해, 핵산의 결합, 결합된 핵산의 세척 및 핵산의 용출은 1개 반응 용기내에서 실시된다.
현재 가장 빈번하게 세계적으로 이용되고 있는 Qiagen 컴패니의 추출키트는 용해, 결합, 세척 및 용출을 위하여 언제나 1개의 필터 카트리지와 4개 이상의 별도의 반응 용기 뿐만 아니라 다중 원심분리 단계를 필요로한다.
이와 반대로, 본 발명에 따른 변형은 단일 원심분리 단계없이 핵산을 추출한다. 이로부터 굉장한 시간상의 이점을 얻을 수 있다. 이들 이점은 Boom에 의한 미국 특허 5,234,809호에 예시된 핵산 추출법에도 관한 것이다.
핵산의 추출 가능성과는 별도로, 결합된 핵산은 0.5 ml 반응 용기의 표면에 잔존할 수 있으며, 완전한 PCR 믹스(프라이머, 뉴클레오타이드, 폴리머라제 완충액, Taq 폴리머라제, 마그네슘)을 부가하는 것에 의해 PCR 적용에 직접적으로 이용될 수 있으며, 즉 동일 반응 용기에서 추출과 증폭을 실시한다.
이들 실시예는 많은 이점과 본 발명으로부터 유도될 수 있는 다양한 용도를 설명한다. 일개 변형예로서,증폭과 필요한 경우 분석을 통한 샘플의 제조 전체 공정을 1개의 반응 캐비티에서 실시한다. 따라서, 변형된 반응 용기(또는 다른 고체 표면) 및 적합한 세포용해/결합 완충액 조건부로 분자생물학을 다루는 실험실에서 새로운 표준을 개발하고 충분히 공지된 샘플을 오염시키는 문제를 갖는 핵산 진단법은 상기 새로운 용액의 적용에 의해 현저하게 감소될 수 있다.
다른 이점 및 다른 용도는 표면상에 고정된 핵산이 더 오랫동안 안정하게 고정되어 있어 후처리가 가능하며, 즉 PCR을 추출한 직후에 하지 않아도 된다. 다른 적용분야는 여기 기재된 음전하 또는 잠재적 음전하를 갖는 표면을 이용하여 필요에 따라 핵산의 전자동화 추출 및 분석을 실시하는 것이다(바람직하게는 적합한 반응 캐비티의 플라스틱 표면, 예컨대 마이크로테스트 플레이트).
단백질분해 효소를 경우에 따라 포함하는 항카오트로픽 염을 주성분으로 사용한 본 발명에 따른 세포용해/결합 완충액 계는 고상 배합물로 제공될 수 있다. 이를 위하여 염 및 세제, 첨가제 및 효소의 혼합물을 통상의 반응 용기에서 동량으로 나누고 95℃에서 수시간 동안 배양하거나 공지 방법에 따라 동결건조시킨 다음 고상 배합물로 전환할 수 있다.
핵산을 분리하기 위한 복잡한 기성 반응 혼합물중의 이들 고상 배합물은 장기간 저장해도 안정하며, 즉 단백질 분해 효소 성분의 생물학적 활성이 장시간 저장(실시예 참조)하는 동안에 유지된다. 따라서, 분해 완충액 혼합물의 안정한 배합물이 그러한 공지의 보호 첨가제를 부가하지 않고도 단순히 저온 동결건조하는 것에 의해 제조될 수 있다.
시판되는 모든 핵산 추출 시험 키트는 필요로하는 성분을 개별적으로 함유하며, 특수한 용액은 사용자에 의해서 제조되어야한다. 그외에, 용액의 안정성도 제한된다. 다른 결점은 현존하는 통상의 시험 키트를 사용하여 핵산을 분리하는 동안 사용자가 다양한 개별 용액에 대한 복수의 피펫팅 단계를 고려해야하는 점이다. 이것은 오염의 위험성을 현저히 증가시키며 의약 진단 분야에서 특히 현저하다. 또한 핵산을 분리하기 위해 주로 적용되는 통상적으로 이용되는 원심분리 칼럼의 로딩 제한으로 인하여, 출발물질의 양이 현저히 제한된다. 이것은 추출에 필요한 용해 및 결합 완충액이 출발재료에 여전히 부가되어야하기 때문이다.
항카오트로픽 염을 기초로한 저장 안정한 용해 혼합물로서 안정한 배합물을 제공하는 것에 의해, 기존의 문제를 완전히 간단한 방식으로 해결한다. 이 배합물은 다음과 같은 이점을 갖는다:
1. 기성의 용해 완충액 혼합물의 저장 시간이 길다.
2. 제조된 용해 혼합물중에서 단백질 분해효소를 안정화하고 저장 시간이 길다.
3. 동일한 크기의 현존하는 원심분리 칼럼에서 다량의 출발물질(출발물질의 양)을 사용한다.
4. 피펫 첨가 단계 및 용액을 감소시키는 것에 의해 오염의 위험을 감소시킨다.
5. 실험실 밖에서 이미 제조된 용해 혼합물중에서 샘플을 흡수하고 필요에따라 장시간 동안 저장한다.
6. 샘플의 안정한 보급과 냉각.
단백질분해 효소를 비롯한 다양한 개별 성분으로 구성된 준비된 고상의 안정한 용해 완충액 혼합물은 필요에 따라 취급하기가 쉬우며(특수한 지식을 갖지 않는 사람에 의해서도), 이는 반응이 분리할 핵산을 함유하는 샘플을 부가하는 것에 의해 간단하게 개시될 수 있기 때문이다. 이와는 다르게, 상기 혼합물은 이들이 함유하는 물질에 따라 6개월 이상의 수명시간을 갖는 점에서 진행될 수 있으며, 실온에서 샘플의 수송이 더 이상 문제가 되지 않는다.
고상 배합물의 이점은 핵산을 함유하는 샘플을 샘플 물질에 함유된 핵산의 용해를 위한 저장 안정한 용해 완충액을 함유하는 반응 용기에 넣어 그 샘플을 각 반응 용기내에서 필요에 따라 물을 부가하여 용해시키는 것을 기초로 하고 있다. 오염의 위험이 있었던 값비싼 복수의 피펫팅 단계는 완전히 감소된다. 주어진 필드 조건에서 임상 샘플 및 법의학 샘플을 수집하고 제조하는 것과 관련된 공지 문제는 본 발명에 따른 배합물에 의해 해결되며 이 배합물은 아주 취급하기가 용이하다.
놀랍게도, 실제 사용에 의하면 H2O를 부가한 후 필요에 따라 고체 샘플을 부가할 때 용해될 출발물질을 부가한 후, 고상 배합물은 아무런 문제를 유발함없이 표준 반응 조건하에서 액상으로 전환될 수 있음을 나타낸다.
요컨대, 다음과 같이 서술할 수 있다:
본 발명의 목적은 고상에 결합하기 위한 핵산, 특히 DNA를 임의의 복잡한 출발물질로부터 분리하기 위한 카오트로픽 성분을 함유하지 않는 배합물에서 항카오트로픽 염의 사용에 관한 것이다. 이 배합물은 하나 이상의 항카오트로픽 염 성분, 고상 및 공지된 세척 및 용출용 완충액을 갖는 세포용해/결합 완충액 계를 함유한다. 용해/결합용 완충액 계는 즉시 사용하기 위한 반응 용기중의 수용액 또는 고상 배합물 형태로서 구입할 수 있다. 모든 캐리어는 카오트로픽 시약을 분리하기 위해 사용되는 고상으로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 음으로 하전된 표면 또는 음전하 전위를 나타내는 화학적으로 변형된 표면을 갖는 유리 섬유, 매트, 유리 막, 실리콘 캐리어 및 에어로실 또는 캐리어이다.
또한, 본 발명의 목적은 출발물질의 용해, 핵산을 캐리어에 결합, 캐리어에 결합된 핵산을 세척하고 핵산을 용출하는 것을 특징으로 하는, 상술한 배합물을 사용하여 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
수득한 DNA 질에 따라서, 예비적 분리법 및 유전자 치료법에 사용하기 위한 DNA 정제에도 적합하게 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 종래의 반응 용기에 즉시 사용하기 위한 혼합물로 유용한 항카오트로픽 염을 기초로하여 핵산을 분리하기 위해 사용되며 저장 안정한 세포용해 완충액 계의 고상 배합물을 제공하는 것이다. 세포용해 완충액 뱃치의 고상 배합물은 샘플(전혈, 침, 세포 현탁액, 혈청, 플라즈마, 액체인 경우)을 단지 부가하는 것에 의해, 고체 표면상의 조직, 모근, 혈액 흔적과 같은 고체의 출발 물질인 경우, 담배 꽁초, 파라핀 제거된 조직 등인 경우 부가적으로 물을 부가하는 것에 의해 활성화되며 출발물질의 용해를 실시한다. 출발물질의 용해를 완료한 후,용해 뱃치를 공지 방법으로, 필요에 따라 에탄올성 용액 또는 알코올/세제 혼합물을 다양한 고상 결합 핵산(현탁액, 원심분리 칼럼)과 함께 부가하는 것에 의해 배양된다. 각 고상에 핵산을 결합시키고, 결합된 핵산을 세척하며 최종적으로 용출시키는 것은 최신 기술에 따라 이미 기재된 바와 같이 실시될 것이다. 이들 고상 배합물에 의해, 핵산 진단을 이용한 임의 분야에 주로 사용되는 신규 용액이 제공된다.
일-단계 방법 및 단일 튜브법과 같은 본 발명의 변형은 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리할 수 있으며, 필요에 따라 타겟을 증폭하고 또 필요한 경우 증폭된 핵산 부분을 분석할 수 있도록 한다. 따라서, 출발물질은 이미 분리한 핵산일 필요가 없고 핵산을 함유하는 복잡한 출발물질이다. 핵산을 결합하기 위한 표면은 음 작용기 또는 잠재적으로 음 작용기를 함유한다. 핵산의 결합은 항카오트로픽 염으로부터 유래한 음 작용의 표면에 음으로 하전된 핵산을 결합시키는데 필요한 이온을 갖는 세포용해/결합용 완충액중에서 실시한다.
따라서 이하를 실시할 수 있다:
1. 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리하기 위한 "단일 튜브"법.
2. 핵산을 분리한 다음 타겟 증폭을 실시하기 위한 "단일 튜브"법.
3. 복잡한 출발물질로부터 핵산을 분리한 다음 타겟 증폭을 실시하며 이어 증폭된 핵산부분을 분석하기 위한 "단일 튜브"법.
이것은 DNA를 함유하는 대부분의 다양한 출발물질로부터 핵산을 분리하고 필요에 따라 타겟 증폭과 분석을 동일 반응 용기 또는 필요에 따라 하나 또는 동일한반응 표면에서 실시함을 의미한다.
임의 출발물질로부터 핵산을 분리하고, 정제한 다음 복잡한 분자 분석하고 핵산 함유량을 정량하기 위한 본 발명에 따른 배합물 및 용 고상에 핵산을 결합시키는 보편적인 방법은 완전히 일체로 자동화된 유전자 분석 계를 개발하기 위한 신규 플랫폼 기술을 나타내며, 그에 의해 1개의 반응 용기중에서 샘플을 제조하고 배가시키며 타겟을 분석할 수 있다.
이후, 이하 실시예를 들어 본 발명을 더 자세하게 설명한다.
1. 다양한 식물물질로부터 게놈 DNA의 분리
50 내지 100 mg의 출발 식물물질을 액체 질소하에서 모르타르로 분쇄한 다음 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기로 옮긴다. 500 ㎕의 용해 완충액(2% CTAB, 2% 폴리비닐 피롤리돈, 10 mM 트리스-HCl, 20 mM EDTA 및 1.3 M 염화 암모늄)을 부가한 다음 65℃에서 30분 이상 동안 배양한다. 용해되지 않은 성분을 원심분리하고 상청액을 200 ㎕의 이소프로판올과 혼합한다. 상기 용액을 유리섬유 막(마이크로 스핀 칼럼, LIDA 캄패니 제조)를 갖는 원심분리 칼럼으로 옮긴다. 12,000 rpm에서 2분간 원심분리한다. 여액을 제거하고 막을 세척 완충액(50 mM NaCl; 10 mM 트리스-HCl; 1mM EDTA; 70% v/v 에탄올)으로 2회 세척한다. 단시간의 원심분리 단계(12,000 rpm으로 2분간)에 의해 에탄올을 제거한 후 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.7)을 부가하고 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하는 것에 의해 DNA를 용출시킨다.
용출 DNA의 20 ㎕를 아가로오스 겔에 놓고 에티듐 브로마이드로 착색시켜 나타낸다(도 1).
2. 보편적인 완충액 계를 이용하여 다양한 출발물질로부터 게놈 DNA의 동시 분리
이하의 샘플을 분리에 사용하였다:
동결된 1-전혈: 50 ml, 2-전혈: 100 ㎕, 3-오이: 50 mg; 4-토마토 식물 잎: 100 mg; 5-타액 샘플: 100 ㎕; 6-닭 간; 동결 음식물: 5 mg; 7-닭 간; 동결 음식물: 20 mg; 8-모근, 9-칠면조 살라미 소세지: 50 mg; 10-주목(yew), 침엽: 100 mg.
모든 샘플을 500 ㎕의 용해 완충액(2% CTAB; 2% 폴리비닐 피롤리돈, 10 mM 트리스-HCL; 20 mM EDTA 및 1.5 M 염화 암모늄)에서 배양하고 다만 모든 식물 샘플에는 20 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml)를 65㎕ 부가하였다. 이어 200 ㎕의 이소프로판올을 용해물에 부가하고 유리섬유 막(마이크로 스핀 칼럼; 캄패니 LIDA 제조)을 갖는 원심분리 칼럼에 전달하였다. 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다. 여액을 제거한 후 막을 세척 완충액(50 mM NaCl; 10 mM 트리스-HCl; 1mM EDTA; 70% v/v 에탄올)로 2회 세척하였다. 간단한 원심분리 단계(12,000 rpm에서 2분)로 에탄올을 제거한 후 50 내지 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.7)을 부가하고 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하는 것에 의해 DNA를 용출시켰다. 용출된 DNA의 1/5을 아가로오스 겔에 걸고 에티듐 브로마이드로 착색하여 나타내었다(도 2).
3. 구강 점막의 표본으로부터 게놈 DNA의 분리
구강 점막 표본으로부터 DNA 분리는 이하와 같이 실시한다.
400 ㎕의 세포용해 완충액(CTAB, 폴리비닐 피롤리돈, 염화 암모늄, 트리스, EDTA)를 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기에 넣었다. 표본 물질을 짜서 20 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml)를 그 현탁액에 부가하였다. 이어 상기 뱃치를 70℃에서 10분간 배양하였다. 200 ㎕의 세제/이소프로판올 혼합물을 부가한 후, 샘플을 짧게 교반한다음 시판되는 원신분리 칼럼(컴패니 LIDA 제조; 유리섬유 막)에 넣고 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다.
이어, 칼럼을 에탄올(12,000 rpm에서 1분간 원심분리)을 함유하는 세척 완충액(NaCl, 트리스-HCl, EDTA, 에탄올)으로 2회 세척하고 막을 짧은 원심분리 단계로 건조시켰다. 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl)을 부가함으로써 결합된 DNA를 짧은 원심분리 단계(10,000 rpm; 1분간)에 의해 필터 막으로부터 용출하였다.
2회의 추출 공정으로부터 분리된 DNA 20 ㎕를 0.7% TAE 아가로오스 겔에 놓고 에티듐 브로마이드로 착색시켜 분석하였다(도 3).
4. 카오트로픽 염의 존재하에 핵산을 결합시키는 것을 기초로한 시판되는 키트와 비교한 본 발명에 따른 전혈 샘플(200 ㎕)로부터의 DNA 추출
본 발명에 따른 방법을 이용하여 게놈 DNA를 분리하는 것을 핵산을 결합시키기 위하여 카오트로픽 염을 사용하여 게놈 DNA를 분리하기 위해 전통적으로 적용되며 시중에서 구입할 수 있는 방법과 비교하였다. 비교방법을 이용하여 게놈 DNA를 추출하는 것은 조절 제어 적용법을 기초로 실시하였다.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 DNA를 분리하는 것은 이하에 기재되어 있다.
200 ㎕의 전혈 샘플(EDTA로 처리, 신선)을 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기에 넣었다.
350 ㎕의 세포용해 완충액(CTAB, 폴리비닐 피롤리돈, 염화 암모늄, 트리스, EDTA) 및 20 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml)를 부가한 후 70℃에서 10분간 배양함으로써 출발물질을 분해시켰다.
용해시킨 후 180 ㎕의 세제/이소프로판올 혼합물을 부가하고, 샘플을 잠깐 진탕시킨 다음 시판되는 원심분리 칼럼(캄패니 LIDA 제조; 유리섬유 막)에 넣고 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다.
이어, 칼럼을 에탄올을 함유하는 세척 완충액(NaCl, 트리스-HCl, EDTA, 에탄올)(12,000 rpm에서 1분간 원심분리)으로 2회 세척하고 상기 막을 간단한 원심분리 단계로 건조시켰다. 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl)을 부가한 후 결합된 DNA를 필터 막으로부터 간단한 원심분리 단계(10,000 rpm에서 1분간)로 용출시켰다.
2회의 추출 공정으로부터 분리한 10 ㎕의 DNA를 0.7% TAE 아가로오스 겔에 놓고 에티듐 브로마이드를 사용하여 착색시켜 분석하였다.
게놈 DNA의 수율, 이들의 통합성(저분자량의 스며든 밴드없이 청정한 개별 밴드) 및 추출 방법의 재현성을 비교하였다. 본 발명에 따른 방법에 의해 드러나듯이, 비교방법에 의해서보다 훨씬 우수한 결과를 나타내었다(도 4).
5. 카오트로픽 염의 존재하에 핵산을 결합시키는 것을 기초로한 시판 키트를 이용하여 본 발명에 따른 전혈 샘플(5 ㎕)로부터의 DNA 추출 비교
본 발명에 따른 방법을 이용하여 게놈 DNA를 분리하는 것을 핵산을 결합시키기 위해 카오트로픽 염을 사용하여 용이하게 적용할 수 있는 전통적으로 이용되어온 방법에 따라 게놈 DNA를 분리하는 것과 비교하였다. 게놈 DNA는 조절 제어 방법을 기초로한 비교 방법에 따라 추출하였다.
본 발명에 따른 방법에 의한 DNA 분리는 다음과 같이 실시한다.
5 ㎕의 전혈 샘플(EDTA로 처리; 신선)을 1.5 ml의 에펜도르프 반응 용기에 넣었다.
196 ㎕의 1 x PBS 완충액을 부가한 다음 350 ㎕의 용해 완충액(CTAB, 폴리비닐 피롤리돈, 염화 암모늄, 트리스, EDTA) 및 20 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml)를 부가한 후 샘플을 200 ㎕로 넣고 70℃에서 10분간 배양하여 출발물질을 분해시켰다.
180 ㎕의 세제/이소프로판올 혼합물을 부가하여 용해시킨 후, 샘플을 간단히 진탕시킨 다음 시판되는 원심분리 칼럼(컴패니 LIDA, 유리섬유 막)에 전달하고 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다.
이 칼럼을 세척 완충액(NaCl, 트리스-HCl, EDTA, 에탄올)(12,000 rpm에서 1분간 원심분리)으로 2회 세척한 다음 막을 간단한 원심분리 단계에 의해 건조시켰다. 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl)을 부가하는 것에 의해 결합된 DNA를 필터 막으로부터 간단한 원심분리 단계(10,000 rpm, 1분)로부터 용출시켰다.
2회의 추출 공정으로부터 분리된 20 ㎕의 DNA를 0.7% TAE 아가로오스 겔상에 놓고 에티듐 브로마이드로 착색시켜 분석하였다.
소량의 출발물질로부터 게놈 DNA를 분리할 가능성과 추출 공정의 재현성을 검출하고 비교하였다. 본 발명에 따른 방법으로부터 분명하듯이, 비교 방법 보다 더 우수한 결과를 나타낸다(도 5).
6. 카오트로픽 염 존재하에서 핵산을 결합시키는 것을 기초로한 시판되는 키트를 사용하여 다양한 유형의 동물 조직 샘플과 다양한 양의 출발물질로부터 본 발명에 따른 DNA를 추출하는 것의 비교
본 발명에 따른 방법에 의한 게놈 DNA의 분리를, 핵산을 결합시키기 위해 카오트로픽 염을 사용하는 시판되며 전통적으로 이용되어온 방법에 따른 게놈 DNA 분리와 비교하였다. 게놈 DNA는 조절 제어방법을 기초로하여 비교 방법에 따라 추출하였다.
본 발명에 따른 방법을 이용한 DNA의 분리는 다음과 같이 실시한다.
돼지 신장, 돼지 심장 및 돼지 간의 5 mg 또는 20 mg 조직 샘플을 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기에 넣었다.
400 ㎕의 용해 완충액(CTAB, 폴리비닐 피롤리돈, 염화 암모늄, 트리스, EDTA) 및 40 ㎕의 프로테나제 K (20 mg/ml)를 샘플에 부가하였다.
출발물질의 용해는 52℃에서 배양함으로써 실시하였다.
용해후, 용해되지 않은 성분을 간단한 원심분리 단계(14,000 rpm에서 1분간)에 의해 원심분리 제거하고 상청액을 200 ㎕의 세제/이소프로판올 혼합물을 사용하여 새로운 반응 용기에 부가하고 샘플을 잠시 진탕시킨 다음 시판되는 원심분리 칼럼(캄패니 LIDA 제조, 유리 필터 막)에 넣고 12,000 rpm에서 2분간 원심분리하였다.
에탄올(NaCl, 트리스-HCl, EDTA; 에탄올)(12,000 rpm에서 1분간)을 함유하는 세척 완충액으로 2회 세척하고 막을 간단한 원심분리 단계에 의해 건조시켰다. 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl)을 부가하는 것에 의해, 결합된 DNA를 간단한원심분리 단계(10,000 rpm, 1분간)에 의해 필터 막으로부터 용출시켰다.
2회 추출 공정으로부터 분리한 DNA 10 ㎕를 0.7% TAE 아가로오스 겔에 놓고 에티듐 브로마이드로 착색시켜 분석하였다.
출발물질의 다양한 조직 샘플 및 다양한 양으로부터 게놈 DNA를 분리하는 가능성 및 게놈 DNA의 수율, 이들의 통합성(저분자량 침투 밴드없이 청정한 개별 밴드) 및 추출의 재현성을 측정하고 비교하였다.
분명한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법에 의하면 비교 방법에 비하여 훨씬 우수한 결과를 얻을 수 있다(도 6).
7. 본 발명에 따른 방법을 이용하여 전혈 샘플(200 ㎕)로부터 DNA를 추출하고 카오트로픽 염을 매개로 하여 결합에 이용된 다양한 캐리어에 핵산을 결합시킴.
본 발명에 따른 방법을 이용하여 200 ㎕의 전혈으로부터 게놈 DNA를 분리하고 카오트로픽제를 이용하여 핵산을 분리하는데 사용된 다양한 캐리어(컬럼 막 및 현탁액)에 핵산을 결합하는 것을 나타낸다.
DNA의 추출은 컴패니 LIDA의 유리 섬유 막 대신 사용된 다양한 캐리어를 이용하여 실시예 4에서 실시하였다.
20 ㎕의 분리 DNA를 0.7% TAE 아가로오스 겔상에 놓고 에티듐 브로마이드로 착색시킨 후 분석하였다.
도 7에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 지금까지 공지된 카오트로픽 방법에 사용되는 다양한 캐리어에 핵산을 결합시키기 위해 실시한다.
8. 단백질분해 효소(완충액 혼합물 1)를 포함한 저장 안정한 세포용해 완충액 계의 제조 및 다양한 출발물질로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 용해 완충액 계의 사용
3M 염화 칼륨, 2% CTAB, 18.2 mM의 트리스-HCl (pH 8.3), 12.5 mM EDTA, 2.8% 폴리비닐 피롤리돈을 함유하는 세포용해 완충액 원액을 제조한다. 400 ㎕ 원액의 동분량을 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기에 넣고 40 ㎕의 프로테나제 K (20 mg/ml)를 부가하였다.
세포용해 완충액 혼합물을 동결건조 공장(알파 2; 컴패니 크리스트)에서 동결건조시켰다. 이어 밀폐된 반응 용기에든 용해 완충액 혼합물을 실온에서 6개월간 저장하였다.
게놈 DNA의 추출은 다음과 같이 실시하였다:
A: 500 ㎕의 전혈
B: 400 ㎕의 타액 샘플
C: 탈파라핀화된 조직 물질
1. 전혈으로부터 DNA의 추출
용해 완충액의 고상 배합물에 500 ㎕의 전혈을 부가하고 70℃에서 10분간 배양하였다. 200 ㎕의 이소프로판올을 부가하고 그 현탁액을 원심분리 칼럼(유리 섬유 매트)에 넣었다. 최대 속도로 2분간 원심분리한 후 원심분리액을 제거한다.
600 ㎕의 세척 완충액(70% 에탄올, NaCl, 트리스, EDTA)를 부가하고, 최대 속도로 1분간 원심분리한 후 원심분리액을 제거하였다. 세척 공정을 반복한다. 이어 최대 속도로 2분간 원심분리하는 것에 의해 막을 건조시킨다. 200 ㎕의 용출 완충액(70℃)을 부가하고 최대 속도로 1분간 원심분리한 후 막으로부터 DNA를 용출시켰다.
2. 타액 샘플로부터 DNA의 추출
500 ㎕의 타액 샘플을 용해 완충액의 고상 배합물에 부가하고 70℃에서 10분간 배양하였다. 200 ㎕의 이소프로판올을 부가하고 그 현탁액을 원심분리 칼럼(유기 섬유 매트)에 넣었다. 최대 속도로 2분간 원심분리하고 원심분리액을 제거하였다. 600 ㎕의 세척 완충액(70% 에탄올, NaCl, 트리스, EDTA)을 부가하고 최대 속도로 1분간 원심분리시키고 원심분리액을 제거하였다. 세척 공정을 반복한다. 이어 최대속도에서 2분간 원심분리하는 것에 의해 막을 건조시켰다.
200 ㎕의 용출 완충액(70℃)을 부가하는 것에 의해 막으로부터 DNA를 용출시키고 최대 속도로 1분간 원심분리하였다.
3. 탈파라핀화된 조직으로부터 DNA의 추출
탈파라핀화된 조직편을 용해 완충액의 고상 배합물에 부가한다. 500 ㎕의 ddH2O를 부가하고 52℃에서 30분간 배양하였다. 200 ㎕의 이소프로판올을 부가하고 그 현탁액을 원심분리 칼럼(유리 섬유 매트)에 넣었다.
최대 속도로 2분간 원심분리하고 원심분리액을 제거하였다. 600 ㎕의 세척 완충액(70% 에탄올, NaCl, 트리스, EDTA)을 부가한 후, 최대 속도에서 1분간 원심분리하고 원심분리액을 제거하였다. 세척 공정을 반복한다. 이어 최대 속도에서 2분간 원심분리하는 것에 의해 막을 건조시켰다.
200 ㎕의 용출 완충액(70℃)을 부가하는 것에 의해 막으로부터 DNA를 용출하고 최대 속도에서 1분간 원심분리하였다.
이어 추출된 DNA를 전기영동에 의해 분석하였다. 이를 위하여 전체 DNA 용출액의 1/10을 사용하였다(도 8).
9. 프로테나제 K(완충액 혼합물 2)를 포함하는 저장안정한 세포용해 완충액 계의 제조 및 8개의 개별 전혈 샘플(100㎕)로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 세포용해 완충액 계의 용도
3M 염화 암모늄, 2% 폴리비닐 피롤리돈, 16.7 mM EDTA, 60 mM 트리스-HCl, 1.6% CTAB, 20 ㎕ 프로테나제 K (20 mg/ml)를 함유하는 세포용해 완충액 원액을 제조하였다.
400 ㎕ 원액을 동분량으로 나누어 1.5 ml 에펜도르프 반응 용기에 넣고 열혼합기중 95℃에서 개방 에펜도르프 용기를 완전히 건조될 때 까지 배양하였다. 이어 반응 용기를 닫고 실온에서 12개월간 저장하였다.
전혈으로부터 DNA의 추출
100 ㎕ 전혈을 용해 완충액의 고상 배합물에 부가하고 70℃에서 10분간 배양하였다. 20 ㎕의 무기 캐리어 현탁액을 실리카 기제에 부가하고 잠시 혼합한다. 상기 뱃치를 1분간 배양하였다. 짧게 원심분리하는 것에 의해 캐리어를 펠릿화한다. 캐리어 펠릿을 800 ㎕ 세척 완충액(70% 에탄올, NaCl, 트리스, EDTA)으로 세척한 다음 70℃에서 배양하는 것에 의해 잔류 에탄올을 제거한다. 70℃로 가열된 200 ㎕의 용출 완충액(10 mM 트리스-HCl; pH 8.69)을 부가하는 것에 의해 캐리어로부터DNA를 용출하고 또 최대 속도로 1분간 원심분리하는 것에 의해 캐리어로부터 핵산을 분리하며 이 핵산을 새로운 반응 용기로 전달하였다. 추출된 DNA를 전기영동에 의해 분석하였다. 이를 위하여, 전체 DNA 용출액의 1/10을 사용하였다(도 9).
10. 마이크로 시험 플레이트의 작용성 표면에 직접 결합시키는 것에 의해 말초 혈액 림프구로부터 게놈 DNA를 분리
COO-기 코팅을 갖는 시판되는 플레이트를 마이크로시험 플레이트로 사용하였다.
관능기를 갖는 플레이트(8개 웰)의 1개 스트립 및 COO-기를 갖지 않는 1개 스트립을 분리에 대한 음성 대조용으로 사용하였다.
모든 웰에 1 x PBS 완충액 및 180 ㎕ 용해 완충액(염화 암모늄, CTAB, 폴리비닐 피롤리돈, 트리스-HCl, EDTA, 프로테나제 K)중의 30 ㎕ 말초 혈액 림프구를 넣고 70℃에서 5분간 배양하였다. 이어 80 ㎕의 세제/이소프로판올 혼합물을 부가하였다. 상기 뱃치를 간단히 진탕시키고 5분간 배양하였다. 이어 상기 용액을 웰로부터 부어내었다. 각 웰을 에탄올을 함유하는 세척 완충액으로 2회 세척하고 70℃에서 짧게 배양하는 것에 의해 나머지 에탄올을 제거하였다.
25 ㎕ 10 mM 트리스-HCl을 부가하고 2분간 배양하는 것에 의해 핵산의 용출을 실시하였다.
용출액을 0.7% 아가로오스 겔상에서 평가하였다(도 10).

Claims (25)

  1. 임의의 복잡한 출발물질로부터 고상에 결합시키는 것을 통하여 핵산, 특히 DNA를 분리하기 위한, 카오트로픽 성분을 함유하지 않는 배합물에 있어서,
    -하나 이상의 항카오트로픽 염 성분을 함유하는 세포용해/결합 완충액 계,
    -고상 및
    -공지의 세정 및 용출 완충액을 함유하는 것을 특징으로 하는 배합물.
  2. 제1항에 있어서, 항카오트로픽 성분이 암모늄, 세슘, 나트륨 및/또는 칼륨염, 바람직하게는 염화 암모늄인 배합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계가 필요에 따라 세제 및 첨가제를 함유하는 배합물.
  4. 제3항에 있어서, 세제 및 첨가제가 트리스-HCl, EDTA, 폴리비닐 피롤리돈, CTAB, 트리톤 X-100, N-라우릴 사르코신, 나트륨 시트레이트, DTT, SDS 및/또는 Tween을 함유하는 배합물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액계가 고상에 결합시키기 위한 알코올을 함유하는 배합물.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계가 효소, 바람직하게는 단백질분해 효소를 함유하는 배합물.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계가 수용액인 배합물.
  8. 제1항 내지 제6항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계가 즉시 사용가능한 반응 용기중에 저장 안정한 고상 배합물인 배합물.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 하나에 있어서, 카오트로픽제를 사용하여 분리하는 데 사용된 고상으로 작용하는 모든 캐리어가 바람직하게는 유리섬유 매트, 유리 막, 유리, 제올라이트, 세라믹, 실리카 캐리어인 배합물.
  10. 제1항 내지 제8항중 어느 하나에 있어서, 음으로 작용하는 표면 또는 음전하 전위로 전환될 수 있는 작용성 표면을 갖는 모든 캐리어가 고상으로 작용하는 배합물.
  11. 제10항에 있어서, 캐리어의 표면이 아세틸기, 카르복시기 또는 히드록시기에 의해 변형된 배합물.
  12. 출발물질을 용해시키고,
    핵산을 고상에 결합시키며,
    캐리어 결합된 핵산을 세척해내고 핵산의 용출을 실시하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제9항중 어느 하나에 따른 배합물을 사용하여 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, DNA를 함유하는 물질을,
    항카오트로픽 염 성분, 세제, 필요에 따라 첨가제 및 필요에 따라 단백질분해 효소를 함유하는 수용액을 포함하는 세포용해/결합 완충액 계와 함께 고상에 접촉시키고, 필요에 따라,
    알코올을 부가하여 세척한 다음,
    핵산을 고상으로부터 용해시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 출발물질이 과일, 종자, 잎, 침상엽 등과 같은 조밀한 식물물질; 전혈, 조직, 마이크로바이오프테이트(microbiopates), 파라핀 피복된 물질, ercp-샘플, 표본과 같은 임상적으로 관련된 샘플; 물고기, 소세지, 통조림, 우유와 같은 식료품; 모근, 담배 꽁초, 혈액 흔적과 같은 법의학 샘플; 및 DNA를 함유하는 기타 샘플인 방법.
  15. 제12항 내지 제14항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합을 위한 항카오트로픽 염의 이온 강도가 0.1 내지 8M인 방법.
  16. 출발물질을 "단일 튜브" 또는 화학적으로 변형된 1 단계 방법으로 음으로 작용하는 표면 또는 음전하 전위로 전환될 수 있는 표면과 접촉시켜 세포용해시키고,
    상기 표면에 핵산을 결합시키며,
    결합된 핵산을 세척하고 필요에 따라 용출하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제8항 및 제10항 내지 제11항중 어느 하나에 따른 배합물을 사용하여 임의의 복잡한 출발물질로부터 핵산, 특히 DNA를 분리하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 음으로 작용하는 표면이 변형된 평면 표면, 필터 막, 전통적인 플라스틱 용기 또는 마이크로시험 플레이트인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 핵산을, 동일 반응 뱃치중에서, 선택된 서열 분획의 증폭반응처리시키고 필요에 따라 유전자 서열을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 핵산을 동일 반응 뱃치중에서 잡종화시키고 및/또는 서열결정화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 핵산을 고상에 결합시키는 것에 의해 분리 및 정제하기 위한 세포용해/결합 완충액 계로서의 항카오트로픽 성분의 용도.
  21. 제20항에 있어서, 항카오트로픽 성분이 암모늄, 세슘, 나트륨 및/또는 칼륨염, 바람직하게는 염화 암모늄인 용도.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 0.1 내지 8M 범위의 이온 강도를 갖는 항카오트로픽 염을 세포용해/결합용으로 사용하는 용도.
  23. 제20항 내지 제22항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계를 수용액으로 사용하는 용도.
  24. 제20항 내지 제22항중 어느 하나에 있어서, 세포용해/결합 완충액 계가 저장 안정한 배합물로서 존재하는 용도.
  25. 제20항 내지 제24항중 어느 하나에 있어서, 유전자 치료에 사용하기 위한 DNA의 예비적 분리 및 정제를 위한 용도.
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