KR20010040474A - 생물전자 칩 상에서 유전이동법에 의한 생물입자의채널레스 분리 - Google Patents

생물전자 칩 상에서 유전이동법에 의한 생물입자의채널레스 분리 Download PDF

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징 쳉
에드워드 엘. 써드 쉘돈
레이 우
제임스 피. 오코넬
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해리 제이. 레온 하르트
나노겐 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 유전이동에 의한 세포 입자의 채널레스 (channel-less) 분리, 분리된 세포의 DC 고전압 펄스 전자 세포용해, 세포 용해물과 같은 초기 혼합물로부터 원하는 성분의 분리, 이러한 용해물의 효소 반응 중 하나 이상을 모두다 단일한 생물전자 칩 상에서 수행할 수 있는 디바이스 및 방법을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 카트리지 (10)이다. 이 카트리지 (10)은 인쇄회로기판 (14) 상에 미세제작된 실리콘 칩 (12)과, 이 칩 (12) 위에 설치되어 있고 유동 챔버를 형성하는 유동 셀 (16)을 포함한다. 카트리지 (10)은 또한 출력 핀 (22)이 있어서 전자 제어기에 전자적으로 접속된다. 칩 (12)는 원형 미세전극 (24) 및 반대전극 (34)를 다수 포함한다. 전극 (24)는 모든 전극과 그 위에 언져진 유동 셀 (16)에 도입된 샘플과의 직접적 접촉을 차단하는 보호층으로 코팅하는 것이 바람직하다. 투과층은 또한 최소 전기장에서 세포 부착을 감소시키는 데 도움이 되며, 특정 세포 포획을 위해 특정 항체를 고정시킬 수 있다. 이 칩 상에서는 여러 세포 혼합물로부터 특정 세포를 분리하고 세포용해하고 효소에 의해 소화시킬 수 있다.

Description

생물전자 칩 상에서 유전이동법에 의한 생물입자의 채널레스 분리 {Channel-less Separation of Bioparticles on a Bioelectronic Chip by Dielectrophoresis}
관련 출원 설명
이 출원은 1996년 9월 6일 출원되고 동시에 계류중인 미국 특허출원 제08/709,353호의 일부 계속 출원이며, 미국 특허출원 제08/709,353호의 명세서는 언급함으로써 마치 전체가 이 명세서에 기재된 것과 같이 여기에 도입된다.
연방 기금 지원 설명
이 발명은 미국 상무부가 응용기술 프로그램 (Advanced Technology Program) 의 일환으로 나노젠사 (Nanogen, Inc.)와 계약 95-08-009을 통해 정부 지원을 함으로써 실행되었다.
여러 분자생물학적 분석 및 면역 분석, 진단 분석 및 시험은 특히나 세포 샘플 (예를 들면, 혈액, 조직 등)을 채취하는 단계, 원하는 세포 물질을 분리하는 단계, 원하는 세포를 파괴하고 세포용해시켜서 원시 DNA 및 RNA (간략하게 나타내기 위해, 아래에서 언급된 DNA는 때에 따라 RNA도 의미한다) 및 모든 단백질을 방출시키는 단계, 초기 세포용해물 (lysate)을 정제하는 단계 (즉, 세포 부스러기를 제거하는 단계), 필요하다면 몇가지 효소 반응을 수행하여 세포용해물을 분석하는 단계를 기본적으로 포함한다.
유전이동법은 용액 상태에서 대전되거나 대전되지 않는 미세입자를 분리하는 대중적인 기술이 되었다. 본 발명의 이전에 보고된 기술은 거의 대부분 유리 슬라이드에 기초한 디바이스에서 수행되는데, 이 디바이스는 노출된 (즉, 벌거벗은) 교대 배치 전극들이 슬라이드 표현 상에 플레이팅되어 있고, 수백 마이크로리터 부피의 유동 챔버를 갖추고 있다. 이런 디바이스에서는 세포의 유전 특성에 따라, 적절한 전도도의 분리 완충액(들)과 적절한 진폭 및 주파수의 AC 신호를 선택함으로써 세포를 분리한다. 이런 종래의 디바이스는 다음과 같은 여러 가지 문제를 안고 있다. 첫번째 문제는 분리된 세포와 비분리된 세포 모두가 슬라이드의 노출된 유리 표면 및 노출된 전극 표면에 비특이적으로 결합한다는 것이다. 두번째 문제는 유동 챔버의 부피 (수백 마이크로미터)가 너무 크기 때문에, 초기에 전극에 보유된 세포들이 열의 대류에 의해 교란되고 밀려나게 된다. 세번째 문제점은 어떤 원치않는 세포를 세척해 버리는 것이 전극에 바람직하게 보유된 세포를 흩뜨러뜨리지 않고는 쉽게 수행될 수 없다는 점이다. 왜냐하면 원하는 세포 및 전극이 유체 흐름의 길목에 있어서 어떤 원치않는 세포를 포함하는 세척물의 흐름을 방해하기 때문이다.
세포를 파괴 또는 용해하면, 원시 DNA 및 RNA 물질이 다른 세포 구성성분들과 함께 방출된다. 본 발명의 이전에 발표된 전자 세포용해 기술은 마이크로칩 기재 디바이스와는 달리, 마크로디바이스에서 일련의 고전압 DC 펄스를 가해 수행되는 것이 보통이다. 이런 통상적인 전자 세포용해 기법은 다음과 같은 여러 문제점이 있다. 첫번째는 공업적 마크로디바이스에 의해 특정된 전자 세포용해 조건은 고분자량 (20 Kb 이상)의 DNA를 방출시키지 못한다. 고분자량 DNA 분자는 종래의 세포용해 방법에 의해 세포막에 생긴 구멍을 통과하는 데 맞지 않기 때문이다. 두번째 문제는, 세포용해 용기에 본래 방출된 일부 핵산이 용기의 표면에 비특이적으로 결합하기 때문에 손실된다는 것이다. 세번째 문제는 통상적인 전자 세포용해 마크로디바이스의 경우 독립된 유닛으로 기능하기 때문에, 유전이동 세포 분리 및 전자 세포용해를 동일한 모듈로 수행할 수 없다는 점이다.
그 다음 초기 세포용해물을 정제 (즉, 불필요한 세포 부스러기를 세척해 버리고 분리함) 후, 정제된 세포용해물을 효소 반응시켜, 혼성화, 검출 및 분석에 맞는 세포용해물을 제조한다. 그러한 반응으로는 세포용해물의 변성, 절단, 또는 증폭 등이 있다. 이러한 샘플 제조 및 DNA 처리 단계 이후에야 비로소 실질적인 혼성화 반응이 수행되며, 마지막으로 검출 및 데이타 환산을 통해 혼성화를 분석 결과로 전환한다. 이러한 통상적인 샘플 제조 및 처리 기술은 다음과 같은 몇 가지 문제가 있다. 첫째, 샘플 제조 및 처리 단계가 통상적으로 혼성화, 검출 및 분석의 다른 주요 단계와 별도로 분리되어 수행된다. 또한 이들 기술 대부분은 많은 수의 샘플에 대해 수많은 조작 (예를 들면 피펫팅, 원심분리, 전기영동)을 수행할 필요가 있다. 이런 조작은 때로 복잡하고 많은 시간이 소요되며, 일반적으로 높은 숙련도를 요구한다. 많은 기술들이 감도나 특이성 또는 반복재현성의 부족으로 인해 그 응용에 제한이 따른다. 예를 들어 핵산 혼성화 분석을 여러 진단 분야에 사용하는 것은 위와 같은 문제점으로 인해 제약이 따랐다.
세포를 분리하고 확인하는 유전이동법을 사용하려는 시도가 이루어져 왔다. 예를 들면 허버트 (Herbert)에게 허여된 미국 특허 제4,326,934호에서는 연속 유전이동법에 의한 세포 분류 방법 및 장치가 공개되어 있다. 세포 입자의 양성 및 음성 유전이동 둘다를 이용함으로써 세포가 분리되었다. 분리된 세포는 두 전극을 통해 이동한 세포의 특징적인 편향 거리를 관찰함으로써 특징분석 및 분류가 가능했다.
또한 월터 (Walter) 등에게 허여된 미국 특허 제5,344,535호는 유전이동에 의한 미생물 및 다른 입자의 특징분석을 위한 방법 및 장치를 기재했다. 여기서는 이들의 독특한 유전이동 수집 속도를 조화시킴으로써 세포의 특징을 규명했다.
월터 등에게 허여된 미국 특허 제5,569,367호는 교대 배치 전극 한쌍을 사용하여 혼합물을 분리하는 방법 및 장치를 개시한다. 이 장치에는 전류가 흐르는 교대 배치 전극 2개가 사용되며, 이 전극은 세포의 일직선 관통 흐름을 방해하며, 또한 불균일한 교번 전기장을 가함으로써 다른 종류의 세포들을 분획으로 분리한다. 이 전극 구조는 이 구조를 관통하는 흐름을 차단하도록 배열된 사이에 끼워진 (interleaved) 그리드형 구조로 이루어진다.
또한 특정 처리 단계들 또는 그 하위 단계를 함께 결합하기 위한 시도도 이루어져 왔다. 예컨데, 지지재 상의 DNA 프로브 어레이를 제조하기 위한 다양한 마이크로로봇계가 제안되었다. 그 예로 1992년 11월 1992 샌디에고 회의: 유전자 인식 (The 1992 San Diego Conference: Genetic Recognition)에서 비티 (Beattie)등은 특정 DNA 서열이 포함된 미세소적을 유리 기판 상에 미세제작된 개개의 샘플 웰로 침적시키는 마이크로로봇계를 사용했다. 포괄적인 샘플 제조계 및 진단계의 복수 단계를 포함시킨, 단일 칩이나 기판에 형성시키는 집적계를 묘사하려는 다양한 시도가 이루어져 왔다. 예들 들면 문헌 (A. Manz et al., "Miniaturized Total Chemical Analysis System: A Novel Concept For Chemical Sensing", Sensors and Actuators, B1(1990), pp.244-248)에는 모듈 구조의 소형화 TAS를 이루는 '통합적 화학분석계(TAS)'를 기재하고 있다. 샘플 채취, 샘플 수송, 임의의 필요한 화학 반응, 크로마토그래피에 의한 분리 및 검출이 자동적으로 수행된다. 제안된 집적계의 다른 것으로는 미국 특허 제5,451,500호 (Stapleton)이 있는데, 이 특허에서는 2차원 형식으로 캐리어를 포함하는 매트리스 내로 다수의 생물학적 샘플을 개별 투입하는, 표적 핵산 서열의 자동검출계를 기재하고 있다. 여러 형태의 캐리어가 여러 종류의 진단 시험 또는 시험 패널에 대해 설명되어 있다.
다양한 양상의 생물학적 샘플 제조 및 분석을 수행하기 위한 다양한 복수 전극계가 공개되어 있다. "마이크로닉 생물학적 샘플 분석용 실리콘 반도체 웨이퍼 (Silicon Semiconductor Wafer for Analyzing Micronic Biological Samples)"이란 제목의 미국 특허 제4,908,112호 (Pace)에는 반도체 디바이스에 모세관 크기의 도관이 채널에 의해 형성되어 있으며, 이 채널에 전극이 위치하여 도관을 통한 액체의 이동을 활성화시키는 분석적 분리 디바이스를 기재하고 있다. 이 특허에 설명된 바에 따르면, 상기 도관의 횡단 치수는 100 ㎛ 미만이다. 또한 분석 계기의 모든 기능 즉, 샘플 주입, 시약 도입, 정제, 검출, 신호 조건설정 회로, 논리 정보 및 온보드 지능 등이 단일 실리콘 웨이퍼 내로 통합될 수 있다고 기재되어 있다. "다수 전기장의 인가에 의한 분자 이동 방법 및 디바이스 (Method and Device for Moving Molecules by the Application of a Plurality of Electrical Fields)"란 제목의 미국 특허 제5,126,002호 (Soane et al.)에는 전극에 전압을 걸어줌으로써 도랑 (trench)을 통해 물질을 이동시키는 계를 설명하고 있으며, 여기서 선택된 성분들은 항원-항체로 채워진 여러 도랑으로 인도되며, 이때 소정의 대전 입자는 매질 내에서 움직이거나 또는 물리적 성질 또는 화학적 성질을 변형하는 것 등을 위해 상보적 성분, 염료, 형광 꼬리표, 방사성 표지, 효소 특이적 꼬리표 또는 다른 종류의 화합물과 접촉하게 된다. 전극에 전압을 걸어주면 복잡한 도랑망을 통해 세균 세포 또는 포유동물 세포 또는 바이러스가 분류될 수 있다. 여기서 전기장을 걸었을 때 도랑망을 통한 세포나 바이러스의 움직임은 움직이는 특정 물질의 크기 또는 전하량 또는 모양에 따라 달라진다. "센서 디바이스 (Sensor Devices)"란 제목의 미국 특허 제5,194,133호 (Clark)는 전분, 알긴네이트, 카라기난 또는 폴리아크릴아미드 중합체 겔 등의 물질이 포함된 긴 미세기계가공 채널이 기판 표면에 형성되어 있고 이 채널을 따라 기질이 함유된 샘플 유체가 통과할 때 샘플 유체의 분리를 유발하는, 상기 샘플 유체의 분석을 위한 센서 디바이스를 기재하고 있다. 이런 생물학적 물질로는 결합 단백질, 항체, 렉틴, 효소, 일련의 효소, 또는 지질 등이 있다.
여러 표면으로부터 DNA를 용출하는 디바이스도 여럿 공지되어 있다. 미국 특허 제5,340,449호 (발명자 Shukla, 발명의 명칭: Apparatus for Electroelution)에는 전기장에서 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 PVDF와 같은 막 등 고상 매트릭스 물질로부터 단백질, DNA, RNA 등의 거대분자를 용출시키는 계 및 방법을 기술하고 있다. 여기서는 분자량 컷오프 막에 의해 부분적으로 정해지는 부피 내로 고상으로부터 물질이 용출된다. 미국 특허 제5,434,049호 (발명자 Okano, 발명의 명칭 Separation of Polynucleotides Using Supports Having a Plurality of Electrode-Containing Cells)는 샘플 중의 표적 폴리뉴클레오티드 다수를 검출하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 개별 용기에 전압을 걸어주어 전극으로 기능하게 함으로써 포획된 표적 폴리뉴클레오티드를 용출시키는 단계를 포함하며, 이 용출된 물질은 그 다음 수집될 수 있다.
일반적으로 종래 기술의 방법들은 지극히 노동집약적이며, 시간 소모가 컸다. 하나의 공정 동안 또는 여러 공정 사이에 사람이 개입해야 하는 단계가 여럿 있기 때문에 오염 및 조작자의 실수가 있을 수 있으므로 부분적으로만 최적화되어 있다. 또한 개개의 공정을 수행하기 위해 다수의 기계나 복잡한 로봇계를 사용하는 것은 대형 실험실이 아니라면, 비용 및 물리적 공간 요건 측면에서 엄두를 내기 어렵다.
전술한 내용으로부터 명백한 바와 같이, 샘플 분리 및 제조 반응을 수행하기 위한 효과적인 기술을 제공하려는 시도가 수없이 이루어져 왔다. 그러나 앞서 말한 이유로 인해 이들 기술은 제한적이고 부족하다. 이런 다양한 접근 방식을 결합하여 완벽한 DNA 진단 분석을 수행할 수 있는 계를 형성하는 것이 쉽지는 않다. 이러한 계가 필요하다는 인식은 오래 되었으나, 만족할만한 해결책은 지금껏 제시되지 못했다.
생물 세포의 개선된 유전이동 분리법 및 분리된 세포의 개선된 생물학적 안정성을 제공할 방법 및 디바이스에 대한 요구는 계속되고 있다. 또한 세포 정제 및 분석을 향상시키고, 세포 분리, 정제 및 분석을 하나의 계로 집적화할 수 있는 방법 및 디바이스에 대한 끊임없는 요구도 있다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 넓게 보면 분자생물학적 샘플의 전자식 분리, 세포용해 (lysis) 및 진단 분석을 수행하는 디바이스 및 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는 유전이동에 의한 세포 입자의 채널레스 분리, 분리된 세포의 DC 고전압 펄스에 의한 전자 세포용해, 샘플 정제 (즉, 원하는 성분을 세포 용해물과 같은 초기 혼합물로부터 분리하는 것) 및(또는) 효소 반응(들)을 모두 샘플 중의 다양한 물질의 서로 다른 이동도 및(또는) 서로 다른 친화도를 이용하여 단일 생물전자 칩 상에서 수행할 수 있는 디바이스 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에서는 디바이스가 다수의 코팅 전극을 갖춘 미세제작 실리콘 칩을 포함한다. 상기 전극은 전극과 샘플 간의 직접적 접촉을 차단하는 보호층으로 코팅되는 것이 바람직하다. 칩에 피복 유동 셀을 부착시켜서 유입구 및 유출구가 있는 밀봉된 챔버를 형성하며, 여기서 유입구 및 유출구는 추가로 플라스틱 튜브에 부착되어 각각의 유입구 및 유출구를 따라 물질의 입출입을 가능하게 할 수 있다.
이러한 디바이스를 사용하는 방법의 일례는 디바이스에 도입할 세포 샘플을 제조하고 (예를 들면, 세포 분리 완충액 중의 현탁액) 이어서 유전이동시키는 것인데, 즉, 샘플을 유동 셀로 도입하고 (예를 들면 펌핑에 의해), 샘플에 전기장을 걸어 원하는 세포를 샘플로부터 유전이동에 의해 분리하고, 유동 셀을 통해 용액을 펌핑함으로써 원치 않는 세포를 세척해 버리고, 남아있는 (원하는) 세포를 하나 이상의 전자 펄스 시리즈로 처리하여 세포를 용해시키는 것고(거나) 이 세포용해물을 원하는 바에 따라 효소 반응(들)시키는 것이다.
따라서 본 발명의 기본적인 목적은 세포 분리, 용해 및(또는) 효소 반응을 수행하기 위한 디바이스 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포 분리, 용해 및(또는) 효소 반응(들)을 단일 칩 상에서 수행하여 피펫팅 및 원심분리 등의 기계적 조작을 생략할 수 있는 디바이스 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 원하는 세포의 균일한 분리를 달성하기 위한 투과층의 사용과 완충제와 전극 어드레싱의 조합을 제공하는 디바이스 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 추가 목적은 투과층을 사용함으로써 유동 챔버 및(또는) 전극에 세포가 비특이적으로 접착되는 것을 최소화한, 원하는 세포의 균일한 분리를 가능하게 하는 디바이스 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 원치 않는 세포를 유동 챔버 내에서 채널 없이 세척을 통해 용이하게 세척제거하는 디바이스 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포가 모양을 유지한 상태에서 그로부터 DNA와 RNA 또는 단백질이 방출될 수 있도록, 매우 국소적이고 통제된 방식으로 하나 이상의 고전압 DC 펄스 시리즈를 전극에 걸어주어 전극 상에 보유된 원하는 세포를 용해시키는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 세포용해물에 대한 효소 반응을 동일한 유동 챔버 내에서 수행하여 DNA 또는 RNA의 어떠한 손실도 일으키지 않으면서 오염 단백질로부터 핵산을 유리시키는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 조작, 즉 세포 분리, 세포 용해, DNA/RNA의 효소적 탈단백질화, 뉴클레아제에 의한 DNA/RNA 분해, DNA 및 RNA 혼성화, 면역 분석, 리간드 결합 반응 중 하나 이상을 단일 칩 상의 자급식 (self-contained) 유동 챔버 내에서 수행하는 것이다.
이 발명은 분자 및 생물학적 샘플의 능동적인 다단계 제조 및 진단 분석을 수행하는 디바이스 및 방법에 관한 것이다. 이 발명은 넓게 보면 전자식 세포 분리, 세포 용해(lysis) 및(또는) 효소 반응을 위한 디바이스 및 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 유전이동법에 의한 세포 입자의 채널레스 (channel-less) 분리, 분리된 세포의 DC 고전압 펄스에 의한 전자 세포용해 (electronic lysis), 및 효소 반응을 모두다 단일 생물전자 칩 (예를 들면 집적 분석계)에서 수행할 수 있는 디바이스 및 방법에 관한 것이다. 이런 조작은 다양한 분야, 예컨데 식품 품질 및 수질의 감시, 감염성 질병 진단학, 암 진단학, 골수 프로세싱 (예를 들면 간세포 분리 및 분석), 및 재판에 사용하기 위한 개인의 유전학적 신원확인 등에 유용하다. 또한 이런 방법 및 디바이스는 특정 부분집단의 RNA 연구를 목적으로 소수의 특정 종류의 세포를 다른 다량의 세포로부터 분리할 필요가 있는 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다.
도 1은 유체 튜브 및 검출창이 구비된 유동 챔버 및 마이크로칩을 보유한 본 발명의 디바이스의 상면도이다.
도 2는 여러 개의 원형 전극 및 반대전극(counterelectrode)을 나타낸, 투과층으로 코팅된 칩의 개략도이다.
도 3a는 각 전극이 그에 가장 인접한 전극과 반대의 바이어스를 갖는 5 X 5 배열의 원형 전극의 체커보드형 전자 어드레싱을 보여주는 개략도이다 (5 X 5 배열은 예시를 위한 목적으로 사용되었을 뿐이며, 이 어레이에는 전극이 25 개 이상 또는 미만으로도 포함될 수 있다).
도 3b는 도 3a에 나타낸 체커보드형 어드레싱에 대응하는 AC 전기장 분포의 컴퓨터 모델을 나타낸 개략도이며, 여기서는 각 전극에서 최대 전기장이, 전극 사이의 영역에서 최소의 전기장이 형성되는 규칙적인 전기장 분포가 얻어진다.
도 3c는 5 X 5 배열의 원형 전극의 스퀘어 웰형 전자 어드레싱의 개략도이며, 여기서 동일한 스퀘어 프레임 상의 전극은 동일한 바이어스를 가지며, 이는 가장 인접한 이웃 스퀘어 프레임(들) 상의 전극과는 반대이다.
도 3d는 도 3c에 나타낸 스퀘어 웰형 어드레싱에 대응하는 AC 전기장 분포의 컴퓨터 모델을 나타낸 개략도이다.
도 4a는 칩의 상세도이다.
도 4b는 도 3a 및 3b의 체커보드형 전자 어드레싱을 사용하여 대장균 (E. coli) 세포 샘플을 도 4a의 칩의 여러 전극 상에 보유되도록 하여 인간 혈액 세포 (적혈구 및 백혈구)로부터 분리하는 것을 보여준다.
도 5는 인간 혈액 세포를 세척, 제거한 후 도 4b의 보유된 대장균 세포를 보여준다.
도 6은 DC 파를 걸어주어, 도 4b 및 도 5에 나타낸 대장균 세포로부터 방출시키고 농축시킨 핵산 샘플을 보여준다.
도 7은 도 6의 핵산을 아가로오스 겔 전기영동하여 분석한 후 찍은 사진으로서, 게놈 DNA, 슈퍼코일형 플라스미드 DNA 및 RNA들까지의 모든 핵산이 전자 세포용해 이후에 세포로부터 방출되었음을 입증한다.
도 8a는 전자식 향상 혼성화를 통해 대장균으로부터 방출된 플라스미드 DNA가 특이적으로 포획되는 것을 입증하기 위한 혼성화 대조구를 보여준다.
도 8b는 도 8a의 혼성화 대조구와 함께, 대장균으로부터 방출된 플라스미드 DNA 샘플이 추가의 프로브에도 전자적으로 혼성화되는 샌드위치 분석 후 결과를 보여준다.
도 9a는 전자식 향상 혼성화를 통해 대장균으로부터 방출된 리보솜 RNA가 특이적으로 포획되는 것을 입증하기 위한 혼성화 대조구를 보여준다.
도 9b는 도 9a의 혼성화 대조구와 함께, 대장균으로부터 방출된 리보솜 16S RNA가 추가의 프로브에도 전자적으로 혼성화되는 샌드위치 분석 후 결과를 보여준다.
도 10a는 세척 후 본 발명의 칩의 표면도이다.
도 10b는 도 3a 및 3b에 나타낸 체커보드형 전자 어드레싱을 사용하여 HeLa 세포 샘플을 도 10a의 칩의 전극 상에 보유시키고 인간 혈액 세포 (적혈구 및 백혈구)로부터 분리하는 것을 보여준다.
도 10c는 인간 혈액 세포를 세척하여 제거한 후의 도 10b의 HeLa 세포 샘플을 보여준다.
도 10d는 염색한 후의 도 10b 및 10c의 HeLa 세포 샘플을 보여준다.
도 11a 및 11b는 세포 분리, 세포 용해, DNA/RNA의 효소적 탈단백질화 방법, DNA 또는 RNA 혼성화 중 하나 이상을 수행하기 위해 설계된 자급식 유동 챔버의 내부 개략도이다.
도 12a-d는 각기 서로 다른 4개의 마이크로칩 설계의 개략도이다.
본 발명은 유전이동에 의한 세포 입자의 채널레스 분리, 분리된 세포의 DC 고전압 펄스에 의한 전자 세포용해, 세포 용해물과 같은 초기 혼합물로부터 원하는 성분의 분리, 이러한 세포용해물의 효소 반응 중 하나 이상을 모두다 단일한 생물전자 칩 상에서 수행할 수 있는 디바이스 및 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 도 1에 나타낸 카트리지 (10)이다. 이 카트리지 (10)은 인쇄회로기판 (14) 상에 미세제작된 실리콘 칩 (12)과, 이 칩 (12) 위에 설치되어 있고 유체 튜브 (18a) 및 (18b)를 포함하는 유동 챔버를 형성하는 유동 셀 (16)과, 검출창 (20)을 포함한다. 상기 유동 챔버는 바람직하게는 부피가 약 10 ㎕ 이다. 카트리지 (10)은 또한 출력 핀 (22)가 있어서 전자 제어기 (예들 들면, 계기 또는 컴퓨터 (도시하지 않음))에 전자적으로 접속된다.
미세제작된 칩 (12)는 도 12에 보였다 (세부적인 것은 도 4a에 나타냄). 도시한 바와 같이, 칩 (12)는 원형 미세전극 (24) 및 반대전극 (34)를 다수 포함한다. 전극 (24)는 전극과 그 위에 언져진 유동 셀 (16)에 도입된 샘플과의 직접적 접촉을 차단하는 보호층으로 코팅하는 것이 바람직하다 (더 자세한 것은 아래에서 설명함).
바람직한 한 실시양태에서, 칩 (12)는 반대전극 (34) 4개 및 5 X 5 열의 백금 미세전극 (24)를 포함한다. 이 칩은 잘 알려진 표준적 반도체 가공 기술로 제작한다. 여기서 주의해야 할 점은 전극의 수가 여기에 도시한 것보다 많거나 적을 수 있으며, 본 명세서는 오직 예시만을 위해 5 X 5 배열을 사용하는 것이지 이것으로 제한되는 것이 아니라는 점이다. 사실상 전극이 더 많은 칩은 더 많은 수의 표적 세포의 회수를 용이하게 할 수 있어서 핵산의 수율이 높아질 수 있다. 이웃한 전극 (24)들 사이의 중심간 거리는 약 200 ㎛ 대가 바람직하며, 각 전극 (24)의 직경은 약 80 ㎛ 대가 바람직하다.
이 실시양태에서, 칩 (12)는 티타늄-텅스텐 (Ti-W)층을 가열산화된 실리콘 웨이퍼 상에 약 100 nm 두께로 스퍼터링한 후, 이 Ti-W층 위에 백금층을 약 300 nm 두께로 스퍼터링하여 제조했다. 왕수(王水) 중에서의 사진석판술 습식 에칭 (photolithographically defined wet etch in aqua regia)을 이용하여 금속화를 수행했다. 패턴화된 금속의 표면 상에 저응력 질화규소 박막 (1.3 ㎛) 및 이산화규소 박막 (100 ㎛)을 플라스마 화학증착에 의해 침착시켰다. 사진석판술 패턴화 건식 플라스마 에칭법을 써서 유전체 전체에 전극 어레이를 에칭했다. 칩 (12)는 인쇄회로기판 (14) (바람직하게는 개인용 컴퓨터 기억카드 국제협회 (PCMCIA)의 개인용 컴퓨터 카드 표면과 일치하는 것임)로 각기 와이어본딩했다.
칩 (12)를 인쇄회로기판 (14)에 접착시킨 후, 칩 (12)를 이소프로판올로 세척하고 탈이온수로 헹궜다. 그 다음 칩 (12)를 질소 스트림을 이용하여 송풍 건조시켰다. 건조된 칩 (12)를 보유한 기판 (14)를 플라스마 클리너 보우트에 수직으로 세우고 아르곤 (250 mTorr, 250 W) 중에서 5분간 세척했다. 플라스마 세척 후, 투과층을 각 칩 (12)에 부가했다.
우선 글리옥실 아가로오스의 2.5% 기부 투과층 (BPL) 용액을 다음과 같이 제조했다. 글리옥실 아가로오스 (250 mg) (미국 미주리주 세인트루이스에 위치한 Sigma사 제품)를 탈염 증류수 10 ml에 가하고, 혼합한 후 8분간 끓였다. 완전히 용해된 아가로오스 용액을 예열된 (65 ℃) 에펜도르프 튜브 내로 1.2 ㎛ 시린지 필터를 써서 고온 여과시켰다. 여과된 아가로오스 용액을 5분간 65 ℃로 평형시켰다. 이어서, 상부 투과층 (TPL)을 다음과 같이 제조했다. 스트렙타비딘 (미국 인디애나주 인디애나폴리스에 위치한 Boehringer Mannheim사 제품)을 염화나트륨 (250 mM) 및 인산나트륨 (10 mM, pH 7.2)이 함유된 용액 중에 현탁시켜서 스트렙타비딘 용액 (5 mg/ml)을 제조했다. 이 스트렙타비딘 용액을 온도 평형화된 BPL 용액과 합하여 2 % 아가로오스 및 1 mg/ml 스트렙타비딘을 얻었다. 따뜻한 BPL 용액 (50 ㎕)을 각 칩 위에 놓고 스핀코팅기 (EC101D, 미국 택사스주 가랜드에 위치한 Headway Research사 제품)로 2500 rpm에서 20초간 실온에서 스피닝했다. BPL을 고형화한 후, 따뜻한 TPL 용액 (50 ㎕)을 BPL의 상부에 놓고 실온에서 20초간 스핀코팅기로 10,000 rpm에서 스피닝했다. 그 다음 코팅된 칩을 30분간 37 ℃에서 베이킹시켰다.
글리옥실 아가로오스와 스트렙타비딘의 1급 아민과의 쉬프 염기 결합을 새로 제조된 시아노붕수소화 나트륨 (0.2 M)/ 붕산나트륨 (0.3 M) (pH 9.0)을 써서 실온에서 1 시간 동안 환원시켰다. 남은 알데히드기를 붕산나트륨 (0.3 M) 중의 글리신 완충액 (0.2 M)(pH 9.0)을 써서 실온에서 30 분간 캡핑시켰다. 이 칩을 마지막으로 5 분 동안 탈염수로 헹구고 4 시간 동안 공기건조시키고 4 ℃에 보관했다.
제조된 칩 (12)/인쇄회로기판 (14)을 선택하고, UV 접착제 (미국 뉴저지주 뉴 브룬스윅에 소재한 Thorlabs사의 Norland 68)를 45초간 200 W UV광 (4 J/㎠) 하에 사용하여 폴리카르보네이트 성형 유동 셀 (16)을 칩 (12) 상에 접착시켜 본 발명의 카트리지 (10)을 완성했다. 바람직하게는 커버 유리 슬립을 유동 셀 (16)의 상부에 접착시켜서 동일한 방식으로 밀봉된 유동 챔버를 형성한다. 입출입 플라스틱 튜브 (18a) 및 (18b)는 각기 끼워맞춤부 (26)을 통해 유동 셀 (16)의 유입구 및 유출구에 연결하여 접착시켰다.
그 다음 카트리지 (10)으로 시험을 위한 준비를 했다. 대장균 세포를 분리하고 세포용해시키고, 효소 반응시키는 시험 및 자궁경부암종 세포를 분리하는 시험이 수행되었다.
대장균 시험
우선 세포 배양물을 잘 알려진 기술을 써서 제조했다. 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)의 SpaO 영역으로부터 296 bp 단편을 증폭시키고, 인비트로겐 T/A 클로닝 키트 (미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 위치한 Invitrogen사 제품)를 사용하여 플라스미드 pCR 2.1 (3890 bp)로 클로닝했다. 키트 설명서에 따라 라이게이션을 수행하고, 그 생성물을 써서 INVαF' 감응성(competent) 대장균을 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린 (100 ㎍/ml), x-gal (20 mg/ml) 80 ㎕, 청/백 스크리닝용 이소프로필티오-B-D-갈락토시드 (40 mM) 4 ㎕를 보충한 LB 플레이트 상에서 증식시켰다. 클론을 스크리닝하기 위해, 백색 콜로니 10개를 골라 세포용해시켜서 분석을 위한 DNA를 방출시켰다. 이 DNA를 SpaO 특이적 프라이머를 써서 PCR로 증폭시켰다. 이 암플리콘들을 겔 전기영동에 의해 검사했다. PCR 스크린으로부터 양성 클론 하나를 LB 및 암피실린 액체 배양액 (100 ㎕/ml) 중에서 37 ℃에서 밤새 225 rpm으로 진탕시키면서 증식시켰다.
그 다음 세포 배양물을 잘 알려진 공지 기술로 제조했다. 0.05 x TBE (4.5 μM Tris, 4.5 μM 붕산, 0.1 μM EDTA, pH 8.2), 250 mM 수크로오스가 함유된 세포 분리 완충액 (pH 8.2)을 제조했다. 완충액의 전도도는 아큐메트 (Accumet) pH 계량기 50 (미국 펜실바니아주 피츠버그에 위치한 Fisher Scientific사 제품)으로 측정했을 때 114 μS/cm이었다. 세포 분리가 수행되는 전도도는 대장균 세포가 양성 유전이동되고, 모든 정상적 인간 혈액 세포가 음성 유전이동되게 하는 값으로 주의깊게 선택되었다. 배양된 대장균 세포 현탁액 (1 ml)을 4 분 동안 325 x g에서 원심분리하고 상층물을 제거했다. 세포 펠렛을 세포 분리 완충액 (1 ml)으로 세척하고, 상기한 바와 동일한 조건으로 펠렛화했다. 그 다음 세포를 세포 분리 완충액 (1 ml) 중에 재현탁시켰다. EDTA에 의해 응고방지된 새 인간 혈액 (20 ㎕)을 대장균 세포 현탁액 (1 ml)에 첨가하고, 세포 배양물을 완성했다.
이 세포 배양물을 본 발명의 카트리지 (10)에 도입하고 대장균 세포를 분리하기 위해 유전이동을 수행했다. 카트리지 (10)을 니콘 (Nikon) 위상차 현미경 위에 올려 놓았다. 환형 광원 (미국 캘리포니아주 이빈에 위치한 Precision MicroOptics사 제품)을 써서 빛을 비췄다. 이미지 신호는 CCD/RGB 칼라 비디오 카메라 (미국 캘리포니아주 샌디애고에 소재한 Mikron Instruments사의 Sony DXC-151)를 써서 10배율로 주집하고, 소니 VCR을 써서 기록하고 소니 텔레비젼 모니터로 관찰했다. 연동 펌프 (모델 RP-1, 미국 매사추세츠주 우번에 위치한 Rainin Instruments 제품)을 통해 유체를 튜브 (18) 및 유동 셀 (16)로 펌핑했다. 함수/임의지정 파형 생성기 (모델 HP33120A, 미국 캘리포니아주 산타클라라에 위치한 Hewlett-Packard 제품)로부터 전극 (24) 상의 신호를 생성시키고, 오실로스코프 (모델 HP54600, Hewlett-Packard 제품)로 관찰했다.
세포 배양물을 실제로 유전이동시키기 전에, 컴퓨터 모델화 및 유전 특징 연구를 수행했다. 인간 혈액 세포의 세척 제거를 용이하게 하기 위해서는 대장균 세포는 양성 유전이동시키고, 모든 정상적인 인간 혈액 세포는 음성 유전이동시키는 것이 바람직했다. 양성 유전이동력 하에서 대장균은 양성 전기장이 최대인 전극 쪽으로 이동한다. 인간 혈액 세포는 음성 유전이동력 하에서 음성 전기장이 최대인 전극 사이의 공간을 향해 이동한다. 이런 현상이 일어날 때의 주파수는 컴퓨터 모델화 및 유전 특징 연구에 준해서 실험적으로 결정했다.
불균일한 전기장 하에서 유도된 분극에 의한 입자 운동인 유전이동의 기본 이론은 광범위하게 연구되어 왔다. 예를 들면 문헌 (R. Pething, "Dielectrophoresis: Using Inhomogeneous AC Electrical Fields To Separate and Manipulate Cells", Crit. Rev. Biotech, 16: 331-48 (1996)), (X. Wang, et al., "A Unified Theory of Dielectrophoresis and Travelling Wave Dielectrophoresis", J. Phys. D: Appl. Phys., 27: 1571-74 (1994)), G. Fuhr, "Cell Manipulation and Cultivation Under AC Electric Field Influence in Highly Conductive Culture Media", Biochem. Biophys. Acta 1158: 40-46 (1993)), (M. Washizu, "Molecular Dielectrophoresis of Biopolymers", IEEE Trans. Industry Applicat. 30: 835-43 (1994)) 등을 참조한다. 유전이동 현상은 에너지 전위를 통해 일반적으로 설명할 수 있다.
상기 식에서은 유전 매질에 현탁된 입자의 유도 쌍극자 모멘트이며,는 걸어준 전기장이다. 따라서, 입자에 작용하는 유전이동력은 에너지 전위의 구배로 나타낼 수 있다.
입자의 순전하량이 0이고 주변 매질이 등방성인 경우, 평균 에너지 전위는 다음과 같이 간단히 나타낼 수 있다.
상기 식에서 p는 부피가 ν인 현탁된 입자의 유효 편극율이다. 편극율 (p)의 값 및 부호는 입자 및 매질의 투과도 및 걸어준 전기장의 주파수에 따라 달라진다 (R. Pething, "Dielectrophoresis: Using Inhomogeneous AC Electrical Fields To Separate and Manipulate Cells", Crit. Rev. Biotech, 16: 331-48 (1996)). 정상 상태 (steady state)에서 양편극율 (p 〉 0)을 갖는 입자는 고전기장 영역에 머무는 경향을 나타낼 것이며, 음편극율 (p 〈 0)을 갖는 입자는 저전기장 영역에 머물 것이다.
본 발명의 전극 (24) 주변의 전기장의 분포를 모델화하기 위해, 다음 두 가지를 가정했다. 첫째, 저주파수 범위에서 칩 및 유동 챔버의 치수는 걸어준 AC 전기장의 파장 보다 작다. 둘째, 샘플 용액은 전기적 중성을 띤다. 이 두 가정하에 본 실험에서 특정 어드레싱 구조에 대한 전기장을 라플라스 방정식및(ψ= 전위 )을 풀어 계산할 수 있다. 이 때 경계 조건은 전극 상에서 고정 전압, 나머지 표면에서 0 정상 전류, 양극에서의 ψ= V0, 음극에서 ψ= 0 , 칩 표면 및 유동 챔버의 나머지 부분에서 δψ/δn = 0이다.
샘플 용액 내의 전기장 및 이에 따른 분극화된 입자의 에너지 전위는 유한차 방법에 의해 산술적으로 계산했다 (K. Binns, "The Analytical and Numerical Solution of Electric and Magnetic Fields", John Wiley ＆ Sons, N. Y. 1992).
대장균 세포가 양성 유전이동력을 받고 혈액 세포가 음성 유전이동력을 받을 때의 주파수는 세포 혼합물에 여러 다른 조건을 적용하여 실험적으로 결정했다. 5 KHz로부터 시작해서 사인형 신호의 주파수 (피크간 10 볼트)를 점차 증가시킴으로써 연구를 수행했다. 주파수가 10 KHz에 도달했을 때 대장균 세포 및 나머지 인간 혈액 세포의 분리가 명확하게 관찰되었다. 이 전기적 파라미터를 이후의 대장균 세포 단리에 사용했다.
세포 배양물 중의 혈액 세포로부터 대장균 세포를 유전이동에 의해 분리하기 위해, 사용한 적이 없는 새 카트리지 (10)을 사용했다. 우선 샘플/완충액 용기 (28)로부터 튜브 (19) 및 유동 셀 (16)을 통해 분리 완충액을 펌핑하여 상기 카트리지 (10)의 칩 (12)를 세척했다. 그 다음 세포 배양물을 유동 셀 (16)으로 펌핑하고 펌프의 스위치를 껐다. 10 KHz에서 피크간 10 볼트의 사인 신호를 적용하여, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 각 전극에서 최대 전기장, 전극 사이의 영역에 최소 전기장을 부여하는 체커보드 바이어스 형식으로 전극 (24)의 전체 어레이 (즉, 5 열 X 5 행 어레이의 25개 전극 모두)를 어드레싱했다. 도 4b에 나타낸 바와 같이 (또한 도 4a와 비교할 때),대략 4 분 후 대장균 세포 (30) (전기장이 최대인 전극 (24)에 모아짐)가 인간 혈액 세포 (32) (전기장이 최소인 전극 (24) 사이의 영역에 모아짐)로부터 완전히 분리되었다. 이후에 펌프의 스위치를 켜고 세척 공정을 시작했다.
도 3c에 나타낸 스퀘어 웰 형식 보다는 도 3a에 나타낸 체커보드 바이어싱 형식을 사용했다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 체커보드형 어드레싱에 상응하는 전기장 분포는 각 전극에서 최대 전기장 및 전극간 영역에 최소 전기장을 낳는 균일한 분포의 전기장을 제공하지만, 스퀘어 웰형 어드레싱에 의해서는 도 3d에 보인 바와 같이, 최소 전기장이 전극들 사이로 흩어지지 않는다. (도 3b에 나타낸 바와 같이) 최소 전기장이 전극 사이에 흩어지는 배열이 바람직한데, 왜냐하면 그러한 배열에 의해서는 원치않는 세포 (즉, 최소 전기장의 영역에 모아진 것)의 세척 제거가 원하는 세포 (즉, 전극 상에 보유된 것)를 흩트러뜨리지 않고도 쉽게 수행할 수 있기 때문이다. 이 때 원하는 세포 및 전극은 유체 흐름의 길목에 있지 않기 때문에 어떠한 원치않는 세포를 포함하는 세척 제거 흐름을 차단하지 않는다. 체커보드형 어드레싱은 전극들을 그룹화하고 각 전극 그룹을 그에 가장 인접한 전극 그룹과 반대로 바이어스시킴으로써 본질적으로 수행할 수 있음이 이해되어야 한다.
샘플 세포 배양물 혼합물이 샘플/완충액 용기 (28)로부터 거의 배수되었을 때, 분리 완충액을 첨가하여, AC 신호가 여전히 켜져 있는 상태로 유동 셀 (16) 전체에 걸쳐 나머지 샘플을 세척했다. (도 4b와 비교할 때) 도 5에 나타낸 바와 같이, 세척 공정에 의해 인간 혈액 세포를 세척 제거하고, 대장균 세포 (30)는 보유된 채로 남겨두었다. 세척한 후, 프로테나제 K (490 ㎍, 미국 인디애나주 인디애나폴리스에 위치한 Boeringer Mannheim 제품)를 함유하는 분리 완충액 (300 ㎕)를 유동 챔버 (16) 내로 펌핑하여 단백질의 크기를 감소시켰다.
그 다음 전자 세포용해를 수행하여 보유된 대장균 세포를 세포용해시켰다. 세포를 세포용해시키기 위해, 일련의 펄스 (500 V, 50 ㎲ 펄스 너비)를 4개의 반대전극 (34) (도 2에 도시)와 25개의 더 작은 세포 수집 전극 (24)의 사이에 적용했다. 펄스는 매 20회 펄스의 극성을 전극 (24) 및 (34)의 두 그룹 사이에서 교대시키는 방식으로 적용했다. 각 세포용해 공정에 대해 전체 400 회 펄스를 가했다. 교번 펄스에 의해 세포로부터 물질이 밖으로 밀려나온다. 도 6은 대장균 세포로부터 방출되고 DC 파를 적용하여 농축된 핵산 (36) 샘플을 보여준다.
세포용해 혼합물을 20 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션시켜서, DNA 오염 단백질을 분해한다. 이 세포용해물을 유동 셀 (16) 밖으로 펌핑하여 수집했다. 유전이동에 의한 분리 및 전자 세포용해를 조합하여 6회 반복하고, 모든 세포용해물을 분석을 위해 모았다.
모아진 세포용해물을 5 분 동안 16000 x g에서 원심분리했다. 이어서 상층물을 회수하고 이 용액에 2배 부피의 냉각된 에탄올 (-20 ℃)을 첨가하고 혼합하여 10 분 동안 16000 x g에서 스피닝시켰다. 상층물을 제거하고, 펠렛을 공기 건조했다. 그 다음 펠렛을 0.05 x TBE 완충액 (300 ㎕)에 재용해했다. 재용해된 용액 (30 ㎕)의 분획을 RNase (3 ㎕, 10 mg/ml, Boehringer Mannheim)이 함유된 용액과 합했다. 합한 용액을 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.
그 후 겔 전기영동을 수행하여 수집된 물질을 분석했다. 1 x TBE 완충액 50 ml에 아가오로스 600 mg을 용융시켜서 1.2 % 아가로오스 겔을 제조했다. 이 아가로오스 용액이 고형화되기 전에 에티듐 브로마이드 (2.5 ㎍)를 첨가했다. 프로테이나제 K를 처리한 세포용해물 샘플을 RNase를 처리하거나 처리하지 않고 마커 DNA와 함께 겔에 로딩했다. 도 7은 도 6의 핵산의 아가로오스 겔 전기영동 이후 찍은 사진으로서, 게놈 DNA, 슈퍼코일형 플라스미드 DNA 및 RNA들까지의 전체 핵산이 전자 세포용해 후 세포로부터 방출되었음을 입증한다.
그 후 DNA 혼성화 분석을 수행했다. 플라스미드 DNA의 SpaO 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 포획 프로브 (39-머)의 3' 말단에 바이오틴을 혼입했다. 포획 프로브를 50 mM L-히스티딘 완충액 중에 희석하여 최종 농도를 500 nM로 만들었다. 포획 프로브를 양으로 바이어스된 전극 (24)를 밑에 둔, 스트렙타비딘이 함유된 시험 마이크로 위치 상에 고정시켰다. 전기 바이어싱은 각 전극 (24)에 전류를 1 분간 200 nA로 유지하여 수행했다. 그 후 나머지 프로브 용액을 제거하고 칩 (12)를 50 mM L-히스티딘 완충액으로 세척했다. 대조구에 대한 프로브 (ATA5 및 GAS 프로브)의 고정은 상기한 바와 같은 프로토콜을 이용하여 수행했다.
DNA 혼성화를 용이하게 하기 위해 프로테이나제 K를 처리한 세포용해물의 분획을 L-히스티딘 완충액으로 각기 3배 및 5배 희석했다. 희석된 세포용해물 샘플을 100 ℃ 수조에서 10 분간 끓여, DNA를 단편화하고 (DNA의 최종 크기는 300 bp 내지 1 Kb), 뿐만 아니라 DNA를 단일가닥화했다. 대조구의 존재를 확인하기 위해, 각 전극에서의 전류를 3 분간 450 nA로 유지함으로써, 고정된 ATA5 프로브 및 인접한 비특이적 GAS 프로브 둘다에 동시에 포획 프로브 ATA5에 특이적인 합성된 RCA5 올리고뉴클레오티드 표적 (F. Becker et al., "Separation of Human Breast Cancer Cells From Blood by Differential Dielectric Affinity", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 860-64 (1995))을 전자적으로 혼성화시켰다. 포획 과정이 끝났을 때, 새 L-히스티딘 완충액을 로딩하여 이전의 완충액을 대체하고 전자 엄격성 세척을 수행했다. 세척은 150 DC 펄스를 한 번에 한 행으로 0.1 초 온 (on)/0.2 초 오프 (off) 방식으로 패드당 1 ㎂ 로 가함으로써 수행했다.
샌드위치 분석을 수행하기 위해, 리포터 프로브의 혼성화를 다음과 같이 수행했다. 칩 (12)를 초음파 처리되고 변성된 송아지 흉선 DNA (100 ㎍/ml, 미국 미주리주 세인트루이스에 위치한 Sigma사 제품)를 함유하는 1 x STE 완충액에 5분간 담가두었다. 그 후 완충액을 배수시키고, 혼합 용액 (상기한 송아지 흉선 DNA가 함유된 1 x STE 완충액 중의 500 mM 리포터 프로브) 15 ㎕를 칩 (12)에 놓고 실온에서 5 분간 놓아두었다. 그 다음 칩 (12)를 0.2 x STE로 제조된 1 % SDS 완충액 15 ㎕으로 5회 세척하고 실온에서 동일한 완충액 5 ml 중에 10분간 담가두었다. 이 칩을 0.2 x STE로 5회 세척했다.
도 8a는 대장균으로부터 방출된 플라스미드 DNA의 전자식 향상 표적 포획에 대한 혼성화 대조구 (37)를 보여주며, 도 8b는 대장균으로부터 방출된 플라스미드 DNA 샘플 (38)이 추가의 프로브에도 전자적으로 혼성화되는 샌드위치 분석 이후의 결과를 보여준다. 도 8a에서 나타난 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 프로브의 고정 화학은 기대한 바와 같이 작동했다 (즉, 고정된 프로브가 올리고뉴클레오티드를 포획함). 또한 도 8b에 나타난 바와 같이, 전자 세포용해 결과 얻어진 열처리된 플라스미드 DNA (38)은 효소에 의한 증폭 과정을 거치지 않고도 높은 반복재현성으로 혼성화 기재 분석에 직접 사용될 수 있다.
그 다음 RNA 혼성화를 수행했다. 16S RNA에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 포획 프로브 5'-XGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG CACTTTA-3'의 3' 말단에 바이오틴을 혼입했다. 이 프로브를 50 mM L-히스티딘 완충액으로 희석하여 최종 농도가 500 nM가 되게 했다. 포획 프로브를 양으로 바이어스된 전극 (24)를 밑에 둔, 스트렙타비딘이 함유된 시험 마이크로 위치 상에 고정시켰다. 바이어싱은 각 전극에 전류를 1 분간 200 nA로 유지함으로써 수행했다. 그 후 나머지 프로브 용액을 제거하고 칩을 50 mM L-히스티딘 완충액으로 세척했다. 대조구에 대한 프로브 (ATA5 및 GAS 프로브)의 고정은 상기한 바와 같은 프로토콜을 이용하여 수행했다.
대조구를 시험하기 위해, 각 전극에서의 전류를 3 분간 450 nA로 유지함으로써, 고정된 ATA5 프로브 및 인접한 비특이적 GAS 프로브 둘다에 동시에 포획 프로브 ATA5에 특이적인 합성된 RCA5 올리고뉴클레오티드 표적을 전자적으로 혼성화시켰다. 합성된 올리고뉴클레오티드 표적 5'-AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGC AAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTATGCAACTCG-3'의 포획을 상기한 바와 같이 수행했다. 16S RNA의 혼성화를 용이하게 하기 위해, 프로테이나제 K를 처리한 세포용해물의 분획을 L-히스티딘 완충액으로 각기 3배 및 5배 희석했다. 플라스미드 DNA 혼성화를 위해 위에서 사용된 희석된 세포용해물 샘플을 여기에도 사용했다. 포획 과정이 끝났을 때, 새 트리스-인산염 완충액 (20 mM 트리스 염기, 20 mM 이염기성 인산나트륨, pH 9.0)을 로딩하여 L-히스티딘 완충액을 대체하고 전자 엄격성 세척을 수행했다. 간단히 L-히스티딘 완충액으로 전자 엄격성 세척을 수행하는 것만으로는 비특이적으로 포획된 RNA를 제거하는 데 불충분하며, 트리스 인산염 완충액을 써서 전자 엄격성 세척을 수행하는 것이 더 낮은 전기장 조건에서조차 L-히스티딘 완충액을 사용하는 세척 보다 더 효과적이었다. 세척은 70 DC 펄스를 한 번에 한 행으로 0.1 초 온 (on)/0.2 초 오프 (off) 방식으로 패드당 750 nA로 가함으로써 수행했다.
샌드위치 분석을 수행하기 위해, 리포터 프로브의 혼성화를 다음과 같이 수행했다. 칩을 초음파 처리되고 변성된 송아지 흉선 DNA (100 ㎍/ml, 미국 미주리주 세인트루이스에 위치한 Sigma사 제품)를 함유하는 1 x STE 완충액에 5 분간 담가두었다. 그 후 완충액을 배수시키고, 혼합 용액 (상기한 송아지 흉선 DNA가 함유된 1 x STE 완충액 중의 500 mM 리포터 프로브) 15 ㎕를 칩에 놓고 실온에서 5 분간 놓아두었다. 그 다음 칩을 0.2 x STE로 제조된 1 % SDS 완충액 15 ㎕으로 5회 세척하고 실온에서 동일한 완충액 5 ml 중에 10 분간 담가두었다. 마지막으로 이 칩을 0.2 x STE로 5회 세척했다.
도 9a는 대장균으로부터 방출된 리보솜 RNA의 전자식 향상 표적 포획에 대한 혼성화 대조구 (39a)를 보여주며, 도 9b는 대장균으로부터 방출된 리보솜 16S RNA (39b)가 추가의 프로브에도 전자적으로 혼성화되는 샌드위치 분석 이후의 결과를 보여준다. 도 9a에서 나타난 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 프로브의 고정 화학은 기대한 바와 같이 작동했다 (즉, 고정된 프로브가 올리고뉴클레오티드를 포획함). 또한 도 9b에 나타난 바와 같이, 전자 세포용해 결과 얻어진 열처리된 리보솜 RNA (39b)는 효소에 의한 증폭 과정을 거치지 않고도 높은 반복재현성으로 혼성화 기재 분석에 직접 사용될 수 있다.
자궁경부암종 시험
앞에서 언급한 바와 같이, 카트리지 (10)은 혼합되어 있는 말초 혈액 세포로부터 배양된 자궁경부암종 세포 (HeLa 세포)를 분리 및 단리하는 데에도 사용했다.
우선 세포 배양물은 잘 알려진 공지 기술을 써서 준비했다. 인간 경부 종양으로부터 유도된 상피 암종 세포주 (HeLa)를 미국 캘리포니아주 샌디에고에 위치한 캘리포니아 대학에서 코어 세포 배양 설비로 제조했다. L-글루타민 (2.5 ml, BRL Life Technologies) 및 태송아지 혈청 (25 ml, Gemini Bio-Products)을 RPMI 1640 (222.5 ml, BRL Life Technologies)에 첨가하여 증식 배지 (250 ml)를 제조했다. 생식불능 여부에 대해 배지를 시험하기 위해, 배지의 일부 (3 ml)를 덜어 원뿔형 튜브 (15 ml)에 넣고 느슨한 뚜껑으로 막아 5 % CO2인큐베이터 (National) (37 ℃)에 1 주일 동안 넣어 두었다. 오염 여부에 관해 한 주 동안 매일 튜브를 검사했다. 그 다음 냉동된 세포 (1.0 ml) 바이알을 37 ℃ 수조에서 교반시킴으로써 급속 해동시켰다. 동일 부피의 예열된 배지를 그 세포에 즉시 첨가하고, 혼합물을 원뿔형 튜브 (15 ml)로 옮겼다. 배지의 다른 일부 (6 ml)를 상기 세포에 첨가하고 최종 부피를 8 ml로 만들었다. 세포를 2 분간 1100 rpm으로 원심분리하여 펠렛화했다. 상층물을 제거하고, 세포 펠렛을 새 매지 (10 ml)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 37 ℃에서 5 % CO2의 존재하에 인큐베이션시켰다. 세포를 트립신으로 처리한 후 당면한 사용을 위해 새 배지에 재현탁시킴으로써 수거했다. 세포 수는 1 x 106/ml이었다.
그 다음 세포 혼합물을 잘 알려진 공지 기술로 제조했다. 세포 분리 완충액은 0.0025 x TBE (225 nM 트리스, 225 nM 붕산, 5 nM EDTA, pH 8.2) 및 250 mM 수크로오즈로 제조했다. 이 완충액의 전도도는 아큐메트 pH 계량기 50 (미국 펜실바니아주 피츠버그에 위치한 Fisher Scientific 제품)로 측정했을 때 10 μS/cm이었다. 세포 분리를 위한 완충액 전도도는 HeLa 세포를 양성 유전이동시키고 모든 정상적 혈액 세포는 음성 유전이동시킬 수 있도록 주의해서 선택되었다. 배양된 HeLa 세포 현탁액 (1 ml)를 4 분간 325 x g에서 원심분리하고 상층물을 제거했다. 세포 펠렛을 세포 분리 완충액 (1 ml)로 세척하고 상기한 바와 동일한 조건을 써서 펠렛화했다. 그 다음 HeLa 세포를 세포 분리 완충액 (1 ml) 중에 재현탁시켰다. EDTA에 의해 응고방지된 새 인간 혈액 (1 ml)을 5 분간 400 x g에서 스피닝하고, 상층물을 제거했다. 모아진 세포 (5 ㎕)를 덜어 HeLa 세포 현탁액 (1 ml)에 첨가했다.
이 시험에 사용된 유전이동계는 검출을 위한 레이저가 포함되었다는 것만 제외하면 상기한 것과 같다. 카트리지 (10)을 분석용 프로브 스테이션 (모델 6000 Micromanipulator, 미국 네바다주 카슨시티 소재) 상에 놓았다. 레이저 여기 (excitation)는 기울어진 각도로 광섬유 (6 mW 출력, 미국 콜로라도주 보울더에 위치한 Research Electro-Optics사의 제품)를 통해 두 개의 He-Ne 594 nm 레이저에 의해 유도되었다. 이미지 신호는 8 배율 (조리개수 0.15) 및 630 ±25 nm 대역 필터를 통해 냉각 (cooled) 칼라 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 (DEI-750T, 미국 매사추세츠주 첼스포드에 위치한 Optronics International 제품)에 의해 수집했다. 이미지 획득은 맥킨토시 호환성 StarMax 3000/200로 IPLab 3.1.1 소프트웨어 및 프레임 그래버 (미국 매릴랜드주 프레더릭에 위치한 Scion사 제품)를 이용하여 수행했다. 연동 펌프 (모델 RP-1, 미국 매사추세츠주 우번에 위치한 Rainin Instruments 제품)을 통해 유체를 펌핑했다. 함수/임의지정 파형 생성기 (모델 HP33120A, 미국 캘리포니아주 산타클라라에 위치한 Hewlett-Packard 제품)로부터 전극 신호를 생성시키고, 오실로스코프 (모델 HP54600, Hewlett-Packard 제품)로 관찰했다.
HeLa 세포를 혈액 세포로부터 유전이동에 의해 분리했다. 칩 (12)를 우선 유동 챔버 전체를 분리 완충액을 펌핑함으로써 세척했다 (이는 또한 칩 투과층을 적시고 임의의 공기 방울을 챔버에서 제거하는 데 도움이 되었다). 도 10a는 세척후의 칩 (12)의 표면을 보여준다. 그 다음 세포 혼합물을 유동 챔버 내로 펌핑하고, 펌프를 껐다. 전극 (24)의 전체 어레이를 상기한 바와 같이, 30 KHz에서 피크간 6 볼트의 사인형 신호를 가해 체커보드 형식으로 어드레싱했다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포 (31) (최대 전기장인 전극 (24)에 모아짐)을 인간 혈액 세포 (32) (최소 전기장인 전극 사이 (25)에서 모아짐)로부터 대략 3분 후 완전히 분리했다. 세포 샘플이 샘플/완충액 용기로부터 거의 배수되었을 때, 유동 셀에 두루 분리 완충액을 펌핑하여 나머지 샘플을 세척했으며, 이때 AC 신호를 여전히 켜 두어 모든 추가의 HeLa 세포가 유동 챔버내로 운반되어 전극 (24)로 유인되어 보유되게 하고, 전극들 사이에서 모아진 말초 인간 혈액 세포는 세척에 의해 제거되게 했다. 도 10c는 이 세척 단계 이후의 칩 표면을 보여준다.
전극 상의 세포가 말초 림프구가 아니라 HeLa 세포임을 확인하기 위해, 퍼피코트 세포를 동일한 혈액으로부터 제조하고 동일한 분리 완충액으로 희석하여 동일한 유전이동 조건을 적용했다. 이 실험에서 림프구는 전극으로부터 떨어져 전극들 사이의 최소 전기장 내로 이동하는 것으로 관찰되었으며, 이는 HeLa 세포가 전극에 있음을 확증하는 것이다.
그 다음 단리된 HeLa 세포를 형광 염색법을 통해 다음과 같이 염색했다. 핵산 결합 형광 염료, 요오드화 프로피듐 (2 ㎕, 1 mg/ml; 미국 오레곤주 유젠에 소재한 Molecular Probes 제품)을 분리 완충액 (100 ㎕)에 첨가했다. 세포 단리 과정이 끝나면, 염색 완충액을 유동 셀 내로 펌핑했다. 염색 과정은 형광 이미지가 도 10d에 나타낸 바와 같이 포착되기 전까지 약 60 초가 걸렸다. 생성된 이미지에서 세포의 크기와 전극의 직경 (80 ㎛로 알고 있음)을 비교함으로써 개별 세포의 직경을 평가할 수 있었다. 전극 상의 단리된 세포의 평가된 크기는 17 내지 34 ㎛였으며, 이는 반전 현미경 하에서 HeLa 세포를 관찰해서 얻은 값과 일치하는 것이다. 또한 이들 세포의 모양은 림프구와 비교하여 더욱 한정되었으며, 이는 또한 이들이 HeLa 세포임을 확증하는 것이다. 단리된 HeLa 세포를 세포용해할 수 있으며, 필요하다면 상기한 바와 같이 효소 반응을 시킬 수 있다.
상기한 유전이동 분리 과정에서 세포의 대류 운동은 전혀 관찰되지 않았다. 앞서 언급한 바와 같이 이는 전극에 의해 처음 보유된 세포의 교란 및 세척에 의한 제거를 최소화하는 데 도움이 된다.
추가의 설명
도 11a 및 11b는 세포 분리, 세포용해, DNA/RNA의 효소적 탈단백질화 방법 및(또는) DNA 또는 RNA 혼성화를 수행하기 위한, 자급식 카트리지 (10)의 설계의 내부 개략도이다. 카트리지 (10)은 마이크로칩 (12) 위에 U자형 유동 셀 챔버 (16)을 포함한다. 마이크로칩 (12)는 U자형 챔버의 하나의 암 (arm)(40a)에 25개의 전극 (24a)으로 구성된 어레이 및 4개의 반대전극 (34a)를, 다른 암 (40b)에 9개의 전극 (24b)로 구성된 어레이를 포함한다. 주의해야 할 것은 전극 어레이에 사용된 전극의 수는 이 경우와 달라질 수 있으며, 본 명세서는 전극의 수를 예시할 뿐이지 제한하는 것이 아니라는 점이다. 튜브 (18a), (18b) 및 (18c)가 유동 챔버 (16)의 내외로 유체 운반을 가능케 하는 비아 (42a, 42b, 42c)에서 유동 챔버 (16)에 부착된다.
도 11a 및 도 11b에 나타낸 것과 같은 U자형 유동 챔버의 한 가지 이점은 샘플을 물리적으로 제거하고(거나) 재도입할 필요없이 본질적으로 상이한 챔버들 내에서 상이한 공정이 수행될 수 있다는 점이다. 예를 들면 도 11a에 나타낸 바와 같이, 튜브 (18c)를 닫고, 샘플을 튜브 (18a)를 통해 도입한다. 원하는 세포의 단리 및 세포용해가 상기한 바와 같이 전극 (24a)에서 일어난다. 그 다음 도 11b에 나타낸 바와 같이 튜브 (18a)를 막고, 튜브 (18c)를 연다. 유동 셀을 통한 흐름 및 셀 (16)에서의 여러 전극의 전하량을 조작하여 U자형 챔버의 암 (40a)로부터 암 (40b)로 세포용해물의 원하는 부분을 이동시킨다. 그 다음 예를 들면 전극 (24b)에서 세포용해물을 혼성화시키거나 어떤 다른 효소 반응을 시킨다. 이런 구획화 접근법은 완전히 세척되지 않는 용해물 중의 원치않는 단편들로 인한 방해를 피할 수 있다는 추가의 이점이 있다.
도 12a-d는 본 발명에 포함될 수 있는 4개의 상이한 마이크로칩 설계의 개략도이다. 도 12a는 유전이동 및 전자 세포용해 둘다의 최적 전극 치수를 연구하기 위한 칩 설계도를 보여준다. 더 확장된 영역이 미세전극으로 덮인 새로 설계된 칩을 사용함으로써 원하는 세포의 수율이 더 짧은 시간 내에 더 높게 얻어질 수 있다고 생각된다.
도 12b는 상기한 바와 같은 유전이동 및 진행파 펌핑 특징을 결합한 칩 설계도이다. 도 12b에 보인 칩 설계도는 (중심 미세전극 어레이를 사용하는) 세포의 유전이동 분리 동안 (전면 전원을 사용하여) 진행파를 가함으로써 도입된 세포 현탁액의 원형 운동을 제공한다.
도 12c 및 12d는 세포를 분리하고 수송하기 위한 진행파의 사용을 평가하기 위한 칩 설계도를 보여준다.
본 발명의 특정한 실시태양이 제시되고 상세히 설명되었으나, 이런 교시에 비추어 첨부된 청구의 범위의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고도 이에 대한 어떤 변화 및 변형이 가능하다는 것은 당업자에게 명확할 것이다.

Claims (25)

  1. 생물학적 샘플을 수용하기 위한 대략 U자형 채널레스 유동 챔버, 및
    다수의 전극이 포함된 생물전자 칩을 포함하며,
    상기 전극이 상기 유동 챔버 내에 배치되어 있으며 각기 바이어스될 수 있고, 상기 유동 챔버 내의 전극 표면 및 칩이 투과층으로 코팅되어 있어서 상기 생물학적 샘플과 상기 표면 사이의 직접적 접촉이 방지되는,
    생물학적 샘플의 분리, 세포용해 및 효소 반응 중 하나 이상을 위한 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다수의 전극이 하나 이상의 어레이를 이루는 것인 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 다수의 전극이 2개의 어레이를 이루는 것인 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유동 챔버가 생물전자 칩에 부착된 피복 유동 셀을 포함하는 것인 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 투과층이 그 층 위에 포획 프로브를 고정시킬 수 있는 것인 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유동 챔버의 근사 부피가 약 10 ㎕인 장치.
  7. 제1항에 있어서, 전극이 체커보드 바이어싱 형식으로 어드레스가능한 것인 장치.
  8. 제1항에 있어서, 각 전극이 그에 가장 인접한 전극들과 반대로 바이어스 되도록 어드레스가능한 것인 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 다수의 전극이 전극 그룹들을 포함하며, 각 그룹이 그에 가장 인접한 전극 그룹들과 반대로 바이어스 되도록 어드레스가능한 것인 장치.
  10. 제1항에 있어서, 한쌍 이상의 반대전극을 추가로 포함하여 이 반대전극과 상기 전극 사이에서 일련의 전자 펄스를 통해 전자 세포용해를 수행할 수 있는 장치.
  11. 제10항에 있어서, 두 쌍의 반대전극을 포함하는 장치.
  12. 제1항에 있어서, 유동 챔버에서 전극 표면의 투과층 상에 고정된 포획 프로브를 추가로 포함하는 장치.
  13. 제13항에 있어서, 상기 포획 프로브가 하나 이상의 항체 및 리간드를 포함하는 것인 장치.
  14. 생물학적 샘플을 수용하기 위한 U자형 채널레스 유동 챔버, 및
    다수의 전극이 포함된 생물전자 칩을 포함하며,
    상기 전극이 상기 유동 챔버 내에 배치되어 있고 각기 바이어스될 수 있으며, 상기 U자형 유동 챔버가 제1 암 (arm) 및 제2 암을 포함하며, 상기 다수의 전극이 둘 이상의 전극 어레이를 이루고, 하나의 전극 어레이가 제1 암에 배치되고 하나의 전극 어레이가 제2 암에 배치되는, 생물학적 샘플의 분리, 세포용해 및 효소 반응 중 하나 이상을 위한 장치.
  15. 제14항에 있어서, 상기 전극이 체커보드 바이어싱 형식으로 어드레스가능한 것인 장치.
  16. 제14항에 있어서, 두 쌍의 반대전극을 추가로 포함하여 이 반대전극과 상기 전극 사이에서 일련의 전자 펄스를 통해 전자 세포용해를 수행할 수 있는 장치.
  17. 제14항에 있어서, 상기 유동 챔버가 생물전자 칩에 부착된 피복 유동 셀을 포함하는 것인 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 유동 챔버 내의 전극 표면 및 칩이 포획 프로브를 표면에 고정시킬 수 있는 투과층으로 코팅된 것인 장치.
  19. 제18항에 있어서, 상기 포획 프로브가 하나 이상의 항체 및 리간드를 포함하는 것인 장치.
  20. 전극 어레이가 있는 유동 챔버를 포함하는 유전이동계 내로 세포 혼합물 현탁액을 도입하는 단계,
    상기 전극을 체커보드 형식으로 바이어스시켜 상기 세포 혼합물 현탁액에 전기장을 가함으로써 원하는 세포를 전극에 모으고 원치않는 세포는 전극 사이에 모으는 단계, 및
    원치않는 세포를 유동 챔버 밖으로 세척해 버리는 단계를 포함하며, 상기 유전이동계 내에서 완수되는, 원하는 세포 물질과 원치않는 세포 물질의 혼합물을 포함하는 생물학적 샘플의 조작 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 유전이동계의 유동 챔버 내에 보유된 원하는 세포에 교번 극성을 갖는 일련의 전자 펄스를 가해 그 세포를 용해시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 유전이동계의 유동 챔버 내의 세포용해된 물질을 효소 반응시키는 추가의 단계를 포함하는 방법.
  23. 분리 및 세포용해용 제1 전극 어레이 및 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 포함하는 혼성화용 제2 전극 어레이를 갖는 유동 챔버가 포함된 유전이동계의 유동 챔버 내로 세포 혼합물 현탁액을 도입하는 단계,
    제1 전극 어레이를 체커보드 형식으로 바이어스시킴으로써 상기 세포 혼합물 현탁액에 전기장을 가하여 원하는 세포를 전극에 모으고, 원치않는 세포를 전극 사이에 모으는 단계,
    상기 유동 챔버 밖으로 원치않는 세포를 세척해 버리는 단계,
    상기 유전이동계의 유동 챔버에 보유된 원하는 세포에 교번 극성을 갖는 일련의 전자 펄스를 가해 그 세포를 용해시키는 단계,
    상기 유전이동계의 유동 챔버 내에 세포용해된 물질을 효소 반응시키는 단계, 및
    효소 반응 생성물을 제2 전극 어레이에 노출시킴으로써 혼성화시키는 단계를 포함하며, 상기 유전이동계 내에서 완수되는, 원하는 세포 물질과 원치않는 세포 물질의 혼합물을 포함하는 생물학적 샘플의 조작 방법.
  24. 분리 및 세포용해용 제1 전극 어레이 및 올리고뉴클레오티드 포획 프로브를 포함하는 혼성화용 제2 전극 어레이를 갖는 유동 챔버가 포함된 유전이동계의 유동 챔버 내로 세포 혼합물 현탁액을 도입하는 단계,
    제1 전극 어레이를 체커보드 형식으로 바이어스시킴으로써 상기 세포 혼합물 현탁액에 전기장을 가하여 원하는 세포를 전극에 모으고, 원치않는 세포를 전극 사이에 모으는 단계,
    상기 유동 챔버 밖으로 원치않는 세포를 세척해 버리는 단계,
    상기 유전이동계의 유동 챔버에 보유된 원하는 세포에 교번 극성을 갖는 일련의 전자 펄스를 가해 그 세포를 용해시키는 단계,
    상기 유전이동계의 유동 챔버 내에 세포용해된 물질을 효소 반응시키는 단계, 및
    리간드 결합을 위해 효소 반응 생성물을 제2 전극 어레이에 노출시키는 단계를 포함하며, 상기 유전이동계 내에서 완수되는, 원하는 세포 물질과 원치않는 세포 물질의 혼합물을 포함하는 생물학적 샘플의 조작 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 리간드 결합체가 고정된 항체인 방법.
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Families Citing this family (217)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197508B1 (en) 1990-09-12 2001-03-06 Affymetrix, Inc. Electrochemical denaturation and annealing of nucleic acid
US6129828A (en) 1996-09-06 2000-10-10 Nanogen, Inc. Apparatus and methods for active biological sample preparation
US7314708B1 (en) * 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US6403367B1 (en) * 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6379897B1 (en) * 2000-11-09 2002-04-30 Nanogen, Inc. Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays
US6071394A (en) * 1996-09-06 2000-06-06 Nanogen, Inc. Channel-less separation of bioparticles on a bioelectronic chip by dielectrophoresis
US6355436B1 (en) 1996-05-17 2002-03-12 L'ecole Centrale De Lyon Method for analyzing biological substances in a conductive liquid medium
AU1460299A (en) * 1997-11-14 1999-06-07 California Institute Of Technology Cell lysis device
AU746580B2 (en) * 1997-12-17 2002-05-02 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Positioning and electrophysiological characterization of individual cells and reconstituted membrane systems on microstructured carriers
US20020144905A1 (en) * 1997-12-17 2002-10-10 Christian Schmidt Sample positioning and analysis system
US20050053962A1 (en) * 1998-01-27 2005-03-10 Gary Blackburn Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6387632B2 (en) * 1998-06-11 2002-05-14 Hitachi, Ltd. Polynucleotide separation method and apparatus therefor
US6093370A (en) * 1998-06-11 2000-07-25 Hitachi, Ltd. Polynucleotide separation method and apparatus therefor
GB9812783D0 (en) 1998-06-12 1998-08-12 Cenes Ltd High throuoghput screen
US20020012916A1 (en) * 1998-10-14 2002-01-31 Gundling Gerard J A method of reducing contamination in an essay vessel
EP1144092A4 (en) * 1998-12-23 2002-10-29 Nanogen Inc INTEGRATED PORTABLE BIOLOGICAL DETECTION SYSTEM
US6294063B1 (en) * 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
CN1181337C (zh) 2000-08-08 2004-12-22 清华大学 微流体系统中实体分子的操纵方法及相关试剂盒
US6858439B1 (en) * 1999-03-15 2005-02-22 Aviva Biosciences Compositions and methods for separation of moieties on chips
WO2000066785A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide probes for detection and quantitation of bacteria in the family enterobacteriaceae
US6821770B1 (en) 1999-05-03 2004-11-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms
EP1360992A3 (en) * 1999-06-22 2004-05-19 Caliper Life Sciences, Inc. Apparatus for the operation of a microfluidic device
US6811668B1 (en) 1999-06-22 2004-11-02 Caliper Life Sciences, Inc. Apparatus for the operation of a microfluidic device
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US20040185462A1 (en) * 1999-08-06 2004-09-23 Tum Gene, Inc. Method of and detecting apparatus and detecting chip for single base substitution SNP and point mutation of genes
US6696022B1 (en) * 1999-08-13 2004-02-24 U.S. Genomics, Inc. Methods and apparatuses for stretching polymers
US6495104B1 (en) * 1999-08-19 2002-12-17 Caliper Technologies Corp. Indicator components for microfluidic systems
EP1080785A1 (en) * 1999-09-04 2001-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag System for thermocycling of fluids in cartridges
US20040023293A1 (en) * 1999-09-27 2004-02-05 Kreimer David I. Biochips for characterizing biological processes
US20020132371A1 (en) * 1999-09-27 2002-09-19 Kreimer David I. Amplification of analyte detection by substrates having particle structures with receptors
US20030232388A1 (en) * 1999-09-27 2003-12-18 Kreimer David I. Beads having identifiable Raman markers
WO2001029550A1 (fr) 1999-10-20 2001-04-26 Shigeori Takenaka Puce detecteur de genes, detecteur et methode de detection
US6824664B1 (en) 1999-11-04 2004-11-30 Princeton University Electrode-less dielectrophorises for polarizable particles
AU2427301A (en) * 1999-12-01 2001-06-12 Regents Of The University Of California, The Electric-field-assisted fluidic assembly of inorganic and organic materials, molecules and like small things including living cells
EP1202803A2 (en) * 1999-12-22 2002-05-08 Gene Logic, Inc. Flow-through chip cartridge, chip holder, system & method thereof
US6824669B1 (en) 2000-02-17 2004-11-30 Motorola, Inc. Protein and peptide sensors using electrical detection methods
US6537433B1 (en) * 2000-03-10 2003-03-25 Applera Corporation Methods and apparatus for the location and concentration of polar analytes using an alternating electric field
US7156506B2 (en) * 2000-06-15 2007-01-02 Seiko Epson Corporation Liquid charging method, liquid container, and method for manufacturing the same
US6602400B1 (en) 2000-06-15 2003-08-05 Motorola, Inc. Method for enhanced bio-conjugation events
US6632400B1 (en) * 2000-06-22 2003-10-14 Agilent Technologies, Inc. Integrated microfluidic and electronic components
US7049579B2 (en) * 2000-07-26 2006-05-23 The Regents Of The University Of California Manipulation of live cells and inorganic objects with optical micro beam arrays
US7270730B2 (en) * 2000-08-04 2007-09-18 Essen Instruments, Inc. High-throughput electrophysiological measurement system
EP1309863A1 (en) * 2000-08-08 2003-05-14 Aviva Biosciences Corporation Methods for manipulating moieties in microfluidic systems
CN100495030C (zh) 2000-09-30 2009-06-03 清华大学 多力操纵装置及其应用
US20020076825A1 (en) * 2000-10-10 2002-06-20 Jing Cheng Integrated biochip system for sample preparation and analysis
US6784420B2 (en) * 2000-11-13 2004-08-31 Genoptix, Inc. Method of separating particles using an optical gradient
US6833542B2 (en) * 2000-11-13 2004-12-21 Genoptix, Inc. Method for sorting particles
US6744038B2 (en) 2000-11-13 2004-06-01 Genoptix, Inc. Methods of separating particles using an optical gradient
US20020160470A1 (en) * 2000-11-13 2002-10-31 Genoptix Methods and apparatus for generating and utilizing linear moving optical gradients
US20030007894A1 (en) 2001-04-27 2003-01-09 Genoptix Methods and apparatus for use of optical forces for identification, characterization and/or sorting of particles
US6936811B2 (en) * 2000-11-13 2005-08-30 Genoptix, Inc. Method for separating micro-particles
US20020123112A1 (en) * 2000-11-13 2002-09-05 Genoptix Methods for increasing detection sensitivity in optical dielectric sorting systems
US6778724B2 (en) * 2000-11-28 2004-08-17 The Regents Of The University Of California Optical switching and sorting of biological samples and microparticles transported in a micro-fluidic device, including integrated bio-chip devices
JP2004518663A (ja) * 2000-12-18 2004-06-24 トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシティ 非対称なパルスフィールド電気泳動を使用した巨大分子の分画
DE60030306T2 (de) * 2000-12-28 2007-08-30 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren, System und Patrone zur Verarbeitung einer Nukleinsäure-Probe durch Oszillation der Patrone
US6707548B2 (en) 2001-02-08 2004-03-16 Array Bioscience Corporation Systems and methods for filter based spectrographic analysis
US6626417B2 (en) 2001-02-23 2003-09-30 Becton, Dickinson And Company Microfluidic valve and microactuator for a microvalve
EP1368497A4 (en) * 2001-03-12 2007-08-15 California Inst Of Techn METHOD AND DEVICE FOR ANALYZING POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES BY ASYNCHRONOUS BASE EXTENSION
WO2002075276A2 (en) * 2001-03-15 2002-09-26 The Regents Of The University Of California Positioning of organic and inorganic objects by electrophoretic forces including for microlens alignment
US20020151041A1 (en) * 2001-03-15 2002-10-17 Kreimer David I. Enhancing surfaces for analyte detection
CN100494360C (zh) * 2001-03-22 2009-06-03 博奥生物有限公司 细胞分离方法及其应用
CA2441366A1 (en) 2001-03-24 2002-10-03 Aviva Biosciences Corporation Biochips including ion transport detecting structures and methods of use
US20030153024A1 (en) * 2001-04-19 2003-08-14 Sullivan Brian M Charged bio-molecule/binding agent conjugate for biological capture
US20040009540A1 (en) * 2001-04-27 2004-01-15 Genoptix, Inc Detection and evaluation of cancer cells using optophoretic analysis
US20030194755A1 (en) * 2001-04-27 2003-10-16 Genoptix, Inc. Early detection of apoptotic events and apoptosis using optophoretic analysis
ATE367205T1 (de) * 2001-05-02 2007-08-15 Applera Corp Konzentration und reinigung von analyten mit elektrischen feldern
ITTO20010411A1 (it) * 2001-05-02 2002-11-02 Silicon Biosystems S R L Metodo e dispositivo per l'esecuzione di test e saggi ad alta processivita' ed alto valore biologico su cellule e/o composti.
DE10122659A1 (de) * 2001-05-10 2002-12-05 Infineon Technologies Ag Biochip-Anordnung
US7419574B2 (en) * 2001-06-20 2008-09-02 Cummings Eric B Dielectrophoresis device and method having non-uniform arrays for manipulating particles
US7014747B2 (en) * 2001-06-20 2006-03-21 Sandia Corporation Dielectrophoretic systems without embedded electrodes
WO2003012030A2 (en) * 2001-08-01 2003-02-13 University Of Utah, Technology Transfer Office Isoform-selective inhibitors and activators of pde3 cyclic
US6890409B2 (en) * 2001-08-24 2005-05-10 Applera Corporation Bubble-free and pressure-generating electrodes for electrophoretic and electroosmotic devices
US8980568B2 (en) 2001-10-11 2015-03-17 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample
US8986944B2 (en) 2001-10-11 2015-03-24 Aviva Biosciences Corporation Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
US7597791B2 (en) 2001-10-19 2009-10-06 The Trustees Of Princeton University Method and apparatus for generating electric fields and flow distributions for rapidly separating molecules
US6783647B2 (en) 2001-10-19 2004-08-31 Ut-Battelle, Llc Microfluidic systems and methods of transport and lysis of cells and analysis of cell lysate
FR2831084B1 (fr) * 2001-10-22 2004-08-27 Centre Nat Rech Scient Procede et systeme pour manipuler par dielectrophorese des particules dielectriques, en particulier des cellules biologiques
US20030175947A1 (en) * 2001-11-05 2003-09-18 Liu Robin Hui Enhanced mixing in microfluidic devices
US6866762B2 (en) * 2001-12-20 2005-03-15 Board Of Regents, University Of Texas System Dielectric gate and methods for fluid injection and control
WO2003060505A1 (en) * 2002-01-04 2003-07-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Wall-less channels for fluidic routing and confinement
DE10321490B3 (de) * 2002-02-05 2004-10-14 Infineon Technologies Ag Schaltkreis-Anordnung, elektrochemischer Sensor, Sensor-Anordnung und Verfahren zum Verarbeiten eines über eine Sensor-Elektrode bereitgestellten Stromsignals
DE10204652B4 (de) * 2002-02-05 2004-07-22 Infineon Technologies Ag Schaltkreis-Anordnung, elektrochemischer Sensor, Sensor-Anordnung und Verfahren zum Verarbeiten eines über eine Sensor-Elektrode bereitgestellten Stromsignals
US6887362B2 (en) * 2002-02-06 2005-05-03 Nanogen, Inc. Dielectrophoretic separation and immunoassay methods on active electronic matrix devices
US20030148362A1 (en) * 2002-02-07 2003-08-07 Eastern Virginia Medical School Of The Medical College Of Hampton Roads Diagnostic microarray and method of use thereof
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US20050100938A1 (en) * 2002-03-14 2005-05-12 Infineon Technologies Ag Vertical impedance sensor arrangement and method for producing a vertical impedance sensor arrangement
US20040033539A1 (en) * 2002-05-01 2004-02-19 Genoptix, Inc Method of using optical interrogation to determine a biological property of a cell or population of cells
US20030211461A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Genoptix, Inc Optophoretic detection of durgs exhibiting inhibitory effect on Bcr-Abl positive tumor cells
US20040011650A1 (en) * 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
GB0218009D0 (en) * 2002-08-02 2002-09-11 Imp College Innovations Ltd DNA extraction microchip, system and method
US20040053209A1 (en) * 2002-09-12 2004-03-18 Genoptix, Inc Detection and evaluation of topoisomerase inhibitors using optophoretic analysis
AU2003267175A1 (en) 2002-09-13 2004-04-30 Valentis, Inc. Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids
AU2003267255A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-08 Novus Molecular, Inc. Methods and devices for active bioassay
US8349276B2 (en) * 2002-09-24 2013-01-08 Duke University Apparatuses and methods for manipulating droplets on a printed circuit board
US7329545B2 (en) 2002-09-24 2008-02-12 Duke University Methods for sampling a liquid flow
US6911132B2 (en) 2002-09-24 2005-06-28 Duke University Apparatus for manipulating droplets by electrowetting-based techniques
US8895298B2 (en) 2002-09-27 2014-11-25 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and uses thereof
US20040067167A1 (en) * 2002-10-08 2004-04-08 Genoptix, Inc. Methods and apparatus for optophoretic diagnosis of cells and particles
CN1429917A (zh) * 2002-10-11 2003-07-16 薛永新 艾滋病毒原位核酸芯片及其制备方法
US7932098B2 (en) * 2002-10-31 2011-04-26 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Microfluidic system utilizing thin-film layers to route fluid
US20040086872A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-06 Childers Winthrop D. Microfluidic system for analysis of nucleic acids
US20040121307A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Genoptix, Inc Early detection of cellular differentiation using optophoresis
US20040121474A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Genoptix, Inc Detection and evaluation of chemically-mediated and ligand-mediated t-cell activation using optophoretic analysis
WO2004098741A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Biovitesse Apparatus and method for detecting live cells with an integrated filter and growth detection device
US20050009066A1 (en) * 2003-05-15 2005-01-13 Connolly Dennis M. Methods for localizing target molecules in a flowing fluid sample
WO2005022147A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Celula, Inc. Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network
US7347923B2 (en) * 2003-10-03 2008-03-25 Sandia Corporation Dielectrophoresis device and method having insulating ridges for manipulating particles
US20050287668A1 (en) * 2003-11-04 2005-12-29 Cell Therapeutics, Inc. (Cti) RNA interference compositions and screening methods for the identification of novel genes and biological pathways
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US8133371B2 (en) 2004-02-02 2012-03-13 The University Of British Columbia Scodaphoresis and methods and apparatus for moving and concentrating particles
US10337054B2 (en) 2004-02-02 2019-07-02 Quantum-Si Incorporated Enrichment of nucleic acid targets
US9186685B2 (en) 2012-01-13 2015-11-17 The University Of British Columbia Multiple arm apparatus and methods for separation of particles
US8529744B2 (en) 2004-02-02 2013-09-10 Boreal Genomics Corp. Enrichment of nucleic acid targets
ATE463584T1 (de) 2004-02-19 2010-04-15 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen
ATE436015T1 (de) 2004-02-26 2009-07-15 Thomsen Bioscience As Verfahren, chip, vorrichtung und integriertes system zum nachweis biologischer partikel
US7932024B2 (en) 2004-02-26 2011-04-26 Delta, Dansk Elektronik, Lys & Akustik Method, chip, device and system for collection of biological particles
US7985540B2 (en) 2004-02-26 2011-07-26 Delta, Dansk Elektronik, Lys & Akustik Method, chip, device and system for extraction of biological materials
US7187286B2 (en) 2004-03-19 2007-03-06 Applera Corporation Methods and systems for using RFID in biological field
EP1765501A1 (en) * 2004-05-28 2007-03-28 Board of Regents, The University of Texas System Programmable fluidic processors
FR2871070B1 (fr) * 2004-06-02 2007-02-16 Commissariat Energie Atomique Microdispositif et procede de separation d'emulsion
WO2006017274A2 (en) * 2004-07-13 2006-02-16 U.S. Genomics, Inc. Systems and methods for sample modification using fluidic chambers
ITPD20040301A1 (it) * 2004-11-26 2005-02-26 Dimensional Srl P Metodo ed apparato per la separazione simultanea di molecole biologiche mediante elettroforesi bidimensionale
KR100594408B1 (ko) 2004-12-17 2006-06-30 한국과학기술연구원 초음파장 및 진행파 유전영동을 이용한 세포 분리 장치
KR100738071B1 (ko) * 2005-01-21 2007-07-12 삼성전자주식회사 농도구배발생부가 구비된 유전영동 장치, 그를 이용한물질의 분리방법 및 물질 분리의 최적 조건을 탐색하는 방법
CA2496294A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-07 The University Of British Columbia Apparatus and methods for concentrating and separating particles such as molecules
JP2006242925A (ja) 2005-03-07 2006-09-14 Seiko Epson Corp 電極基板、該基板を備える検出装置および該装置を含むキット、並びに該キットを用いた検出方法
JP2006242926A (ja) 2005-03-07 2006-09-14 Seiko Epson Corp 電極基板、該基板を備える検出装置および該装置を含むキット、並びに該キットを用いた検出方法
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
EP1764418B1 (en) * 2005-09-14 2012-08-22 STMicroelectronics Srl Method and device for the treatment of biological samples using dielectrophoresis
US20070090026A1 (en) * 2005-10-06 2007-04-26 Jongyoon Han Continuous biomolecule separation in a nanofilter
EP1951860A4 (en) * 2005-11-21 2012-06-06 Life Technologies Corp PORTABLE PREPARATION, ANALYSIS AND DETECTION APPARATUS FOR THE TREATMENT OF NUCLEIC ACIDS
KR101157175B1 (ko) * 2005-12-14 2012-07-03 삼성전자주식회사 세포 또는 바이러스의 농축 및 용해용 미세유동장치 및방법
JP4748451B2 (ja) * 2006-02-08 2011-08-17 凸版印刷株式会社 ハイブリダイゼーションの検出方法
WO2007120870A2 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 University Of South Florida Microbial cell and particle control
JP4813244B2 (ja) * 2006-04-25 2011-11-09 シャープ株式会社 サンプル分離吸着器具
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8372584B2 (en) 2006-06-14 2013-02-12 The General Hospital Corporation Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
EP2041299A4 (en) * 2006-07-14 2010-01-13 Aviva Biosciences Corp METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OF RARE CELLS FROM A BIOLOGICAL SAMPLE
US8999636B2 (en) * 2007-01-08 2015-04-07 Toxic Report Llc Reaction chamber
US20100105104A1 (en) * 2007-03-05 2010-04-29 On-Chip Cellomics Consortium Chip for sampling cell component, system for analyzing cell component and method of analyzing cell component using the same
WO2009009127A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 U.S. Genomics, Inc. Method and system for transferring and/or concentrating a sample
JP2010533840A (ja) 2007-07-13 2010-10-28 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リランド スタンフォード ジュニア ユニヴァーシティ 改善された生物学的アッセイのための電場を用いる方法および器具
GB0714866D0 (en) * 2007-07-31 2007-09-12 Univ Leeds Biosensor
US8268246B2 (en) * 2007-08-09 2012-09-18 Advanced Liquid Logic Inc PCB droplet actuator fabrication
US8308926B2 (en) 2007-08-20 2012-11-13 Purdue Research Foundation Microfluidic pumping based on dielectrophoresis
GB0812679D0 (en) 2008-07-10 2008-08-20 Sec Dep For Innovation Universities Sample carrier for effecting chemical assays
WO2009068862A1 (en) 2007-11-26 2009-06-04 The Secretary Of State For Innovation, Universities And Skills Of Her Majesty's Britannic Government Electrochemical detection using silver nanoparticle labelled antibodies
WO2009094772A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 The University Of British Columbia Methods and apparatus for particle introduction and recovery
CN101231262B (zh) * 2008-02-22 2011-09-14 东南大学 用于单细胞组学的方法
GB0804491D0 (en) * 2008-03-11 2008-04-16 Iti Scotland Ltd Detecting analytes
CA2720324C (en) * 2008-04-03 2016-08-23 The Regents Of The University Of California Ex-vivo multi-dimensional system for the separation and isolation of cells, vesicles, nanoparticles and biomarkers
US8632669B2 (en) * 2008-06-06 2014-01-21 University Of Washington Method and system for concentrating particles from a solution
GB0812681D0 (en) * 2008-07-10 2008-08-20 Sec Dep For Innovation Universities Apparatus and methods for effecting chemical assays
US8361716B2 (en) * 2008-10-03 2013-01-29 Pathogenetix, Inc. Focusing chamber
US8940092B1 (en) 2008-10-27 2015-01-27 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Hybrid fibers, devices using hybrid fibers, and methods for making hybrid fibers
US10895575B2 (en) * 2008-11-04 2021-01-19 Menarini Silicon Biosystems S.P.A. Method for identification, selection and analysis of tumour cells
KR101023040B1 (ko) 2008-11-13 2011-03-24 한국항공대학교산학협력단 고속 입자분리 장치 및 그 방법
WO2010104993A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 The Regents Of The University Of California Fluidic flow cytometry devices and particle sensing based on signal-encoding
US8877028B2 (en) 2009-04-21 2014-11-04 The University Of British Columbia System and methods for detection of particles
CA2769320C (en) * 2009-08-02 2021-01-26 Qvella Corporation Cell concentration, capture and lysis devices and methods of use thereof
WO2012054904A2 (en) * 2010-10-21 2012-04-26 The Regents Of The University Of California Microfluidics with wirelessly powered electronic circuits
WO2012065075A2 (en) * 2010-11-12 2012-05-18 The Regents Of The University Of California Electrokinetic devices and methods for high conductance and high voltage dielectrophoresis (dep)
US20120219987A1 (en) * 2010-12-13 2012-08-30 Tofy Mussivand Device for electroporation and lysis
CA2742327A1 (en) 2011-05-20 2012-11-20 The University Of British Columiba Systems and methods for enhanced scoda
ES2759824T3 (es) 2011-07-25 2020-05-12 Qvella Corp Métodos y dispositivos para preparación de muestra eléctrica
US11198126B2 (en) 2011-10-31 2021-12-14 Fluid-Screen, Inc. Apparatus for pathogen detection
US9120105B2 (en) 2011-10-31 2015-09-01 Monika Weber Electronic device for pathogen detection
FR2986802A1 (fr) * 2012-02-13 2013-08-16 Centre Nat Rech Scient Dispositif et procede de manipulation et traitement de cellules par champ electrique.
EP2839035B1 (en) 2012-04-16 2020-11-25 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8932815B2 (en) 2012-04-16 2015-01-13 Biological Dynamics, Inc. Nucleic acid sample preparation
US8685708B2 (en) 2012-04-18 2014-04-01 Pathogenetix, Inc. Device for preparing a sample
US9028776B2 (en) 2012-04-18 2015-05-12 Toxic Report Llc Device for stretching a polymer in a fluid sample
WO2013166444A2 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Boreal Genomics Corp. Biomarker analysis using scodaphoresis
GB201217390D0 (en) 2012-09-28 2012-11-14 Agplus Diagnostics Ltd Test device and sample carrier
WO2014062719A2 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Nanocellect Biomedical, Inc. Systems, apparatus, and methods for sorting particles
US10662420B2 (en) 2012-11-30 2020-05-26 Qvella Corporation Apparatus and method for extracting microbial cells
US8975060B2 (en) * 2012-11-30 2015-03-10 Qvella Corporation Method for pretreatment of microbial samples
US9340835B2 (en) 2013-03-15 2016-05-17 Boreal Genomics Corp. Method for separating homoduplexed and heteroduplexed nucleic acids
CN103627788A (zh) * 2013-08-21 2014-03-12 中山大学达安基因股份有限公司 一种电化学基因传感器生物芯片的制备方法
MX2016013216A (es) 2014-04-08 2017-05-01 Biological dynamics inc Dispositivos mejorados para la separacion de materiales biologicos.
CN103894248B (zh) * 2014-04-09 2015-09-16 国家纳米科学中心 一种单细胞分析用微流控芯片和系统及单细胞分析方法
ES2749925T3 (es) 2014-04-24 2020-03-24 Lucira Health Inc Detección colorimétrica de amplificación de ácido nucleico
US11130986B2 (en) 2015-05-20 2021-09-28 Quantum-Si Incorporated Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins
CN104897888A (zh) * 2015-05-27 2015-09-09 合肥卓元科技服务有限公司 一种分隔式酶反应传感器系统
CN106310944B (zh) * 2015-07-01 2022-10-11 王冰 用于分离介质内颗粒和小液滴的介电电泳电极及电极阵列
EP3361231B1 (en) * 2015-10-07 2021-02-17 AFI Corporation Inspection device, inspection system, and inspection method
JP6796932B2 (ja) * 2016-02-16 2020-12-09 株式会社Ａｆｉテクノロジー 分離装置
WO2017160840A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Diassess Inc. Selectively vented biological assay devices and associated methods
CA3018900A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Biological Dynamics, Inc. Disposable fluidic cartridge and components
EP3442711B1 (en) 2016-04-15 2020-12-09 Fluid-Screen, Inc. Analyte detection methods and apparatus using dielectrophoresis and electroosmosis
WO2017184178A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Cell lysis
US11067535B2 (en) * 2016-10-27 2021-07-20 Sharp Kabushiki Kaisha Fluorescent testing system, dielectrophoresis device, and molecular testing method
US11080848B2 (en) 2017-04-06 2021-08-03 Lucira Health, Inc. Image-based disease diagnostics using a mobile device
EP3622084A4 (en) 2017-05-08 2021-02-17 Biological Dynamics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR PROCESSING ANALYTICAL INFORMATION
US10549275B2 (en) 2017-09-14 2020-02-04 Lucira Health, Inc. Multiplexed biological assay device with electronic readout
CN116121340A (zh) 2017-12-19 2023-05-16 生物动力学公司 用于从生物样品中检测多种分析物的方法和装置
CN117599868A (zh) 2018-01-30 2024-02-27 生命技术公司 用于智能分子分析系统的工作流中的仪器、装置和消耗品
CN117065932A (zh) 2018-04-02 2023-11-17 生物动力学公司 介电材料
USD907232S1 (en) 2018-12-21 2021-01-05 Lucira Health, Inc. Medical testing device
CN113646088B (zh) * 2019-03-05 2023-07-04 卢西拉健康公司 对流体室的无气泡液体填充
EP3940385A4 (en) * 2019-03-11 2022-11-23 Boe Technology Group Co., Ltd. MICROCANAL, ITS PREPARATION METHOD AND ITS OPERATING METHOD
MX2022005183A (es) 2019-10-29 2022-08-08 Quantum Si Inc Bombeo peristáltico de fluidos y métodos, sistemas y dispositivos asociados.
WO2021097035A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Fluid-Screen, Inc. An apparatus and methods to rapidly detect, separate, purify, and quantify various viruses from cells, cultured medium and other fluids
CA3161454A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Fluid-Screen, Inc. Methods and apparatus for detection of bacteria in a sample using dielectrophoresis
US11542541B2 (en) 2019-11-26 2023-01-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and system for sampling material from cells
CN111250183B (zh) * 2020-02-17 2021-04-09 北京中科生仪科技有限公司 一种微流控系统用注液泵驱动装置
USD953561S1 (en) 2020-05-05 2022-05-31 Lucira Health, Inc. Diagnostic device with LED display
CN111644212B (zh) * 2020-05-22 2022-05-24 华东理工大学 一种微流控芯片和纳米颗粒分离装置
USD962470S1 (en) 2020-06-03 2022-08-30 Lucira Health, Inc. Assay device with LCD display
US20220042944A1 (en) * 2020-07-24 2022-02-10 Palogen, Inc. Nanochannel systems and methods for detecting pathogens using same
CN112986556B (zh) * 2021-05-12 2022-02-18 佛山微奥云生物技术有限公司 一种用于快速检测的芯片及其加工方法

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3346479A (en) * 1964-04-09 1967-10-10 Scientific Industries Preparative separation by a combination of gel separation and electrophoresis
US3375187A (en) * 1965-05-13 1968-03-26 Buchler Instr Inc Apparatus for temperature controlled preparative and analytical electrophoresis
US3533933A (en) * 1967-03-31 1970-10-13 Hannig Kurt Process and device for the isolation of fractions of a substance mixture electrophoretically separated in a carrier gel
US3539493A (en) * 1967-08-31 1970-11-10 Canal Ind Corp Apparatus for preparative electrophoresis on gel support media
US3627137A (en) 1968-10-10 1971-12-14 Milan Bier Dialyzing membrane envelope
DE1807481C3 (de) * 1968-11-07 1975-10-09 Messerschmitt-Boelkow-Blohm Gmbh, 8000 Muenchen Verfahren zum partiellen Galvanisieren
US3616454A (en) * 1969-03-13 1971-10-26 Univ New York Method of and apparatus for electrophoretic separation in a gel column
US3640813A (en) * 1969-06-09 1972-02-08 Samuel T Nerenberg Adapter for a macromolecule separation device
DE2051715B2 (de) 1970-10-21 1976-01-15 Trennkammer fuer die kontinuierliche ablenkungselektrophorese
JPS4821679U (ko) 1971-07-16 1973-03-12
NL7115364A (ko) * 1971-11-08 1973-05-10
DE2221242C3 (de) * 1972-04-29 1974-09-26 Stephan 8520 Erlangen Nees Gerät für die präparat!ve Elektrophorese und Verfahren zu deren Durchführung mit diesem Gerät
SU434985A1 (ru) 1972-06-07 1974-07-05 Устройство для препаративного разделения высокомолекулярных биологических веществ
GB1359944A (en) 1972-07-18 1974-07-17 Miles Lab Apparatus for gel electrophoresis
US3795600A (en) * 1973-03-23 1974-03-05 Instrumentation Specialties Co Electrophoresis and method apparatus
US3980546A (en) * 1975-06-27 1976-09-14 Caccavo Francis A Micropreparative electrophoresis apparatus
NL182822C (nl) * 1976-05-18 1988-05-16 Roskam Willem Gerrit Preparatief elektroforese-apparaat.
SU616568A1 (ru) 1977-01-24 1978-07-25 Специальное Конструкторское Бюро Биофизической Аппаратуры Устройство дл электрофоретического разделени веществ
US4326934A (en) 1979-12-31 1982-04-27 Pohl Herbert A Continuous dielectrophoretic cell classification method
US4390403A (en) * 1981-07-24 1983-06-28 Batchelder J Samuel Method and apparatus for dielectrophoretic manipulation of chemical species
JPS58147639A (ja) 1982-02-26 1983-09-02 Hideyuki Nishizawa 連続電気泳動分離法および装置
DE3374082D1 (en) * 1982-07-23 1987-11-19 Matthias Hediger Apparatus for preparative gel electrophoresis, in particular for separating mixtures on a gradient gel polyacryl amide column
US4441972A (en) * 1983-04-08 1984-04-10 D.E.P. Systems, Inc. Apparatus for electrofusion of biological particles
US4661451A (en) * 1984-02-06 1987-04-28 Ortho Diagnostic Systems, Inc. Methods for immobilizing and translocating biological cells
EP0155833A3 (en) 1984-03-15 1988-07-27 Fuji Photo Film Co., Ltd. Element for electrophoresis
FR2574311B1 (fr) 1984-12-11 1989-09-15 Inst Nat Sante Rech Med Perfectionnements aux procedes et appareils d'electrophorese preparative
US4617102A (en) 1985-03-21 1986-10-14 Lifecodes Corp. Process and apparatus for purifying and concentrating DNA from crude mixtures containing DNA
US4740283A (en) * 1986-02-27 1988-04-26 University Patents, Inc. Pulsed-field gradient gel electrophoretic apparatus
US4699706A (en) * 1986-05-30 1987-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and apparatus for extraction of species from electrophoresis media
US5593580A (en) 1986-11-26 1997-01-14 Kopf; Henry B. Filtration cassette article, and filter comprising same
ES2037273T3 (es) * 1987-04-11 1993-06-16 Ciba-Geigy Ag Proceso de focalizacion isoelectrica y medios para llevar a cabo dicho proceso.
US4787963A (en) * 1987-05-04 1988-11-29 Syntro Corporation Method and means for annealing complementary nucleic acid molecules at an accelerated rate
US4936963A (en) 1987-05-27 1990-06-26 Abbott Laboratories Polycationic buffers and method for gel electrophoresis of nucleic acids
US5202010A (en) 1987-11-25 1993-04-13 Princeton Biochemicals, Inc. Automated capillary electrophoresis apparatus
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US4908112A (en) * 1988-06-16 1990-03-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Silicon semiconductor wafer for analyzing micronic biological samples
US5188963A (en) * 1989-11-17 1993-02-23 Gene Tec Corporation Device for processing biological specimens for analysis of nucleic acids
US5382511A (en) * 1988-08-02 1995-01-17 Gene Tec Corporation Method for studying nucleic acids within immobilized specimens
US4877510A (en) * 1988-10-25 1989-10-31 Bio-Rad Laboratories, Inc. Apparatus for preparative gel electrophoresis
US5062942A (en) * 1989-04-12 1991-11-05 Hitachi, Ltd. Fluorescence detection type electrophoresis apparatus
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5344535A (en) * 1989-11-27 1994-09-06 British Technology Group Limited Dielectrophoretic characterization of micro-organisms and other particles
US5795457A (en) * 1990-01-30 1998-08-18 British Technology Group Ltd. Manipulation of solid, semi-solid or liquid materials
US5126022A (en) * 1990-02-28 1992-06-30 Soane Tecnologies, Inc. Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
US5085756A (en) * 1990-08-21 1992-02-04 Hewlett-Packard Company Column separation system for electrophoresis with sample pretreatment
US5527670A (en) 1990-09-12 1996-06-18 Scientific Generics Limited Electrochemical denaturation of double-stranded nucleic acid
US5269931A (en) * 1990-09-17 1993-12-14 Gelman Sciences Inc. Cationic charge modified microporous membranes
US5151189A (en) * 1990-09-17 1992-09-29 Gelman Sciences, Inc. Cationic charge modified microporous membrane
US5340449A (en) * 1990-12-07 1994-08-23 Shukla Ashok K Apparatus for electroelution
JP3104995B2 (ja) * 1991-01-31 2000-10-30 ワーナー−ランバート・コンパニー 抗炎症剤として有用な４，６−ジ−第三ブチル−５−ヒドロキシ−１，３−ピリミジンの置換されたヘテロアリール類似体
US5217593A (en) * 1991-03-13 1993-06-08 Macconnell William P Nucleic acid purification system and method
US5139637A (en) * 1991-03-13 1992-08-18 Macconnell William P Plasmid purification system and method
US5078853A (en) 1991-03-22 1992-01-07 Assay Technology, Inc. Segmented electrophoretic separation system useful for lipid profiling
US5209831A (en) * 1991-06-14 1993-05-11 Macconnell William P Bufferless electrophoresis system and method
US5161165A (en) * 1991-09-26 1992-11-03 Hewlett-Packard Company Multimode stabilized external cavity laser
US6048690A (en) 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6051380A (en) 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5849486A (en) 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US5846708A (en) 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
EP0544969B1 (de) 1991-12-06 1997-03-05 Ciba-Geigy Ag Elektrophoretische Trennvorrichtung und elektrophoretisches Trennverfahren
JPH05236997A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
GB9208357D0 (en) * 1992-04-16 1992-06-03 British Tech Group Apparatus for separating a mixture
US5340499A (en) 1992-08-11 1994-08-23 Neste Oy Electrically conductive compositions and methods for their preparation
US5376249A (en) * 1992-11-25 1994-12-27 Perseptive Biosystems, Inc. Analysis utilizing isoelectric focusing
GB9301122D0 (en) * 1993-01-21 1993-03-10 Scient Generics Ltd Method of analysis/separation
GB9306729D0 (en) * 1993-03-31 1993-05-26 British Tech Group Improvements in separators
US5427664A (en) 1993-07-22 1995-06-27 Stoev; Stoyan V. Free solution electrophoresis-membrane filters trapping assay apparatus and method
US6309601B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Scanning optical detection system
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6099803A (en) 1994-07-07 2000-08-08 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
DE4400955C2 (de) * 1993-12-23 1999-04-01 Fraunhofer Ges Forschung Adhäsionssteuerbare Oberflächenstruktur
US6071394A (en) 1996-09-06 2000-06-06 Nanogen, Inc. Channel-less separation of bioparticles on a bioelectronic chip by dielectrophoresis
US5728267A (en) 1994-11-15 1998-03-17 Flaherty; James E. Concentrator for separating small samples in a centrifuge
WO1997008293A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 Scientific Generics Limited Release of intracellular material
US5858192A (en) * 1996-10-18 1999-01-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for manipulation using spiral electrodes
AU6751800A (en) 1999-08-13 2001-03-13 Aventis Research And Technologies Gmbh Microelectronic molecular descriptor array devices, methods, procedures, and formats for combinatorial selection of intermolecular ligand binding structures and for drug screening
US6960298B2 (en) 2001-12-10 2005-11-01 Nanogen, Inc. Mesoporous permeation layers for use on active electronic matrix devices
US20040011650A1 (en) 2002-07-22 2004-01-22 Frederic Zenhausern Method and apparatus for manipulating polarizable analytes via dielectrophoresis

Also Published As

Publication number Publication date
CA2319705C (en) 2008-07-15
CN1291913A (zh) 2001-04-18
EP1053055B1 (en) 2003-07-30
AU2344599A (en) 1999-08-16
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WO1999038612A1 (en) 1999-08-05
DE69909971D1 (de) 2003-09-04
US6989086B2 (en) 2006-01-24
KR100512518B1 (ko) 2005-09-06
ATE246040T1 (de) 2003-08-15
JP2002502047A (ja) 2002-01-22
CA2319705A1 (en) 1999-08-05
BR9908349A (pt) 2000-12-05
US6071394A (en) 2000-06-06
AU743074B2 (en) 2002-01-17
US6280590B1 (en) 2001-08-28

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