WO1999054438A1 - Culture microbienne avec activite de la glutaminase amelioree et son utilisation - Google Patents

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WO1999054438A1
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microorganism
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Ari Yuasa
Hideki Okamura
Jiro Kataoka
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/20—Synthetic spices, flavouring agents or condiments
    • A23L27/21—Synthetic spices, flavouring agents or condiments containing amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a microorganism culture having enhanced glutaminase activity, and more particularly, to releasing catabolite repression during culture of a microorganism capable of producing glutaminase and, if necessary, in the middle of culture.
  • the present invention relates to a method for preparing a microorganism culture in which glutaminase activity is enhanced by supplementing a nitrogen source.
  • the present invention also relates to a microorganism culture having enhanced glutaminase activity, a method for producing a protein hydrolyzate using the microorganism culture, and a protein hydrolyzate obtained by the production method. Since the protein hydrolyzate has a high glutamate content, it has a strong taste and is highly useful as a seasoning. Background art
  • Glutaminase is an enzyme widely distributed in the living world. It acts on L-glutamine, hydrolyzes amide groups, and decomposes into L-glutamic acid and ammonia.
  • L-Glutamate obtained by neutralizing L-glutamate with sodium hydroxide or sodium carbonate, is the basic substance of any umami taste. The largest use of this substance is in seasonings, an additive that is essential in the manufacture of processed foods as well as for household use.
  • degradable natural seasonings include acid-degradable and enzyme-degradable forms.
  • Acid-degradable seasonings include Hydrolyzed Vegetable Protein, which is obtained from plant proteins such as soybean and wheat, and Hydrolyzed Animal Protein, which is obtained from animal proteins such as gelatin and milk zein. Certain amino acid compositions vary greatly from raw material to raw material and affect taste, sweetness, etc.
  • the decomposition solution obtained by the hydrochloric acid decomposition method of defatted soybean is 70% or more, and glutamate release rate (glutamate Z total nitrogen) is as high as 1.2, which is extremely excellent in umami.
  • chlorohydrin such as monochloropropanol and dichloropropanol, which are harmful to the human body, is generated by the acid decomposition method, and this is becoming a problem as a food material.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, released catabolite repetition during culture of microorganisms and supplied a nitrogen source at the middle stage of culture as necessary, thereby obtaining glutamase.
  • the inventors have found that the production has been dramatically improved, and have completed the present invention.
  • the first invention has an enhanced glutaminase activity characterized by releasing catabolic repression during culturing of a microorganism capable of producing glutaminase and, if necessary, supplying a nitrogen source during the middle of culturing.
  • the second invention which is a method for preparing a microorganism culture, is a method according to the first invention, wherein the catabolic triplet is released by continuously or intermittently supplying a carbon source during the culture.
  • the third invention is the method according to the first invention, wherein the microorganism capable of producing glutamine is koji mold or yeast.
  • a fourth invention is a microorganism culture having enhanced glutaminase activity prepared by the method of the first invention.
  • the microorganism culture with enhanced glutaminase activity according to the fourth aspect is allowed to act on a protein under conditions of salt-free or salt concentration of 3% (weight Z volume%) or less.
  • a microorganism culture when allowed to act on a protein, the reaction is carried out in a temperature range of 15 to 39 ° C. while aerating and stirring at first, and then the aeration is stopped to obtain 40 to 60 ° C.
  • a seventh invention is a protein hydrolyzate produced by the method of the fifth or sixth invention.
  • An eighth invention is a protein hydrolyzate having the following characteristics.
  • the content of glutamate in the total solid content is from 16 to 16% as sodium glutamate. 3 6 (weight Z weight)%.
  • the total amino acid content in the total solid content is 40 to 72% (weight Z weight).
  • the salt content in the total solid content is not more than 14% (weight / weight).
  • the reducing sugar content in the total solid content is 5% (weight / weight) or less.
  • the microorganism used in the present invention is a microorganism having an ability to produce glutamine, and examples thereof include Bacillus microorganisms, Pseudomonas microorganisms, and Escherichia microorganisms in addition to the koji molds and yeasts described above. . Among them, Aspergillus oryzae is preferred. As the koji mold, yellow koji molds represented by Aspergillus oryzae, Aspergillus socia, and the like are preferable. In addition, as yeast, Brera delxii or the like is used.
  • the medium used in the present invention may be any medium as long as the microorganism can grow, and generally contains a carbon source, a nitrogen source, a cofactor and the like.
  • the carbon source in the culture medium in the case of a carbon source with a high rate of assimilation by microorganisms such as glucose, maltose, fructos, sucrose, etc., culture is performed in order to release the catabolite triplet by these. It is necessary to supply the inside to keep the concentration low. Specifically, when the carbon source concentration in the culture solution is continuously supplied, the carbon source concentration is 0.5% (weight / volume) or less, preferably 0.2% (weight / volume). In the following, when the treatment is carried out intermittently, it should be supplied so as not to exceed 1.2% (weight Z capacity), preferably to 0.5% (weight Z capacity).
  • Glucose may be in the form of starch hydrolyzate, and sucrose may be in the form of molasses.
  • carbon sources whose assimilation rate by microorganisms such as lactose, mannitol, and sorbose is relatively slow, even when supplied in a normal amount from the initial stage of cultivation, catabolic triple expression does not occur. Therefore, they are added to the medium at the beginning of the culture at 0.5-3.0% (weight Z volume), preferably at 1.0-2.0% (weight Z volume).
  • the above carbon sources may be used alone or in combination of two or more. In this way, by releasing the catabolic triplet during the culture of the microorganism, the production of glutaminase can be improved, and the glutaminase can be produced in high yield.
  • Suitable examples of the nitrogen source in the medium include inorganic nitrate sources such as sodium nitrate, sodium nitrite, ammonium chloride, ammonium sulfate, casamino acids, polypeptone, park topton, soy protein, isolated soybeans.
  • Organic nitrogen sources such as proteins, defatted soybeans, and casein; sodium L-glutamate, L-sodium aspartate, L-butaline, L-alanine, glycine, and L-glutamine Acids.
  • glutamase production can be further increased.
  • the amount of nitrogen source added is between 0.1 and 2.0% (weight / volume), preferably between 0.5 and 1.0% (weight Z volume).
  • the above nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more.
  • ammonium and glutamin are used as the nitrogen source, the production of glutamase may be suppressed, but the production can be avoided by adding the glutamin in small amounts.
  • magnesium sulfate heptahydrate sodium hydrogen phosphate, sodium hydrogen phosphate, potassium potassium phosphate, potassium potassium phosphate, meat extract, chloride
  • potassium, corn steep and prika, etc. are appropriately selected and used.
  • magnesium sulfate it is most preferable to use about 0.5% (weight / volume) of magnesium sulfate and about 0.5% (weight / volume) of monopotassium hydrogen phosphate.
  • the initial culture conditions may be ordinary aerobic culture conditions, pH 4.5 to 9.0, preferably pH 5.5 to 8.5, temperature 15 to 40 ° C, preferably The temperature is suitably 25 to 35 ° C.
  • the number of agitation and the amount of aeration may be any conditions as long as the culture environment can be maintained aerobically.
  • Glutaminase activity is obtained by culturing a microorganism according to the method of the present invention.
  • Glutaminase can be produced in high yield, with about 2 to 32 times higher than normal. Therefore, the expression "enhanced glutaminase activity" in the present invention means that the activity is not increased during the cultivation in a medium containing 1.5% (by weight Z volume) of glucose at the initial concentration without supplying a carbon source during culturing. It means that the activity is enhanced by about 2 times or more, preferably about 5 times or more, obtained by culturing.
  • the amount of glutaminase in a culture solution is improved by applying the method of the present invention, and a high-quality product is efficiently produced in large quantities. can do.
  • the thus obtained microbial culture having a high glutaminase activity can act on a protein in the presence of a proteolytic enzyme to obtain a hydrolyzate having a strong taste.
  • the protease used may be a commercially available enzyme preparation, or may contain other enzymes such as a cell wall degrading enzyme. Further, a purified enzyme can also be used.
  • a purified enzyme can also be used.
  • the culture contains both glutaminase activity and proteolytic enzyme activity. It is not necessary to add proteolytic enzymes from outside.
  • Proteins that act on the microorganism culture having high glutaminase activity of the present invention include, for example, soybean, wheat, wheat gluten, cornmeal, milk casein, fishmeal, etc., and further defatted soybean or puffed solubilized Various proteins processed as described above, or proteins separated from these various protein raw materials may be used. In particular, a protein containing a large amount of glutamin such as wheat gluten is suitable for causing a microorganism culture having a high glutaminase activity to act.
  • the conditions under which a microbial culture having a high glutaminase activity is allowed to act on a protein are as follows.
  • a raw material having a concentration of 0.2 to 50%, preferably 1 to 20% has a high glutaminase activity.
  • the microbial cultures are mixed in the presence of proteolytic enzymes and allowed to react at 5 to 60 ° C, preferably 30 to 50 ° C, for 4 hours to 10 days, preferably 10 hours to 5 days. Just do it.
  • the above-mentioned protein raw materials may contain carbohydrates such as starch, To reduce sugars such as glucose. If reducing sugars remain in the protein hydrolyzate to be produced, they cause browning. Therefore, the amount of reducing sugars is 5% or less (weight Z weight), preferably 3%, based on the total solids in the reaction product. (Weight Z weight) or less, and more preferably 1.5% (weight / weight) or less. Specifically, first, the reaction is carried out at a temperature in the range of 15 to 39 ° (preferably 25 to 38 ° C. while aerating and stirring) to assimilate the reducing sugar, and then the aeration is performed.
  • a temperature in the range of 15 to 39 ° (preferably 25 to 38 ° C. while aerating and stirring) to assimilate the reducing sugar, and then the aeration is performed.
  • the point at which the reaction temperature is shifted is a point at which 10 to 6 O o / o of the total reaction time has elapsed after the start of the reaction.
  • the protein hydrolysis reaction is carried out without salt or under low salt conditions with a salt concentration of 3% or less (by weight).
  • the activities of proteolytic enzymes and glutamase may be inhibited by salt, and a lower salt concentration is preferred because the reaction rate is improved.
  • a small amount of ethanol or salt may be added for preservative purposes.
  • unreacted insoluble substances such as raw material proteins and bacterial cells may be removed by a conventional separation method such as centrifugation or filtration.
  • the liquid fraction after solid-liquid separation may be concentrated by vacuum concentration, reverse osmosis, or the like.
  • the ammonia content contained in the reaction solution can be reduced.
  • the ammonia content may be such that the amount of ammonia nitrogen / total nitrogen in the total solid content is 0.35 (weight / weight) or less, preferably 0.15 (weight Z weight) or less.
  • the concentrate can be powdered or granulated by a drying treatment such as freeze drying, reduced pressure drying, spray drying and the like.
  • a protein hydrolyzate having a high sodium glutamate content and a strong taste can be obtained without adding sodium glutamate from the outside.
  • the protein hydrolyzate obtained as described above does not contain monochlorohydroxypropanols and dichloropropanols unlike the hydrochloride hydrolyzate. This is achieved by a method in which the derivative with phenylboric acid is extracted by an extractorone column and detected by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS method) (Ushijima et al., Shokusai 36, 3, 360-364, 1995).
  • GC-MS method gas chromatography-mass spectrometry
  • the detection limits for these substances by the method of the invention described above are 0.05 ppm for liquid samples and 0.05 ppm for powder samples.
  • the protein hydrolyzate of the present invention can be used in various foods (products using flour, instant foods, agricultural-livestock, processed marine products, dairy products, oils and fats, frozen foods, basic and complex seasonings, confectionery, taste drinks, etc.
  • foods products using flour, instant foods, agricultural-livestock, processed marine products, dairy products, oils and fats, frozen foods, basic and complex seasonings, confectionery, taste drinks, etc.
  • it has the effects of enhancing umami, enhancing sweetness, giving richness and elongation, imparting mellowness, enhancing flavor, reducing saltiness and sourness, and masking off-flavors.
  • the protein hydrolyzate of the present invention has a weak flavor, a light color, and a high sodium glutamate content, the above-mentioned effects can be obtained without changing the original flavor of the food or increasing the color. And enhance umami.
  • the combined use with other umami components such as nucleic acids, yeast extract, and protein hydrolyzate enables production of foods with even stronger umami and rich taste.
  • Aspergillus Orlyze (ATCC 1 149 4) is the American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852- 1) 776, USA) Aspergillus' Soja (JCM2250) and Brera Derxii (JCM5280) were issued RIKEN's Microbial Strain Preservation Facility (Saitama, Japan). Hirosawa, Wako-shi, Prefecture 2-1) It is listed in each catalog issued and can be ordered by request.
  • Glutaminase activity is determined by the method of Toman et al. (Hartman, S .: J. Biol. Chera., 243, 853-863), which determines the amount of y-glutamylhydroxamic acid produced by an enzyme reaction in the presence of hydroxylamin. (1968)).
  • reagent A 0.4 M trisaminomethane, 0.2 M hydroxylamine hydrochloride (pH 7.0)
  • reagent B 100 mM L-glutamine, 20 mM reduced glutathione (PH 7.0)
  • Add 1 ml of the culture solution to 1 ml of an equal volume of the mixture, and incubate for 1 hour with 37.
  • (1) 3N hydrochloric acid, (2) 12% trichloroacetic acid and (3) 5% ferric chloride hexahydrate in 0.1N hydrochloric acid solution to stop the reaction and develop color.
  • the culture was measured for glutaminase activity.
  • the amount of glucose-minase production in the culture solution was 0.1% when the carbon source of the culture medium was glucose with a high assimilation rate. 0 5 7 (u / m ⁇ ), but 0.18 for lactate with low assimilation rate
  • glutamase production could be reduced by adding 1.0% sodium L-glutamate monohydrate in the middle stage of the culture and continuing the culture. 0.41 (u / m1).
  • the culture was measured for glutaminase activity.
  • the amount of glutaminase produced in the culture broth was 0.011 (u / m1) when the carbon source of the medium was sucrose, which had a high assimilation rate.
  • it was 0.148 (u / m) indicating that the amount of glutaminase produced was 13 times or more that when sucrose was used.
  • the use of mannitol, a carbon source with a low assimilation rate lifted the catabolic triplet and increased production.
  • L-glutamic Glutaminase production was increased to 0.331 (u / ml) by adding 1.0% sodium phosphate monohydrate and continuing the culture.
  • glutaminase can be obtained by using mannitol as a carbon source and adding 1.0% sodium L-glutamate monohydrate as a nitrogen source in the middle stage of culture and continuing the culture. Production could be increased about 30 times.
  • Example 3 Production of microbial culture with enhanced glutaminase activity using Aspergillus soja
  • Medium A (glucose 1.5%, polypeptone 1.5%, magnesium sulfate 7 hydrate 0.5%, potassium chloride 0.25%, sodium hydrogen phosphate 0.253 ⁇ 4 (pH )
  • Medium B (polypeptone 1.5 ⁇ , magnesium sulfate heptahydrate 0.5%, potassium chloride 0.25%, sodium hydrogen phosphate 0.25% (pH Adjustment)) 2 L was placed in a jar fermenter with a total volume of 5 L, and after autoclaving, Aspergillus' soja (JCM225) was inoculated as usual. The form of the koji mold inoculated at this time may be spores or hypha. Thereafter, Te temperature 3 0, was performed stirred number 6 0 0 rpm, the 3 4 hour incubation at an aeration rate of 1 ⁇ ⁇ 2 vvm.
  • the culture was measured for glutaminase activity.
  • the amount of glutaminase produced in the culture cultivated in Medium A was 0.002 (u / m 1), while the culture was continuously added in Medium B to keep the glucose at 0.2% or less.
  • Glutaminase production was 0.022 (u / 'm), and glucose was added continuously in medium B to keep it at 0.2% or less, and L-glutamic acid was added at 1 hour of culture.
  • Glutaminase production of the culture solution cultured with 1.0% sodium monohydrate was 0.064 (u / ml). From the above results, glucose with a high assimilation rate was added at a high concentration from the start of culture.
  • Glutaminase production was increased by approximately 11 times in the case where glucose was continuously added at a low concentration and catabolite repression was released, compared to the amount of glutaminase produced when cultivation was performed. . Furthermore, it was found that by adding sodium L-glutamate monohydrate in the middle stage of culture and culturing, the amount of glutaminase produced by Aspergillus was improved 32 times.
  • Example 4 Method for Producing a Microbial Culture with Enhanced Glutaminase Activity Using Yeast Medium A (glucose 1.5%, nose, keptopeptone 0.5%, malt extract 0.3%, yeast extract 0 3 i1 ⁇ 2 (no pH adjustment)) or medium B (0.5% bactopeptone, 0.3% malt extract, 0.3% yeast extract (unregulated ⁇ ))
  • medium A glucose 1.5%, nose, keptopeptone 0.5%, malt extract 0.3%, yeast extract 0 3 i1 ⁇ 2 (no pH adjustment)
  • medium B (0.5% bactopeptone, 0.3% malt extract, 0.3% yeast extract (unregulated ⁇ )
  • Brera Derxi JCM5280
  • the cells were cultured for 55 hours at a temperature of 25, a stirring speed of 800 rpm, and an aeration rate of 1/2 VVm.
  • the fermentation in the fermentation medium in culture medium B was continued with the addition of glucose continuously at 0.05% or less, and with the continuous addition of glucose at 0.05% or less.
  • Two jar fermenters to which 1.0% of sodium L-glutamate monohydrate, a nitrogen source, was added at 24 hours of medium-term culture were used.
  • the culture was measured for glutaminase activity.
  • the amount of glutaminase produced in the culture cultivated in the medium A was 0.121 (u nom1)
  • the amount of glutaminase produced in the culture in the medium B in which glucose was continuously added was 0.11 (u m 1).
  • a control using 10 ml of a culture of Aspergillus oryzae using sucrose described in Example 1 as a carbon source was similarly performed as a control.
  • the supernatants of these reaction products were measured for the total nitrogen amount (T-N) and the amount of free glutamate.
  • Glutamate content was determined by the enzymatic method, and total nitrogen was determined by the Kjeldahl method.
  • Table 1 shows these analytical values and the glutamate release rate (glutamate amount Z total nitrogen amount) determined from the amounts of glutamate and total nitrogen.
  • Cultivation was performed at a temperature of 30 ° C., a stirring speed of 600 rpm, and an aeration rate of 1/2 vvm.
  • the glucose solution is divided into four batches so that the total amount added becomes 1.5% (weight / volume) and the glucose concentration in the culture solution does not exceed 0.5%. Supplied.
  • 0.5% sodium L-glutamate was added to continue the culture, and the culture was completed in 48 hours.
  • the total nitrogen content, ammonia nitrogen content, salt content, free amino acid content and reducing sugar content of the spray-dried product were measured.
  • the salt content was calculated from the chloride content, and the amount of free amino acid was measured by amino acid analysis.
  • the reducing sugar was determined as a glucose equivalent by the Somogyi-Nelson method. Tables 2 and 3 show these analytical values.
  • a microorganism culture having enhanced glutaminase activity.
  • a protein hydrolyzate can be efficiently produced. Since the obtained protein hydrolyzate has a high glutamate content, it has a strong taste and is highly useful as a seasoning.

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Description

明細書 グルタ ミナ一ゼ活性が増強された微生物培養物及びその利用 技術分野
本発明は、 グルタミナ一ゼ活性が増強された微生物培養物の調製方法に関し、 詳しくはグルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物の培養中のカタボラィ ト リプレツ ショ ンを解除すること並びに必要により培養中期に窒素源を補給することによつ て、 グルタ ミナーゼ活性が増強された微生物培養物を調製する方法に関する。 また、 本発明は、 グルタ ミナーゼ活性が増強された微生物培養物、 該微生物培 養物を用いた蛋白質加水分解物の製造方法及び該製造方法により得られる蛋白質 加水分解物に関する。 この蛋白質加水分解物は、 グルタ ミ ン酸含有量が高いため に呈味力が強く、 調味料としての利用価値が高い。 背景技術
グルタ ミナ一ゼは、 生物界に広範に分布する酵素であり、 L 一グルタ ミ ンに作 用し、 アミ ド基を加水分解して L 一グルタ ミ ン酸とアンモニアに分解する酵素で ある。
L —グルタ ミ ン酸を水酸化ナ トリゥムまたは炭酸ナ ト リゥムで中和することに よって得られる L —グルタ ミ ン酸ナト リウムは、 あらゆるうま味の基本物質であ る。 この物質の最大の用途は調味料で、 家庭用のみならず加工食品の製造になく てはならない添加物である。
また、 これまでに知られている天然調味料の製造は、 蛋白質の分解を経て行わ れるものが主流であった。 天然調味料と称されるもののうち、 分解型天然調味料 には酸分解型と酵素分解型がある。 酸分解型調味料には、 大豆、 小麦などの植物 性蛋白質を原料として得られる Hydrolyzed Vegetable Proteinとゼラチン、 乳力 ゼインなどの動物性蛋白質を原料として得られる Hydrolyzed Animal Protein が あり、 その主成分であるアミ ノ酸組成は原料により大きく異なり、 呈味、 甘味な どに影響を及ぼす。 例えば、 脱脂大豆の塩酸分解法で得られる分解液は、 分解率 (フオルモール態窒素 Z総窒素） が 7 0 %以上、 グルタ ミ ン酸遊離率 （グル夕 ミ ン酸 Z総窒素） が 1 . 2 と高く、 うま味の点においては極めて優れている。
しかしながら、 一般に塩酸分解法により蛋白質加水分解物を得る場合、 1 0 0 で 1〜 2 日間という反応条件を要するが、 このような高温で長時間の反応は、 エネルギー消費量が大きい。 さらに、 酸による蛋白質の加水分解は簡便であるけ れども、 異臭の発生やアミ ノ酸の過剰分解、 中和のために高塩分となる等の欠点 がある。
その上、 近年、 酸分解法では人体に有害なモノクロ口プロパノ一ルゃジクロ口 プロパノ一ル等のクロロヒ ドリ ンが生成することが指摘されており、 食品素材と して問題になりつつある。
一方、 酵素的にアミ ノ酸液を製造する方法は、 古くから多々試みられており、 複雑な基質をァミノ酸にまで分解するために複合酵素系を必要とし、 通常その目 的を達成するためにはァスペルギルス 'オリ一ゼ (Aspergi ll us oryzae) を中心 とする麹菌を用いている。 この方法で製造されるァミノ酸液の代表的なものとし ては醤油が挙げられる。 醤油は、 蛋白質原料を加熱処理し、 これに麹菌を繁殖さ せた後、 食塩水中にて発酵、 熟成させることにより製造される。
しかしながら、 この方法も多大の労力と時間を要するにも関わらず、 アミノ酸 遊離率が低く、 特に大豆蛋白質中に最も多量含有され、 かつ呈味性に重要なグル 夕 ミ ン酸の遊離率が低いという欠点がある。
このように蛋白質の酵素分解により製造される調味料は、 近年欧州を中心にそ の需要が増加しつつあるものの、 モノクロロヒ ドロキシプロパノ一ル類及びジク ロロプロパノ一ル類を含まず、 塩酸分解に匹敵する旨味の強い調味料は存在しな かった。
醤油製造においてグル夕 ミ ン酸が不足する原因として、 麹菌のグルタ ミナ一ゼ 活性の不足が挙げられる。 そこで、 固体培養においてプロテア一ゼ高活性株とグ ルタ ミナ一ゼ高活性株との細胞融合による高活性菌株の造成も行われている （S. Ushi ima, T. Nakadai： Agric. Biol. Chem. , 51, (4), 1051 (1987) ; S. Ushi j ima, T. Nakadai, K. Uchida : Agric. Biol. Chem. , 51 ( 10), 2781 ( 1987) ; S. Ushij ima , T. Nakadai, K. Uchida : 醤研， 17, (3)， 89 ( 1991 ),特公平 3 - 73271号公報、 特公 平 3-68672号公報） 。
また、 多くの酵素系が、 消費速度の速い炭素源によって、 その酵素の生合成が 阻害されるカタボライ ト リプレツショ ンを受けることが知られている （Aunstrp, et al： "Microbial Technology" Vol. l(2nd edition), Academic Press, New York, 282(1979)) 。 ァスペルギルス ' ニジュランス (Aspergillus nidulans) ではプロリ ン代謝系酵素やアルコール利用系酵素での研究が、 ァスペルギルス · オリ一ゼではタカァミ ラ一ゼ遺伝子発現制御の研究が進んでおり、 creA遺伝子産 物である creA蛋白質が、 様々な酵素の合成の負の調整を行っていることが知られ ている （塚越規弘 ： 化学と生物， 32(1), 48 (1994)) 。
しかしながら、 ァスペルギルス ·ニジュランスにおいて、 培養時の窒素源がァ ンモニゥムの場合、 グル夕 ミナーゼの生産が抑制されるという報告のみで、 麹菌 や酵母のグルタ ミナ一ゼがカタボラィ ト リプレツショ ンを受けるという報告は無 い。 さらに、 各菌株の液体培養におけるグルタ ミナーゼに関しては以下のような 報告があるのみである。
ァスペルギルス ·オリ一ゼ及びァスペルギルス . ソ一ャの液体培養における リ ン酸 1カリウム添加による菌体内ダルタ ミナーゼ生産量の向上 （山崎達雄、 稲森 和夫、 内田一生 ： 醤研， 22，（1)， 13 (1996))、 バチルス · リケニホルミス (Bacill us lichenifo iis)におけるグルタ ミ ンによるグルタ ミナ一ゼの誘導、 ダルコ一 スによる阻害 （Cook. William R， Hoffman. Joshua H, Bernlohr. Robert W ： J. Bacteriol. , 148(1), 365 (1981)) 、 シユー ドモナス · ボレオポリス (Pseudomona s boreopolis) におけるグルタ ミ ンによるグルタ ミナ一ゼの誘導 （Berezov. Τ, T, hisamov. G. Z, Evseev. L. P, Zanin. V. A： Byull. Eksp. Biol. Med. , 76(10), 54 (1973)) 、 ェシエ リチア · コリ (Escherichia coli) におけるグルタ ミ ンによる グルタミナ一ゼ生産阻害 (Varricchio, Frederick: Arch. Mikrobiol. ,81(3), 23 4 (1972)) 、 シュ一ドモナス · フルォレッセンス (Pseudomonas f luorescens)( おけるクェン酸、 コハク酸、 α—ケ トグルタル酸添加によるグルタ ミナーゼ生産 の減少 (Nikolaev. A. Ya, Sokolov. N. N, Mardashev. S. R: Biokhimiya, 36(3), 643 (1971)) などである。
以上に説明したように、 ァスペルギルス属に属する微生物や酵母を含めた真菌 類のグルタ ミナ一ゼ生産の向上法に関しては殆ど報告がない。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、 微生物の培養中 のカタボラィ ト リプレツショ ンを解除し、 かつ必要により培養中期に窒素源を供 給することによりグルタ ミナ一ゼ生産が飛躍的に向上することを見出し、 本発明 を完成するに至った。
第 1の発明は、 グルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物の培養中のカタボラィ ト リプレツショ ンを解除すること並びに必要により培養中期に窒素源を供給するこ とを特徴とするグルタ ミナーゼ活性が増強された微生物培養物の調製方法である 第 2の発明は、 カタボラィ トリプレツションの解除を、 培養中に炭素源を連続 的又は間欠的に供給することにより行う第 1の発明の方法である。
第 3の発明は、 グルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物が、 麹菌又は酵母である 第 1の発明の方法である。
第 4の発明は、 第 1の発明の方法により調製されるグルタ ミナ一ゼ活性が増強 された微生物培養物である。
第 5の発明は、 第 4の発明のグルタ ミナ一ゼ活性が増強された微生物培養物を 、 無塩もしく は食塩濃度 3 % (重量 Z容量％) 以下の条件で蛋白質に作用させる ことを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法である。
第 6の発明は、 微生物培養物を蛋白質に作用させる際に、 当初通気及び攪拌を 行いながら 1 5〜 3 9 °Cの温度範囲で反応を行い、 次いで通気を停止して 4 0〜 6 0 °Cの温度範囲で反応を行うことを特徴とする第 5の発明の蛋白質加水分解物 の製造方法である。
第 7の発明は、 第 5又は 6の発明の方法により製造される蛋白質加水分解物で ある。
第 8の発明は、 下記の特徴を有する蛋白質加水分解物である。
( a ) 小麦グルテンを原料とする。
( b ) 全固形分中のグルタ ミ ン酸含有量がグルタ ミ ン酸ナト リウムとして 1 6〜 3 6 (重量 Z重量） ％である。
( c ) 全固形分中の全窒素含有量が 8〜 1 3 % (重量/重量） である。
( d ) 全固形分中の総ァミノ酸含有量が 4 0〜 7 2 % (重量 Z重量） である。 ( e ) 全固形分中の食塩含有量が 1 4 % (重量/重量） 以下である。
( f ) 全固形分中の還元糖含有量が 5 % (重量/重量） 以下である。
( g ) モノクロロヒ ドロキシプロパノール類及びジクロロプロパノ一ル類を含ま ない。 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる微生物は、 グルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物であり、 例え ば前記したような、 麹菌や酵母の他に、 バチルス属微生物、 シユー ドモナス属微 生物、 ェシヱリチア属微生物などが挙げられる。 これらの中では、 麹菌が好適で ある。 麹菌としては、 ァスペルギルス · ォリ一ゼ、 ァスペルギルス · ソ一ャ等で 代表される黄麹菌が好ましい。 また、 酵母としては、 ブレラ · デルキシ一などが 用いられる。
本発明において使用する培地は、 上記微生物が生育し得るものであればよく、 一般的に炭素源、 窒素源、 補助因子などを含むものである。
培地中の炭素源については、 グルコース、 マルト一ス、 フラク ト一ス、 シュク ロース等のような微生物による資化速度の速い炭素源の場合、 これらによるカタ ボライ トリプレツショ ンを解除する目的から、 培養中は低濃度に保つように供給 する必要がある。 具体的には、 培養液中の炭素源濃度が、 炭素源の供給を連続的 に行う場合には、 0 . 5 % (重量/容量） 以下、 好ましくは 0 . 2 % (重量/容 量） 以下、 間欠的に行う場合には、 1 . 2 % (重量 Z容量） 以下、 好ましくは 0 . 5 % (重量 Z容量） 以下になるように供給すべきである。 なお、 グルコースは デンプンの加水分解物、 シュクロースはモラセスのような形態であってもよい。 一方、 ラク トース、 マンニトール、 ソルボース等の微生物による資化速度が比 較的遅い炭素源に関しては、 培養初期から通常量供給してもカタボラィ トリプレ ッシヨンが発生することはない。 それ故、 これらは培養初期に 0 . 5〜 3 . 0 % (重量 Z容量） 、 好ましくは 1 . 0〜 2 . 0 % (重量 Z容量） を培地に添加する 上記の炭素源は単独で用いる他、 2種以上を組み合わせて用いても良い。 この ようにして、 微生物の培養中のカタボラィ トリプレッショ ンを解除することによ りグルタ ミナ一ゼ生産を向上させ、 高収率でグルタ ミナ一ゼを製造することがで きる。
培地中の窒素源の好適な例としては、 硝酸ナ トリウム、 亜硝酸ナ ト リウム、 塩 化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム等の無機窒素源、 カザミ ノ酸、 ポリペプトン 、 パク トぺプトン、 大豆蛋白質、 分離大豆蛋白質、 脱脂大豆、 カゼィン等の有機 窒素源、 L 一グルタミ ン酸ナト リウム、 L —ァスパラギン酸ナト リウム、 L —プ 口リ ン、 L—ァラニン、 グリ シン、 L —グルタ ミ ン等のアミ ノ酸類が挙げられる 。 特に、 培養中期にこのような窒素源を供給することにより、 グルタ ミナ一ゼ生 産をさらに上昇させることができる。 添加する窒素源の量は、 0 . 1 〜 2 . 0 % (重量/容量） 、 好ましくは 0 . 5〜 1 . 0 % (重量 Z容量） である。
上記の窒素源は単独で用いる他、 2種以上を組み合わせて用いても良い。 なお 、 アンモニゥム及びグルタ ミ ンを窒素源として使用する場合、 グルタ ミナ一ゼの 生産が抑制されることがあるが、 少量ずつ添加を行うことにより生産抑制を回避 することができる。
さらに、 補助因子としては、 硫酸マグネシウム 7水和物、 リ ン酸水素 2ナト リ ゥム、 リ ン酸水素 1ナト リウム、 リ ン酸水素 1 カリウム、 リ ン酸水素 2カリウム 、 肉エキス、 塩化カリウム、 コーンスティ一プリカ一などがあり、 これらを適宜 選択して使用する。
これらの添加量について述べると、 例えば硫酸マグネシウムを約 0 . 5 % (重 量/容量） 、 リ ン酸水素 1カリウムを約 0 . 5 % (重量/容量） 用いることが最 適である。
さらに、 初発の培養条件は、 通常の好気的培養条件でよく、 p H 4 . 5〜 9 . 0、 好ましくは p H 5 . 5〜 8 . 5、 温度 1 5〜 4 0 °C、 好ましくは 2 5〜 3 5 °Cが適当である。 また、 攪拌数や通気量については、 培養環境を好気的に保つこ とができる条件であればいかなる条件でも差し支えない。
本発明の発明の方法に従って微生物を培養することにより、 グルタ ミナ一ゼ活 性は通常の約 2〜 3 2倍に向上し、 高収率でグルタ ミナ一ゼを製造することがで きる。 従って、 本発明において 「グルタ ミナーゼ活性が増強された」 という表現 は、 該活性がグルコースを初発濃度で 1 . 5 % (重量 Z容量） 含有する培地で培 養中に炭素源を供給することなく培養したときに得られる該活性の約 2倍以上、 好ま しく は約 5倍以上に増強されていることを意味する。
また、 麹菌などを用いて調味料を製造する場合、 本発明の発明の方法を適用す ることによって、 培養液中のグルタ ミナーゼ生産量が向上し、 高品質の製品を効 率よく大量に製造することができる。
このようにして得られた高グルタ ミナーゼ活性を有する微生物培養物は、 蛋白 質分解酵素の存在下、 蛋白質に作用させることにより、 旨みの強い加水分解物を 得ることができる。
使用する蛋白質分解酵素としては、 市販の酵素製剤でよく、 細胞壁分解酵素等 他の酵素を含むものであっても構わない。 また、 精製した酵素も使用することが できる。 特に、 グルタ ミナ一ゼ活性を増強させる微生物として麹菌を使用する場 合、 麹菌自らが蛋白質分解酵素を生産するため、 培養物中にグルタ ミナーセ活性 と蛋白質分解酵素活性の両方が含まれており、 蛋白質分解酵素を外から添加する 必要は必ずしもない。
本発明の高グルタ ミナーゼ活性を有する微生物培養物を作用させる蛋白質とし ては、 例えば大豆、 小麦、 小麦グルテン、 コーンミール、 ミルクカゼイ ン、 フィ ッシユミ一ル等であり、 更に脱脂大豆あるいは膨化ゃ可溶化等の加工をされた種 々の蛋白質、 あるいはこれらの種々の蛋白原料からの分離蛋白質でもよい。 特に 、 小麦グルテン等のグルタ ミ ンを多く含む蛋白質は、 高グル夕 ミナ一ゼ活性を有 する微生物培養物を作用させるのに適している。
また、 高グル夕 ミナ一ゼ活性を有する微生物培養物を蛋白質に作用させる条件 について述べると、 例えば 0 . 2〜 5 0 %、 好ましくは 1 ~ 2 0 %の濃度の原料 に高グルタ ミナーゼ活性を有する微生物培養物を蛋白質分解酵素存在下で混合し 、 5〜 6 0 °C、 好ましく は 3 0〜 5 0 °Cにて、 4時間〜 1 0 日間、 好ましくは 1 0時間〜 5 日間反応させればよい。
なお、 上記の蛋白原料には、 澱粉等の炭水化物が含まれることがあり、 反応中 に加水分解されてグルコース等の還元糖が生成することがある。 製造される蛋白 加水分解物に還元糖が残存すると、 褐変を起こす原因となるため、 還元糖の量を 反応生成物中の全固形分に対し 5 % (重量 Z重量） 以下、 好ましく は 3 % (重量 Z重量） 以下、 さらに好ましくは 1 . 5 % (重量/重量） 以下に調整することが 望ま しい。 具体的には、 まず、 通気及び攪拌を行いながら 1 5〜 3 9 ° ( 、 好ま し くは 2 5〜 3 8ての温度範囲で反応を行い、 還元糖を資化させた後、 通気を停止 して 4 0〜 6 0 =C、 好ましくは 4 1 〜 5 0 °Cの温度範囲で反応を行ったのち反応 を終了させることにより、 反応生成物中の還元糖の量を低減することができる。 反応温度を移行させる時点は、 反応開始後、 全反応時間の 1 0〜 6 O o/oを経過し た時点である。
蛋白質の加水分解反応は、 無塩もしくは食塩濃度 3 % (重量 容量） 以下の低 塩条件下で行う。 蛋白分解酵素及びグルタ ミナ一ゼは食塩により活性が阻害され ることがあり、 食塩濃度が低い方が反応速度が向上するので好ましい。 但し、 反 応中、 防腐の目的で少量のエタノール、 食塩を添加してもよい。
反応終了後、 未反応の原料蛋白質、 菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、 従 来の分離法を用いて除去すればよい。 また、 必要に応じて、 固液分離後の液体区 分を減圧濃縮、 逆浸透法などにより濃縮してもよい。 特に、 pHをアルカリ性に調 整した後、 減圧下で濃縮を行うことにより、 反応液中に含まれるアンモニア含量 を低減することができる。 本発明者らの知見によれば、 グルタ ミ ン含量の高い小 麦グルテンを原料として使用した場合、 蛋白質加水分解物中のァンモニァが他原 料由来のものと比べて多くなり、 これが最終生産物の褐変を引き起こ している。 従って、 蛋白質加水分解物からアンモニア含量を低減するすることが望ましい 。 アンモニア含量は、 全固形分中のアンモニア態窒素量/全窒素量が 0 . 3 5 ( 重量/重量） 以下、 好ましくは 0 . 1 5 (重量 Z重量） 以下となるようにすれば よい。
更に、 濃縮物は凍結乾燥、 減圧乾燥、 噴霧乾燥等の乾燥処理により、 粉末化又 は顆粒化することができる。 かく して外部からグルタミ ン酸ナ ト リゥムを添加す ることなく、 グルタ ミ ン酸ナトリウム含有量が高く呈味性の強い蛋白質加水分解 物を得ることができる。 上記のようにして得られる蛋白質加水分解物は、 塩酸分解物とは異なり、 モノ クロロヒ ドロキシプロパノ一ル類及びジクロロプロパノ一ル類を含まない。 これ は、 エキス トレル一ォカラムにより抽出し、 フエニルホウ酸による誘導体をガス クロマトグラフィ一質量分析法 （G C— M S法） で検出する方法 （牛島ら、 食衛 誌 36, 3, 360- 364, 1995 ) によって検出限界以下であることにより確認すること ができる。 なお、 モノ クロロヒ ドロキシプロパノール類には、 3- chloro_ l， 2- pr opandiol 、 2- chloro- 1, 3 propandiol 、 ジクロロプロパノール類には、 1 , 3- di chloro 2- propanol ヽ 2, 3 - dichloro-ト propanol 力、'ある 0
上記の発明の方法によるこれらの物質のの検出限界は、 液体試料では 0 . 0 0 5 p p m、 粉末試料では 0 . 0 5 p p mである。
本発明の蛋白質加水分解物を各種食品 （小麦粉使用製品、 即席食品類、 農産 - 畜産 ，水産加工品、 乳製品、 油脂類、 冷凍食品、 基礎及び複合調味料、 菓子類、 嗜好飲料類、 その他の食品） へ添加することにより、 うま味の強化、 甘味の強化 、 濃厚感 '伸びの付与、 まろやかさの付与、 風味の増強、 塩味 '酸味の緩和、 異 風味のマスキング等の効果がある。 特に、 ①醤油存在下での甘味、 まろやかさ、 濃厚感の付与、 ②肉製品の異風味のマスキング及び肉風味の増強、 ③ポーク、 チ キン、 ビーフ、 魚介、 野菜エキス併用時の風味増強、 ④香辛料存在下での香辛料 風味の増強及び辛味のェンハンスの効果が強い。
本発明の蛋白質加水分解物は、 風味が弱く、 色が淡く、 かつグルタ ミ ン酸ナ ト リウム含有量が高いので、 食品のもとの風味を変えたり、 色を強めることなく、 上記の効果を高めたり、 うま味の強化が可能である。 また、 核酸等の他のうま味 成分や酵母エキス、 蛋白加水分解物との併用により、 更にうま味 · こ く味の強い 食品の製造が可能となる。 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例により本発明を詳細に説明する。 しかし、 これらの実施例は本発 明を限定するものではない。
なお、 ァスペルギルス · ォリ一ゼ （ A T C C 1 1 4 9 4 ) は、 American Typ e Culture Collection ( 12301 Parklawn Drive, Rockvi l le, Maryland 20852- 1 776, U. S. A. ) 発行の力タ口グに、 ァスペルギルス ' ソ一ャ （ J CM 2 2 5 0 ) 及びブレラ · デルキシ一 （ J CM 5 2 8 0 ) は、 理化学研究所微生物系統保 存施設 （埼玉県和光市広沢 2 — 1 ) 発行のカタログにそれぞれ掲載されており、 請求により分譲を受けることができる。
なお、 実施例中におけるグルタ ミナ一ゼ活性の測定法は以下の通りである。 グルタ ミナ一ゼ活性は、 ヒ ドロキシルァミ ン存在下の酵素反応で生成する y— グルタ ミルヒ ドロキサム酸を定量する トマンらの変法 （Hartman,S. ： J. Biol. Chera. , 243, 853- 863(1968))に従い測定した。 具体的には、 試薬 A ( 0. 4 M ト リスァミ ノメタン、 0. 2M 塩酸ヒ ドロキシルァミ ン （p H 7. 0 ) ) と試薬 B ( 1 0 0 mM L—グルタ ミ ン、 2 0 mM 還元グルタチォン （ p H 7. 0 ) ) との等量混合液 1 m 1に培養液 2 0 0〃 1を加え、 3 7てで 1時間ィ ンキュベ一 卜する。 次に、 反応停止及び発色のために、 （ 1 ) 3 N 塩酸、 （ 2 ) 1 2% ト リクロ口酢酸及び （ 3) 5 % 塩化第二鉄 6水和物を 0. 1 N 塩 酸溶液に溶解した溶液のそれぞれの等量混合液 1 m 1を加えて攪拌し、 この反応 液上清の 5 2 5 nmでの吸光度を測定して酵素活性を求めた。 なお、 上記条件下 において 1分間に 1 gのァ一グルタ ミルヒ ドロキサム酸を生成させる酵素活性 を 1単位 （U) とした。 実施例 1 ァスペルギルス · ォリ一ゼを用いたグルタ ミナ一ゼ活性が増強された 微生物培養物の製造
ラク トース又はグルコース 1. 5 %、 ポリペプトン 1. 5 %、 硫酸マグネシゥ ム 7水和物 0. 5 %、 塩化力リウム 0. 2 5%、 リ ン酸水素 1ナ トリウム 0. 2 5 %を含む培地 （p H無調整） 2 Lを総容量 5 Lのジャーファーメ ンタ一に張り 込み、 ォ一 トク レーブ殺菌後、 ァスペルギルス ' オリ一ゼ （AT C C 1 1 4 9 4) を常法通り接種した。 なお、 この際に接種する麹菌の形態は任意であり、 胞 子であっても、 菌糸であっても差し支えない。 その後、 温度 3 0°C、 攪拌数 6 0 0 r p m、 通気量 1 / 2 V V mにて 4 8時間培養を行った。
培養終了後、 培養物のグルタ ミナーゼ活性を測定した。 その結果、 培養液のグ ル夕 ミナーゼ生産量は、 培地の炭素源が資化速度の速いグルコースの場合、 0. 0 5 7 ( u / m 〗 ） であったが、 資化速度の遅いラク ト一スの場合は、 0 . 1 8
5 ( u / m 1 ) であり、 グルコースを用いたときと比べて 3倍以上のグルタ ミナ —ゼ生産量を示した。 すなわち、 資化速度の遅い炭素源であるラク ト一スを用い ることにより、 カタボライ ト リプレツショ ンが解除され、 生産量が向上したわけ である。
さらに、 炭素源としてラク トースを使用した場合、 培養中期に L 一グルタ ミ ン 酸ナ トリウム 1水和物 1 . 0 %を添加して培養を継続することにより、 グルタ ミ ナ一ゼ生産量は 0 . 4 0 1 ( u / m 1 ) に向上した。
以上の結果から、 ラク トースを炭素源として用い、 かつ培養中期に窒素源であ る L —グルタ ミ ン酸ナ ト リウム 1水和物 1 . 0 %を添加して培養を継続すること により、 グルタ ミナ一ゼ生産量を約 7倍に上昇させることができた。 実施例 2 ァスペルギルス ·ォリーゼを用いたグルタ ミ十一ゼ活性が増強された 微生物培養物の製造
マンニ トール又はシュクロ一ス 1 . 5 %、 ポリペプトン 1 . 5 %、 硫酸マグネ シゥム 7水和物 0 . 5 %、 塩化カリウム ϋ . 2 5 %、 リ ン酸水素 1ナ ト リウム 0 . 2 5 %を含む培地 （ ρ Η無調整） 2 Lを総容量 5 Lのジャ一フアーメ ンターに 張り込み、 オー トク レーブ殺菌後、 ァスペルギルス ' オリ一ゼ （ A T C C 1 1 4 9 4 ) を常法通り接種した。 なお、 この際に接種する麹菌の形態は任意であり 、 胞子であっても、 菌糸であっても差し支えない。 その後、 温度 3 0 °C、 攪拌数
6 0 0 r p m . 通気量 1 /. 2 v v mにて 4 8時間培養を行った。
培養終了後、 培養物のグルタ ミナーゼ活性を測定した。 その結果、 培養液のグ ルタ ミナ一ゼ生産量は、 培地の炭素源が資化速度の速いシュクロースの場合、 0 . 0 1 1 ( u / m 1 ) であつたが、 資化速度の遅いマンニトールの場合は、 0 . 1 4 8 ( u / m 】 ） であり、 シュクロースを用いたときと比べて 1 3倍以上のグ ルタ ミナ一ゼ生産量を示した。 すなわち、 資化速度の遅い炭素源であるマンニト ールを用いることにより、 カタボラィ トリプレツショ ンが解除され、 生産量が向 上したわけである。
さらに、 炭素源としてマンニト一ルを使用した場合、 培養中期に Lーグルタ ミ ン酸ナト リウム 1水和物 1. 0 %を添加して培養を継続することにより、 グルタ ミナ一ゼ生産量は 0. 3 3 1 ( u/m l ) に向上した。
以上の結果から、 マンニトールを炭素源として用い、 かつ培養中期に窒素源で ある L一グルタ ミ ン酸ナト リウム 1水和物 1. 0 %を添加して培養を継続するこ とにより、 グルタ ミナーゼ生産量を約 3 0倍に上昇させることができた。 実施例 3 ァスペルギルス · ソーャを用いたグルタ ミナ一ゼ活性が増強された微 生物培養物の製造
培地 A (グルコース 1. 5 %、 ポリペプトン 1. 5 %、 硫酸マグネシゥム 7水 和物 0. 5 %、 塩化カリウム 0. 2 5 %、 リ ン酸水素 1ナ ト リウム 0. 2 5 ¾ ( p H無調整） ） 又は培地 B (ポリペプトン 1. 5 ¾、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 5 %、 塩化力リウム 0. 2 5 %、 リ ン酸水素 1ナ トリウム 0. 2 5 % ( p H 無調整） ） 2 Lを総容量 5 Lのジャーファーメ ンターに張り込み、 オー トク レー ブ殺菌後、 ァスペルギルス ' ソ一ャ （ J CM 2 2 5 0 ) を常法通り接種した。 なお、 この際に接種する麹菌の形態は胞子であっても、 菌糸であっても差し支え ない。 その後、 温度 3 0て、 攪拌数 6 0 0 r p m、 通気量 1 ζκ 2 v v mにて 3 4 時間培養を行った。
培地 Bで発酵を開始するジャーファーメ ンタ一については、 グルコースを 0. 2 %以下に保つべく連続添加するものと、 同じく グルコースを 0. 2 %以下に保 つべく連続添加すると共に、 培養中期である培養開始 1 7時間目に窒素源である L一グルタ ミ ン酸ナト リウム 1水和物 1. 0 %を添加するものの合計 2基のジャ 一ファ一メ ンタ一を用意した。
培養終了後、 培養物のグルタ ミナ一ゼ活性を測定した。 その結果、 培地 Aで培 養した培養液のグルタ ミナ一ゼ生産量は 0. 0 0 2 ( u / m 1 ) 、 培地 Bでグル コースを 0. 2 %以下に保つべく連続添加した培養液のグルタミナ一ゼ生産量は 0. 0 2 2 ( u /' m 】 ） 、 培地 Bでグルコースを 0. 2 %以下に保つべく連続添 加し、 培養 1 Ί時間目に L一グルタ ミ ン酸ナト リウム 1水和物 1. 0 %を添加し て培養した培養液のグルタ ミナーゼ生産量は 0. 0 6 4 ( u / m l ) を示した。 以上の結果から、 資化速度の速いグルコースを培養開始時から高濃度に添加し て培養を行った場合のグルタ ミナ一ゼ生産量に比べ、 グルコースを低濃度で連続 添加し、 カタボライ ト リ プレッ ショ ンを解除したものは、 グルタ ミナ一ゼ生産量 が約 1 1倍向上した。 さらに培養中期に L 一グルタ ミ ン酸ナ トリウム 1水和物を 添加して培養することにより、 麹菌のグルタ ミナ一ゼ生産量は 3 2倍に向上する ことがわかった。 実施例 4 酵母を用いたグルタ ミナーゼ活性が増強された微生物培養物の製造法 培地 A (グルコース 1 . 5 %、 ノぺ、ク 卜ペプトン 0 . 5 ¾、 麦芽エキス 0 . 3 % 、 酵母エキス 0 . 3 i½ ( p H無調整） ） 又は培地 B (バク トペプトン 0 . 5 %、 麦芽エキス 0 . 3 %、 酵母エキス 0 . 3 % ( ρ Η無調整） ） 2 Lを総容量 5 しの ジャーファ一メ ンターに張り込み、 ォ一 トク レーブ殺菌後、 ブレラ · デルキシ一 ( J C M 5 2 8 0 ) を常法通り接種した。 その後、 温度 2 5 、 攪拌数 8 0 0 r p m、 通気量 1 / 2 V V mにて 5 5時間培養を行った。
培地 Bにて発酵を開始するジャーフアーメ ン夕一は、 グルコースを 0 . 0 5 % 以下に保つべく連続添加するものと、 同じく グルコースを 0 . 0 5 %以下に保つ ベく連続添加すると共に、 培養中期の培養 2 4時間目に窒素源である L 一グルタ ミ ン酸ナ ト リウム 1水和物 1 . 0 %を添加するジャーファーメ ンタ一の 2基を用 思した
培養終了後、 培養物のグルタ ミナ一ゼ活性を測定した。 その結果、 培地 Aで培 養した培養液のグルタ ミナーゼ生産量は 0 . 1 2 1 ( uノ m 1 ) 、 培地 Bでグル コースを連続添加した培養液のグルタ ミナ一ゼ生産量は 0 . 2 5 2 ( u / m 1 ) 、 培地 Bでグルコースを連続添加し、 培養 2 4時間目に L —グルタ ミ ン酸ナト リ ゥム 1水和物 1 . 0 %添加して培養した培養液のグルタ ミナーゼ生産量は 0 . 4 8 6 ( u /' m 】 ） を示した。
以上のことから、 資化速度の速いグルコースを培養開始時から高濃度に添加し て培養を行った際のグルタ ミナ一ゼ生産量に比べ、 カタボラィ ト リプレツシヨ ン を解除すべく グルコースを低濃度で連続添加したものはグルタ ミナーゼ生産量が 2 . 1倍向上した。 さらに培養中期に L 一グルタ ミ ン酸ナ ト リウム 1水和物を供 給することにより、 グルタ ミナーゼ生産量は 4倍に向上することがわかった。 実施例 5 小麦グルテンからのグル夕 ミ ン酸の遊離
以下の操作は無菌的に行った。 ォ一 トク レーブ処理した 5 %小麦ダルテン （商 品名 ： アジブロン G 2 ： 味の素 （株） 製） 溶液 2 0 m 1 に、 実施例 2記載のマン 二トールを炭素源としたァスペルギルス ' オリ一ゼ （A T C C 1 1 4 9 4 ) の 培養物 1 0 m l を混合し、 4 0 で 1 0時間、 2 4時間、 4 日間、 1 0 日間反応 させた。
また、 実施例 1記載のシユ ークロースを炭素源としたときのァスペルギルス · ォリーゼの培養物 1 0 m l を用いたものを比較対照として同様に実施した。 これらの反応物の上清について全窒素量 （T 一 N ) 、 遊離グルタ ミ ン酸量の測 定を行った。 グルタ ミ ン酸含量は酵素法により、 また全窒素量はケルダール法に より求めた。 これらの分析値及びグルタ ミ ン酸量と全窒素量から求めたグルタ ミ ン酸遊離率 （グルタ ミ ン酸量 Z全窒素量） を表 1に示す。
表 1に示した通り、 マンニトールを炭素源としたときのァスペルギルス ·ォリ ーゼの培養物を用いた小麦グルテン分解液のグルタ ミ ン酸遊離率は、 シュ一クロ ースを炭素源としたときより も明らかに高い値であった。 また、 それらの分解液 は強い呈味を有していた。
表 1 小麦グルテン分解液のグルタ ミ ン酸遊離率比較
培地 反応時間 ク"ルタミン酸量 全窒素量 ク"ルタミン酸遊離率 炭素源 ( g/ d 1 ) ( g, d 1 )
シユークロース 10時間 0 . 1 0 0 . 4 6 0 . 2 2
24時間 0 . 1 4 0 . 4 6 0 . 3 2
4曰 0 . 2 3 0 . 4 7 0 . 4 8
10曰 0 . 4 2 0 . 4 7 0 . 8 9 マンニトール 10時間 0 . 5 4 0 . 4 6 1 . 1 8
24時間 0 . 6 5 0 . 4 6 1 . 4 1
4曰 0 . 8 0 0 . 4 7 1 . 7 0
10日 0 . 8 7 0 . 4 7 1 . 8 5 実施例 6 小麦グルテン加水分解物の製造
以下の培養、 分解反応は無菌的に行った。 分離大豆蛋白 （商品名 ： アジブロン E 3、 味の素 （株） 製） 1 . 5 ¾、 硫酸マグネシウム 7水和物 0 . 5 0、 塩化力 リウム 0 . 2 5 %及びリ ン酸水素ナ ト リウム 0 . 2 5 %を含む培地 （ p H無調整 ) 2 Lを総容量 5 Lのジャーファーメ ンターに張り込み、 オー トク レーブ殺菌し 、 ァスペルギルス ·オリ一ゼ （A T C C 1 1 4 9 4 ) を常法通り接種した。 培 養は、 温度 3 0 °C、 攪拌数 6 0 0 r p m、 通気量 1 / 2 v v mにて行った。 培養 中、 グルコース溶液を全添加量が 1 . 5 % (重量/容量） となるように、 また培 養液中のグルコース濃度が 0 . 5 %を超えないように間欠的に 4回に分けて供給 した。 また、 培養中期には L —グルタ ミ ン酸ナ トリウム 0 . 5 %を添加して培養 を継続し、 4 8時間で培養を終了した。
この培養物 1 Lと 5 %小麦グルテン （商品名 ： アジプロン G 2、 味の素 （株） 製） 分散液 2 Lをォ一 トク レーブ殺菌したものを混合し、 小型ジャーファーメ ン ターで通気攪拌を行いながら、 3 5 °Cで 8時間反応させたのち、 通気を停止し、 4 5 °Cで 1 6時間分解反応を行った。
この分解液をヌ ツチ を用いて固液分離した後、 濾液のアンモニア濃度と等モ ル量の水酸化ナト リゥムを添加してエバポレ一ターで濃縮し、 アンモニアを除去 した。 濃縮液に塩酸を添加して p H 7 . 0とし、 8 0 °Cで 2 0分間加熱殺菌を行 つた。 冷却後、 ヌッチヱを用いて澱引きし、 ディスク式のスプレー ドライヤ一を 用いて噴霧乾燥し、 噴霧乾燥品を得た。
噴霧乾燥品の全窒素量、 アンモニア態窒素量、 食塩含量、 遊離アミ ノ酸量及び 還元糖量を測定した。 食塩含量は塩化物含量より算出し、 遊離アミ ノ酸量はアミ ノ酸分析により測定した。 また、 還元糖はソモジ · ネルソン法によりグルコース 換算値として求めた。 これらの分析値を表 2、 表 3に示す。
表 3に示した通り、 グルタ ミナーゼ活性の高いァスペルギルス ·ォリ一ゼの培 養物を用いて小麦グルテンを加水分解することにより、 噴霧乾燥品としてグルタ ミ ン酸 （グル夕 ミ ン酸ナ ト リウムとして） を 2 9 . 9 % (重量 Z重量） 、 全窒素 量を 9 . 1 °/。 （重量 重量） 、 総アミ ノ酸量を 5 5 . 4 % (重量/ 重量） 含む呈 味力の強い蛋白質加水分解物を製造することができた。 表 2 噴霧乾燥品のアミ ノ酸遊離量と遊離率 アミノ酸 遊離量 遊離率
( g/lOOg) ( / g N )
Asp 2. 4 6 0. 2 7
Thr 1. 7 2 0. 1 9
Ser 2. 7 4 0. 3 0
Glu 2 3. 5 6 2. 5 6
Pro 5. 1 4 0. 5 6
Gly 2. 0 5 0. 2 3
Ala 2. 0 1 0. 2 2
Cys 0. 3 9 0. 0 4
Val 2. 6 2 0. 2 9
Met 0. 8 7 0. 1 0 lie 2. 3 8 0. 2 6
Leu 4. 3 9 0. 4 8
Tyr 0. 6 2 0. 0 7
Phe 2. 0 2 0. 2 2 し ys 1. 2 6 0. 1 4
His 1. 0 3 0. 1 1
Arg 0. 1 7 0. 0 2
A
t=t 1 5 5. 4 4 6. 0 9
表 3 噴霧乾燥品の分析値
Figure imgf000019_0001
氺
ク"ルタミン酸ナトリウムとして 産業上の利用可能性
本発明により、 グルタ ミナ一ゼ活性が増強された微生物培養物が提供される。 この微生物培養物を用いることによって、 蛋白質加水分解物を効率よく製造する ことができる。 得られた蛋白質加水分解物は、 グルタ ミ ン酸含有量が高いため、 呈味力が強く、 調味料としての利用価値が高い。

Claims

請求の範囲
1 . グルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物の培養中のカタボラィ ト リプレツシ ョ ンを解除すること並びに必要により培養中期に窒素源を供給することを特徴と するグルタ ミナ一ゼ活性が増強された微生物培養物の調製方法。
2 . カタボライ トリブレツ ショ ンの解除を、 培養中に炭素源を連続的又は間欠 的に供給することにより行う請求項 1記載の発明の方法。
3 . グルタ ミナ一ゼ産生能を有する微生物が、 麹菌又は酵母である請求項 1記 載の発明の方法。
4 . 請求項 1記載の発明の方法により調製されるグルタ ミナーゼ活性が増強さ れた微生物培養物。
5 . 請求項 4記載のグルタ ミナーゼ活性が増強された微生物培養物を、 蛋白質 分解酵素の存在下、 無塩もしくは食塩濃度 3 % (重量/容量） 以下の条件下で蛋 白質に作用させることを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法。
6 . 微生物培養物を蛋白質に作用させる際に、 当初通気及び攪拌を行いながら 1 5〜 3 9ての温度範囲で反応を行い、 次いで通気を停止して 4 0〜 6 0 °Cの温 度範囲で反応を行うことを特徴とする請求項 5記載の蛋白質加水分解物の製造方 法。
7 . 請求項 5又は 6記載の発明の方法により製造される蛋白質加水分解物。
8 . 下記の特徴を有する蛋白質加水分解物。
( a ) 小麦グルテンを原料とする。
( b ) 全固形分中のグルタ ミ ン酸含有量がグルタ ミ ン酸ナ ト リウムとして 1 6〜 3 6 (重量/重量） ％である。
( c ) 全固形分中の全窒素含有量が 8〜 1 3 % (重量/重量） である。
( d ) 全固形分中の総ァミ ノ酸含有量が 4 0〜 7 2 % (重量 z重量） である。 ( e ) 全固形分中の食塩含有量が 1 4 90 (重量/ 重量） 以下である。
( f ) 全固形分中の還元糖含有量が 5 % (重量/重量） 以下である。
( ) モノクロロヒ ドロキシプロパノ一ル類及びジクロロプロパノ一ル類を含ま ない。
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