KR100402714B1

KR100402714B1 - 디테르펜계 화합물을 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로사용하는 신규한 용도

Info

Publication number: KR100402714B1
Application number: KR10-2002-0082517A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 이정형; 김항섭; 홍영수; 황방연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2002-12-23
Publication date: 2003-11-13
Also published as: KR20030003215A

Abstract

본 발명은 디테르펜계 화합물을 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 사용하는 신규한 용도에 관한 것으로, 구체적으로 항염증 및 항암활성이 우수한 카우란 디테르펜계 화합물 카메바닌(kamebanin, 화학식 1), 카메바세탈 A(kamebacetal A, 화학식 2), 카메바카우린(kamebakaurin, 화학식 3) 및 이그지사닌 A(exisanin A, 화학식 4)를 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 사용하는 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물은 염증반응과 면역질환을 유발하는 NO(nitric oxide), 프로스타글란딘(prostaglandin), TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 활성을 억제할 뿐만 아니라 염증유발인자와 세포사멸에 연관된 NF-κB의 활성을 보다 효과적으로 억제함으로써 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디테르펜계 화합물을 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 사용하는 신규한 용도{A novel use of diterpene compounds as therapeutic agents of inflammation, immune disease and cancer}

본 발명은 디테르펜계 화합물을 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 사용하는 신규한 용도에 관한 것으로, 구체적으로 항염증 및 항암활성이 우수한 카우란 디테르펜계 화합물 카메바닌(kamebanin, 화학식 1), 카메바세탈 A(kamebacetal A, 화학식 2), 카메바카우린(kamebakaurin, 화학식 3) 및 이그지사닌 A(exisanin A, 화학식 4)를 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로 사용하는 신규한 용도에 관한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

LPS(lipopolysaccharide), 염증유발인자 및 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질을 과도하게 유도하여 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식거부반응, 자가면역질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.

염증유발물질 중 하나인 NO는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며 세포살상과 살균작용 이외에도 다양한 생리활성을 나타내는데, 특히, 혈관 내피세포의 이완작용에 있어서 혈압의 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS, 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 유도형 산화질소 합성효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthetase)의 발현을 유도하여 많은 양의 NO를 4 내지 6시간 동안 계속적으로 생성시키는데 이와 같이 생성된 과도한 양의 NO는 상기와 같은 질환들을 유발한다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높으며, 또한 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 사용될 수 있다.

또 다른 염증유발물질인 PGE₂, PGF2a 그리고 PGI₂와 같은 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 상기 호르몬의 율속효소인 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린 인도메타신 같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

마지막으로 TNF-α는 BCG, LPS 및 염증유발인자에 의해 활성화된 대식세포와 섬유아 세포 등에서 생산되어 세포살상 효과, 프로스타글란딘 및 IL-1, IL-6와 같은 사이토카인(cytokine)의 생산을 유도한다. 종양괴사인자로 발견된 TNF-α는 류마티스 관절염, 장기이식거부반응 등의 자가면역질환, 천식, 아토피성피부염 등의 알러지성 염증질환 및 패혈증, 급성간질환 등의 급성면역질환 등에 대한 관련성이 보고되면서 TNF-α의 합성을 억제하는 화합물에 대한 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다. 최근의 보고에 의하면, TNF-α 수용체의 유전자가 손상된 쥐는 LPS에 의한 치사독성에 저항성이 있으며 TNF-α의 항체를 투여한 쥐는 관절염이나 LPS의 독성을 예방하는 효과가 있음이 알려졌다(Beutler B.,Science,229:869, 1985; Pfeffer K et al.,Cell, 73;457, 1993).

상기 NO의 과잉생성과 관련된 iNOS 유전자의 발현이나 프로스타글란딘 및 TNF-α의 생산에는 전사인자인 NF-κB(nuclear factor Kappa B)의 활성화가 필요한데 NF-κB는 세포사멸, 면역반응 및 염증반응 등의 다양한 세포 반응에 관련된 단백질들의 발현에 작용하는 것으로 알려져 있다.

NF-κB는 p50 단백질과 p65 단백질의 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)로 구성되어 있으며 세포질에서 그 활성 억제단백질인 IκB와 결합하여 불활성화된 상태로 존재한다. 그러나, TNF-α, IL-1, LPS, 자유기(free radical), 방사선 조사 등의 다양한 자극을 받게되면 IκB 카이네이즈(IκB kinase, IKK)가 활성화되어 NF-κB와 결합한 IκB를 인산화시켜 분해함으로써 IκB로부터 유리된 NF-κB가 핵으로 들어가 다양한 염증 또는 면역반응관련 유전자의 전사인자로 기능을 하게 된다(P. A. Baeueric, D. Baltimore,Cell, 98:13-20, 1996).

NF-κB는 iNOS의 발현에 작용하는 것 이외에도 염증반응에서 COX-2의 발현과 TNF-α 등의 각종 사이토카인, E-셀렉틴(E-selectin), I-CAM, V-CAM 등의 접착분자 발현에 중요한 전사인자일 뿐만 아니라 TNF-α 수용체족(TNF-α receptor family)과 같은 사멸 수용체(death receptor)를 통한 세포사멸 신호를 조절하는 역할을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다(F.H. Epstein,New Engl. J. Med., 336(15):1066-1071, 1997; T. Collins, M. A. Read et al.,FASEB J., 9:899-909, 1995). 그 예로서 사멸수용체(death receptor)를 매개로 하여 세포사멸 억제활성을 나타내는 단백질로 알려진 Mn-SOD, A20(zinc finger protein), IAP(inhibitor of apoptosis protein) 등의 발현조절에 NF-κB가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(D.J. Van Antwerp, S.J. Martin et al.,Trends in Cell Biology, 8:107-111, 1998; C.-Y. Wang, M.W. Mayo et al.,Science,281:1680-1683, 1998).

TNF-α나 아드리아마이신(adriamycin)으로 암세포를 처리하면 NF-κB가 활성화되어 상기 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하게 되는데, 이러한 NF-κB의 활성화를 억제하면 세포사멸경로가 활성화되어 약물의 감수성이 증가하게 된다(A.A. Beg, D.Baltimore,Science, 274:782-784, 1996; C.-Y. Wang, M.W. Mayo, A.S. Baldwin Jr.,Science, 274:784-789, 1996). 대표적인 항염증제로 알려진 글루코코르티코이드(glucocorticoid)류나 아스피린류는 항염증작용의 중요한 기전으로 NF-κB의 활성화 저해/또는 NO나 프로스타글란딘의 생성을 억제하는 작용이 있으며 또한, 한방이나 민간에서 항염증제로 사용되어 왔던 약물들도 NF-κB의 활성을 저해하는 것에 의해 그 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(E. Kopp, S. Ghosh,Science, 265:956-959, 1994; A. Ray, K.E. Prefontaine,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:752-756, 1994). 이와 같이 NF-κB는 외부의 유해한 자극에 반응하여 활성화되어 염증유발인자의 발현에 중심적인 역할을 할 뿐만 아니라 신경 세포의 사멸에 관련되어 있으며 TNF-α나 항암제에 의해 유도되는 암세포의 사멸을 억제하는 기능을 하는 단백질의 발현에도 중요한 역할을 한다.

한편, 상기 NO, NF-κB 및 TNF-α의 활성을 억제하는 약물들이 보고되었는데그 개발현황을 살펴보면 하기와 같다.

NO의 생산을 억제하는 물질의 연구는 주로 iNOS의 효소활성을 특이적으로 저해하는 물질의 개발에 집중되어 연구되었는데, 전구체인 L-아르기닌(arginin)의 유도체, L-시트룰린(citrulline)의 유도체, 아미노구아니딘(aminoguanidine) 유도체, 이소치오우레아(isothiourea) 유도체 등의 개발연구가 진행되고 있다(Babu, B.R.B., Griffith O.W.,Current Opinion in Chemical Biology, 2:491-500, 1998).

NF-κB의 활성화를 억제하는 화합물로는 커쿠민(curcumin), 캡사이신(capsacin), 카페산(caffeic acid) 유도체, 테트란드린(tetrandrine), 생귀나린(sanguinarine) 등이 보고되었으며, 대표적인 글루코코르티코이드계 소염제인 덱사메타손(dexamethason)은 iNOS 유전자의 발현을 억제하여 NO의 생성을 저해하는데 덱사메타손의 이러한 활성 기전은 I-κB 단백질의 합성을 유도하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 iNOS의 유전자 전사를 억제하는 것으로 보고 되었다(De Vera, M.E. et al.,Am. J. Physiol., 273:1290-1296, 1997).

TNF-α의 생산을 억제하는 의약품의 개발연구 현황을 살펴보면 사이토카인으로서 IL-4, IL-10, TGF-β(tumor growth factor-β) 등의 활성이 보고되었고 항 TNF-α 항체와 수용성 TNF-α 수용체를 이용한 임상실험이 진행되고 있다. 합성 화합물로는 펜톡시필린(pentoxifylline), 탈리도마이드(thaliodomide), 피롤리딘 디티오카바메이트(pyrrolidine dithiocarbamate), 바이사이클릭 이미다졸(bicyclic imidazole)인 SKF 86002 등의 개발연구가 진행되고 있지만 아직 치료제로 개발된 TNF-α 생성 억제 화합물은 없다(A. Eigler et al.,Immunology Today, 18:487-492, 1997).

한편, 연명초나 근연식물에서는 200여종의 디테르펜계 화합물이 보고되었으나 이들 화합물이 LPS로 자극 받은 세포주에서 NO의 생산, PGE₂의 생산, TNF의 생산을 억제한다는 보고나 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제한다는 보고는 없었다.

이에 본 발명자들은 염증유발인자의 생성을 억제하는 화합물을 개발하기 위하여 연구하던 중 연명초(Isodon japonicus) 지상부의 메탄올 추출물에서 분리한 카우란 디테르펜(kaurane diterpene)계 화합물인 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(kamebacetal A), 카메바카우린(kamebkaurine) 및 이그지사닌 A(exisanin A)가 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-κB의 활성화를 억제할 뿐만 아니라 NO, 프로스타글란딘 및 TNF-α의 생성을 강하게 억제하는 것을 발견하고 상기 4종의 화합물이 염증질환, 면역질환 및 암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 염증질환 및 면역질환 치료제로 뿐 아니라 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로 유용하게 사용될 수 있는 화합물로서 항염증 황성 및 항암 효과가 우수한 디테르펜계 화합물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(camebacetal A), 카메바카우린(kamebakaurin) 및 이그지사닌 A(exisanin A)의 NF-κB(nuclear factor Kappa B) 활성화에 대한 억제효과를 측정한 결과이고,

도 2a는 본 발명의 카우란 디테르펜 화합물인 카메바카우린이 NF-κB에 의해 발현이 조절되는 세포사멸 억제유전자인 Bfl-1/A1의 RNA 발현 억제효과를 노던 블럿(Northern blot)으로 확인한 결과이고,

(1) ; MCF-7 세포에서 Bfl-1/A1의 RNA 발현 억제효과

(2) ; HT1080 세포에서 Bfl-1/A1의 RNA 발현 억제효과

도 2b는 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바카우린이 NF-κB에 의해 발현이 조절되는 세포사멸 억제유전자인 cIAP-1 및 cIAP-2의 발현은 억제하지만 NF-κB에 의해 발현이 조절되지 않는 세포사멸 억제유전자인 Bcl-2와 Bax의 발현에는 영향을 미치지 않음을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이고,

도 3a는 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바카우린이iNOS(inducible nitric oxide sythetase)와 COX-2(cyclooxygenaes 2)의 mRNA 발현에 대한 억제효과를 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)로 확인한 결과를 나타낸 것이고,

도 3b는 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바카우린이 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 억제효과를 웨스턴 블럿(Western blot) 분석으로 확인한 결과이고,

도 4는 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바카우린이 TNF-α에 의해 유도되는 세포독성에 대한 증강효과를 측정한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항염증 활성 및 항암 활성이 우수한 카우란 디테르펜계 화합물인 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(kamebacetal A), 카메바카우린(kamebakaurin), 이그지사닌 A(exisanin A) 및 약학적으로 허용되는 그들의 염을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효 성분으로 하여 독성이 적고 효과가 우수한 염증질환, 면역질환 및 암의 치료와 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 화합물을 염증질환, 면역질환 및 암의 치료와 예방에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 카우란 디테르펜계 화합물인 화학식 1로 표시되는 카메바닌(kamebanin), 화학식 2로 표시되는 카메바세탈 A(kamebacetal A), 화학식 3으로 표시되는 카메바카우린(kamebakaurin), 화학식 4로 표시되는 이그지사닌 A(exisanin A) 및 약학적으로 허용되는 그들의 염을 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

본 발명자들은 연명초 지상부의 메탄올 추출물로부터 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(kamebacetal A), 카메바카우린(kamebakaurine) 및 이그지사닌 A(exisanin A) 4 종류의 디테르펜계 화합물을 분리하였다.

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물의 분리방법은,

1) 연명초(Isodon japonicus)를 유기용매로 추출하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 추출물을 유기용매로 재추출하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 추출물을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 정제하는 단계로 구성된다.

단계 1)에서는 연명초를 유기용매로 3회 반복하여 추출하였고 이를 농축시켜 유기용매 추출물을 얻었다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 유기용매로 메탄올(methanol)을 사용하여 메탄올 추출물을 얻었다.

단계 2)에서는 단계 1)의 추출물을 유기용매와 물을 이용하여 분획하여 유기용매 추출물을 얻었는데, 이 때 유기용매로는 디클로로메탄(dichloromethane)을 사용하는 것이 바람직하다.

단계 3)에서는 상기 추출물을 정제하기 위하여 메탄올에 용해한 후 n-헥산으로 세척하였고, 세척이 완료된 추출물을 실리카겔(silica gel) 컬럼 크로마토그래피 1에 흡착시키고 디클로로메탄-메탄올로 구성되는 단계 농도구배 용매시스템을 적용하여 6개의 분획을 얻었다.

상기에서 얻은 6개의 분획 중 분획 2를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 2에 흡착시키고 헥산-아세톤으로 구성되는 단계 농도구배 용매시스템을 적용하여 4개의 분획 2-A, 2-B, 2-C, 2-D를 얻었다. 이로부터 얻은 분획 2-B로 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화학식 1의 카메바닌을 분리하였다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1의 분획 중 분획 3을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 3에 흡착시켜 헥산-에틸아세테이트로 구성되는 단계 농도구배 용매시스템을 이용하여 4개의 분획 3-A, 3-B, 3-C, 3-D를 얻을 수 있었다. 이로부터 얻은 분획 3-B와 3-C로부터 각각 화학식 2의 카메바세탈 A와 화학식 3의 카메바카우린을 분리하였다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1로부터 얻은 분획 4를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 4에 흡착시키고 n-헥산-아세톤으로 구성되는 단계 농도구배 용매시스템을 이용하여 화학식 4의 이그지사닌 A를 분리하였다.

상기 방법으로 분리된 디테르펜계 화합물의 수율은 카메바닌 15 mg, 카메바세탈 A 62 mg, 카메바카우린 21 mg 및 이스지사닌 A 135 mg으로 카메바카우린의 수율이 가장 우수하였다.

본 발명의 화학식 1 내지 4의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 화학식 1 내지 4의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 하여 독성이 적고 효과가 우수한 염증질환, 면역질환 및 암의 치료와 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1 내지 4의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제호는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물의 유효 용량은 카메바카우린인 경우에는 10 - 500 mg/kg 이고, 50 - 250 mg/kg 이 바람직하며, 카메바닌인 경우에는 10-500 mg/kg 이고, 50 - 250 mg/kg 이 바람직하며, 카메바세탈 A인 경우에는 10 - 500 mg/kg 이고, 50 - 250 mg/kg 이 바람직하며, 이그지사닌 A인 경우에는 10 - 500 mg/kg 이고, 50 - 250 mg/kg 이 바람직하다. 또한, 상기 각 화합물은 하루 1 - 3회 투여될 수 있다.

상기 디테르펜계 화합물의 염증질환 및 면역질환 치료제로서의 효능을 조사하기 위하여, 상기 4종류의 화합물을 LPS로 자극한 대식세포주에 각각 농도별로 첨가하여 염증유발물질인 NO, 프로스타글란딘 E₂, TNF-α의 생성 및 이들의 발현을 조절하는 전사인자 NF-κB의 활성화에 미치는 영향을 조사한 결과 LPS에 의한 NO의 생성은 상기 4종류의 화합물 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다(표 1참조). 또한, 상기 디테르펜계 화합물이 다른 염증유발물질인 프로스타글란딘 E₂에 미치는 영향을 효소면역 분석법(enzymeimmunometric assay)으로 조사한 결과, 프로스타글란딘 E₂의 생성 역시 첨가된 카우란 디테르펜 화합물의 농도에 의존적으로 억제되었다(표 2참조).

본 발명의 디테르펜계 화합물이 염증유발인자 중의 하나로 세포살상 효과, 프로스타글란딘 및 사이토카인의 생산을 유도하는 TNF-α에 미치는 영향을 효소면역분석법으로 조사한 결과, TNF-α의 생성은 첨가된 카우란 디테르펜 화합물의 농도에 의존적으로 억제되었다(표 3참조).

NO나 프로스타글란딘 E₂, TNF 생성에 필수적인 iNOS 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 조절하는 전사인자 NF-κB의 활성에 대한 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물의 억제효과를 조사한 결과, LPS에 의해 유도된 NF-κB의 활성을 리포트하는 SEAP의 활성은 카우란 디테르펜 화합물 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제 되었다(표 4참조). 또한, 상기 결과를 확인하기 위하여 NF-κB의 DNA 결합 활성에 상기 카우란 디테르펜 화합물이 미치는 영향을 젤-쉬프트 분석(gel-shift assay)으로 조사한 결과도 1에 나타낸 바와 같이 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 DNA 결합 활성은 첨가된 카우란 디테르펜계 화합물의 농도에 의존적으로 감소함을 알 수 있었다.

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 치료제로 활용하기 위하여 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성실험을 수행한 결과 독성변화는 관찰되지 않았고 경구 투여 최소 치사량인 (LD₅₀)은 0.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기 결과로부터 본 발명의 4종의 카우란 디테르펜계 화합물은 효과적인 염증질환 및 면역질환 치료제로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 4종의 카우란 디테르펜계 화합물 중 카메바카우린을 사용하여 염증질환 및 면역질환 치료제의 용도와 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로서의 용도를 제시하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 염증유발물질인 NO와 프로스타글란딘의 생성은 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 방법과 웨스턴 블럿 분석으로 조사한 결과,도 2a에서 볼 수 있듯이 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현은 카메바카우린 1 ㎍/㎖부터 억제됨을 알 수 있고,도 2b에서는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 처리한 카메바카우린의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 실험쥐를 이용한 관절염 모델에서 카메바카우린의 항 염증효과를 실험한 결과, 푸타키(Futaki, N. et al.,General Pharmacology, 24:105-110, 1993) 등의 방법을 사용한 아쥬반트 관절염(adjuvant arthritis) 실헙 동물에서 투여된 카메바카우린의 농도에 의존적으로 관절염이 억제되었다.

아울러, 상기 카메바카우린이 세포사멸 억제유전자인 Bfl-1/A1, cIAP-1 및 cIAP-2의 발현에 미치는 영향을 노던 블럿 분석으로 조사한 결과, 첨가한 카메바카우린의 농도에 의존적으로 Bfl-1/A1의 발현이 저해됨을 알 수 있었다(도 3a). 또한, 상기 세포로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿 방법으로 cIAP-1 및 cIAP-2의 단백질 발현을 측정한 결과 첨가한 카메바카우린의 농도에 의존적으로cIAP-1 및 cIAP-2의 발현이 저해됨을 알 수 있었다(도 3b).

또한, TNF-α의 세포독성 활성에 카메바카우린이 미치는 영향을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolum bromide) 측정 방법으로 분석한 결과, TNF-α의 세포독성 활성이 카메바카우린의 첨가에 의해 증가됨을 알 수 있었다(도 4).

상기 결과로부터 본 발명의 카메바카우린은 염증질환 및 면역질환 치료제로 뿐만 아니라 암 치료제로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

구체적으로, 상기 카메바카우린은 산화질소 또는 프로스타글란딘의 과잉생산을 억제하는 것을 특징으로 할 뿐만 아니라 염증유발인자인 사이토카인, 접착분자, 세포사멸 억제인자 등의 발현에 중요한 작용을 하는 NF-κB의 활성화를 억제하는것을 특징으로 하는 염증질환 및 면역질환 치료제로 사용될 수 있으며, 상기 염증질환 및 면역질환은 관절염, 페혈증, 염증, 자가 면역질환 및 신경세포사멸에 의한 질환 등을 포함할 수 있다. 아울러, 상기 카메바카우린은 세포사멸 억제인자 등의 발현에 중요한 작용을 하는 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 치료제로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 카우란 디테르펜계 화합물의 분리방법

건조시킨 연명초(Isodon japonicus) 4.3 kg을 메탄올(methanol)로 추출하되 3회 반복하여 감압 농축시켜 메탄올 추출물 203 g을 얻을 수 있었고 이를 디클로로메탄(dichloromethan)과 물을 이용하여 분획하였다.

이로부터 디클로로메탄 추출물 84.6 g을 얻을 수 있었고 이를 90% 메탄올에 용해한 후 n-헥산(n-hexan)으로 3회 세척하였다. 세척된 90% 메탄올 농축액 18 g을 디클로로메탄-메탄올 단계농도구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) 1을 실시하여 6개의 분획을 얻었다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1에 의해 얻은 2g의 분획 2를 실리카겔컬럼 크로마토그래피 2에 흡착시키고 헥산-아세톤 단계 농도구배 용매시스템을 5:1, 3:1, 3:2, 0:1의 비율로 적용하여 4개의 분획 2-A, 2-B, 2-C, 2-D를 얻었다.

상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 2의 분획 중 분획 2-B로 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화학식 1의 카메바닌 15 mg을 얻을 수 있었다.

또한, 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1에 의해 얻은 3 g의 분획 3을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 3에 흡착시켜 헥산-에틸아세테이트 단계 농도구배 용매시스템을 이용하여 4개의 분획 3-A, 3-B, 3-C, 3-D를 얻을 수 있었다. 상기 분획 중 분획 3-B로부터 화학식 2의 카메바세탈 A를 62 mg, 상기 분획 3-C로부터 화학식 3의 카메바카우린을 210 mg 얻을 수 있었다.

아울러, 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1로부터 얻은 분획 4를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 4에 흡착시키고 헥산-아세톤 단계 농도구배 용매시스템을 적용하여 화학식 4의 이그지사닌 A를 135 mg 얻을 수 있었다.

상기 방법으로 분리된 디테르펜계 화합물의 수율은 카메바닌 15 mg, 카메바세탈 A 62 mg, 카메바카우린 210 mg 및 이그지사닌 A 135 mg으로 카메바카우린의 수율이 가장 우수하였다.

<실시예 2> 카우란 디테르펜계 화합물의 NO 생성 억제효과 측정

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 얻은 카우란 디테르펜계 화합물이 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 NO(nitric oxide)의 생성을 억제하는지 조사하기 위하여, 연명초에서 분리한 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(kamebacetal A), 카메바카우린(kamebakaurin) 및 이그지사닌 A(exisanin A) 4종의 카우란 디테르펜(kaurane diterpene)계 화합물을 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 뮤린 대식세포(murine macrophage)에 첨가하여 NO₂(nitrite)의 생성량을 측정하였다.

구체적으로, Raw 264.7 뮤린 대식세포(ATCC TIB-71)를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트(well plate)에 1×10⁵세포/well 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 상기 대식세포에서 NO 생성을 유발하기 위하여 LPS를 최종 농도 1 ㎍/㎖로 첨가하고 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 각각 3, 0.3, 0.03 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양액 중에 LPS에 의해 생산이 유도된 NO로부터 축적된 최종 산화물인 NO₂의 생성량을 다음과 같이 측정하였다. 상기 배양액을 회수하여 원심분리하고 각 배양액 100 ㎕에 그리이스 시약 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 10분간 방치 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 그리이스 시약은 1% 설파닐아미드(sulfanilamide)를 5% 인산(phosphoric acid)에 녹인 용액과 0.1% 나프틸에틸렌다이아민·HCl(naphthylethyldiamine·HCl)의 수용액을 1:1로 섞어 제조하였다. 표준 NO 생성량을 측정하기 위하여, NaNO₂를 농도별로 희석한 후 상기 그리이스 시약과 반응시켜 흡광도를 측정하였고 이로부터 표준 NO 생성 커브를 작성하였다. 각 화합물 첨가에 의한 NO의 생성량을 표준 NO 생성커브를 이용하여 환산하였고 그 결과를표 1에 나타내었다.

카우란 디테르펜계 화합물의 NO 생성 억제효과

샘플(sample)	농도(㎍/㎖)	NO(μM)	억제도(%)	억제농도(IC₅₀, μM)
(-)LPS(+)LPS카메바닌카메바세탈 A카메바카우린이그지사닌 A	30.30.0330.30.0330.30.0330.30.03	3.3±0.349.6±1.83.6±0.34.6±0.623.4±1.33.3±0.719.9±3.738.5±4.83.6±0.716.1±2.829.1±4.26.7±0.822.2±2.332.5±3.5	100.00.099.397.256.5100.064.223.999.372.444.292.559.337.0	0.060.580.150.35

표 1에 나타낸 바와 같이, LPS에 의한 NO의 생성은 카우란 디테르펜계 화합물 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 관찰할 수 있었고 NO 생성 억제농도 IC₅₀(inhibition concentration)은 카메바닌이 0.06 μM, 카메바세탈 A가 0.58 μM, 카메바카우린이 0.15 μM, 카메바닌 A가 0.35 μM로 소량의 화합물 첨가로도 NO 생성이 상당히 억제되는 효과를 나타냈으며 특히, 카메바세탈 A를 3 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우는 LPS를 전혀 처리하지 않은 음성 대조군의 수준으로 NO의 생성을 억제하였다.

<실시예 3> 카우란 디테르펜계 화합물의 프로스타글란딘 E ₂ 생성 억제효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물이 염증유발물질인 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제하는지 조사하기 위하여, LPS로 자극한 뮤린 대식세포에 연명초에서 분리한 디테르펜계 화합물을 첨가하여 프로스타글란딘 E₂의 생성량을 측정하였다.

구체적으로, Raw 264.7 세포를 DMEM 배지로 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 × 10⁵세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 18시간 동안 세포를 배양하였다. 상기 각 웰에 아스피린(aspirin)을 500 μM로 첨가하여 3시간 동안 반응시켜 프로스타글란딘의 율속 효소인 사이클로옥시게나아제-1(cyclooxygenase-1)을 불활성화 시킨 후 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액으로 2회 세척하였다. 상기 세포에 LPS를 최종농도 1 ㎍/㎖로 첨가하고 각각의 카우란 디테르펜계 화합물을 0, 0.03, 0.3, 3 ㎍/㎖로 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 16시간 배양하였다. 원심분리로 배양 상층액만을 분리한 후 배양액 내 프로스타글란딘의 양을 면역효소 분석법(enzymeimmunometric assay)으로 정량하였고 그 결과를표 2에 나타냈다.

카우란 디테르펜계 화합물의 프로스타글란딘 E₂생성 억제효과

샘플	농도(㎍/㎖)	PGE₂(ng/㎖)	억제도(%)	억제농도(IC₅₀, μM)
(-)LPS(+)LPS카메바닌카메바세탈 A카메바카우린이그지사닌 A	30.30.0330.30.0330.30.0330.30.03	1.1±0.511.9±1.40.7±0.14.0±0.314.4±2.22.7±0.49.8±1.413.2±0.81.8±0.49.2±0.210.7±1.25.7±0.710.7±1.313.7±0.3	100.00.0104.273.9-22.585.619.6-11.395.19.7-7.157.711.7-16.1	0.882.802.635.37

표 2에서 보면, 프로스타글란딘 E₂의 생성은 카우란 디테르펜계 화합물의 첨가시 농도 의존적으로 억제됨을 관찰할 수 있었고 억제농도 IC₅₀은 카메바닌이 0.88 μM, 카메바세탈 A가 2.80 μM, 카메바카우린이 2.63 μM, 카메바닌 A가 5.37 μM로 소량의 화합물 첨가로도 프로스타글란딘 E_2의생성이 상당히 억제됨을 알 수있다. 카메바카우린은 3 ㎍/㎖로 첨가한 경우에 95% 이상의 억제효과를 나타냈고 특히, 카메바닌은 3 ㎍/㎖로 첨가한 경우 LPS를 처리하지 않은 음성 대조군의 수준으로 억제 효과를 나타냈다.

<실시예 4> 카우란 디테르펜계 화합물의 TNF-α 생성 억제효과 측정

상기 실시예 얻은 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물이 염증유발인자 중의 하나로 세포 살상효과, 프로스타글란딘 및 사이토카인 생성을 유도하는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 생성을 효과적으로 억제하는지 조사하기 위하여, 연명초에서 분리한 카우란 디테르펜계 화합물을 LPS로 자극한 뮤린 대식세포에 첨가하여 TNF-α의 생성량을 측정하였다.

구체적으로, Raw 264.7 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 × 10⁵세포/㎖로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 세포를 배양하여 부착하였다. 세포 부착 후 LPS를 최종농도 1 ㎍/㎖로 첨가하였고 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 각각 0, 0.03, 0.3, 3 ㎍/㎖로 첨가하여 16시간 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상층액만을 회수하고 배양액내 TNF-α의 양을 효소면역 분석법으로 정량하여 그 결과를표 3에 나타냈다.

카우란 디테르펜 화합물의 TNF-α 생성 억제효과

샘플	농도(㎍/㎖)	TNF-α(pg/㎖)	억제도(%)	억제농도(IC₅₀, μM)
(-)LPS(+)LPS카메바닌카메바세탈 A카메바카우린이그지사닌 A	30.30.0330.30.0330.30.0330.30.03	17.1±1.01669.0±129.019.8±0.7805.6±195.41835.0±158.838.9±1.0691.4±152.71495.0±239.729.6±5.3654.4±29.41407.0±255.6103.2±12.8936.1±0.01243.0±195.6	100.00.099.852.3-10.098.759.210.599.261.315.994.844.425.8	1.000.600.530.61

표 3에 나타낸 바와 같이, TNF-α의 생성은 카우란 디테르펜계 화합물의 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제되었고 억제농도 IC₅₀은 카메바닌이 1.00 μM, 카메바세탈 A가 0.60 μM, 카메바카우린이 0.53 μM, 카메바닌 A가 0.61 μM로 소량의 화합물 첨가에 의해서 TNF-α의 생성이 효과적으로 억제됨을 알 수 있다. 또한, 각 화합물을 3 ㎍/㎖로 첨가한 경우는 모두 90% 이상의 억제효과를 나타냈다.

본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 실시예 3의 결과로부터 연명초로부터 분리한 카우란 디테르펜계 화합물이 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유도하는 NO, 염증유발물질인 프로스타글란딘 및 TNF-α의 생성을 효과적으로 억제함을 확인하고 상기 카우란 디테르펜계 화합물이 염증질환 및 면역질환 치료제로 개발될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 카우란 디테르펜계 화합물의 NF-κB 활성 억제효과

상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물이 NO, 프로스타글란딘 및 TNF-α의 생성에 필수적인 iNOS 및 사이크로옥시게나아제의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 효과적으로 억제하는지 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<5-1> 카우란 디테르펜계 화합물의 NF-κB 활성 억제효과 측정

NF-κB에 의존적인 리포터 유전자의 발현을 검색할 수 있는 RAW-NF-AP(대한민국 특허출원 제 99-6025호)를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 × 10⁵세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양하여 웰 표면에 세포를 부착하였다. 세포 부착 후 LPS를 1 ㎍/㎖로 첨가하고 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 각각 0.03, 0.3, 3 ㎍/㎖로 첨가하여 16시간 동안 배양하였다. 세포 배양액을 원심분리하여 상층액만을 NF-κB의 활성에 의해 발현되는 분비형 알칼라인 포스파타아제(secreted alkaline phosphatase, SEAP)의 활성을 측정하여표 4에 나타냈다.

카우란 디테르펜계 화합물의 NF-κB 활성 억제효과

샘플	농도(㎍/㎖)	SEAP 활성억제도(%)	억제농도(IC₅₀, μM)
(-)LPS(+)LPS카메바닌카메바세탈 A카메바카우린이그지사닌 A	30.30.0330.30.0330.30.0330.30.03	100099.748.50.6110.462.21.396.433.12.593.719.4-2.6	0.722.451.111.66

표 4에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 활성을 나타내는 SEAP의 활성은 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물의 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제되었고 4 종류의 화합물 모두 3 ㎍/㎖로 첨가한 경우에 90% 이상 SEAP 활성을 억제하였으며 특히, 카메바세탈 A는 LPS를 첨가하지 않은 음성 대조군의 수준으로 억제효과를 나타냈다.

<5-2> 카우란 디테르펜계 화합물이 NF-κB의 DNA 결합 활성에 미치는 영향 조사

상기 실시예 <5-1>로부터 카우란 디테르펜계 화합물이 NF-κB 활성을 억제함을 확인한 본 발명자들은 NF-κB의 DNA 결합 활성에 카우란 디테르펜계 화합물이 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, Raw 264.7 뮤린 대식세포에 본 발명의 화합물을 각각 0, 1, 5, 10 ㎍/㎖로 첨가하여 30분 동안 전처리한 후 1 ㎍/㎖의 LPS로 30분 동안 자극하였다. 상기 대식세포로부터 분리한 핵 추출물 20 ㎍을 방사성 동위원소로 표지된서열번호 1로 기재되는 이중나선 올리고핵산(double strand oligonucleotide)과 반응시킨 후 비변성 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing electrophoresis gel)에 전기영동 하여 분리하고 와트만 3MM 셀룰로오즈지(Whattman 3MM cellulose)에 옮긴 후 x-ray 필름으로 감광하였다.

그 결과도 1에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 유도된 NF-κB의 DNA 결합 활성이 카우란 디테르펜계 화합물에 의해 농도 의존적으로 감소하였고 특히, 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우는 NF-κB의 DNA 결합 활성이 완전히 차단됨을 확인하였다.

도 1의 화합물 1은 카메바닌을, 화합물 2는 카메바세탈 A를, 화합물 3은 카메바카우린을 그리고 화합물 4는 이그지사닌 A를 각각 나타낸다.

상기 결과로부터 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물은 염증유발인자의 발현에 중심적인 역할을 하며 암세포의 사멸을 억제하는 단백질의 발현을 조절하는 NF-κB의 활성을 저해함으로써 염증질환 치료제 및 면역질환 치료제로 개발될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 6> 카우란 디테르펜계 화합물의 항 염증효과 측정

상기 실시예로부터 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물이 LPS로 자극된 뮤린 대식세포에서 NO, 프로스타글란딘, TNF의 생성 및 NF-κB의 활성을 강력하게 억제함을 알 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 카우란 디테르펜계 화합물의 염증질환 치료제로서의 효능을 조사하기 위하여 실험동물을 이용한 관절염 모델에서 푸타키(Futaki, N. et al.,General pharmacology, 24:105-110, 1993)등의 방법으로 항 염증효과를 실험하였다.

관절염이 유발된 실험동물을 준비하기 위하여, 180 g 정도의 웅성 스프라그-돌리 래트(Sprague-Dawley rat)에 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 0.1% 되도록 현탁시킨 프레우드 아쥬반트(Freud adjuvant, Sigma) 용액을 래트의 왼쪽 발바닥의 피내에 0.05 ㎖ 주입하였다. 주입 후 15일째에 래트의 오른 쪽 발 부피를 용적측정장치 (plethysmometer, Ugo-Basile, Italy)로 측정하여 오른 쪽 발에 관절염이 유발된 래트만을 선발하여 새롭게 실험 군당 6마리씩 4군으로 나눴다. 본 발명의 4종류의 카우란 디테르펜계 화합물의 투여는 관절염 유발후 16일째부터 22일째까지 하루에 한 번씩 래트 체중 1 kg당 3, 10, 20 ㎎씩 0.1% 메틸셀룰로오즈(methylcellulose)용액에 현탁하여 각각의 실험군에 경구로 투여하였다. 23일째 되는 날 발 부피를 측정하여 이를 대조군과 비교함으로써 관절염 억제율을 계산하였고 그 결과를표 5에 나타냈다.

카우란 디테르펜계 화합물의 염증억제 효과

약물	용량(경구투여)	억제율(%)
카메바닌	3 mg/kg/day10 mg/kg/day20 mg/kg/day	30±1550±1268±14
커메바세탈 A	3 mg/kg/day10 mg/kg/day20 mg/kg/day	33±1855±1069±14
카메바카우린	3 mg/kg/day10 mg/kg/day20 mg/kg/day	35±1959±1171±17
이그지사닌 A	3 mg/kg/day10 mg/kg/day20 mg/kg/day	33±1452±1264±13

표 5에 나타낸 바와 같이, 투여한 카우란 디테르펜계 화합물의 농도에 의존적으로 관절염이 억제되었고 화합물 상호간의 억제율은 큰 차이가 없었으며 이로부터 염증치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> 카우란 디테르펜계 화합물의 세포사멸 억제유전자의 발현 억제효과 측정

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물이 세포사멸 억제유전자인 Bfl-1/A1,cIAP-1 및 cIAP-2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<7-1> 카우란 디테르펜계 화하물이 Bfl-1/A1의 mRNA 발현에 미치는 영향

MCF-7 세포주(ATCC HTB 22, 유방암 세포주)와 HT-1080 세포주(ATCC CCL 121, 섬유아세포육종)를 각각 배양하고 본 발명의 4종류의 카우란 디테르펜계 화합물을 1, 5, 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 30분간 반응시킨 후 Bfl-1/A1의 발현을 유도하도록 20 ng/㎖의 TNF-α로 3시간 동안 자극하였다. 대조군 및 상기 시료 처리군 세포로부터 전체 RNA를 분리하여 노던 블럿 분석을 수행하여 Bfl-1/A1의 mRNA 발현을 측정하였다. 우선, 20 ㎍의 전체 RNA를 2.2 M 포름알데하이드(formaldehyde)를 함유한 1% 아가로스젤로 전기영동한 후 나일론 막(nylon membrane)에 흡착시키고 자외선으로 고정화하였다. 상기 나일론 막을³²P로 표지된, Bfl-1/A1 유전자의 c-DNA에 특이적인서열번호 2로 기재되는 프로브(probe)로 혼성화(hybridization)시키고 나이론 막에 결합하지 않은 프로브를 SDS(sodium doodecyl sulfate)를 포함한 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액으로 세척한 후 x-ray 필름에 노출시켰다.

그 결과, 추출된 전체 RNA 양은 대조군 및 시료 처리군에서 일정하였고 TNF-α에 의해 유도되는 Bcl-2 패밀리의 세포사멸억제(antiapoptotic) 유전자인 Bfl-1/A1의 mRNA 발현은 처리한 카우란 디테르펜계 화합물의 농도에 의존적으로 억제되었으며 상기 결과 중 카메바카우린의 결과를도 2a에 나타냈고도 2a의 (1)은 MCF-7 세포에서 Bfl-1/A1의 RNA발현 억제효과 나타내고도 2a의 (2)는 HT1080 세포에서 Bfl-1/A1의 RNA발현 억제효과 나타낸다.

<7-2> 카우란 디테르펜계 화합물이 cIAP-1 및 cIAP-2의 단백질 발현에 미치는 영향

MCF-7 세포주와 HT-1080 세포주를 각각 배양하고 본 발명의 4종류의 카우란 디테르펜계 화합물을 1, 5, 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 30분간 반응시킨 후 cIAP-1 및 cIAP-2의 단백질 발현을 유도하도록 20 ng/㎖의 TNF-α로 6시간 동안 자극하였다. 배양된 세포로부터 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl, pH 7.5), 1% 논이뎃(Nonidet) P40, 150 mM 염화 나트륨(NaCl), 1 mM EDTA, 1 mM 패닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethyl sulfonyl fluoride), 2 g/㎖ 루펩틴(leupeptin), 2 g/㎖ 아프로티닌(aprotinin)으로 구성된 단백질 추출 완충용액을 사용하여 단백질 추출물을 제조하였고 대조군 및 시료 처리군의 단백질 추출물을 각각 50 ㎍씩 변성 폴리아크릴아마이드 젤(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동 하였다. 전기영동한 단백질을 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane)에 흡착시킨 후 5% 탈지유(skim milk)로 2시간 동안 블록킹(blocking)하고 cIAP-1, cIAP-2, bcl-2 및 bax 항체(Santa Cruz Biochemicals)와 반응시켰다. 항체와 결합한 막을 PBS 완충용액으로 세척하고 호스래디뒤 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)로 표지된 2차 항체와 반응시키고다시 PBS 완충용액으로 세척한 후 ECL 시스템(ECL system, Amersham Pharmacia Biotec)을 이용하여 단백질을 검출하였다.

그 결과, TNF-α에 의해 유도되며 NF-κB에 의해 발현이 조절되는 cIAP-1과 cIAP-2의 단백질 발현은 처리한 카우란 디테르펜계 화합물의 농도에 의존적으로 억제되었으나 NF-κB에 의해 발현이 조절되지 않는 세포사멸억제 유전자인 Bcl-2와 전세포사멸(proapoptotic) 유전자인 Bax의 발현에는 영향이 없었으며 상기 결과 중 카메바카우린의 결과를도 2b에 나타냈다.

상기 결과로부터 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물은 TNF-α에 의해 발현이 유도되고 NF-κB의 타겟(target) 유전자인 c-IAP-1, c-IAP-2 및 Bfl-1/A1의 발현을 억제함으로써 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로 활용될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 8> 카우란 디테르펜계 화합물의 급성 독성실험

본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 치료제로서 임상적으로 활용하기 위하여 하기와 같은 방법으로 급성독성을 조사하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 래트(rat)를 군당 5마리씩으로 나누어 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물을 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 0.5 g/kg/15㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물 중 카메바닌을 투여한 동물에서는 혈액검사, 형액생화학적검사 및 부검소견 등에서 독성이 관찰되었고, 나머지 카메바세탈 A, 카메바카우린 및 이그지사닌 A를 각각 투여한 동물에서는 특기할만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 실험한 화합물은 카메바닌을 제외하고는 모두 래트에서 0.5 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 0.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<실시예 9> 카메바카우린의 iNOS 및 COX-2의 발현 억제효과

Raw 264.7 뮤린 대식세포에서 LPS에 의해 유도, 생성되는 NO 및 프로스타글란딘은 각각 iNOS와 COX-2의 발현에 의해 결정되는데 이러한 iNOS와 COX-2의 발현에 본 발명의 카우란 디테르펜계 화합물 중 카메바카우린이 미치는 영향을 하기와 같이 조사하였다.

<9-1> iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제효과

RAW 264.7 뮤린 대식세포를 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하고 동시에 카메바카우린을 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 배양한 후 전체 RNA(total RNA)를 분리하고 이를 주형 RNA(template RNA)로 사용하여서열번호 3과4로 기재되는 iNOS에 대한 시발체(primer)와서열번호 5와6으로 기재되는 COX-2에 대한 시발체를 이용하여 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chainreaction)을 수행하였다.

그 결과도 3a에 나타낸 바와 같이, iNOS와 COX-2의 mRNA 발현은 카메바카우린의 첨가에 의해 감소하였으며 특히, iNOS의 mRNA 발현은 카메바카우린을 1 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우 완전히 억제되었고 COX-2의 mRNA 발현은 카메바카우린을 3 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우에 완전히 억제되었다.

<9-2> iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제효과 측정

RAW 264.7 뮤린 대식세포를 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하고 동시에 카메바카우린을 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂에서 18시간 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 실시예 <7-2>의 단백질 추출 완충용액을 이용하여 세포 분해 산물(total cell lysates)을 제조하여(N. Suh et al,Cancer Res., 58, 717-723, 1998) 단백질 발현 양상을 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다.

그 결과, 카메바카우린을 처리하지 않은 대조군에서는 LPS에 의해 유도, 생성되어진 130 kDa의 iNOS와 72 kDa의 COX-2 단백질이 검출된 반면, 카메바카우린이 처리된 실험군에서는 카메바카우린의 농도에 의존적으로 각각의 단백질 발현이 억제되었다. 특히, 카메바카우린을 3 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우는 iNOS의 단백질 발현이 완전히 억제됨을 알 수 있었다(도 3b).

상기 결과로부터 본 발명의 카메바카우린은 iNOS와 COX-2의 효소활성을 특이적으로 저해함으로써 염증유발물질인 NO 및 프로스타글란딘의 활성을 억제하는 약물로 개발될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 10> 카메바카우린의 TNF-α의 세포독성 증강효과 측정

TNF-α의 세포독성 활성에 카메바카우린이 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, MCF-7 세포를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트(well plate)에 1×10⁴세포/well 농도로 분주하고 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰에 카메바카우린을 1, 5 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후 세포독성을 유발하기 위하여 20 ng/㎖의 TNF-α를 처리하였다. 상기 세포를 48시간 동안 배양한 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 가하여 4시간 동안 배양시켜 형성된 포르마잔 다이(formazan dye)의 양을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 용해시켜 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 카메바카우린의 음성 대조군에서는 TNF-α 처리에 의해 세포독성이 유발되어 세포생육도가 85%로 감소한 반면, 시료처리군에서는

카메바카우린 처리에 의해 TNF-α에 의해 저하된 세포생육도가 20%, 15%로 더욱 감소되었고 TNF-α를 처리하지 않은 군에서도 카메바카우린 처리에 의해 세포생육도가 75%, 50%로 감소하였다. 따라서, TNF-α에 의해 유도된 세포독성은 카메바카우린에 의해 더욱 증가됨을 알 수 있다(도 4의 * 표시는 통계적 유의성이 있음을 나타냄). 이로부터 본 발명의 카메바카우린은 TNF-α에 의한 암세포의 살상효과를 증강시킴으로써 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 보조제로서 활용될 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 디테르펜계 화합물인 카메바닌(kamebanin), 카메바세탈 A(kamebacetal), 카메바카우린(kamebakaurin) 및 이그지사닌 A(exisanin)는 iNOS나 COX-2의 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 NO, 프로스타글란딘, TNF의 생성을 강력하게 저해하는 활성이 있고, 급성 독성실험에서 안전한 물질로 판단되었으며, 특히, 카메바카우린은 세포사멸을 억제하는 Bfl-1/A1, cIAP-1 및 cIAP-2의 발현을 억제하고 관절염 모델에서 우수한 항염증효과가 입증되었으므로 관절염, 패혈증 등의 염증질환, 자가면역질환 및 신경세포사멸에 의한 질환에 있어서 효과적인 치료제로 활용될 수 있고 항암제나 방사선을 이용한 암치료시 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 카우란 디테르펜계 화합물 카메바닌(kamebanin) 및 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환치료제.

<화학식 1>
하기 화학식 2의 구조를 갖는 카우란 디테르펜계 화합물 카메바세탈 A(kamebacetal A) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환치료제.

<화학식 2>
하기 화학식 3의 구조를 갖는 카우란 디테르펜계 화합물 카메바카우린(kamebakaurin) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환치료제.

<화학식 3>
하기 화학식 4의 구조를 갖는 카우란 디테르펜계 화합물 이그지사닌 A(exisanin A) 및 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환치료제.

<화학식 4>
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 NF-κB의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환치료제.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환치료제.