KR101677083B1 - 항염증 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

항염증 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종래 화학적 항염증제와 같은 부작용이 없는 비스테로이드 성분이며, 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖고, 천연물 유래 물질로서 세포독성이 없는 항염 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공에 관한 것이다.

Description

항염증 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Anti-inflammatory active composition and pharmaceutical composition comprising the same}
본 발명은 항염증 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖는 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증반응은, 조직(세포)이 손상되거나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역세포가 관련되어 나타나는 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게 되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생하는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다.
정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알레르기성 염증질환 등이 나타나게 되며 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다. 이러한 인자 중에서, 나이트릭 옥사이드(NO; nitric oxide)는 염증과정의 매개체로서 병원성 DNA를 손상시키는 방어작용을 함으로써 항상성을 유지하는 역할을 한다(Kou and Schroder, Annuals of Surgery 221, 220-235, 1995).
NO는 세 가지 주요한 나이트릭 옥사이드 합성효소(NOS) 이성질체인 nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS), iNOS(inducible NOS)에 의해 L-아르기닌 (L-arginine)으로부터 생성된다. nNOS와 eNOS는 Ca2 +/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에 관여하며, 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고, 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NF-κB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Lawrence et al., Nat Med., 7:1291-1297, 2001).
현재 염증 치료제로는 부신피질 호르몬 성분을 이용한 덱사메타손, 코티손 등이 있다. 그러나 이들은 염증 치료제로서 작용을 하기는 하나, 독성이 강하며, 부작용으로서 부종 같은 증상을 일으키기도 한다. 또한, 염증 원인에 대하여 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다[Check W.A. and Kaliner M.A., Am. Rev. Respir. Dis., 141, p44∼51. 1990].
따라서, 부신피질 호르몬 성분에 대한 염증 치료제 대안 중 공개특허 10-2013-0094145(공개일자: 2013.08.23)에는 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 기재하고 있으나, 20% 미만의 낮은 추출 수율을 보이는 문제점이 있었다.
또한, 현존하는 항염증제인 부신피질 호르몬 성분을 이용한 스테로이드 약제로 부종과 같은 심한 부작용을 나타내므로 부작용이 없는 비스테로이드 성분의 약제의 개발이 시급한 실정이다.
상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명은 종래 화학적 항염증제와 같은 부작용이 없는 비스테로이드 성분이며, 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖고, 천연물 유래 물질로서 세포독성이 없는 항염 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항염증 활성 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016037638761-pat00061
(상기 화학식 1에 있어서, 상기 R1은 -H 또는 C1 ~ C3의 알콕시기(alkoxyl group)이고, 상기 R2는 -H 또는 C1 ~ C3의 알콕시기(alkoxyl group)이며, R3는 -H, C3 ~ C6의 헤테로사이클기(heterocyclic group) 또는
Figure 112014108021191-pat00002
이고, R4는 -H 또는 C3 ~ C6의 헤테로사이클기(heterocyclic group)이며, R5는
Figure 112014108021191-pat00003
,
Figure 112014108021191-pat00004
,
Figure 112014108021191-pat00005
,
Figure 112014108021191-pat00006
,
Figure 112014108021191-pat00007
또는
Figure 112014108021191-pat00008
이다.)
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1은 -H이고, R2는 -H이며, R3과 R4는 각각
Figure 112014108021191-pat00009
일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1과 R2는 메틸알콕시기(methyloxyl group; -OCH3)이고, R3와 R4는 -H일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1과 R2는 메틸알콕시기(methyloxyl group; -OCH3)이고, R3은
Figure 112014108021191-pat00010
이며, R4는 -H일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항염증 활성 조성물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112014108021191-pat00011

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 화학식 1 내지 2로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염은 감귤(citrus) 유래일 수 있다.
나아가, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물를 제공한다:
[화학식 3]
Figure 112014108021191-pat00012
(상기 화학식 3에 있어서, 상기 R1은 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기(alkyl group)이고, 상기 R2는 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기이며, 상기 R3은 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기이고, 상기 R4는 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기이며, 상기 R5는 페닐기(phenyl group) 또는 페놀기(phenol gorup)이다.)
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 화학식 3의 R1과 R2는 아이소펜탄기(isopentanyl group; -CH2CH2CH(CH3)2)이고, R3는 에틸기(ethyl group, -CH2CH3)이며, R4는 -H이고, R5는 페놀기(phenol group)일 수 있다.
게다가, 본 발명은 상술한 화학식 3의 화합물을 포함하고, 세포 내 산화질소(NO) 발현양을 감소시키는 항염증 활성 조성물을 제공한다.
더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공을 제공한다.
또한, 상기 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
본 발명의 "염증"이란, 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다.
또한, 본 발명의 "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료" 또는 "개선"이란, 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
더불어, 본 발명의 "항염증 활성"은 염증을 억제하는 것을 말하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출, 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 말한다. 보다 구체적으로 염증은 선천성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기로 인식하고 병원체를 공격한다. 만일 병원균이 신체의 물리적 장벽을 깨고 들어온다면 염증반응이 일어난다. 염증반응은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서, 상처가 나거나 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 초기단계 면역반응을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포 내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다.
본 발명은 종래 화학적 항염증제와 같은 부작용이 없는 비스테로이드 성분이며, 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖고, 천연물 유래 물질로서 세포독성이 없는 항염 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.
도 1 내지 3은 화합물 1에 대한 분광학적 분석결과이다.
도 4 내지 6은 화합물 2에 대한 분광학적 분석결과이다.
도 7 내지 9는 화합물 3에 대한 분광학적 분석결과이다.
도 10 내지 12는 화합물 4에 대한 분광학적 분석결과이다.
도 13 내지 15는 화합물 5에 대한 분광학적 분석결과이다.
도 16은 실험예 1에서 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 5를 처리한 세포의 세포 독성 측정 결과이다.
도 17은 실험예 2에서 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 5를 처리한 세포의 산화질소 발현량 측정 결과이다.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명을 한다.
상술한 바와 같이, 현존하는 항염증제인 부신피질 호르몬 성분을 이용한 스테로이드 약제의 부종과 같은 심한 부작용이 없고, 세포독성도 없으며 항염 활성이 높아 염증 질환의 예방 또는 치료용으로 사용하게 적합한 천연 유래 물질의 개발이 시급한 문제가 있었다.
이에 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항염증 활성 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 종래 화학적 항염증제와 같은 부작용이 없는 비스테로이드 성분이며, 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖고, 천연물 유래 물질로서 세포독성이 없는 항염 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 효과가 있다.
[화학식 1]
Figure 112014108021191-pat00013

상기 화학식 1의 R1은 -H 또는 C1 ~ C3의 알콕시기(alkoxyl group)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 -H 또는 메틸알콕시기(methyloxyl group; -OCH3)일 수 있다.
상기 화학식 1의 R2는 -H 또는 C1 ~ C3의 알콕시기(alkoxyl group)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 -H 또는 메틸알콕시기(methyloxyl group; -OCH3)일 수 있다.
상기 화학식 1의 R3는 -H, C3 ~ C6의 헤테로사이클기(heterocyclic group) 또는
Figure 112014108021191-pat00014
일 수 있고, 더욱 바람직하게는 -H,
Figure 112014108021191-pat00015
또는
Figure 112014108021191-pat00016
일 수 있다.
상기 화학식 1의 R4는 -H 또는 C3 ~ C6의 헤테로사이클기(heterocyclic group)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 -H 또는
Figure 112014108021191-pat00017
일 수 있다.
상기 화학식 1의 R5는
Figure 112014108021191-pat00018
,
Figure 112014108021191-pat00019
,
Figure 112014108021191-pat00020
,
Figure 112014108021191-pat00021
,
Figure 112014108021191-pat00022
또는
Figure 112014108021191-pat00023
일 수 있으며, 더욱 바람직하게는
Figure 112014108021191-pat00024
일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 그의 염으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항염증 활성 조성물을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112014108021191-pat00025

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 화학식 1 내지 2로 표시되는 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 그의 염은 천연물로부터 분리되거나, 또는 판매되는 것을 구입할 수 있으며, 바람직하게는 천연물 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 감귤(Citrus) 유래일 수 있다.
더불어, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 3]
Figure 112014108021191-pat00026
상기 화학식 3의 R1은 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기(alkyl group)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아이소펜탄기(isopentanyl group; -CH2CH2CH(CH3)2)일 수 있다.
상기 화학식 3의 R2는 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아이소펜탄기(isopentanyl group; -CH2CH2CH(CH3)2)일 수 있다.
상기 화학식 3의 R3은 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 에틸기(ethyl group, -CH2CH3)일 수 있다.
상기 화학식 3의 R4는 -H 또는 C1 ~ C4의 알킬기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 -H일 수 있다.
상기 화학식 3의 R5는 페닐기(phenyl group) 또는 페놀기(phenol group)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 페놀기(phenol group)일 수 있다.
더불어, 본 발명은 상술한 바와 같은 화학식 3으로 표시되는 화합물을 포함하고, 세포 내 산화질소(NO) 발현양을 감소시키는 항염증 활성 조성물을 제공한다.
나아가, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 각각의 염은 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔 설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 화학식 2로 표시되는 화합물, 화학식 3으로 표시되는 화합물 또는 이들 각각의 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 동일한 효능을 나타내는 용매화물, 수화물 및 입체 이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함한다.
게다가, 상술한 바와 같은 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001 ~ 500 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 혈관질환 예방 또는 치료하는 데 충분한 양 및/또는 혈관노화 억제에 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 예방제 또는 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 상술한 바와 같은 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능성 식품의 종류에는 통상적으로 제조 및/또는 판매되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 상기 항염증 활성 조성물을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
통상적으로, 건강기능성 식품 조성물에 포함되는 상기 항염증 활성 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 ~ 50 중량%을, 바람직하게는 1 ~ 40 중량%을 포함할 수 있다. 또한, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수도 있다.
이하 첨부된 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 감귤 유래 단일 화합물의 분리
국립원예특작과학원 감귤시험장에 재배되는 감귤을 3kg 수확하여 적당한 크기로 분쇄한 후, 50 중량% 에탄올을 20ℓ를 가하고, 상온(17℃)에서 24시간씩 2회 반복 추출하였고, 여과지로 여과하였으며, 이를 감압농축하여 300g의 감귤 추출물을 수득하였다.
수득한 감귤 추출물 300g을 증류수 2ℓ에 현탁하고, 헥산 2ℓ에 추가 현탁한 후 헥산, 메틸렌크로라이드, 에틸아세테이트, 부탄올로 차례로 분핵하였고, 각각 분핵된 헥산, 메틸렌크롤라이드, 에틸아세테이트, 부탄올을 증발 및 농축시켜 헥산, 메틸렌클로아이드, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물을 제조하였다.
다음으로, 상기 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물을 실리카겔 컬럼과 HP-20 컬럼을 사용한 크로마토그래피를 이용하여 또 다른 분획물을 얻었다. 즉, 메틸렌클로라이드-메탄올 혼합용액(v/v = 98% : 2%, 50% : 50%) 구성되는 단계별 농도 구배 용매시스템을 적용하여 각각 에틸아세테이트 분획물 6개(COE1 ~ COE6)의 분획물을 얻었다. 또한 클로르포름-메탄올 혼합용액(v/v = 70% : 30%) 구성되는 단계별 농도 구배 용매시스템을 적용하여 각각 부탄올 분획물 6개(COB1 ~ COB6)의 분획물을 얻었다.
감귤 추출물의 부탄올 분획물인 COB3을 고속액체 클로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 통해 화합물 1을 분리·정제하였으며,
감귤 추출물의 부탄올 분획물인 COB1을 고속액체 클로마토그래피를 통해 화합물 2을 분리·정제하였다.
또한, 감귤 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 COE2을 고속액체 클로마토그래피를 통해 화합물 3과 화합물 5를 분리·정제하였으며,
감귤 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 COE1을 고속액체 클로마토그래피를 통해 화합물 4를 분리·정제하였다.
실험예 1. 화합물 1 내지 5의 구조분석
상기 실시예 1에서 분리한 화합물 1 내지 5의 분자량 및 분자식을 LC/MS 분광기(제조사: AB 3200 Q-trap)를 사용하여 결정하고, 핵자기공명(NMR) 분석기(Bruker 700 MHz)를 통하여 1H NMR, 13C NMR 스펙트럼을 얻어, 분자구조를 결정하였다.
1H NMR 결과는 도 1, 도 4, 도 7, 도 10 및 도 13에 나타내었고,
13C NMR 결과는 도 2, 도 5, 도 8, 도 11 및 도 14에 나타내었으며,
ESI-MS 스펙트럼 분석 결과는 도 3, 도 6, 도 9, 도 12 및 도 15에 나타냈다.
도 1 내지 3는 화합물 1의 분석결과이고, 도 4 내지 6은 화합물 2의 분석결과이며, 도 7 내지 도 9는 화합물 3의 분석결과이고, 도 10 내지 도 12는 화합물 4의 분석결과이며, 도 13 내지 도 15은 화합물 5의 분석결과이다.
그 결과 화합물 1 내지 5의 화학구조를 하기와 같이 결정하였다.
화합물 1:
Figure 112014108021191-pat00027
1) 물성 : 백색분말 (white powder)
2) 분자량 : 740 g/mol
3) 분자식 : C33H40019
4) 1H NMR (700 ㎒, CD3OD): δ 8.04 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-2'), 8.04 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-6'), 6.92 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-3'), 6.92 (1H, d, J = 8.9 Hz, H-5'), 6.39 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 5.63 (1H, d, J = 7.6 Hz, 3-Glucosyl H-1), 5.25 (1H, d, J = 1.5 Hz, 2''-Rhamnosyl H-1), 4.52 (1H, d, J = 1.5 Hz, 6''- Rhamnosyl H-1), 1.11 (3H, d, J = 6.2 Hz, 6''- Rhamnosyl H-6), 1.01 (3H, d, J = 6.1 Hz, 2''- Rhamnosyl H-6)
5) 13C NMR (175 ㎒, CD3OD): δ 179.4 (C-4), 166.2 (C-7), 163.2 (C-5), 161.4 (C-2), 159.1 (C-4'), 158.6 (C-9), 134.4 (C-3), 132.2 (C-2'), 132.2 (C-6'), 123.3 (C-1'), 116.2 (C-3'), 116.2 (C-5'), 105.9 (C-10), 102.9 (2''- Rhamnosyl C-1), 102.4 (6''- Rhamnosyl C-1), 100.6 (3-Glucosyl C-1), 100.0 (C-6), 95.0 (C-8), 80.0 (3-Glucosyl C-2), 79.0 (3-Glucosyl C-3), 77.2 (3-Glucosyl C-5), 74.1 (2''- Rhamnosyl C-4), 73.9 (6''- Rhamnosyl C-4), 72.5 (2''- Rhamnosyl C-2), 72.4 (2''- Rhamnosyl C-3), 72.2 (6''- Rhamnosyl C-3), 72.1 (6''- Rhamnosyl C-2), 72.0 (3-Glucosyl C-3), 70.0 (2''- Rhamnosyl C-5), 69.8 (6''- Rhamnosyl C-5), 68.4 (3-Glucosyl C-6), 17.9 (6''- Rhamnosyl C-6), 17.6 (2''- Rhamnosyl C-6).
6) ESI-MS data at [M-H]- 739 (calcd. for C33H39O19 : 739)
7) 1H NMR spectrum 을 통하여 2개의 메틸기(methyl group)(δH = 1.11 and 1.01), 6개의 아로마틱 양성자 신호(aromatic proton signals) (δH = 8.04, 8.04, 6.92, 6.92, 6.39 and 6.20)을 확인하였다.
8) 13C NMR spectrum을 통하여 33개의 탄소 신호를 발견했으며, 15개의 아글리콘 탄소(aglycone carbon) (δC = 179.4, 166.2, 163.2, 161.4, 159.1, 158.6, 134.4, 132.2, 132.2, 123.3, 116.2, 116.2, 105.9, 100.0 및 95.0), 6개의 3-Glucosyl 탄소 (δ C = 100.6, 80.0, 79.0, 77.2, 72.0 및 68.4), 6개의 2''- Rhamnosyl 탄소 (δ C = 102.9, 74.1, 72.5, 72.4, 70.0 및 17.6), 6개의 6''- Rhamnosyl 탄소 (δ C = 102.4, 73.9, 72.2, 72.1, 69.8 및 17.9)을 확인하였다.
화합물 2:
Figure 112014108021191-pat00028
1) 물성 : 백색분말 (white powder)
2) 분자량 : 652 g/mol
3) 분자식 : C29H32017
4) 1H NMR (700 ㎒, CD3OD): δ7.97 (1H, br s, H-2'), 7.73 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6'), 6.94 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5'), 6.29 (1H, br s, H-6), 5.36 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1''), 4.25 (1H, dd, J = 11.0, 1.0 Hz, H-6''a), 4.14 (1H, dd, J = 11.0, 3.0 Hz, H-6''b), 3.98 (3H, s, 3'-OCH3), 3.94 (3H, s, 8-OCH3), 3.53 (1H, m, H-2''), 3.50 (1H, m, H-5''), 3.39 (1H, m, H-3''), 3.33 (1H, m, H-4''), 2.52 (4H, m, H-2''', H-4'''), 1.23 (3H, s, H-6''')
5) 13C NMR (175 ㎒, CD3OD): δ 178.5 (C-4), 171.5 (C-5'''), 171.3 (C-1'''), 157.9 (C-7), 157.6 (C-2), 157.1 (C-5), 150.1 (C-4'), 149.4 (C-9), 147.5 (C-3'), 134.4 (C-3), 128.2 (C-8), 123.1 (C-6'), 122.1 (C-1'), 115.2 (C-5'), 113.3 (C-2'), 104.7 (C-10), 103.0 (C-1''), 99.3 (C-6), 77.0 (C-3''), 75.0 (C-5''), 74.9 (C-2''), 70.8 (C-4''), 69.7 (C-3'''), 63.6 (C-6''), 61.2 (8-OCH3), 55.8 (3'-OCH3), 45.2 (C-2'''), 45.1 (C-4'''), 26.9 (C-6''').
6) ESI-MS data at m/z [M-H]- 651 (calcd. for C29H31O17 : 651)
7) 1H NMR spectrum 을 통하여 1개의 메틸기(methyl group)(δ H = 1.23), 2개의 메틸렌기(methylene group) (δ H = 2.52, 2.52), 4개의 아로마틱 양성자 신호 (aromatic proton signals) (δ H = 7.97, 7.73, 6.94 및 6.29), 2개의 메톡시 양성자 신호 (methoxy proton signals) (δ H = 3.98, 3.94)을 확인하였다.
8) 13C NMR spectrum을 통하여 29개의 탄소 신호를 발견했으며, 15개의 아로마틱 탄소 (aromatic carbon) (δ C=178.5, 157.9, 157.6, 157.1, 150.1, 149.4, 147.5, 134.4, 128.2, 123.1, 122.1, 115.2, 113.3, 104.7, 99.3), 2개의 메톡시 탄소 (methoxy carbon) (δ C = 61.2 및 55.8), 3개의 메틸렌 탄소 (methylene carbon) (δ C=74.9, 70.8 및 63.6)을 확인하였다.
화합물 3:
Figure 112014108021191-pat00029
1) 물성 : 백색분말 (white powder)
2) 분자량 : 508 g/mol
3) 분자식 : C23H24013
4) 1H NMR (700 ㎒, CD3OD): δ 7.90 (1H, br s, H-2'), 7.62 (1H, dd, J = 8.8 Hz, 2.0 Hz, H-6'), 6.84 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5'), 6.18 (1H, s, H-6), 5.36 (1H, d, J =7.2 Hz, H-1''), 3.86 (3H, s, 3'-OCH3), 3.81 (3H, s, 8-OCH3)
5) 13C NMR (175 ㎒, CD3OD): δ 179.7 (C-4), 158.6 (C-7), 158.4 (C-5), 158.2 (C-2), 151.1 (C-9), 150.5 (C-4'), 148.6 (C-3'), 135.5 (C-3), 129.1 (C-8), 124.4 (C-6'), 123.3 (C-1'), 116.2 (C-5'), 114.3 (C-2'), 105.8 (C-10), 103.7 (C-1''), 100.2 (C-6), 78.6 (C-5''), 78.0 (C-3''), 75.7 (C-2''), 71.6 (C-4''), 62.3 (8-OCH3), 62.0 (C-6''), 57.5 (3'-OCH3).
6) ESI-MS data at m/z [M-H]- 507 (calcd. for C23H23O13 : 507)
7) 1H NMR spectrum 을 통하여 4개의 아로마틱 양성자 신호(aromatic proton signals) (δH = 7.90, 7.62, 6.84 및 6.18), 2개의 메톡시 양성자 신호 (methoxy proton signals) (δH = 3.86, 3.81)을 확인하였다.
8) 13C NMR spectrum을 통하여 23개의 탄소 신호를 발견했으며, 15개의 아로마틱 탄소 (aromatic carbon) (δC=179.7, 158.6, 158.4, 158.2, 151.1, 150.5, 148.6, 135.5, 129.1, 124.4, 123.3, 116.2, 114.3, 105.8, 100.2), 2개의 메톡시 탄소 (methoxy carbon) (δC = 62.3 및 57.5)를 확인하였다.
화합물 4:
Figure 112014108021191-pat00030
1) 물성 : Gum
2) 분자량 : 546 g/mol
3) 분자식 : C29H38010
4) 1H NMR (700 ㎒, CD3OD): δ 7.56 (1H, d, H-21), 7.53 (1H, d, H-23), 6.48 (1H, br s, H-22), 5.53 (1H, s, H-17), 3.70 (1H, s, H-15), 3.63 (3H, s, 2-OCH3), 1.27 (3H, s, H-19), 1.22 (3H, s, H-24), 1.21 (3H, s, H-25b), 1.17 (3H, s, H-25a), 1.12 (3H, s, H-18)
5) 13C NMR (175 ㎒, CD3OD): δ 211.9 (C-7), 173.6 (C-3), 172.4 (Acetate carbonyl), 169.7 (C-16), 144.6 (C-21), 142.9 (C-23), 122.1 (C-20), 111.6 (C-22), 80.0 (C-17), 77.9 (C-1), 74.9 (C-4), 66.7 (C-14), 54.1 (C-15), 52.5 (C-8), 47.5 (C-10), 40.4 (C-2), 38.5 (C-13), 36.2 (C-6), 33.2 (Me 25a), 21.4 (Me-24), 21.1 (Me-25b), 16.8 (Me-18), 16.0 (Me-19).
6) ESI-MS data at m/z [M+H]+ 547 (calcd. for C29H39O10 : 547)
7) 1H NMR spectrum 을 통하여 5개의 메틸기 (methyl group) (δH 1.27, 1.22, 1.21, 1.17 및 1.12)을 확인하였다.
8) 13C NMR spectrum을 통하여 29개의 탄소 신호를 발견했으며 5개의 메틸 탄소 (methyl carbon) (δC 33.2, 21.4, 21.1, 16.8 및 16.0)을 확인하였다.
화합물 5:
Figure 112014108021191-pat00031
1) 물성 : 백색분말 (white powder)
2) 분자량 : 727 g/mol
3) 분자식 : C36H53N709
4) 1H NMR (700 ㎒, CD3OD): δ 7.07 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-27), 7.07 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-31), 6.73 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-28), 6.73 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-30), 4.67 (1H, dd, J = 7.5, 6.5 Hz, H-12), 4.60 (1H, br s, J = 8.0, H-2), 4.59 (1H, dd, J = 8.5, 5.5 Hz, H-7), 4.40 (1H, dd, J = 7.0, 4.5 Hz, H-35), 4.22 (1H, dd, J = 7.5, 7.0 Hz, H-24), 4.18 (1H, dd, J = 11.0, 4.5 Hz, H-18), 4.04 (1H, dd, J = 17.0, 1.0 Hz, H-33), 3.98 (1H, dd, J = 13.0, 7.0 Hz, H-36), 3.96 (1H, dd, J = 13.0, 4.5 Hz, H-36), 3.93 (1H, m, H-33), 3.67 (1H, m, H-5), 3.63 (1H, m, H-10), 3.56 (1H, m, H-10), 3.55 (1H, m, H-5), 2.98 (1H, dd, J = 14.0, 7.5 Hz, H-25), 2.98 (1H, dd, J = 14.0, 7.0 Hz, H-25), 2.43 (1H, m, H-3), 2.29 (1H, m, H-8), 2.20 (1H, m, H-3), 2.09 (1H, m, H-9), 2.02 (1H, m, H-9), 1.97 (1H, m, H-4), 1.84 (1H, m, H-8), 1.81 (1H, m, H-4), 1.68 (1H, m, H-13), 1.67 (1H, m, H-19), 1.56 (1H, m, H-19), 1.56 (1H, m, H-14), 1.34 (1H, m, H-13), 1.34 (1H, m, H-20), 0.95 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-15), 0.94 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-16), 0.93 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-22), 0.86 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-21)
5) 13C NMR (175 ㎒, CD3OD):δ 174.5 (C-23), 174.4 (C-17), 174.1 (C-1), 173.7 (C-6), 172.3 (C-34), 172.9 (C-32), 170.9 (C-11), 157.8 (C-29), 131.3 (C-27), 131.3 (C-31), 127.9 (C-26), 116.5 (C-28), 116.5 (C-30), 62.6 (C-2), 62.6 (C-36), 61.2 (C-7), 59.5 (C-35), 54.4 (C-18), 50.8 (C-12), 48.7 (C-10), 48.1 (C-5), 43.1 (C-33), 41.9 (C-13), 40.7 (C-19), 37.2 (C-25), 32.6 (C-3), 29.5 (C-8), 26.3 (C-9), 25.8 (C-14), 25.7 (C-20), 23.7 (C-22), 23.4 (C-16), 23.0 (C-4), 23.0 (C-15), 21.4 (C-21)
6) ESI-MS data at m/z [M-H]- 726 (calcd. for C36H52 N7O9 : 726)
7) 1H NMR spectrum 을 통하여 4개의 메틸기 (methyl group) (δ H 0.95, 0.94, 0.93 및 0.86), 22개의 메틸렌기 (methylene group) (δ H 4.04, 3.98, 3.96, 3.93, 3.67, 3.63, 3.56, 3.55, 2.98, 2.98, 2.43, 2.29, 2.20, 2.09, 2.02, 1.97, 1.84, 1.81, 1.68, 1.67, 1.56, 1.34)을 확인하였다.
8) 13C NMR spectrum을 통하여 36개의 탄소 신호를 발견했으며 4개의 메틸 탄소 (methyl carbon) (δC 23.7, 23.4, 23.0 및 21.4), 11개의 메틸렌 탄소 (methylene carbon) (δC 48.7, 48.1, 43.1, 41.9, 40.7, 37.2, 32.6, 29.5, 26.3, 23.0)을 확인하였다.
준비예 1. 세포 배양
쥐에서 유래된 RAW264.7 대식 세포는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포주의 세포배양액은 4.5 g/L glucose와 L-glutamine이 첨가된 DMEM 배지에 10%의 송아지 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, 웰진, 대구, 대한민국)과 1%의 penicillin-streptomycin을 첨가하여 배양하였다. 세포들은 37℃에서 5%의 CO2가 공급된 배양기에서 배양 후 스크레퍼를 이용하여 세포를 분리하여 1×105 cells/㎖ 농도로 실험을 수행하였다. 트리판블루(Trypan blue dye)를 이용하여 세포활성의 기준을 삼았으며 죽은 세포의 농도는 1% 미만을 유지하였다.
실험예 2. 세포독성 측정
준비예 1에서 18시간 동안 배양한 대식세포(RAW 264.7)를 96-웰(well)에 1×105 cells로 분주하고 실시예 1에서 수득한 화합물 1 내지 5를 200 μM의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양시켰다. 그 후, 세포의 활력 측정을 통해 화합물 1 내지 5의 세포독성을 측정하였다.
상기 세포 활력은 상용화된 MST-1 assay를 이용하였으며, 준비예 1의 배양 세포에 실시예 1의 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 5를 처리하고 3시간 동안 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후 10 ㎕의 MTT 용액(10 ㎎/㎖ in phosphate buffered saline, pH 7.4; PBS)을 첨가하고 3시간 동안 더 배양하였다.
상기 배양으로 생성된 포르마잔(formazan)을 용해하기 위해서 15% 소듐 도데실 설페이트(SDS; Sodium dodecyl sulphate)를 각 웰에 첨가하여 배양을 중단하였다. 이후 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)(BD PharMingen, USA)를 이용하여 460 ㎚에서 흡광도를 측정하여 측정 결과를 도면 16에 나타냈다.
도 16에서 확인되는 바와 같이, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 및 화합물 5 모두 200 μM의 농도로 처리하여도 세포 활력이 낮아지지 않아 세포 독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 항염 활성 측정
실시예 1에서 수득한 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 또는 화합물 5를 준비예 1에서 배양한 대식세포(RAW 264.7)에 처리한 후 그리스(Griess) 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 양을 측정하여 산화질소 저해 활성을 측정하였다.
구체적으로, 준비예 1와 동일한 대식세포를 96-웰(well)에 1×105 cells로 분주하고 1 ㎍/㎖의 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS)를 처리한 후 37 ℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 대식세포에 0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM 또는 200 μM의 화합물 1 내지 5 중 하나의 화합물을 첨가하였다. 이후 세포배양 상등액 100 ㎕ 및 그리스(Griess)시약 100 ㎕를 1 : 1 비율로 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
상기 그리스 시약은 1%(w/v) 설파닐아미드(sulfanilamide)에 5%(v/v) 인산(phosphoric acid) 및 0.1%(w/v) 나프틸에틸렌디아민-염화수소(naphtylethylenediamine-HCl)을 첨가한 시약이다.
측정된 일산화질소양은 도 17에 나타냈다.
도 17에서 확인되는 바와 같이, 화합물 1, 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 및 화합물 5는 산화질소(NO) 형성이 화합물의 처리 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 특히, 각각의 화합물을 50 μM로 처리하였을 때 NO 형성을 50% 미만으로 감소시켰으며, 화합물을 100 μM로 처리하였을 때는 10% 미만으로 NO 형성을 억제하는 것을 알 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 화합물 1 내지 5는 종래 화학적 항염증제와 같은 부작용이 없는 비스테로이드 성분이며, 세포 내 산화질소(NO) 발현양 감소를 통해 항염 활성을 갖고, 천연물 유래 물질로서 세포독성이 없는 항염 활성 조성물 및 이를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

  1. 하기 화합물 2, 하기 화합물 3 및 약제학적으로 허용되는 그의 염으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 항염증 활성 조성물;
    [화합물 2]
    Figure 112016037638761-pat00062

    [화합물 3]
    Figure 112016037638761-pat00063

  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 화합물 2, 화합물 3 및 약제학적으로 허용가능한 그의 염은 감귤(citrus) 유래인 것을 특징으로 하는 항염증 활성 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항염증 활성 조성물을 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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