CN1297476A - 谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物及其应用 - Google Patents

Abstract

消除能产生谷氨酰胺酶的微生物在培养过程中的产物抑制作用,并在培养中期根据需要供给氮源,调制谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。此法调制的微生物培养物,在有蛋白酶,无盐或食盐浓度3%(W/V)以下的条件下作用于蛋白质,制造呈味力强的调味料且应用价值很高的蛋白质水解物。

Description

谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物及其应用

                      技术领域

本发明涉及谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的调制方法。具体地，本发明涉及消除能产生谷氨酰胺酶的微生物在培养过程中的产物抑制作用，并在培养中期根据需要补给氮源来调制谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的方法。

另外，本发明涉及谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物、应用该微生物培养物的蛋白水解物的制备方法以及按该制备方法制得的蛋白水解物。此蛋白水解物谷氨酸含量高，所以呈味力强，作调味料的应用价值高。

                      背景技术

谷氨酰胺酶是广泛分布于生物界的酶，是作用于L-谷氨酰胺，将酰胺基水解，生成L-谷氨酸和氨的酶。

L-谷氨酸用氢氧化钠或碳酸钠中和得到的L-谷氨酸钠是所有鲜味的基本物质。此物的最大用途是作调味料，不仅家庭用，也是加工食品制造中不可缺少的添加物。

另外，至今已知的天然调味料主要是将蛋白质分解进行制造为主。天然调味料中，分解型天然调味料有酸分解型和酶分解型。酸分解型调味料中有以大豆、小麦等植物性蛋白质为原料制成的水解植物蛋白和以动物胶、乳酪蛋白等动物性蛋白质为原料制成的水解动物蛋白。其主成分的氨基酸组成，因原料不同而有很大差异，从而影响呈味、甜味等。例如：脱脂大豆用盐酸分解法制得的分解液，分解率(甲醛态氮(用甲醛滴定法测得)/总氮)70％以上，谷氨酸游离率(谷氨酸/总氮)高达1.2，在鲜味上是很出色的。

但是，一般用盐酸分解法生产蛋白水解物时，需要100℃、1-2天的条件，这种高温长时反应，能源消耗很大。而且蛋白质的酸法水解虽然简便，但也有发生异臭、氨基酸分解过度，中和后盐分高等缺点。

此外近年酸水解法被指出会生成对人体有害的一氯丙醇、二氯丙醇等氯代醇，作为食品素材仍成为问题。

另一方面，用酶来制备氨基酸的方法，自古以来做了很多尝试。为了把复杂的底物分解成氨基酸，复合酶是必要的。通常为了达到这一目的，利用以米曲霉(Aspergillus oryzae)为主的曲霉。由此法制得的氨基酸液的代表是酱油。酱油是将蛋白质原料经加热处理、接种曲霉后在食盐水中发酵、熟成而制成的。

但是，这种方法且不说需要很多劳力和时间，还有氨基酸游离率低，特别是大豆蛋白质中含量最多，而且有对呈味性最重要的谷氨酸游离率低这样的缺点。

这种经蛋白质经酶水解制造的调味料，近年来以欧洲为中心其需求量在增加，但还没有既不含一氯羟丙醇类及二氯丙醇类，又能与盐酸分解相匹敌的鲜味很强的调味料。

在酱油制造中谷氨酸不足的一个主要原因是曲霉的谷氨酰胺酶活性不足。因此，进行了在固体培养中高蛋白酶活性菌株和高谷氨酰胺酶活性菌株通过细胞融合，选育高活性菌株的工作(S.Ushijima，T.Nakadai：Agric.Biol.Chem51，(4)，1051(1987)；S.Ushijima，T.Nakadai，K.Uchida：Agric.Biol.Chem51，(10)，2781(1987)；S.Ushijima，T.Nakadai，K.Uchida：酱研，17，(3)，89(1991)，特公平3-73271号公报、特公平3-68672号公报)。

另外，很多酶系，都已知因碳源的消耗速度快，使其酶的生物合成受到阻碍，发生产物抑制(Aunstrp，K.et al：“MicrobiolTechnology”Vol.1(2^ndedition)，AcademicPress，NewYork，282(1979))。利用构巢曲霉(Aspergillus nidulans)进行其脯氨酸代谢系酶的研究、乙醇利用系酶的研究，利用米曲霉研究高麦芽糖酶基因表达调控的工作不断深入。creA的基因产物为creA蛋白，对各种酶的合成进行负调控(塚越规弘：化学和生物，32(1)，48(1994))。

但是对构巢曲霉来说，只有报告说当培养时的氮源为铵时，谷氨酰胺酶的生产才受到抑制，而没有曲霉、酵母的谷氨酰胺酶受到产物抑制的报告。而且，关于各菌株的液体培养中的谷氨酰胺酶也只有以下的报告。

在米曲霉及酱油曲霉(Aspergillus sojae)的液体培养中磷酸二氢钾可提高菌体内谷氨酰胺酶产量(山崎达雄、稻森和、内田一生：酱研，22(1)，13(1996))；地衣芽孢杆菌(Bacillus Sicheniformis)谷氨酰胺对谷氨酰胺酶的诱导、由葡萄糖引起的阻碍(Cook.WilliamR，Hoffmann.Joshua H，Bernlohr.Robert W：J.Bacteriol148(1)，365(1981))；北城假单孢菌(Pseudomona boreopolis)中谷氨酰胺对谷氨酰胺酶的诱导(Berezov.T.T，Khisamov.G.Z，Evseev.L.P，Z.V.A：Byull.Eksp.Biol.Med76(10)，54(1973))；大肠埃希氏杆菌中谷氨酰胺对谷氨酰胺酶生产的阻碍(Varricchio，Frederick：Arch.Microbiol81(3)，234(1972))；荧光假单孢菌(Pseudomona fluorescens)中添加柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸使谷氨酰胺酶的生成减少(Nikolaev.A.Ya，Sokolov.N.N，Mardashev.S.R：Biokhimiya，36(3)，643(1971))等。

正如以上所述，与几乎还没有关于提高曲霉属微生物、以及酵母在内的真菌类的谷氨酰胺酶生产方法的报道。

                        发明内容

本发明人，为解决上述问题，经不断研究发现通过消除微生物培养中的产物抑制作用，并在培养中期根据需要供给氮源，可以使谷氨酰胺酶的生产有质的提高，由此完成本发明。

第l项发明是谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的调制方法，其特征在于消除有产生谷氨酰胺酶能力的微生物在培养中的产物抑制作用，并在培养中期根据需要供给氮源。

第2项发明是第一项发明的方法，其中通过在培养中连续或间歇地供给碳源，以消除产物抑制作用发明的。

第3项发明是第一项发明的方法，其中能产生谷氨酰胺酶的微生物为曲霉或酵母。

第4项发明是由第1项发明方法调制出的谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。

第5项发明是蛋白水解物的调制方法，其特征在于使第4项发明的谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物在无盐或食盐浓度3％(W/V)以下的条件下，作用于蛋白质。

第6项发明是第5项发明的蛋白质水解物的调制方法，其特征在于微生物培养物作用于蛋白质时，开始边通气边搅拌，使反应在15～39℃的温度范围内进行，其后停止通气并使反应在40～60℃的温度范围内进行。

第7项发明是由第5或第6项发明方法调制出的蛋白质水解物。

第8项发明是具有以下特征的蛋白质水解物：

(a)以小麦谷蛋白为原料。

(b)总固形物中谷氨酸含量以谷氨酸钠计为16～36％(W/W)。

(c)总固形物中总氮含量8～13％(W/W)。

(d)总固形物中总氨基酸含量40～72％(W/W)。

(e)总固形物中食盐含量14％(W/W)以下。

(f)总固形物中还原糖含量5％(W/W)以下。

(g)不含一氯羟丙醇类及二氯丙醇类。

以下，详细说明本发明。

本发明中应用的微生物是能产生谷氨酰胺酶的微生物。例如除前面所说的曲霉、酵母以外，还有杆菌属微生物、假单孢菌属微生物、埃希氏菌属微生物等。其中优选曲霉。曲霉中优选米曲霉、酱油曲霉为代表的黄曲霉。另外也有使用酵母中的布勒弹孢酵母(Bulleraderxii)等的。

本发明中使用的培养基，只要上述的微生物可以生长繁殖即可，一般含碳源、氮源、辅助因子等。

当培养基中的碳源为葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖等微生物吸收速度快的碳源时，为了消除这些糖引起的产物抑制作用，供给时必须保持低浓度。具体为，当连续供给碳源时培养液中的碳源浓度按0.5％(W/V)以下供给，优选0.2％(W/V)以下；间歇供给时按2％(W/V)以下供给优选0.5％(W/V)。另外，可用淀粉水解物替代葡萄糖，糖蜜替代蔗糖。

另一方面，乳糖、甘露醇、山梨糖等微生物吸收速度慢的碳源，从培养初期按通常量供给也不会引起产物抑制。因此，这些糖在培养初期按0.5～3.0％(W/V)，优选1.0～2.0(W/V)添加到培养基中。

上述的碳源可以单独使用，也可以两种以上组合使用。其中由于消除了微生物培养中的产物抑制作用，从而提高谷氨酰胺酶的生产，以高产率调制谷氨酰胺酶。

培养基中的氮源，如硝酸钠、亚硝酸钠、氯化铵、硫酸铵等无机氮源；酪蛋白水解物、多种蛋白胨(polypeptone)、细菌用蛋白胨(bacto-peptone)、大豆蛋白、大豆分离蛋白、脱脂大豆、酪蛋白等有机氮源；L-谷氨酸钠、L-天门冬氨酸钠、L-脯氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-谷氨酰胺等氨基酸类都是合适的例子。特别是在培养中期供给这样的氮源，可以进一步提高谷氨酰胺酶的生产。氮源的添加量为0.1～2.0％(W/V)，优选0.5～1.0％(W/V)。

上述的氮源可以单独使用，也可以两种以上组合使用。但以铵及谷氨酰胺为氮源时，虽然会抑制谷氨酰胺酶的生产，但如果每次少量添加则可以避免对生产的抑制。

并且，作为辅助因子，有七水硫酸镁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，肉汁提取液(肉浸膏)，氯化钾，玉米浆等，从中选择适当的使用。

这些物质的添加量，如硫酸镁约按0.5％(W/V)、磷酸二氢钾约按0.5％(W/V)使用为最好。

进一步，起始培养条件，通常的好气培养条件即可，pH4.5-9.0，优选5.5-8.5，温度15～40℃，优选25～35℃。另外，至于搅拌数、通气量，只要能保持好气的培养环境，什么条件无所谓。

按本发明发明的方法进行微生物培养，可以使谷氨酰胺酶活性提高至通常的约2～32倍，以高产率调制谷氨酰胺酶。所以本发明中“谷氨酰胺酶活性增强”这一表述，是指该活性比用葡萄糖起始浓度1.5％(W/V)的培养基在培养中不供给碳源进行培养时所得活性的约2倍，理想时约5倍以上的意思。

另外，利用曲霉等制造调味料时，合理使用本发明发明的方法，可以提高培养液中的谷氨酰胺酶产量，高效、大量地制造高品质的制品。

由此法制得的有高谷氨酰胺酶活性的微生物培养物，在有蛋白酶存在的条件下，作用于蛋白质，可以获得鲜味很强的水解物。

使用的蛋白酶，市售的酶制剂即可，即使含有细胞壁分解酶等其它的酶也没关系。另外也可以使用纯化的酶。特别是使用谷氨酰胺酶活性增强的微生物曲霉时，因曲霉自身可以产生蛋白酶，培养物中同时具有谷氨酰胺酶活性和蛋白酶活性，所以并非一定要外加蛋白酶。

作为本发明的有高谷氨酰胺酶活性的微生物培养物作用的蛋白质，有大豆、小麦、小麦谷蛋白、玉米粉、乳酪蛋白、鱼粉等，特别是，脱脂大豆或经膨化和可溶化加工的各种蛋白质或这些蛋白原料的分离蛋白均可以。特别是小麦谷蛋白等富含谷氨酰胺的蛋白质，比较适于被有高谷氨酰胺酶活性的微生物培养物作用。

另外，关于具有高谷氨酰胺酶活性的微生物培养物的作用条件，例如0.2～50％，优选1～20％浓度的原料在有蛋白酶存在条件下，与有高谷氨酰胺酶活性的微生物培养物混合，5～60℃、优选30～50℃，反应4小时-10天，优选10小时-5天。

但是上述的蛋白原料中，可能含有淀粉等碳水化合物，反应中会被水解生成葡萄糖等还原糖。如果制造的蛋白水解物中残存有还原糖会引起褐变，所以希望将还原糖的量调整至反应生成物总固形分的5％(W/W)以下，优选3％(W/W)以下，最优选1.5％(W/W)以下。具体方法为首先一边通气一边搅拌，在15～39℃(25～38℃更好)的温度范围内进行反应，待还原糖被消耗后，停止通气，在40～60℃，优选41～50℃的温度范围内进行反应，其后终止反应，就可以降低反应生成物中的还原糖的量。改变反应温度的时间为反应开始后经过全反应时间的10～60％那一时点。

蛋白质的水解反应，在无盐或食盐浓度3％(W/V)以下的低盐条件下进行。食盐会抑制蛋白酶及谷氨酰胺酶的活性优选在低盐浓度下提高反应速度。但反应中，为了防腐可以添加少量的酒精、食盐。

反应终止后，未反应的原料蛋白质、菌体等不溶物可用离心分离、过滤等传统的分离法除去。另外如果有必要，固液分离后的液体部分可以用减压浓缩、逆渗透法等方法浓缩。特别是将pH调至碱性后，进行减压浓缩，可以降低反应液中氨的含量。按本发明人的经验在以谷氨酰胺含量高的小麦谷蛋白为原料时，蛋白水解物中的氨含量比其它原料的蛋白水解物的高，这会引起最终产物发生褐变，因此，希望降低蛋白水解物的氨含量。氨含量按氨态氮占总固形分中的总氮量计在0.35(W/W)以下，优选0.15(W/W)以下。

进一步，浓缩物可以经冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等干燥处理粉末化或颗粒化。于是不需要从外部添加谷氨酸钠，就可以得到谷氨酸钠含量高而且呈味性强的蛋白水解物。

按上述方法制得的蛋白水解物与盐酸水解物不同，不含一氯羟丙醇类及二氯丙醇类。这可以用extrelut柱提取，苯(基)硼酸作诱导体用气相色谱-质谱法(GC-MS)检出，确认其含量在检出界限以下(牛岛等，食卫志36.3，360-364，1995)。另外-氯羟丙醇类中有了3-氯-1，2-丙二醇、2-氯-1，3丙二醇，二氯丙醇类中有1，3-二氯-2-丙醇、2，3-二氯-1-丙醇。

上述发明的方法的这些物质的检出界限为液体样品0.005ppm，粉末样品0.05ppm。

本发明的蛋白质水解物添加到各种食品(小麦粉制品、速食食品类、农产·畜产·水产加工制品、乳制品、油脂类、冷冻食品、基础及复合调味料、糖果点心类、嗜好性饮料、其它食品)中，具有强化鲜味、强化甜味、赋予浓厚感·滞后、赋予圆润感、增强风味、缓和盐味·酸味，掩盖异味等效果，特别是(1)酱油存在时的甜味、圆润感、浓厚感的赋予；(2)肉制品异味的掩盖及风味的增加；(3)猪肉、鸡肉、牛肉、水产、野菜提取液并用时的风味增强；(4)有香辛料时香辛料风味的增强及辣味的强化。

本发明的蛋白水解物因其风味弱，颜色淡而且谷氨酸钠含量高，所以不但不会改变食品原有的风味或使其颜色加深，而且可以提高上述的效果，强化鲜味。另外，核酸等其他鲜味成分、酵母提取物与蛋白水解物共用，可以制出味道更鲜更浓的食品。

实施发明的最好方法

以下根据实施例来详细说明本发明。但是本发明并不只限于这些

实施例。

另外，米曲霉(ATCC 11494)在美国典型培养物保藏中心(12301pardlawn Drive，Rockville，Maryland20852-1776，U.S.A)出版的产品目录中有描述，酱油曲霉(JCM2250)及布勒弹孢酵母菌(JCM5280)在理化学研究所微生物系统保存设施(玉县和光市广沢2-1)出版的产品目录中有登载，可以通过申请获得。

另外，实施例中的谷氨酰胺酶活性测定方法如下：

谷氨酰胺酶活性是按Hartma等改进的方法(Hartman，S.C.J.Biol，chem，243，853-863(1968))通过对在羟胺存在的条件下酶反应生成的γ-谷酰基羟氨基酸进行定量测定的。具体方法为，试剂A(0.4M Tris，0.2M盐酸羟胺(pH 7.0))与试剂B(100mML-谷氨酰胺，20mM还原型谷胱甘肽(pH7.0))的等量混合液lml中加入培养液200μl，37℃培养1小时。然后为了停止反应及显色，加入(1)3N盐酸；(2)12％三氯乙酸及(3)5％六水合氯化亚铁的0.1N盐酸溶解液，将各液等量混合液1ml并搅拌，此反应液上清液在525nm处测吸光度求出酶活性，另外，上述条件下1分钟生成1μg γ-谷氨酰基羟氨酸定为1个酶活性单位(U)。

实施例1利用米曲霉调制谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。

含乳糖或葡萄糖1.5％，多种蛋白胨1.5％、7水合硫酸镁0.5％、氯化钾0.25％、磷酸二氢钠0.25％的培养基(未调pH)2L转移到总容量5L的发酵罐中，高压杀菌后，按常规方法接种米曲霉(ATCC 11494)。另外，此时接种的曲霉可以是任意形态，孢子、菌丝都可以，然后按温度30℃，搅拌速度600rpm，通气量1/2vvm培养48小时。

培养终止后，测定培养物的谷氨酰胺酶活性。其结果，当培养基的碳源为吸收速度快的葡萄糖时，培养液的谷氨酰胺酶的产量为0.057(u/ml)，而当碳源为吸收速度慢的乳糖时，谷胺酰胺酶产量为0.185(u/ml)。可见比起利用葡萄糖来乳糖的碳源可以获得3倍以上的谷氨酰胺酶产量。即，利用吸收速度慢的乳糖为碳源，可以消除产物抑制，提高产量。

再者，利用乳糖为碳源时，在培养中期添加1％一水合L-谷氨酸钠并继续培养，可以使谷氨酰胺酶产量提高至0.401(u/m0l)。

从以上结果可以看出，以乳糖为碳源，且在培养中期添加氮源1％一水合L-谷氨酸钠并继续培养，可以使谷氨酰胺酶产量提高至约7倍。

实施例2利用米曲霉制造谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。

含甘露醇或蔗糖1.5％、多种蛋白胨1.5％、7水硫酸镁0.5％、氯化钾0.25％、磷酸二氢钠0.25％的培养基(未调pH)2L转移到总容量5L的发酵罐中，高压杀菌后，按常规的方法接种米曲霉(ATCC 11494)。另外，此时接种的曲霉可以是任意形态，孢子，菌丝均可，然后30℃，600rpm搅拌，1/2vvm通气培养48小时。

培养终止后，测定谷氨酰胺酶活性。其结果，培养液的谷氨酰胺酶产量，当培养基的碳源为吸收速度快的蔗糖时为0.011(u/ml)，而当碳源为吸收速度慢的甘露醇时为0.148(u/ml)。可见谷氨酰胺酶产量为使用蔗糖时的13倍以上，也就是说，以吸收速度慢的甘露醇为碳源，可以消除产物抑制，提高产量。

进一步在以甘露醇为碳源使用时，在培养中期添加1.0％的一水合L-谷氨酸钠并继续培养，可以使谷氨酰胺酶产量提高至0.331(μ/ml)。

从以上结果可以看出，以甘露醇为碳源时，并在培养中期添加氮源1.0％的一水合L-谷氨酸钠继续培养，可以使谷氨酰胺酶产量提高至约30倍。

实施例3利用酱油曲霉制造谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。

培养基A(葡萄糖1.5％、多种蛋白胨1.5％、7水硫酸镁0.5％、氯化钾0.25％、磷酸二氢钠0.25％(未调pH))或培养基B(多种蛋白胨1.5％、7水硫酸镁0.5％、氯化钾0.25％、磷酸二氢钠0.25％(未调pH))2L移至总容量5L的发酵罐中，高压杀菌后，按常规方法接种酱油曲霉。另外，此时接种的曲霉形态，孢子、菌丝均可，然后30℃，600rpm搅拌，1/2vvm通气培养34小时。

培养基B发酵开始的发酵罐准备了两个，一个用于进行连续添加以使葡萄糖浓度保持在0.2％以下，另一个用于在进行连续添加以使葡萄糖浓度保持在0.2％以下的同时，在培养中期即培养开始第17个小时添加氮源1.0％的1水合L-谷氨酸钠。

培养终止后，测定培养物的谷氨酰胺酶活性。其结果，用培养基A培养的培养液的谷氨酰胺酶产量为0.002(u/ml)；用培养基B培养的为保持葡萄糖浓度0.2％以下进行连续添加的培养液的谷氨酰胺产量为0.022(u/ml)；用培养基B，在为保持葡萄糖浓度0.2％以下进行连续供给的同时，在培养的第17个小时添加1％1水合L-谷氮酸钠进行培养的培养液的谷氨酰胺酶的产量为0.064(u/ml)。

从以上结果可以看出，与培养开始时添加高浓度的吸收速度快的葡萄糖进行培养时的谷氨酰胺酶的产量相比，低浓度连续添加葡萄糖，消除了产物抑制，使谷氨酰胺酶的产量提高至约11倍。进一步，在培养中期添加1水合L-谷氨酸钠进行培养，曲霉的谷氨酰胺酶产量提高至32倍。

实施例4利用酵母的谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物调制法。

培养基A(葡萄糖1.5％、细菌用蛋白胨(bactopeptone)0.5％、麦芽提取液0.3％、酵母提取液0.3％(未调pH))，或培养基B细菌用蛋白胨(bactopeptone)0.5％、麦芽提取液0.3％、酵母提取液0.3％(未调pH))2L移至总容量5L的发酵罐中，高压杀菌后，按常规方法接种布勒弹孢酵母JCM 5280，然后25℃，800rpm搅拌，1/2vvm通气条件下培养55小时。

培养基B的发酵罐准备了2个，一个在为使葡萄糖保持在0.05％以下连续添加进行培养时使用，另一个在同样为使葡萄糖保持在0.05％以下连续添加的同时，在培养中期，即培养的第24小时添加氮源1％1水合L-谷氨酸钠进行培养时使用。

培养终止后，测定培养物的谷氨酰胺酶活性。其结果，培养基A中培养液的谷氨酰胺酶产量为0.121(u/ml)；培养基B中连续添加葡萄糖的培养液的谷氨酰胺酶产量为0.252(u/ml)；培养基B中连续添加葡萄糖，并在培养的第24个小时添加1％1水合L-谷氨酸钠进行培养的培养液，其谷氨酰胺酶产量为0.486(u/ml)。

由以上结果可以看出，与从培养开始时添加高浓度的吸收速度快的葡萄糖进行培养时的谷氨酰胺酶的产量相比，低浓度连续添加葡萄糖消除了产物抑制，使谷氨酰胺酶的产量提高至2.1倍。进一步，在培养中期供给1水合L-谷氨酸钠，可以使谷氨酰胺酶产量提高至4.1倍。

实施例5小麦谷蛋白中谷氨酸的游离

以下操作在无菌条件下进行。经高压杀菌处理的5％小麦谷蛋白(商品名：Ajipurom G2、味之素(株)制)溶液20ml中，以实施例2记述的甘露醇为碳源的米曲霉(ATCC11494)培养物10ml，40℃分别反应10小时，24小时，4天，10天。

另外以实施例1中记述的以蔗糖为碳源时的米曲霉的培养物10ml为对照，进行相同操作。

对这些反应物的上清液的总氮量(T-N)、游离谷氨酸量进行了测定。谷氨酸含量用酶法，总氮量用凯氏定氮法测得。根据这些谷氨酸含量和总氮量求得的谷氨酸游离率(谷氨酸量/总氮量)见表1。

如表1所示，使用以甘露醇为碳源时的米曲霉的培养物所得的小麦谷蛋白分析液的谷氨酸游离率，明显高于以蔗糖为碳源时的数值。另外，其分解液有强呈味性。

表1小麦谷蛋白分解液的谷氨酸游离率比较

培养基碳源	反应时间	谷氨酸量(g/dl)	总氮量(g/dl)	谷氨酸游离率
					蔗糖	10小时24小时4天10天	0.100.140.230.42	0.460.460.470.47	0.220.320.480.89
甘露醇	10小时24小时4天10天	0.540.650.800.87	0.460.460.470.47	1.181.411.701.85

实施例6小麦谷蛋白水解液的调制

以下的培养、分解反应在无菌条件下进行。含大豆分离蛋白(商品名：AjipuronE3、味之素(株)制)1.5％、7水硫酸镁0.5％、氯化钾0.25％及磷酸二氢钠0.25％的培养基(未调pH)2L移入总容量5L的发酵罐中，高压杀菌后，以常规方法接种米曲霉(ATCC 11494)，30℃，600rpm搅拌，1/2vvm通气培养。培养中，葡萄糖溶液的总添加量要使终浓度达到1.5％(W/V)、另外每次分4次间隔供给培养液中的葡萄糖浓度不超过0.5％。另外，在培养中期添加0.5％L-谷氨酸钠后继续培养。48小时终止培养。

该培养物11与经高压杀菌的5％小麦谷蛋白(商品名AjipuronE3、味之素(株)制)分散液2L混合，在小型发酵罐中边通气边搅拌35℃反应8小时后停止通气，45℃进行分解反应16小时。

此反应液经吸滤过滤器固液分离后，添加与滤液中氨等摩尔的氢氧化钠，蒸发器中浓缩，除去氨。浓缩液中添加盐酸调pH值至7.0，80℃ 20分钟加热杀菌。冷却后用真空过滤除去沉淀，用离心式喷雾干燥机进行喷雾干燥，得到喷雾干燥品。

测定喷雾干燥品的总氮量，氨态氮量，食盐含量，游离氨基酸量及还原糖量。食盐含量通过氯化物含量算出，游离氨基酸量通过氨基酸分析测定。另外还原糖用索莫吉-纳尔逊(Somogyi Nelson)葡萄糖换算值求得。这些分析值见表2、表3。

如表3所示，使用谷氨酰胺酶活性高的米曲霉的培养物，对小麦谷蛋白进行水解，可以制造喷雾干燥品含谷氨酸(按谷氨酸钠计)29.9％(W/W)、总氮量9.1％(W/W)、总氨基酸量55.4％(W/W)的呈味力强的蛋白水解物。

表2喷雾干燥品的氨基酸游离量与游离率

氨基酸	游离量(g/100g)	游离率(g/gN)
			天门冬氨酸ASP	2.46	0.27
苏氨酸Thr	1.72	0.19
			丝氨酸Ser	2.74	0.30
谷氨酸Glu	23.56	2.56
			脯氨酸Pro	5.14	0.56
甘氨酸Gly	2.05	0.23
			丙氨酸Ala	2.01	0.22
半胱氨酸Cys	0.39	0.04
			缬氨酸Val	2.62	0.29
蛋氨酶Met	0.87	0.10
			异亮氨酸Ile	2.38	0.26
亮氨酸Leu	4.39	0.48
			酪氨酸Tyr	0.62	0.07
苯丙氨酸Phe	2.02	0.22
			赖氨酸Lys	1.26	0.14
组氨酸His	1.03	0.11
			精氨酸Arg	0.17	0.02
合计	55.44	6.09

            表3喷雾干燥品的分析值

分析项目	含量(g/100g)	按每克氮计算的含量(g/gN)
			谷氨酸*	29.9	2.59
总氮量	9.12	1.00
			总氨基酸游离量	55.4	6.09
食盐	4.37	0.48
			氨态氮	0.48	0.053
还原糖	1.33	0.149

*以谷氨酸钠计算

产业上的可利用性

本发明提供了谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物，利用此微生物培养物可以高效地制造蛋白水解物。得到的蛋白水解物，因谷氨酸含量高，所以呈味力强，作调味料的利用价值很高。

Claims (8)

1．谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物的调制方法，其特征在于消除具有产生谷氨酰胺酶能力的微生物培养物中的产物抑制作用，并在培养中期根据需要提供氮源。

2．权利要求1所述的发明方法，其中通过在培养中连续或间歇地供给碳源来消除产物抑制。

3．权利要求1所述的发明方法，其中具有产生谷氨酰胺酶能力的微生物为曲霉或酵母。

4．由权利要求1的发明方法调制出的谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物。

5．蛋白质水解物的制备方法，其特征在于使权利要求4所述的谷氨酰胺酶活性增强的微生物培养物，在有蛋白酶、无盐或食盐浓度3％(W/V)以下的条件下作用于蛋白质。

6．权利要求5的蛋白水解物的制备方法，其特征在于当微生物培养物作用于蛋白质时，开始边通气边搅拌，使反应在15-39℃的温度范围内进行，其后停止通气，使反应在40-60℃的温度范围内进行。

7．由权利要求5或6的发明方法制备蛋白水解物。

8．具有下述特征的蛋白水解物：

(a)以小麦谷蛋白为原料；

(b)总固形物的谷氨酸含量以谷氨酸钠计为16-36(W/W)；

(c)总固形物中总氮量为8-13％(W/W)；

(d)总固形物中总氨基酸含量为40-72％(W/W)；

(e)总固形物中食盐含量为14％(W/W)以下；

(f)总固型物中还原糖含量5％(W/W)以下；

(g)不含一氯羟丙醇类及二氯丙醇类。