ES2226106T3 - 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona para el tratamiento de reumatismo, inflamacion y enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

Un agente antireumático que se caracteriza en que contiene al menos un compuesto seleccionado entre un grupo constituido por 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representado por la siguiente fórmula [I] y una sustancia activa ópticamente y una sal del mismo como un componente efectivo.

Description

4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona para el tratamiento de reumatismo, inflamación y enfermedades autoinmunes.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de un compuesto para la preparación de un medicamento, alimento o bebida para la terapia y prevención de enfermedades inflamatorias tal como el reumatismo articular crónico.

Técnica anterior

Se cree que la inflamación es un resultado en el que el cuerpo vivo actúa de forma defensiva contra la invasión procedente del exterior y produce una sustancia activa intrínseca para adaptar el estado del cuerpo a ésta. Existen muchos casos, sin embargo, en que la reacción inducida de este modo es perjudicial y provoca un estado patológico. Además, la inflamación en las enfermedades autoinmunitarias procede del hecho de que los inmunocitos se consideran materias extrañas y actúan de manera interceptora incluso en las células normales.

Se ha descrito que, en los linfocitos T cooperadores (Th), existen células Th1 que producen interleucina 2 e interferón \gamma (IFN-\gamma) que son citocinas que favorecen la activación de la inmunidad celular, como por ejemplo el macrófago (M\varphi), y también células Th2 que producen interleucina 4, interleucina 5 e interleucina 10 activando la actividad humoral que participa en la producción de anticuerpos.

Se ha demostrado también que los linfocitos Th1 y los linfocitos Th2 están controlados entre sí por las citocinas producidas por cada uno de ellos. De este modo, el IFN-\gamma producido por los linfocitos Th1 controla la activación de los linfocitos Th2 e induce la activación de los linfocitos Th1. Por otra parte, la interleucina 10 producida por los linfocitos Th2 controla la activación de los linfocitos Th1 y la interleucina 4 induce la activación de los linfocitos Th2.

Las enfermedades autoinmunitarias se clasifican de manera aproximada en organoespecíficas y generales. Se cree que, en las enfermedades autoinmunitarias generales y en la enfermedad alérgica, el síntoma es producido por la respuesta inmunitaria dominante en Th2 en tanto que, en las enfermedades autoinmunitarias específicas del órgano y en la enfermedad inflamatoria, el síntoma es producido por la respuesta inmunitaria dominante en Th1.

El reumatismo articular crónico que es una de las enfermedades autoinmunitarias se cree que es específico de la inflamación en el punto articular y se sugiere que probablemente es una enfermedad específica del órgano o, en otras palabras, autoinmunitaria mediada por Th1. De hecho, en los puntos de inflamación de los pacientes que padecen reumatismo, se observa la invasión de M\varphi y de los neutrófilos que se cree que son inducidos y activados por citocinas procedentes de Th1 y el aumento significativo en el factor a de la necrosis tumoral producido por M\varphi. En otras enfermedades autoinmunitarias específicas de los órganos y en las enfermedades inflamatorias, se observan también los mismos tipos histológicos y se cree que las células inflamatorias y las citocinas inflamatorias que están inducidas por Th1la agravan la inflamación.

A partir de estos hechos, se cree que, en la terapia de las enfermedades autoinmunitarias específicas del órgano tales como el reumatismo articular crónico, son importantes la supresión del factor de la necrosis tumoral producidas por M\varphi y la inducción de la interleucina 10 que es una citocina inhibidora de Th1 [Igaku no Ayumi, publicada por Ishiyaku Shuppan KK, volumen 182, páginas 523-528 y 661-665 (1997)].

Como farmacoterapia para el reumatismo articular crónico, se ha llevado a cabo una terapia interna mediante esteroides, agentes anti-inflamatorios no esteroideos y agentes inductores de la remisión tal como el oro y la D-penicilamina.

Problemas que debe resolver la invención

Un objetivo de la presente invención es desarrollar un compuesto que sirva para la terapia de las enfermedades inflamatorias tal como el reumatismo articular crónico y para facilitar productos farmacéuticos, alimentos y bebidas que contengan dicho compuesto.

Medios para resolver el problema

Para conseguir el objetivo mencionado anteriormente, los presentes inventores han realizado una investigación intensa y han descubierto que el 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona que está representado por la fórmula [I] (en lo sucesivo, denominado solo "la ciclopentenona") es útil en la terapia o prevención de enfermedades inflamatorias tales como el reumatismo articular crónico y las enfermedades inmunitarias, con lo cual se ha logrado la presente invención.

La idea de la presente invención es que la primera característica de la presente invención se refiere a un agente antirreumático que se caracteriza por contener al menos un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representado por la fórmula [I] siguiente y una sustancia ópticamente activa y una de sus sales como componente eficaz.

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La segunda característica de la presente invención se refiere a un alimento o bebida para la mejora o prevención del reumatismo articular crónico que se caracteriza por contener al menos un compuesto seleccionado de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representado por la fórmula [I] y una sustancia ópticamente activa y una de sus sales como componente eficaz.

Breve explicación de los dibujos

La Fig. 1 presenta la influencia de la ciclopentenona en el desarrollo de las células de Jurkat.

La Fig. 2 presenta la influencia de la ciclopentenona en el desarrollo de las células Molt-3.

La Fig. 3 presenta la expresión del antígeno Fas en las células Molt-3.

La Fig. 4 presenta la expresión del antígeno Fas en las células Jurkat.

La Fig. 5 presenta los cambios en la proporción de células que expresan el antígeno Fas cuando se realiza la incubación después de añadir 10 \muM de ciclopentano a las células Molt-3.

La Fig. 6 presenta la relación entre la cantidad de ciclopentenona y la proporción creciente de edema pedio.

La Fig. 7 presenta la relación entre la cantidad de ciclopentenona y la cantidad producida de factor de necrosis tumoral.

La Fig. 8 presenta la relación entre la concentración de ciclopentenona y la concentración de NO_{2}^{-}.

La Fig. 9 presenta la relación entre el tiempo de incubación y el número de células vivas en presencia de ciclopentenona.

La Fig. 10 presenta la actividad inhibidora de la ciclopentenona en la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado.

La Fig. 11 presenta la actividad inhibidora de la ciclopentenona en la proliferación de linfocitos.

La Fig. 12 presenta la actividad inhibidora de la ciclopentenona en la reacción de mezcla de linfocitos.

La Fig. 13 presenta un CD de derivado de p-dimetilaminobenzoílo de (-)-ciclo-pentenona y una estereoestructura de (-)-ciclopentenona.

La Fig. 14 presenta un CD de derivado de p-dimetilaminobenzoílo de (+)-ciclo-pentenona y una estereoestructura de (+)-ciclopentenona.

Realizaciones de la invención

A continuación la presente invención se ilustrará específicamente de la forma siguiente.

La ciclopentenona representada por la fórmula [I] utilizada en la presente invención abarca ambos isómeros en los que las configuraciones de los grupos hidroxilo en las posiciones 4 y 5 son cis y trans. En la presente invención, se puede utilizar cualquier cis-ciclopentenona, trans-ciclopentenona y una mezcla de cis- y trans-ciclopentenona. También es posible utilizar sus sustancias ópticamente activas.

Se puede preparar cis-ciclopentenona por síntesis química [Helvetica Chimica Acta, volumen 55, páginas 2838-2844 (1972)]. Se puede preparar trans-ciclopentenona bien por síntesis química [Carbohydrate Res., volumen 247, páginas 217-222 (1993)] o calentando un ácido urónico tal como el ácido glucorónico, derivado de ácido urónico tal como glucuronolactona o una sustancia que contenga la misma (referirse a PCT/JP97/03052). En la presente invención, es también posible utilizar dicho producto calentado o su producto 6r parcialmente purificado.

Por ejemplo, cuando se utiliza ácido D-glucurónico como ácido urónico y se calienta a 121ºC su solución al 1% durante cuatro horas, se produce ciclopentenona en la sustancia tratada térmicamente. Se extrae con un disolvente la ciclopentenona en esta sustancia tratada térmicamente y se concentra el extracto. A continuación, este extracto concentrado se separa mediante una cromatografía en columna de gel de sílice, se concentra la fracción de ciclopentenona eluida, la ciclopentenona se extrae del concentrado con cloroformo y el extracto del concentrado se somete a una cromatografía en columna en fase normal después de lo cual la ciclopentenona se aísla en la sustancia tratada térmicamente.

Las propiedades físicas de la ciclopentenona se darán a continuación, en relación con éstas, se realizó un análisis espectrométrico de masas de la ciclopentenona utilizando un espectrómetro de masas DX302 (fabricado por Nippon Denshi). Además, se realizó la medición de una RMN utilizando cloroformo pesado como disolvente con JNM-A 500 (fabricado por Nippon Denshi). Se midió la rotación específica con un polarímetro DIP-370 (fabricado por Nippon Bunko); se midió el espectro de absorción ultravioleta con un espectrofotómetro UV-2500 (fabricado por Shimadzu); y se midió el espectro de absorción infrarrojo (IR) con un espectrofotómetro infrarrojo FTIR-8000 (fabricado por Shimadzu).

MS m/z 115 [M+H]^{+}

^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta 4,20 (1H, d, J=2,4 Hz, 5-H), 4,83 (1H, m, 4-H), 6,30 (1H, dd, J = 1,2, 6,1 Hz, 2-H), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 6,1 Hz, 3-H).

A este respecto, el valor del desplazamiento químico de la ^{1}H-RMN se dio basándose en que el valor del desplazamiento químico de CHC_{3} era 7,26 ppm.

Rotación óptica: [\alpha]_{D}^{20} 0º (c 1,3, agua)

UV: \lambda_{max} 215 nm (agua)

IR (método KBr): las absorciones están indicadas a 3400, 1715, 1630, 1115, 1060, 1025 cm^{-1}.

Cuando la ciclopentenona aislada se somete a una resolución óptica, se obtienen (-)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona y (+)-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona. No hace falta decir que la ciclopentenona obtenida por el procedimiento sintético se puede someter también a una resolución óptica.

Se disuelve la ciclopentenona, por ejemplo, en etanol. A esta solución etanólica se añade además hexano/etanol (94/6) para preparar una solución de ciclopentenona. La ciclopentenona se puede resolver ópticamente cuando esta solución de la muestra se somete a una HPLC utilizando, por ejemplo, un Chiral Pack AS (fabricado por Daicel Chemical Industries) con la condición de que la temperatura de la columna sea 40ºC y la fase móvil sea hexano/etanol (94/6).

La rotación óptica de la (-)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona [en lo sucesivo denominada (-)- ciclopentenona] resuelta ópticamente es [\alpha]_{D}^{20} - 105º (c 0,30, etanol) mientras que la de la (+)-trans-4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona [en lo sucesivo denominada (+)- ciclopentenona] es [\alpha]_{D}^{20} + 104º (c 0,53, etanol). A este respecto, se midió la rotación óptica con el polarímetro mencionado anteriormente del tipo DIP-370 (fabricado por Nippon Bunko).

Después de esto, cada (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona se sometió a análisis estructural mediante análisis de masas y resonancia magnética nuclear (RMN), medición del espectro de absorción UV y medición del espectro de absorción infrarrojo por el método ya mencionado. Como resultado, ambas sustancias ópticamente activas presentaron los mismos resultados que los de la ciclopentenona antes de la resolución óptica.

Cada (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona ópticamente resuelta se transformó en un derivado de p-dimetilaminobenzoílo, se midió el espectro de dicroísmo circular (CD) utilizando un dispersímetro de dicroísmo circular de tipo J-720 (fabricado por Nippon Bunko) y el resultado se aplicó a una regla de quiralidad de dibenzoato [J. Am. Chem. Soc., volumen 91, páginas 3989-3991 (1969)] para determinar la configuración.

En la Fig. 13 se presenta el CD del derivado de p-dimetilaminobenzoílo de (-)-ciclopentenona y la estereoestructura de (-)-ciclopentenona. En el dibujo, la ordenada indica el dicroísmo circular molar mientras que la abscisa indica la longitud de onda (nm). A este respecto, se da a continuación la estereoestructura anterior como fórmula [II]

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En la Fig. 14 se presenta el CD del derivado de p-dimetilaminobenzoílo de (+)-ciclopentenona y la estereoestructura de (-)-ciclopentenona. En el dibujo, la ordenada indica el dicroísmo circular molar mientras que la abscisa indica la longitud de onda (nm). A este respecto, se da a continuación la estereoestructura anterior como fórmula [III]

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Como se presenta en la Fig. 13, Fig. 14, fórmula [II] y fórmula [III], la (-)-ciclopentenona es (-)-(4R, 5S)-trans-4,5-di-hidroxi-2-ciclopeten-1-ona en tanto la (+)-ciclopentenona es (+)-(4R, 5S)-trans-4,5-di-hidroxi-2-ciclopeten-1-ona.

Las ciclopentenonas mencionadas anteriormente o una de sus sustancias ópticamente activas se pueden preparar por cualquier método, es decir, se puede preparar por un método descrito en esta memoria o por síntesis química; y se pueden utilizar también en la presente invención la trans- y la cis-ciclopentenona o una de sus mezclas y una de sus sustancias ópticamente activas.

Ejemplos de la sal de ciclopentenona o de su sustancia ópticamente activa son las sales farmacéuticamentes aceptables y se pueden preparar por los métodos de transformación conocidos.

La ciclopentenona reacciona in vivo, por ejemplo, con un compuesto que contiene SH (tal como cisteína y glutation) para producir un derivado metabólico que sirve como fármaco. Por consiguiente, se cree que el efecto farmacéutico del derivado metabólico se consigue aún cuando se administre también ciclopentenona. El producto de reacción de la ciclopentenona con un compuesto que contiene SH in vivo se supone que es una de las sustancias metabólicamente eficaces.

De este modo, cuando se realiza la ejemplificación para un compuesto que contiene SH (R-SH), reacciona con el compuesto que contiene SH para dar un compuesto representado, por ejemplo, por la siguiente fórmula [IV] o [V]. Además, un compuesto representado por la fórmula [V] se transforma en un compuesto representado por la fórmula [IV].

Como tal, la ciclopentenona se transforma en cada uno de los derivados metabólicos en presencia de un compuesto que contiene SH (R-SH) y dicho derivado metabólico producido in vivo consigue un efecto también como fármaco.

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(R es un grupo residual en el que un grupo SH se transforma en el compuesto que contiene SH).

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Por consiguiente, la utilización de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales con un objetivo de producción de dicho producto de reacción in vivo, es decir, un derivado metabólico, está comprendida también por la presente invención.

La ciclopentenona, sus sustancias ópticamente activas o sus sales son los compuestos que tienen una acción fisiológica, tal como una acción antirreumática y una acción inhibidora en el reumatismo articular crónico. Cuando se utiliza al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de sus sustancias ópticamente activas o de una de sus sales como un componente eficaz y se prepara una preparación farmacéutica mediante combinación con conocidos vehículos farmacéuticos, es posible preparar entonces un agente antirreumático. En general, al menos uno de los compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales se compone con un vehículo líquido o sólido farmacéuticamente aceptable y, si es necesario, se añaden a ésta un disolvente, un agente dispersante, un emulsionante, un tampón, un estabilizante, una carga, un aglutinante, un agente disgregador, un lubricante para dar dicha preparación farmacéutica que puede ser en forma sólida como comprimidos, gránulos, polvos diluidos, polvos, cápsulas o en forma líquida tal como soluciones, suspensiones y emulsiones. Además, ésta puede estar en una preparación seca que se puede preparar en líquido añadiendo un vehículo apropiado antes de

\hbox{su
uso.}

El vehículo farmacéutico se puede seleccionar dependiendo del modo de administración y de forma de la preparación mencionados anteriormente. En el caso de preparaciones orales, se puede utilizar almidón, lactosa, azúcar, manitol, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sales inorgánicas. En la fabricación de las preparaciones orales, pueden componerse además con éstas aglutinantes, agentes de disgregación, agentes tensioactivos, lubricantes, fluidificantes, correctores de sabor, agentes colorantes y esencias.

Por otra parte, en el caso de preparaciones parenterales, éstas se pueden preparar por métodos habituales en los que, al menos uno de los compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales, que es un componente eficaz de la presente invención, se disuelve o se pone en suspensión en un diluyente tal como agua destilada para inyectables, solución salina fisiológica, solución acuosa de glucosa, aceite vegetal para inyectables, aceite de sésamo, aceite de cacahuete, aceite de semillas de soja, aceite de maíz, propilenglicol, polietilenglicol, seguido, si es necesario, de adición a éstos de bactericidas, estabilizantes, agentes isotónicos, analgésicos.

El agente antirreumático de la presente invención se administra por una vía apropiada dependiendo de la forma de la preparación. No existe tampoco limitación particular para el método de administración y se puede administrar por vía oral, vía externa e inyección. Las preparaciones inyectables se administran, por ejemplo por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracutánea, en tanto que las preparaciones por vía externa incluyen los supositorios.

La dosis del agente antirreumático no se especifica de manera concreta pero puede determinarse de forma apropiada dependiendo de la forma de dosificación, del método de administración, del fin del uso y de la edad, del peso corporal, de las enfermedades, de los pacientes. Normalmente, sin embargo, la cantidad de al menos uno de los compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales contenida en la preparación para un adulto es de 0,1 \mug a 200 mg/kg al día. Por rutina, la dosis puede variar en función de varios factores y, por consiguiente, una dosis menor que la mencionada anteriormente puede ser suficiente en algunos casos mientras que, en otros casos, puede ser necesaria una dosis mayor de la anterior. El agente de la presente invención se puede administrar por vía oral tal cual y, además, el agente se puede tomar diariamente después de añadirlo también a alimentos y/o a bebidas habituales.

Además de la actividad antirreumática y de la actividad inhibidora mencionadas anteriormente en el reumatismo articular crónico la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales realiza varias actividades fisiológicas tales como la actividad anti-inflamatoria en la artritis, la actividad inhibidora del edema de carragenina, la actividad inhibidora de la producción del factor de necrosis tumoral, el aumento de actividad de la producción de interleucina 10, la actividad inhibidora de la producción del monóxido de nitrógeno, la actividad inductora de apoptosis en las células sinoviales, la actividad inductora de la producción del antígeno Fas, la actividad inmunomoduladora, como por ejemplo la actividad inhibidora de hipersensibilidad de tipo retardado, la actividad inhibidora de proliferación de linfocitos, la actividad inhibidora en la reacción de linfocitos mixtos, la actividad inhibidora en la producción de IgE, la actividad inhibidora en la topoisomerasa. Por lo tanto, el agente farmacéutico tal como el agente anti-inflamatorio o el profiláctico de la inflamación, el inhibidor de la producción del factor de necrosis tumoral o el profiláctico de la producción del factor de necrosis tumoral, el potenciador de la producción de interleucina 10, el inhibidor de la producción de monóxido de nitrógeno, el inductor de la producción del antígeno Fas, el inmunomodulador, el inhibidor de la producción de IgE, el inhibidor de la hipersensibilidad de tipo retardado y el inhibidor de la topoisomerasa que contienen al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales se pueden preparar en preparaciones farmacéuticas de la misma manera que en caso del agente antirreumático anterior y se pueden administrar de la misma manera que el agente antirreumático anterior.

La dosis de esas preparaciones se puede determinar de manera apropiada dependiendo del agente antirreumático anterior. Por ejemplo, en el caso de un agente anti-inflamatorio y de un inhibidor de la producción del factor de necrosis tumoral, la cantidad de uno o más compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de sus sustancias ópticamente activas o de sus sales contenidas en la preparación es preferentemente de 50 pg a 50 mg/kg al día para adultos mientras que, en el caso del inhibidor de la producción de monóxido de nitrógeno, la cantidad de uno o más compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de sus sustancias ópticamente activas o de sus sales contenidas en la preparación preferentemente es de 0,1 \mug a 20 mg/kg al día para adultos. La cantidad de componente eficaz en la preparación se puede controlar en función del objeto de su utilización. Esos agentes se pueden administrar por vía oral tal cual y, además, el agente se puede tomar diariamente después de añadir también al alimento y/o a la bebida habitual.

El reumatismo es una enfermedad autoinmunitaria en la que tiene lugar impedimento en las células del peritoneo y en las células del cartílago y el agente antialérgico de la presente invención es útil también como agente terapéutico en las enfermedades autoinmunitarias.

La ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales inhibe la producción del factor de la necrosis tumoral que se cree que produce directamente la inflamación en las enfermedades autoinmunitarias específicas del órgano tales como la artritis reumatoide crónica o las enfermedades inflamatorias y aumenta la producción de interleucina 10 que es una citocina que inhibe a Th1. Por consiguiente, mejoran los síntomas de inflamación tal como el reumatismo que es una enfermedad autoinmunitaria específica del órgano, particularmente la artritis reumatoide crónica; disminuyen en gran medida los marcadores de inflamación tales como el índice de proteína reactiva C (CRP), el índice del factor reumatoide (RF) y la velocidad de sedimentación de eritrocitos (sedimentación de la sangre); y también mejoran de forma significativa las complicaciones tal como la disbasia.

El factor de la necrosis tumoral se observó como factor que induce la necrosis hemorrágica en el punto del tumor y, actualmente, se reconoce como citocina que participa ampliamente en la biofilaxia de tipo inflamatorio y en la función inmunitaria. La insuficiencia en la regulación de la producción de este factor de necrosis tumoral produce varios inconvenientes en el huésped y el exceso o la producción no modulada del factor de necrosis tumoral está relacionada con muchas enfermedades incluyendo la artritis reumatoide crónica, la mielitis reumática, la osteoartritis, la artritis gotosa, la septicemia, el choque septicémico, el choque de endotoxina, la septicemia por bacterias gram negativas, el síndrome del choque tóxico, la malaria cerebral, la neumonía crónica, la enfermedad injerto contra huésped, la reacción de rechazo al alotrasplante y otras fiebres y dolores musculares por enfermedades infecciosas tales como la gripe, la caquexia secundaria a la infección o el tumor maligno, la caquexia secundaria al síndrome humano de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), SIDA, síndrome relacionado con el SIDA, formación de queloides, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, diabetes mellitus autoinmunitaria y lupus eritematoso generalizado [Molecular Medicine, volumen 33, páginas 1010-1020 y páginas 1182-1189 (1996)]. El agente antirreumático de la presente invención es útil en la terapia de enfermedades que están mediadas o empeoran por el factor de necrosis tumoral. La presente invención facilita además un método para controlar la producción del factor de necrosis tumoral en el que se utiliza al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales como componente eficaz. La presente invención facilita además un alimento o bebida que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales que mejora los síntomas de la enfermedad o que impide que la enfermedad se medie o empeore por el factor de necrosis tumoral.

El monóxido de nitrógeno (en lo sucesivo, abreviado como NO) es el factor principal del factor relajante dependiente del endotelio (EDRF) [Nature, volumen 327, páginas 524-526 (1987)]. La presente invención facilita un agente farmacéutico que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales como componente eficaz para la terapia o prevención de las enfermedades que requieren la inhibición de la producción de NO. No existe particular limitación para las enfermedades que requieren la inhibición de la producción de NO y sus ejemplos son la hipotensión general producida por el choque tóxico o por la terapia de determinada citocina, que disminuyen la respuesta de la presión sanguínea, las enfermedades autoinmunitarias, la inflamación, la artritis, la artritis reumatoide, la diabetes mellitus, las enfermedades inflamatorias del intestino, la insuficiencia de la función de los vasos sanguíneos, la dilatación etiológica de los vasos sanguíneos, la alteración de los tejidos, la isquemia vascular, la sensibilidad al dolor, la isquemia cerebral, las enfermedades causadas por angiogénesis y el cáncer. Las enfermedades incluyen aquellas que se mencionan en las publicaciones Hei de la patentes japonesas expuestas al público nº 09/504.524; nº 09/505.288; nº 08/501.069; nº 08/512.318 y nº 06/508.849.

El inhibidor de la producción de NO que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales como compuesto eficaz sirve para el estudio del mecanismo de la producción de NO y del mecanismo de la actividad biológica del NO y, además, se puede utilizar para identificar las sustancias que participan en el mecanismo de la producción de NO.

La ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales realiza una inhibición de actividad de la producción de NO en las células productoras de NO. Por ejemplo, cuando se añade la endotoxina (lipopolisacárido o LPS) a la cepa de células de macrófago, se expresa la NO sintetasa (NOS) inducible y se segrega NO en el medio mientras que, cuando se añade LPS en la coexistencia de la ciclopentenona, derivados de ciclopentenona o sus sustancias ópticamente activas, se inhibe la producción de NO. Cuando se induce la producción de NO mediante tratamiento con LPS, disminuye la cantidad de células supervivientes debido a la actividad citopática del NO pero, cuando se añade ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales durante el tratamiento con LPS, disminuye la producción de NO y se suprime también el trastorno a las células.

La angiogénesis es esencial para el crecimiento del carcinoma sólido y el factor de crecimiento angioendotelial/factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) desempeña un papel importante en esta etapa. En varias células cancerosas, VEGF es inducido por NO. Cuando la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales inhibe la producción de NO, se inhibe también la producción de VEGF de las células cancerosas y, como resultado se inhibe la angiogénesis en torno a los tejidos cancerosos. Cuando la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales se administra al ratón en el que se forma un cáncer sólido mediante un transplante subcutáneo de células cancerosas, se vuelve insuficiente la formación de vasos sanguíneos alrededor de los tejidos cancerosos y el cáncer se separa de éstos.

Las nitrosoaminas son una serie de compuestos que se sintetizan por adición del grupo nitroso a la amina secundaria y se conocen varios centenares de nitrosoaminas. Muchas de ellas alteran el ADN y son carcinógenas para los animales. Se ha dicho que las nitrosoaminas están muy relacionadas también con la generación de cáncer en el hombre y normalmente se producen en el estómago por reacción del nitrito con aminas. Incluso en condiciones fisiológicas de pH neutro, el NO reacciona con la amina para dar nitrosoamina. Además, la producción de NO aumenta en los pacientes infectados por el tremátodo hepático oriental y en aquellos que padecen cirrosis hepática que está muy relacionada inmunológicamente con el cáncer. Por consiguiente, cuando se suprime el aumento la producción de NO por administración de ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales, es posible evitar la generación del cáncer, especialmente en un grupo de alto riesgo. Como tal, la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales presenta una acción anticancerosa en sus dos etapas inhibidoras de carciogénesis y también de inhibición de angiogénesis en los tejidos cancerosos.

Además, NO produce el edema que se observa de forma característica en las lesiones inflamatorias, es decir la permeabilidad de los vasos sanguíneos [Maeda, et al., Japanese Journal of Cancer Research, volumen 85, páginas 331-334 (1994)] y también induce la biosíntesis de prostaglandinas que son mediadoras de la inflamación [Salvemini, et al., Proceedings of Nacional Academy of Sciences, U.S.A., volumen 90, páginas 7240-7244 (1993)]. Por otra parte, se cree que el NO reacciona rápidamente con los radicales superóxido y que el peroxinitrito resultante produce células inflamatorias y alteraciones en el tejido.

Cuando los inmunocitos activados se alojan en un órgano y se libera citocina de éste, se induce la producción de NO. La diabetes mellitus dependiente de insulina es una enfermedad producida por una destrucción específica de las células \beta de Langerhans y el NO realiza la destrucción. Además, el fluido de la articulación de las lesiones de los pacientes que padecen reumatismo articular crónico, reumatismo osteoarticular, artritis gotosa y artritis acompañada de la enfermedad de Behçet contiene concentraciones mayores de NO en comparación con el fluido de la articulación en las articulaciones normales de dichos pacientes o de las articulaciones de personas sanas. Cuando la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales se administra a dichos pacientes, se inhibe la producción de NO en las lesiones y mejoran los síntomas.

Durante la isquemia cerebral y después de la revascularización, la producción de NO aumenta y, como resultado, se alteran los tejidos cerebrales. Cuando se administra al paciente durante la isquemia cerebral ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales, se reduce la alteración de los tejidos cerebrales y mejora el pronóstico.

El antígeno de la superficie celular que se denomina antígeno Fas (antígeno APO-1 o CD95) ha estado recibiendo atención como molécula inductora de apoptosis [Cell, volumen 66, páginas 233-243 (1991); J. Exp. Med., volumen 169, páginas 1747-1756 (1989); J. Biol. Chem., volumen 267, páginas 10709-10715 (1992); y J. Immunology, volumen 184, páginas 1274-1279 (1992)].

El antígeno Fas se expresa en los inmunocitos, tales como las células del timo, linfocitos T, linfocitos T citotóxicos, linfocitos B y células NK. Contra la invasión de pseudo-autoantígenos extraños, el sistema inmunitario induce la reacción inmunitaria mediante la cual se excluye el pseudo-autoantígeno. Sin embargo, no presenta reacción inmunitaria contra el autoantígeno y se crea auto-tolerancia. Esto es debido a que las células madre linfocíticas con autorreactividad se someten a la eliminación de clones que es una selección negativa mediante la cual tiene lugar la exclusión por muerte de las células por apoptosis. Sin embargo, cuando estas células no se someten a la apoptosis debido a alguna anomalía en el cuerpo vivo, tal como una deficiencia genética del antígeno Fas, los linfocitos T autorreactivos se acumulan, por ejemplo, en las áreas periféricas. En el cuerpo vivo normal, la auto-tolerancia está disponible incluso para los linfocitos B que son las células en carga de los linfocitos B inmunes y de los autorreactivos se mueren normalmente debido a la apoptosis pero, cuando los linfocitos B autorreactivos no se someten a apoptosis debido a una anomalía, tal como una insuficiencia genética del antígeno Fas, los linfocitos B autorreactivos se acumulan en las zonas periféricas. Además, en el caso del reumatismo articular, la anomalía mencionada anteriormente en los linfocitos autorreactivos y la anomalía en la renovación de las células sinoviales son algunas causas de las enfermedades.

Un inductor de la producción del antígeno Fas en el que al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales es un componente eficaz útil para la inducción de la apoptosis de las células innecesarias para constituir el cuerpo vivo que no se eliminan en el cuerpo vivo debido a la anomalía de la renovación y se pueden utilizar linfocitos autorreactivos en un método de inducción de la producción del antígeno Fas. El agente que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales como componente eficaz sirve también como agente para la prevención o terapia de las enfermedades acompañadas de producción anormal de antígeno Fas. En la presente invención, no existe limitación concreta para las enfermedades acompañadas de producción anormal de antígeno Fas y sus ejemplos son el reumatismo articular y las enfermedades autoinmunitarias producidas por los linfocitos T autorreactivos y los linfocitos B autorreactivos incluyendo las enfermedades mencionadas en la memoria del documento WO97/0965.

La ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales tiene una actividad inmunomoduladora, tal como la actividad potenciadora de la producción de interleucina 10, la actividad inhibidora de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, la actividad inhibidora de proliferación de linfocitos, la actividad inhibidora de la reacción mixta de linfocitos, la actividad inhibidora de producción de IgE y la actividad inhibidora del edema de carragenina y el inmunomodulador que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales como un componente eficaz es útil como agente para la terapia o la prevención de las enfermedades producidas por la anomalía de este sistema inmunitario y de este factor
inmunitario.

Por lo tanto, como resultado de la reducción de la producción de interleucina 10, se activa Th1 y se reduce la inflamación del Th1 autoinmunitario dominante. Esta inflamación participa en las enfermedades autoinmunitarias específicas del órgano, tales como la nefritis y la hepatitis así como el rechazo del transplantes y la dermatitis alérgica de contacto. El inmunomodulador anterior aumenta la producción de interleucina 10 e inhibe la actividad de Th1, por lo que es útil en la terapia y prevención de aquellas enfermedades.

La proliferación de linfocitos es una reacción en la que el mitógeno se une al receptor en la superficie del linfocito para activar el linfocito con lo cual se favorece la división y el crecimiento de éste. La reacción de linfocitos mixtos es una reacción en la que los linfocitos obtenidos a partir de animales de la misma especie pero de diferente familia se someten a un cultivo mixto con lo cual se induce la activación de los linfocitos debido a la discrepancia de los antígenos principales adaptables al tejido y se favorece la división y el crecimiento de los linfocitos. El inmunomodulador mencionado anteriormente inhibe aquellas reacciones y es particularmente útil para la terapia o prevención de las enfermedades autoinmunitarias crónicas causadas por el fomento de linfocitos, tales como la nefritis crónica, la colitis crónica, la diabetes mellitus de tipo I y el reumatismo articular crónico y es también útil en la inhibición del rechazo del transplante.

El modelo de enema pedio inducido por la carragenina es una reacción en la que se inyecta por vía subcutánea en las patas carragenina, que es un inductor de inflamación para inducir células de inflamación tal como macrófagos y neutrófilos por lo cual aumenta la permeabilidad de los vasos sanguíneos por factores inflamatorios producidos por aquellas células que inducen el edema. La acción inhibidora del inmunomodulador mencionado anteriormente en el edema es útil en la terapia o prevención de enfermedades que requieren control del aumento de permeabilidad del vaso sanguíneo, tal como el reumatismo articular crónico.

En las enfermedades alérgicas representadas por el asma y la dermatitis atópica, la liberación de mediadores químicos de mastocitos desempeña un papel importante en la reacción alérgica. Esta reacción se induce cuando la IgE se une a los receptores en la membrana de la célula para formar una reticulación y el inmunomodulador anterior inhibe la producción de IgE y es totalmente útil para la mejora de los síntomas y/o la prevención de enfermedades mediadas o empeoradas por la producción de IgE, tales como las enfermedades alérgicas producidas por IgE incluyendo el asma bronquial, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la conjuntivitis alérgica, la urticaria, el choque anafiláctico, además, el inmunomodulador anterior inhibe la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado y es útil para la terapia y prevención de las enfermedades acompañadas de hipersensibilidad de tipo retardado, tal como la hipersensibilidad por contacto, la dermatitis alérgica por contacto, la alergia bacteriana, la alergia micótica, la alergia vírica, la alergia a los fármacos, la tiroiditis y la encefalitis alérgica.

En la presente invención, se utilizan la ciclopentenona, sus sustancias ópticamente activas o una de sus sales y un material seleccionado del producto tratado térmicamente de la ciclopentenona y una ciclopentenona purificada parcialmente a partir de dicho producto tratado térmicamente para facilitar un alimento o bebida funcional que tenga actividad antirreumática, actividad anti-inflamatoria, actividad inhibidora de la producción del factor de necrosis tumoral, aumento de la actividad de la producción de interleucina 10, actividad inhibidora de la producción del monóxido de nitrógeno, actividad inductora de apoptosis en las células sinoviales, actividad inductora de la producción del antígeno Fas, actividad inmunomoduladora, tal como la actividad inhibidora de hipersensibilidad de tipo retardado, la actividad inhibidora de la proliferación de linfocitos, actividad inhibidora de la reacción de linfocitos mixtos, actividad inhibidora de la producción de IgE y actividad inhibidora en la topoisomerasa tal como un alimento o bebida para mejorar el reumatismo, un alimento o bebida para mejorar la inflamación, un alimento o bebida para inhibir la producción del factor de necrosis tumoral, un alimento o bebida para aumentar la producción de interleucina 10, un alimento o bebida para inhibir la producción de monóxido de nitrógeno, un alimento o bebida para inducir la producción de antígeno Fas, un alimento o bebida para la inmunomodulación, un alimento o bebida para inhibir la producción de IgE y un alimento o bebida para la inhibición de la topoisomerasa.

No existe ninguna limitación concreta para el método de preparación del alimento o bebida de la presente invención pero se pueden aplicar los métodos de preparación, tratamiento y fabricación utilizados frecuentemente para el alimento o la bebida con la condición de que al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales con acción fisiológica, tal como una acción antirreumática esté contenido como componente eficaz en el alimento o bebida resultante. El alimento o bebida en el que uno o más compuestos seleccionados de la ciclopentenona, sus sustancias ópticamente activas o sus sales está(n) contenidos en ésta, añadidos a ésta y/o diluidos en ésta se define como el alimento o bebida de la presente invención.

No existe ninguna limitación concreta de tamaño del alimento o bebida de la presente invención en la medida en que al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales esté contenido en ésta, añadido a ésta o diluido en ésta como componente eficaz. De este modo, la forma incluye las que se pueden tomar por vía oral como por ejemplo comprimidos, gránulos, cápsulas, geles y soles.

Debido a que el alimento o bebida de la presente invención con actividades fisiológicas de al menos uno o más compuestos seleccionados de la ciclopentenona, de sus sustancias ópticamente activas o de sus sales, tales como la actividad antirreumática, la actividad anti-inflamatoria, la actividad inhibidora de la producción del factor de necrosis tumoral, el aumento de actividad de la producción de interleucina 10, la actividad inhibidora de la producción de monóxido de nitrógeno, la inducción de actividad de la producción de antígeno Fas, la inmunomodulación de actividad tal como la actividad inhibidora de la hipersensibilidad de tipo retardado, la actividad inhibidora de la producción de IgE y la actividad inhibidora a la topoisomerasa, es un alimento o bebida sanitario con efecto mejorador de los síntomas en las enfermedades que presentan sensibilidad a la ciclopentenona, a su sustancia ópticamente activa o a una de sus sales y que evita el efecto de dichas enfermedades, y además, es un alimento o bebida que sirve para mantener las constantes del cuerpo vivo.

Actualmente es posible según la presente invención que una cantidad apropiada de ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales con actividad fisiológica esté contenida en el alimento o bebida. Debido a la acción fisiológica de estos compuestos tal como la actividad inductora de apoptosis en las células sinoviales, la actividad inductora de la producción de antígeno Fas, la actividad inhibidora de la producción del factor de necrosis tumoral, la actividad inhibidora de la producción de NO y la actividad para mejorar y/o prevenir los síntomas de reumatismo, particularmente la del reumatismo articular crónico, el alimento o bebida de la presente invención es muy útil en la mejora o prevención de los síntomas del reumatismo, en las complicaciones debidas al reumatismo y en la dificultad para andar.

No se observó toxicidad en el compuesto utilizado en la presente invención aún cuando se administre la dosis eficaz para conseguir esas actividades fisiológicas. En el caso de la administración oral, por ejemplo, no se observó ningún caso de muerte en ratas por una sola administración oral de 100 mg/kg de ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales.

Ejemplos

La presente invención se ilustrará además mediante los siguientes ejemplos. A este respecto, "%" utilizado en los ejemplos representa "% en peso".

Ejemplo de referencia 1

Se disolvió ácido D-glucurónico (G 5269; fabricado por Sigma) (10 g) en 1 litro de agua, se calentó a 121ºC durante cuatro horas y se concentró al vacío hasta aproximadamente 10 ml. Se mezcló esto con 40 ml de una capa superior de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido acético y agua y se centrifugó y se concentró al vacío el líquido sobrenadante resultante hasta aproximadamente 10 ml.

El extracto anterior se aplicó a gel de sílice (BW-300SP; 2 \times 28 cm; fabricado por Fuji Silycia) para una cromatografía en columna y se separó utilizando una capa superior de una mezcla 3:2:2 de acetato de butilo, ácido acético y agua como eluyente a un caudal de aproximadamente 5 ml/minuto a una presión de 0,2 kg/cm^{2} utilizando un compresor. Se realizó el fraccionamiento para preparar un volumen de una fracción de 10 ml y se analizó por cromatografía en capa fina una parte de cada fracción después de lo cual contenía ciclopentenona de gran pureza en las fracciones 61º a 80º. Se recogieron estas fracciones, se concentraron al vacío, se extrajeron con 40 ml de cloroformo y se concentró el extracto al vacío para dar 100 mg de ciclopentenona.

Se separó la fracción por medio de HPLC en fase normal utilizando una columna Palpack de tipo S, cuando se realizó la detección por absorción ultravioleta de 215 nm, se obtuvo la pureza del 98%.

Se disolvió la ciclopentenona anterior (113,9 mg) en 2,85 ml de etanol. A esta solución etanólica se añadió 3,85 ml de hexano/etanol (94/6) para preparar una solución de ciclopentenona (17 mg/ml). Se filtró esta solución a través de un filtro de 0,5 \mum para preparar una solución de muestra para una HPLC de resolución óptica.

Esta solución de muestra se aplicó a una HPLC de resolución óptica, se recogieron las fracciones de (-)-ciclopentenona en el pico inicial y de (+)-ciclopentenona en el último pico y se evaporó a sequedad al vacío para dar 43,2 mg de (-)-ciclopentenona y 43,0 mg de (+)-ciclopentenona.

Condiciones para la HPLC de resolución óptica.

Columnas: Chiral Pack AS (fabricada por Daicel) 2,0 cm \times 25,0 cm

Temperatura de la columna: 40ºC

Fase móvil; exano/etanol (94/6)

Caudal: 14,0 ml/minuto

Detección: UV 210 nm

Cantidad de la muestra cargada: 150 \mul (2,55 mg)

Cada (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona obtenida en esta memoria contiene aproximadamente 1% de enantiómero y, por consiguiente, se sometieron de nuevo a una resolución óptica en las condiciones mencionadas anteriormente. Como resultados, se obtuvieron 19,7 mg de (-)-ciclopentenona no conteniendo ningún enantiómero a partir de 30,0 mg de (-)-ciclopentenona del pico inicial, mientras que a partir de 37,4 mg de (+)-ciclopentenona del último pico, se obtuvieron 27,7 mg de (+)-ciclopentenona no conteniendo ningún enantiómero. A este respecto, los tiempos de elucción en la HPLC de resolución óptica de la (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona fueron 33 minutos y 40 minutos, respectivamente.

Ejemplo 1

Cuando se administró 50 ml del preparado de bebida (conteniendo 2 mg de ciclopentenona) por día según el Ejemplo 12-(2) durante un mes a una paciente hembra (de 56 años de edad) que fue diagnosticada de reumatismo articular crónico desde hacía cinco años y se trató como reumatismo artrítico crónico por medio de esteroides, agentes antirreumáticos, agentes anti-inflamatorios sedantes como agentes terapéuticos pero sin presentar mejoría en los síntomas, en la que el índice CRP no era menor de 3 mg/dl, siendo el índice RF no menor de 300 U/ml y siendo no menor de 20 ml/h la velocidad de sedimentación de eritrocitos y estaba casi encamada debido a la dificultad para andar, se observaron mejoras hematológicas de los síntomas del reumatismo articular crónico, como por ejemplo los datos de CRP, los datos de RF y la velocidad de sedimentación de eritrocitos. Además, la función cinética en la vida diaria como por ejemplo el andar mejoró de manera significativa junto con los descensos de los datos anteriores.

Ejemplo 2

Las células DSEK (cepa de células almacenada en el Department of Second Internal Medicine, Integrated Medical Center, Saitama Collage of Medicine)que era una cepa de fibroblastos creada a partir de la membrana sinovial de un paciente que padecía reumatismo articular crónico se incubó en un medio Dulbecco modificado por Iscob (IMDM, fabricado por Gibco, 12440-053) conteniendo suero bovino fetal al 10% (FBS, fabricado por Gibco, 26140-079) a 37ºC en gas dióxido de carbono hasta confluencia y a continuación se recogieron las células por exfoliación con tripsina-EDTA (fabricado por Gibco, 25300-054). Se pusieron en suspensión las células en el medio mencionado anteriormente hasta que resultaron 25.000 células/ml y se colocaron 100 \mul en cada pocillo de una placa de microvaloración de 96 pocillos. Después de cinco días de incubación cuando se había conseguido casi el estado de confluencia, se desechó el medio y a continuación se añadió el medio mencionado anteriormente conteniendo 2,5, 5, 10, 20 ó 30 \muM de ciclopentenona. Después de incubación durante 24, 48 ó 72 horas, se añadió a esto 10 \mul de WST-1 premezclado (fabricado por Takara Shuzo, MK400) seguido de someter a una reacción a 37ºC durante cuatro horas. El valor obtenido deduciendo la absorbancia a 650 nm (A_{650}) de ésta a 450 nm (A_{450}) se definió como grado de crecimiento de las
células.

El resultado es el mostrado en la Tabla 1.

TABLA 1

6

En ambos casos de incubación durante 24 horas y 48 horas, se inhibió el crecimiento celular en las secciones en las que se añadió 5 \muM o más ciclopentenona en comparación con la referencia en la que se añadió agua y, en la sección en la que se añadió 10 \muM de ciclopentenona, se notó la producción de cuerpos apoptósicos. En la sección en la que se añadió 20 \muM o más de ciclopentenona, apenas se observaron células vivas.

Como tal, la ciclopentenona presentó acción inductora de apoptosis y acción inhibidora de crecimiento en las células sinoviales. (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona presentaron también resultados similares.

Ejemplo 3

(1) Se incubaron 5 \times 10^{5} células/ml de células de Jurkat (ATCC TIB-152) y células Molt-3 (ATCC CRL-1552) que eran cepas de linfocitos T humanos de leucemia en un medio RPMI 1640 (fabricado por Gibco BRL) conteniendo suero de ternero fetal al 10% (FCS, fabricado por Bio Whittaker) a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% y se añadió a esto ciclopentenona 0, 5, 10 ó 20 \muM seguido de incubación durante otras 24 horas. Se midió el crecimiento celular por un método MTT [Mosmann, et al.: J. Immunol. Methods, volumen 65, páginas 55-63 (1983)] en el que el grado de crecimiento celular se determinó por la absorbancia a 560 nm.

El resultado fue que, en ambas cepas de células, se inhibió el crecimiento celular en una extensión de aproximadamente 50% y no menos del 75% en las secciones en las que se añadieron 10 \muM y 20 \muM de ciclopentenona, respectivamente en comparación con la referencia en la que se añadió agua. En el caso en que se añadió ciclopentenona 5 \muM o menor, no hubo efecto significativo en el crecimiento de las células.

Como tal, la ciclopentenona inhibió, en función de la concentración, el crecimiento de las células de Jurkat y de las células Molt-3 que eran cepas de células de leucemia con linfocitos T.

Los resultados se dan en la Fig. 1 y en la Fig. 2. La Fig. 1 presenta una influencia de ciclopentenona en el crecimiento de las células de Jurkat mientras que la Fig. 2 presenta una influencia de la ciclopentenona en el crecimiento de las células Molt-3. En la Fig. 1 y en la Fig. 2, la abscisa indica la concentración (\muM) de ciclopentenona en tanto que la ordenada indica la absorbancia a 560 nm.

(2) La influencia de la ciclopentenona en la expresión del antígeno Fas (inducción productiva) en las células de Jurkat y en las células Molt-3 se midió de la forma siguiente. En un medio RPMI 1640 con FCS al 10% conteniendo 0, 1, 5, 10 ó 20 \muM de ciclopentenona o GM, 5 \times 10^{5} células/ml de células de Jurkat o de células Molt-3 se incubaron a 37ºC durante 24 horas en presencia de 5% de CO_{2} y a continuación se sometieron a una inmunotinción en dos etapas utilizando un anticuerpo anti-Fas (fabricado por Boehringer-Ingelheim) según el método de Munker [Munker, R.: Ann. Hematol., volumen 70, páginas 15-17 (1995)].

Se midió la intensidad de fluorescencia de las 1 \times 10^{4} células teñidas con un citómetro de flujo (Orthocytron; fabricado por Ortho Diagnostic Systems) y se calculó la cantidad de células que presentaban una intensidad de fluorescencia predeterminada o mayor que eran las células que expresan el antígeno Fas.

El resultado fue que en ambas cepas de células, la cantidad de células que expresan el antígeno Fas aumentó en función de la concentración cuando se añadía 1 a 20 \muM de ciclopentenona.

Los resultados se presentan en la Fig. 3 y en la Fig. 4. De este modo, la Fig. 3 presenta la expresión del antígeno Fas en las células Molt-3 mientras que la Fig. 4 presenta la de las células de Jurkat. En la Fig. 3 y en la Fig. 4, la abscisa indica la concentración (\muM) de ciclopentenona mientras que la ordenada indica la cantidad (%) de células que expresan el antígeno Fas por lo que se observó una acción inductora de la producción de antígeno Fas por la ciclopentenona.

(3) Se incubaron células Molt-3 durante 1, 3, 6, 12 ó 24 horas después de la adición de 10 \muM de ciclopentenona y a continuación se midió la cantidad de células que expresaban el antígeno Fas.

El resultado fue que cuando se añadía 10 \muM de ciclopentenona, la cantidad de células que expresan el antígeno Fas comenzaba a aumentar después de una hora de incubación y continuaba aumentando gradualmente hasta 24 horas después de la incubación.

El resultado se presenta en la Fig. 5. De este modo, la Fig. 5 presenta un cambio en la proporción de células que expresan el antígeno Fas cuando se realiza la incubación después de añadir 10 \muM de ciclopentenona a células Molt-3 en las que la abscisa indica el tiempo de incubación (horas) mientras que la ordenada indica la proporción (%) de células que expresan el antígeno Fas.

De este modo, como se mencionó en el ejemplo 3-(1) a (3), se determinó una acción de la ciclopentenona para inducir la expresión del antígeno Fas. (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona también dieron resultados similares.

Ejemplo 4

Se prepararon modelos de edema pedio inducidos por carragenina, que eran modelos animales de reumatismo articular crónico, de la forma siguiente utilizando ratas de Lewis macho [adquiridas en Seac-Yoshitomi de cinco semanas (peso corporal: aproximadamente 130 g) después de someter a una cría preliminar durante una semana para nuestra finalidad] y se evaluaron los fármacos del ensayo.

Se administró a las ratas que estaban en ayunas desde hace 18 horas antes del inicio del experimento por vía oral con 10 ml/kg de ciclopentenona que se preparó con agua destilada (fabricada por Otsuka Pharmaceutical) para preparar 1 y 5 mg/ml.

Después de 0,5 horas de la administración del fármaco de la prueba, se inyectó 100 \mul/rata de suspensión al 1% de carragenina (fabricada por Wako) en una solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical) en la pata derecha para inducir edema pedio. Después de tres horas de la inyección de carragenina, se midió el volumen de la pata derecha de la rata con un dispositivo de medición del volumen pedio (fabricado por UGO BASILE). Con este objeto, se expresó el valor medido calculando la cantidad creciente del volumen de la pata derecha de cada rata medido antes de la administración de carragenina.

El resultado se presenta en la Fig. 6. De este modo, la Fig. 6 presenta una relación entre la cantidad de ciclopentenona y la proporción creciente de enema pedio en el que la ordenada indica un aumento de la proporción (%) mientras que la abscisa indica una dosis de ciclopentenona (mg/kg).

La ciclopentenona presentó una actividad de inhibición significativo al enema pedio a la dosis de 50 mg/kg. (-)-Ciclopentenona y (+)-ciclopentenona también proporcionaron efectos similares.

Ejemplo 5

(1) Se administró LPS (lipopolisacárido; fabricado por Sigma; L-2012) procedente de Salmonella abortus equi disuelto en una solución salina fisiológica por vía intraperitoneal (0,1 mg/kg) a ratones hembra de la cepa CDF1 de 20 semanas de edad para preparar modelos de choque con endotoxina.

Se administró ciclopentenona bien por vía intraperitoneal o por vía oral a una dosis de 30 mg/kg, 30 minutos antes de la administración de LPS. Por otra parte, el grupo de referencia no se administró como tal. Después de 90 minutos de la administración de LPS, se extrajo sangre de los ratones y se separó el suero. A continuación se midió la cantidad de factor de necrosis tumoral en el suero por medio de un kit TNF-\alphaELISA (fabricado por Genzyme) y se midió el efecto de la inhibición de la producción del factor de necrosis tumoral mediante administración de
ciclopentenona.

El resultado se da en la Tabla 2. De este modo, las concentraciones del factor de necrosis tumoral en el suero fueron bajas, en comparación con el grupo de referencia, en los grupos administrados con ciclopentenona tanto en los grupos de administraciones intraperitoneales como orales, por lo que la producción del factor de necrosis tumoral se suprimió de forma significativa mediante administración de la ciclopentenona.

TABLA 2

7

**: con diferencia significativa en la referencia a p < 0,001

*: con diferencia significativa en la referencia a p < 0,01

(2) Se inyectó LPS (10 \mug/ratón) por vía intraperitoneal a ratones CDF1 hembra de ocho semanas de edad y se prepararon modelos de choque con endotoxina. Se administró por vía subcutánea ciclopentenona a la dosis de 0,03, 0,3, 3 y 30 mg/kg quince minutos antes de la administración de LPS (constando cada grupo de cuatro ratones). Después de una hora de administración de LPS, se extrajo sangre de los ratones, se separó el suero y se midió la cantidad de factor de necrosis tumoral en el suero y la cantidad de interleucina 10 mediante un kit ELISA disponible en el comercio (fabricado por Endogen).

El resultado se presenta en la Tabla 3. De este modo, la ciclopentenona suprimió un aumento de concentración del factor \alpha de necrosis tumoral en el suero por administración de LPS en función de la dosis. Además, en comparación con el grupo de referencia al que se administró agua destilada (cuatro ratones por grupo), las concentraciones de interleucina 10 en el suero aumentaron de forma significativa en el grupo administrado con ciclopentenona (30
mg/kg).

TABLA 3

8

(3) Se administró por vía intraperitoneal aceite de parafina (Cosmo Bio) (2 ml) a ratones CDF1 hembra de ocho semanas de edad para inducir M\varphi celíaco. Después de una semana de administración de aceite de parafina, se infundió por vía intraperitoneal medio RPMI 1640 (Gibco), bien masajeado y se recuperó para dar células celíacas.

Se lavaron dos veces las células celíacas con un medio RPMI-1640 y se pusieron en suspensión en un medio RPMI-1640 conteniendo 10% de suero de ternero fetal (FCS; High-Clone) para ajustar la concentración a 1 \times 10^{6}células/ml. La solución de células (1 ml) preparada como tal se colocó en placas de 24 pocillos y se incubó en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante dos horas. Se eliminaron las células no adheridas contenidas en el líquido sobrenadante después de la incubación y se utilizaron células adheridas como M M\varphi celíacas.

A cada uno de los pocillos de la placa se añadió 800 \mul de medio RPMI-1640 conteniendo 10% de FCS, a continuación se añadió a éste 100 \mul de ciclopentenona 1, 10, 100 y 1000 \muM disuelta en una solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical) y se realizó la incubación en un incubador con CO_{2} a 37ºC durante una hora.

Después de la incubación, se añadió 100 \mul de LPS de 100 ng/ml (fabricado por Sigma). Después de terminar la incubación, se recuperó el líquido sobrenadante de ésta y se determinó la cantidad de TNF-\alpha producido de ésta utilizando un kit ELISA disponible en el comercio (fabricado por Endogen).

El resultado se presenta en la Fig. 7. De este modo, la Fig. 7 presenta la relación entre la concentración de ciclopentenona y la cantidad de factor de necrosis tumoral producida, en la que la ordenada indica la cantidad (pg/ml) de factor de necrosis tumoral mientras que la abscisa indica la concentración (\muM) de ciclopentenona de cada muestra.

La ciclopentenona a una concentración no menor de 10 \muM inhibió de forma significativa la producción del factor de necrosis tumoral procedente del macrófago celíaco de ratones inducido por LPS.

Como se presenta en el Ejemplo 5-(1) a (3) anterior, la ciclopentenona tiene una acción inhibidora de la producción de factor de necrosis tumoral y una actividad creciente de la producción de interleucina 10. (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona presentaron también los mismos resultados.

Ejemplo 6

Se midió la actividad inhibidora de la ciclopentenona en la producción de NO y en la alteración de las células de la forma siguiente utilizando células RAW264.7 de la cepa de células de macrófago de ratón (ATCC TIB 71) y LPS.

Se incubó medio de Eagle modificado por Dulbecco (fabricado por Life Technologies Oriental; 11054-020) conteniendo 2 mM de L-glutamina (fabricado por Life Technologies Orietal; 25030-149) sin contener fenol rojo, conteniendo 5 ml de suero de ternero fetal al 10% (fabricado por Gibco) conteniendo 1,5 \times 10^{6} células de RAW 264.7 en una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos en presencia de gas dióxido de carbono al 5% a 37ºC durante 12 horas, se añadió 50 \mul de LPS de 50 \mug/ml (fabricado por Sigma), a continuación se añadió a cada pocillo 50 \mul de ciclopentenona 500 \muM, ciclopentenona 250 \muM, ciclopentenona 100 \muM o ciclopentenona 50 \muM, se continuó después la incubación durante otras 12 horas y, después de ésta, se midió el NO_{2}^{-} producido por oxidación de NO en el medio y la cantidad de células vivas. Con este objeto, se prepararon como referencias una sección en la que no se añadió LPS y una sección en la que no se añadió ciclopentenona.

Para la medición de NO_{2}^{-}, se separó 100 \mul del fluido sobrenadante incubado de cada pocillo, se añadió 10 \mul de solución de 50 \mug/ml de 2,3-diaminonaftaleno (fabricado por Dojindo Laboratories; 341-07021) (solución en ácido clorhídrico 0,62 N), se dejó reposar la mezcla durante 15 minutos, a continuación se añadió 5 \mul de solución acuosa 2,8 N de hidróxido de sodio y se midió la fluorescencia del naftaleno triazol resultante con un Titertec Fluoroscan II (suministrado por Dainippon Pharmaceutical), a la longitud de onda de excitación de 355 nm y midiendo la longitud de onda de 460 nm. Todos los experimentos se realizaron en dos series, se dedujo un valor de referencia de la sección a la que no se añadió LPS de su valor medio y se realizó una comparación desde el punto de vista del valor relativo de cada sección con el valor de la sección a la que se añadió LPS.

El resultado fue que la ciclopentenona inhibió la producción de NO inducida por LPS en las células RAW 264.7 y además inhibió la alteración de las células en las células RAW 264.7 producidas por LPS.

En la Fig. 8 y en la Fig. 9 se presentan los resultados. La Fig. 8 presenta la relación entre la concentración de ciclopentenona y la concentración de NO_{2}^{-} en el líquido de cultivo en el que la ordenada indica un valor relativo (%) de la concentración de NO_{2}^{-}. La Fig. 9 presenta la relación entre el tiempo de incubación y el número de células vivas en presencia de ciclopentenona en la que la ordenada es el número de células vivas (\times 10^{5}células/5 ml) contenidas en 5 ml del líquido de cultivo mientras que la abscisa indica el tiempo de incubación (horas). En la Fig. 9, el cuadro blanco (\square) indica referencia; rombo blanco (\lozenge) indica LPS; el círculo blanco (\circ) indica ciclopentenona 5 \muM; el triángulo blanco (\triangle) indica el caso de ciclopentenona 5 \muM + LPS; el cuadro negro (\blacksquare) indica ciclopentenona 2,5 \muM + LPS; rombo negro (\blacklozenge) indica ciclopentenona 1 \muM + LPS y el círculo negro (\medbullet) indica ciclopentenona 0,5 \muM + LPS.

Como tal, la ciclopentenona presentó una acción inhibidora para la producción de NO. (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona presentaron también efectos similares.

Ejemplo 7

Se sensibilizaron ratones BALB/c macho (Nippon Clare) (de cinco semanas de edad; cinco ratones por grupo) por administración intraperitoneal de 100 \mul de solución salina fisiológica al 0,01% de albúmina de clara de huevo (Sigma) y 100 \mul de alumbre (nombre comercial: Imject Alum; Pearce) y 11 días después, se extrajo sangre periférica de la vena del fondo del ojo.

Se centrifugó (2.000 rpm durante 5 minutos) la sangre extraída, se separó el plasma y se midió la cantidad de IgE total en el plasma por medio de ELISA (Kit IgE Mouse EIA Seikagaku Corporation).

En el grupo en el que se administró ciclopentenona, se administró de forma forzada 10 mg/kg al día una vez al día a partir de la fecha de sensibilización del antígeno hasta el día antes de la extracción de la sangre.

En el grupo de referencia, se administró agua destilada por vía oral de la misma manera que anteriormente y el grupo sensibilizado se denominó grupo no tratado.

En La Tabla 4 se da el resultado. Se suprimió un aumento de la cantidad total de IgE en el plasma por sensibilización con albúmina de clara de huevo por administración de ciclopentenona.

TABLA 4

9

(2) Se sensibilizaron ratas macho de la estirpe Wistar de cinco semanas de edad (un grupo constituido por cinco ratas) (Nipón SLC) mediante una inyección intraperitoneal de 100 \mul de solución de albúmina de clara de huevo al 0,01% (Sigma) en solución salina fisiológica acuosa y 100 \mul de alumbre (denominación comercial: Imject Alum; Pierce) y, después de 14 días, se extrajo sangre de la arteria abdominal.

Se centifugó (a 2.000 rpm durante cinco minutos) la sangre extraída, se separó el plasma y se midió la cantidad de IgE específica del antígeno por una reacción de anafilaxia cutánea pasiva (PCA) de la rata a las 48 horas.

De este modo, se diluyó el suero con una solución salina fisiológica de modo sucesivamente al doble variando desde 1/4 hasta 1/64 y cada 0,1 ml de ésta se inyectó por vía subcutánea en el lomo rasurado de ratas macho de la estirpe Wistar de siete semanas de edad. Después de 48 horas de la inyección subcutánea, se inyectó en la vena de la cola 1 ml de una mezcla de albúmina de clara de huevo al 0,05% y azul de Evans al 0,5% (fabricado por Nacalai Tesque). Después de 30 minutos de la inyección en la vena de la cola, se sometió a las ratas a decapitación y a muerte por desangrado, se observó la aparición de manchas azules en el lomo, las manchas de un diámetro de 5 mm o más se consideraron positivas y se adoptó la dilución mayor como título de IgE.

En los grupos administrados con ciclopentenona, se administró por vía intraperitoneal 1 mg/kg o 10 mg/kg de ciclopentenona una vez al día durante tres días a partir del día sensibilizado con antígeno, en el grupo de referencia, se administró por vía intraperitoneal agua destilada de la misma manera.

En la Tabla 5 se da el resultado.

TABLA 5

10

Se inhibió un aumento en la cantidad de IgE específica del antígeno por sensibilización con albúmina de clara de huevo por administración de ciclopentenona en función de la dosis.

La ciclopentenona inhibió la producción de IgE, como tal. Se observó una actividad de inhibición similar para la producción de IgE en la (-)-ciclopentenona y en la (+)-ciclopentenona.

Ejemplo 8

(1) Se adquirieron ratones C57BL/6 (hembras, de cinco semanas de edad) en Nippon SLC y se utilizaron para el experimento después de una cría preliminar durante una semana para nuestro finalidad. El eritrocito ovino (fabricado por Shimizu Jikken Zairyo) que es un antígeno que provoca la reacción de sensibilidad de tipo retardado se lavó tres veces con una solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical) para preparar 1 \times 10^{9}células/ml y 200 \mul de ésta se inyectó por vía intraperitoneal a ratones para someterlos a una sensibilización con antígeno.

Después de cinco días de la sensibilización, se inyectó 40 \mul de antígeno que se había preparado de la misma manera en la pata derecha para inducir un antígeno por lo que se provocó edema pedio. A partir de la fecha del antígeno sensibilizado, se administró por vía intraperitoneal ciclopentenona a ratones (consistiendo en un grupo de cinco ratones) una vez al día a una dosis de 1 mg/kg o de 10 mg/kg durante 3 días.

Después de dos días de la inducción del antígeno, se midió el volumen de la pata derecha de los ratones con un dispositivo de medición para el edema pedio (fabricado por Ugo Basile) y se utilizó como índice para la reacción de sensibilidad de tipo retardado. El valor medido se dio calculando la cantidad creciente del volumen de la pata derecha de los ratones medido antes de la inducción del antígeno.

En la Fig. 10 se presenta el resultado. De este modo, la Fig. 10 presenta una actividad inhibidora de la ciclopentenona para la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado en la que la ordenada indica la cantidad creciente (%) en tanto que la abscisa indica una dosis de ciclopentenona (mg/kg). Con este objeto, ** en el dibujo significa que es significativo para la referencia en p <0,01.

La administración de 1 mg/kg de ciclopentenona suprimió la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado y la administración de 10 mg/kg presentaba una actividad inhibidora significativa para la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado.

A este respecto, (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona también presentaban efectos similares.

(2) Se hizo una escisión en el bazo en ratones C3H/HeJ (Nippon SLC; macho; cinco semanas de edad), se disgregó finamente y se puso en suspensión en un medio RPMI-1640 (fabricado por Gibco) que contenía 10% de suero de ternero fetal (fabricado por High Clone) para dar una solución unicelular. La solución sobrenadante de las células se colocó en placas Petri de plástico, se incubó a 37ºC en un incubador con dióxido de carbono gas durante dos horas, se eliminaron las células adherentes, adhiriéndose a la placa Petri y las células no adherentes se utilizaron como linfocitos del bazo. Se ajustó la concentración de las células a 2 \times 10^{8} células/ml y se colocó en placas de microvaloración de 96 pocillos a razón de 200 \mul/pocillo, se añadió ciclopentenona de varias concentraciones a cada uno de los pocillos excepto al del grupo de referencia, a continuación 5 \mug de concanavalina A (ConA; fabricada por Nacalai Tesque) a todos los pocillos y se realizó la incubación a 37ºC en un incubador con gas dióxido de carbono durante un día. Después de la incubación se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a todas las células y se realizó la incubación durante un día más y se midió su cantidad incorporada en las células con un contador de centelleo líquido.

En la Fig. 11 se presenta el resultado. De este modo, la Fig. 11 presenta una actividad de inhibición de la ciclopentenona en la proliferación de linfocitos en la que la ordenada presenta la cantidad de ^{3}H-timidina (CPM) incorporada mientras que la abscisa presenta la adición de ConA, la referencia sin adición y la concentración (\mug/ml) de ciclopentenona. Es evidente en el dibujo que la ciclopentenona presenta una actividad inhibidora dependiente de la dosis para la proliferación de linfocitos de ratones estimulados por mitógeno y la proliferación de linfocitos se suprime casi completamente por 10 \mug/ml por lo que se observó una actividad inhibidora para la activación de los linfocitos.

A este respecto, (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona presentaron también efectos similares.

(3) Se excitó el bazo de ratones BALB/c (Nippon SLC; macho; cinco semanas de edad) un ratón C57Bl/6 (Nippon SLC; macho; de cinco semanas de edad) y se prepararon linfocitos del bazo por el método mencionado anteriormente. Se ajustó a 2 \times 10^{6} células/ml la concentración de cada una de las soluciones con sobrenadante de células y cada 100 \mul se mezcló y se colocó en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se añadió ciclopentenona de varias concentraciones a cada uno de los pocillos excepto para el grupo de referencia y se incubó a 37ºC en un incubador con dióxido de carbono gas durante cuatro días. Después de la incubación, se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a cada uno de los pocillos y se incubó durante un día más y se midió la cantidad incorporada en las células con un contador de centelleo líquido.

En la Fig. 12 se presenta el resultado. De este modo, la Fig. 12 presenta la actividad inhibidora de la ciclopentenona en una reacción de linfocitos mixtos en la que la ordenada presenta la cantidad de ^{3}H-timidina (CPM) incorporada mientras que la abscisa presenta el control de linfocitos del bazo de BALB/c (presentado como BALB/c en el dibujo), la referencia de linfocitos del bazo de C57BL/6 (mostrado como C57BL/6 en el dibujo), la referencia mezclada de linfocitos del bazo de BALB/c y de linfocitos del bazo C57BL/6 y las concentraciones (\mug/ml) de ciclopentenona. Es evidente en el dibujo que la ciclopentenona presenta una actividad de inhibición dependiente de la dosis para los linfocitos activados por estimulación del antígeno alogeneico y se observa la supresión casi completa por 10 \mug/ml por lo que se observó una actividad inhibidora para la activación de linfocitos por una reacción de linfocitos mezclados.

A este respecto, (-)-ciclopentenona y (+)-ciclopentenona presentaron la actividad de inhibición similar a la reacción de linfocitos mezclados.

Ejemplo 9

(1) Se añadió 1 \mul de ADN de pBR322 de 0,25 \mug/ml (fabricado por Takara Shuzo) a una mezcla de 2 \mul de topoisomerasa II (fabricada por TopoGEN, 2 unidades/\mul), 2 \mul de un tampón con una concentración diluida diez veces [Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), KCl 1,2M, MgCl_{2} 0,1M, trifosfato de adenosina 5 mM y ditiotreitol 5 mM, 2 \mul de albúmina de suero bovino al 0,1% (fabricada por Takara Shuzo), 11 \mul de agua destilada y 2 \mul de agua destilada (referencia) o una muestra (50, 100, 200, 500, 1000 o 2500 \muM de ciclopentenona) y se hizo reaccionar a 37ºC. Después de la reacción durante 30 minutos, se interrumpió la reacción añadiendo 2 \mul de solución acuosa de dodecil sulfato sódico al 1%, glicerol al 50% y azul de bromofenol al 0,02%.

La solución (20 \mul) de la reacción anterior se aplicó a gel de agarosa al 1% preparado a partir de agarosa L03 (fabricada por Takara Shuzo) y tampón TAE [Tris 40 mM, acetato de sodio 5 mM y etilendiaminotetraacetato disódico (EDTA) 1 mM; se ajustó a pH 7,8 con ácido acético] y se realizó la electroforesis en el tampón TAE. Después de la electroforesis, se añadió gota a gota el gel en una solución acuosa de bromuro de etidio de 1 \mug/ml y se irradió con rayos ultravioletas para observar la configuración electroforética del ADN. En una referencia que era una solución acuosa, el ADN cambió completamente de un tipo superenrollado a un tipo de relajación pero, cuando se inhibió la actividad de la topoisomerasa II, el cambio desde el tipo superenrollado al tipo de relajación se inhibió parcial o completamente.

El resultado se presenta en la Tabla 6.

TABLA 6

11

En la referencia en la que se añadió agua, el ADN cambió completamente desde un tipo superenrollado a un tipo de relajación pero, cuando la concentración de ciclopentenona era de 200 \muM o mayor, el cambio de ADN desde un tipo superenrollado a un tipo de relajación se inhibió parcial o completamente por lo que se determinó la actividad de ciclopentenona para inhibir la topoisomerasa II. En la Tabla 6, - significa un cambio completo desde un tipo superenrollado a un tipo con relajación; + significa un cambio en un grado medio; ++ significa que permaneció la mayor parte del tipo superenrollado y +++ significa que no había disminución del tipo superenrollado en absoluto.

(2) Se midió la actividad de ciclopentenona para inhibir la topoisomerasa I por el mismo método que en el Ejemplo 9-(1) excepto que se utilizó topoisomerasa I [fabricada por TopoGEN, 0,01 unidades/\mul] en lugar de topoisomerasa II; y se utilizaron Tris-HCl 100 mM (pH 7,9), EDTA 10 mM, espermidina 1 mM y glicerol al 50% como tampón con una concentración diluida diez veces. A este respecto, como muestra, se añadió ciclopentenona para preparar la concentración 1 mM final.

El resultado fue que la ciclopentenona 1 mM inhibió la topoisomerasa I.

Como tal, la ciclopentenona presentó una actividad inhibidora para la topoisomerasa II que se expresó únicamente de forma transitoria durante una fase mitótica en las células normales pero llegó a expresarse mucho en todo el ciclo celular por canceración y también en la topoisomerasa I que aumenta en su cantidad de expresión y en la actividad por canceración. (-)-Ciclopentenona y (+)-ciclopentenona dieron también resultados similares.

Ejemplo 10 Preparaciones inyectables

(1) Se añadió ciclopentenona a una solución salina fisiológica (como la relacionada en la Farmacopea Japonesa) a una concentración de 1% para preparar una preparación inyectable.

(2) Se añadieron (-)-ciclopentenona y ácido glicirrícico a una solución salina fisiológica (la misma que anteriormente) en concentraciones de 0,5% y 0,1%, respectivamente, para preparar una preparación inyectable.

Ejemplo 11 Comprimidos

(1) Se preparó un comprimido conteniendo 100 mg de ciclopentenona y una cantidad apropiada de celulosa microcristalina y se recubrió con azúcar para fabricar una preparación en comprimidos.

(2) Se preparó un comprimido conteniendo 0,1 mg de (+)-ciclopentenona, 10 mg de glicirrizinato dipotásico y una cantidad apropiada de celulosa microcristalina y se recubrió con azúcar para fabricar una preparación en comprimidos.

Ejemplo 12

(1) Se añadió pectina (Pomosin Pectin LM-13CG; fabricada por Hercules) (5 kg) a 100 litros de agua del grifo y se calentó la mezcla desde la temperatura del líquido de 28ºC hasta 120ºC mediante vapor insuflado en su interior durante 35 minutos, se mantuvo a 120ºC durante cinco horas en agitación y se enfrió para preparar 135 litros de mezcla enfriada. A ésta se añadió 1,35 kg de Celite nº 545 (fabricado por Celite) y 1,35 kg de Sílice nº 600-S (fabricado por Chuo Silica) como adyuvantes del filtro y se realizó la filtración utilizando un filtro compacto (papel de filtro de 6 pulgadas en 16 etapas; ADVANTEC nº 327) prerrecubierto con 0,1 kg de Celite nº 545 y 0,1 kg de Sílice nº 600-S. El filtrado resultante se sometió a un tratamiento de calentamiento instantáneo continuo (a 98ºC durante 60 segundos) utilizando una placa calefactora (fabricada por Nichihan Seisakusho) seguido de enfriamiento para preparar 150 litros de solución de pectina tratada térmicamente contenendo ciclopentenona.

Dicha solución de pectina tratada térmicamente conteniendo ciclopentenona tenía un pH de aproximadamente 3,5, una acidez de 6,2 ml y un grupo de azúcar de 5,8 Brix %. A este respecto, se midió el pH con un pH-metro, que expresó la acidez en función de la cantidad (ml) de NaOH 0,1 N utilizado para neutralizar a pH 7,0 y se midió el grado de azúcar con un sacarómetro Brix.

(2) Se preparó la bebida según la siguiente formulación.

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Se utilizó la solución de pectina tratada térmicamente que contenía la ciclopentenona mencionada en el Ejemplo 12-(1) como material conteniendo ciclopentenona y se añadió su cantidad calculada en base sólida. Esta bebida (100 ml) contiene 4 mg de ciclopentenona.

Cualidades de la invención

Según la presente invención, se facilita la utilización de un producto farmacéutico que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona o de sus sustancias ópticamente activas o de sus sales como compuesto eficaz. Dicho producto farmacéutico es completamente útil como agente antirreumático o agente preventivo para el reumatismo y como agente terapéutico o agente preventivo para enfermedades acompañadas de inflamación como agente anti-inflamatorio o agente preventivo para la inflamación mediante control de la citocina inflamatoria. Además, actualmente es posible según la presente invención que una cantidad apropiada de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales con actividad fisiológica esté contenida en un alimento o en una bebida. Debido a la función fisiológica de estos compuestos, el alimento o la bebida funcional de la presente invención tiene una acción mejoradora y/o una acción preventiva para los síntomas del reumatismo, particularmente del reumatismo articular crónico, por lo que es completamente útil para la terapia, prevención o complicaciones por reumatismo y de la dificultad para andar. Además, debido a la actividad inhibidora en la citocina inflamatoria, el alimento o bebida de la presente invención sirve para la mejoría o prevención de los síntomas de las enfermedades acompañadas de inflamación.

Además, el producto farmacéutico de la presente invención suprime la producción del factor de necrosis tumoral y el producto farmacéutico de la presente invención es útil en la terapia o prevención de enfermedades tales como las enfermedades mediadas por la producción del factor de necrosis tumoral, las enfermedades que empeoran por la producción de dicho factor, la septicemia, el SIDA, el reumatismo articular crónico, etc. Además, el alimento o bebida de la presente invención es completamente útil para mejorar los síntomas de enfermedades tales como las enfermedades mediadas por la producción del factor de necrosis tumoral, las enfermedades que empeoran por la producción de dicho factor, la septicemia, el SIDA, el reumatismo articular crónico, etc. y también para prevenir dichas enfermedades. Por lo tanto, la utilización de al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de sus sustancias ópticamente activas y de sus sales como compuesto eficaz es completamente útil para controlar la cantidad productora del factor de necrosis tumoral.

Además, la presente invención facilita la utilización de un producto farmacéutico que contiene la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales con una actividad inhibidora para la producción de NO, para la terapia o prevención de las enfermedades que requieren la supresión de la producción de NO, tal como la reducción de la presión sanguínea general, la reducción de la respuesta de la presión sanguínea, las enfermedades autoinmunitarias, la inflamación, la artritis, la artritis reumática, las enfermedades inflamatorias intestinales, la insuficiencia de la función de los vasos sanguíneos, la dilatación etiológica de los vasos sanguíneos, la lesión de los tejidos, la isquemia cardiovascular, la hipersensibilidad al dolor, la isquemia cerebral, las enfermedades acompañadas de neovascularización y el cáncer y también para mantener la homeostasis de los organismos vivos.

Además, se facilitan también un inhibidor para la producción de NO, un inhibidor para la neovascularización, un agente anti-inflamatorio y un agente mejorador para la lesión cerebral isquémica conteniendo al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa y de una de sus sales. Dicho inhibidor para la producción de NO es también útil en la investigación bioquímica y en la identificación de los fármacos.

Según la presente invención, actualmente es posible que una cantidad apropiada de la ciclopentenona, de una de sus sales ópticamente activa o de una de sus sales con actividad fisiológica esté contenida en un alimento o en una bebida. Debido a la actividad inhibidora de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales para la producción de NO, el alimento o bebida de la presente invención es un alimento o bebida saludable que tiene la función de mantener la homeostasis del cuerpo vivo mediada por la actividad inhibidora de la producción de NO, tal como la acción anti-inflamatoria, la acción mejoradora para la lesión cerebral isquémica y la potenciación de la acción de la biofilaxia.

La presente invención facilita un agente inductor para la producción de antígeno Fas que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales como compuesto eficaz; un método para inducir la producción del antígeno Fas útil en el estudio de la función fisiológica del antígeno Fas o en la investigación de antagonistas que utilizan estos compuestos como componentes eficaces; y un agente preventivo o terapéutico para las enfermedades acompañadas de producción de antígeno Fas, tal como las enfermedades autoinmunitarias y el reumatismo articular.

Además, el alimento o bebida que contiene una cantidad eficaz de al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales es un alimento o bebida funcional de la presente invención ebido a la acción de estos compuestos para inducir la producción de antígeno Fas y es completamente útil para mejorar los síntomas y para prevenir el comienzo de las enfermedades mencionadas anteriormente. Además, la ciclopentenona, su sustancia ópticamente activa o una de sus sales tiene una actividad inductora de la apoptosis en las células sinoviales y el producto farmacéutico, el alimento o la bebida de la presente invención es particularmente útil como producto antirreumático, alimento o bebida farmacéuticos.

La presente invención facilita un agente inmunomodulador que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa y de una de sus sales con una actividad de inhibición para la producción de IgE, una actividad inhibidora para la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado, una actividad inhibidora para la proliferación de linfocitos y una actividad inhibidora para una reacción de linfocitos mixtos.

Debido a la acción inmunomoduladora de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa o de una de sus sales, el alimento o la bebida que contiene un compuesto seleccionado de esos compuestos es útil para la mejoría de los síntomas de las enfermedades que requieren modulación de la función inmunitaria, tal como la enfermedad inmunitaria o para la prevención de la anomalía inmunitaria como alimento inmunomodulador o bebida inmunomoduladora.

Además, el método de la presente invención es útil para la modulación de la cantidad productiva de IgE y también para la inmunomodulación.

La presente invención facilita además un inhibidor para la topoisomerasa que contiene al menos un compuesto seleccionado de la ciclopentenona, de su sustancia ópticamente activa y de una de sus sales, como componente eficaz y también un método para inhibir la topoisomerasa que contiene al menos un compuesto seleccionado de esos compuestos como componente eficaz. Dicho método de inhibición de topoisomerasa es útil en el estudio bioquímico y en la identificación de los fármacos anticancerosos.

Claims (2)

1. Utilización de al menos un compuesto seleccionado de los isómeros cis-, trans- o de una mezcla de isómeros de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representados por la fórmula [1] siguiente y de sus correspondientes formas ópticamente activas o de una de sus sales

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para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del reumatismo, la inflamación o la enfermedad autoinmunitaria.

2. Utilización de al menos un compuesto seleccionado de los isómeros cis-, trans-o de una mezcla de isómeros de 4,5-dihidroxi-2-ciclopenten-1-ona representados por la fórmula [1] siguiente y de sus correspondientes formas ópticamente activas o de una de sus sales

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para la preparación de un alimento o bebida para el tratamiento o la prevención del reumatismo, la inflamación o la enfermedad autoinmunitaria.