KR20010044622A - 광범위 피부질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부를 구성하는 주요 지질 성분들로 구성되어 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 어린선, 세균 감염성 피부질환, 소양증 및 소양증으로 비롯된 홍반, 피부창상, 균열, 궤양 등을 치유 또는 개선시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로, 통상의 피부 적용용 기재 또는 담체 30∼90 중량% ; 스핑고리피드 장쇄염기 0.01∼5.0 중량% ; 리소포스파티딜산 0.001∼1.0 중량% 및 유기 또는 무기 첨가제 1∼40 중량%를 함유하는 광범위 피부질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

Description

광범위 피부질환 치료용 조성물{Therapeutic composition for broad spectrum dermal disease}

본 발명은 아토피 피부염과 같이 피부장벽의 손상으로 야기되는 피부질환의 근원적인 치료제로 사용할 수 있는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 손상된 피부장벽을 정상적으로 복구시켜 피부의 보습기능과 선택적 투과성을 회복시킴으로써 외부 자극에 의한 피부발작 증세를 최대한 억제하거나 완화시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신, 테트라아세틸파이토스핑고신, 헥사노일파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신 인산염 등으로 이루어진 군에서 선택된 스핑고리피드 장쇄염기 0.01∼5 중량% 및 리소스테로일포스파티딜산(18:0), 리소올레오일포스파티딜산(18:1), 리소팔미토일포스파티딜산(16:0) 또는 계란 난황이나 콩에서 유래하는 천연의 리소포스파티딜산 0.001∼1 중량%를 함유하는 광범위 피부질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

건선, 아토피성 피부염 등 많은 피부질환은 21세기에도 여전히 암, 에이즈, 치매 등과 함께 인류가 해결해야 할 난치병으로 알려지고 있다. 아직도 그 원인이 정확하게 밝혀지지 않고 있으며 근본적인 치료법이 개발되지 않고 있는 병이다.

다만 유전적, 환경적 그리고 면역학적 요인들이 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 추측되고 있으며 만성적이며 주기적인 발병과 재발을 특징으로 하고 있다. 이들 피부병은 치명적인 질환은 아니지만 많은 환자들에게 있어서는 일상생활을 영위하는데 심각한 장애를 초래하고 있으며, 특히 어린이 등 청소년들에게는 정서불안, 집중력의 감소 등 학업에 지장을 주고 있어 사회적으로도 문제가 되고 있다.

예를 들어, 아토피성 피부염의 경우 환자의 85%가 5세 이전에 발병하고 이들 가운데 60%는 성인이 되어서도 아토피성 피부염 증세를 지니고 있다고 한다. 대체로 전체 인구의 5∼10%가 이러한 질병을 경험하는 것으로 알려졌으나 문제는 환경적 요인에 의해 발병율이 점차 증가하고 있는데 있다. 일례로 미국의 경우 1970년대보다 최근에는 환자 발병율이 3배나 증가하였다는 보고가 이를 뒷받침한다.

한국은 세계적으로도 아토피 환자의 발병율이 높은 국가에 속하는데 이는 우리의 주거 환경이 아파트 위주로 되어가기 때문일 것으로 생각된다. 미국의 조사 보고서에 의하면 응답자의 56%가 사회생활에 불편을 느끼고 있다고 했으며 80%는 수면장애를 경험한 것으로 나타났다.

현재까지는 아토피성 피부염을 완치할 수 있는 방법이 없으며 주요 치료방법으로는 스테로이드계 연고나 항히스타민제 등이 주로 사용되고 있으며, 병변의 진행에 따라 수반되는 피부감염증의 치료로 항생제가 사용되기도 하며 심한 경우 자외선 조사나 면역억제제 등이 사용되기도 한다.

이러한 치료방법의 배경은 마크로파아지와 T Cell의 비정상 기능이 아토피 병증의 중심원인이며, 인터루킨 4 및 5의 과생산이 병부위의 피부조직에서 관찰되고 있는데 이것이 아토피 피부염의 특징인 IgE와 eosinophilia의 고농도 현상과 밀접한 관계가 있을 것으로 보여지고 있기 때문이다(Ohmen JD et.al., J Immunol, 1995 ; 154 : 1956-1963 - Overproduction of IL-10, Hamid Q et.al., J Clin Invest, 1994 ; 94 : 870-876 - Cytokine expression).

그러나 피부과 전문의 등은 스테로이드의 장기 처방으로 야기되는 부작용을 경고하고 있으며, 일반적으로 스테로이드의 사용 중단에 의해 병변이 재발하는 것이 관찰된다. 외용 또는 경구용 스테로이드 호르몬제의 장기적인 사용은 실제로 피부층을 얇게 하거나 골다공증의 유발 및 어린이의 경우 성장저해를 야기하기도 한다. 따라서 현재까지의 많은 연구는 부작용이 적은 스테로이드계 물질의 개발에 초점이 모아졌으며 2000년도 미국 피부과학 아카데미 정기학술대회에서 발표된 내용들도 비스테로이드(non-steroid) 또는 스테로이드 소량함유(steroid-sparing) 제재의 개발이 최신 동향임을 보여주고 있다.

본 발명의 핵심요소는 아토피 피부염과 같이 피부장벽의 손상으로 야기되는 피부질환을 근원적으로 치료할 수 있는 의약 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 손상된 피부장벽을 정상적으로 복구시켜 피부의 보습기능과 선택적 투과성을 회복시킴으로써 외부 자극에 의한 피부발작 증세를 최대한 억제하거나 완화시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부장벽을 정상적으로 복구시켜주는 성분과 함께 아토피 피부염의 특징인 피부염증, 가려움증 및 피부의 건조화, 세균 감염증을 해소할 수 있는 성분으로서 피부 지질의 한 성분인 스핑고리피드 장쇄염기인 파이토스핑고신 또는 그 유도체와 리소포스파디딜산 등 기능성 인지질을 포함하는 광범위 피부질환 치료용 조성물을 개발한 것이다.

도 1은 본원 발명 실시예 1의 급성 피부장벽 실험을 통한 본원 발명의 조성물과 대조군간의 피부장벽 복원력을 나타낸 도표이다. cx 33%는 실시예 1의 조성물 1을 나타내고, base는 조성물 2를 나타내며, None은 무처치구를 나타낸다.

도 2a는 본원 발명 실시예 1의 급성 피부장벽 실험에서 조성물 1의 처치시 피부장벽 복원사진이다.

도 2b는 본원 발명 실시예 1의 급성 피부장벽 실험에서 무처치구의 피부장벽 복원사진이다.

도 3은 본원 발명의 리소포스파티딜산과 스핑고리피드 장쇄염기 조성물의 상처 치유효과를 무처치구, 리소포스파티딜산 단독 처치구 및 스핑고리피드 장쇄염기 단독 처치구와 비교하여 나타낸 도표이다.

도 4a 및 도 4b는 피부 표피 사진으로, 상처 치유효과를 나타내고 있다.

도 5는 본원 발명 실시예 5의 테트라아세틸파이토스핑고신의 항균력을 나타낸 도표이다. 본 항균력 테스트에 사용된 균주는 프로피오니 박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스종, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)및 비듬 원인균인 피티로스포럼 오발레(Pityrosporum ovale)이다.

도 6은 본원 발명 실시예 6의 프로테인 키나제 C(PKC)의 억제효과를 나타낸 도표이다. 본 시험에 사용된 파이토스핑고신, 테트라아세틸파이토스핑고신, N-아세틸파이토스핑고신의 PKC 억제효과가 낮은 농도에서도 우수함을 나타낸다.

따라서 본 발명의 목적은 통상의 피부 적용용 기재 또는 담체 30∼90 중량% ; 스핑고리피드 장쇄염기 0.01∼5.0 중량% ; 리소포스파티딜산 0.001∼1.0 중량% 및 유기 또는 무기 첨가제 1∼40 중량%를 함유하는 광범위 피부질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

한편, 상기 스핑고리피드 장쇄염기는 파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신, 테트라아세틸파이토스핑고신, 헥사노일파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신 인산염 등에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로 한다.

한편, 상기 유기 첨가제 중에는 세라마이드, 콜레스테롤 및 지방산이 정상 피부의 조성에 준하여 40∼60% : 20∼30% : 20∼30% 비율로 함유되어 있음을 특징으로 한다.

또한, 상기 세라마이드는 세라마이드 3, 세라마이드 6 및 이들의 혼합물로서 그 입체화학적 조성이 인체 피부지질을 구성하고 있는 것과 동일함을 특징으로 한다.

또한 상기의 리소포스파티딜산으로는 리소스테로일포스파티딜산(18:0), 리소올레오일포스파티딜산(18:1), 리소팔미토일포스파티딜산(16:0) 또는 계란 난황이나 콩에서 유래하는 천연의 리소포스파티딜산을 0.001∼1 중량%를 함유하는 광범위 피부질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

한편, 상기 조성물은 아토피성 피부염, 습진, 건선에서 보이는 피부각질 과각화, 피부염증, 소양증, 세균감염증 또는 창상 등에 치료효과를 나타냄을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 조성으로 구성된 통상의 피부용 담체를 사용한 크림, 로션, 연고, 스킨, 에센스, 바디워시, 샴푸 조성물 등을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물의 장점으로는 아토피 피부염의 치료에 주로 사용되는 스테로이드 호르몬제와 항생제를 사용하지 않고 그와 유사한 효능을 발휘할 수 있다는 점과 본 발명의 핵심 성분인 세라마이드, 스핑고리피드 장쇄염기류 및 리소포스파티딜산 등이 이미 피부에 존재하는 성분으로 피부에 장기간 사용하여도 피부의 자연스러운 대사작용에 의해 부작용이 전혀 없다는 점이다.

스핑고리피드의 일종인 세라마이드는 피부의 보습력을 결정하는 주요한 피부지질 성분으로서 이미 주요 화장품의 기능성 원료로 사용되어 왔다.

연구보고서에 의하면 아토피성 피부, 건선, 여드름 피부에는 세라마이드 함량이 정상 피부에 비해 현저히 낮은 것으로 조사되고 있으며 아토피성 피부의 경우 피부에 존재하는 6가지 세라마이드 중에서도 세라마이드 3의 함량은 40% 이상 낮아져 있는 것으로 조사되고 있어 세라마이드 3의 피부지질 내 함량이 다양한 피부질환과 직접 연관이 되어 있는 것으로 밝혀졌다.

세라마이드에 의한 피부보습 효과는 2가지 측면에서 이루어진다. 피부장벽의 구조를 살펴보면 각질화된 죽은 피부세포가 벽돌처럼 쌓여 있고 그 사이 간극을 세라마이드, 콜레스테롤 그리고 지방산이 적절한 비율로(세라마이드 : 콜레스테롤 : 지방산 = 45% : 25% : 25%) 혼합되어 수분의 증발을 억제하는 지질막(LIPID LAMELLA BARRIER)을 형성하는 "BRICS ＆ MOTAR MODEL" 구조이다. 건강한 피부는 끊임없이 새로운 피부장벽을 만들어 내서 피부의 항상성을 유지하게 된다.

피부장벽에 손상이 발생하면 피부세포는 새로운 피부장벽 성분들을 생합성하여 공급하는데 이때 세라마이드의 공급이 제일 늦게 이루어진다. 따라서 피부에서 세라마이드 함량이 부족하게 되면 피부장벽의 손상은 빨리 복구되지 않고, 이로 인해 피부내의 수분을 유지할 수 없게 된다. 세라마이드에 의한 피부보습의 두 번째 측면은 피부내 존재하는 수분의 1/3 정도가 세라마이드에 결합된 형태인 BOUND WATER로서 존재한다는 것이다. 따라서 피부장벽을 구성하는 지질 가운데 세라마이드가 피부보습의 유지에 결정적인 영향을 미치게 되는 것이다.

현재까지는 피부장벽의 손상을 단순히 피부 보습력의 저하에만 국한시켜 온 경향으로 인하여 세라마이드의 기능을 단순 보습제로서 인식해온 것이 사실이다. 그러나 피부장벽은 단순히 피부의 보습 균형을 유지하는 기능 이외에도 피부를 자극하는 알러젠이나 독성물질의 투과에 대한 장벽기능도 가지고 있는 것으로 밝혀지고 있다.

따라서 피부장벽의 손상은 알러젠이나 독성물질에 대한 장벽기능의 저하라는 보다 심각한 결과를 초래하게 된다. 일례로 피부장벽의 손상이 심한 Lamellar Ichyosis 환자의 경우 살리실릭산이나 lindane에 의한 급성독성이 유발되는 것이 보고되고 있다(JAMA 151:372-374, 1953, Arch Dermatol, 123:1056-1058, 1987).

피부의 보습력을 결정하는 피부 각질층에는 6가지 종류의 세라마이드가 존재한다. 이들 세라마이드는 그 전구체인 스핑고신 또는 파이토스핑고신에 따라 세라마이드 1, 2, 3, 4, 5, 6으로 분류되는데 피부의 각질층에서 발견되는 세라마이드는 모두 순수한 세라마이드로서 당, 인산 또는 콜린기 등이 붙어 있지 않은 소수성 세라마이드이다. 사람 피부에 존재하는 세라마이드는 그 입체화학적 구조가 독특한 천연구조만이 존재하며 실제로도 이러한 천연구조의 세라마이드만이 손상된 피부 각질층을 본래의 상태로 복원할 수 있다.

한편 동물성 또는 식물성 세라마이드는 당이 붙어있는 형태로서 손상된 피부장벽의 복원에는 적당하지 않으며 화학 합성으로 생산된 유사 세라마이드는 피부층에서 자연적인 대사가 이루어지지 않고 축적이 될 수 있어 장기적인 사용시에는 오히려 피부 장벽을 손상시킬 수 있고 또한 천연 세라마이드가 가지는 생리활성 기능이 없다.

피부에 존재하는 6종류의 세라마이드중 특히 세라마이드 3의 감소가 피부의 수분증발(Transepidermal Water Loss : TEWL)과 상관관계가 가장 큰 것으로 알려졌다(Acta Derm Venereol, 1998: 78: 27-30). 또한, 아토피성 피부염 환자의 경우는 환부외의 피부에서도 피부지질 중에 세라마이드의 함량이 역시 현저히 낮게 나타나고 있다. 이는 아토피 환자의 병변을 치유 또는 개선하기 위해서는 국소용 조성물과 함께 향후 병변부로 발전할 가능성을 사전에 예방하는 차원에서 피부의 장벽기능을 강화할 수 있는 전신용, 또는 일상용 조성의 사용을 병행할 필요가 있음을 시사한다.

본 발명의 광범위 피부질환 치료용 조성물의 피부질환 치료 효과를 살펴보면 다음과 같다.

1. 피부홍반 등 염증완화 및 민감성 피부개선 효과

일반적으로 항염증제는 프로테인 키나제 C(이하 PKC) 억제기능을 가지고 있으며, 많은 PKC 활성 억제물질들이 항염증제로서 개발되고 있다. 염증유발의 생화학적 경로를 보면 외부 자극에 의해 PKC 활성이 높아지고, 이어서 포스포리파제 D(이하 PLD)의 활성이 증가되면서 염증반응이 진행된다.

본 발명의 핵심성분중 하나인 스핑고리피드 장쇄염기는 PKC 및 PLD 활성을 현저히 저하시키는 효과를 가지고 있음이 확인되었으며, 이는 현재 피부자극 완화제로 통상적으로 사용되고 있는 글리치리진계의 피부 자극 완화제와 비교했을 때에도 우수한 것으로 나타났다. 또한 부신피질 호르몬제는 용량 의존성으로 랑게르한스 세포표면에 표지자의 발현과 항원전달 능력을 감소시켜 그 효능을 나타낸다.

한편, 자외선 조사에 의한 아토피성 피부염의 치료방법은 자외선 조사에 의한 랑게르한스 세포의 밀도나 항원전달 능력을 조절하여 치료효과를 보고자 함이다. 본 발명의 구성 성분인 테트라아세틸파이토스핑고신을 비롯한 스핑고리피드 장쇄염기들은 피부에 도포했을 때 랑게르한스 세포의 밀도를 50∼80% 감소시키는 것으로 나타났으며 이러한 결과는 피부의 과민반응에 의한 소양증, 발진 등을 진정시키는 효과로 나타날 것으로 기대되고 있다.

이상의 결과는 스핑고리피드 장쇄염기가 단독으로 또는 같은 유도체군 내의 2∼3종류의 조합으로 제조되는 조합물이 기존의 스테로이드 호르몬제나 면역억제제가 가지는 부작용의 위험이 없으면서 동일한 기능을 나타낼 수 있음을 보여주고 있다.

2. 상처 치료 및 상재균 콘트롤

아토피 피부염 환자의 환부에서는 화농균으로 알려진 포도상 구균이 정상 피부에서보다 10∼20배 많이 검출되고 있다. 많은 경우 아토피 환자들은 가려움증으로 인하여 취침 중에도 심하게 긁어 상처를 내게 되는데, 이때 감염된 포도상 구균은 아토피 피부염의 염증을 유발하는 한 요인이 되며, 더 나아가서는 피부 각질층의 세라마이드를 분해하는 효소를 분비하여 세라마이드 결핍증을 유발하기도 한다(Int'l J Dermatology, 1990, 29: 579-582).

오래전부터 피부 각질층에는 항균 물질이 존재하여 외부로부터 침입하는 세균에 대한 1차적인 방어체계를 이루고 있다는 것이 알려져 왔다. 최근에는 이 항균 물질이 파이토스핑고신, 스핑고신 등 세라마이드의 전구체인 것이 미국 캘리포니아 주립대 의대 과학자들에 의하여 밝혀졌다. 이러한 특성은 현재 항생제 과다 사용으로 인한 내성균 유발 문제를 해결하면서 만성적 피부질환을 치유할 수 있는 방법이 될 것이다. 실제로 영국 리드대학의 약 10년간에 걸친 임상병리학적 조사연구에 의하면 여드름을 비롯한 피부병 치료제로서 항생제를 장기적으로 바르고 있는 환자의 60% 이상에서 항생제에 내성을 나타내는 세균이 검출되었다고 한다.

본 발명에서는 지금까지 습진, 아토피성 피부염, 건선, 소양증, 어린선 및 여드름 등 염증, 홍반, 피부장벽의 이상과 함께 부수적으로 발생하는 세균감염증 치료효과를 보기 위하여 통상적으로 사용되고있는 스테로이드 호르몬제, 레티노이드계 제재, 면역억제재 및 항생제를 사용하지 않고도 상기의 피부질환에 광범위하게 효과가 있는 조성물을 제시하고 있다.

본 발명의 조성물의 주요 성분인 스핑고리피드 장쇄염기는 항염증의 효과를 가진 스테로이드 호르몬제나 레티노이드류, 발작성 피부 민감증을 완화시켜주는 면역억제제, 그리고 항생제의 기능을 대신하거나 그 사용량과 사용빈도를 크게 낮출 수 있는 효과를 낼 수 있다. 또한 심한 피부의 소양증에 의해 심하게 긁은 상처, 피부의 균열 등을 치유하기 위해서는 손상된 피부조직과 혈관의 재생효과가 있는 리소포스파디딜산이 스핑고리피드 장쇄염기와 적절히 조합되어 상기 질환으로 유발된 피부조직의 손상 및 상흔을 치유하는 상승효과가 있다.

리소포스파티딜산은 리소포스파티딜 콜린과 더불어 생체내의 여러 막에 존재하는 것으로서 생체의 트랜스 멤브레인 시그날링에 관여하는 중요한 인지질의 하나이다. 리소포스파티딜산은 세포질의 Ca++의 증가, Mitogen-Activated Protein Kinase의 활성화에 관여한다. 이외에도 리소포스파티딜산은 세포간 염증반응에 관여하는 중간자로 작용하며 혈액응고, 근육 및 피브로브라스트의 수축반응 및 증식에 관여하는 인자로 알려져 있다. 특히 스핑고신-1-인산과 함께 혈관세포 부착인자의 발현유도에 관여하는 것으로 알려지고 있으며 염증반응의 리셉터로 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀지고 있다. 리소포스파티딜산은 활성화된 혈소판에서 분비되며 smooth muscle과 fibroblast의 증식에 관여하여 염증성 호흡기 질환이 천식에 관여할 것으로 예상할 수 있으며 혈관세포 부착인자의 발현유도에 관여함으로 인해 상처의 빠른 치유 또는 신생혈관의 생성과 밀접히 관여할 것으로 판단된다.

한편 손상된 피부조직의 재생은 진피, 상피와 함께 피부 각질층의 복원도 이루어져야 한다. 피부 각질층 즉 피부장벽의 복원에는 주요 성분인 세라마이드의 공급이 필수적이다. 미국 특허 제5,578,641호에 의하면 스핑고리피드 장쇄염기의 국소적용이 피부내 세라마이드 합성을 50% 이상 증진시키는 것으로 나타났다. 그러나 세라마이드의 생합성이 다른 피부지질의 생합성보다 늦게 이루어지므로 조성물 가운데 세라마이드를 비롯하여 피부장벽을 구성하는 주요 성분인 콜레스테롤과 지방산을 적절히 배합한 기재를 사용하여 스핑고리피드 장쇄염기와 리소포스파티딜산의 약리적 효능이 극대화되도록 하였다.

본 발명에서 사용된 스핑고리피드 장쇄염기류는 미국 특허 제5,958,742호에 제시한 방법으로 제조되었으며 리소포스파티딜산의 경우 난황 또는 콩에서 분리된 레시틴으로부터 분액정제하여 사용하거나 리소스테로일포스파티딜산(18:0), 리소 올레오일포스파티딜산(18:1), 리소팔미토일포스파티딜산(16:0)을 사용하였다. 본 발명에서는 여러 연구를 통해 파이토스핑고신, N-아세틸파이토스핑고신 및 테트라아세틸파이토스핑고신 등 스핑고리피드 장쇄염기류가 PKC, PLD 활성억제효과, 항균효과 및 피부세포의 세라마이드 합성촉진 효과 등은 유사하나 물리적 성질에서는 서로간에 상당한 차이를 보이고 있음을 밝혀냈으며 피부용 국소 조성물 제형의 제재 측면에서는 다른 성분과의 상용성, 용해도, 안정성 및 피부 침투성에서 테트라아세틸파이토스핑고신이 가장 우수함을 알 수 있었다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) 급성 피부장벽 실험

본 발명의 효과를 파악하기 위해 세라마이드 및 스핑고리피드 장쇄염기류 및 리소포스파티딜산을 첨가하여 표 1과 같은 조성으로 아토피 피부염 치료용 조성물을 얻었다.

각 크림 조성물의 활성성분

	조성물 1	조성물 2
세라마이드류	1.17	0
스핑고리피드 장쇄염기류	0.495	0
콜레스테롤	0.825	0
유리 지방산	0.99	0
리소포스파티딜산	0.1	0
글리세린	4	4
1,3-부티렌 글리콜	2	2
Carbopol 940	0.2	0.2
TEA	0.18	0.18
Germall 115	0.2	0.2
Phytosqualane	15	15
DC-345	5	5
기타	31.92	35.5
증류수	38.12	41.7

상기의 방법으로 만들어진 조성물의 피부장벽 복원효과를 파악하기 위하여 다음과 같은 급성 피부장벽 복원실험을 실시하였다. 우선 생후 8∼12주령의 헤어리스 마우스의 등의 양면의 피부 수분 증발량(TEWL)을 측정한 후(정상피부 약 10 ±2) 동일한 위치에 스카치 테이프를 붙였다 떼어내는 것을 약 5∼10회 정도 반복하면서 피부의 수분 증발량이 40∼50정도가 될 때까지 계속한다.

헤어리스 마우스의 등쪽 피부를 스카치 테이프를 이용하여 손상시키고 한쪽 등에는 본 발명의 조성물을 12시간 간격으로 도포(손상직후, 12시간 경과후, 24시간 경과후, 36시간 경과후)하고 다른 한쪽 등에는 아무것도 도포하지 않은 대조군으로 하여 시간의 경과(초기, 손상직후, 2시간 경과후, 6시간 경과후, 24시간 경과후, 48시간 경과후)에 따라 수분 증발량을 측정하여 피부장벽의 복원정도를 파악하였다.

각 크림 조성물의 장벽 복원력(% recovery)

시 간	조성물 1	무처치구	조성물 2
0	0.0	0.0	0.0
2	45.1	27.1	17.5
6	68.5	51.1	39.2
24	85.6	75.9	69.4
48	100	89.6	79.1

표 2 및 도 1에 나타난 바와 같이, 무처치구 및 조성물 2에 비해 조성물 1은 피부장벽을 빠르게 복원하는 것을 알 수 있으며 48시간에 100% 복원되었음을 알 수 있었다. 즉, 본원 발명의 스핑고리피드 장쇄염기류와 리소포스파티딜산을 포함하는 조성물의 경우 48시간에 100% 피부장벽 복원효과를 나타낸 것이다.

도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 현미경을 이용한 피부 조직의 검사에서도 무처치구에 비해 피부보호막(Stratum corneum)의 재생도 우수하게 일어남을 알 수 있었다.

도 3은 본원 발명의 리소포스파티딜산과 스핑고리피드 장쇄염기 조성물의 상처 치유효과를 무처치구, 리소포스파티딜산 단독 처치구 및 스핑고리피드 장쇄염기 단독 처치구와 비교하여 나타낸 도표이며, 도 4a 및 도 4b는 피부 표피 사진으로 상처 치유효과를 나타내고 있다.

(실시예 2) 임상실험

본 발명의 아토피 피부염 치료효과를 파악하기 위하여 아토피 피부염 환자를 대상으로 임상실험을 실시하였다.

아토피 피부염 환자의 병변 부위 및 비병변 부위의 수분증발량, 함수정도, pH 및 화농균의 밀식정도를 측정하여 피부상태를 검사한 후 본 발명의 조성물을 하루 2회씩 병변부위에 2주간 도포하여 피부상태의 개선정도를 파악하여 아토피 피부염의 치료효과를 파악하였다. 또한, 가려움증, 홍반, 염증을 동반한 상처의 완화효과를 종합적으로 분석하여 본 발명품의 효과를 파악하였다.

	초기 피부상태	2주간 도포후 피부상태 변화
	TEWL	Hydration	pH	미생물 분포	TEWL	Hydration	pH	미생물 분포
Case 1	병변부	64	26	7.2	154	16.6	46	5.7	39
	비병변부	14	53	5.7	30	13	55	5.5	15
Case 2	병변부	36.8	31	4.9	148	20.4	41	5.3	48
	비병변부	16.7	50	5.4	12	12.7	51	5.4	19
Case 3	병변부	46.2	23	5.6	6400	23.4	39	5.2	327
	비병변부	12.8	46	5.8	12	17.7	51	5.6	33
Case 4	병변부	46.3	25	5.8	89	19.8	38	5.6	25
	비병변부	17.9	39	6.2	3	16.9	46	5.5	5
Case 5	병변부	48.5	45	4.7	65	20.5	47	5.2	33
	비병변부	16	54	5.2	6	15.6	54	5.2	8

상기의 표에서 보는 바와 같이 아토피 피부염 환자의 경우 병변부와 비병변부의 수분 손실량(TEWL), 수분보유량(Hydration), pH 및 미생물 분포는 많은 차이를 보이고 있다.

수분 손실량의 경우는 보통의 정상피부의 12 부근에 비해 병변부위의 수분 손실량은 매우 높은 것으로 나타났으며 수분 보유량도 정상의 50∼60에 못미쳐 피부가 매우 건조함을 알 수 있다. 이는 피부의 수분 보호막이 매우 심하게 손상되어 수분의 증발이 심하게 일어남을 보여주는 것이다. 또한 피부 pH도 건강한 피부의 5.5 근처에서 다소 벗어나 있음을 알 수 있다. 미생물의 분포는 사람마다 매우 다르지만 아토피 피부염의 병변부위는 비병변부위에 비해 높았으며 가려움을 해소하기 위해 긁으면서 2차 감염이 일어나고 있음을 추정할 수 있다.

그러나 본 발명의 조성물 1을 2주간 도포함으로 인해 손상받은 피부가 많이 회복되어 수분 손실량이 많이 줄어들었고, 피부의 수분 보유량도 많이 늘어 건조함이 많이 해소되었음을 알 수 있었다. 또한 본 발명의 조성물 1을 도포함으로 인해 피부의 건조함이 줄어들면서 가려움증이 해소되어 긁지 않게 되었고 이로 인해 상처 및 염증이 줄어들고 2차 감염이 일어나지 않아 미생물 분포도 초기값에 비해 많이 줄어들었음을 알 수 있다.

또한 표 4와 같이 환자 스스로 느끼는 가려움증은 본 발명의 조성물 1을 도포함으로 인해 도포전에 비해 두드러지게 개선되었음을 알 수 있었으며, 이로 인해 홍반, 상처도 많이 치유되었음을 확인할 수 있었다.

	초기	2주간 도포후
	가려움증	홍반	상처	가려움증	홍반	상처
Case 1	+++++	++++	+++++	+	++	++
Case 2	+++++	+++	++	++	+	+
Case 3	+++++	+++++	+++++	+	++	+
Case 4	+++++	+++	+++	+	+	+
Case 5	+++++	+++++	+++++	+	+	+

+ : 심하지 않음, +++++ : 매우 심함

(실시예 3) 파이토스핑고신 및 이의 유도체 창상 치유효과 측정

실험동물 모델로서 암컷의 뉴질랜드 화이트 토끼(체중 2 Kg)를 사용하여 파이토스핑고신 및 이의 유도체 창상 치유효과를 측정하였다.

창상은 케타민(3∼4 mg/Kg) 근육주사로 마취시킨 후 양측 귀의 안쪽 털과 각질을 제거한 후 6 mm 피부조직검사용 punch(Stiefel사, 독일)로 귀 한쪽당 네 군데의 전층 창상을 낸다. 각 실험군당 10개의 창상에 대한 치유효과를 관찰하였다. 대조군으로서 창상부위에 10 ㎕ 0.1% BSA + PBS 용액을 2일 간격으로 처리하였고 실험군으로는 1) 스핑고리피드 장쇄염기류, 2) 리소포스파티딜산, 3) 스핑고리피드 장쇄염기류 및 리소포스파티틸산의 동시처방으로 여러가지 농도(5 μM, 10 μM, 50 μM)로 대조군과 동일한 방법으로 2일 간격으로 처리한 후 Cathreep(Nichiban Co., 일본)으로 밀봉하였다. 처리 후 4일째와 8일째에 토끼를 도살하여 조직학적 관찰을 하였다.

실험결과 대조구에 비해서 상처치유 효과가 매우 빠름을 확인할 수 있었으며 특히 표피층의 형성과 진피층 형성 과정인 과립층의 형성이 매우 빠르게 촉진되고 있음이 관찰되었다. 한편 새로운 혈관의 형성도 관찰되었다.

(실시예 4) 랑게르한스 세포에 미치는 파이토스핑고신 및 테트라아세틸파이토스핑고신 효과

피부면역반응을 매개하는 랑게르한스 세포는 과민성 피부면역 반응에 의한 피부증상을 치료하는 방법 중에는 랑게르한스 세포수의 조절이나 이의 면역전달 능력을 조절하는 치료가 있다. 스핑고리피드 장쇄염기가 랑게르한스 세포수 조절에 미치는 영향을 보기 위해 다음과 같은 실험을 하였다. 피부조직절편(Explant)에 1%의 샘플을 도포한 후 조직검사를 통해 랑게르한스 세포의 수를 조사한 결과 대조군에 비하여 스핑고리피드 샘플을 도포한 경우 26∼65% 감소하였다. 테트라아세틸파이토스핑고신보다 파이토스핑고신의 감소효과가 더 컸다.

(실시예 5) 테트라아세틸파이토스핑고신의 항균력 검사

테트라아세틸파이토스핑고신의 피부 유해균에 대한 항균력을 측정하기 위해 프로피오니 박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스종, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)및 비듬 원인균인 피티로스포럼 오발레(Pityrosporum ovale)를 대상으로 항균력을 검사하였다.

프로피오니 박테리움 아크네스에 대한 항균력을 검사하기 위해서 사용한 배지는 증류수 1L에 Brain Heart Infusion 25 g, 효모 추출물 5 g, Casitone 4 g, L-시스테인 HCl 1 g, 포도당 5 g, 가용성 전분 1 g, Monopotassium Phosphate 15 g, 황산암모늄 1 g, 황산마그네슘 0.2 g, 염화칼슘 0.02 g를 균등히 녹인 후 가압 살균한 후 사용하였고, BBL GasPak Anaerobic System을 이용하여 혐기조건을 형성한 후 37℃에서 약 3∼5일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 균수를 측정하여 항균력을 검사하였다.

한편 스타필로코커스 아우레우스 배양에는 Staphylococcus Medium 110(Difco사)을 사용하였고 바실러스 서브틸리스와 마이크로 코커스의 배양에는 Nurrient Agar를 사용하였고 아스퍼질러스 나이거의 배양에는 포테이토 덱스트로스 아가(Difco사, Potato Dextrose Agar)를 사용하였고 피티로 스포럼 오발레의 배양에는 펩톤 0.1%, 포도당 0.5%, 효모엑기스 0.01%, oxbile 0.4%, glyceryl monostarate 0.05%, 전지분유 0.1%, 글리세롤이 0.1% 포함한 배지를 사용하였다.

본 발명에 사용한 테트라아세틸파이토스핑고신의 시료는 에탄올을 이용하여 녹여 사용하였으며 항균효과를 파악하기 위해서는 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 각각의 미생물을 배양하여 10배씩 순차적으로 희석하여 각각의 배양배지에 도말하여 배양한 후 한 평판배지당 약 103∼104개의 집락을 형성하는 희석배수를 결정하였다. 각각의 미생물을 배양한 후 상기의 실험에서 결정된 희석배수로 희석하였다(이때 희석용액으로는 0.85% NaCl을 사용한다).

상기항의 방법으로 준비한 시료를 시료준비에 사용한 용매에 순차적으로 희석하여 원하는 농도를 만든 후 희석한 시료를 9 ㎖의 미생물 희석용액에 1 ㎖ 첨가하고 충분히 혼합하였다. 대조구의 경우는 시료용해에 사용한 용매를 사용한다. 37℃에서 30분∼1시간 방치한 후(가끔 혼합해 줌) 배지에 100 ㎕씩 도말한 후 각각의 배양조건에서 배양하고 배양이 끝난 후 집락의 수를 측정하였다.

도 5는 테트라아세틸파이토스핑고신의 항균력을 나타낸 도표이다. 본 항균력 테스트에 사용된 균주는 프로피오니 박테리움 아크네스, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 서브틸리스, 마이크로코커스종, 아스퍼질러스 나이거 및 비듬 원인균인 피티로스포럼 오발레이다.

(실시예 6) 크림 조성물의 항염증 효과 파악

크림 조성물의 항염증 효과를 파악하기 위하여 쥐의 피부 표피세포를 사용하여 프로테인 키나제 C(PKC)의 억제효과를 보았다. 표피세포를 2 ×10⁷세포/㎖이 되도록 배양한 후 파이토스핑고신 및 그 유도체의 함량이 100 μM, 400 μM이 되도록 첨가한 후 반응시켰다. 상기의 세포를 PBS로 세척한 후 호모게나이저로 세포를 파쇄하였다. 세포의 파쇄액을 원심분리하고 상등액을 DE52 컬럼을 통과시키면서 프로테인 키나제 C를 함유하는 부분을 얻었다. 활성화된 PKC 반응을 위해 PKC coactivation 5X buffer, PKC activation 5X buffer, PKC biotinylated peptide substrate, (32P)ATP mix를 각각 5 ㎕를 첨가한 튜브와 대조 반응을 보기 위해 PKC coactivation 5X buffer, Control 5X buffer, PKC biotinylated peptide substrate, (32P)ATP mix를 각각 5 ㎕ 함유한 튜브를 준비하고 각각에 5 ㎕의 효소를 첨가한 후 30℃에서 5분간 반응하였다. 반응후 12.5 ㎕의 반응정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 10 ㎕를 SAM2TM 멤브레인에 떨어뜨린 후 2M NaCl로 30초간 1회, 2M NaCl로 2분간 3회, 1% H₃PO₄와 2M NaCl용액에 2분간 4회, 증류수로 30초간 2회 세척한 후 건조한 후 방사성 동위원소를 측정하여 PKC 저해효과를 측정하였다.

도 6은 프로테인 키나제 C(PKC)의 억제효과를 나타낸 도표이다. 본 시험에 사용된 파이토스핑고신, 테트라아세틸파이토스핑고신, N-아세틸파이토스핑고신의 PKC 억제효과가 낮은 농도에서도 우수함을 나타낸다. 도 4중 SG와 DPG는 감초 추출물을 나타낸다.

도표에서 보는 바와 같이 스핑고신 장쇄염기를 처리함으로 인해 프로테인 키나제의 활성이 억제됨을 알 수 있다. 염증유발의 생화학적 경로를 보면 외부 자극에 의해 PKC 활성이 높아지고, 이어서 포스포리파제 D(이하 PLD)의 활성이 증가되면서 염증반응이 진행되는데 본원 발명 조성물을 처리함으로 인해 PKC의 활성을 억제함으로 이하 연속적인 염증반응이 억제될 수 있음을 확인하였다. 스핑고신 장쇄염기를 사용하는 것은 화장품에 주로 사용되어온 글리치리진계 자극완화제인 감초추출물에 비해 PKC 억제 효과가 큼을 알 수 있었다.

(실시예 7) 테트라아세틸파이토스핑고신(TAPS)의 피부세포에서의 대사과정 추적시험

국소적으로 적용된 TAPS, PS 등이 피부세포에서 글루코실 세라마이드의 합성을 50% 이상 촉진하는 것이 알려져 있다. 그러나 세포내에 침투한 TAPS가 어떤 경로를 거쳐 이러한 활성을 나타내는지는 보고되고 있지 않다. 본 연구에서는 TAPS를 비롯한 여러 파이토스핑고신 유도체가 human skin fibroblasts에 미치는 영향과 함께 대사경로를 조사하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

세포주는 Human skin fibroblasts를 사용하였다. 직경 7 cm 디쉬에 fibroblasts가 confluent한 조건에서, 에탄올-도데칸의 혼합용매에 테트라아세틸파이토스핑고신 및 파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신의 스톡 용액을 만들었다. 각각 20 μM씩 가한 후, 48시간 CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 분석을 위해 스핑고지질의 일반적 추출 방법에 따라 염기성 조건에서 가수분해를 37℃에서 하룻밤 정치하였고, 역상 컬럼을 통과시켜 염을 제거하였다. 결과의 분석은 TLC 전개 분석법을 사용하였다. TLC plate는 Merck의 Silicagel 60G의 HPTLC plate를 사용하였으며 전개용매는 중성지질을 보기 위하여 클로로포름/메탄올/진한 아세트산의 용액을 190/9/1로 섞어 사용하였다.

테트라아세틸파이토스핑고신을 비롯한 스핑고리피드 장쇄염기들은 투여량 20 μM (total media vol.: 6 ㎖, 절대 투여량: 83.3 nmol)에서 skin fibroblasts의 성장 및 외형의 변화에 영향을 주지 않았다. 이는 TAPS를 비롯한 파이토스핑고신과 그 유도체들이 진피를 구성하는 FIBROBLAST에 세포독성이 없다는 것을 시사한다. TAPS는 세포내에서 C2-파이토세라마이드로 전환되어 축적되었다. TAPS의 3곳의 -OH에 부가된 아세틸기가 세포내의 효소에 의하여 떨어져 나가 C2-파이토세라마이드로 전환된 것으로 추정된다. 일반적으로 C2-세라마이드는 천연 세라마이드보다 대사되는 속도가 늦어 24시간 이후에는 약 60∼70%가 남아있다는 보고와 일치하는 것이다(Hannun et al., JBC 1993).

이러한 결과는 TAPS가 비록 사람의 피부에 존재하는 스핑고리피드 형태가 아닌 화학적 구조를 가지고 있으나 피부세포에서는 자연상태의 스핑고리피드 대사 중간체로 전환이 되어 그 생리활성 기능을 나타내는 것을 증명하는 것이다. 또한 이는 TAPS가 다른 스핑고리피드 장쇄염기들 보다 세포독성이 적은 이유가 TAPS의 생리활성이 약한 것이 아니라 시간의 경과를 두고 서서히 세포내에서 활성이 있는 형태로 전환되면서 그 기능을 수행하기 때문인 것으로 해석할 수 있다.

본 발명의 효과는 피부장벽을 정상적으로 복구시켜주는 성분과 함께 아토피 피부염의 특징인 피부염증, 가려움증 및 피부의 건조화, 세균 감염증을 해소할 수 있는 성분으로서 피부 지질의 한 성분인 스핑고리피드 장쇄염기인 파이토스핑고신 또는 그 유도체와 리소포스파디딜산 등 기능성 인지질을 포함하는 광범위 피부질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

Claims (7)

1. 통상의 피부 적용용 기재 또는 담체 30∼90 중량% ; 스핑고리피드 장쇄염기 0.01∼5.0 중량% ; 리소포스파티딜산 0.001∼1.0 중량% 및 유기 또는 무기 첨가제 1∼40 중량%를 함유하는 광범위 피부질환 치료용 조성물
2. 제 1항에 있어서, 상기 스핑고리피드 장쇄염기는 파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신, 테트라아세틸파이토스핑고신, 헥사노일파이토스핑고신, 아세틸파이토스핑고신 인산염 등에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로 하는 광범위 피부질환 치료용 조성물
3. 제 1항에 있어서, 상기 유기 첨가제 중에는 세라마이드, 콜레스테롤 및 지방산이 정상 피부의 조성에 준하여 40∼60% : 20∼30% : 20∼30% 비율로 함유되어 있음을 특징으로 하는 광범위 피부질환 치료용 조성물
4. 제 3항에 있어서, 상기 세라마이드는 세라마이드 3, 세라마이드 6 및 이들의 혼합물로서 그 입체화학적 조성이 인체 피부지질을 구성하고 있는 것과 동일함을 특징으로 하는 광범위 피부질환 치료용 조성물
5. 제 1항에 있어서, 상기 리소포스파티딜산은 리소스테로일포스파티딜산(18:0), 리소올레오일포스파티딜산(18:1), 리소팔미토일포스파티딜산(16:0) 또는 계란 난황이나 콩에서 유래하는 천연의 리소포스파티딜산에서 선택된 1종 이상의 것임을 특징으로 하는 광범위 피부질환 치료용 조성물
6. 제 1항의 조성물을 아토피성 피부염, 습진, 건선에서 보이는 피부각질 과각화, 피부염증, 소양증, 세균감염증 또는 창상 등의 치료에 사용하는 방법
7. 통상의 피부 적용용 기재 및 담체를 사용하여 제조된 제 1항 조성의 크림, 로션, 연고, 스킨, 에센스, 바디워시, 샴푸