KR20000076147A - 항류마티스제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온으로 이루어진 군 중에서 선택된 1 이상의 화합물 및 이들의 염을 유효 성분으로 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 항류마티스제에 관한 것이다.
화학식 I

Description

항류마티스제{ANTIRHEUMATIC AGENTS}
염증은 생체가 외부로부터의 침입에 대하여 방어적으로 작동하여, 내인성의 활성 물질을 생산함으로써 몸의 상태를 적응시키고 있는 결과라고 생각되고 있다. 그러나, 이들에 의해서 일어나는 반응이 해가 되어, 병적인 상태를 유발하는 경우가 많다. 또한 자기 면역 질환에 있어서의 염증은 면역 세포가 자기를 이물질이라고 간주하여, 정상 세포에 대해서도 장해적으로 작동함으로써 발생한다.
핼퍼 T(Th) 세포에는 매크로파지(Mφ) 등의 세포성 면역의 활성화를 촉진하는 시토킨인 인터페론 γ(IFN-γ), 인터류킨-2를 생산하는 Th1 세포와 항체 생산에 관여한 액성 면역을 활성화하는 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-10을 생산하는 Th2 세포가 존재하는 것이 보고되어 있다.
또한 Th1 세포와 Th2 세포는 각각 생산하는 시토킨에 의해서 서로 제어하고 있는 것도 개시되어 있다. 즉, Th1 세포가 생산하는 IFN-γ는 Th2 세포의 활성화를 제어하여 Th1 세포의 활성화를 유도한다. 반대로 Th2 세포가 생산하는 인터류킨-10은 Th1 세포의 활성화를 제어하고, 인터류킨-4는 Th2 세포의 활성화를 유도한다.
자기 면역 질환은 크게 나누어 장기 특이성의 것과 전신성의 것으로 분류되어 있다. 전신성 자기 면역 질환이나 알레르기 질환은 Th2 우위의 면역 응답에 의해 병태(病態)가 형성되는 데에 반해, 장기 특이성 자기 면역 질환이나 염증성 질환은 Th1 우위의 면역 응답에 의해 병태가 형성된다고 생각된다.
자기 면역 질환의 하나인 만성 관절 류마티스는 관절 부위에서의 특이적인 염증이라고 생각되며, 장기 특이적, 즉 Th1 개재 자기 면역 질환일 가능성이 시사된다. 실제로, 류마티스 환자의 염증 부위에 있어서는 Th1 유래의 시토킨에 의해 유도, 활성화되었다고 생각되는 Mφ 및 호중구의 침윤, 동시에 Mφ로부터 생산되는 종양 괴사 인자 -α의 현저한 증가가 확인되고 있다. 또한 그 밖의 장기 특이성 자기 면역 질환이나 염증성 질환에 있어서도 동일한 양상의 조직 소견이 관찰되고 있고, Th1에 의해 유도된 이들 염증 세포 및 염증성 시토킨에 의해 염증이 더욱 악화되고 있다고 생각된다.
이러한 사실로부터, 만성 관절 류마티스 등의 장기 특이성 자기 면역 질환이나 염증성 질환의 치료에 있어서는 염증을 직접 야기하고 있다고 생각되는, Mφ로부터 생산되는 종양 괴사 인자의 억제, 및 Th1 억제 시토킨인 인터류킨-l0의 유도가 중요하다고 생각된다{문헌[이가쿠노아유미, 이시야쿠슈판사 발간, 제182권, pp. 523∼528, pp. 661∼665(1997)] 참조}.
만성 관절 류마티스의 약물 치료법으로서는, 스테로이드, 비스테로이드계 항염증제와, 금, D-페니실라민 등의 관해(寬解) 도입약에 의한 내과적 치료가 행해지고 있다.
본 발명은 만성 관절 류마티스 등의 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용한 의약, 식품 및 음료에 관한 것이다.
도 1은 Jurkat 세포의 증식에 대한 시클로펜텐온의 영향을 나타낸 도면.
도 2는 Molt-3 세포의 증식에 대한 시클로펜텐온의 영향을 나타낸 도면.
도 3은 Molt-3 세포에 있어서의 Fas 항원의 발현을 나타낸 도면.
도 4는 Jurkat 세포에 있어서의 Fas 항원의 발현을 나타낸 도면.
도 5는 Molt-3 세포에 10μM 시클로펜텐온을 첨가하여 배양했을 때의 Fas 항원 발현 세포의 비율의 변화를 나타낸 도면.
도 6은 시클로펜텐온의 양과 발 부종 증가율의 관계를 나타낸 도면.
도 7은 시클로펜텐온의 양과 종양 괴사 인자 생산량의 관계를 나타낸 도면.
도 8은 배양액 중의 시클로펜텐온 농도와 NO2 -농도의 관계를 나타낸 도면.
도 9는 시클로펜텐온 존재 하에 배양 시간과 생세포수의 관계를 나타낸 도면.
도 10은 시클로펜텐온의 지연형 과민 반응 억제 작용을 나타낸 도면.
도 11은 시클로펜텐온의 임파구 유약화(幼若化) 억제 작용을 나타낸 도면.
도 12는 시클로펜텐온의 혼합 임파구 반응 억제 작용을 나타낸 도면.
도 13은 (-)형 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)형 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타낸 도면.
도 14는 (+)형 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)형 시클로펜텐온의 입체 구조를 나타낸 도면.
발명의 실시 형태
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 있어서 사용하는 화학식 Ⅰ로 표시되는 시클로펜텐온은 4 번과 5 번 위치에 존재하는 히드록실기의 입체 배치에 따른 시스형 이성질체와 트랜스형 이성질체 양쪽 모두를 포함한다. 본 발명에 있어서는 시스형 시클로펜텐온을 사용하여도 좋고, 트랜스형 시클로펜텐온을 사용하여도 좋으며, 시스형 시클로펜텐온과 트랜스형 시클로펜텐온의 혼합물을 사용하더라도 좋다. 또한 이들의 광학 활성체를 이용하여도 좋다.
시스형 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서 얻을 수 있다 {문헌[Helvetica Chimica Acta, 제55권, pp.2838∼2844(1972)] 참조}. 트랜스형 시클로펜텐온은 화학 합성법에 의해서도 얻을 수 있고{문헌[Carbohydrate Res., 제247권, pp.217∼222(1993)] 참조}, 또한 우론산(예, 글루쿠론산), 우론산 유도체(예, 글루쿠로노락톤), 또는 이들의 함유물 등을 가열 처리함으로써도 얻을 수 있다(PCT/JP97/03052호 명세서 참조). 본 발명에서는 시클로펜텐온을 함유하는 이들의 가열 처리물, 그 부분 정제물 및 정제물도 사용할 수 있다.
예컨대, 우론산으로서 D-글루쿠론산를 사용하여, 그 1% 용액을 121℃에서 4시간 가열 처리함으로써, 가열 처리물 중에 시클로펜텐온이 생성된다. 이 가열 처리물 중의 시클로펜텐온을 용매로 추출하고, 이 추출물을 농축한다. 이어서, 이 농축물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하여, 용출되는 시클로펜텐온 분획을 농축하고, 농축물로부터 시클로펜텐온을 클로로포름으로 추출하여, 추출 농축물의 순상(順相) 칼럼 크로마토그래피를 행함으로써, 가열 처리물 중의 시클로펜텐온이 단리된다.
시클로펜텐온의 물성은 하기와 같이 나타낼 수 있다. 또한 시클로펜텐온의 질량 분석은 DX302 질량 분석계(니혼덴시사 제조)를 이용하여 수행하였다. 또한 중(重)클로로포름 용매를 이용한 NMR 스펙트럼의 측정은 JNM-A500(니혼덴시사 제조)을 이용한다. 비선광도는 DlP-370형 선광계(니혼분코사 제조)를, UV 흡수 스펙트럼은 UV-2500 분광 광도계(시마즈세이사쿠쇼 제조)를, 적외 흡수 스펙트럼(IR)은 FTIR- 8000 적외 분광 광도계(시마즈세이사쿠쇼 제조)를 각각 이용하여 측정하였다.
MS : m/z 115〔M+H〕+
1H-NMR(CDCl3) : δ4.20(1H, d, J=2.4Hz, 5-H), 4.83(1H, m, 4-H), 6.30(1H, dd, J=1.2, 6.1Hz, 2-H), 748(1H, dd, J=2.1, 6.1Hz, 3-H).
단,1H-NMR의 화학 이동치는 CHC13의 화학 이동치 7.26 ppm을 기준으로 하여 나타내었다.
선광도 :〔α〕D 200°(c 1.3, 물)
UV : λmax 215 nm(물)
IR(KBr법) : 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm-1에 흡수를 갖는다.
단리된 시클로펜텐온을 광학 분할함으로써, (-)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 및 (+)-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온을 얻을 수 있다. 물론, 합성 방법에 의해 얻은 시클로펜텐온도 광학 분할할 수 있다.
예컨대, 시클로펜텐온을 에탄올에 용해시킨다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6)을 더 첨가하여, 시클로펜텐온 용액을 조제한다. 이 시료 용액을, 예컨대 Chiral Pack AS(다이셀가가쿠고교) 칼럼을 이용하여 칼럼 온도 : 40℃, 이동상 : 헥산/에탄올(94/6)로 HPLC를 수행함으로써, 시클로펜텐온을 광학 분할할 수 있다.
분할된 (-)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온〔이후, (-)형 시클로펜텐온이라고 명명함]의 선광도는 〔α〕D 20-105°(c 0.30, 에탄올)이며, (+)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온〔이후, (+)형 시클로펜텐온이라고 명명함〕의 선광도는 〔α〕D 20+104°(c 0.53, 에탄올)이다. 또한 선광도는 상기 DIP-370형 선광계(니혼분코사 제조)를 이용하여 측정한다.
다음에 (-)형 시클로펜텐온 및 (+)형 시클로펜텐온 각각의 질량 분석, 핵 자기 공명법(NMR)에 의한 구조 해석, UV 흡수 스펙트럼의 측정, 적외 흡수 스펙트럼의 측정을 상기 방법에 준하여 수행한다. 그 결과, 양 광학 활성체는 광학 분할 전의 시클로펜텐온과 동일한 결과를 나타내었다.
광학 분할된 (-)형 시클로펜텐온 및 (+)형 시클로펜텐온을 각각 p-디메틸아미노벤조일 유도체로 하여, J-720형 원이색성 분산계(니혼분코사 제조)를 이용하여, 원이색성 스펙트럼(CD)을 측정하고, 그 결과를 디벤조에이트 키랄성 규칙에 적용하여{문헌[J. Am. Chem Soc., 제91권, pp.3989∼3991(1969)] 참조}, 그 입체 배치를 결정하였다.
(-)형 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (-)형 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 13에 도시한다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또한 상기 입체 구조를, 하기 화학식 Ⅱ로 하기에 나타낸다.
(+)형 시클로펜텐온의 p-디메틸아미노벤조일 유도체의 CD 및 (+)형 시클로펜텐온의 입체 구조를 도 14에 도시한다. 도면 중, 종축은 몰 원이색성, 횡축은 파장(nm)을 나타낸다. 또한 상기 입체 구조를 하기 화학식 Ⅲ으로 나타낸다.
도 13, 도 14 및 화학식 Ⅱ, 화학식 Ⅲ에 나타낸 바와 같이 (-)형 시클로펜텐온은 (-)-(4R,5S)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온, (+)형 시클로펜텐온은 (+)-(4S,5R)-트랜스-4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온이다.
이상, 본 발명에 사용하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체는 어떠한 방법으로 제조하더라도 좋고, 명세서에 개시된 방법으로 제조하여도 좋으며, 화학 합성방법으로 합성하여도 좋고, 시클로펜텐온의 트랜스형, 시스형, 이들의 혼합물 및 이들의 광학 활성체도 본 발명에 사용된다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체의 염으로는 의약적으로 허용되는 염이 있고, 공지의 방법으로 변환시킬 수 있다.
시클로펜텐온은 생체내에서, 예컨대 SH기 함유 화합물(예 시스테인, 글루타티온 등)과 반응하여, 의약으로서 유용한 대사 유도체를 생성한다. 따라서, 이 대사 유도체가 나타내는 약효는 시클로펜텐온을 투여한 경우에 있어서도 얻을 수 있다고 생각된다. 생체 내에서의 시클로펜텐온과 SH기 함유 화합물과의 반응 생성물은 대사 유효 물질의 하나로 추정된다.
즉, SH기 함유 화합물(R-SH)에 관해서 예시하면, 시클로펜텐온은 SH기 함유 화합물과 반응하여, 예컨대 하기 화학식 Ⅳ 또는 하기 화학식 Ⅴ로 표시되는 화합물이 된다. 또한 하기 화학식 V로 표시되는 화합물은 하기 화학식 Ⅳ로 표시되는 화합물로 변환된다.
이와 같이 시클로펜텐온은 SH기 함유 화합물(R-SH)의 존재 하에, 각 대사 유도체로 변환되어, 생체내에 있어서 생성되는 이들의 대사 유도체도 의약으로서의 효과를 발휘한다.
(단, R은 SH기 함유 화합물에서 SH기를 제거한 잔기이다.)
(단, R은 SH기 함유 화합물에서 SH기를 제거한 잔기이다.)
따라서, 이들 생체내에서 형성되는 반응 생성물, 즉 생체내에서의 대사 유도체의 형성을 목적으로 하는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 사용하는 것도 본 발명에 포함된다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 항류마티스 작용, 만성 관절 류마티스 억제 작용 등의 생리 활성을 갖는 화합물이며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 하여, 이것을 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화하면 항류마티스제를 제조할 수 있다. 그 의약의 제조는 일반적으로 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 약학적으로 허용 가능한 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라서 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 가하여, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 제조할 수 있다. 또한 이것을 사용 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로서 얻어지는 건조품으로 제조할 수 있다.
의약용 담체는 상기 투여 형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있으며, 경구제의 경우에는, 예컨대 전분, 젖당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀루로오스, 옥수수 전분, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 따라서는, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제(嬌味劑), 착색제, 향료 등을 더 배합할 수도 있다.
한편, 비경구제의 경우에는, 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효 성분인 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리 식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜, 필요에 따라서 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가함으로써 조제된다.
본 발명의 항류마티스제는 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여한다. 투여 방법도 특별히 한정되지는 않고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있고, 외용제에는 좌약제 등도 포함된다.
본 발명의 항류마티스제의 투여량은 적응증, 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라 적절히 설정되며, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물의 양이 성인 1 일 당 0.1 ㎍∼200 ㎎/㎏이다. 물론 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동되기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 그 범위를 넘어 필요한 경우도 있다. 본 발명의 약제는 그대로 경구 투여하는 것 이외에, 임의의 식품 또는 음료에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 전술한 항류마티스 작용, 만성 관절 류마티스 억제 작용 뿐만 아니라 관절염 등에서 항염증 작용, 캐라게난 부종 억제 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용, 인터류킨-10 생산 증강 작용, 일산화질소 생산 억제 작용, 활막 세포에서의 세포 소멸 유도 작용, Fas 항원 생산 유도 작용, 면역 조절 작용, 예컨대 지연형 과민 반응 억제 작용, 임파구 유약화 반응 억제 작용, 혼합 임파구 반응 억제 작용, IgE 생산 억제 작용, 토포이소메라아제(topoisomerase) 저해 작용 등의 다양한 생리 활성을 지니며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 유효 성분으로 하는 항염증제 또는 염증 예방제, 종양 괴사 인자 생산 억제제 또는 종양 괴사 인자 생산 예방제, 인터류킨-10 생산 증강제, 일산화질소 생산 억제제, Fas 항원 생산 유도제, 면역 조절제, IgE 생산 억제제, 지연형 과민 반응 억제제, 토포이소메라아제 저해제 등의 의약을 상기 항류마티스제에 준하여 제제화할 수 있고, 상기 항류마티스제에 준한 방법으로 투여할 수 있다.
이들 제제의 투여량은 상기 항류마티스제에 준하여 적절하게 설정할 수 있다. 예컨대, 항염증제, 종양 괴사 인자 생산 억제제로서는 제제 중에 함유되는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물의 양이 적합하게는 성인 1 일 당 10 pg∼50 ㎎/㎏이며, 일산화질소 생산 억제제로서는 제제 중에 함유되는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물의 양이 적합하게는 성인 1 일 당 0.1 ㎍∼20 ㎎/㎏이며, 사용 목적에 따라 제제 중의 유효 성분의 양을 조절할 수 있다. 이들 약제는 그대로 경구 투여하는 것 이외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.
류마티스는 골막 세포나 연골 세포에 장해가 발생하는 자기 면역 질환이며, 본 발명의 항류마티스제는 자기 면역 질환 치료제로서도 유용하다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 만성 관절 류마티스 등의 장기 특이성 자기 면역 질환이나 염증성 질환에 있어서, 염증을 직접 야기하고 있다고 생각되는 종양 괴사 인자의 생산을 억제하고, Th1 억제 시토킨인 인터류킨-l0의 생산을 증강한다. 따라서, 염증, 예컨대 장기 특이성 자기 면역 질환인 류마티스, 특히 만성 관절 류마티스의 증상이 개선되고, 염증 마커인 C 반응 단백(CRP)치, 류마토이드 인자(RF)치, 적혈구 침강 속도(혈침)치가 격감되어, 보행 곤란 등의 합병 증상도 현저히 개선된다.
종양 괴사 인자는 종양 부위에 출혈성 괴사를 유도하는 인자로서 발견되었지만, 현재는 염증을 기본으로 한 생체 방어·면역 기구에 널리 관계되는 시토킨으로서 인식되고 있다. 이 종양 괴사 인자의 생산 조절 기구의 파탄은 각종 문제를 숙주에도 초래하여, 종양 괴사 인자의 과도 또는 미조절의 생산은 만성 관절성 류마티스, 류마티스성 척수염, 변형성 관절증, 통풍성 관절염, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 그램 음성균 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 뇌성 말라리아, 만성 폐렴, 이식편 대 숙주 반응, 동종 이식편 거절 반응, 인플루엔자와 같은 감염증에 의한 발열 및 근육통, 감염 또는 악성 종양에 대하여 이차적인 악액질, 사람의 후천성 면역 부전 증후군(AIDS)에 대하여 이차적인 악액질, AIDS, AIDS 관련 증후군, 켈로이드 형성, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 자기 면역 당뇨병 및 전신 에리테마토데스 등의 자기 면역 질환을 포함하는 이들 대부분의 질환에 관련되어 있다{문헌[Molecular Medicine, 제33권, pp. 1010∼1020, pp.1182∼1189(1996)] 참조}. 본 발명의 항류마티스제는 종양 괴사 인자에 의해 매개되거나 또는 악화되는 병상의 치료에도 유용하다. 또한 본 발명에 의해, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로서 사용하는 종양 괴사 인자의 생산 조절 방법이 제공된다. 또한 본 발명에 의해, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 함유하여, 종양 괴사 인자에 의해 매개되거나 또는 악화되는 질병의 병상(病狀) 개선용 식품 또는 음료, 또는 질병 예방용 식품 또는 음료가 제공된다.
일산화질소(이하, NO라고 약칭함)는 내피 세포 유래 혈관 평활근 이완 인자(EDRF)의 본체이다{문헌[Nature, 제327권, pp. 524∼526(1987)] 참조}. 본 발명은 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 NO 생산의 억제를 필요로 하는 질병 치료용 의약 또는 질병 예방용 의약을 제공한다. 본 발명에 있어서, NO 생산의 억제를 필요로 하는 질병은 특히 한정되지는 않지만, 예컨대 독성 쇼크나 어떤 종류의 시토킨에 의한 치료 등에 의해 전신성 혈압 저하, 혈압 응답 저하, 자기 면역 질환, 염증, 관절염, 류마티스성 관절염, 당뇨병, 염증성 장질환, 혈관 기능 부전, 병인성 혈관 확장, 조직 손상, 심장 혈관계 허혈, 통감(痛感) 과민증, 뇌허혈, 혈관 신생을 동반하는 질병, 암 등이 있고, 일본 특허 공개 평9-504524호, 일본 특허 공개 평9-505288호, 일본 특허 공개 평8-501069호, 일본 특허 공개 평8-512318호, 일본 특허 공개 평6-508849호의 각 공보에 기재된 질병을 포함한 것이다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 NO 생산 억제제는 NO 생산 기구 연구, NO 작용 기작 연구에도 유용하며, 또한 NO 생산 기구에 관여하는 물질의 스크리닝에 사용할 수도 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 NO 생산 세포에 대하여 NO 생산 억제 작용을 나타낸다. 예컨대, 매크로파지 세포주에 엔도톡신(LPS)을 첨가하면 유도형 NO 합성 효소(NOS)가 발현되어 NO가 배지 중으로 분비되지만, 시클로펜텐온, 시클로펜텐온 유도체, 또는 이들의 광학 활성체 공존 하에 LPS를 작용시키면 NO 생산은 억제된다. LPS 처리로 NO 생산을 유도한 경우, NO의 세포 장해 활성에 의해서 세포 생존율은 저하되지만, LPS 처리시에 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 첨가하면 NO의 생산이 저하되어, 세포에 대한 장해도 감소한다.
고형 암의 증대에 혈관 신생은 필수이지만, 결함 내피 증식 인자/혈관 투과성 항진 인자(VEGF)는 이 과정에 중요한 역할을 하고 있다. 각종 암 세포에 있어서 VEGF가 NO에 의해서 유도된다. 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 NO 생산을 억제함으로써 암 세포의 VEGF 생산도 억제하고, 그 결과 암 조직 주변에서의 혈관 신생이 저해된다. 암 세포를 피하에 이식하여 고형 종양을 형성시킨 마우스에게 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 투여하면 암 조직 주변의 혈관 형성이 불충분하게 되어, 암은 탈락한다.
니트로소아민은 2급 아민에 니트로소기가 부가된 일군의 화합물로서 수백 종류가 알려져 있고, 그 대부분이 DNA에 손상을 가함으로써 동물에 대해 발암성을 나타낸다. 니트로소아민은 사람의 발암에도 깊게 관여하고 있다고 되어 있으며, 통상 위속에서 아질산염과 아민이 반응함으로써 생성된다. NO는 pH 중성의 생리적 조건 하에서도 아민과 반응하여 니트로소아민을 생성한다. 또한 역학적(疫學的)으로 암과의 관계가 높은 간흡충(肝吸蟲) 감염 환자나 간경변 환자에 있어서 NO 생산은 항진하고 있다. 따라서, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 투여하여 NO 생산의 항진을 방지함으로써, 특히 고도로 위험한 군의 발암을 예방할 수 있다. 이상과 같이, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 발암의 억제와 암 조직에 있어서의 혈관 신생 저해라는 2 단계로 항암 작용을 나타낸다.
또한 NO는 염증성 병변에 특징적으로 확인되는 부종, 즉 혈관 투과성 항진 작용을 유발하고{마에다 등의 문헌[Japanese Journal of Cancer Research, 제85권, pp. 331∼334(1994)] 참조}, 또한 염증성 매개체인 프로스타그란딘류의 생합성을 항진시킨다{살베미니 등의 문헌[Proceedings of National Academy of Sciences, USA, 제90권, pp. 7240∼7244(1993)] 참조}. 한편, NO는 수퍼옥사이드 라디칼과 신속히 반응하여 퍼옥시 니트라이트를 발생시키고, 퍼옥시 니트라이트가 염증성의 세포, 조직 장해를 야기한다고도 생각되고 있다.
활성화된 면역 세포가 장기에 들어가 시토킨을 방출하면 NO의 생산이 유도된다. 인슐린 의존성 당뇨병은 췌도 β 세포가 특이적으로 파괴됨으로써 야기되는 질환이며, NO에 의한 파괴라고 여겨지고 있다. 또한 만성 관절성 류마티스, 변형성 관절 류마티스, 통풍성 관절염, 베세트병에 동반되는 관절염 환자의 병변부의 관절액에는 동일 환자의 정상적인 관절이나 정상인의 관절의 관절액에 비해서 고농도의 NO가 포함되어 있다. 이들 환자에게 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 투여하면 병변부에서의 NO 생산을 억제하여, 증상이 개선된다.
뇌허혈중 및 재관류(再灌流) 후에는 NO 생산이 증대되어, 그에 따라 뇌조직이 손상을 받는다. 뇌허혈시에 환자에게 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 투여함으로써 뇌조직의 손상이 경감되어, 예후(豫侯)가 개선된다.
Fas 항원(APO-1 항원, CD95)이라고 불리우는 세포 표면 항원은 세포 소멸을 유도하는 분자로서 주목받고 있다{문헌[Cell, 제66권, pp. 233∼243(1991)], 문헌[J. Exp. Med., 제169권, pp. 1747∼l756(1989)], 문헌[J. Biol. Chem., 제267권, pp. 10709∼l0715(1992)], 문헌[J. Immunology, 제184권, pp. 1274∼1279(1992)] 참조}.
Fas 항원은 흉선 세포, T 세포, 세포 상해성 T 세포, B 세포 혹은 NK 세포 등의 면역계 세포에서 발현하고 있다. 면역계는 외래의 비자기 항원의 침입이 있을 때에는, 면역 반응을 야기하여 비자기 항원을 배제시킨다. 그러나, 면역계는 자기 항원에 대해서는 면역 반응을 보이지 않고 자기 관용이 성립하고 있다. 이것은 자기 반응성을 갖는 임파구계 간세포가 클론 제거라는 네가티브 선택을 받아 들여 세포 소멸에 기인한 세포 치사에 의해 배제되는 것에 따른 것이다. 그러나, Fas 항원의 유전자적 결함 등의 생체의 어떠한 이상에 의해 이들 세포가 세포 소멸을 당하지 않은 경우에는, 예컨대 자기 반응성 T 세포가 말초에 축적된다. 또한 정상적인 생체에 있어서는 면역 담당 세포인 B 세포에 관해서도 자기 관용이 성립하고 있고, 이 자기 반응성 B 세포도 통상 세포 소멸에 의해 죽음에 이르지만, 자기 반응성 B 세포가 Fas 항원의 유전자적인 결함 등의 이상에 의해 세포 소멸을 당하지 않은 경우에는, 자기 반응성 B 세포가 말초에 축적된다. 더욱이, 관절 류마티스의 경우에는, 상기 자기 반응성 임파구의 이상, 활막 세포의 대사 회전(turnover)의 이상이 병인의 한 실마리가 되고 있다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 Fas 항원 생산 유도제는 자기 반응성 임파구, 대사 회전의 이상에 의해 생체로부터 배제될 수 없었던 불필요한 생체 구성 세포의 세포 소멸 유도에 유용하며, Fas 항원 생산 유도 방법에 사용할 수 있다. 또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 Fas 항원 생산 이상을 동반하는 질병의 예방제 또는 치료제로서 유용하다. 본 발명에 있어서 Fas 항원 생산 이상을 동반하는 질병은, 특별히 한정하지는 않지만, 예컨대 자기 반응성 T 세포, 자기 반응성 B 세포에 의해 야기되는 자기 면역 질환, 관절 류마티스 등을 예로 들 수 있고, WO97/0965호 공보에 기재된 질병을 포함한 것이다.
시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 인터류킨-10 생산 증강 작용, 지연형 과민 반응 억제 작용, 임파구 유약화 반응 억제 작용, 혼합 임파구 반응 억제 작용, IgE 생산 억제 작용, 카라게난 부종 억제 작용 등의 면역 조절 작용을 지니고, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 면역 조절제는 이들의 면역계, 면역인자의 이상이 원인이 되는 질병의 치료제 또는 예방제로서 유용하다.
즉, 인터류킨-10의 생산 저하에 의해 Th1이 활성화되어, Th1 우위의 자기 면역의 염증이 야기된다. 이 염증은 신장염, 간염 등 장기 특이적 자기 면역 질환, 및 이식편 거절 반응이나 알레르기성 접촉성 피부염 등의 질환에 관여하고 있다. 상기 면역 조절제는 인터류킨-10의 생산을 증강시키고, Th1의 활성을 억제함으로써, 이들 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
또한 임파구 유약화 반응이란, 마이토젠이 임파구 표면의 수용체에 결합하여, 임파구를 활성화시켜, 그 분열, 증식을 촉진시키는 반응이다. 혼합 임파구 반응이란, 동종이계의 동물로부터 얻어진 임파구를 혼합 배양함으로써, 주요 조직 적합 항원의 불일치에 의한 임파구의 활성화가 유도되어, 임파구의 분열, 증식이 촉진되는 반응이다. 상기 면역 조절제는 이들 반응을 억제하여, 임파구의 이상 항진이 원인이 되는 자기 면역성 질환, 예컨대 만성 신장염, 만성 대장염, I형 당뇨병, 만성 관절 류마티스 등의 만성 질환의 치료 또는 예방에 특히 유용하며, 또한 이식편 거절 반응의 억제에 있어서도 유용하다.
카라게난 발 부종 모델은 기염제인 카라게난을 족척부(足蹠部)에 피하 주사함으로써, 매크로파지, 호중구 등의 염증 세포가 유도되어, 이들 세포로부터 생산된 염증성 인자에 의해 혈관 투과성이 항진되어 부종이 야기되는 반응이다. 상기 면역 조절제의 부종 억제 작용은 혈관 투과성의 항진의 제어를 필요로 하는 질환, 예컨대 만성 관절 류마티스의 치료 또는 예방에 유용하다.
천식이나 아토피성 피부염으로 대표되는 알레르기 질환에 있어서는 마스트(mast) 세포로부터의 화학 조절자의 방출이 알레르기 반응에 있어서 큰 역할을 담당한다. 이 반응은 IgE가 세포막상의 수용체에 결합하여 가교함으로써 야기되며, 상기 면역 조절제는 IgE의 생산을 억제하여, IgE 생산에 의하여 매개되거나 악화되는 증상, 예컨대 IgE가 원인이 되는 알레르기 질환, 예컨대 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 두드러기, 아나필락시성 쇼크 등의 증상 개선 및/또는 질환 예방에 매우 유용하다. 또한 상기 면역 조절제는 지연형 과민 반응을 억제하여, 지연형 과민 반응을 동반하는 질병, 예컨대 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선염, 알레르기성 뇌염 등의 치료, 예방에 있어서 유용하다.
본 발명에 있어서는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염, 시클로펜텐온을 함유하는 가열 처리물, 및 이 가열 처리물로부터의 부분 정제 시클로펜텐온 중에서 선택되는 원료를 사용하여, 항류마티스 작용, 항염증 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용, 인터류킨-10 생산 증강 작용, 일산화질소 생산 억제 작용, 활막 세포에서의 세포 소멸 유도 작용, Fas 항원 생산 유도 작용, 면역 조절 작용, 예컨대 지연형 과민 반응 억제 작용, 임파구 유약화 반응 억제 작용, 혼합 임파구 반응 억제 작용, IgE 생산 억제 작용, 토포이소메라아제 저해 작용 등을 갖는 기능성 식품 또는 음료, 예컨대 류마티스 개선용 식품 또는 음료, 염증 개선용 식품 또는 음료, 종양 괴사 인자 생산 억제용 식품 또는 음료, 인터류킨-10 생산 증강용 식품 또는 음료, 일산화질소 생산 억제용 식품 또는 음료, Fas 항원 생산 유도용 식품 또는 음료, 면역 조절용 식품 또는 음료, IgE 생산 억제용 식품 또는 음료, 토포이소메라아제 저해용 식품 또는 음료를 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 또는 음료의 제조법은, 특별히 한정되지는 않지만, 조리, 가공 및 일반적으로 이용되고 있는 식품 또는 음료의 제조법에 의한 제조를 들 수 있고, 제조된 식품 또는 음료에 항류마티스 작용 등의 생리 작용을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물이 유효 성분으로서 함유되어 있으면 되며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물을 함유, 첨가 및/또는 희석하여 이루어지는 식품 또는 음료를 본 발명의 식품 또는 음료로 정의한다.
본 발명의 식품 또는 음료로서는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 1 이상의 화합물이 유효 성분으로서 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있으면, 특별히 그 형상에 한정은 없고, 정제상, 과립상, 캡슐상, 겔상, 졸상 등과 같은 형상이 경구적으로 섭취 가능한 형상물도 포함한다.
본 발명의 식품 또는 음료는 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물의 항류마티스 작용, 항염증 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용, 인터류킨-10 생산 증강 작용, 일산화질소 생산 억제 작용, Fas 항원 생산 유도 작용, 면역 조절 작용, 예컨대 지연형 과민 반응 억제 작용, IgE 생산 억제 작용, 토포이소메라아제 저해 작용 등에 의해서, 이들을 섭취함으로써 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염에 감수성을 보이는 질병의 증상 개선 효과 또는 그 질병의 예방 효과를 갖는 건강 식품 또는 음료이며, 생체의 항상성 유지에 유용한 식품 또는 음료이다.
이상, 본 발명에 의해, 식품 또는 음료 중에 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 그 염의 적정량을 함유시키는 것이 가능하게 되었다. 이들 화합물이 갖는 생리 작용, 예컨대 활막 세포에서의 세포 소멸 유도 작용, Fas 항원 생산 유도 작용, 종양 괴사 인자 생산 억제 작용, NO 생산 억제 작용, 류마티스, 특히 만성 관절 류마티스의 증상 개선 작용 및/또는 예방 작용 등에 의해서, 본 발명의 식품 또는 음료는 류마티스, 류마티스에 동반하는 합병 증상, 보행 곤란 등의 증상의 개선 또는 예방에 매우 유용하다.
본 발명에서 사용하는 화합물은 그 생리 활성의 유효량을 투여하더라도 독성은 인정되지 않으며, 예컨대 경구 투여의 경우 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 래트에 100 ㎎/㎏로 단회 투여하여도 사망예가 확인되지 않는다.
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은, 만성 관절 류마티스 등의 염증성 질환의 치료에 유용한 화합물을 개발하여, 그 화합물을 함유하는 의약, 식품 및 음료를 제공하는 데에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 검토한 결과, 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온(이하, 간단히 시클로펜텐온이라고 명명함)이 류마티스 등의 염증성 질환이나 면역 이상을 동반하는 질환 등의 치료 또는 예방에 유용하다는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제1 발명은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항류마티스제에 관한 것이다.
본 발명의 제2 발명은 상기 화학식 Ⅰ로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 개선용 식품 또는 음료, 또는 류마티스 예방용 식품 또는 음료에 관한 것이다.
이하, 실시예를 예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 하등 한정되는 것이 아니다. 또한, 실시예에 있어서의 %는 중량%를 의미한다.
참고예 1
D-글루쿠론산(시그마사 제조 G 5269) 10 g을 1 리터의 물에 용해시키고, 121℃에서 4 시간 가열한 후 약 10 ㎖가 될 때까지 감압 하에 농축시켰다. 이것에 초산부틸:초산:물=3:2:2 혼합액의 상층 40 ㎖을 첨가하여 혼합한 후, 원심에 의해서 얻은 상청을 감압 하에 약 10 ㎖까지 농축시켰다.
상기 추출액을 칼럼 크로마토그래피용 실리카 겔 BW-30OSP(2 ×28 ㎝, 후지시리시아가가쿠사 제조)에 가하고, 초산부틸:초산:물=3:2:2의 상층을 용리액으로서 압축기에 의해 0.2 kg/㎠로 가압하여, 매분 5 ㎖의 유속으로 분리를 수행하였다. 1 분획 당 10 ㎖이 되도록 분류를 수행하여, 각 분획의 일부를 취해 박층 크로마토그래피로 분석한 결과 61 번에서 80 번까지의 분획에 고순도 시클로펜텐온이 포함되어 있었다. 이들 분획을 모아 감압 하에 농축한 후 클로로포름 40 ㎖로 추출하고, 이 추출액을 감압 하에 농축함으로써 시클로펜텐온 100 ㎎을 얻었다.
이 분획을 Palpack형 S 칼럼을 이용한 순상 HPLC로 분리하여, 215 nm의 자외선 흡수로 검출한 결과 순도는 98%이었다.
상기 시클로펜텐온 113.9 ㎎을 에탄올 2.85 ㎖에 용해시켰다. 이 에탄올 용액에 헥산/에탄올(94/6) 3.85 ㎖을 더 첨가하여, 17 ㎎/㎖의 시클로펜텐온 용액을 조제하였다. 이 액을 0.5 μm의 필터로 여과하여, 광학 분할 HPLC 시료 용액으로 하였다.
이 시료 용액을 이하의 조건에서 광학 분할 HPLC를 행하여, 전 피크의 (-)형 시클로펜텐온 및 후 피크의 (+)형 시클로펜텐온의 분류를 각각 모아 감압 건조시켜서, (-)형 시클로펜텐온 43.2 ㎎, (+)형 시클로펜텐온 43.0 ㎎을 각각 얻었다.
광학 분할 HPLC 조건
칼럼 : Chiral Pack AS(다이셀가가쿠고교) 2.0 cm × 25.0 cm
칼럼 온도 : 40℃
이동상 : 헥산/에탄올(94/6)
유속 : 14.0 ㎖/분
검출 : UV 210 nm
시료 주입량 : 150 ㎕(2.55 ㎎)
생성된 (-)형 시클로펜텐온 및 (+)형 시클로펜텐온은 양자 모두 약 1%의 거울상 이성질체를 함유하고 있었기 때문에 상기 조건으로 다시 광학 분할하였다. 그 결과, 전 피크의 (-)형 시클로펜텐온 30.0 ㎎에서 거울상 이성질체를 함유하지 않는 (-)형 시클로펜텐온 19.7 ㎎을, 후 피크의 (+)형 시클로펜텐온 37.4 ㎎에서 거울상 이성질체를 함유하지 않는 (+)형 시클로펜텐온 27.7 ㎎을 각각 얻었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온 및 (+)형 시클로펜텐온의 광학 분할 HPLC의 용출 시간은 각각 33 분과 40 분이었다.
실시예 1
5년 전에 만성 관절 류마티스라고 진단되어, 치료약으로서 스테로이드제, 항류마티스제, 진통 소염제에 의해, 만성 관절염 류마티스의 치료를 받아 왔지만, CRP 정량치 3 ㎎/dl 이상, RF 정량치 300 U/㎖ 이상, 혈침 20 ㎖/hr 이상으로 증상의 개선이 보이지 않아, 보행 곤란 때문에 거의 자리 보전 상태였던 여성(56세)이 후술하는 실시예 12-(2)에서 얻어진 음료를 매일 50 ㎖(시클로펜텐온 2 ㎎ 함유)씩 1개월간 음용한 결과, CRP 정량치, RF 정량치, 혈침 등의 만성 관절 류마티스 증상의 혈액학적 개선이 확인되었다. 또한 이들 수치의 저하와 함께, 보행 등 일상 생활에 있어서의 운동 기능이 현저하게 개선되었다.
실시예 2
만성 관절 류마티스 환자의 활막에서 수립된 섬유 아세포주인 DSEK 세포(사이타마 의과대학 종합의료센터 제2 내과 보존 세포주)를, 10% 소 태아 혈청(FBS, 기부코사 제조, 26140-079)을 함유한 이스코부 개량 둘베코(dulbecco) 배지(IMDM, 기부코사 제조, 12440-053)에서 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 응집(confluent) 될 때까지 배양하여, 트립신-EDTA(기부코사 제조, 25300-054)로 세포를 떼어 내어 모았다. 이 세포를 25000 개/㎖가 되도록 상기 배지에 현탁하여, 96 셀 미세 역가판의 각 웰에 100 ㎕씩 나누어 주입하였다. 배양 5 일 후, 거의 응집이 된 시점에서 배지를 버려, 2.5, 5, 10, 20 또는 30 μM 시클로펜텐온을 함유하는 상기 배지를 첨가하였다. 24 시간 또는 48 시간 배양 후, 예비 혼합물 WST-1(다카라츠죠사 제조, MK400) 10 ㎕을 첨가하여 37℃에서 4 시간 반응시키고, 450 nm에서의 흡광도(A450)로부터 650 nm에서의 흡광도(A650)를 뺀 값을 세포 증식도로 하였다.
그 결과는 하기 1에 나타내었다.
농도(μM) A450- A650
24 시간 48 시간
0 0.846 1.270
2.5 0.724 0.956
5 0.530 0.541
10 0.325 0.216
20 0.247 0.192
30 0.253 0.187
24 시간 배양, 48 시간 모두 5 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서 물 첨가의 대조에 비해서 세포 증식이 억제되고 있고, 10 μM의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서 세포 소멸 소체의 형성이 보였다. 20 μM 이상의 시클로펜텐온을 첨가한 구분에서는 생세포는 거의 보이지 않았다.
이상, 시클로펜텐온은 활막 세포에서의 세포 소멸 유도 작용, 증식 억제 작용을 나타내었다. 또한 ( -)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온에 대해서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 3
(1) 5×105개/㎖의 사람 T 세포성 백혈병 세포주인 Jurkat 세포(ATCC TIB-152) 및 Molt-3 세포(ATCC CRL-1552)를 10% 소 태아 혈청(FCS, 바이오위타카사 제조)를 포함하는 RPMI1640 배지(기부코 BRL사 제조)에서 5% CO2존재 하에 37℃에서 배양하고, 0, 5, 10 또는 20 μM의 시클로펜텐온을 첨가하여 24 시간 더 배양하였다. 세포 증식은 MTT법{모스맨 등의 문헌[J. Immunol. Methods, 제65권, pp. 55∼63(1983)] 참조}을 이용하여, 세포 증식도를 560 nm에서의 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 물 첨가의 대조에 비해서 양 세포주 모두 10 μM 시클로펜텐온 첨가 구분에서는 약 50%, 20 μM 시클로펜텐온 첨가 구분에서는 75% 이상, 세포 증식이 억제되었다. 5 μM 이하의 시클로펜텐온을 첨가해도 세포의 증식에 유의적인 영향은 없었다.
이상과 같이, 시클로펜텐온은 T 세포성 백혈병 세포주인 Jurkat 세포 및 Molt-3 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다.
그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다. 즉, 도 1은 Jurkat 세포의 증식에 대한 시클로펜텐온의 영향을 나타낸 도면이며, 도 2는 Molt-3 세포의 증식에 대한 시클로펜텐온의 영향을 나타낸 도면이다. 도 1과 도 2에 있어서, 횡축은 시클로펜텐온 농도(μM)를, 종축은 560 nm에서의 흡광도를 나타낸다.
(2) Jurkat 세포 및 Molt-3 세포에 있어서의 Fas 항원 발현(생산 유도)에 대한 시클로펜텐온의 영향을 다음과 같은 방식으로 측정하였다. 0, 1, 5, 10 또는 20 μM의 시클로펜텐온을 포함하는 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 5×105개/㎖의 Jurkat 세포 또는 Molt-3 세포를 5% CO2존재 하에 37℃에서 24 시간 배양하고, 문커(Munker, R.)의 방법{문헌[Ann. Hematol., 제70권, pp. 15∼l7(1995)] 참조}에 따라 항Fas 항체(베링거·인겔하임사 제조)를 이용하여 2 단계 면역 염색을 수행하였다.
염색한 세포 1×104개의 형광 강도를 플로우 사이토미터(오소사이트론 : 오소·다이아그노스틱·시스템즈사 제조)를 이용해서 측정하여, 일정치 이상의 형광 강도를 나타내는 세포를 Fas 항원 발현 세포로서 그 비율을 계산하였다.
그 결과, 양 세포주에 있어서, 시클로펜텐온을 첨가한 경우에는 1∼20 μM의 범위에서 Fas 항원 발현 세포의 비율이 농도 의존적으로 상승하였다.
그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 즉, 도 3은 Molt-3, 도 4는 Jurkat 세포에 있어서의 Fas 항원 발현을 나타낸 도면이다. 도 3과 도 4에 있어서 횡축은 시클로펜텐온 농도(μM), 종축은 Fas 항원 발현 세포의 비율(%)을 나타내며, 시클로펜텐온에 의한 Fas 항원 생산 유도 작용이 확인되었다.
(3) 10 μM 시클로펜텐온을 첨가하고 Molt-3 세포를 1, 3, 6, 12 또는 24 시간 배양하여, Fas 항원 발현 세포의 비율을 측정하였다.
그 결과, 10 μM 시클로펜텐온을 첨가한 경우, Fas 항원 발현 세포의 비율은 배양 1 시간 후부터 상승하여 24 시간 후까지 서서히 상승하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 즉, 도 5는 Molt-3 세포에 10 μM 시클로펜텐온을 첨가하여 배양했을 때 Fas 항원 발현 세포의 비율 변화를 나타낸 도면이며, 횡축은 배양 시간(시간), 종축은 Fas 항원 발현 세포의 비율(%)을 나타낸다.
이상, 실시예 3의 (1)∼(3)에 기재한 바와 같이, 시클로펜텐온에 의한 Fas 항원 생산 유도 작용이 확인되었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온에서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 4
6 주령의 숫컷 루이스 래트(세악요시토미사로부터 5 주령, 체중 약 130 g일 때 구입하여 1 주일간 예비 사육)를 이용하여, 만성 관절 류마티스 동물 모델인 카라게난 유발 발 부종 모델을 다음과 같이 제작하여 피검약을 평가하였다.
실험 개시 18 시간 전부터 절식한 래트에게 증류수(오쯔카세이야쿠사 제조)로 1, 5 ㎎/㎖이 되도록 조정한 시클로펜텐온을 10 ㎖/kg의 투여량으로 경구 투여하였다.
피검약 투여 0.5 시간 후에 생리 식염수(오쯔카세이야쿠사 제조)에 현탁하여 1%의 농도로 조정한 카라게난(와코사 제조)을 100 ㎕/래트로 오른쪽 발 족척에 주사하여 발 부종을 야기시켰다. 카라게난 주사 3 시간 후에 래트의 오른쪽 발 용적을 래트 발 용적 측정 장치(우고바질사 제조)로 측정하였다. 또한 측정치는 카라게난 투여 전에 측정한 래트의 오른쪽 발 용적으로부터 증가율을 산정하여 표시하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 즉, 도 6은 시클로펜텐온과 발 부종 증가율의 관계를 나타낸 도면이며, 종축은 증가율(%), 횡축은 시클로펜텐온의 양(㎎/㎏)을 나타낸다.
시클로펜텐온은 50 ㎎/kg의 투여량에 있어서 유의적인 발 부종 억제 작용을 나타내었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온에서도 동일한 효과를 얻었다.
실시예 5
(1) 20 주령의 암컷 CDF1계 마우스에게, 생리 식염수에 용해된 살모넬라 아보타스 이퀴(Salmonella abortus equi) 유래의 LPS(리포폴리사카라이드 : 시그마사 제조, L-2012)를 복강내 투여(0.1 ㎎/kg)하여, 엔도톡신 쇼크 모델을 제작하였다.
시클로펜텐온은 LPS 투여 30 분 전에 30 ㎎/kg의 용량으로 복강내 투여 또는 경구 투여하였다. 한편, 대조군은 무처치로 하였다. LPS 투여 90 분 후에 마우스로부터 혈액을 채취하여, 혈청을 분리하였다. 이어서, 혈청 중의 종양 괴사 인자량을 TNF-α·ELISA 키트(젠자임사 제조)로 측정하여, 시클로펜텐온 투여에 의한 종양 괴사 인자 생산 억제 효과를 측정하였다.
그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 즉, 대조군에 대해, 시클로펜텐온 투여군에서는 복강내 투여군, 경구 투여군의 어느 쪽 군에 있어서도, 혈청 중의 종양 괴사 인자의 농도는 낮은 값이며, 시클로펜텐온 투여에 의해, 종양 괴사 인자의 생산이 유의적으로 억제되었다.
군 마리수 혈청 중 TNF-α(ng/ml)평균 ±SE
대조군 5 3.96 ±0.52
시클로펜텐온 복강내 투여군 5 0.58 ±0.08**
시클로펜텐온 경구 투여군 5 1.80 ±0.30*
**p＜0.001에서 대조군에 대하여 유의적인 수준임*p＜0.01에서 대조군에 대하여 유의적인 수준임
(2) 8 주령의 암컷 CDF1계 마우스를 이용하여 LPS를 복강내 투여(10 ㎍/마우스)하여, 엔도톡신 쇼크 모텔을 제작하였다. 시클로펜텐온은 LPS 투여 15 분 전에, 0.03, 0.3, 3, 30 ㎎/kg의 용량으로 피하 투여하였다(1군 4마리). LPS 투여 1 시간 후에 마우스로부터 채혈하고, 혈청을 분리하여, 혈청 중의 종양 괴사 인자 -α량 및 인터류킨-10의 양을 시판용 ELISA 키트(엔도젠사 제조)로 측정하였다.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 즉, LPS 투여에 의한 혈청 중의 종양 괴사 인자 -α 농도의 상승을, 시클로펜텐온은 용량 의존적으로 억제하였다. 또한 시클로펜텐온 30 ㎎/kg 투여군에 있어서는 증류수를 투여한 대조군(1군 4마리)에 대하여, 혈청 중의 인터류킨-10 농도를 유의적으로 상승시켰다.
투여량(mg/kg) 종양 괴사 인자의 양(ng/ml)평균 ±SD 혈청 인터루킨-10의 양(ng/ml)평균 ±SD
대조군 3.00 ±0.30 1.79 ±0.29
시클로펜텐온 투여군 30 0.24 ±0.08 3.16 ±0.28
3 1.41 ±0.45 1.95 ±0.20
0.3 2.30 ±0.24 1.32 ±0.16
0.03 2.68 ±0.28 1.58 ±0.29
(3) 8 주령 암컷 CDF1계 마우스의 복강 내에 파라핀 오일(코스모바이오사) 2 ㎖을 투여하여, 복강 Mφ을 유도하였다. 파라핀 오일 투여 1 주일 후에 마우스의 복강 내에 RPMI-1640 배지(기부코사) 4 ㎖을 주입하고 잘 맛사지한 후 회수하여, 복강 세포를 얻었다.
복강 세포는 RPMI-1640 배지로 2회 세정한 후, 10% 소 태아 혈청(FCS : 하이클론사)를 포함한 RPMI-1640 배지에 현탁하여, 세포 농도를 1×106세포수/㎖로 조정하였다. 조정한 세포액 1 ㎖를 24 웰 평판에 뿌려 37℃ C02배양기에서 2 시간 배양하였다. 배양 후 상청에 포함되는 비접착 세포를 제거하고, 접착 세포를 복강 Mφ로서 이용하였다.
평판의 각 웰에 10% FCS를 포함한 RPMI-1640 배지 800 ㎕을 첨가하고, 이어서 생리 식염수(오쯔카세이야쿠사 제조)에 용해된 1, 10, 100 μM의 시클로펜텐온을 100 ㎕ 첨가하여 37℃ C02배양기에서 1 시간 배양하였다.
배양 후 100 ng/㎖의 LPS를 100 ㎕ 첨가하여, 24 시간 더 배양하였다. 배양 종료 후, 배양 상청을 회수하여 생산된 종양 괴사 인자 -α의 양을 시판용 ELISA 키트(엔도젠사 제조)를 이용하여 정량하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다. 즉, 도 7은 시클로펜텐온과 종양 괴사 인자 생산량의 관계를 나타낸 도면이며, 종축은 종양 괴사 인자량(pg/㎖), 횡축은 각 시료의 시클로펜텐온 농도(μM)를 나타낸다.
시클로펜텐온은 10 μM 이상의 농도에 있어서 LPS가 유발하는 마우스 복강 매크로파지로부터의 종양 괴사 인자 생산을 현저히 억제하였다.
이상, 실시예 5의 (1)∼(3)에서 나타낸 바와 같이 시클로펜텐온은 종양 괴사 인자 생산 억제 작용, 인터류킨-10 생산 증강 작용을 나타내었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온에 대해서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 6
시클로펜텐온의 NO 생산 억제 활성 및 세포 장해 억제 활성을 마우스 매크로파지 세포주 RAW264.7 세포(ATCC TIB 71) 및 LPS를 사용하여, 다음과 같이 측정하였다.
RAW264.7 세포 1.5×106개를 포함하는, 10% 소 태아 혈청(기부코사 제조)을 함유하고 페놀레드를 함유하지 않으며, 2 mM L-글루타민(라이프테크오리엔탈사 제조, 25030-149)을 함유하는 둘베코 개량 이글 배지(라이프테크오리엔탈사 제조, 11054-020) 5 ㎖를 6개의 웰을 갖는 조직 배양 평판에서 5% 탄산 가스 존재 하에 37℃에서 12 시간 배양한 후, 50 ㎍/㎖ LPS(시그마사 제조) 50 ㎕를 첨가하고, 각 웰에 500 μM 시클로펜텐온, 250 μM 시클로펜텐온, 100 μM 시클로펜텐온, 50 μM 시클로펜텐온 각각 50 ㎕을 첨가하여, 12 시간 더 배양한 다음, NO가 배지 중에서 산화됨에 따라 발생하는 NO2 -및 생세포의 수를 측정하였다. 또한 대조로서 LPS를 가하지 않은 구(區) 및 시클로펜텐온을 가하지 않는 구를 설정하였다.
NO2 -의 측정에서는 각 웰로부터 배양 상청 100 ㎕을 분리하고, 50 ㎍/㎖ 2,3 -디아미노나프탈렌(도우닌가가쿠겐큐쇼사 제조, 341-07021) 용액(0.62N 염산 용액) 10 ㎕을 첨가하여 실온에서 15 분간 방치한 다음, 2.8N 수산화나트륨 수용액 5 ㎕을 첨가하고, 생성된 나프탈렌트리아졸의 형광을 Titertec Fluoroscan II(다이니폰세이야쿠사 판매)를 이용하여 여기 파장 355 nm, 측정 파장 460 nm에서 측정하였다. 실험은 전부 2회 연속으로 수행하여, 이 평균치로부터 LPS 비첨가의 대조치를 공제하고, LPS 첨가 구분의 값에 대한 각 구분의 상대치로 비교하였다.
그 결과, 시클로펜텐온은 LPS에 의해 RAW264.7 세포로 유도되는 NO 생산을 억제하고, 게다가 LPS에 의한 RAW264.7 세포에 대한 세포 장해를 억제하였다.
그 결과를 도 8과 도 9에 나타내었다. 도 8은 배양액 중의 시클로펜텐온 농도와 NO2 -농도의 관계를 나타낸 도면이며, 종축은 NO2 -농도의 상대치(%)를 나타낸다. 도 9는 시클로펜텐온 존재 하에 배양 시간과 생세포수의 관계를 나타낸 도면이며, 종축은 배양액 5 ㎖ 중에 포함되는 생세포수(×105개/5㎖)를 나타내고, 횡축은 배양 시간(시간)을 나타낸다. 도 9에 있어서, 백색 사각(□)은 대조를, 백색 마름모꼴(◇)은 LPS를, 백색 동그라미()는 5 μM 시클로펜텐온을, 백색 삼각(△)은 5 μM 시클로펜텐온＋LPS를, 검정색 사각(■)은 2.5 μM 시클로펜텐온＋LPS를, 검정색 마름모꼴(◆)은 1 μM 시클로펜텐온＋LPS를, 검정색 동그라미()는 0.5 μM 시클로펜텐온＋LPS를 나타낸다.
이상, 시클로펜텐온은 NO 생산 억제 작용을 나타내었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온도 동일한 효과를 나타내었다.
실시예 7
(1) 1군 5마리의 5 주령 BALB/c계 숫컷 마우스(니본쿠레아사)에, 난백 알부민(시그마사)의 0.01% 생리 식염수 용액 100 ㎕ 및 알럼(Alum)[상품명 임젝트 알럼(Imject Alum) ; 피어스사] 100 ㎕을 복강내 투여하여 감작시키고, 이로부터 11일 후에 안저정맥에서 말초혈을 채취하였다.
채취한 혈액은 원심 분리(2000 rpm, 5 분) 후, 혈장을 분리하여, ELISA(IgE 마우스 EIA 키트 : 세이카가쿠고교)로 혈장 중의 총 IgE 량을 측정하였다.
시클로펜텐온 투여군은 항원 감작일부터 채혈 전날까지 10 ㎎/㎏를 1 일 1회 강제 경구 투여하였다.
또한 대조군에서는 증류수를 동일한 방식으로 경구 투여하여, 비감작군을 무처치군으로 하였다.
그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 난백 알부민 감작에 의한 혈장 중의 총 IgE 량의 상승은 시클로펜텐온의 투여에 의해 억제되었다.
혈장 중 총 IgE 량(ng/ml)평균 ±SEM
무처치군 0
대조군 742.6 ±366.0
시클로펜텐온 투여군 355.8 ±127.5
(2) 1군 5마리의 5 주령 Wister계 숫컷 래트(니혼에스엘씨사)에, 난백 알부민(시그마사)의 0.01% 생리 식염수 용액 100 ㎕ 및 알럼(Alum)[상품명 임젝트 알럼(Imject Alum) ; 피어스사] 100 ㎕을 복강내 투여하여 감작시키고, 이로부터 14 일 후에 복대정맥에서 혈액을 채취하였다.
채취한 혈액은 원심 분리(2000 rpm, 5 분) 후, 혈장을 분리하여, 48 시간 래트 수신 피부 아나필락시스(PCA) 반응으로 항원 특이적 IgE 량을 측정하였다.
즉, 혈장의 배가 희석 계열을 4 배에서 64 배까지, 생리 식염수를 사용하여 제작하고, 이것을 무모 7 주령 Wister계 숫컷 래트의 등부분 피부 내로 0.1 ㎖씩 주사하였다. 피부내 주사의 48 시간 후, 0.05% 난백 알부민 및 0.5% 에반스 블루(나카라이테스크사 제조)의 혼액 1 ㎖을 미(尾)정맥에서 주사하였다. 미정맥 주사 30 분 후, 래트를 단두하여 방혈 치사시키고, 등부분에 나타난 청색 반점을 관찰한 후, 직경 5 mm 이상의 반점을 양성으로 하여, 최고 희석도를 IgE 역가로서 나타내었다.
시클로펜텐온 투여군은 항원 감작일로부터 3 일간, 시클로펜텐온 1 ㎎/kg 또는 10 ㎎/kg을 1 일 1회 복강내 투여하였다. 또한 대조군에서는 증류수를 동일한 방식으로 복강내 투여하였다.
그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
IgE 역가
대조군 64
시클로펜텐온 투여군(1 mg/kg/일) 16
시클로펜텐온 투여군(10 mg/kg/일) ＜4
난백 알부민 감작에 의한 항원 특이적 IgE 량의 상승은 용량 의존적인 시클로펜텐온의 투여에 의해 억제되었다.
이상, 시클로펜텐온에 의해 IgE 생산이 억제되었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온과 (+)형 시클로펜텐온은 동일한 IgE 생산 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 8
(1) C57BL/6 마우스(암컷, 5 주령)은 니혼에스엘씨사에서 구입하여, 1 주간의 예비 사육 후, 실험에 이용하였다. 지연형 과민 반응의 야기 항원인 양 적혈구(키요미즈시켄자이료)를 생리 식염수(오쯔카세이야쿠사 제조)로 3회 세척하여 1×109세포수/㎖로 조정하고, 200 ㎕을 마우스의 복강 내에 주사하여 항원 감작시켰다.
감작으로부터 5 일 후에 동일한 방식으로 조제한 항원 40 ㎕을 오른쪽 발 족척에 주사하여 항원 유발시킴으로써 발 부종을 야기하였다. 시클로펜텐온은 1군 5마리의 마우스에게 항원 감작일로부터 1 일 1회, 3 일간 복강 내로 1 ㎎/kg 또는 10 ㎎/kg을 투여하였다.
항원 유발로부터 2 일 후에 마우스의 오른쪽 발 용적을 발 부종 측정 장치(우고바질사 제조)로 측정하여, 지연형 과민 반응의 지표로 삼았다. 측정치는 항원 유발 전에 측정한 마우스의 오른쪽 발 용적로부터의 증가율을 산정하여 표시하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다. 즉, 도 10은 시클로펜텐온의 지연형 과민 반응 억제 작용을 나타낸 도면이며, 종축은 증가율(%), 횡축은 시클로펜텐온 투여량(㎎/kg)을 나타낸다. 또한 도면 중 **은 대조에 대하여 p＜0.01에서 유의적임을 의미한다.
시클로펜텐온은 1 ㎎/kg의 투여시 지연형 과민 반응을 억제하고, 10 ㎎/kg의 투여시 유의적인 지연형 과민 반응 억제 작용을 나타내었다.
또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온도 동일한 효과를 나타내었다.
(2) C3H/HeJ 마우스(니혼에스엘씨사, 숫컷, 5 주령)에서 비장을 적출하고, 잘게 분쇄하여 10% 소 태아 혈청(하이클론사 제조)을 포함한 RPMI-1640 배지(기부코사 제조)에 현탁하여 단세포액을 얻었다. 세포 부유액을 플라스틱 샤알레에 파종하여 37℃로 탄산 가스 배양기에서 2 시간 배양하고, 접착성 세포를 샤알레에 접착시켜 제외하며, 비접착성 세포를 비장 임파구로서 이용하였다. 세포 농도를 2×106세포/㎖로 조정하고, 96 웰 미세 역가판에 200 ㎕/웰로 파종한 다음, 대조군 이외의 각 웰에 각 농도의 시클로펜텐온을 첨가하고, 또한 모든 웰에 5 ㎍의 콘카나발린 A(ConA : 나카라이테스크사 제조)를 첨가하여 37℃로 탄산 가스 배양기에서 1 일간 배양하였다. 배양 후 1 μCi의3H-티미딘을 각 웰에 첨가하고 또한 1 일간 배양하여 세포에의 취입량을 액체 섬광계수기로 측정하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다. 즉, 도 11은 시클로펜텐온의 임파구 유약화 억제 작용을 나타낸 도면이며, 종축은3H-티미딘 취입량(CPM), 횡축은 ConA의 첨가, 비첨가의 대조, 및 시클로펜텐온의 농도(㎍/㎖)를 나타낸다. 도면에서 명백히 알수 있는 바와 같이, 시클로펜텐온은 마이토젠 자극의 마우스 임파구의 유약화에 대하여, 용량 의존적인 억제 작용을 나타내고, 10 ㎍/㎖에서 거의 완전히 임파구의 증식을 억제하며, 임파구의 활성화에 대한 억제 작용이 확인되었다.
또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온도 동일한 효과를 나타내었다.
(3) BALB/c 마우스(니혼에스엘씨사 ; 숫컷, 5 주령) 및 C57BL/6 마우스(니혼에스엘씨사 ; 숫컷, 5 주령)에서 비장을 적출하고, 상기 방법에 의해 비장 임파구를 얻었다. 각 세포 부유액의 농도를 2×106세포/㎖로 조정하고, 100 ㎕씩 혼합하여 96웰 미세 역가판에 파종하였다. 대조군 이외의 각 웰에 각 농도의 시클로펜텐온을 첨가하고, 37℃로 탄산 가스 배양기로에서 4 일간 배양하였다. 배양 후 1μCi의3H-티미딘을 각 웰에 첨가하고 또한 1 일간 배양하여 세포로의 취입량을 액체 섬광계수기로 측정하였다.
그 결과를 도 12에 나타내었다. 즉, 도 12는 시클로펜텐온의 혼합 임파구 반응 억제 작용을 나타낸 도면이며, 종축은3H-티미딘 취입량(CPM), 횡축은 BALB/c 비장 임파구의 대조(도면 중, BALB/c로 나타냄), C57BL/6 비장 임파구 대조(도면 중, C57BL/6으로 나타냄), BALB/c 비장 임파구와 C57BL/6 비장 임파구 혼합 대조(도면 중, Mix로 나타냄) 및 시클로펜텐온의 농도(㎍/㎖)를 나타낸다. 도면에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 알로 항원 자극에 의해 활성화된 임파구에 대하여 시클로펜텐온은 용량 의존적인 억제 작용을 보이고, 10 ㎍/㎖로 거의 완전히 억제하여, 혼합 임파구 반응에 의한 임파구의 활성화에 대한 억제 작용이 확인되었다.
또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온도 동일한 혼합 임파구 반응 억제 작용을 보였다.
실시예 9
(1) 토포이소메라아제 II〔토포젠(TopoGEN)사 제조, 2 단위/㎕〕 2 ㎕, 10배 농도 완충액〔0.5M Tris-HCl(pH 8.0), 1.2M KCl, 0.1M MgCl2, 5mM 아데노신3인산, 5 mM 디티오스레이톨〕2 ㎕, 0.1% 소 혈청 알부민(다카라츠죠사 제조) 2 ㎕, 증류수 11 ㎕ 및 대조의 증류수 또는 시료(100, 200, 500, 1000 또는 2500 μM의 시클로펜텐온) 2 ㎕을 혼합한 것에, 0.25 ㎍/㎕ pBR322 DNA(다카라츠죠사 제조) 1 ㎕을 첨가하여 37℃에서 반응시켰다. 30 분간 반응 후, 1% 도데실황산나트륨, 50% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀 블루 수용액 2 ㎕을 첨가하여 반응을 정지하였다.
아가로스 L03(다카라츠죠사 제조)과 TAE 완충액[40 mM Tris, 5 mM 초산나트륨, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 초산에 의해 pH 7.8로 조정]을 사용하여 제작한 1% 아가로스 겔에 상기 반응액 20 ㎕을 가하고, TAE 완충액 중에서 전기 영동을 수행하였다. 영동 후, 겔을 1 ㎍/㎖ 브롬화에티디움 수용액에 침지시키고, 자외선을 조사하여 DNA 전기 영동 패턴을 관찰하였다. 또한 물 첨가의 대조에서는 DNA가 초나선형에서 이완형으로 완전히 변화되지만, 토포이소메라아제 II 활성이 저해되면 초나선형에서 이완형으로의 변화가 일부 또는 완전히 저해된다.
그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
반응액 중의 농도(μM) 저해 활성
0 -
10 -
20 ++
50 ++
100 +++
250 +++
물 첨가의 대조에서는 DNA가 초나선형에서 이완형으로 완전히 변화했지만, 20μM 이상의 시클로펜텐온 농도에서는 DNA의 초나선형에서 이완형으로의 변화가 일부 또는 완전히 저해되어, 시클로펜텐온의 토포이소메라아제 II 저해 활성이 확인되었다. 표 6에 있어서, -는 초나선형에서 이완형으로 완전히 변화하고 있다는 것을, +은 중간 정도로 변화하고 있다는 것을, ++는 대부분의 초나선형이 남아 있다는 것을, +++은 초나선형이 전혀 감소되지 않은 것을 나타낸다.
(2) 실시예 9의 (1)과 같이 동일한 방법으로 시클로펜텐온의 토포이소메라아제 I 저해 활성을 측정하였다. 단, 토포이소메라아제 II 대신에 토포이소메라아제 I[토포젠사 제조, 0.01 단위/㎕], 10배 농도 완충액으로서 100 mM Tris-HCl(pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM 스퍼미딘 50% 글리세롤을 사용하였다. 또한 시료로서 최종 농도가 1 mM로 되도록 시클로펜텐온을 첨가하였다.
그 결과, 1 mM 시클로펜텐온에 의해 토포이소메라아제 I는 저해되었다.
이상, 정상 세포에서는 분열기에만 일과적으로 발현하고 있지만, 암화에 의해 전체 세포 주기를 통해 높게 발현되게 되는 토포이소메라아제 II나, 암화에 의해 발현량이나 활성이 증대되는 토포이소메라아제 I에 대해 시클로펜텐온 저해 활성을 나타내었다. 또한 (-)형 시클로펜텐온, (+)형 시클로펜텐온에 대해서도 동일한 결과를 얻었다.
실시예 10
주사제
(1) 생리 식염액(일본 약국방 수록품)에 시클로펜텐온을 1% 농도로 가하여 주사제를 조제하였다.
(2) 생리 식염수(상기와 동일)에 (-)형 시클로펜텐온 및 글리실리틴산을 각각 0.5% 및 0.1% 농도로 가하여, 주사제를 조제하였다.
실시예 11
정제
(1) 시클로펜텐온 100 ㎎과 미결정성 셀룰로오스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의(糖衣)를 행하여, 정제를 만들었다.
(2) (+)형 시클로펜텐온 0.1 ㎎, 글리실리틴산디칼륨 10 ㎎ 및 미결정 셀룰로오스의 적정량을 함유하는 정제를 조제하고, 당의를 행하여, 정제를 만들었다.
실시예 12
(1) 펙틴(포모신펙틴 LM-l3CG : 허큘리즈사 제조) 5 kg을 수돗물 100 리터에 첨가하여, 액상 온도 28℃에서 액상 온도 120℃가 될 때까지 수증기 취입에 의해 35 분간 승온시키고, 이어서 교반 하에 120℃로 5 시간 보온하며, 계속해서 냉각하여, 냉각물 135 리터를 조제하였다. 이어서, 냉각물에 여과 조제로서, 셀라이트 #545(셀라이트사 제조) 1.35 kg 및 실리카 #600-S(쥬오실리카사 제조) 1.35 kg을 첨가하고, 계속해서 셀라이트 #545 0.1 kg과 실리카 #600-S 0.1 kg로 미리 코팅한 조밀한 필터(6 인치 16 단 여과지 : ADVANTEC #327)로 여과하였다. 얻어진 여과액은 평판 가열기(히사카세이사쿠쇼 제조)에 의한 연속 순간 가열 처리(98℃, 60초)를 행한 후 냉각하여, 150 리터의 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 조제하였다.
시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액의 pH는 약 3.5, 산도는 6.2 ㎖, 당도는 5.8 Brix%였다. 또한 pH는 pH 측정기로 측정하고, 산도는 시료 10 ㎖를 pH 7.0에 중화하는 데 필요한 0.1N NaOH 량(㎖)으로 표시하였다. 또한 당도는 Brix 당도계로 측정하였다.
(2) 하기 조성으로 음료를 조제하였다.
과당 포도당 액당 5.00%
설탕 4.00%
산미료 1.20%
향료 0.30%
시클로펜텐온 함유물 0.5%
정제수 적당량
계 100.00%
또한 시클로펜텐온 함유물로서는 실시예 12의 (1)에 기재한 시클로펜텐온 함유 펙틴 가열 처리액을 사용하여, 그 고형물 환산량을 첨가하였다. 이 음료 100 ㎖ 중에는 4 ㎎의 시클로펜텐온이 함유되어 있다.
본 발명에 의해 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 의약이 제공된다. 이 의약은 항류마티스제 또는 류마티스 예방제로서, 또한 염증성 시토킨의 제어에 의한 항염증제 또는 염증 예방제로서 염증을 동반하는 질병의 치료제 또는 예방제로서 매우 유용하다. 또한 본 발명에 의해, 식품 또는 음료 중에 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염의 적정량을 함유시키는 것이 가능하게 되었다. 이들 화합물이 갖는 생리 기능에 의해 본 발명의 기능성 식품 또는 음료는, 류마티스, 특히 만성 관절 류마티스의 증상 개선 작용 및/또는 예방 작용에 의해서, 류마티스에 동반하는 합병 증상, 보행 곤란 등의 치료 또는 예방 등에 매우 유용하다. 또한 염증성 시토킨의 제어 작용에 의해, 본 발명의 식품 또는 음료는 염증을 동반하는 질병의 증상 개선 또는 예방에 유용하다.
또한 본 발명의 의약에 의해 종양 괴사 인자의 생산이 억제되어, 본 발명의 의약은 종양 괴사 인자의 생산에 의하여 매개되는 질병, 그 인자의 생산에 의해서 악화되는 질병, 패혈증, AIDS, 만성 관절성 류마티스 등의 질병의 치료 또는 예방에 유용하다. 또한 본 발명의 식품 또는 음료는 종양 괴사 인자의 생산에 의해서 매개되는 질병, 그 인자의 생산에 의해 악화되는 질병, 패혈증, AIDS, 만성 관절성 류마티스 등의 질병의 증상의 개선 또는 그 질병의 예방에 매우 유용하며, 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로서 사용하는 본 발명 방법은 종양 괴사 인자의 생산량의 조절에 매우 유용하다.
게다가, 본 발명에 의해 NO 생산 억제 작용을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염을 함유하는 의약이 제공되며, 이 의약은 NO 생산의 억제를 필요로 하는 질병, 예컨대 전신성 혈압 저하, 혈압 응답 저하, 자기 면역 질환, 염증, 관절염, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 혈관 기능 부전, 병인성 혈관 확장, 조직 손상, 심장 혈관계 허혈, 통증 과민증, 뇌허혈, 혈관 신생을 동반하는 질병, 암의 치료 또는 예방, 및 생체의 항상성 유지에 유용한 의약품이다.
또한 NO 생산 억제 작용을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 NO 생산 억제제, 혈관 신생 억제제, 발암 예방제, 항암제, 항염증제, 허혈성 뇌손상 개선제도 제공된다. 상기 NO 생산 억제제는 생화학 연구나, 의약의 스크리닝에 유용하다.
본 발명에 의해, 식품 또는 음료 중에 생리 활성을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염의 적정량을 함유시키는 것이 가능하게 되었다. 이 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염이 갖는 NO 생산 억제 작용에 의해서, 본 발명의 식품 또는 음료는 NO 생산 억제 작용을 통한 발암 예방, 항암 작용, 항염증 작용, 허혈성 뇌손상 개선 작용, 생체 방어 작용 증강 등의 생체의 항상성 유지 기능을 갖는 건강 식품 또는 음료이다.
본 발명에 의해 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 하는 Fas 항원 생산 유도제, 이들의 화합물을 유효 성분으로서 사용하여 Fas 항원의 생리 기능 연구나 길항제의 탐색 등에 유용한 Fas 항원 생산 유도 방법, 및 Fas 항원 생산 이상을 동반하는 질병, 예컨대 자기 면역 질환, 관절 류마티스 등의 예방제 또는 치료제가 제공된다.
또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물의 유효량을 함유하는 식품 또는 음료는 이들 화합물이 갖는 Fas 항원 생산 유도 작용에 의해 본 발명의 기능성 식품 또는 음료이며, 상기 질환의 증상 개선, 발병 예방 작용에 매우 유용하다. 또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염은 활막 세포에서의 세포 소멸 유도 작용을 지니며, 본 발명의 의약, 식품 또는 음료는 항류마티스용 의약, 식품 또는 음료로서, 특히 유용하다.
본 발명에 의해 IgE 생산 억제 작용, 지연형 과민 반응 억제 작용, 임파구 유약화 억제 작용, 혼합 임파구 반응 억제 작용을 갖는 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 면역 조절제가 제공된다.
또한 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염이 갖는 면역 조절 작용에 의해, 이들 화합물에서 선택되는 화합물을 함유하는 식품 또는 음료는 면역 조절용 식품 또는 면역 조절용 음료로서, 자기 면역 질환 등의 면역 기능의 조절을 필요로 하는 질환 증상의 개선 또는 면역 이상증의 예방에 유용하다.
또한 본 발명의 방법은 IgE의 생산량의 조절, 면역 조절 등에 유용하다.
또한 본 발명에 의해 시클로펜텐온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 토포이소메라아제 저해제, 이들 화합물에서 선택되는 1 이상의 화합물을 유효 성분으로서 사용하는 토포이소메라아제 저해 방법이 제공된다. 상기 토포이소메라아제 저해제는 항암제로서 유용하며, 상기 토포이소메라아제 저해 방법은 생화학 연구나 항암제의 스크리닝 등에 유용하다.

Claims (2)

  1. 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항류마티스제:
    화학식 I
  2. 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 4,5-디히드록시-2-시클로펜텐-1-온 또는 그 광학 활성체 또는 이들의 염 중에서 선택되는 적어도 1 이상의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 류마티스 개선용 식품 또는 음료, 또는 류마티스 예방용 식품 또는 음료:
    화학식 I
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