KR20010052251A

KR20010052251A - 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20010052251A
Application number: KR1020007011401A
Authority: KR
Inventors: 유아사아리; 오카무라히데키; 가타오카지로
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2001-06-25
Also published as: BR9909642A; EP1072676A1; TW541338B; EP1072676A4; CN1198917C; ID26079A; DE69942722D1; EP1072676B1; WO1999054438A1; CN1297476A; KR100591493B1; MY146534A

Abstract

글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물은 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물의 배양동안에 미생물의 이화대사산물 억제를 해제하고 경우에 따라 배양 중간 단계에서 질소원을 공급함으로써 제조된다.

단백질 분해 효소가 존재하고 염화나트륨이 부재하거나 염화나트륨이 3%(중량/용량)이하의 농도로 존재하는 가운데 이와같이 수득된 미생물 배양물과 단백질을 반응시켜 강한 풍미 효과를 갖고 식품 조미료로서 매우 유용한 가수분해된 단백질을 수득한다.

Description

글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물 및 이의 용도{Microbial culture with enhanced glutaminase activity and utilization thereof}

글루타미나제는 생물계에서 널리 분포되어 있는 효소이고 L-글루타민산에 작용하여 아미드 그룹을 가수분해시킴으로써 L-글루타민산 및 암모니아를 형성시킨다. L-글루타민산을 수산화나트륨 또는 탄산나트륨으로 중화시켜 수득된 모노나트륨 L-글루타메이트는 모든 맛의 기본 물질이다. 이러한 물질은 대부분 조미료에 사용되고 가정용 식품 뿐만 아니라 가공 식품의 생산을 위해 첨가될 수 있는 첨가물이다.

지금까지 공지된, 천연적으로 유래된 식품 조미료의 생산은 주로 단백질의 가수분해를 통해 수행된다. 이러한 조미료중에서, 가수분해된 단백질은 산-가수분해된 단백질 및 효소-가수분해된 단백질을 포함한다. 산-가수분해된 단백질은 출발물질로서, 대두 및 밀로 부터 기원하는 식물성 단백질을 사용함에 의해 수득된 가수분해된 식물성 단백질 및 출발물질로서, 젤라틴 및 밀크 카제인과 같은 동물성 단백질을 사용함에 의해 수득된 가수분해된 동물성 단백질을 포함한다. 주요 성분으로서 아미노산의 조성은 출발 물질에 따라 다양하고 정미와 감미등에 영향을 미친다. 예를 들어, 염산으로 탈지 대두를 가수분해시켜 수득한 가수분해물에서 가수분해율은 70% 이상일 정도로 높고 글루타민산의 유리율은 1.2일 정도로 높다. 따라서, 느낌이 좋은 맛의 관점에서 매우 우수하다.

그러나, 가수분해된 단백질이 염산으로 가수분해되어 수득되는 경우, 100℃에서 반응은 1 내지 2일을 소모한다. 고온에서 장시간동안의 상기 반응은 대량의 에너지를 소비한다. 추가로, 산을 사용한 단백질의 가수분해는 간단하지만 악취의 발생, 아미노산의 과잉 가수분해 및 중화를 위해 높은 함량의 염이 필요하다는 결점을 갖고있다.

추가로, 최근에, 인체에 해로운 모노클로로프로판올과 디클로로프로판올과 같은 클로로하이드린은 산 가수분해에서 생성된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 방법은 식품 물질 용도로서의 문제점이 대두되고 있다.

한편, 아미노산 용액을 효소적으로 생산하기 위한 방법에 대해 많은 시도가 있어왔다. 결합된 효소 시스템이 복합 기질을 아미노산으로 가수분해시키는데 요구되고 통상적으로 국균(Koji mold)인 주로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)가 상기 목적을 달성하는데 사용된다. 상기 방법에 의해 생산되는 전형적인 아미노산 용액으로서 간장이 언급된다. 간장은 단백질 출발물질을 열 처리하고 여기에서 국균을 증식시키고 이어서 염수에서 발효시키고 수득한 물질을 숙성시킴으로써 생산된다.

그러나 상기 방법은 보다 많은 노동과 시간을 필요로 할뿐만아니라 아미노산의 유리율이 낮고 특히 대두 단백질에 대량으로 함유되고 정미성에 있어서 중요한 글루타민산의 유리율이 낮다는 결점을 갖고있다.

따라서, 최근해에, 단백질의 효소적 가수분해에 의해 생산되는 조미료는 저렴하기 때문에 유럽에서 이의 수요가 날로 증가하고 있다. 따라서, 모노클로로하이드록시프로판올과 디클로로프로판올을 함유하지 않고 염산으로 가수분해시켜 수득된 조미료와 동등한 강한 맛을 갖는 조미료는 존재하지 않았다.

간장의 생산에 있어서, 국균의 글루타미나제 활성이 부족하여 글루타민산의 양이 불충분하다. 따라서, 고체 배양에서, 높은 프로테아제 활성을 갖는 균주와 높은 글루타미나제 활성을 갖는 균주의 세포를 융합시켜 높은 활성을 갖는 균주 개량이 수행되어왔다[문헌참조: S. Ushijima, T. Nakadai: Agric. Biol. Chem., 1(4), 1051(1987); S. Ushijima, T. Nakadai, K. Uchida: Agric. Biol. Chem., 51(10), 2781(1987): S. Ushijima, T. Nakadai. K. Uchida: Nippon Shoyu Kenkyusyo Zasshi, 17, (3), 89(1991); JP-B-3-73271; JP-B-3-68672].

추가로, 다수의 효소 시스템은 이화대사산물 억제, 즉, 효소의 생합성이 신속하게 소비될 수 있는 탄소원에 의해 억제되는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: Aunstrp, K. et al.: "Microbial Technology", vol. 1(2^ndedition), Academic Press, New York, 282(1979)]. 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)에서, 프롤린 대사 또는 알콜 이용에 관여하는 효소에 대한 연구가 수행되었다. 아스퍼질러스 오리재에서 타카(Taka)-아밀라제 유전자 발현 조절에 대한 연구가 수행되었다. creA 유전자 산물인 creA 단백질은 다양한 효소의 네가티브 합성 조절을 수행하는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: N. Tsukakoshi: Chemistry and Biology, 32(1), 48(1994)].

그럼에도 불구하고, 아스퍼질러스 니듈란스에서, 배양을 위한 질소원이 암모늄인 경우 글라타미나제 생산이 억제된다는 것만이 보고되었고 국균 또는 효모의 글루타미나제가 이화대사산물 억제를 받는다는 보고는 없었다. 추가로, 균주의 액체 배양에서의 글루타미나제에 대하여 단지 하기와 같은 사항이 보고되었다:

아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 소재의 액체 배양에서 인산일칼륨을 첨가함으로써 세포에서 생산되는 글루타미나제 양이 개선됨[문헌참조: T, Yamazaki, K. Inamori, I. Uchida: Nippon Shoyu Kenkyusyo Zasshi, 22, (1), 13(1996));

바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에서 글루타민이 글루타미나제를 유도하고 글루코스에 의해 억제됨[문헌참조: Cook, William R., Hoffman, Joshua H, Bernlohr, Robert W.: J. Bacteriol., 148(1), 365(1981)];

슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomonas boreopolis)에서 글루타민이 글루타미나제를 유도함[문헌참조: Berezov, T.T., Khisamov, G. Z,, Evseev, L. P., Zanin, V. A.: Byull. Eksp. Biol. Med., 76(10), 54(1973));

에스케리치아 콜리에서 글루타민이 글루타미나제 생산을 억제함[문헌참조: Varricchio, Frederick; Arch. Mikrobiol., 81(3), 234(1972)]; 및

슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)에서 시트르산, 숙신산 및 α-케토글루타르산을 첨가함으로써 글루타미나제 생산이 감소됨[문헌참조: Nikolaev, A. Ya., Sokolov., N.N., Mardashev, S.R.; Biokhimiya. 36(3), 634(1971)].

상기 언급된 바와 같이, 아스퍼질러스 속 및 효모에 속하는 미생물을 포함하는 진균류를 사용하여 글루타미나제 생산을 개선시키는 방법에 대해 보고된 바가 거의 없다.

본 발명은 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 이것은 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물의 배양동안에 이화대사산물 억제를 해제하고 경우에 따라 배양 중간 단계에서 질소원을 공급함으로써 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물을 생산하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물, 미생물 배양물을 사용하여 가수분해된 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 수득된 가수분해된 단백질에 관한 것이다. 이러한 가수분해된 단백질은 글루타민산의 함량이 높기 때문에 정미력(seasoning power)이 강하고 조미료로서 이용가치가 높다.

본 발명자는 문제점을 해결하기 위한 연구를 꾸준히 수행하였고 결과적으로 미생물 배양동안에 이화대사산물 억제를 해제하고 경우에 따라 배양의 중간 단계에서 질소원을 공급함으로써 글루타미나제 생산이 비약적으로 개선된다는 것을 밝혔다. 상기와 같은 발견을 토대로 본 발명이 완성되었다.

제1 발명은, 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물의 배양동안에 이화대사산물 억제가 해제되고 경우에 따라 질소원이 배양 중간 단계에 공급됨을 특징으로 하는, 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물을 생산하는 방법이다.

제2 발명은, 이화대사산물 억제가 배양동안에 탄소원을 연속적으로 또는 간헐적으로 공급함에 의해 해제되는 제1 발명의 방법이다.

제3 발명은 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물이 국균 또는 효모인 제1 발명의 방법이다.

제4 발명은 제1 발명의 방법에 의해 생산되는 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물이다.

제5 발명은 단백질 분해 효소의 존재, 및 염화나트륨의 부재 또는 3%(중량/용량)이하의 농도로 염화나트륨의 존재하에 제4 발명에서 언급한 바와 같은 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물과 단백질을 반응시킴을 특징으로하는 가수분해된 단백질의 생산 방법이다.

제6 발명은, 단백질을 미생물 배양물과 반응시키는 경우 먼저, 통기 및 교반을 수행하면서 15 내지 39℃의 온도 범위에서 반응을 수행하고 이어서 통기 없이 40 내지 60℃의 온도 범위에서 반응을 수행하는, 제5 발명에서 언급된 바와 같은 가수분해된 단백질을 생산하는 방법이다.

제7 발명은 제5 또는 제6 발명의 방법에 의해 생산되는 가수분해된 단백질이다.

제8 발명은 하기의 특징들을 갖는 가수분해된 단백질이다.

(a) 밀 글루텐이 출발물질로서 사용된다.

(b) 전체 고체 함량중에 글루타민산 함량은 일나트륨 글루타메이트로서 16 내지 36%(중량/중량)이다.

(c) 전체 고체 함량중에 전체 질소 함량은 8 내지 13%(중량/중량)이다.

(d) 전체 고체 함량중에 전체 아미노산 함량은 40 내지 72%(중량/중량)이다.

(e) 전체 고체 함량중에 염화나트륨 함량은 14%(중량/중량)이하이다.

(f) 전체 고체 함량중에 환원당 함량은 5%(중량/중량)이하이다.

(g) 모노클로로하이드록시프로판올 및 디클로로프로판올은 존재하지 않는다.

본 발명은 이후부터 상세하게 기술된다.

본 발명에 사용되는 미생물은 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물이고 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이 국균, 효모 및 바실러스, 슈도모나스 또는 에스케리치아 속에 속하는 미생물을 포함한다. 이들중에서, 국균이 바람직하다. 국균으로서, 아스퍼질러스 오리재 및 아스퍼질러스 데르시로 분류되는 황국균이 바람직하다. 추가로 효모로서, 부를레라 데르시(Bullera derxii)가 바람직하다.

본 발명에 사용되는 배지는 미생물이 증식할 수 있는 배지이고 일반적으로 탄소원, 질소원 및 보조인자를 함유한다.

배지내에 탄소원이 미생물에 의해 신속하게 자화되는 탄소원, 예를 들어, 글루코스, 말토스, 프럭토스 및 슈크로스인 경우, 이화대사산물 억제를 해제할 목적으로 농도가 배양동안에 낮게 유지될 수 있도록 공급되어야만 한다. 특히, 탄소원은 배양액중에 탄소원 농도가 0.5%(중량/용량) 이하, 바람직하게 0.2% 이하(중량/용량)이하에서 유지되도록 연속적으로 공급되어야만 한다. 탄소원이 간헐적으로 공급되는 경우 배양액중에 탄소원의 농도는 1.2%(중량/용량) 이하, 바람직하게 0.5%(중량/용량)이하로 유지되도록 공급되어야만 한다. 또한, 글루코스는 전분의 가수분해물 형태일 수 있고 슈크로스는 당밀 형태일 수 있다.

한편, 미생물에 의해 비교적 느리게 자화되는 탄소원, 예를 들어, 락토스, 만니톨 및 소르보스등에 대해서는 이것이 배양 초기 단계에서 통상적인 양으로 공급되는 경우에도 이화대사산물 억제가 일어나지 않는다. 따라서, 상기 탄소원은 배양 초기 단계에서 0.5 내지 3.0%(중량/용량), 바람직하게 1.0 내지 2.0%(중량/용량)의 농도로 배지에 첨가된다.

이들 탄소원은 단독으로 또는 배합되어 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 미생물 배양동안에 이화대사산물 억제가 해제되어 글루타미나제 생산을 개선시킬 수 있고 고수율로 글루타미나제를 생산할 수 있다.

배지내 질소원의 바람직한 예는 무기 질소원(예: 질산나트륨, 아질산나트륨, 염화암모늄 및 황산암모늄), 유기 질소원(예: 카사미노산, 폴리펩톤, 박토-펩톤, 대두 단백질, 분리된 대두 단백질, 탈지 대두 및 카제인) 및 아미노산(예: 나트륨 L-글루타메이트, 나트륨 L-아스파르테이트, L-프롤린, L-알라닌, 글라이신 및 L-글루타민)을 포함한다. 특히, 상기 질소원은 배양의 중간 단계에서 공급됨으로써 글루타미나제 생산이 추가로 증가될 수 있다. 첨가될 질소원의 양은 0.1 내지 2.0%(중량/용량)이고, 바람직하게 0.5 내지 1.0%(중량/용량)이다.

이들 질소원은 단독으로 또는 배합되어 사용될 수 있다. 암모늄 또는 글루타민이 질소원으로서 사용되는 경우 글루타미나제 생산이 억제되지만 생산 억제는 동일한 것을 소분획으로 첨가하여 회피될 수 있다.

추가로, 보조인자의 예는 황산마그네슘 7-수화물, 인산수소이나트륨, 인산수소일나트륨, 인산수소일칼륨, 인산수소이칼륨, 고기 추출물, 염화칼륨 및 옥수수 침지액을 포함한다. 이들은 선택적으로 사용된다.

이들의 첨가양에 대하여, 예를 들어, 황산마그네슘은 약 0.5%(중량/용량)이고 인산수소일칼륨은 대략 0.5%(중량/용량)인 것이 가장 적당하다.

추가로, 초기 단계에서 배양조건은 통상적으로 호기적 배양 조건일 수 있다. pH는 4.5 내지 9.0, 바람직하게 5.5 내지 8.5이다. 온도는 15 내지 40℃, 바람직하게 25 내지 35℃이다. 추가로, 교반 속도 및 통기량은 호기적 배양 환경이 유지될 수 있는한 특별히 제한되지 않는다.

미생물이 본 발명의 방법에 따라 배양되는 경우, 글루타미나제 활성은 통상적인 방법과 비교하여 대략 2 내지 32배 개선될 수 있고 글루타미나제는 고수율로 생산될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 "증가된 글루타미나제 활성"이란 표현은 배양동안에 탄소원을 공급하지 않고 초기 농도 1.5%(중량/용량)의 글루코스를 함유하는 배지에서 배양을 통해 수득한 활성과 비교하여 활성이 2배 이상, 바람직하게 5배 이상 증가된다는 것을 의미한다.

추가로, 조미료가 국균을 사용하여 생산되는 경우, 본 발명의 방법은 배양액에서 생산되는 글루타미나제의 양을 개선시켜 우수한 효율로 고품질 상품의 생산을 가능하게 한다.

높은 글루타미나제 활성을 갖는 이와같이-수득된 미생물 배양물은 단백질 분해 효소의 존재하에 단백질과 반응시키는데 사용되어 강한 맛을 나타내는 가수분해물을 수득할 수 있다.

사용되는 단백질 분해 효소는 시판되는 효소 제제일 수 있고 세포벽 분해 효소와 같은 또 다른 효소를 포함할 수 있다. 추가로, 정제된 효소가 또한 사용될 수 있다. 특히, 국균이 글루타미나제 활성을 증가시키기 위한 미생물로서 사용되는 경우 국균 그 자체가 단백질 분해 효소를 생산한다. 따라서, 배양물은 글루타미나제 활성과 프로테아제 활성 모두를 갖고 외부에서 단백질 분해 효소를 투입할 필요가 없다.

높은 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물과 반응할 단백질의 예는 대두, 밀, 밀 글루텐, 옥수수 곡류, 밀크 카제인 및 피쉬 밀(fish meal)을 포함한다. 추가로, 탈지된 대두유, 팽창 또는 가용화와 같은 공정을 거치는 다양한 단백질 또는 이들 다양한 단백질 출발 물질로부터 분리된 단백질이 또한 유용하다. 특히, 대량의 글루타민 함유 단백질(예: 밀 글루텐)은 높은 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물과 반응시키는 것이 적당하다.

단백질이, 높은 글타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물과 반응되는 조건은 하기와 같이 기술된다. 예를 들어, 0.2 내지 50%, 바람직하게 1 내지 20% 농도의 출발물질을 프로테아제의 존재하에 높은 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물과 혼합하고 혼합물을 4시간 내지 10일동안, 바람직하게 10시간 내지 5일동안 5 내지 60℃, 바람직하게 30 내지 50℃에서 반응시키는 것이 바람직하다.

그러나, 단백질 출발 물질은 반응동안에 가수분해되어 글루코스와 같은 환원 당을 형성하는 전분과 같은 탄수화물을 포함한다. 환원당이 가수분해된 단백질에 잔류하는 경우 갈변을 일으킨다. 따라서, 환원당의 양을 반응 산물의 전체 고체 함량을 기준으로 5%(중량/중량) 이하, 바람직하게 3%(중량/중량) 이하, 보다 바람직하게 1.5%(중량/중량) 이하의 양으로 조정하는 것이 바람직하다. 특히, 반응 산물중에 환원당의 양은, 통기와 교반을 수행하고 환원당을 자화시키면서 처음에 반응을 15 내지 39℃, 바람직하게 15 내지 38℃의 온도 범위에서 수행함에 이어서 통기를 종료한 즉시 40 내지 60℃, 바람직하게 41 내지 50℃의 온도범위에서 반응을 수행하고 이후에 반응을 종료시킴으로써 감소될 수 있다. 반응 온도는 반응을 개시한후 전체 반응 시간의 10 내지 60%가 경과한 경우에 전환된다.

단백질의 가수분해는 염화나트륨의 부재하에 수행되거나 3%(중량/용량) 이하의 낮은 농도로 염화나트륨의 존재하에 수행한다. 프로테아제 및 글루타미나제의 활성은 때로는 염화나트륨에 의해 억제되기 때문에 보다 낮은 농도의 염화나트륨이 반응 속도를 개선시키는데 바람직하다. 그러나, 소량의 에탄올 또는 염화나트륨은 소독을 목적으로 반응동안에 첨가될 수 있다.

반응이 종결된후에 미반응된 출발 단백질 및 세포와 같은 불용성 입자가 원심분리 또는 여과와 같은 통상적인 분리 방법에 의해 제거될 수 있다. 추가로, 요구되는 바와 같이, 고체-액체 분리후에 액체 부위는 진공 농축 또는 역삼투압을 통해 농축될 수 있다. 특히, pH가 알카리 영역으로 조정되는 경우 및 진공에서 농축되는 경우, 반응 용액내 암모니아 함량은 감소될 수 있다. 발명자의 식견에 따라, 높은 글루타민 함량을 갖는 밀 글루텐이 출발물질로서 사용되는 경우, 가수분해된 단백질내 암모니아 함량은 또 다른 출발 물질로부터 유래된 산물에서 보다 높아 최종 산물을 갈변시킨다.

따라서, 가수분해된 단백질내 암모니아 함량을 감소시키는 것이 바람직하다. 암모니아 함량은 전체 고체 함량에서 암모니아-형 질소 함량/전체 질소 함량이 0.35%(중량/중량) 이하, 바람직하게는 0.15%(중량/중량) 이하가 되도록 조정될 수 있다.

추가로, 농축물은 동결-건조, 진공-건조 또는 분무 건조와 같은 건조 처리를 통해 분쇄되거나 과립화될 수 있다. 따라서, 외부에서 일나트륨 글루타메이트 첨가없이 높은 함량의 일나트륨 글루타메이트를 갖고 강한 정미성을 갖는 가수분해된 단백질을 수득할 수 있다.

이와같이-수득된 가수분해된 단백질은 염산 가수분해물 같지 않게 모노클로로하이드록시프로판올 및 디클로로프로판올이 없다. 이것은, 엑스트레루트(extrelut) 칼럼으로 추출되고 페닐보르산과의 유도체가 가스 크로마토그래피-질량 스펙트럼(GC-MS)에 의해 검출되는 방법에 의해 검출 한계 이하의 테이터로부터 확인된다[문헌참조: Ushijima, et al., Shohin Eiseigaku Zasshi, 36.3, 360-364, 1995]. 부수적으로, 모노클로로하이드록시프로판올의 예는 3-클로로-1,2-프로판디올 및 2-클로로-1,3-프로판디올을 포함하고 디클로로프로판올의 예는 1,3-디클로로-2-프로판올 및 2,3-디클로로-1-프로판올을 포함한다.

상기 방법에 따른 이들 물질의 검출 한계는 액체 샘플에서 0.005ppm이고 분말 샘플에서는 0.05ppm이다.

본 발명의 가수분해된 단백질은 다양한 식품(밀가루 제품, 인스턴트 식품, 농산, 축산 및 수산 가공품, 유제품, 유지류, 냉동식품, 기초 및 복합 조미료, 과자류, 기호음료수 및 기타 식품)에 첨가되어 맛과 감미를 증진시키고 농후감 및 신도를 부여하고 자극성이 적은 맛을 부여하고 풍미를 증가시키고 짠맛 및 신맛을 감소시키고 쓴맛을 차폐시킨다. 특히, 두유 존재하에 (1) 감미, 자극이 적은 맛 및 농후감을 부여하고 (2) 고기 제품의 쓴맛을 차폐시키고 고기 풍미를 증진시키고, (3) 돼지고기, 닭고기, 소고기, 수산식품 및 식물성 추출물과 배합된 풍미를 증진시키고 (4) 양념의 존재하에 양념 맛 또는 매운 양념 맛을 증진시키는데 매우 효과적이다.

본 발명의 가수분해된 단백질은 약한 향, 담색 및 높은 함량의 일나트륨 글루타메이트를 갖기때문에 상기 언급된 효과를 증가시키고 식품 고유의 맛을 변화시키거나 이의 색을 짙게 하지 않으면서 맛을 증진시킬 수 있다. 추가로, 느낌이 좋은 맛과 함축적인 맛(Kokumi)(농후감, 풍만감 및 지속적인 맛)이 강한 식품은 핵산, 효모 추출물 또는 가수분해된 단백질과 같은 느낌이 좋은 맛과 배합하여 사용함으로써 제공될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되지 않는다.

아스퍼질러스 오리재(ATCC 11494)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, U.S,A.)에 의해 발간된 카탈로그에 기술되어 있고 아스퍼질러스 소재(JCM 2250) 및 불레라 데르시는 각각 제팬 콜렉션 오브 마이크로오거니즘 및 더 인스티튜트 오브 피지컬 앤드 케미컬 리서치(RIKEN)(2-1, Hirosawa, Wako-shi, Saitama-ken)에 의해 발간된 카탈로그에 기술되어 있다. 이들은 요구하는 즉시 공급받을 수 있다.

실시예에서 글루타미나제 활성은 하기 방법으로 측정된다.

글루타미나제 활성은 하이드록실아민의 존재하에 효소 반응을 통해 형성된 γ-글루타밀하이드록삼산의 양을 결정하기 위한 변형된 방법[문헌참조: Hartman, S. C,: J. Biol. Chem., 243, 853-863(1968)]으로 측정된다. 구체적으로, 200㎕의 배양액을 시약 A(0.4M 트리스-아미노메탄 및 0.2M 하이드록실아민 하이드로클로라이드(pH 7.l0)를 함유함) 및 시약 B(100mM L-글루타메이트 및 20mM 환원 글루타치온(pH 7.0)을 함유함)를 동일한 양으로 함유하는 혼합된 용액 1ml에 가하고 혼합물을 1시간동안 37℃에서 항온처리한다. 이어서 반응을 종료하고 발색시키기 위해 동일한 양의 (1) 3N 염산, (2) 12% 트리클로로아세트산 및 (3) 5%의 염화철 6-수화물을 함유하는 혼합된 용액 1ml을 여기에 첨가한다. 혼합물을 교반시키고 상기 반응 용액내 상등액의 흡광도를 525nm에서 측정하여 효소 활성을 검출한다. 상기-언급된 조건하에서 분당 γ-글루타밀하이드록삼산 1㎍을 형성하는 효소 활성은 1 유니트(U)로서 정의한다.

실시예 1

아스퍼질러스 오리재를 사용하는 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물의 생산

1.5%의 락토스 또는 글루코스, 1.5%의 폴리펩톤, 0.5%의 황산 마그네슘 7-수화물, 0.25%의 염화칼륨 및 0.25%의 인산수소일나트륨을 함유하는 2ℓ의 배지를 총 용적이 5ℓ인 소형 발효기(jar-fermenter)에 첨가하고 오토클레이브한다. 이어서, 아스퍼질러스 오리재(ATCC 11494)를 통상적인 방식으로 접종한다. 이때에, 국균을 임의의 방식으로 접종하고 이것은 포자 또는 균사체일 수 있다. 이어서, 48시간동안 1/2 vvm의 통기 속도 및 600rpm의 교반속도로 30℃의 온도에서 배양한다.

배양을 종료한 후에, 배양물의 글루타미나제 활성을 측정한다. 결과로서, 배양액에 생산된 글루타미나제의 양은 신속하게 자화되는 글루코스가 배지내에서 탄소원인 경우 0.057(u/ml)인 반면에 느리게 자화되는 락토스가 탄소원인 경우 0.185(u/ml)이다. 따라서, 락토스를 사용하여 생산된 글루타미나제의 양은 글루코스에서 생산되는 글루타미나제의 양의 3배 이상이다. 즉, 자화율이 느린 탄소원인 락토스를 사용함으로써 이화대사산물 억제가 해제되고 글루타미나제의 양을 개선시킨다.

추가로, 락토스가 탄소원으로서 사용되는 경우, 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물를 배양 중간 단계에서 첨가하고 배양을 계속한다. 결과로서, 생산되는 글루타미나제의 양은 0.401(u/ml)로 증가한다.

결과로부터 명백해진 바와 같이, 생산되는 글루타미나제의 양은 탄소원으로서 락토스를 사용하고 배양 중간 단계에서 질소원으로서 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물을 첨가하면서 배양을 계속함으로써 대략적으로 7배 증가될 수 있다.

실시예 2

1.5%의 만니톨 또는 슈크로스, 1.5%의 폴리펩톤, 0.5%의 황산 마그네슘 7-수화물, 0.25%의 염화칼륨 및 0.25%의 인산수소일나트륨을 함유하는 2ℓ의 배지(조절되지 않은 pH)를 총 용적이 5ℓ인 소형 발효기에 첨가하고 오토클레이브한다. 이어서, 아스퍼질러스 오리재(ATCC 11494)를 통상적인 방식으로 접종한다. 이때에, 국균을 임의의 방식으로 접종하고 이것은 포자 또는 균사체일 수 있다. 이어서, 48시간동안 1/2 vvm의 통기 속도 및 600rpm의 교반속도로 30℃의 온도에서 배양한다.

배양을 종료한 후에, 배양물의 글루타미나제 활성을 측정한다. 결과로서, 배양액에 생산된 글루타미나제의 양은 신속하게 자화되는 슈크로스가 배지내에서 탄소원인 경우 0.011(u/ml)인 반면에 느리게 자화되는 만니톨이 탄소원인 경우 0.148(u/ml)이다. 따라서, 만니톨을 사용하여 생산된 글루타미나제의 양은 슈크로스를 사용하여 생산되는 글루타미나제의 양의 13배 이상이다. 즉, 자화율이 느린 탄소원인 만니톨을 사용함으로써 이화대사산물 억제가 해제되고 글루타미나제의 양은 개선된다.

추가로, 만니톨을 탄소원으로서 사용하는 경우, 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물를 배양 중간 단계에서 첨가하고 배양을 계속한다. 결과로서, 생산되는 글루타미나제의 양은 0.331(u/ml)로 증가한다.

결과로부터 명백해진 바와 같이, 생산되는 글루타미나제의 양은 탄소원으로서 만니톨을 사용하고 배양 중간 단계에서 질소원으로서 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물을 첨가하면서 배양을 계속함으로써 대략적으로 30배 증가될 수 있다.

실시예 3

아스퍼질러스 소재를 사용하는 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물의 생산

배지 A(1.5%의 글루코스, 1.5%의 폴리펩톤, 0.5%의 황산 마그네슘 70수화물, 0.25%의 염화칼륨 및 0.25%의 인산수소이나트륨(조절되지 않은 pH)을 함유함) 또는 배지 B(1.5%의 폴리펩톤, 0.5%의 황산마그네슘 7-수화물, 0.25%의 염화칼륨 및 0.25%의 인산수소일나트륨(조절되지 않은 pH)을 함유함) 2ℓ를 총 용적이 5ℓ인 소형 발효기에 첨가하고 오토클레이브한다. 이어서, 아스퍼질러스 소재(JCM 2250)을 포자 또는 균사체의 형태로 접종할 수 있다. 이어서, 34시간동안 600rpm의 교반속도와 1/2 vvm의 통기율로 30℃의 온도에서 배양한다.

발효가 배지 B에서 시작되는 소형 발효기에 대해 총 2개의 소형 발효기가, 즉 이중 하나는 글루코스가 0.2% 이하의 농도로 유지되도록 연속적으로 첨가되고 또 하나는 글루코스가 0.2% 이하의 농도로 유지되도록 연속적으로 첨가되고 질소원으로서 1.0% 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물이 배양을 시작한지 17시간인 배양의 중간 시기에 첨가되도록 배열된다.

배양을 종료한 후에, 배양물의 글루타미나제 활성을 측정한다. 결과로서, 배지 A의 배양액에 생산되는 글루타미나제의 양은 0.002(u/ml)이고, 글루코스를 0.2% 이하의 농도로 연속적으로 첨가하는 배지 B의 배양액에서 생산되는 글루타미나제의 양은 0.022(u.ml)이고 0.2% 이하의 농도로 글루코스를 연속적으로 첨가하고 배양한지 17시간에 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물를 첨가하는 배지 B의 배양액에서 생산되는 글루타미나제의 양은 0.064(u/ml)이다.

결과로부터 명백해지는 바와 같이, 글루코스를 매우 낮은 농도로 연속적으로 첨가하여 생산되는 글루타미나제의 양은 이화대사산물 억제를 해제하여 발효 시작부터 높은 농도로 신속하게 자화되는 글루코스를 첨가하여 배양시켜 생산되는 글루타미나제의 양과 비교하여 대략 11배로 개선된다. 추가로, 국균에서 생산되는 글루타미나제의 양은 배양의 중간 단계에서 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물을 첨가하는 배양을 통해 32배로 개선된다.

실시예 4

효모를 사용하는 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물의 생산 방법

배지 A(1.5%의 글루코스, 0.5%의 박토-펩톤, 0.3%의 맥아 추출물 및 0.3%의 효모 추출물(조절되지 않은 pH)을 함유함) 또는 배지 B(0.5%의 박토-펩톤, 0.3%의 맥아 추출물, 0.3%의 효모 추출물(조절되지 않은 pH)을 함유함) 2ℓ를 총 용적이 5ℓ인 소형 발효기에 첨가하고 오토클레이브한다. 이어서, 블레라 데르시(JCM 5280)를 통상적인 방식으로 접종한다. 이어서, 55시간동안 800rpm의 교반속도와 1/2 vvm의 통기율로 25℃의 온도에서 배양한다.

발효가 배지 B에서 시작되는 소형 발효기에 대해 총 2개의 소형 발효기가, 즉 이중 하나는 글루코스가 0.05% 이하의 농도로 유지되도록 연속적으로 첨가되고 또 하나는 글루코스가 0.05% 이하의 농도로 유지되도록 연속적으로 첨가되고 질소원으로서 1.0% 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물이 배양을 시작한지 24시간인 배양의 중간 시기에 첨가되도록 배열된다.

배양을 종료한 후에, 배양물의 글루타미나제 활성을 측정한다. 결과로서, 배지 A의 배양액에 생산되는 글루타미나제의 양은 0.121(u/ml)이고, 글루코스를 연속적으로 첨가하는 배지 B의 배양액에서 생산되는 글루타미나제의 양은 0.252(u/ml)이고 글루코스를 연속적으로 첨가하고 배양한지 24시간에 1.0%의 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물를 첨가하는 배지 B의 배양액에서 생산되는 글루타미나제의 양은 0.486(u/ml)이다.

결과로부터 명백해지는 바와 같이, 글루코스를 매우 낮은 농도로 연속적으로 첨가하여 생산되는 글루타미나제의 양은 이화대사산물 억제를 해제하여 발효 시작부터 높은 농도로 신속하게 자화되는 글루코스를 첨가하여 배양시켜 생산되는 글루타미나제의 양과 비교하여 대략 2.1배로 개선된다. 추가로, 글루타미나제의 양은 배양의 중간 단계에서 나트륨 L-글루타메이트 1-수화물을 공급함에 의해 4배로 개선된다.

실시예 5

밀 글루텐으로부터 글루타민산의 유리

하기 과정은 멸군적으로 수행된다. 오토클레이브된 5% 밀 글루텐(상표명: "Ajipuron G2"(제조회사: 아지노모토 가부시키가이샤))의 20ml의 용액을 실시예 2에 기술된 바와 같이 탄소원으로서 만니톨을 사용하여 수득된 아스퍼질러스 오리재(ATCC 11494)의 배양물 10ml과 혼합한다. 혼합물을 10시간, 24시간, 4일 내지 10일동안 40℃에서 반응시킨다.

비교를 위해, 동일한 과정을 실시예 2에 기술된 바와 같이 탄소원으로서 슈크로스를 사용함에 의해 수득된 아스퍼질러스 오리재의 10ml의 배양물을 사용하여 수행한다.

이들 반응 산물의 상등액에 대해, 총 질소 함량(T-N) 및 글루타민산의 함량을 측정한다. 글루타민산 함량을 효소적 방법으로 측정하고 총 질소 함량은 킬달(Kieldahl) 방법에 의해 측정한다. 글루타민산 함량 및 총 질소 함량으로부터 수득된 분석값 및 글루타민산의 유리율(글루타민산 함량/총 질소 함량)을 표 1에 나타낸다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 탄소원으로 만니톨을 사용하는 경우 아스퍼질러스 오리재의 배양물로 수득된 가수분해된 밀 글루텐에서 글루타민산의 유리율은 탄소원으로서 슈크로스를 사용하는 경우 보다 명백하게 높다. 추가로 가수분해물은 강한 맛을 나타낸다.

밀 글루텐의 가수분해물 액체내에서의 글루타민산의 유리율에 대한 비교

배지내 탄소원	반응 시간	글루타민산 함량(g/dl)	총 질소 함량(g/dl)	글루타민산의 유리율
슈크로스	10시간	0.10	0.46	0.22
	24시간	0.14	0.46	0.32
	4일	0.23	0.47	0.48
	10일	0.42	0.47	0.89
만니톨	10시간	0.54	0.46	1.18
	24시간	0.65	0.46	1.41
	4일	0.80	0.47	1.70
	10일	0.87	0.47	1.85

실시예 6

가수분해된 밀 글루텐의 생산

하기 배양 및 가수분해를 멸균적으로 수행한다. 1.5%의 분리된 대두 단백질(상표명: "Ajipuron E3"(제조회사: 아지노모토 가부시키가이샤로부터 공급됨)), 0.5% 황산 마그네슘 7-수화물, 0.25%의 염화칼륨 및 0.25%의 인산수소나트륨을 함유하는 2ℓ의 배지(조절되지 않은 pH)를 총 용적이 5ℓ인 소형 발효기에 첨가하고 오토클레이브한다. 아스퍼질러스 오리재(ATCC 11494)를 통상적인 방식으로 접종한다. 600rpm의 교반 속도와 1/2vvm의 통기율을 사용하여 30℃의 온도에서 배양한다. 배양동안에 첨가되는 글루코스 총 양이 1.5%(중량/용량)이고 배양액내 글루코스 농도가 0.5%를 초과하도록 4개의 분할된 분획으로 간헐적으로 첨가한다 추가로 배양 중간 단계에서 0.5%의 나트륨 L-글루타메이트를 첨가함으로써 배양을 계속하고 배양을 48시간내에 완성한다.

1ℓ의 상기 배양물 및 2ℓ의 5%의 밀 글루텐(상표명: "Apipuron G2" (제조회사: 아지노모토 가부시키가이샤)) 분산액을 오토클레이브하고 혼합한다. 통기 및 교반을 수행하면서 혼합물을 작은 크기의 소형 발효기에서 8시간동안 35℃에서 반응시킨다. 이어서, 통기를 정지하고 가수분해 반응을 16시간동안 45℃에서 수행한다.

상기 가수분해물을 부크너 깔때기를 사용하는 고체-액체 분리법에 적용한다. 수득한 산물을 여과물의 암모니아와 동몰량의 수산화나트륨과 함께 농축시키고 증발기로 암모니아를 제거한다. 염산을 첨가하면서 농축물을 pH 7.0으로 조절하고 20분동안 80℃에서 열-살균한다. 산물을 냉각시키고 침전물을 부크너 깔때기로 걸러내고 디스크형 분무 건조기를 사용하여 분무-건조시켜 분무 건조된 산물을 수득한다.

분무 건조된 산물의 총 질소 함량, 암모니아-형 질소 함량, 염화나트륨 함량, 유리된 아미노산 함량 및 환원당 함량을 측정한다. 염화나트륨 함량을 염소 함량으로부터 계산하고 유리된 아미노산 함량을 아미노산 분석으로 측정한다. 환원당 함량을 글루코스 함량에 대해 스모기-넬슨(Somogyi-Nelson) 방법으로 측정한다. 이들 분석 값은 표 2 및 표 3에 나타낸다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 29.9%(중량/중량)의 글루타민산 (글루타메이트로서)을 함유하고 총 질소 함량이 9.1%(중량/중량)이고 총 아미노산 함량이 55.4%인 강한 정미력을 갖는 가수분해된 단백질은 높은 글루타미나제 활성을 갖는 아스퍼질러스 오리재의 배양물을 사용하여 밀 글루텐을 가수분해시켜 분무-건조된 산물로서 생산될 수 있다.

분무 건조된 산물중에 유리된 아미노산 함량 및 유리율

아미노산	유리된 양(g/100g)	유리율(g/gㆍN)
Asp	2.46	0.27
Thr	1.72	0.19
Ser	2.74	0.30
Glu	23.56	2.56
Pro	5.14	0.56
Gly	2.05	0.23
Ala	2.01	0.22
Cys	0.39	0.04
Val	2.62	0.29
Met	0.87	0.10
Ile	2.38	0.26
Leu	4.39	0.48
Tyr	0.62	0.07
Phe	2.02	0.22
Lys	1.26	0.14
His	1.03	0.11
Arg	0.17	0.02
총계	55.44	6.09

분무-건조된 산물의 분석값

분석 항목	함량(g/100g)	질소를 기준으로한 함량(g/gㆍN)
글루타민산^*	29.9	2.59
전체 질소	9.12	1.00
전체 유리된 아미노산	55.4	6.09
염화나트륨	4.37	0.48
암모니아형 질소	0.48	0.053
환원당	1.33	0.149
^*일나트륨 글루타메이트

본 발명은 증가된 글루타미나제 활성을 갖는 미생물 배양물을 제공한다. 미생물 배양물을 사용하여 우수한 효율로서 가수분해된 단백질을 생산할 수 있다. 수득한 가수분해된 단백질은 높은 글루타민산 함량을 갖기 때문에 이것은 강한 정미력을 나타내고 조미료로서 매우 유용하다.

Claims

글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물의 배양동안에 글루타미나제의 이화대사산물 억제가 해제되고, 경우에 따라 배양의 중간 단계에서 질소원이 공급됨을 특징으로하는, 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 배양동안에 연속적으로 또는 간헐적으로 탄소원을 공급함으로써 이화대사산물 억제가 해제되는 방법.
제1항에 있어서, 글루타미나제를 생산할 수 있는 미생물이 국균 또는 효모인 방법.
제1항에 따른 방법에 의해 생산되는 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물.
단백질 분해 효소의 존재 및 염화나트륨의 부재 또는 3%(중량/용량) 이하의 농도로 염화나트륨의 존재하에 제4항에 따른 글루타미나제 활성이 증가된 미생물 배양물과 단백질을 반응시킴을 특징으로하는 가수분해된 단백질의 제조 방법.
제5항에 있어서, 단백질과 미생물 배양물을 반응시키는 경우, 먼저 통기 및 교반하에 15 내지 39℃의 온도 범위에서 반응을 수행하고 이어서 통기 없이 40내지 60℃의 온도 범위에서 반응을 수행함을 특징으로하는, 가수분해된 단백질의 제조 방법.
제5항 또는 제6항에 따른 방법에 의해 제조된 가수분해된 단백질.
(a) 밀 글루텐이 출발 물질로서 사용되고;

(b) 총 고체 함량중에 글루타민산 함량이 일나트륨 글루타메이트로서 16 내지 36%(중량/중량)이고;

(c) 총 고체 함량중에 총 질소 함량이 8 내지 13%(중량/중량)이고;

(d) 총 고체 함량중에 총 아미노산 함량이 40 내지 72%(중량/중량)이고;

(e) 총 고체 함량중에 염화나트륨 함량이 14%(중량/중량) 이하이고;

(f) 총 고체 함량중에 환원당 함량이 5%(중량/중량) 이하이고;

(g) 모노클로로하이드록시프로판올 및 디클로로프로판올이 부재하는 특징을 갖는 가수분해된 단백질.