KR20000066932A

KR20000066932A - 세스퀴테르펜 락톤 화합물 코스투놀라이드의 염증질환 치료제로서의 용도

Info

Publication number: KR20000066932A
Application number: KR1019990014355A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 이정형; 김항섭; 홍영수; 구태현
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2000-11-15
Also published as: KR100321312B1

Abstract

본 발명은 태산목 (Magnolia grandiflora L.)의 잎에서 추출한 세스퀴테르펜 락톤 (sesquiterpene lactone) 화합물로서 염증질환 및 면역질환 치료제로 이용될 수 있는, 화학식 1의 구조를 갖는 코스투놀라이드 (costunolide)에 관한 것으로, 상기 화합물들은 인체의 면역체계를 조절하는 중요한 인자인 산화질소 (nitric oxide, NO)나 종양괴사인자-알파 (TNF-α)의 생성을 억제하고, 염증매개인자의 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써, 산화질소나 종양괴사인자-알파의 과잉생성 또는 NF-κB의 활성화에 의해 야기되는 염증관련 질환 및 면역질환의 효과적인 치료제로 이용될 수 있다.

코스투놀라이드

Description

세스퀴테르펜 락톤 화합물 코스투놀라이드의 염증질환 치료제로서의 용도 {Use of costunolide as antiinflammatory agent}

본 발명은 태산목 (Magnolia grandiflora L.)의 잎에서 추출한 세스퀴테르펜 락톤 (sesquiterpene lactone) 화합물로서, 인체의 면역체계를 조절하는 중요한 인자인 산화질소 (nitric oxide, NO)나 종양괴사인자-알파 (TNF-α)의 생성을 억제하고, 염증매개인자의 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써, 염증관련 질환 및 면역질환의 치료제로 이용될 수 있는 코스투놀라이드 (costunolide)에 관한 것이다.

산화질소는 인체의 대식세포 (macrophage)에서 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthetase, 이하 NOS라 칭한다)에 의해 L-아르기닌 (L-arginine)으로부터 생성된다 (Kerwin, J. F. Jr. et al., J. Med. Chem. 1995, 38, 4343-4362). 인체의 NOS에는 내피세포 구성형 NOS (endothelial constitutive NOS, 이하 ecNOS라 칭한다), 신경세포 구성형 NOS (neuronal constitutive NOS, 이하 ncNOS라 칭한다) 및 유도성 NOS (inducible NOS, 이하 iNOS라 칭한다)의 3가지 이성체가 존재한다. 이중 ecNOS와 ncNOS는 각각 내피세포 (endothelial cell)와 신경외피세포 (neuroectodermal cell)에서 발현되며, 칼슘 및 칼모듈린 (calmodulin)에 의존적인 반면, iNOS는 병원균의 세포막 성분인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, 이하 LPS라 칭한다), IL-1, TNF-α 같은 사이토카인 (cytokine), 방사선 등의 면역 자극제에 의해 세포가 활성화될 때에만 여러 세포에서 많은 양이 발현되며 칼슘 및 칼모듈린에 비의존적이다.

NO는 높은 농도에서는 종양세포와 병원균에 대해서 방어기능을 하며, 혈관내피세포에서 생성된 낮은 농도의 NO는 혈압 조절작용을, 신경세포에서 생성되는 NO는 신경전달물질 (neurotransmitter), 학습, 기억 등에 관련된 다양한 생리 반응을 수행한다. 유도형이 아닌 구성형 NOS (cNOS)는 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데, ecNOS에 의해 생성된 NO는 혈관계에 작용하여 혈관확장, 혈소판 부착이나 응집을 억제시키며, ncNOS에 의해 생성된 NO는 신경계에 작용하여 기억능력에 중요한 장기 기억능력을 상승시키거나 신경전달물질로서 우울증을 일으킬 뿐만 아니라, 소화기관의 운동성이나 음경의 발기에도 관여한다. 반면에, 특정 사이토카인이나 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현에 의해 생성되는 NO는 염증발현이나 숙주방어기전 등에 작용한다. 또한, 균체내독소 (endotoxin)의 자극에 의해 대식세포 (macrophage)에서의 iNOS 발현이 유도되고, 이로부터 NO의 생성이 증가되기도 한다 (Butler, A.R., Chemistry ＆ Industry, 1995, 16, 828-830).

LPS, 염증유발인자, 방사선조사 등의 외부 자극에 의해 iNOS의 발현이 유도되면 많은 양의 NO가 4∼6 시간 동안 계속적으로 생성되고, 이는 인체에 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 쥐의 경우 LPS의 외부 자극에 의해 대식세포에서 많은 양의 iNOS mRNA와 단백질이 발현되고 여기서 합성된 NO는 미생물 살균 작용과 항종양 작용을 수행한다. 그러나, 필요 이상의 과다한 NO의 생성은 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 야기 시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 이러한 질병치료제로서의 개발가능성이 높으며, 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 이용될 수 있다.

면역 반응시에 NO의 과잉생성과 관련된 iNOS 유전자의 발현에는 전사인자인 NF-κB가 가장 중요하다. 전사인자 NF-κB (nuclear factor Kappa B)는 세포사멸(apoptosis), 면역반응, 염증반응 등의 다양한 세포 반응에 관련된 단백질들의 발현에 작용한다. p50 단백질과 p65 단백질의 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 정상상태에서는 세포질에서 그 억제제(inhibitor)인 IκB와 결합하고있어 불활성화된 상태로 존재하다. 그러나, TNF-α, IL-1, LPS, 자유기(free radical), 방사선 조사(radiation) 등의 다양한 자극에 의해 IκB kinase(IKK)가 활성화되면, IκB가 인산화 되어 분해됨으로써 NF-κB가 IκB로부터 유리되어 핵으로 들어가 다양한 염증 또는 면역반응관련 유전자의 전사인자로서 기능을 하게 된다 (P.A. Baeuerie and D. Baltimore, Cell 87, 13-20, 1996).

NF-κB는 염증반응에서 사이클로옥시제나제-2 (cyclooxygenase-2), iNOS 등의 발현과 TNF-α 등의 각종 사이토카인 (cytokine), E-셀렉틴(E-selectin), ICAM, VCAM 등의 접착분자 발현에 중요한 전사인자일 뿐만 아니라 TNF-α 수용체 족(TNF-α receptor family)과 같은 사멸 수용체 (Death Receptor)를 통한 세포사멸 신호를 조절하는 역할을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다 (F.H. Epstein, New Engl. J. Med., 336(15), 1066-1071, 1997, T. Collins, M.A. Read et. al., FASEB J 9, 899-909, 1995). 그 예로서 사멸수용체(death receptor)를 매개하여 세포사멸 (apoptosis) 억제활성을 나타내는 단백질로 알려진 Mn-SOD, A20 (zinc finger protein), IAP (inhibitor of apoptosis protein)등의 발현조절에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다 (D.J. Van Antwerp, S.J. Martin, et. al., Trends in Cell Biology 8, 107-111, 1998, C.-Y. Wang, M.W. Mayo et. al., Science 281, 1680-1683, 1998). 암세포에서도, TNF-α나 아드리아마이신으로 처리하면 NF-κB가 활성화되어 이들 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하게 되는데, 이들 약물에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화를 억제하면 세포사멸경로가 활성화되어 약물의 감수성이 증가하게 된다 (A.A. Beg and D. Baltimore, Science 274, 782-784, 1996, C.-Y. Wang, M.W. Mayo and A.S. Baldwin Jr., Science 274, 784-789, 1996).

신경세포에 있어서 NF-κB의 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 쥐에 있어 뇌 허혈이나 외상에 의한 손상시 시상하부 (hippocampus)와 대뇌피질 (cerebral cortex)에서의 NO나 TNF-α양이 급격히 증가되는데, 이는 신경세포에서 NF-κB를 활성화하여 신경세포의 사멸을 억제하려는 항 세포사멸신호(antiapoptotic signal)일 것으로 생각된다. 실제로 TNF-α나 세라마이드 (ceramide)는 시상하부 뉴론 (hippocampal neuron) 배양계에서 NF-κB를 활성화시키고 아밀로이드 펩타이드 (amyloid peptide)와 철 이온에 의한 산화성 스트레스(oxidative stress)로부터 세포를 보호하는 작용이 있다. 산화성 스트레스는 세포의 정교한 조절 기구에 의해 그 항상성이 유지되나 과도한 산화성 스트레스는 세포의 사멸을 유발시켜 조직의 손상 및 노화를 초래하게 되는 것이다. 또한, 아밀로이드 펩타이드나 과산화수소같은 산화성 스트레스에 내성이 높은 PC12 세포주에서도 NF-κB의 활성이 높은 것으로 알려져 있다 (F. Lezoualc'h, Y. Sagara, et al., J Neurosci 18, 3224-3232, 1998).

한편 이와는 반대로 다양한 신경세포 사멸 유도인자에 의해 NF-κB가 활성화되어 신경세포의 사멸을 유도한다는 보고도 있다. 한 예로서 치매 (Alzheimer's disease) 환자의 경우 신경독성 펩타이드인 베타-아밀로이드 (β-amyloid)가 침착되는데 이 펩타이드는 글루타메이트(glutamate) 경로를 거쳐서, 활성산소기를 생성하여 전사인자 NF-κB를 활성화시키게 된다. 실제로 치매 환자의 병소 주위에 다량의 활성화된 NF-κB가 발현되고 있는 것으로 알려져 있으며, 실험동물 모델에서 글루타메이트에 의해 유발되는 세포사멸(apoptosis)은 NF-κB의 활성화 저해제로 알려진 아스피린(aspirin)으로 처리하면 저해된다고 보고되어 있다 (M. Grilli, M. Pizzi, et. al., Science 274, 1383-1385, 1996). 신경세포의 경우, 신경전달물질인 글루타메이트가 과도한 자극에 의해 다량 분비되면 카이네이트(kainate)를 통한 일련의 반응을 거쳐 생성된 활성기(reactive radical)가 전사인자 NF-κB를 활성화시킴으로써 세포사멸 및 신경세포의 손상을 초래하는데, 이러한 활성기에 의한 NF-κB 활성화 및 세포사멸은 항산화제에 의해 저해되는 것으로 알려져 있다.

이와 같이 NF-κB는 외부의 압박에 반응하여 활성화되어 염증유발인자의 발현에 중심적인 역할을 할뿐만 아니라 아직 논란은 있지만 신경 세포의 사멸에 관련되어 있으며, TNF-α나 항암제에 의해 유도되는 암세포의 사멸을 억제하는 기능을 하는 단백질의 발현에도 중요한 역할을 한다. 대표적인 항염증제로 알려진 글루코코르티코이드 (glucocorticoid)류나 아스피린류는 항염증작용의 중요한 기전으로서 NF-κB의 활성화 저해 및/또는 NO나 프로스타글란딘 (prostaglandine)의 생성을 억제하는 작용이 있으며, 또한 한방이나 민간에서 항염증제로 사용되어왔던 약물들도 NF-κB의 활성을 저해하는 것에 의해 그 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다 (E. Kopp and S. Ghosh, Science 265, 956-959, 1994, A. Ray, K.E. Prefontaine, Proc Natl Acad Sci U S A 91, 752-756, 1994).

NF-κB의 활성화에 의해 생산되는 염증유발인자 중 TNF-α는 오랫동안 면역질환 치료제개발에 있어 목표가 되어 왔으며, 생체에서 LPS등의 다양한 자극에 반응하여 NO와 같이 대식세포로부터 생성된다. 종양괴사인자로 발견된 TNF-α는 자가면역질환 (rheumatoid arthritis, 장기이식거부반응), 알러지성 염증질환 (천식, 아토피성피부염), 급성면역질환 (패혈증, 급성간질환)등에 관련성이 보고되면서 TNF-α 합성을 억제하는 화합물개발연구가 활발하게 진행되고 있으며, 암세포의 혈관형성에의 관련성도 제시되었다.

NO, NF-κB 및 TNF-α의 활성을 억제하는 약물 및 그 개발현황을 살펴보면, NO의 생산을 억제하는 물질은 주로 iNOS의 효소활성을 특이적으로 저해하는 물질개발에 집중하여 연구되었는데, 전구체인 L-아르기닌의 유도체, L-시트룰린 (L-citrulline) 유도체, 아미노구아니딘 (amionguanidine) 유도체, 이소치오우레아 (isothiourea) 유도체 등의 개발연구가 진행되고 있다 (Babu, B.R.B and Griffith O.W. Current Opinion in Chemical Biology, 1998, 2, 491-500).

NF-??B의 활성화를 억제하는 화합물로는 커쿠민 (curcumin), 캡사이신 (capsacin), 카펙산 (caffeic acid) 유도체, 테트라드린 (tetrandrine), 생귀나린 (sanguinarine) 등이 보고되었으며, 대표적인 글루코코르티코이드계 소염제인 덱사메타손 (dexamethasone)은 iNOS 유전자의 발현을 억제하여 NO 생성을 저해하는데, 덱사메타손의 이러한 활성 기전은 I-κB 단백질을 합성을 유도하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 iNOS의 유전자 전사를 억제하는 것으로 보고 되었다 (De Vera, M.E. et al., Am. J. Physiol. 1997, 273, 1290-1296).

TNF-α 생산을 억제하는 의약품개발연구 현황을 살펴보면 사이토카인으로서 IL-4, IL-10, TGF-β등의 활성이 보고되었고, Anti-TNF-α 항체와 수용성 TNF-α 수용체를 이용한 임상시험이 진행되고 있다. 합성화합물로는 펜톡시필린 (pentoxifylline), 탈리도마이드(thaliodomide), 피롤리딘 디티오카바메이트 (pyrrolidine dithiocarbamate), 바이사이클릭 이미다졸 (bicyclic imidazole)인 SKF 86002 등의 개발연구가 진행되고 있지만, 아직 치료제로 개발된 TNF-α 생성 억제 화합물은 없다 (A. Eigler et al. Immunology Today, 18, 487-492, 1997).

따라서 다양한 반응에 의해 유도되는 iNOS의 발현억제 화합물, 전사인자 NF-κB의 활성화 조절 화합물 및 TNF-α의 생성 억제 화합물은 염증 치료제, 면역질환 치료제, 암 치료제 및 신경세포 보호 약물 등의 개발에 유용할 것이다.

이에 본 발명자들은 염증유발인자인 NO의 생성을 억제하는 화합물을 개발하기 위해 연구하던 중, 태산목(Magnolia gradiflora) 잎의 메탄올 추출물에서 분리한 세스퀴테르펜 락톤 화합물인 코스투놀라이드가 LPS로 자극한 대식세포에서 I??B의 인산화를 억제함으로써 NF-κB의 활성화를 억제하여 NO와 TNF-α의 생성을 강력하게 억제하는 활성이 있음을 발견하고, 이로부터 코스투놀라이드의 염증질환 및 면역질환 치료제로서의 용도를 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 태산목 (Magnolia grandiflora L.)의 잎에서 추출한 세스퀴테르펜 락톤 화합물로서 염증질환 및 면역질환 치료제로 이용될 수 있는 코스투놀라이드를 제공하는 것이다.

도 1 은 코스투놀라이드 (costunolide, CTN)의 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthetase, iNOS)의 mRNA (1a)와 단백질 (1b) 발현 억제효과를 역전사-중합효소 연쇄반응 (reverse transcription - polymerase chain reaction, 이하 RT-PCR이라 칭한다) 및 웨스턴 블럿 (western blot) 방법으로 확인한 젤 사진이고,

도 2 는 코스투놀라이드의 NF-κB 활성화 억제효과를 젤-쉬프트 (gel-shift) 실험으로 확인한 사진이며,

도 3 은 코스투놀라이드의 IκB 분해 억제효과(3a, b) 및 IκB 인산화 저해효과(3c)를 웨스턴 블럿 방법으로 확인한 사진이다.

본 발명은 태산목 (Magnolia grandiflora L.) 잎의 메탄올 추출물로부터 분리한 세스퀴테르펜 락톤계열의 화합물로서 화학식 1의 구조를 갖는 코스투놀라이드 (costunolide)를 제공한다.

화학식 1

코스투놀라이드

본 발명은 태산목으로부터 추출한 세스퀴테르펜 락톤 화합물 코스투놀라이드 를 유효성분으로 하는 염증질환 및 면역질환 치료제를 제공한다.

보다 상세하게는, 본 발명은 산화질소 (nitric oxide, NO) 또는 종양괴사인자-알파 (TNF-α)의 생성을 억제하며, 염증유발인자인 사이토카인 (cytokine), 접착분자, 세포사멸 억제인자들의 발현에 중요한 NF-κB의 활성화를 억제하는 작용을 갖는, 코스투놀라이드의 염증질환 및 면역질환 치료제로서의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 관절염, 패혈증, 염증, 자가면역질환, 신경세포사멸에 의한 질환 및 두통 치료제 등의 염증질환 및 면역질환 치료제로서의 코스투놀라이드의 용도를 제공한다.

본 발명의 코스투놀라이드는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 코스투놀라이드는 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 코스투놀라이드의 유효용량은 5 ∼ 50 mg/kg 이고, 바람직하기로는 5∼20 mg/kg 이며, 하루 1~3 회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 코스투놀라이드는 이미 사용되고 있는 기관지 확장제, 항히스타민제, 소염진통제, 항암제, 신경세포보호제 및 항생제 등의 기존의 약제와 함께 제제화 또는 병용하여 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 코스투놀라이드는 세스퀴테르펜 락톤 계열의 화합물로서 태산목 (Magnolia grandiflora L.) 잎의 메탄올 추출물로부터 분리된다. 상기 화합물은 LPS로 자극한 대식세포주에서 NO의 생성을 강력하게 억제하는 활성을 보이는데, 이는 iNOS 유전자 및 단백질의 발현을 억제하기 때문이다.

또한, 상기 화합물은 NF-κB의 활성화에 필수적인 I-κB의 인산화를 저해함으로써 NF-κB로부터의 I-κB의 분해를 막고 이를 통해 NF-κB의 활성을 억제할 뿐만 아니라, TNF-α의 생성을 강력하게 억제하는 작용을 나타낸다. 또한, 이러한 활성은 생체외 (in vitro)에서는 물론 생체내 (in vivo)에서도 동일하게 나타나는데 구체적으로는 코스투놀라이드가 생쥐에서 LPS에 의한 치사독성을 보호하는 작용이 우수하다.

상기와 같은 활성으로 인하여 이들 화합물은 NO, TNF-α의 과도한 생성으로 인한 염증성 질환, 더 나아가 NF-κB의 활성화가 수반되는 질환에 대한 치료제로서 효과적으로 이용될 수 있다.

한편 본 발명의 코스투놀라이드의 급성 독성을 알아보기 위해 독성시험을 수행한 결과, 실험된 코스투놀라이드는 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 코스투놀라이드의 산화질소 생성 저해활성

코스투놀라이드의 nitric oxide 생성 억제활성을 다음과 같이 측정하였다. RAW 264.7 뮤린 대식세포 (murine macrophage cell)에 LPS (1 μg/ml)를 농도별로 희석한 코스투놀라이드와 함께 처리하여 24시간동안 배양한 후 배양 상등액을 취하여 그리이스 시약 (Griess reagent)을 이용하여 각 조건에서 축적된 아질산 (nitrite, NO의 최종 산화물)의 생성량을 측정하였다 (도 1). 그 결과, LPS에 의한 NO의 생성이 코스투놀라이드 농도에 의존적으로 생성이 억제되어짐을 관찰할 수가 있었다. 코스투놀라이드의 NO 생성저해 IC₅₀(inhibition concentration)은 0.2 μg/ml 이었고, 특히 1 μg/ml의 코스투놀라이드에서는 LPS를 전혀 처리하지 않은 대조군의 수준으로 NO의 생성을 억제하였다.

코스투놀라이드의 Nitric oxide 생성 저해효과

	Costunolide(μg/ml)	Nitric oxide (μM)
(+) LPS	0	22.45±0.86
	0.01	20.36±1.16
	0.03	17.96±1.23
	0.1	13.08±0.66
	0.3	6.21±0.57
	1.0	1.59±0.07
(-) LPS	0	1.16±0.03

실시예 2. 코스투놀라이드의 iNOS mRNA와 단백질의 발현 억제효과

RAW 264.7 뮤린 대식세포에서 LPS에 의해 유도, 생성되는 NO는 주로 iNOS의 발현에 의해 결정되어지기 때문에, 코스투놀라이드가 iNOS 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사해 보았다. RAW 264.7 뮤린 대식세포세포에 LPS (1 μg/ml)를 처리하고 동시에 코스투놀라이드를 농도별로 함께 처리하여 6 시간동안 키운 뒤 RNA 전체를 분리하고 iNOS에 대한 시발체 (primer)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 도 1a에서와 보는 바와 같이, LPS에 의해 유도된 iNOS mRNA 발현이 코스투놀라이드 0.1 μg/ml부터 억제되어짐을 관찰할 수가 있었으며, 이 결과는 NO 생성 억제 효과와 일치하였다.

코스투놀라이드가 LPS에 의해 유도되는 iNOS 단백질 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (도 1b). RAW 264.7 뮤린 대식세포 세포에 LPS (1 μg/ml)를 처리하고 동시에 코스투놀라이드를 농도별로 함께 처리하여 18 시간을 키운 뒤 전체 세포 분해물 (total cell lysates)을 준비하여 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과 도 1b에서 보는 바와 같이 분자량 130 kDa에서 LPS에 의해 유도, 생성되어진 iNOS 단백질을 관찰하였고, 처리한 코스투놀라이드의 농도에 의존적으로 iNOS의 발현이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 NO의 생성을 억제하는 면에서 iNOS mRNA의 결과와 일치한다고 할 수 있다.

실시예 3. 코스투놀라이드의 NF-κB 활성화 억제효과

iNOS의 발현에 있어 NFκB, AP-1 (activator protein-1), IRF-1(interferon regulatory factor-1) 등의 전사 인자가 관련된다고 알려져 있는데 이 가운데 NFκB가 가장 중요한 전사인자이다. 이에 코스투놀라이드의 iNOS mRNA와 단백질 발현억제 효과가 NFκB의 활성화 억제와 직접적인 관계가 있는지를 조사해 보았다.

NFκB 의존적 리포터유전자의 발현을 검색할 수 있는 세포주인 RAW-NF-AP 세포주 (대한민국 특허출원 제 99-6025 호)에 여러 가지 농도의 코스투놀라이드를 LPS (1 μg/ml)와 동시에 처리하여 발현되는 분비형 알칼라인 포스파타제 (secreted alkaline phosphatase, 이하 SEAP라 칭한다)의 활성을 측정하였다. 표 2에서 보는 바와 같이, LPS에 의해 유도되는 리포터 유전자인 SEAP 활성은 코스투놀라이드에 농도 의존적으로 감소하였고, 코스투놀라이드 0.03 μg/ml에서 약 48 %, 1 μg/ml에서 약 76 %의 SEAP 활성 감소 효과를 나타내었다.

코스투놀라이드의 NF-κB 활성 저해효과

	Costunolide(μg/ml)	SEAP활성(% of control)
(+) LPS	0	100±3.5
	0.01	74.4±2.7
	0.03	52.0±3.6
	0.1	41.3±2.9
	0.3	31.6±3.5
	1.0	24.2±1.9

이 결과를 확인하기 위하여, 젤-쉬프트 분석 (gel shift assay)을 통해 NF-κB의 DNA binding 활성에 코스투놀라이드가 미치는 영향을 조사하였다. RAW 264.7 뮤린 대식세포에 3 시간동안 각각 0, 0.5, 1.5, 3 μg/ml의 코스투놀라이드로 전 처리한 다음 LPS (1 μg/ml)로 30 분 동안 처리한 후, 핵 추출물을 분리하였다. 핵 추출물 20 μg을 방사성 동위원소로 표지된 이중나선 올리고핵산 (double strand oligonucleotide, 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG-3')과 반응시킨 후에 비변성 폴리아크릴아마이드 젤 (nondenaturing polyacrylamide gel)에 옮겨 전기영동으로 분리하고, 와트만 3MM 셀룰로오즈지에 옮긴 후에 X-ray 필름으로 감광 하였다. 그 결과 도 2에서 보는 바와 같이, LPS에 의해 유도된 NF-κB의 DNA binding 활성이 코스투놀라이드에 의해 농도 의존적으로 감소함을 알 수가 있었다. 특히, 3 μg/ml의 코스투놀라이드는 LPS에 의해 유도된 NFκB의 DNA 결합 활성을 완전히 차단하였다 (도 2). 이것은 전술한 SEAP 활성 결과와 일치한다.

실시예 4. 코스투놀라이드의 IκB-α와 IκB-β의 분해 및 인산화 억제효과

(1) 분해 억제효과

코스투놀라이드의 LPS에 의해 유도된 NFκB 활성억제 기전을 이해하기 위하여, NFκB와 복합체를 형성하여 NFκB의 활성을 억제시키는 IκB에 대한 코스투놀라이드의 영향을 조사하였다. RAW 264.7 뮤린 대식세포에 3 μg/ml의 코스투놀라이드를 3시간동안 전 처리한 다음 LPS (1 μg/ml)로 자극하고 각각 15분, 30분, 60분, 120분, 240분 후에 세포분해물을 얻은 다음 IκB-α와 IκB-β의 항체을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 그 결과 IκB-α가 30분 후에는 LPS에 의해 분해가 되었다가 60분 후에 다시 생성되는 것을 볼 수가 있었다. 또한, IκB-β의 경우, 30 분 후에는 LPS에 의해 분해되지 않다가 60분 후엔 부분적으로 분해되는 양상을 보였고 240분 후엔 다시 생성되는 것을 볼 수가 있었다. 그러나, 코스투놀라이드를 LPS와 함께 처리하였을 경우에는, LPS에 의해 유도되는 IκB-α와 β의 분해를 억제시키는 결과를 관찰할 수 있었다 (도 3a, 3b).

(2) 인산화 억제효과

IκB 분해에 필수적인 IκB 인산화에 코스투놀라이드가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 IκB-α 인산화의 변화를 관찰하였다. 앞의 실험과 같은 방법으로 세포 분해물을 얻은 다음 인산화된 IκB-α를 인식하는 항체(New England Biolabs Inc., MA. USA)로 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. 그 결과, LPS에 의해 유도되는 IκB-α의 인산화가 코스투놀라이드에 의해 억제되는 결과를 관찰하였다 (도 3c). 이러한 결과를 통해 코스투놀라이드는 IκB의 인산화를 저해함으로서 NF-κB의 활성화를 억제함을 알 수 있었다.

실시예 5. 코스투놀라이드의 Raw 264.7세포에서 TNF-α 생성 억제효과

Raw 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 TNF-α의 생성억제에 미치는 코스투놀라이드의 효과를 측정하였다. 먼저 Raw 264.7 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 24 웰 플레이트 (well plate)에 0.5 X 10⁶세포/ml 씩 가하고 37 ℃, 5 % CO₂에서배양하여 세포를 부착시켰다. 3시간 후 각 웰에 LPS를 최종농도가 1 μg/ml 되도록, 그리고 코스투놀라이드를 배지 ml당 0, 0.03, 0.1, 0.3, 1 μg이 되도록 가해주었다. 20시간 배양한 후 배양액을 회수하여 원심분리하고, 각 여액 중에 있는 TNF-α 양을 TNF-α 엘리자 키트 (ELISA kit)를 사용하여 정량하였다. 그 결과 표 3에 나타난 바와 같이 1 μg/ml의 코스투놀라이드에서 80 % 이상의 TNF-α 생산저해 효과를 나타내었다.

코스투놀라이드의 TNF-α 생성 저해효과

	CTN(μg/ml)	TNF-α(% of control)
(+) LPS	0	100±2
	0.03	91.2±4
	0.1	50.0±3
	0.3	14.1±0.1
	1	4.7±0.1
(-) LPS	0	0.5±0.01

실시예 6. 실험생쥐에서 LPS 치사독성에 대한 코스투놀라이드의 억제효과

코스투놀라이드가 쥐 대식세포주 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-α의 생성을 강력하게 억제하고 NF-κB의 활성화를 억제하였기 때문에, 실험생쥐에서 LPS에 의한 치사독성을 억제하는지를 실험하였다. 특정병원균부재 (specific pathogen free) ICR 마우스(암컷, 22-27 g, 6주령)를 비교군과 코스투놀라이드 투여군 등 4개의 실험군으로 하여 각각 15마리씩 사용하였다. 비교군에는 30 % PEG (polyethylene glycol)400을 200 μl씩 복강에 주사하고, 각각의 실험군에는 코스투놀라이드를 1 mg/마리, 0.5 mg/마리 그리고 0.25 mg/마리 용량으로 30 % PEG 400에 용해하여 복강에 투여하였다. 약물투여 2시간 후에 생리식염수에 녹인 LPS (Sigma : E. coli 055 : B5 LPS)를 3 mg/마리 용량으로 복강에 투여하고 6일 동안에 걸쳐 실험생쥐의 사망을 관찰하였다. LPS만 투여한 대조군의 경우 실험생쥐의 93 % (15마리 중 14마리사망)가 3일 이내에 사망하였으나 LPS 투여 2시간 전에 코스투놀라이드를 투여한 실험군의 경우 1 mg/마리 용량에서는 치사율이 13 % (15마리 중 2마리 사망)로 낮아졌고, 0.5 mg/마리 및 0.25 mg/마리 용량에서는 치사율이 각각 40 % (15마리 중 6마리 사망)와 67 % (15마리 중 10마리 사망)로 LPS 치사독성에 대한 현저한 보호효과를 보였다.

상기와 같이 과도한 면역반응에 기인하는 패혈병 (sepsis)의 동물모델로 이용하는 실험생쥐에서 코스투놀라이드가 LPS 치사독성을 억제할 수 있음을 볼 때, NO나 TNF-α의 과도한 생성이나 더 나아가 NF-κB의 활성화에 의해 발현되는 사이토킨, 접착 단백질분자들이 병인이 되는 인체질환에 코스투놀라이드가 치료제로서 이용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 7. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 본 발명의 코스투놀라이드를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 0.5g/kg/15ml의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 0.5 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 0.5 g/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 태산목(Magnolia gradiflora) 잎의 메탄올 추출물로부터 분리한 세스퀴테르펜 락톤계열의 화합물인 코스투놀라이드는 iNOS 단백질이나 TNF-α의 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 NO와 TNF-α의 생성을 강력하게 억제하는 활성이 있으며, 이러한 활성으로 인해 NO와 TNF-α의 과도한 생성 혹은 NF-κB의 활성화에 의한 인체질환 및 관절염, 패혈증 등의 염증질환, 자가면역질환 및 신경세포사멸에 의한 질환 등에 효과적인 치료제로 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 태산목(Magnolia gradiflora) 잎의 메탄올 추출물에서 분리한 세스퀴테르펜 락톤 화합물 코스투놀라이드 (costunolide)를 유효성분으로하는 염증질환 및 면역질환 치료제.

화학식 1
제 1항에 있어서, 산화질소 (nitric oxide, NO) 또는 종양괴사인자-알파 (TNF-α)의 과잉생산을 억제하는 것을 특징으로하는 코스투놀라이드를 유효성분으로 하는 염증질환 및 면역질환 치료제.
제 1항에 있어서, 염증유발인자인 사이토카인 (cytokine), 접착분자, 세포사멸 억제인자 등의 발현에 중요한 작용을 하는 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 코스투놀라이드를 유효성분으로 하는 염증질환 및 면역질환 치료제.
제 1항에 있어서, 염증질환 또는 면역질환은 관절염, 패혈증, 염증, 자가면역질환 및 신경세포사멸에 의한 질환인 것을 특징으로 하는 염증질환 또는 면역질환 치료제.
제 1항에 있어서, 치료제는 기관지 확장제, 항히스타민제, 소염진통제, 항암제, 신경세포보호제 및 항생제 등의 기존의 약제와 함께 제제화 또는 병용하여 사용하는 것을 특징으로 하는 염증질환 및 면역질환 치료제.