KR100450062B1 - 세래스트롤, 세래판올, 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환,면역질환 또는 암 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새래스트롤, 화학식 2로 표시되는 세래판올, 및 화학식 3으로 표시되는 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 이들을 포함하는 노박덩쿨 추출물의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 화합물 및 노박덩쿨 추출물이 IκB의 인산화를 저해하여 IκB의 분해 자체를 억제함으로써, NF-κB의 전사 활성을 억제하여 iNOS, COX-2, TNF의 생성을 강력하게 저해하여 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

(상기식에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₄는 명세서에서 정의한 바와 같다)

Description

세래스트롤, 세래판올, 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환, 면역질환 또는 암 치료제{A THERAPEUTIC AGENT CONTAINING CELASTROL, CELAPHANOL, SESQUITERPENE ESTER OR AN EXTRACT OF CELASTRUS OBICULATUS AS AN EFFECTIVE INGREDIENT FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASE, IMMUNE DISORDERS OR CANCERS}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 새래스트롤, 화학식 2로 표시되는 세래판올, 및 화학식 3으로 표시되는 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 및 이들을 포함하는 노박덩쿨 추출물의 NF-κB의 억제제의 용도에 관한 것으로, 상기 화합물 또는 노박덩쿨 추출물이 IκB의 인산화를 저해하여 IκB의 분해 자체를 억제함으로써, NF-κB의 전사 활성을 억제하고 iNOS, COX-2, TNF의 생성을 강력하게 저해하여 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

(상기 식에서, R₁은 수소, 퓨라노익산기, 또는 아세트산기, R₂는 퓨라노익산기 또는 벤조익산기, R₃는 수소 또는 아세트산기 및 R₄는 퓨라노익산기 또는 벤조익산기이다.)

전사인자 NF-κB(nuclear factor kappa B; 이하 "NF-κB"라 한다)는 염증유발 사이토카인, 독성화합물, 박테리아감염, 바이러스감염, 방사선, UV, 활성산소 등의 다양한 외부자극에 의해 활성화되어 세포사멸, 면역반응 및 염증반응 등의 다양한 세포 반응에 관련된 단백질들의 발현을 조절하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

따라서 비정상적인 NF-κB의 활성은 백혈병등 각종암, 관절염등 염증질환, 천식, 동맥경화, 알츠하이머, 호지킨씨병 등 암, 염증, 면역질환과 관련되어 있어, 이러한 NF-κB의 활성을 저해하는 화합물은 상기한 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 표적이 되고 있다[A. S. Baldwin Jr.J. Clin. Invest.,2001, 107, 241-246].

NF-κB는 전사인자로써, p50 단백질과 p65(RelA) 단백질을 포함한 5 종의 단백질의 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)로 구성되어 있으며, 세포질 내에서 활성 억제단백질인 IκB와 결합하여 불활성화된 상태로 존재한다. 그러나 염증유발 사이토카인, 독성화합물, 박테리아감염, 바이러스감염, 방사선, UV, 활성산소 등의 다양한 외부자극을 통해 IκB 카이네이즈(IκB kinase, IKK)가 활성화되어 NF-κB와 결합되어 있는 IκB를 인산화하고, 그 결과 NF-κB가 IκB로부터 유리된다. 유리된 NF-κB는 핵으로 들어가 다양한 염증 또는 면역반응, 세포증식관련 유전자의 전사인자로 기능을 하게 된다[P. A. Baeueric, D. Baltimore,Cell, 1996, 98, 13-20].

활성화된 NF-κB는 핵 안에서 NF-κB 결합부위가 있는 유전자의 프로모터에 결합되어 염증 및 면역반응에 관련된 단백질 (사이토카인, 케모카인, 접착분자, 사이토카인 리셉터), 효소(유도형 산화질소생산효소, 유도형 사이클로옥시나아제 등)의 발현을 조절하거나 TNF-α(tumor necrosis factor-α, 이하 "TNF-α"라 한다) 수용체 족(receptor family)과 같은 세포사멸 수용체(death receptor)를 통한 세포사멸 신호를 조절하는 역할을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다 (F.H. Epstein,New Engl. J. Med., 336(15):1066-1071, 1997; T. Collins, M. A. Read et al.,FASEB J., 9:899-909, 1995).

이와 같이 NF-κB는 외부의 유해한 자극에 반응하여 활성화되어 염증유발인자 및 면역반응 인자의 발현에 중심적인 역할을 할 뿐만 아니라 신경 세포의 사멸에 관련되어 있으며 TNF-α(tumor necrosis factor-α, 이하 "TNF-α"라 한다)나 항암제에 의해 유도되는 암세포의 사멸을 억제하는 단백질의 발현에도 중요한 역할을 하므로, 비정상적인 NF-κB 활성은 다양한 염증질환, 면역질환 또는 암의 원인이나 악성화에 관련되어 있으며, 반대로 NF-κB의 활성을 억제하는 화합물은 다양한 염증질환, 면역질환 또는 암의 치료제로 이용할 수 있다.

NF-κB를 활성화시키는 대표적인 자극인자인 LPS(lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라 한다), TNF-α, 인터루킨(interleukin-1), 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α, 인터루킨-1, IL-6, 프로스타글란딘 E₂(prostagladin E₂), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, 이하 "NO"라 한다)와 같은 염증유발 물질의 생산을 과도하게 유도하여 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식 거부반응, 자가면역 질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.

NF-κB의 활성을 억제하면 항암제로 사용할 수 있는데, 상기 NF-κB는 사멸수용체를 매개로 하여 세포사멸 억제활성을 나타내는 단백질로 알려진 망간네이즈-슈퍼옥사이드 변이효소(Manganese-superoxide dismutase; Mn-SOD), 아연 핑거 단백질(zinc finger protein) 계열의 단백질의 일종인 A20, TNF 수용체결합 단백질인 TRAF(TNF receptor associated factor), 세포사멸 단백질의 억제제(inhibitor of apoptosis protein), 세포사 억제단백질 Bcl-2 유사단백질인 Bfl-1/A1등의 발현조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[D.J. Van Antwerp, S.J. Martin et al.,Trends in Cell Biology, 1998, 8, 107-111, ; C.-Y. Wang, M.W. Mayo et al.,Science,1998, 281, 1680-1683].

또한, NF-κB는 상기한 바와 같이 세포사를 저해하는 유전자 발현을 통하여 암 발생에 관련될 뿐만 아니라 세포증식에 중요한 프로토온코진(protooncogene) c-Myc와사이클린 D1(cyclin D1)의 활성화를 통하여 암 발생에 기여하기도 한다[D. C. Guttridge et al.Mol Cell. Biol., 1999,19, 5785-5799].

실제로 TNF-α나 아드리아마이신(adriamycin)으로 암세포를 처리하면 NF-κB가 활성화되어 상기 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하게 되고, NF-κB의 활성을 억제하면 세포사멸 경로가 활성화되어 약물의 감수성이 증가하게 된다(A.A. Beg, D. Baltimore,Science, 274:782-784, 1996; C.-Y. Wang, M. W. Mayo, A.S. Baldwin Jr.,Science, 274:784-789, 1996).

또한, NF-κB의 활성을 억제하면 항염증제 및 면역질환 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

대표적인 항염증제로 알려진 글루코코르티코이드(glucocorticoid)류나 아스피린류는 항염증작용의 중요한 기전으로 NF-κB의 활성화를 저해하거나 NO(nitric oxide, 이하 "NO"라 한다) 또는 프로스타글란딘의 생성을 억제하는 작용이 있으며, 또한 한방이나 민간에서 항염증제로 사용되어 왔던 약물들도 NF-κB의 활성을 저해하는 것에 의해 그 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(E. Kopp, S. Ghosh,Science, 265:956-959, 1994; A. Ray, K.E. Prefontaine,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:752-756, 1994).

염증유발물질 중 하나인 NO는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며 세포살상과 살균작용 이외에도 다양한 생리활성을 나타내는데, 특히, 혈관 내피세포의 이완작용에 있어서 혈압의 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS(lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라 한다), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 유도형 산화질소 합성효소인 iNOS(inducible nitric oxide sythetase; 이하 "iNOS"라 한다)의 발현을 유도하여 많은 양의 NO를 4 내지 6 시간 동안 계속적으로 생성시키는데 이와 같이 생성된 과도한 양의 NO는상기와 같은 질환들을 유발한다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높으며, 또한 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 사용될 수 있다.

또 다른 염증유발 물질인 PGE₂, PGF2a 및 PGI₂과 같은 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 프로스타글란딘 생산의 율속효소인 사이클로옥시게나아제(COX)에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린 인도메타신같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

상기 NO의 과잉생성과 관련된 iNOS 유전자의 발현이나 프로스타글란딘 생산효소인 COX 유전자 발현에도 전사인자인 NF-κB의 활성화가 필요하기 때문에 NF-κB 활성 억제제는 NO 또는 프로스타글란딘의 생산을 저해한다.

NO의 생산을 억제하는 물질의 연구는 주로 iNOS의 효소활성을 특이적으로 저해하는 물질의 개발에 집중되어 연구되었는데, 전구체인 L-아르기닌(arginin)의 유도체, L-시트룰린(citrulline)의 유도체, 아미노구아니딘(aminoguanidine) 유도체, 이소싸이오우레아(isothiourea) 유도체 등의 개발연구가 진행되고 있다(Babu, B.R.B., Griffith O.W.,Current Opinion in Chemical Biology, 2:491-500, 1998).

NF-κB의 활성화를 억제하는 화합물로는 커쿠민(curcumin),캡사이신(capsacin), 카페산(caffeic acid) 유도체, 테트란드린(tetrandrine), 생귀나린(sanguinarine) 등이 보고되었으며, 대표적인 글루코코르티코이드계 소염제인 덱사메타손(dexamethason)은 iNOS 유전자의 발현을 억제하여 NO의 생성을 저해하는데 덱사메타손의 이러한 활성 기전은 IκB 단백질의 합성을 유도하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 iNOS의 유전자 전사를 억제하는 것으로 보고되었다(De Vera, M.E. et al.,Am. J. Physiol., 273:1290-1296, 1997).

NF-κB의 활성을 저해하는 천연에서 분리한 화합물들은 작용기전에 따라 분류해 보면 파테노라이드같이 IκB의 분해나 IκB 인산화를 저해하여 NF-κB 활성을 억제하는 화합물과, IκB의 분해나 NF-κB의 핵으로의 이동에는 영향이 없으나 NF-κB가 DNA에 결합하는 단계를 저해하는 화합물(카메바카우린, 프로스타글란딘유도체), 그리고 NF-κB가 DNA에 결합은 하지만 NF-κB의 목표유전자의 전사유도활성을 저해하는 화합물인 트립토라이드(triptolide)가 있다[Kye Young Lee et. al.,J Biol. Chem.1999,274, 13451-13455].

한편, 노박덩쿨, 메역순나무를 포함하는 노박덩굴과 식물군에서는 수많은 퀴논 메싸이드(quinone methide)계 화합물이 보고되었으나, 이들 화합물이 LPS 또는 TNF로 자극 받은 세포주에서 NO 또는 PGE₂의 생산을 억제한다는 보고나 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제한다는 보고는 없었다.

이에 본 발명자들은 NF-κB의 활성을 저해하게 되면 다양한 염증질환, 면역질환, 및 암 치료에 이용 가능하다는 사실에 착안하여 다년간 연구를 수행한 결과, 노박덩굴(Celastrus orbiculatus)로부터 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 및 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물을 분리하였고, 상기 화합물이 IκB의 인산화를 저해하고 IκB의 분해를 억제하여 NF-κB의 활성을 억제함에 따라, 염증 유도효소인 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하고, TNF의 염증유도 시이토카인의 생성을 강력히 저해한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 또는 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제로서의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 또는 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 노박덩굴(Celastrus orbiculatus)을 C₁∼ C₄알코올로 추출하고, 얻어진 추출물을 유기용매로 재추출하여 얻어진 재추출물을 분리 및 정제하여 얻어지며 세래스트롤을 포함하는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 하는 NF-κB 억제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 하는 염증질환제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 세래스트롤이 NO의 생성 억제를 측정한 것이고,

도 2는 본 발명의 세래스트롤이 TNF-α의 생성억제를 측정한 것이고,

도 3은 본 발명의 세래스트롤이 TNF-α의 세포독성의 증강 효과에 대한 측정한 것이고,

도 4a는 본 발명의 세래스트롤의 TNF-α의 자극에 의한 NF-κB(nuclear factor kappa B) 활성의 억제효과를 측정한 결과이고,

도 4b는 본 발명의 세래스트롤의 PMA 자극에 의한 NF-κB 활성의 억제효과를 측정한 결과이고,

도 4c는 본 발명의 세래스트롤의 LPS 자극에 의한 NF-κB 활성의 억제효과를 측정한 결과이고,

도 5a는 본 발명의 세래스트롤이 TNF-α의 자극의 조건에서 NF-κB 활성화단계의 IκB 단백질의 분해억제 효과를 측정한 결과이고,

도 5b는 본 발명의 세래스트롤이 PMA 자극의 조건에서 NF-κB 활성화 단계의 IκB 단백질의 분해 억제효과를 측정한 결과이고,

도 6은 본 발명의 TNF-α의 자극의 조건에서 세래스트롤의 IκB 분해억제효과가 IκB의 인산화를 억제하는 효과에 의한 결과임을 보여주는 것이고,

도 7a는 본 발명의 세래스트롤이 염증유발인자 NO의 유전자 iNOS 의 mRNA 발현에 대한 억제효과를 나타낸 것이고,

도 7b는 본 발명의 세래스트롤이 TNF-α의 유전자 mRNA의 발현에 대한 억제효과를 나타낸 것이고,

도 8은 본 발명의 NF-κB에 의해 발현이 조절되는 세포사멸 억제유전자인 Bfl-1/A1의 RNA 발현 억제효과를 노던 블럿(Northern blot)으로 확인한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 이들의 화합물을 포함하는 노박덩쿨 추출물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제로서의 용도를 제공한다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

(상기 식에서, R₁은 수소, 퓨라노익산기, 또는 아세트산기, R₂는 퓨라노익산기 또는 벤조익산기, R₃는 수소 또는 아세트산기 및 R₄는 퓨라노익산기 또는 벤조익산기이다.)

상기 화학식 1, 화학식 2, 또는 화학식 3의 화합물은 노박덩쿨, 메역순나무를 포함하는 노박덩굴과 식물군에서 분리 및 정제될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 일례로 노박덩쿨(Celastrus orbiculatus)를 알코올로 추출하고, 얻어진 알코올 추출물을 유기용매로 재추출하고, 얻어진 재추출물을 분리 및 정제하여 얻어진다.

상기 사용되는 알코올은 C₁∼ C₄알코올이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메탄올이 사용된다.

또한, 상기 단계에서는 얻은 알코올 추출물을 재추출하는 유기용매로는 에틸아세테이트, 노르말-헥산, 클로로포름, 및 디클로로메탄에서 선택되어 사용되는 것이며, 바람직하게는 디클로로메탄을 사용하는 것이다.

상기 단계에서 얻어진 추출물은 당 분야에 해당하는 지식을 가진 자가 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있으며, 본 발명은 크로마토그래피(chromatography)를 2 ∼ 3 회 반복하여 실시하는 것이고, 바람직하게는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피을 이용하는 것이다.

상기 방법으로 분리 및 정제된 본 발명의 화합물은

1) 화학식 1의 세래스트롤(celastrol),

2) 화학식 2의 세래판올(celaphanol), 및

3) 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계(sesquiterpene ester) 화합물이며, 보다 구체적으로, 상기 세스퀴테르펜 에스터계 화합물은

화학식 3a으로 표시되는 1β,8β-디아세톡시-6α,9α-디퓨로일옥시-디하이드로-β-아가로퓨란(1β,8β-diacetoxy-6α,9α-difuroyloxy-dihydro-β-agarofuran:오비큐린 H), 화학식 3b로 표시되는 1β-아세톡시-2β,6α,9α-트리퓨로일옥시-디하이드로-β-아가로퓨란(1β-acetoxy-2β,6α,9α-trifuroyloxy-dihydro-β-agarofuran:오비큐린 I), 화학식 3c로 표시되는 1β,2β-디아세톡시-6α,9α-디벤조일옥시-디하이드로-β-아가로퓨란(1β,2β-diacetoxy-6α,9α-dibenzoyloxy-dihydro-β-agarofuran:오비큐린 A), 화학식 3d로 표시되는 1β-아세톡시-6α,9α-디퓨로일옥시-디하이드로-β-아가로퓨란(1β-acetoxy-6α,9α-difuroyloxy-dihydro-β-agarofuran:오비큐린 D), 화학식 3e로 표시되는 1β,2β-디아세톡시-6α-퓨로일옥시-9α-벤조일옥시디하이드로-β-아가로퓨란(1β,2β-diacetoxy-6α-furoyloxy-9α-benzoyloxydihydro-β-agarofuran:오비큐린 E), 화학식 3f로 표시되는 1β-에세톡시-2β,6α-디퓨로일옥시-9α-벤조일옥시디하이드로-β-아가로퓨란(1β-acetoxy-2β,6α-difuroyloxy-9α-benzoyloxydihydro-β-agarofuran:오비큐린 F)이다.

본 발명은 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 이들을 포함하는 노박덩쿨 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제를 제공한다.

본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 화합물 또는 노박덩쿨 추출물의 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제에 대한 효능을 조사하기 위하여, LPS로 자극한 후, 염증유발물질인 NO 와 TNF-α의 생성 및 이들의 발현을 조절하는 전사인자 NF-κB의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과, NF-κB의 활성을 강력하게 억제함으로써 NO의 생성도 억제된다. 바람직하게는 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 또는 화학식 3a, 화학식 3b, 및 화학식 3d의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물이며, 가장 바람직하게는 화학식 1의 세래스트롤이 강력하게 NF-κB의 활성을 억제한다.

도 1은 화학식 1의 세래스트롤에 대한 농도별로 NO 생성을 관찰한 결과, 첨가된 화학식 1의 세래스트롤의 농도에 의존하여 NO 생성 억제할 뿐 만 아니라,도 2의 결과에서 보는 바와 같이, 화학식 1의 세래스트롤이 염증유발인자 중의 하나로 세포살상 효과, 프로스타글란딘 및 사이토카인의 생산을 유도하는 TNF-α의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 결과를 보이고 있다.

도 3에서 보는 바와 같이, TNF-α를 첨가하지 않고 화학식 1의 세래스트롤만을 첨가하면 100%의 세포 생존율을 유지하는 반면, TNF-α및 화학식 1의 세래스트롤을 동시에 처리하면 세래스트롤에 대해여 농도의존적으로 세포의 생존율을 감소시키는 결과를 보임으로써, TNF-α의 세포독성을 더욱 증가시키는 효과가 있다.

따라서, 화학식 1의 세래스트롤은 NF-κB의 활성을 억제하는 메카니즘에 의하여 TNF-α에 의한 암세포의 살상효과를 증가시킴으로써, 암 치료제 및 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로서 이용될 수 있다.

도 4a내지도 4c에서는 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤이 TNF-α, PMA, LPS등의 외부자극의 종류에 무관하게 NF-κB의 DNA 결합 활성을 농도에 의존하여 억제된다.

또한, 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤이 NF-κB 활성을 억제하는 효과는 IκB의 인산화를 저해하여 IκB의 분해 자체를 억제함으로써, 세포사멸 억제 유전자 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성을 억제하며, 유전자 발현을 억제할 뿐만아니라 iNOS 및 TNF-α의 생성을 강력하게 저해한다.

본 발명의 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 또는 이들을 포함하는 노박덩쿨 추출물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법이 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 화합물에적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제호는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화합물 중에서 선택된 최소의 하나를 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 화학식 1의 세래스트롤의 경우는 10 ∼ 500 mg/kg이고, 바람직하기로는 50 ∼ 250 mg/kg 이며, 화학식 2의 세래판올의 경우는 50 ∼ 500 mg/kg 이고, 바람직하기로는 50 ∼ 250 mg/kg 이고, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물의 경우는 50 ∼ 500 mg/kg이고, 50 ∼ 250 mg/kg이고, 노박덩쿨 추출물의 경우 50 ∼ 500 mg/kg이고, 바람직하기로는 50 ∼ 250 mg/kg 이다. 또한, 상기 각 화합물 및 노박덩쿨 추출물은 하루 1 ∼ 3 회 투여될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 노박덩쿨 추출물을 임상에 적용하기 위하여 실험용 생쥐에 대한 독성실험을 수행한 결과, 독성변화는 관찰되지 않았고 경구 투여 최소 치사량인 (LD₅₀)은 0.5 g/kg 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 화합물 및 노박덩쿨을 유효성분으로 함유하여 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 노박덩굴에서 활성물질의 분리방법

건조시킨 1.5 kg의 노박덩굴(Celastrus orbiculatus) 뿌리를 3 ℓ의 메탄올을 이용하여 상온에서 3 회 반복 추출하고 감압 농축하여 145 g의 메탄올 추출물을 얻었고, 상기 메탄올 추출물을 2 ℓ의 물에 현탁한 후, 2 ℓ의 디클로로메탄을 이용하여 3 회 추출하여 55 g의 디클로로메탄 추출물을 얻었다. 상기 디클로로메탄 추출물을 90% 메탄올에 용해한 후, n-헥산으로 1 회 세척하고 디클로로메탄-메탄올 단계 농도구배(step gradient) 용매 시스템(50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100% 메탄올)을 적용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 7 개의 분획을 얻었다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻은 7 개의 분획 중 다섯 번째 분획 4 g을 메틸렌클로라이드:메탄올(1:1) 용매 조성으로 세파덱스 LH-20(sephadex LH-20) 컬럼크로마토그래피를 실시하여 2 g의 화학식 1의 세래스트롤 및 70 mg의 화학식 2의 세래판올을 얻었다.

또한, 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻은 7 개의 분획 중 네 번째의 활성분획(4.2 g)을 메탄올의 용매를 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였고, 다시 6 개의 분획(4-1, 4-2, 4-3, 4-4, 4-5, 4-6)을 얻었다.

상기 분획 중 3.1 g의 4-3 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 n-헥산:에틸아세테이트의 단계 농도구배 용매시스템 (20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 100% 에틸아세테이트)을 적용하여 다시 10 개의 분획(4-3-1, 4-3-2,....., 4-3-10)을 얻었다.

상기 분획 4-3-8 분획에서 prep-HPLC를 실시하여 15 mg의 화학식 3b (오비큐린 I) 및 86 mg의 화학식 3d (오비큐린 D)를 분리하였고 분획 4-3-9 분획을 prep-HPLC를 실시하여 70 mg의 화학식 3a (오비큐린 H), 37 mg의 화학식 3c (오비큐린 A), 15 mg의 화학식 3e (오비큐린 E), 40 mg의 화학식 3f (오비큐린 F)를 분리하였다.

본 발명의 노박덩쿨에서 분리한 화합물 및 이에 대한 물리적 성질을 하기표 1에 기재하였다.

노박덩쿨에서 분리한 화합물 및 이에 대한 물리적 성질

화학식	화합물	물리적 성질
1		붉은 색; m.p. 202 ∼ 204℃; UV (메탄올) 206, 245, 289, 429 nm; IR(KBr): 2990, 1705, 1582, 1445, 1226, 872 cm-1; HR-MS m/z 450.2783(M+, C29H38O4).
2		노란색; UV(메탄올) 256, 286, 316 nm; IR(KBr) 3413, 1701, 1655, 1296, 1025 cm-1; HR-MS m/z:288.1363(M+, C17H20O4).
3a오비큐린H		흰색 무결정 분말; m. p. 111 ∼ 113℃; [a] 25D 19.5°(c 1.00, 메탄올); UV (메탄올) 207 (4.26), 241 (3.94) nm; IR (KBr) 2965, 2940, 1730, 1715, 1578, 1504, 1372, 1308, 1227, 1161, 1078, 1022, 970, 878, 762cm-1; ESI-MS m/z 581.4(M+Na)+; HR-FAB-MS m/z 559.2186(M+H)+(calcd for C29H35O11, 559.2179).
3b오비큐린I		흰색 바늘형 결정상(needle crystal); mp 253 ∼ 255℃; [a] 25D +39.2°(c 0.63, 메탄올); UV (메탄올) 209 (4.72), 241 (4.28)nm; IR (KBr) 2952, 2928, 1747, 1718, 1578, 1504, 1382, 1305, 1232, 1160, 1080, 1008, 964, 866, 760cm-1; ESI-MS m/z 633.0(M+Na]+; HR-FAB-MS m/z 633.1942(M+H)+(calcd for C32H34O12Na, 633.1948).
3c오비큐린A		흰색 무결정 분말; m. p. 122 ∼ 125℃; [a] 25D 9.5°(c 0.21, 메탄올); UV (메탄올) 202 (4.26), 231 (4.42), 275 (3.29), 281 (3.22) nm; IR (KBr) 2969, 2929, 1747, 1716, 1602, 1452, 1274, 1247, 1099, 1022, 713cm-1; ESI-MS m/z 578 (M)+; HR-FAB-MS m/z 578.2532 (calcd for C33H38O9, 578.2515).
3d오비큐린D		흰색 무결정분말; m. p. 76 ∼ 78℃; [a]25D +16.87 (c 2.49, 메탄올; UV (메탄올) 204 (4.56), 230 (4.435), 275 (3.22)nm; EI-MS m/z 500 [M]+(5), 294 (13), 206 (17), 159 (18), 95 (100), 67 (14); HR-FAB-MS m/z 500.2053 (calcd for C27H32O9, 500.2046)
3e오비큐린E		흰색무결정 분말: mp 134∼136℃; [a]25D +34.67 (c1.24, 메탄올); UV (메탄올) 202 (4.48), 227 (4.08), 280 (3.20), nm; EI-MSm/z568 [M]+(10), 352 (26), 292 (14), 237 (41), 217 (20), 175 (29), 105 (100), 95 (100), 77 (34); HRFABMSm/z568.2302 (calcd for C31H36O10, 568.2308)

화학식	화합물	물리적 성질
3f오비큐린F		흰색무결정분말: mp 98∼100℃; [a]25D +45.0 (c0.80, 메탄올); UV (메탄올) 202 (4.81), 229 (4.45), 275 (3.55), nm; EIMSm/z620 [M]+(18), 404 (16), 237 (25), 175 (18), 105 (100), 95 (100) 77 (42); HRFABMSm/z620.2248 (calcd for C34H36O11, 620.2258)
상기 식에서,이다.

<실험예 1> 노박덩굴에서 분리한 화합물의 NO 생성 억제효과 측정

상기 실시예 1의 노박덩굴에서 분리된 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3의 화합물이 신경세포의 사멸 및 면역질환을 유발하는 NO의 생성억제를 조사하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

상기 실시예 1의 노박덩굴에서 분리된 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3의 화합물을 각각 LPS로 자극한 뮤린 대식세포(murine macrophage)에 첨가하여 NO의 생성량을 측정하는 것으로, 보다 구체적으로는 Raw 264.7 뮤린 대식세포 (ATCC TIB-71)를 둘베코의 변형된 필수 배지(Dulbecco's Modified Essential Medium ;이하 "DMEM"라 한다)에 현탁하여 96 웰 플레이트(well plate)에 1 ×10⁵세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3 시간동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 상기 대식세포에서 NO 생성을 유발하기 위하여 LPS를 최종 농도 1 ㎍/㎖로 첨가하여, 상기 화학식 1의 화합물은 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 μM/㎖ 농도로 첨가하고, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물은 300,100, 30, 10, 3 , 1 μM/㎖ 농도로 첨가하여 24 시간 배양하였다.

배양액 중에 LPS로 생산이 유도된 NO의 농도를 측정하기 위하여, 상기 배양액을 회수하여 원심분리하고 각 배양액 100 ㎕에 그리이스 시약 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 10 분간 방치 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 그리이스 시약은 1% 설파닐아마이드(sulfanilamide)를 5% 인산(phosphoric acid)에 녹인 용액과 0.1% 나프틸에틸렌디아민ㆍHCl(naphthylethyldiamineㆍHCl)의 수용액을 1:1로 섞어 제조하였다.

표준 NO 생성량을 측정하기 위하여, NaNO₂를 농도별로 희석한 후, 상기 그리이스 시약과 반응시켜 흡광도를 측정하여 검정곡선을 작성하였다. 따라서, NO₂(nitrite)의 양을 측정하여 상기 검정곡선을 이용, 환산함으로써 실시예 1의 노박덩쿨에서 분리된 각 화합물에 의한 NO 생성을 50% 억제하는 농도를 계산하여 그 결과를표 2에 나타내었다.

노박덩굴에서 분리한 화합물의 NO 생성 억제효과

화합물	NO 생성 50% 억제농도(μM)
1	0.23 ± 0.02
2	32.6 ± 1.4
3a	50.4 ± 0.8
3b	51.2 ± 1.3
3c	>300
3d	43.6 ± 1.2
3e	>300
3f	>300
아미노구아니딘	16.3 ± 0.4

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 노박덩굴에서 분리한 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 화합물이 LPS로 자극한 세포에서 NO의 생성을 억제함을 확인하였고, 구체적으로, 화학식 1의 세래스트롤은 NO 생성 억제농도 IC₅₀(inhibition concentration)가 0.23 μM이며, 화학식 2의 세래판올은 32.6 μM이고, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계류 화합물 중 화학식 3a의 오비큐린 H, 화학식 3b의 오비큐린 I, 및 화학식 3d의 오비큐린 D은 각각 50.4 μM, 51.2 μM, 43.6 μM을 보이고 있다.

가장 바람직하게는 화학식 1의 세래스트롤이 NO 생성을 가장 강력하게 억제하였고, 대조군으로 사용한 iNOS 효소저해제인 아미노구아니딘(aminoguanidine)의 억제효과 정도와 근접한 효과를 보이고 있다.

도 1은 화학식 1의 세래스트롤의 농도 별로 NO 생성을 관찰한 결과, 첨가된 화학식 1의 세래스트롤의 농도에 의존하여 NO 생성을 억제하였으며, 1.0 μM/㎖의 농도인 경우는 LPS로 자극되지 않은 세포의 수준으로 억제되었다.

<실험예 2> 노박덩굴에서 분리한 화합물의 NF-κB 활성 억제효과

상기 실시예 1의 노박덩굴에서 분리한 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 화합물이 LPS로 자극된 세포에서 NF-κB의 활성억제을 조사하기 위하여 하기와 같은 실시하였다.

NF-κB에 의존적인 리포터 유전자의 발현을 검색할 수 있는 RAW-NF-AP(대한민국 특허 제99-6025호)를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 ×10⁵세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3 시간 동안 배양하여 웰 표면에 세포를 부착하였다. 세포 부착 후 1 ㎍/㎖의 LPS로 자극하고, 상기 실시예 1에서 분리된 화학식 1의 세래스트롤을 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 μM/㎖ 농도로 자극하고, 화학식 2 및 화학식 3의 화합물의 각각 300,100, 30, 10, 3 , 1 μM/㎖ 농도로 첨가하여 16 시간동안 배양하였다.

세포 배양액을 원심분리하여 상층액만을 NF-κB의 활성에 의해 발현되는 분비형 알칼라인 포스파타아제(secreted alkaline phosphatase, 이하 "SEAP"라고 한다)의 활성을 측정하여표 3에 나타내었다.

노박덩굴에서 분리한 화합물의 NF-κB 활성 억제효과

화학식	NF-κB 활성 50%억제농도(μM)
1	0.27 ± 0.01
2	18.2 ± 0.97
3a	33.5 ± 1.1
3b	61.5 ± 1.4
3c	>300
3d	36.7 ± 1.5
3e	>300
3f	>300

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤 및 화학식 2의 세래판올이 LPS로 자극된 세포에서 SEAP의 활성을 강력하게 억제함으로써 NF-κB의 활성을 억제하였다. 보다 상세하게는 화학식 1의 세래스트롤은 50% SEAP 활성억제 농도가 0.27 μM 이고, 화학식 2의 세래판올은 18.2 μM 이였다.

또한, 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 중 화학식 3a의 오비큐린 H, 화학식 3d의 오비큐린 D가 50% SEAP 활성을 효과적으로 억제함으로써 NF-κB의 활성이 억제함을 확인하였다.

상기 결과로부터 본 발명의 노박덩쿨에서 분리된 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 및 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물은 염증유발 인자의 발현에 중심적인 역할을 하며 암세포의 사멸을 억제하는 단백질의 발현을 조절하는 NF-κB의 활성을 저해하였다.

바람직하게는 화학식 1의 세래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 및 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 중 화학식 3a의 오비큐린 H, 화학식 3b의 오비큐린 I, 화학식 3d의 오비큐린 D가 NF-κB의 활성을 효과적으로 저해하였으며, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 세래스트롤이 강력하게 NF-κB의 활성을 저해함으로써, 본 발명의 화합물은 염증질환 치료제, 면역질환 치료제 또는 암 치료제로 사용될 수 있다.

<실험예 3> 세래스트롤의 TNF-α생성 억제효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1의 세래스트롤이 염증유발 인자 중의 하나로서, 세포 살상효과, 프로스타글란딘 및 사이토카인 생성을 유도하는 TNF-α의 생성 억제를 조사하기 위하여 하기와 같이 실시하였다

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 ×10⁵세포/㎖로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3 시간동안 세포를 배양하여 부착하였다. 세포 부착 후 1 ㎍/㎖의 LPS를 첨가하였고 0, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 ㎍/㎖의 세래스트롤을 로 첨가하여 16 시간동안 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상층액만을 회수하고 배양액내 TNF-α의 양을 효소면역 분석법으로 정량하여 그 결과를도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 화학식 1의 세래스트롤 첨가에 의하여 TNF-α의 생성은 농도 의존적으로 억제되었고, TNF 생성억제 농도 IC₅₀은 0.1 ㎍/㎖ 이하로 강력하게 억제하였으며, 1 ㎍/㎖에서는 TNF 생성이 완전히 차단되었다.

<실험예 4> 셀라스트롤의 TNF-α의 세포독성 증강효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1의 세래스트롤이 TNF-α의 세포독성 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같은 실시하였다.

MCF-7 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1×10⁴세포/㎖ 농도로분주하고 37℃, 5% CO₂에서 24 시간동안 배양하였다. 상기 웰에 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1. 3 ㎍/㎖의 농도로 화학식 1의 셀라스트롤을 첨가하여 30 분동안 반응시킨 후 세포독성을 유발하기 위하여 20 ng/㎖의 TNF-α를 처리하였다.

상기 세포를 48 시간동안 배양한 후 3-(4,5-디메틸싸이아졸-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 가하여 4 시간동안 배양시켜 형성된 포르마잔 다이(formazan dye)의 양을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3에서 보는 바와 같이, TNF-α를 첨가하지 않고 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 ㎍/㎖의 화학식 1의 세래스트롤을 첨가하면 세포 생존도에 영향을 미치지 않고 100%를 유지하는 반면에 20 ng/㎖의 TNF-α와 화학식 1의 세래스트롤을 동시에 처리하면 세래스트롤 농도 의존적으로 세포의 생존도를 감소시킨다.

1 ㎍/㎖의 화학식 1의 세래스트롤을 첨가함으로써, 세포의 성장이 10% 정도 감소하지만 TNF-α를 같이 처리하면 세포의 성장이 40% 정도로 감소되었다.

따라서, 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤은 TNF-α의 세포독성을 더욱 증가시키는 효과를 유발함으로써, 화학식 1의 세래스트롤은 NF-κB의 활성이 억제하는 메카니즘에 의해 TNF-α에 의한 암세포의 살상효과를 증강시킬 수 있고 NF-κB의 활성이 높아진 암의 치료 및 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로서 활용될 수 있음을 확인하였다.

<실험예 5> 세래스트롤의 NF-κB의 DNA 결합 활성에 미치는 영향 조사

상기 실험예에서 NF-κB 활성에 대해서 억제효과가 우수한 화학식 1의 세래스트롤이 NF-κB의 DNA 결합에 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

구체적으로, 상기 실시예에서 얻은 화학식 1의 세래스트롤을 져캣(Jurkat) T 세포에 각각 0, 0.1, 0.3, 1 ㎍/㎖로 첨가하여 30 분동안 전처리한 후 20 ng/㎖의 TNF-α 및 50 ng/㎖의 PMA로 90 분동안 자극하였다. 또한 U937 세포에도 세래스트롤을 30 분 전처리하고 10 ㎍/㎖의 LPS로 30 분동안 자극하였다.

상기 기술한 각각 세포로부터 분리한 20 ㎍의 핵 추출물을 방사성 동위원소로 표지된서열번호 1로 기재되는 이중나선 올리고핵산(double strand oligonucleotide)과 반응시킨 후 비변성 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing electrophoresis gel)에 전기영동하여 분리하고 와트만 3MM 셀룰로오즈지(Whattman 3MM cellulose)에 옮긴 후 x-ray 필름으로 감광하였다.

그 결과도 4a내지도 4c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤은 TNF-α, PMA, LPS등의 자극 물질의 종류 또는 세포의 종류에 관계없이 NF-κB의 DNA 결합 활성을 농도 의존적으로 억제되었고 특히, 각 경우의 1 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우는 NF-κB의 DNA 결합 활성이 완전히 차단됨을 확인하였다.

<실험예 6> 세래스트롤의 IκB 분해 저해효과

NF-κB의 활성화는 IκB의 분해에 기인하므로, 외부자극에 의한 NF-κB 저해활성을 갖는 화학식 1의 세래스트롤이 IκB의 분해 자체를 억제하는지 알기 위하여 웨스턴 블럿으로 조사하였다.

1 ㎍/㎖의 세래스트롤을 져캣(Jurkat) T 세포에 첨가하여 30 분동안 전처리한 후 20 ng/㎖의 TNF-α또는 50 ng/㎖의 PMA를 가하고 15 분, 30 분, 또는 60 분 후에 배양된 세포로부터 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.5), 1% 논이뎃(Nonidet) P40, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM EDTA, 1 mM 패닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethyl sulfonyl fluoride), 2 g/㎖ 루펩틴(leupeptin), 2 g/㎖ 아프로티닌(aprotinin)으로 구성된 단백질 추출 완충용액을 사용하여 시간별 시료 처리군에서 단백질 추출물을 제조하였으며, 각각 50 ㎍씩 변성 폴리아크릴아마이드 젤(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동하였다. 전기영동한 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane)에 흡착시킨 후 5% 탈지유(skim milk)로 2 시간동안 블록킹(blocking)하고 IκB-α항체(New England Biolabs Inc, Beverly, MA, USA)와 반응시켰다. 항체와 결합한 막을 PBS 완충용액으로 세척하고 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)로 표지된 2 차 항체와 반응시킨 후, 다시 PBS 완충용액으로 세척한 후 ECL 시스템(ECL system, Amersham Pharmacia Biotec)을 이용하여 IκB 단백질의 분해정도를 검출하였다.

상기도 5a또는도 5b의 결과로부터 IκB-α는 TNF-α또는 PMA 처리후 30 분안에 완전히 분해되었지만 화학식 1의 세래스트롤을 첨가하면 IκB의 분해가 완전하게 억제되었다.

<실험예 7> 세래스트롤의 IκB 인산화 저해효과

외부자극에 의한 IκB 분해는 IκB의 써린(serine) 잔기 2 개가 IκB 인산화효소 결합체로 인해 인산화된 후 유도되므로 화학식 1의 세래스트롤이 IκB의 인산화를 억제하는지를 조사하였다.

상기 실험예 1의 조건에 1 ㎍/㎖의 세래스트롤로 전처리한 후 20 ng/㎖의 TNF-α를 15 분, 30 분, 또는 60 분의 시간별로 자극한 세포에서 제조한 단백질용액에서 인산화된 IκB의 양을 phospho-specific IκB 항체를 이용하여 웨스턴 블럿으로 조사하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 화학식 1의 세래스트롤은 IκB의 인산화를 억제하였고, 상기 결과에서 관찰된 화학식 1의 세래스트롤이 NF-κB 활성을 억제하는 효과는 화학식 1의 세래스트롤이 IκB의 인산화 자체를 억제함으로써, IκB의 분해를 억제하는 작용 기전으로 설명할 수 있었다.

<실험예 8> 세래스트롤의 iNOS 및 TNF-α의 mRNA 발현 억제효과

본 발명의 노박덩쿨에서 분리한 화학식 1의 새래스트롤이 iNOS 및 TNF-α의 발현에 대해 미치는 영향을 하기와 같이 조사하였다.

RAW 264.7 뮤린 대식세포를 각각 0, 0.01, 0.1, 0.3, 1 ㎍/㎖의 세래스트롤로 첨가하여 30 분동안 전처리한 후 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하고 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 배양한 후 전체 RNA(total RNA)를 분리하여 이를 주형 RNA(template RNA)로 사용하여서열번호 2와3으로 기재되는 iNOS에 대한 프라이머 및서열번호 4와5로 기재되는 TNF-α에 대한 프라이머를 이용하여 역전사효소-폴리머레이즈 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 수행하였다.

그 결과도 7a및도 7b에 나타낸 바와 같이, 화학식 1의 세래스트롤 첨가에 의해 iNOS 및 TNF-α의 mRNA 발현은 감소하였으며 특히, 1 ㎍/㎖의 세래스트롤 농도로 첨가한 경우는 iNOS 및 TNF-α의 mRNA 발현이 완전히 억제되었다.

<실험예 9> 세래스트롤의 Bfl-1/A1의 mRNA 발현 억제효과

본 발명의 노박덩쿨에서 분리한 화학식 1의 새래스트롤이 세포사멸 억제유전자인 Bfl-1/A1의 mRNA 발현에 대해 미치는 영향을 하기와 같이 조사하였다.

HT1080 세포를 배양하고 0, 0.1, 0.3, 1 ㎍/㎖의 세래스트롤 농도로 첨가하여 30 분동안 반응시킨 후, 20 ng/㎖의 TNF-α로 3 시간동안 자극하여 Bfl-1/A1의 발현을 유도하였다. 대조군 및 세래스트롤 처리군 세포로부터 전체 RNA를 분리하여서열번호 5으로 기재되는 프로브(probe)로 노던 블럿 분석을 수행하여 Bfl-1/A1의 mRNA 발현을 측정하였다.

도 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤을 첨가함으로써, TNF-α에 의해 유도되는 Bcl-2 패밀리의 세포사멸 억제(antiapoptotic) 유전자인 Bfl-1/A1의 mRNA 발현이 농도에 의존하여 억제되었다.

<실험예 10> 세래스트롤의 급성 독성실험

본 발명의 화합물을 임상적으로 활용하기 위하여 하기와 같은 방법으로 급성독성을 조사하였다.

6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트(rat)를 군당 5 마리씩으로 나누어 본 발명의 세래스트롤을 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 0.5 g/kg/15㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과 본 발명의 화학식 1의 세래스트롤은 동물에서는 혈액검사, 혈액생화학적검사 및 부검소견 등에서 독성이 관찰되지 않았고, 투여한 동물에서는 특기할만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 실험한 화합물은 래트에서 0.5 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 0.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 화학식 1의 새래스트롤, 화학식 2의 세래판올, 및 화학식 3의 세스퀴테르펜 에스터계 화합물 및 이들을 포함하는 노박덩쿨 추출물노박덩굴이 IκB의 인산화를 저해하고 IκB의 분해 자체를 억제하여 세포사멸 억제 유전자 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성을 억제함으로써, 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라 iNOS, COX-2, TNF의 생성을 강력하게 저해하고, 암세포에서 TNF-α세포독성을 증강시키는 화합물로서 급성 독성실험에서 안전한 물질로 판단됨으로써, 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로도 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A therapeutic agent containing celastrol, celaphanol, cesquterpen ester or an extract of celastrus obiculatus as an effective ingredient for the treatment of inflammatory disease, immune disease or cancers <130> 1p-11-20c <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA binding sequence of NF-kB <400> 1 agttgagggg actttcccag gc 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS sense <400> 2 cagaagcaga atgtgaccat c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS antisense <400> 3 cttctggtcg atgtcatgag c 21 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF sense <400> 4 ggcaggtcta ctttggagtc attgc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF antisense <400> 5 acattcgagg ctccagtgaa ttcgg 25 <210> 6 <211> 737 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ccagctcaag actttgctct ccaccaggca gaagatgaca gactgtgaat ttggatatat 60 ttacaggctg gctcaggact atctgcagtg cgtcctacag ataccacaac ctggatcagg 120 tccaagcaaa acgtccagag tgctacaaaa tgttgcgttc tcagtccaaa aagaagtgga 180 aaagaatctg aagtcatgct tggacaatgt taatgttgtg tccgtagaca ctgccagaac 240 actattcaac caagtgatgg aaaaggagtt tgaagacggc atcattaact ggggaagaat 300 tgtaaccata tttgcatttg aaggtattct catcaagaaa cttctacgac agcaaattgc 360 cccggatgtg gatacctata aggagatttc atattttgtt gcggagttca taatgaataa 420 cacaggagaa tggataaggc aaaacggagg ctgggaaaat ggctttgtaa agaagtttga 480 acctaaatct ggctggatga cttttctaga agttacagga aagatctgtg aaatgctatc 540 tctcctgaag caatactgtt gaccagaaag gacactccat attgtgaaac cggcctaatt 600 tttctgactg atatggaaac gattgccaac acatacttct acttttaaat aaacaacttt 660 gatgatgtaa cttgaccttc cagagttatg gaaattttgt ccccatgtaa tgaataaatt 720 gtatgtattt ttctcta 737

Claims (13)

1. 삭제
2. 하기 화학식 2로 표시되는 세래판올을 유효성분으로 함유하는 염증질환제.

   화학식 2
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 제 2 항의 세래판올을 유효성분으로 함유하는 면역질환 치료제.
11. 삭제
12. 삭제
13. 제 2 항의 세래판올을 유효성분으로 함유하는 암 치료제.