KR20030042344A - 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제 - Google Patents

에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3으로 표시되는 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물이 NF-κB의 활성을 억제함으로써, NO 및 프로스타글란딘의 생성을 강력하게 저해하여 염증질환 치료제 또는 면역질환 치료제로 유용하며, 또한 세포사멸을 유도하여 암 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제{A THERAPEUTIC AGENT CONTAINING EREMOPHILANE COMPOUNDS OR AN EXTRACT OF LIGULARIA FISCHERI AS AN EFFECTIVE INGREDIENT FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASE, IMMUNE DISORDERS OR CANCERS}
본 발명은 하기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3로 표시되는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물이 NF-κB의 전사활성을 강력히 억제함으로써 NF-κB에 의해 발현되어 염증반응 및 면역질환을 유발하는 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, 이하 PG E2로 약칭한다)의 생성을 억제할 뿐만 아니라 NF-κB에 의해 발현되어 세포사멸을 억제하는 세포사멸 억제인자의 생성을 억제하여 염증질환치료제, 면역질환치료제 및 암 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
전사인자 NF-κB는 염증유발 사이토카인, 독성화합물, 박테리아감염, 바이러스감염, 방사선, UV, 활성산소 등의 다양한 외부자극에 의해 활성화되어 세포사멸, 면역반응 및 염증반응 등의 다양한 세포 반응에 관련된 단백질들의 발현을 조절하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
따라서 비정상적인 NF-κB의 활성은 백혈병등 각종암, 관절염등 염증질환, 천식, 동맥경화, 알츠하이머, 호지킨씨병 등 암, 염증, 면역질환과 관련되어 있어, 이러한 NF-κB의 활성을 저해하는 화합물은 상기한 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 표적이 되고 있다[A. S. Baldwin Jr.J. Clin. Invest.,2001, 107, 241-246].
NF-κB는 전사인자로써, p50 단백질과 p65 (RelA) 단백질등 여러 단백질의 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer)로 구성되어 있으며, 세포질 내에서 활성 억제단백질인 IκB와 결합하여 불활성화된 상태로 존재한다. 그러나 염증유발 사이토카인, 독성화합물, 박테리아감염, 바이러스감염, 방사선, UV, 활성산소 등의 다양한 외부자극을 통해 IκB 카이네이즈(IκB kinase, IKK)가 활성화되어 NF-κB와 결합되어 있는 IκB를 인산화하고, 그 결과 NF-κB가 IκB로부터 유리된다. 유리된 NF-κB는 핵으로 들어가 다양한 염증 또는 면역반응, 세포증식관련 유전자의 전사인자로 기능을 하게 된다[P. A. Baeueric, D. Baltimore,Cell, 1996, 98, 13-20, ].
활성화된 NF-κB는 핵 안에서 NF-κB 결합부위가 있는 유전자의 프로모터에 결합되어 염증 및 면역반응에 관련된 단백질 (사이토카인, 케모카인, 접착분자, 사이토카인 리셉터), 효소(유도형 산화질소생산효소, 유도형 사이클로옥시나아제 등)의 발현을 조절하거나 TNF-α(tumor necrosis factor-α, 이하 "TNF-α"라 한다) 수용체 족(receptor family)과 같은 세포사멸 수용체(death receptor)를 통한 세포사멸 신호를 조절하는 역할을 하고 있는 것으로 밝혀지고 있다 (F.H. Epstein,New Engl. J. Med., 336(15):1066-1071, 1997; T. Collins, M. A. Read et al.,FASEB J., 9:899-909, 1995).
이와 같이 NF-κB는 외부의 유해한 자극에 반응하여 활성화되어 염증유발인자 및 면역반응 인자의 발현에 중심적인 역할을 할 뿐만 아니라 신경 세포의 사멸에 관련되어 있으며 TNF-α나 항암제에 의해 유도되는 암세포의 사멸을 억제하는단백질의 발현에도 중요한 역할을 하므로, 비정상적인 NF-κB 활성은 다양한 염증질환, 면역질환 또는 암의 원인이나 악성화에 관련되어 있으며, 반대로 NF-κB의 활성을 억제하는 화합물은 다양한 염증질환, 면역질환 또는 암의 치료제로 이용할 수 있다.
NF-κB를 활성화시키는 대표적인 자극인자인 LPS(lipopolysaccharide; 이하 "LPS"라 한다), TNF-α, 인터루킨(interleukin-1), 방사선조사 등의 유해한 자극은 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 TNF-α, 인터루킨-1, IL-6, 프로스타글란딘 E2(prostagladin E2), 루코트리엔(luecotriene) 및 산화질소(nitric oxide, 이하 "NO"라 한다)와 같은 염증유발 물질의 생산을 과도하게 유도하여 관절염, 패혈증 등의 염증질환과 조직이식 거부반응, 자가면역 질환, 당뇨병 등의 면역질환 및 신경세포의 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다.
NF-κB의 활성을 억제하면 항암제로 사용할 수 있는데, 상기 NF-κB는 사멸수용체를 매개로 하여 세포사멸 억제활성을 나타내는 단백질로 알려진 망간네이즈-슈퍼옥사이드 변이효소(Manganese-superoxide dismutase; Mn-SOD), 아연 핑거 단백질(zinc finger protein) 계열의 단백질인의 일종인 A20, TNF 수용체결합 단백질인 TRAF(TNF receptor associated factor), 세포사멸 단백질의 억제제(inhibitor of apoptosis protein), 세포사 억제단백질 Bcl-2 유사단백질인 Bfl-1/A1등의 발현조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[D.J. Van Antwerp, S.J. Martin et al.,Trends in Cell Biology, 1998, 8, 107-111, ; C.-Y. Wang, M.W. Mayo et al.,Science,1998, 281, 1680-1683].
또한, NF-κB는 상기한 바와 같이 세포사를 저해하는 유전자 발현을 통하여 암 발생에 관련될 뿐만 아니라 세포증식에 중요한 프로토온코진(protooncogene) c-Myc와 cyclin D1의 활성화를 통하여 암 발생에 기여하기도 한다[D. C. Guttridge et al.Mol Cell. Biol., 1999,19, 5785-5799].
실제로 TNF-α나 아드리아마이신(adriamycin)으로 암세포를 처리하면 NF-κB가 활성화되어 상기 약물에 의해 유도되는 세포사멸을 억제하게 되고, NF-κB의 활성을 억제하면 세포사멸 경로가 활성화되어 약물의 감수성이 증가하게 된다(A.A. Beg, D. Baltimore,Science, 274:782-784, 1996; C.-Y. Wang, M.W. Mayo, A.S. Baldwin Jr.,Science, 274:784-789, 1996).
또한, NF-κB의 활성을 억제하면 항염증제 및 면역질환 억제제로 유용하게 사용할 수 있다. 대표적인 항염증제로 알려진 글루코코르티코이드(glucocorticoid)류나 아스피린류는 항염증작용의 중요한 기전으로 NF-κB의 활성화 저해하거나 NO 또는 프로스타글란딘의 생성을 억제하는 작용이 있으며, 또한 한방이나 민간에서 항염증제로 사용되어 왔던 약물들도 NF-κB의 활성을 저해하는 것에 의해 그 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(E. Kopp, S. Ghosh,Science, 265:956-959, 1994; A. Ray, K.E. Prefontaine,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:752-756, 1994).
염증유발물질 중 하나인 NO는 정상상태에서는 내피세포나 대식세포에서 생산되며 세포살상과 살균작용 이외에도 다양한 생리활성을 나타내는데, 특히, 혈관 내피세포의 이완작용에 있어서 혈압의 항상성(homeostasis)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS, 염증유발인자 및 방사선조사 등의 자극은 특히, 유도형 산화질소 합성효소인 iNOS의 발현을 유도하여 많은 양의 NO를 4 내지 6 시간 동안 계속적으로 생성시키는데 이와 같이 생성된 과도한 양의 NO는 상기와 같은 질환들을 유발한다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높으며, 또한 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 사용될 수 있다.
또 다른 염증유발 물질인 PGE2, PGF2a 및 PGI2과 같은 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 프로스타글란딘 생산의 율속효소인 사이클로옥시게나아제(COX)에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린 인도메타신 같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 NO의 과잉생성과 관련된 iNOS 유전자의 발현이나 프로스타글란딘 생산효소인 COX 유전자 발현에도 전사인자인 NF-κB의 활성화가 필요하기 때문에 NF-κB 활성 억제제는 NO 또는 프로스타글란딘의 생산을 저해한다.
NO의 생산을 억제하는 물질의 연구는 주로 iNOS의 효소활성을 특이적으로 저해하는 물질의 개발에 집중되어 연구되었는데, 전구체인 L-아르기닌(arginin)의 유도체, L-시트룰린(citrulline)의 유도체, 아미노구아니딘(aminoguanidine) 유도체, 이소티오우레아(isothiourea) 유도체 등의 개발연구가 진행되고 있다(Babu, B.R.B., Griffith O.W.,Current Opinion in Chemical Biology, 2:491-500, 1998).
NF-κB의 활성화를 억제하는 화합물로는 커쿠민(curcumin), 캡사이신(capsacin), 카페산(caffeic acid) 유도체, 테트란드린(tetrandrine), 생귀나린(sanguinarine) 등이 보고되었으며, 대표적인 글루코코르티코이드계 소염제인 덱사메타손(dexamethason)은 iNOS 유전자의 발현을 억제하여 NO의 생성을 저해하는데 덱사메타손의 이러한 활성 기전은 I-κB 단백질의 합성을 유도하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 iNOS의 유전자 전사를 억제하는 것으로 보고되었다(De Vera, M.E. et al.,Am. J. Physiol., 273:1290-1296, 1997).
NF-κB의 활성을 저해하는 천연에서 분리한 화합물들은 작용기전에 따라 분류해 보면 파테노라이드같이 IkB의 분해나 IkB 인산화를 저해하여 NF-κB 활성을 억제하는 화합물과, IkB의 분해나 NF-κB의 핵으로의 이동에는 영향이 없으나 NF-κB가 DNA에 결합하는 단계를 저해하는 화합물(카메바카우린, 프로스타글란딘유도체), 그리고 NF-κB가 DNA에 결합은 하지만 NF-κB의 목표유전자의 전사유도활성을 저해하는 화합물인 트립토라이드(triptolide)가 있다[Kye Young Lee et. al.,J Biol. Chem.1999,274, 13451-13455].
한편, 곰취나 천연식물에서는 수많은 에레모필란계 화합물이 보고되었으나이들 화합물이 LPS로 자극 받은 세포주에서 NO 또는 PGE2의 생산을 억제한다는 보고나 전사인자 NF-κB의 활성화를 억제한다는 보고는 없었다.
이에 본 발명자들은 NF-κB의 활성을 저해하게 되면 다양한 염증질환, 면역질환, 및 암 치료에 이용 가능하다는 사실에 착안하여 다년간 연구를 수행한 결과, 곰취로부터 곰취추출물 및 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물을 분리하여 상기 곰취추출물 및 화합물이 NF-κB 활성을 강하게 억제함에 따라, 염증 유도효소인 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하여 NO 및 프로스타글란딘의 생성을 강력히 저해함을 확인하였고 독성실험을 통하여 안전한 물질임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제로서의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 NO 또는 프로스타글라딘 E2생성억제제로서의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 화학식 1의퓨라노리글라레논(furanoligrarenon)을 유효성분으로 함유하는 염증질환제, 면역질환 치료제, 또는 암 치료제로의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 화학식 2, 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제로서의 용도를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물에 의한 산화질소의 생성억제 효과를 측정한 결과이고,
도 2는 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물에 의한 프로스타글란딘 E2의 생성억제 효과를 측정한 결과이고,
도 3은 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논(furanoligularenone)에 의한 NF-κB (nuclear factor kappa B; 이하 "NF-κB"라 한다) 활성억제 효과를 측정한 결과이고,
도 4는 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 의한 NF-κB 전사활성 억제효과를 측정한 결과이고,
도 5는 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 의한 iNOS (inducible nitric oxide sythetase; 이하 "iNOS"라 한다) 및 COX-2(cyclooxygenase 2; 이하"COX-2"라 한다)의 mRNA 발현억제 효과를 측정한 결과이고,
도 6은 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 의한 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현억제 효과를 측정한 웨스턴 블럿(Western blot)의 분석 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3으로 표시되는 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제를 제공한다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
상기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물은 곰취를 포함하는 리구라리아 종 (Ligularia species) 식물군에서 정제, 분리될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 일례로 곰취(Ligularia fischeri)를 알코올로 추출하고, 얻어진 추출물을 유기용매로 재추출하고, 얻어진 재추출물을 분리 및 정제하여 얻어진다.
상기 사용되는 알코올은 C1∼ C4알코올이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올이 사용된다.
또한, 상기 단계 2의 유기용매로는 에틸아세테이트, 클로로포름, 및 디클로로메탄으로 구성된 군에서 선택되는 것이다.
상기 단계에서 얻어진 추출물은 당 분야에 해당하는 지식을 가진 자가 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 분리 및 정제할 수 있으며, 본 발명은 크로마토그래피(chromatography)를 이용하여 분리 및 정제한다.
상기 방법으로 얻어진 본 발명의 에레모필란계 화합물은
1) 화학식 1의 퓨라노리글라레논(furanoligularenone),
2) 화학식 2의 3-옥소-8α-하이드록시-10αH-에레모필라-1,7(11)-디엔-12,8β-올라이드(3-oxo-8α-hydroxy-10αH-eremophila-1,7(11)-dien-12,8β-olide), 및
3) 화학식 3의 3-옥소-8α-메톡시-10αH-에레모필라-1,7(11)-디엔-12,8β-올라이드(3-oxo-8α-methoxy-10αH-eremophila-1,7(11)-dien-12,8β-olide)이다.
본 발명은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제 및 NO 또는 프로스타글라딘 E2생성억제제로서의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제의 용도를 제공한다.
본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 또는 곰취추출물의 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제에 대한 효능을 조사하기 위하여, LPS로 자극한 후, 각 화합물에 대해 1) 염증유발 물질인 NO 생성, 2) 프로스타글란딘 E2의 생성 및 3) 이들을 생산하는 단백질의 발현뿐만 아니라 세포사멸을 억제하는 단백질들의 발현에 중요한 전사인자 NF-κB의 활성화에 미치는 영향을 측정하여 알 수 있다.
도 1은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물이 NO의 생성을 농도 의존적으로 억제하고, 가장 바람직하게는 화학식 1의 퓨라노리글라레논의 경우가 대조군인 아미노구아닌(AG)의 경우보다 NO의 생성억제 효과가 우수한 결과를 보인다.
또한, 다른 염증유발 물질인 프로스타글란딘 E2에 대하여, 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물은 프로스타글란딘 E2의 생성을 농도에 의존하여 억제되는 결과를 보인다(도 2참조).
도 3은 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물이 LPS로 유도된 대식세포 내에서 NO 또는 프로스타글란딘 E2생성에 필수적인 iNOS 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 조절하는 전사인자 NF-κB의 활성억제 효과를 조사한 결과 농도 의존적으로 억제하며, 화학식 1의 퓨라노리글라레논의 경우, 가장 우수한 억제효과를 보임을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물은 NO 및 프로스타글란딘 E2의 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 이들을 생산하는 단백질의 발현뿐만 아니라 세포사멸을 억제하는 단백질들의 발현에 중요한 전사인자 NF-κB의 활성이 농도에 의존하여 억제되는 효과를 보이고, 가장 바람직하게는 화학식 1의 퓨라노리글라레논의 경우 우수한 억제효과를 보인다.
도 4는 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물에서 가장 우수한 효과를 보인 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 대하여 NF-κB 전사활성의 억제에 대한 결과를 나타낸 것이다.
상기 도 4의 결과에서 보는 바와 같이, 화학식 1의 퓨라노리글라레논은 우선 DNA와 결합 후, NF-κB의 유전자 전사활성을 농도에 의존하여 차단함으로써 NF-κB의 전사활성을 저해함을 알 수 있다.
상기의 결과는 NF-κB이 염증 유발인자 및 암세포의 사멸을 억제하는 단백질의 발현에 중심적인 역할을 하며, 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물이 NF-κB의 활성을 저해함으로써, 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 iNOS 및 COX-2의 효소발현을 특이적으로 저해함으로써 염증유발 물질 및 면역질환 유발물질인 NO 및 프로스타글란딘 E2의 활성을 억제하여 관절염, 패혈증, 염증, 자가 면역질환 등의 염증질환 및 면역질환 그리고 신경세포사멸에 의한 질환 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 세포사멸 억제유전자의 발현을 유도하는 NF-κB의 활성을 억제함으로써, 상기 NF-κB가 비정상적으로 활성화되어 유발되는 고형암 및 혈액암에 대한 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 에레모필란계 화합물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.
본 발명의 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법이 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 에레모필란계 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제호는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 에레모필란계 화합물 중에서 선택된 최소의 하나를 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 화학식 1의 퓨라노리글라레논의 경우는 10 ∼ 500 mg/kg이고, 바람직하기로는 50 ∼ 250 mg/kg 이며, 화학식 2의 경우는 10 ∼ 500 mg/kg이고, 바람직하기로는 50 ∼ 250 mg/kg 이고, 화학식 3의 경우는 10 ∼ 500 mg/kg이고, 50 - 250 mg/kg이고, 곰취추출물의 경우 50 ∼ 1,000 mg/kg이고, 바람직하기로는 100 ∼500mg/kg 이다. 또한, 상기 각 화합물 및 곰취추출물은 하루 1 ∼ 3 회 투여될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물은 실험용 생쥐에서 0.5 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 0.5 g/kg 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 에레모필란계 화합물은 생체에 대해 안전하게 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 에레모필란계 화합물의 분리
건조시킨 곰취(Ligularia fischeri)의 뿌리 4.2 kg을 메탄올 10 ℓ로 실온에서 3 일간 3 회 반복 추출하였고, 얻어진 추출물을 감압 농축하여 메탄올 추출물(120 g)을 얻었다. 상기의 메탄올 추출물을 3 ℓ물에 현탁하여 4 ℓ디클로로메탄으로 3 회 추출하여 디클로로메탄에 녹아 있는 추출물(75 g)을 얻었다.
상기에서 얻어진 추출물을 90% 메탄올에 용해한 후, n-헥산으로 3 회 세척하고, 90% 메탄올 농축액 70 g을 헥산-에틸아세테이트 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 1 회 실시하여 9 개의 분획을 얻었다.
화학식 1의 퓨라노리글라레논은 상기에서 얻은 9 개의 분획 중 두 번째 분획을 분리하고 용매를 감압 제거한 후 얻어진 침전을 디클로로메탄:메탄올(1:1)로 재결정하여 얻었다.
화학식 1의 퓨라노리글라레논에 대한 물리화학적 성질은 다음과 같다. 무색판상 결정; 선광도 +3.2°(크로로포름 1몰 농도); m.p. 92 ∼ 96℃; UV(MeOH)=226 nm; IR(cm-1)=3030, 1689, 1644, 1568; EI-MS(m/z) 230[M]+;1H-NMR 및13C-NMR 결과는 이미 보고된[Torres P, Ayala J, Grande C, Anaya J, Grande M. Furanoeremophilane derivatives from Senecio flavus.Phytochemistry, 1999,52, 1507-13, Jizba J, Samek Z, Novotny L, Najdenova E, BoevaA. Components of Senecio nemorensis var. bulgaricus. Collection Czechoslovak Chemical Communications, 1978,43, 1113-24] 결과와 일치하였다.
화학식 2의 3-옥소-8α-하이드록시-10αH-에레모필라-1,7(11)-디엔-12,8β-올라이드(3-oxo-8α-hydroxy-10αH-eremophila-1,7(11)-dien-12,8β-olide)은 상기에서 얻은 9 개의 분획 중 여섯 번째 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 디클로로메탄:메탄올(99:1)로 구성되는 단계농도 구배(step gradient) 용매시스템을 적용하여 9 개의 분획을 얻었고, 이중 네 번째 분획의 용매를 감압 제거한 후 얻어진 침전을 디클로로메탄:메탄올(1:1)로 재결정하여 얻었다.
화학식 2의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같다. 무색판상 결정; m.p. 208 ∼ 210℃; UV(MeOH)=225, 325 nm; IR(cm-1)=3370, 3075, 1764, 1681; EI-MS(m/z) 262 [M]+;1H-NMR 및13C-NMR의 결과는 상기 화학식 1의 화합물이 보고된 동일한 문헌의 결과와 일치하였다.
화학식 3의 3-옥소-8α-메톡시-10αH-에레모필라-1,7(11)-디엔-12,8β-올라이드(3-oxo-8α-methoxy-10αH-eremophila-1,7(11)-dien-12,8β-olide)은 상기에서 얻은 9 개의 분획 중 여섯 번째 분획에서 상기와 동일한 방법으로 얻고 디클로로메탄:메탄올(1:1)로 재결정하여 얻었다.
화학식 3의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같다. 무색판상 결정; m.p. 216 ∼ 219℃; UV(MeOH)=226, 326 nm; IR(cm-1)=2940, 1764, 1681; EI-MS(m/z) 276 [M]+;1H-NMR 및13C-NMR의 결과는 상기 화학식 1의 화합물이 보고된 동일한 문헌의 결과와 일치하였다.
최종적으로 분리 및 정제된 화합물의 수율은 화학식 1의 화합물이 7 g, 화학식 2의 화합물이 93 mg, 화학식 3의 화합물이 150 mg이었다. 상기 결과로부터 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 가장 높은 수율로 얻어짐이 따라 주성분임을 확인하였다.
<실험예 1> 에레모필란계 화합물의 NO 생성 억제효과 측정
상기 실시예 1의 곰취에서 분리된 에레모필란계 화합물이 신경세포의 사멸 및 면역질환을 유발하는 NO의 생성억제를 조사하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.
상기 실시예 1의 곰취에서 분리된 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물을 각각 LPS로 자극한 뮤린 대식세포(murine macrophage)에 첨가하여 NO의 생성량을 측정하는 것으로, 보다 구체적으로는 Raw 264.7 뮤린 대식세포 (ATCC TIB-71)를 둘베코의 변형된 필수 배지(Dulbecco's Modified Essential Medium ;이하 "DMEM"라 한다)에 현탁하여 96 웰 플레이트(well plate)에 1 ×105 세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2에서 3 시간동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 상기 대식세포에서 NO 생성을 유발하기 위하여 LPS를 최종 농도 1 ㎍/㎖로 첨가하여, 상기 실시예 1의 곰취에서 분리된 에레모필란계 화합물을 각각 10, 3, 1, 0.3, 0.1 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 24 시간 배양하였다.
배양액 중에 LPS로 생산이 유도된 NO의 농도를 측정하기 위하여, 상기 배양액을 회수하여 원심분리하고 각 배양액 100 ㎕에 그리이스 시약 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 10 분간 방치 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 그리이스 시약은 1% 설파닐아마이드(sulfanilamide)를 5% 인산(phosphoric acid)에 녹인 용액과 0.1% 나프틸에틸렌디아민ㆍHCl(naphthylethyldiamineㆍHCl)의 수용액을 1:1로 섞어 제조하였다.
표준 NO 생성량을 측정하기 위하여, NaNO2를 농도별로 희석한 후, 상기 그리이스 시약과 반응시켜 흡광도를 측정하여 검정곡선을 작성하였다. 따라서, NO2(nitrite)의 양을 측정하여 상기 검정곡선을 이용, 환산함으로써 실시예 1의 곰취에서 분리된 에레모필란계 각 화합물 첨가에 의한 NO의 생성량을 얻은 결과를 하기표 1에 기재하였다.
화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물의 NO 생성억제 효과
시료 농도(mg/ml) NO2(mM) IC50(mM)
() LPS - 2.8 ± 0.2
(+) LPS - 52.9 ± 1.9
화학식 1의 화합물 10 3.9 ± 0.7** 2.38
3 8.7 ± 2.4**
1 27.1 ± 3.1**
0.3 32.7 ± 4.4*
0.1 44.6 ± 4.7
화학식 2의 화합물 10 8.6 ± 0.3** 3.47
3 19.9 ± 0.4**
1 31.7 ± 1.1*
0.3 36.8 ± 0.7
0.1 41.2 ± 1.4
화학식 3의 화합물 10 5.1 ± 0.6** 2.45
3 13.0 ± 0.8**
1 27.7 ± 1.3**
0.3 36.1 ± 2.2*
0.1 43.7 ± 1.6
* P <0.05, 정상군과 유의적인 차이를 보이고** P <0.01 정상군과 유의적인 차이를 보인다.
상기 결과를 표현한도 1은 상기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 화합물이 LPS로 유도된 대식세포에서 NO의 생성이 농도 의존적으로 억제됨을 관찰하였다.
NO 생성 억제농도 IC50(inhibition concentration)는 화학식 1의 화합물이 0.55 ㎍/㎖, 화학식 2의 화합물이 0.91 ㎍/㎖, 및 화학식 3의 화합물이 0.68 ㎍/㎖으로 관찰됨으로써, 소량의 화합물 첨가로도 NO 생성억제 효과가 우수하였고, 바람직하게는 화학식 3의 화합물이며, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 화합물이 강력하게 NO의 생성을 억제하여 LSP로 유도되지 않은 군의 수준으로 억제되었다.
<실험예 2> 에레모필란계 화합물의 프로스타글란딘 E 2 생성 억제효과 측정
상기 실시예 1에서 얻은 에레모필란계 화합물이 염증 유발물질인 프로스타글란딘 E2의 생성억제를 조사하기 위하여, 하기와 같이 실시하였다.
LPS로 자극한 뮤린 대식세포)에 상기 실시예 1에서 얻은 에레모필란계 화합물을 첨가하여 프로스타글란딘 E2의 생성량을 측정하는 것으로, 보다 구체적으로는 Raw 264.7 세포를 DMEM 배지로 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 ×105 세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2에서 18 시간동안 세포를 배양하였다. 상기 각 웰에 아스피린(aspirin)을 500 μM로 첨가하여 3 시간동안 반응시켜 프로스타글란딘의 율속효소인 사이클로옥시게나아제-1(cyclooxygenase-1)을 불활성화 시킨 후, PBS(phosphate buffered saline) 완충용액으로 2 회 세척하였다. 상기 세포에 LPS를 최종농도 1 ㎍/㎖로 첨가하고, 상기 상기 실시예 1에서 분리된 에레모필란계 화합물을 각각 0, 0.1, 0.3, 3, 10 ㎍/㎖로 첨가하여 37℃, 5% CO2에서 16 시간 배양하였다. 원심분리로 배양 상층액만을 분리한 후, 배양액 내 프로스타글란딘의 양을 면역효소 분석법(enzymeimmunometric assay)으로 정량하여 하기표 2에 기재하였다.
화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물의 PGE2생성억제 효과.
시료 농도(mg/ml) PGE2(ng/well) IC50(mM)
() LPS - 1.1 ± 0.4
(+) LPS - 10.8 ± 1.9
화학식 1의 화합물 10 0.9 ± 0.09** 8.40
3 4.3 ± 0.08*
1 9.3 ± 0.3
화학식 2의 화합물 10 5.2 ± 0.2* 28.07
3 9.8 ± 1.1
1 11.1 ± 0.2
화학식 3의 화합물 10 2.9 ± 0.5* 12.16
3 8.1 ± 1.1
1 9.4 ± 1.4
* P <0.05, 정상군과 유의적인 차이를 보이고** P <0.01 정상군과 유의적인 차이를 보인다.
상기 표 2 및도 2에서 보는 바와 같이, 상기 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3의 화합물은 프로스타글란딘 E2의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 결과를 보이고 있다. 상기 억제농도 IC50는 화학식 1의 화합물이 1.93 ㎍/㎖, 화학식 2의 화합물이 7.35 ㎍/㎖, 및 화학식 3의 화합물이 3.36 ㎍/㎖으로 관찰됨으로써, 소량의 화합물 첨가로도 프로스타글란딘 E2의 생성이 상당히 억제됨을 알 수 있었다. 바람직하게는 화학식 3의 화합물이며, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 화합물이 강력하게 프로스타글란딘 E2의 생성을 억제하여 LPS로 유도되지 않은 군의 수준으로 억제되었다.
<실험예 3> 퓨라노리글라레논 화합물의 NF-κB 활성 억제효과 측정
상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 중 NO 및 프로스타글란딘 E2생성억제 가장 우수한 효과를 보인 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 대한 iNOS 및 사이크로옥시게나아제의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성억제를 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
NF-κB에 의존적인 리포터 유전자의 발현을 검색할 수 있는 RAW-NF-AP(대한민국 특허출원 제 99-6025호)를 DMEM 배지에 현탁하여 96 웰 플레이트에 1 ×105세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO2에서 3 시간 동안 배양하여 웰 표면에 세포를 부착하였다. 세포 부착 후 LPS를 1 ㎍/㎖로 첨가하고, 상기 실시예 1에서 얻은 에레모필란계 화합물 중 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ㎍/㎖로 첨가하여 16 시간동안 배양하였다. 세포 배양액을 원심분리하여 상층액만을 NF-κB의 활성에 의해 발현되는 분비형 알칼라인 포스파타아제(secreted alkaline phosphatase, SEAP)의 활성을 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 화학식 1의 퓨라노리글라레논은 LPS로 유도된 NF-κB의 활성에 대한 지표인 SEAP의 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 10 ㎍/㎖로 첨가한 경우에 리포터 유전자의 발현을 억제하여 LPS를 첨가하지 않은 음성 대조군의 수준까지 억제되는 효과를 나타냈다.
<실험예 4> 퓨라노리글라레논 화합물의 NF-κB의 DNA 결합 및 전사조절 활성에 미치는 영향 조사
상기 실시예 1에서 얻은 에레모필란계 화합물 중 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 대하여 NF-κB의 DNA 결합 및 전사조절 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Raw 264.7 뮤린 대식세포에 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 각각 0, 1, 5, 10 ㎍/㎖로 첨가하여 30 분동안 전처리한 후, 1 ㎍/㎖의 LPS로 30 분동안 자극하였다. 상기 대식세포로부터 분리한 핵 추출물 20 ㎍을 방사성 동위원소로 표지된 서열번호 1로 기재되는 이중나선 올리고 헥산(double strand oligonucleotide)과 반응시킨 후 비변성 폴리아크릴아마이드 젤(nondenaturing electrophoresis gel)에 전기영동 하여 분리하고 와트만 3MM 셀룰로오즈지(Whattman 3MM cellulose)에 옮긴 후 X-ray 필름으로 감광하여 핵 추출물내의 NF-κB가 올리고 헥산에 결합했는지를 조사했으나 화학식 1의 퓨라노리글라레논은 NF-κB의 DNA 결합을 억제하는 활성이 없었다.
상기의 결과에서 보는 바와 같이, 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 NF-κB의 DNA 결합을 억제하지는 않았고, 이에 NF-κB의 전사활성을 억제하는지를 조사하였다.
NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65(RelA)의 전사활성은 Gal4 시스템을 이용하여 측정하였다. pFA-CMV 벡터(Stratagene사 제품)의 Gal4-DNA 결합 도메인(binding domain)에 서열번호 2로 표시되는 p65의 전사활성도메인(transactivation domain; 인간의 p65 (RelA)의 아미노산번호 286-551에 해당하는 cDNA)을 결합시켜 pFA-CMV-RelA286-551 벡터를 만들고, 수용체 벡터로는 Gal4-DBD(DNA 결합 도메인)이 5 번 반복되고, 리포터를 루시퍼레이즈(luciferase)로 하는 pFR-Luc 벡터(Stratagene사 제품)를 사용하였다. HeLa세포에 위에서 조제한 pFA-CMV-RelA286-551 벡터 및 pFR-Luc 벡터를 리포펙트아민 플러스 리젠트(lipofectamine plus reagent;Invitrogen사 제품)를 이용하여 동시에 트랜스펙션(transfection)시키고 24 시간 후에 0.1, 1, 10 mg/ml 농도의 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 처리하고 16 시간 더 배양한 후 세포추출물을 얻어 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 루시퍼레이즈의 활성은 EG&G Berthold사의 발광측정기(luminometer)를 이용하여 측정하였다.
도 4는 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 NF-κB의 전사활성의 억제에 대한 결과를 나타낸 것으로서, DNA와 결합 후, 농도 의존적으로 상기 NF-κB의 유전자 전사활성을 차단함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논은 염증 유발인자의 발현에 중심적인 역할을 하며 암세포의 사멸을 억제하는 단백질의 발현을 조절하는 NF-κB의 활성을 저해함으로써 염증질환 치료제, 면역질환 치료제, 및 암치료제로 개발될 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 5> 퓨라노리글라레논의 iNOS 및 COX-2의 발현억제 효과 측정
본 발명의 곰취에서 추출한 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 iNOS 및 COX-2에 대한 발현 억제효과를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
RAW 264.7 뮤린 대식세포를 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하고 동시에 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 0.3, 1, 3, 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 6 시간 동안 배양한 후, 전체 RNA(total RNA)를 분리하여 이를 주형 RNA(template RNA)로 사용하여 서열번호 3 및 4로 기재되는 iNOS에 대한 프라이머 및 서열번호 5와 6으로 기재되는 COX-2에 대한 프라이머를 이용하여 역전사효소-폴리머레이즈 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 수행하였다.
도 5는 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 의한 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현억제 효과를 측정한 결과로서, 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현을 감소시켰으며 특히, 3 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 경우 iNOS의 mRNA 발현이 완전히 억제되었고 COX-2 mRNA의 발현도 현저하게 억제되었다.
<실험예 6> 퓨라노리글라레논의 iNOS 및 COX-2의 발현억제 효과의 웨스턴 블럿 측정
본 발명은 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 iNOS 및 COX-2의 발현 억제효과를 웨스턴 블럿(Western blot) 분석을 통하여 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
RAW 264.7 뮤린 대식세포를 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하고 동시에 본 발명의 곰취에서 추출한 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 배양된 세포로부터 단백질 추출 완충용액을 이용하여 세포 분해 산물(total cell lysates)을 제조하여(N. Suh et al,Cancer Res., 1998,58, 717-723) 단백질 발현 양상을 웨스턴 블럿 분석하였다.
도 6은 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논에 의한 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현억제 효과를 웨스턴 블럿(Western blot)으로 분석한 결과로서, 상기 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 처리되지 않은 대조군에서는 LPS로 유도된 대식세포에서 130 kDa의 iNOS 및 72 kDa의 COX-2 단백질이 검출된 반면, 상기 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 처리된 실험군에서는 농도에 의존하여 iNOS 및 COX-2 단백질 발현이 억제되었다. 특히, 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 3 ㎍/㎖ 농도로 처리된 경우 iNOS의 단백질 발현이 완전히 억제되었다.
<실험예 7> 퓨라노리글라레논 화합물의 급성 독성실험
화학식 1의 퓨라노리글라레논을 임상적으로 활용하기 위하여 하기와 같은 방법으로 급성독성을 조사하였다.
6 주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트(rat)를 군당 5 마리씩으로 나누어 본발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 0.5% 메틸셀룰로오즈 용액에 현탁하여 0.5 g/kg/15㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다. 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 투여한 동물에서는 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학적 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 실험한 상기 화합물은 랫트에서 0.5 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 0.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
상기 실험의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 퓨라노리글라레논이 DNA와 결합 후, NF-κB의 전사활성을 농도에 의존하여 억제하고, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현을 크게 감소시켜 소량의 첨가로도 완전히 억제하는 결과를 보였다.
그러므로 상기 화학식 1의 퓨라노리글라레논을 포함하여 본 발명의 화학식 2, 화학식 3의 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물은 NO 및 프로스타글란딘의 활성을 농도 의존적으로 억제하여 염증질환 및 면역질환의 치료제로 사용될 수 있을 뿐 아니라 NF-κB에 의해 전사가 유도되는 염증유도 사이토카인(IL-1, TNF-α등), 염증유도 효소 (iNOS, COX-2)의 생산을 억제하고 세포사를 조절하는 것으로 알려진 수많은 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 NF-κB의 비정상적인 활성화에 기인한 질환들의 치료제로 사용할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학식 1, 화학식 2, 및 화학식 3을 포함하는 에레모필란계 화합물 및 곰취추출물은 iNOS 및 COX-2의 효소발현을 특이적으로 저해함으로써 면역질환 유발물질 및 염증유발 물질인 NO 및 프로스타글란딘 E2의 활성을 억제하여 관절염, 패혈증, 염증, 자가 면역질환 등의 염증질환 및 면역질환 치료제 및 신경세포사멸에 의한 질환 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 세포사멸 억제유전자의 발현을 유도하는 NF-κB의 활성을 억제함으로써, 상기 NF-κB가 비정상적으로 활성화되어 유발되는 고형암 및 혈액암에 대한 암 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 퓨라노리글라레논(furanoligularenone)을 유효성분으로 하는 NF-κB 억제제.
    화학식 1
  2. 제 1 항의 퓨라노리글라레논을 유효성분으로 함유하는 NO 또는 프로스타글라딘 E2생성억제제.
  3. 제 1 항의 퓨라노리글라레논을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제 또는 암 치료제.
  4. 하기 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유하는 NF-κB 억제제.
    화학식 2
    화학식 3
  5. 제 4 항의 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유하는 NO 또는 프로스타글라딘 E2생성억제제.
  6. 제 4 항의 에레모필란계 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제 또는 암 치료제.
  7. 곰취(Ligularia fischeri)를 C1∼ C4알코올로 추출하고, 얻어진 추출물을 유기용매로 재추출하여 얻어진 재추출물을 분리 및 정제하여 얻어지며 에레모필란계 화합물을 포함하는 곰취추출물을 유효성분으로 하는 NF-κB 억제제.
  8. 제 7 항의 곰취추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제, 면역질환 치료제 또는 암 치료제.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101248861B1 (ko) * 2009-12-21 2013-03-29 한양대학교 에리카산학협력단 가자 추출물을 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제
KR101300798B1 (ko) * 2010-09-08 2013-08-29 고려대학교 산학협력단 곰취 추출물을 포함하는 뇌신경세포 보호용 조성물
KR101312579B1 (ko) * 2005-05-19 2013-09-30 아지엔드 키미쉐 리유나이트 안젤리니 프란체스코 에이.씨.알.에이.에프. 에스.피.에이 프로스타글란딘 ｅ2의 생산과 관련된 질환 치료용3-아미노카보졸의 벤조일 유도체의 용도
CN110194754A (zh) * 2019-04-29 2019-09-03 首都医科大学 一种蹄叶橐吾脂溶性提取物及其制备方法和用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817816A (en) * 1996-06-20 1998-10-06 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Sesquiterpene derivatives having progesterone receptor binding inhibitory activity
KR20030001658A (ko) * 2001-06-26 2003-01-08 강삼식 항염증 작용을 하는 곰취 추출물 및 그 분획물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817816A (en) * 1996-06-20 1998-10-06 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Sesquiterpene derivatives having progesterone receptor binding inhibitory activity
KR20030001658A (ko) * 2001-06-26 2003-01-08 강삼식 항염증 작용을 하는 곰취 추출물 및 그 분획물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Inhibition of inflammatory mediators production by sesquiterpens from ligularia fischeri, 29 , 1998.12 *
Korean J. Food Sci. Technol., vol 30, 1998 *
Park HJ., et al., sesquiterpenes from the leaves of Ligularia fischeri var. spiciformis, Planta Med., Dec. 2000 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101312579B1 (ko) * 2005-05-19 2013-09-30 아지엔드 키미쉐 리유나이트 안젤리니 프란체스코 에이.씨.알.에이.에프. 에스.피.에이 프로스타글란딘 ｅ2의 생산과 관련된 질환 치료용3-아미노카보졸의 벤조일 유도체의 용도
KR101248861B1 (ko) * 2009-12-21 2013-03-29 한양대학교 에리카산학협력단 가자 추출물을 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제
KR101300798B1 (ko) * 2010-09-08 2013-08-29 고려대학교 산학협력단 곰취 추출물을 포함하는 뇌신경세포 보호용 조성물
CN110194754A (zh) * 2019-04-29 2019-09-03 首都医科大学 一种蹄叶橐吾脂溶性提取物及其制备方法和用途

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