KR101248861B1

KR101248861B1 - 가자 추출물을 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제

Info

Publication number: KR101248861B1
Application number: KR1020100110674A
Authority: KR
Inventors: 채영규; 난도 듀라 다스; 정경화; 김경숙; 최미란; 박경선
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2009-12-21
Filing date: 2010-11-08
Publication date: 2013-03-29
Also published as: KR20110073241A

Abstract

본 발명은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는 NF-κB 억제제 및 가자 추출물을 이용하여 NF-κB의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NF-κB 억제제는 NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병, 특히 염증성 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

Description

가자 추출물을 포함하는 ＮＦ―κＢ 억제제{NF-κB INHIBITOR INCLUDING ERMINALIA CHEBULA EXTRACT}

본 발명은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는 NF-κB 활성 억제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 가자 추출물을 이용하여 NF-κB 의 활성을 억제하고 이를 이용한 NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병의 치료 및 예방에 대한 것이다.

NF-κB는 다양한 생물학적 기능이 일어날 때 "센서"로 작용한다. NF-κB 패밀리는 서로 구조적으로 관계가 있는 다양한 성분들(p50, p52, RelA or p65, RelB 및 c-Rel)로 구성된다. 이들 성분들 중에서 가장 연구가 많이 되고, 잘 알려진 것은 p50/p65로 구성된 이형접합체와 p50/p50로 구성된 동형접합체이다.

NF-κB의 활성을 유발하는 것으로는 염증유발 사이토카인(proinflammatory cytokines), 유해산소자유기(oxidant free radicals), 호흡으로 흡입된 인자(inhaled particles), 자외선, 그리고 박테리아와 바이러스의 산물 등이 있다. NF-κB의 활성의 주경로는 IKK(inhibitor of kappa kinase)의 활성 촉진, IκBα의 분해, 그리고 전사 능력의 활성 강화 등이다. 구체적인 예로, TNFR1를 통한 사이토카인 TNFα의 신호 전달은 10분 안에 완전한 IκBα의 분해를 유발하며, 그 다음 NF-κB가 핵 내로 이동하여 특정 DNA 부분에 결합되어서 특정 유전자의 발현을 유도한다(Nelson, G., L. Paraoan, et al . J. Cell Sci . (2002) 115: 1137-1148., Nature Rev . Mol . Cell Biol . (2007) 8: 49-62.).전사 활성과 NF-κB의 특이성은 세포주의 종류에 따라 다양하게 조절된다. 세포의 생존(cellular inhibitor of apoptosis; c-IAP, cellular FLICE-like inhibitory protein; c-FLIP, 및 B-cell lymphoma extra large; Bcl-xl), 증식 (TNF, IL-1, IL-6, cyclin-D1, 및 c-myc), 혈관신생(vascular endothelial growth factor; VEGF, TNF, IL-1 and IL-8), 염증반응(TNF, IL-1, and chemokines), 외부 병원균의 침입(invasion)(cyclooxygenase-2; COX-2, and matrix metallopeptidase 9; MMP9), 그리고 전이(intercellular adhesion molecule; ICAM-1, and vascular cell adhesion molecule; VCAM-1)에 관련되는 많은 유전자들의 발현이, NF-κB의 활성화에 의하여 조절된다(Sun, S. C. et al ., Trends in Immunology. (2008) 29: 469-478.). 그러나 아직 암세포에서 NF-κB의 항시 발현의 원인이 무엇인지 정확히 밝혀지지 않았다.

세포사멸(Apoptosis)에서 NF-κB는 다양한 세포사멸 자극(apoptotic stimuli)에 의해 활성화되어 항-세포사멸(antiapoptotic) 기능을 갖는 다양한 단백질들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 암세포에 있어서 NF-κB의 활성화는 항-세포사멸 경로(anti-apoptotic pathway)를 활성화시켜 세포사멸에 대한 내성을 유발시킴으로써 약물치료(chemotherapy)나 방사선치료(radiotherapy)에 대한 내성의 원인이 되며 암의 성장 또는 악성화에 유리하게 작용하는 것으로 알려져 있다.

전사인자 NF-κB는 발생, 면역반응 등의 정상 생리 기능에도 중요하지만 비정상적인 NF-κB 활성화는 여러 질병의 병리기전과도 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있으므로 비정상적인 NF-κB의 활성화를 조절하여 퇴행성·난치성 질환의 발병이나 진행을 억제할 수 있어 의약품 개발의 표적 물질로서 주목을 받고 있다.

전사인자 NF-κB에 관련된 질병으로는 천식(asthma), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 염증장병(inflammatory bowel disease) 건선(psoriasis) 등과 같은 염증성 질환(inflammatory disease), 감염쇼크(septic shock), AIDS, 암, 죽상경화증(atherosclerosis), 노화 등이 있다.

NF-κB의 활성을 생물학적 및 생화학적으로 억제할 수 있는 대부분의 억제제들은 NF-κB의 활성을 유발하는 신호전달 경로를 막거나, NF-κB의 표적 DNA에 대한 결합 능력을 조절하는 방법을 사용한다. 일부 억제제들은 TNF/IL-1의 수용체, 수용체 연관 단백질이나 IKK 복합체 같은 특이적인 물질을 표적으로 하기도 한다. 반면에 유비퀴틴 연결 효소(ubiquitin-conjugating enzymes)나 프로테아좀(proteasome) 같은 상대적으로 덜 특이적인 물질을 표적으로 하는 억제제들이 존재한다. 많은 항산화제들은 신호전달체계의 상위 과정인 IκB의 인산화(phosphorylation)를 막아주는 방법을 사용하기도 한다(Bharti, A. C. et al ., Blood (2003) 101: 1053-1062.).

그러나 NF-κB의 억제제로 알려져 있는 물질들인 Ery(erythromycin), Bay11 (Bay 11-7082) 및 I3C(indole-3-carbinol) 등은 세포 독성이 있어서 세포를 죽이는 문제점이 발생할 수 있다. 따라서 NF-κB 억제제로 이용가능한 천연물에 대한 연구가 필요하다.

가자(訶子)는 사군자과(使君子科; Combfreetaceae)에 속한 낙엽교목인 가자(架子 Terminalia chebuia chebula RETZ.) 또는 융모가자(T. chebula RETZ. var. tomentella KuRT.)의 성숙(成熟)한 열매를 건조한 것이다. 가자는 만성 후두염, 후두 결핵, 장출혈, 치루 출혈, 부녀자궁출혈, 만성 자궁염, 대하(帶下), 이질, 구해천급(久咳喘急), 실음(失音) 등 증세에 이용되고 있다. 가자에는 탄닌(tannin)이 많아서 수렴, 지사작용이 있으며, 녹농균, 디프테이라균, 황색 포도상구균, 용혈성 연쇄상구균에 억제작용을 일으킨다고 알려져 있다. 이러한 가자 추출물은 전사요소 단백질들의 활성을 억제시키는 물질로 이용될 가능성이 있다.

일반적으로 NF-κB는, T 및 B 림프구의 특정 T 세포 및 B 세포 수용체 특이적 항원을 인지하는 면역계에서 그 활성을 증가시키면서 중요한 역할을 한다. 이러한 관점에서 살펴보면, 인간의 많은 면역 관련 질환은 NF-κB 기능 장애와 많은 관련이 있다는 사실은 놀라운 일이 아니다. 따라서, 다양한 자극에 대한 전사과정의 정교한 조절은 면역작용의 적절한 기능을 위하여 중요하다. 그러나 NF-κB는, 종양세포, 증식 T 세포 및 B 세포, 흉선세포(thymocytes), 단핵 백혈구세포 (monocytes), 성상세포(astrocytes)에서 항시적 활성을 가진다. 따라서 NF-κB 활성을 억제하는 물질은 암, 신경질환 및 면역질환의 치료 및/또는 예방에 중요하게 이용될 것이다.

본 발명자들은 상기 언급한 문제점을 해결하기 위하여 NF-κB 의 활성 억제제로서 가자 추출물을 이용하였다. 또한 NF-κB 로 조절되는 중요한 면역반응 관련 유전자들을 찾아내었다.

본 발명은 가자 추출물을 이용하여 NF-κB의 활성을 억제하기 위한 것이다.

본 발명의 목적은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는 NF-κB 활성 억제제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 가자 추출물을 이용하여 NF-κB 의 활성을 억제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는, NF-κB에 의해 조절되는 유전자의 전사 억제제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는, NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는 NF-κB 억제제를 제공한다.

상기 가자 추출물은 이 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 본 발명에서는 열수추출법을 이용하여 가자 추출물을 수득하였다.

본 발명에서 “억제제”란, 단백질의 활성을 억제시키는 물질을 의미한다. 구체적으로 단백질 발현을 위한 전사, 번역 등을 억제하거나 또는 단백질이 만들어지는 과정 중에 나타나는 분자생물학 수준에서의 작용들을 억제하는 물질을 의미한다.

또한 본 발명은 가자 추출물을 이용하여 NF-κB 의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 가자 추출물은 NF-κB의 억제자인 IκBα의 분해 및 인산화를 방해하여 NF-κB 가 핵 내로 이동하는 것(translocation)을 저해함으로써 NF-κB의 활성화를 억제한다

본 발명은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는, NF-κB에 의해 조절되는 유전자의 전사 억제제를 제공한다. 상기 NF-κB에 의해 조절되는 유전자는 TNF-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인터루킨-8, GMCSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), RANTES, MIP-1α(macrophage inflammatory protein-1α), MCP-1(macrophage chemotatic protein-1), Eotaxin, iNOS, COX-2, 5'-리폭시제나아제(5'-lipoxygenase), cPLA2, ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴(E-selectin), 인터루킨-2 수용체, T-세포 수용체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 여기 언급된 유전자들의 서열은 이미 공지되어 있으므로 구체적인 서열 정보는 생략하기로 한다.

본 발명에서 “유전자의 전사 억제”란 DNA의 전사 억제를 의미하며, 전사에 의해 목적 단백질이 생산되는 것을 억제하는 것도 포함한다.

또한 본 발명은 가자 추출물을 활성 성분으로 포함하는, NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병은 암, 면역질환 또는 신경계 질환일 수 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "예방"이란 가자 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 NF-κB의 활성 증가로 인해 발생하는 질병의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, "치료"란 상기 약제학적 조성물을 투여하여 NF-κB의 활성의 증가로 인한 질병을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

신경계질환은 신경 세포의 사망 또는 손상과 관련되는 질환이다. 특히 알츠하이머 질환, 다경색 치매, 알츠하이머 질환과 다경색 치매의 혼합형, 파킨슨씨 질환, 저갑상선증, 알코올성 치매 알츠하이머, 헌팅턴 병 등의 중추신경계 세포의 손상 및 사망에 따른 중추신경계 질환이 대표적이다. 이런 질병의 주요 증상은 인지 기능 장애와 언어, 판단, 추상력, 공간시간적 능력 및 기타 새로운 기술 습득의 장애 등을 포함하며, 성격변화, 정서적 불안정 등의 증세가 나타나고 종국적으로는 사망에 이르게 된다. 이 중 본 발명의 약제학적 조성물은 신경조직에서 NF-κB가 과발현되는 등 그 활성이 증가된 질병에 쓰일 수 있는데, 구체적으로는 뇌에서 NF-κB가 과발현되는 알츠하이머병 질환에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 신경조직에서 NF-κB가 활성화되어 과발현되는 모든 질병의 치료에 사용될 수 있다.

암의 경우, 암의 전이, 화학적 내성, 방사성 내성을 가지는 암에서 NF-κB의현저한 발현 증가가 확인되었다. 따라서 NF-κB의 억제는 암 예방 및 치료 측면에서도 중요하다. 본 발명의 가자 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 사용하여 예방 또는 치료될 수 있는 구체적 암은 NF-κB의 활성 증가가 나타나는 암, 구체적으로는 대장암, 소장암, 직장암, 항문암, 식도암, 췌장암, 위암, 신장암, 자궁암, 유방암, 폐암, 임파선암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 피부암, 결장암, 뇌종양, 방광암, 난소암, 담낭암 등을 포함하고, 이에 제한되지는 않는다.

NF-κB는 면역질환에도 중용한 효과를 가지고 있다. 일례로서 퇴행성질환 중에 하나인 류마티스의 경우를 들 수 있다. 류마티스의 특징은 염증반응과 과증식증(hyperplasia)인데, 여기에 모두 NF-κB가 관여하고 있다. 류마티스의 활막의 활액세포는 다양한 자극에 의해 NF-κB가 활성화되고 이 활성화된 NF-κB는 염증유발인자를 발현시키는 동시에 활액세포의 세포사멸을 저해함으로써 염증반응과 과증식증을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 류마티스 등의 면역질환에 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 NF-κB의 활성을 억제하면 염증유발인자의 생성이 감소되고 더불어 세포사멸이 증가되어 류마티스의 염증반응과 과증식증 모두 현저히 저해될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 기술을 이용하여 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 기존의 세포독성제, 화학요법제 등의 다양한 치료제와 병합 투여될 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예, 정맥 내 볼루스 주사, 정맥 내 주입, 동맥 내 볼루스 주사, 동맥 내 주입, 맥관 내로의 카테터 점적주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예를 들면 삼투압 펌프 이용), 조직 주위 및 조직 내 투여(예: 종양주위 및 종양내 주사) 또는 침착 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 개체의 성별, 연령, 건강상태, 체중, 투여 방법과 횟수, 표적 조직이나 세포 등 다양한 요인을 고려하여 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 상기 유효량은 NF-κB 활성을 억제시키기에 충분한 양이다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.

가자 추출물을 이용하여 NF-κB의 활성을 억제시킴으로써 NF-κB의 활성 증가와 연관된 질병의 효과적인 치료, 개선 및 예방이 가능하다. 또한 본 발명의 가자 추출물은 세포 독성이 적으므로 NF-κB의 활성을 억제시키면서 세포를 죽이는 부작용이 최소화될 수 있다.

도 1은 TNFα 및 Ery를 5 시간 동안 처리한 후의 NIH3T3-NF-κB 세포주를 나타낸 것이다. TNFα(10 ng/ml) 자극은 양성 대조군으로서 34.85 ± 2.14 %의 활성 세포를 보여준다. 그러나 Ery (5 ng/ml)의 첨가는 세포 활성을 억제하였으며(25.57 ± 4.97%), Ery(5 ng/ml)만 첨가한 경우에는 17.17 ± 3.07 % 의 세포 활성을 나타낸다. 각각 세 번의 실험을 수행하였으며, ±는 표준오차를 나타낸다.
도 2는 세포기반 분석을 사용하여 Jurkat-NFκB 세포에서 TNFα의 효과를 확인한 것이다.
도 3은 MTT 분석 기법을 이용한 IC50값을 나타내는 그래프이다. 가자 추출물(TC)(50 μg/ml)을 6 시간 인큐베이션 한 경우는, 세포의 생존능력이 거의 100 %가 나와서 음성 대조군처럼 나왔다. 아폽토시스 유발제로 알려진 스타로스포린 (staurosporine; STS) (0.5 μM)의 IC50 은 약 65%이다. 모든 실험값은 세 개 웰(well)의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 4는 Jurkat-NF-κB 세포에서 I3C의 효능을 확인한 것이다. TNFα + I3C (10 ng/ml + 1 mM)를 5 시간 처리한 B는 8.39 ± 0.6%의 활성 세포(파란색)를 나타냈고, I3C(1 mM)만 처리한 E는 8.82 ± 2.22%의 활성 세포를 나타냈다. TNFα(10 ng/ml)만을 처리한 A는 거의 83%의 활성 세포가 나타난 양성 대조군이고, H는 음성 대조군으로 85%의 활성 세포를 나타낸다. C에서는 TNFα + I3C(10 ng/ml + 0.5 mM)를 처리하였고, D에서는 TNFα + I3C (10 ng/ml + 0.1 mM), F에서는 I3C (0.5 mM), 그리고 G에서는 I3C (0.1 mM)를 각각 처리하여, 활성 세포는 각각 82.61 ± 3.99%, 86.50 ± 3.51%, 79.65 ± 4.25%, 및 78.77 ± 2.33%가 나왔다.
도 5a는 I3C와 TNFα의 농도 및 처리 시간을 다르게 하여 Jurkat nF-κB 세포에 처리하였을 때의 활성 세포(%)를 나타내는 그래프이다. TNFα(10 ng/ml)로 유도된 Jurkat-NF-κB의 활성은 I3C (1 mM)를 3, 4 시간 처리한 뒤에 급격하게 억제되었는데, 활성 세포(%)가 23.43 ± 3.68% 와 9.98 ± 1.99%로 떨어진 것이다. 이는 1시간 처리후의 활성 세포(61.49%)와 비교하였을 때 큰 차이가 났다. I3C(1 mM)만을 처리한 경우 또한 활성이 억제되었는데, 4 시간 처리 후에 9.74 ± 1.01%의 활성 세포가 관찰되었다. 각각의 실험은 세 번 반복하였으며 각각의 값은 평균 ± 표준오차를 나타낸다.
도 5b는 Jurkat-NF-κB 세포에서의 NF-κB의 억제제들-I3C와 가자추출물(TC), Bay11 및 Ery-을 비교하여 나타낸 그래프이다. 처리시간은 5 시간이었다. I3C (1 mM)과 가자추출물 (50 μg/ml) 처리시 각각 8.80 ± 0.97%와 18.36 ± 1.67% 의 활성 세포를 보였는데, 이는 5 μg/ml의 Bay11을 처리한 경우(76.08%)나 10 ng/ml의 Ery를 처리한 경우(92.53%)에 비해 유의하게 낮은 수치였다.
도 6은 Jurkat-NFκB 세포에서의 가자 추출물의 효능을 나타낸 것이다. 가자 추출물을 30 μg/ml(a) 와 50 μg/ml(b) 로 처리하였을 때 NF-κB 활성이 억제되었으며, 각각 33.82% 와 18.36%의 활성 세포(파란색)를 확인하였다. 그러나, TNFα(10ng/ml)는 80%의 활성 세포를 보여주었다(d). 그러나 TNFα(10ng/ml) + TC 추출물(50 μg/ml)를 처리시(C)에는 하자 NF-κB가 활성 세포가 29.12%로 감소하였다.
도 7은 가자 추출물이 NF-κB (p65)의 활성 증가를 억제하고 IκBα 인산화를 억제하는 것을 보여주는 웨스턴 블랏 결과이다. (A) 세포는 6 시간 동안 배양되었으며, 여려 종류의 샘플로부터 p65는 세포 핵 추출물에 존재한다는 것을 확인하였다(a의 1번째 패널). 세포질 추출물을 준비한 뒤에 인산화-항-IκBα(phosphor-anti-IκBα) 항체와, 항-IκBα(anti-I κBα) 항체를 이용하여 분석하였다. 가자 추출물과 I3C가 IκBα의 인산화(phosphorylation)를 억제하고(a, 2번째 패널), IκBα의 강한 밴드를 통하여 가자 추출물이 NF-κB의 활성을 억제할 수 있음을 확인하였다(a, 3번째 패널). β-actin 발현은 대조군으로 사용하였다(a, 4번째 패널). (B) 가자 추출물은 인산화 p65가 세포 핵 추출물에 존재하지 않게 하였고(b의 아래쪽 패널), 인산화 p65는 세포질 추출물에 존재하였다(b의 가운데 패널). β-actin 발현은 대조군으로 사용하였다(b의 아래쪽 패널).
도 8은 인산화 p65의 위치를 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. Jurkat NF-κB 세포에 6시간 동안 TNFα(10 ng/ml)를 처리하면, 인산화 p65 (phospho-p65)를 확인할 수 있지만, 가자 추출물이 인산화 p65의 발현을 억제하였다(핵 안으로 들어가지 못하므로 녹색을 나타낸다). DAPI 이미지를 통해 세포 핵을 확인하여 알아내었다.
도 9는 NF-κB로 조절되는 유전자들을 분석한 그래프이다. 가자 추출물에서 IL8, MCP-1, 그리고 p65같은 유전자들의 발현은, TNFα(6h 처리)로 활성화된 세포의 경우와 비교하였을 때 각각 13배, 9배, 4배 감소하였다. 이는 다른 억제제로 알려진 I3C의 기능보다 훨씬 뛰어나다. 가자 추출물 및 TNFα를 함께 사용한 경우, TNFα 단독 자극보다 MCP-1의 발현이 현저히 감소하였다.
도 10은 서로 다른 가자 추출물 분획의 세포 기반 분석을 나타낸 것이다. Jurkat-NF-κB 세포는 4 개의 서로 다른 가자 추출물로 5 시간 동안 처리되어 세포 기반 분석이 수행되었다. Fr 2(10 μg/ml)가 다른 분획물 보다 큰 NF-κB 활성 세포감소율을 보여주었다(46.67%).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1: 방법

1-1: 가자 추출물의 준비

가자 열매 50 g에 1000 ml의 100% 증류수를 가하여 끓인 후, 끓는 물이 처음 넣은 물 부피의 반이 되면 거즈를 이용하여 침전물과 상등액을 분리하였다. 그 다음, 침전물에 다시 20배의 부피에 해당하는 물을 가하여 끊이고 다시 그 부피의 반이 되면 거즈를 이용하여 침전물과 상등액을 분리하여 처음 분리된 상등액과 합하였다. 그 다음, 회수한 상등액을 약 1/3 부피로 농축하여 4℃에서 7000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하고 동결건조하였다. 위 증류수 이외에 50% (v/v)수용성 메탄올, 50% (v/v)수용성 아세톤, 100% (v/v) 아세톤 용매를 이용하여 분리하여 가자 추출물을 얻었다.

1-2: 시약

마우스 재조합 TNFα를 Sigma-Aldrich(USA)로부터 구매하였다. 억제제 Bay11은 Calbiochem(UK)에서, Ery와 I3C는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. 세포배양 배지인 RPMI 1640, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle medium), FBS(fetal bovine serum), PS(penicillin-streptomycin) 용액은 Gibco Life Technologies(UK)에서 구매하였다.

1-3: 세포배양

Jurkat(인간 T 세포 림프종)과 NIH-3T3(마우스 파이브로블라스트) 세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 구해서 사용하였다. 세포는 95%의 공기와 5% CO₂ 습도를 가지는 환경으로 37 ℃를 유지하면서 배양하였다. Jurkat은 RPMI 1640 배지를 사용하였으며, NIH-3T3는 DMEM 배지를 사용하였고 각각 10% FBS 와 1% PS를 첨가하여 사용하였다.

1-4: 외부 유전자 도입( transfection ) 및 세포주 선택

Jurkat 과 NIH-3T3 세포를 상기 언급한 배지에서 배양하였고, 외부 유전자의 도입(transfection)은 마이크로포레이션(microporation) 방법 (iNCYTO, Korea)을 따라 Invitrogen사의 pLenti-bsd/NF-κB-bla CellSensor^TM 벡터를 사용하여 수행하였다. 우선, 1 X PBS(phosphate buffer saline) 현탁액에 포함되어 있는 1 X 10⁵ 개의 세포를 얻었으며, 4℃, 1000 RPM 에서 5 분 동안 원심분리(microcentrifuge)한 뒤에 상등액을 제거하고 40 μl의 마이크로포레이터 용액을 넣어 주었다. 그 뒤에는 10 μl의 NF-κB 플라스미드를 40 μl의 세포 현탁액에 넣어준 뒤 조심스럽게 섞었다. Jurkat 세포의 마이크로포레이션용 파라미터는, 펄스 전압(V)-1380, 펄스 간격 (ms)-30, 펄스 #1과 팁 타입 10 μl이고, NIH-3T3 세포용 파라미터는 펄스 전합V)-1740, 펄스 간격(ms)-10, 펄스 #3과 팁 타입 10 μl이다. 벡터에 브라스티사이딘 저항성(blasticidin resistance) 유전자(bsdR)가 있기 때문에, 양 세포주는 10 μg/ml의 블라스티딘 S HCl (Invitrogen)을 7일 동안 처리한 후에 선택되었다.

1-5: 세포 기반 분석( Cell based assay )

세포 기반 분석은 Gene Blazer technique(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 이는 형광에너지 공명이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)-기반-β-락타메이즈(lactamase)(bla) 리포터 분석이다. 베타-락타메이즈의 기질인 CCF2나 CCF4가 세포 내로 들어가게 되면, 상기 세포는 세포질에 존재하는 에스터라제 (esterase)로 기질을 절단(cleavage)되게 하고, 절단된 기질 분자가 빠르게 음전하성 기질로 변환되도록 한다. 그 다음 이를 통하여 자극을 받거나 활성을 가지게 된 세포는 푸른색 산물을 만들어내게 된다. 베타-락타메이즈가 존재하지 않는 경우에는 530 nm 파장의 녹색 형광을 나타내는 반면, 효소 활성에 의해 절단된 산물이 염색약을 분리하면 형광에너지 공명 이동이 붕괴되므로 408 nm의 파장에서 자극을 받아서 460 nm의 파장에서 푸른색 형광을 나타내게 된다. 이 과정에서, 세포는 맨 처음에는 200 μI 부피의 96 웰-플레이트에 10,000 cells/well의 농도로 도포되었다. 하룻밤 동안의 배양 뒤에 상기 배지는 제거되고, 각각의 상기 웰들은 사이토카인, TNFα, 억제제인 Bay11와 Ery, 그리고 I3C를 포함하는 배지에서 서로 다른 농도와 시간으로 처리되었다. 그 다음에 베타-락타메이즈 기질인 CCF4-AM 로딩 용액이 사용되었고, 상기 플레이트들은 5% CO₂의 습도를 가지는 37℃ 인큐베이터에서 90분간 배양된 뒤에, 위상차 현미경(phase contrast microscope)을 이용하여 460 nm로 방출되는 절단된 CCF4의 파란색 파장(활성화 상태)과 530 nm로 방출되는 CCF4의 녹색 파장을 필터를 통하여 확인되었다.

1-6: 세포 증식 분석( Cell proliferation assay )

세포의 증식 분석을 위하여, 테트라졸리움염(tetrazolium salts)의 한종 류인 PreMix WST-1을 Takara Bio에서 구입하여 사용하였다. 테트라졸리움염은 숙신산-테트라졸리움 환원효소(succinate-tetrazolium reductase)에 의하여 절단되어 포마즌 염료(formazen dye)가 되는데, 이는 미토콘드리아에서의 호흡 사슬에 존재하고 살아 있는 세포에서만 활성화된다. 신진대사가 활발할 세포에서 형성된 포마즌 염료의 양은 ELISA 리더를 이용한 흡광도를 측정을 통해 계산하였다. 이 과정에서, 세포는 96 웰-플레이트에 100 μl의 부피로 웰당 5 X 10³개의 밀도로 도포되었고 안정화를 위해 배양되었다. 그 뒤에는 처리시간과 농도에 따라서, PreMix WST-1 용액이 첨가되고 4 시간 동안 배양한 뒤에 450 ± 20 nm의 파장으로 흡광도가 측정되었다. 세포 생존률(cell viablity)는 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 % 생존률로 환산하여 세포의 증식을 50% 억제할 수 있는 농도(IC50 값)을 기준으로 계산하였다.

1-7: 웨스턴 블랏 분석

단백질 추출물(20 ㎍)은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 통하여 전기영동하였고, 단백질은 미세공성 PVDF 막에(polyvinylidene difluoride membrane, Schleicher & Schuell Bioscience, Inc., Keene, NH) 전기블랏팅(electroblotting)되었다. 그 뒤에는 상기 막은 한 시간 동안 블라킹(blocking)된 후 세척되었으며 1차 항체를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 세척을 한 뒤에는 상기 막은 2차 항체를 사용하여 한 시간 동안 인큐베이션되었다. 세척 과정을 거친 뒤에는 블랏(blot)된 부분들은 화학발광(chemiluminescence)용 키트 (ECL^TM Plus Western Blotting Detection Kit; GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 가시화하였다. 여기서 사용한 항체인 NF-κB p65(3034)와 phospho-NF-κB p65(ser536, 3033)는 Cell Signaling Technologies(Beverly)에서 구매하였고, IκBα(sc-56710), p-IκBα (sc-7977)는 Santa Cruz Biotechnology Inc(Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. 2차 항체는 당나귀 항-염소(donkey anti-goat)의 IgG-HRP(sc-2020)와, 항-마우스 (anti-mouse)의 IgG-HRP (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), 그리고 항-토끼(anti-rabbit)의 IgG-HRP(Jackson ImmunoRes. Lab. Inc.)를 사용하였다.

1-8: 정량 실시간 RT -PCR( Quantative real time RT - PCR )

실시간 RT-PCR은 SYBR Green PCR Master Mix(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) 및 7500 fast real time PCR system(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 수행하였다. 프라이머의 제작은 Primer Expres(Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 수행하였으며, 프라이머의 목록은 하기 표 1과 같다.

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
hlL1ß	5'-CGACACCCTCGTTATCCCATGTGTCG-3'	5'-CTCCGACCACCACTACAGCAAG-3'
hIL8	5'-AGGGTTGCCAGATGCAATAC-3'	5'-GCAAACCCATTCAATTCCTG-3'
hMCP1	5'-CTTCGGAGTTTGGGTTTGCTTGTC-3'	5'-AGTCTCTGCCGCCCTTCTGTG-3'
hp65	5'-TTGAGGTGTATTTCACGGGACC-3'	5'-GCACATCAGCTTGCGAAAAGG-3'

SYBR Green 분석용 반응 혼합물(reaction mixture)은 2 X SYBR^? Green PCR Master Mix(Takara Bio Inc., Shiga, Japan), 10 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머와, Jurkat-NF-κB cell에서 얻은 0.05 ㎍의 c-DNA가 사용되었다. 각각의 PCR 사이클에서, 축적된 PCR의 산물은 ds-DNA 결합 SYBR Green으로부터 발생하는 리포터 염색약의 형광의 증가를 모니터링하여 탐색하였다. PCR의 기본적인 과정은, 95℃에서 15 분간의 변성과정을 거친 뒤에 95℃에서 30초 간의 변성을 40 사이클 거치고, 60℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 1분간의 연장 과정을 통하여 진행되었다. 실시간 RT-PCR을 수행한 뒤, 60℃ 및 95℃ 사이의 온도 기울기 동안 분해곡선(dissociation curve, melting curve)이 만들어졌다. hGAPDH(human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다. 모든 결과는 2^-ㅿㅿCT 방법을 통하여 분석하였다(Pfaffl, M.W., Nucleic Acid Res. (2001) 29: 2003-2007).

1-9: 면역형광 분석

인산(phosphor) p65의 세포 핵으로의 이동(tranclocation)에 대한 가자 추출물의 효과는, 면역형광 분석(immunofluorescence analysis)을 통하여 수행하였다. 간단하게, 세포를 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액으로 상온에서 30분간 고정한 뒤에, 트리톤 X-100으로 투과성을 가지게 하고(permeabilize), 10%의 말 혈청(horse serum)을 이용하여 블라킹(blocking)하였다. 고정된 세포는 하룻밤 동안 포스포-NF-κB p65 항체(ser536)와 인큐베이션시켰다. 적절한 세척 과정을 거친 뒤에, 상기 세포들은 플루오레세인(fluorescein) 항-토끼(anti-rabbit) IgG (FI-1000, Vector Laboratories)와 한 시간 인큐베이션시키고, DAPI(H-1200, Vector Laboratories)를 가진 벡터쉴드 마운팅 배지(vectashield mounting medium; H-1200, Vector Laboratories)에 올렸다. 최종적으로 상기 세포들을 공초점 현미경으로 분석하였다.

실시예 2: NIH -3 T3 - NF -κB 및 Jurkat - NF -κB 세포에 사이토카인 처리

염증유발성 사이토카인(proinflamatory cytokine)인 TNFα는 TNF 수용체의 삼량체를 형성하여(trimerization) NF-κB와 AP-1 두 종류의 전사인자 (transcriptional factors)의 활성을 촉진시킨다는 것이 보고되었다(Baud et al . Trends Cell Biol . (2001) 11: 372-377.). 상기 세포주의 TNFα의 효과는 Gene Blazer 기술을 이용하여 위상차 현미경으로 분석하였다. 도 1 에 나타난 것과 같이, NIH-3T3-NF-κB 세포의 경우에는 TNFα(10 ng/ml)를 처리하자 5 시간 뒤에 35%의 세포만이 활성을 보이는 반면에, Jurkat-NF-κB 세포의 경우는 80%의 활성 세포를 가짐을 알 수 있다.

다음으로, 세포기반 분석을 사용하여 Jurkat-NFκB 세포에서 TNFα의 효과를 확인하였다. 도 2는 Jurkat-NFκB 세포에서의 TNFα의 효과를 나타낸 것이다. Jurkat-NFκB 세포에 TNFα 10 ng /ml)를 4 시간 처리하면 세포의 약 90%가 NF-κB 활성을 보였으며, TNFα 를 처리하지 않은 Jurkat-NFκB 세포에서는 NF-κB활성화된 세포가 56.25 ±2.37% 확인되었다. 각각 세 번의 실험을 수행하였으며, ±는 표준오차를 나타낸다.

NF-κB가 인간의 다발성 골수종 (multiple myeloma;MM))에서 항시적 활성을 가짐이 이미 알려졌으며(Bharti, A. C. et al., Blood (2003) 101: 1053-1062.), 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocyte leukemia)에서도 이러한 현상이 나타남이 보고되어 있다(Kordes, U., D. et al., Leukemia (2000) 14: 399-402., ; Kim, H. J. et al ., Cell Death Diff . (2006) 13: 738-747.). 그러나, NF-κB 신호전달 경로 유전자의 돌연변이는 오히려 다양한 악성 종양에서 자주 발생된다. 적절한 성장인자에 의해 활성화되는 NIK(NF-κB inducing kinases)나 NF-κB1-p105의 과발현은 NF-κB가 항시적 활성을 가지도록 한다(Courtois, G., and T. D. Gilmore Oncogene (2006) 25: 6831-6843.). 본 실시예에서 Jurkat 세포는 NF-κB의 활성에 있어서 마우스의 파이브로블라스트 세포보다 두 배 이상의 활성을 가짐을 보여준다. 또한 TNFα에 의해 유도된 NIH-3T3-NF-κB 세포의 활성상태를 확인하였으며, 이런 TNFα에 의한 NF-κB의 활성을 Ery가 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 3: 억제제와 사이토카인의 처리 시간과 농도에 따른 세포증식 분석

Jurkat-NF-κB 세포의 생존 능력(viability)에 대한 I3C와 가자 추출물(TC) 효과를 측정하였다. 도 3은 MTT 분석 기법을 이용한 IC50값을 나타내는 그래프이다. 가자 추출물(50 μg/ml)을 6 시간 인큐베이션 한 경우는, 세포의 생존능력이 거의 100 %가 나와서 음성 대조군처럼 나왔다. 아폽토시스 유발제로 알려진 스타로스포린 (staurosporine; STS) (2 μM)을 6 시간 인큐베이션 한 경우는 세포가 9.51 ±2.58% 만 생존하였다. 모든 실험값은 세개 웰(well)의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.

실시예 4: Jurkat - NF -κB 세포에서의 I3C 와 가자 추출물의 효과

Jurkat-NF-κB 세포에서 NF-κB의 항시적 활성이 억제되는 것을 확인할 필요가있다. Ery와 Bay11는 억제 능력이 작기 때문에, Jurkat 세포에 I3C를 처리하였다. I3C는 글루코시놀에이트(glucosinolate)나, 글루코브라시신(glucobrassicin)의 자가분해 (autolysis) 산물로서, 유채속(Brassica species) 식물이나, 십자화과 채소(cruciferous vegetable-양배추 브로콜리, 콜리플라워 및 방울다다기 양배추(brussels sprouts))에서 NF-κB의 활성 경로를 막고, 관련 유전자들의 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Takada, Y., M. et al ., Blood (2005) 106:2: 641-649.). 본 실시예에서는, I3C 처리를 통하여 TNFα로 유도된 NF-κB의 활성이 감소함을 확인하였다. 이 과정에서 농도와 시간은 중요한 역할을 한다. 도 4에 I3C를 각각 다른 농도별로 처리한 것과 TNFα와 함께 처리한 것을 나타내었다. TNFα와 I3C(10 μg ng/ml과 1m M)를 각각 처리한 경우와 I3C만을 1 mM로 처리한 경우에 각각 8.39%와 8.82%의 활성 세포가 확인되었다. TNFα(10ng/ml)만을 처리한 것은 양성 대조군으로 83%의 활성 세포가 관찰되고, 음성 대조군은 85%의 활성 세포를 보였는데 이는 Jurkat-NF-κB 세포의 경우에는 자동적으로 자극을 받는 특징이 있기 때문이다. I3C는 IKK의 억제나 IκBα의 인산화 (phosphorylation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 분해(degradation)와 연관된 세포나 p65와 인산화 (phosphorylation), 세포 핵으로의 이동(nuclear translocation), 그리고 아세틸화(acetylation) 등과 연관된 세포의 종류에 상관없이 다양한 원인에 의한 NF-κB의 활성 증가를 억제한다. I3C는 또한 NF-κB에 의하여 조절되는 리포터 유전자 (reporter gene)의 전사를 하향 조절하고, 세포 증식(cell proliferation), 항아폽토시스(anti-apoptosis), 외부 물질의 침입(invasion)등과 관련된 유전자 산물을 하향조절한다(Takada, Y., M. et al ., Blood (2005) 106:2: 641-649.). 도 5a에 나타난 것과 같이, I3C 1mM를 TNFα 에 의해 유도된 Jurkat-NF-κB 세포에 시간과 농도를 다르게 하여 처리하였을 때, 특히 I3C 를 3 시간과 4 시간 처리하였을 때, NF-κB의 활성이 급격히 낮아짐을 알 수 있다.

그 다음으로는, TNFα에 의해 유도된 Jurkat-NF-κB 세포에서 I3C 전처리시의효과에 대하여 알아보았다. 12.5 μM의 Bay11을 TNFα에 의한 자극을 주기 30분 전에 처리한 경우에, p65의 세포핵 내로의 이동이 급격하게 억제되었는데, 이는 p65가 IκBα와 결합하여 세포질에서 있고 오직 IκBα의 인산화 (phosphorylation)에 의해서만 방출됨을 의미한다(Nelson, G. et al., J. Cell Sci . (2002) 115: 1137-1148.). 1 mM의 I3C를, TNFα를 처리하기 30분 전에 먼저 처리한 경우에는 11.52%의 자극을 보인 반면에, I3C를 처리한 후 30분 후에 TNFα를 처리하면 55.90%의 자극이 나타난다(하기 표 2 참고). TNFα 처리 전에 I3C 1 mM를 처리하면, IκBα의 동역학(kinetics)적 분해가 늦어지기 때문이다. TNFα에 의한 자극을 주기 30분 전에 세포에 1 mM의 I3C를 처리하는 경우, NF-κB의 활성이 급격하게 억제되었는데, 이는 p65와 IκBα가 세포질에 결합하여 존재하면서, IκBα의 인산화가 일어날 경우만 이 결합이 떨어져 p65의 방출이 일어남을 나타낸다. 도 5b를 보면, I3C(1 mM)과 가자추출물(TC,50 μg/ml) 처리시 각각 8.80 ± 0.97%와 18.36 ± 1.67% 의 활성 세포를 보였는데, 이는 5 μg/ml의 Bay11을 처리한 경우(76.08%)나 10 ng/ml의 Ery를 처리한 경우(92.53%)에 비해 유의하게 낮은 수치였다. 이 결과는 I3C 및 TC가 TNFα에 의하여 유도된 NF-κB의 활성증가에 대한 억제제로서의 가능성이 크다는 것을 나타낸다.

TNF α처리 30분 전 I3C 처리	활성화된 세포(%)	TNF α처리 30분 후 I3C 처리	활성화된 세포(%)
I3C + TNFα (1 mM+10 ng/ml)	11.52 ± 2.04	TNFα + I3C (10 ng/ml+1 mM)	55.90 ±5.11
I3C + TNFα (0.5 mM +10 ng/ml)	79.07 ±3.09	TNFα + I3C (10 ng/ml+0.5 mM)	85.29 ±3.66
I3C + TNFα (0.1 mM +10 ng/ml)	87.02 ±2.35	TNFα + I3C (10 ng/ml+0.1 mM)	84.68 ±2.16

본 실시예에서는 I3C를 Jurkat-NF-κB 세포의 NF-κB 억제제로 선택하였다. 그 다음 가자 추출물(TC)을 Jurkat-NF-κB 세포에 다양한 시간 및 농도에 따라 처리하였다. 세포기반 분석(Cell based assay)를 통하여 가자 추출물이 NF-κB의 활성을 항시적으로 억제하는 것을 확인하였다. Jurkat-NF-κB 세포는 서로 다른 농도의 가자 추출물로 처리되어 5 시간 동안 인큐베이션 되었고, 50 μg /ml의 가자 추출물로 처리하였을 때 불과 18.36%의 세포 생존만이 나타났다. 이는 가자 추출물의NF-κB의 억제 능력이 뛰어남을 보여준다(도 6).

실시예 5: 가자 추출물에 의한 IκBα의 분해와 인산화 과정 억제

세포에 가자 추출물, I3C 및 TNFα를 처리하였다. IκBα의 인산화(phosphorylation), 유비퀴틴화(ubiquitination), 단백질의 가수분해 (proteolytic degradation)가 일어난 후에, NF-κB가 세포 핵 내로 이동한다. NF-κB의 활성 억제가 IκBα의 분해에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 세포에 가자 추출물과 TNFα 처리 후 5 시간 37℃에서 배양하였다. 그 결과, TNFα에 의한 IκBα의 분해를 확인하였는데, 가자 추출물을 처리한 경우에는 이미 알려진 억제제인 I3C를 처리한 경우와 같이 IκBα의 인산화 과정이 보호됨을 알 수 있었다. (도 7a 2번째 및 3번째 패널). 세린-인산화된 IκBα를 인지할 수 있는 항체를 사용하여 웨스턴 블랏(Western blot)을 수행한 결과, 가자 추출물과 I3C는 Jurkat NF-κB 세포에서 IκBα의 인산화를 강하게 억제함을 알 수 있었다(도 7a의 2번째 패널).

실시예 6: 가자 추출물에 의한 p65 인산화 억제

전사 활성을 가지기 위해서는 인산화된 p65가 필요하다(Ghosh, S., et al ., Annu. Rev . Immunol. (1998) 16:225-260.). 따라서 가자 추출물이 세린 잔기 536에서 p65의 인산화에 주는 영향을 조사해 보았다. 가자 추출물을 처리한 세포의 핵 추출물(nuclear extract)에서는 p65의 인산화를 나타내는 밴드를 확인할 수 없었다(도 7). 가자 추출물이 p65의 세포 핵 내로의 이동을 조절하는지 확인하기 위해 면역형광 분석(immunofluorescence assay)를 수행하여, 가자 추출물이 인산화된 p65의 세포 핵 내 이동을 억제하는 것을 확인하였다. 웨스턴 블랏을 통하여 p65가 세포 핵의 추출물 속에 존재하는 것을 확인하였다(도 7a의 1번째 패널). 가자 추출물은 인산화 p65가 세포 핵 추출물에 존재하지 않게 하였고(도 6b의 아래쪽 패널), 인산화 p65는 세포질 추출물에 존재하였다(도 7b의 위쪽 패널). 또한 TNF에 의하여 유도되어 인산화된 p65가 존재하는 경우에도, 가자 추출물을 5 시간 동안 세포에 처리하면 인산화된 p65를 더 이상은 확인할 수 없다(도 8).

실시예 7: 가자 추출물에 의한 TNF -유도성 NF -κB 의존적 유전자 발현의 억제

NF-κB는 IL8, IL1β, MCP1와 같은 염증반응 관련 단백질들의 발현을 조절하기 때문에, 이들 염증 유전자의 TNFα 유도성 발현이 가자 추출물에 의해 조절되는지 알아보았다. 본 실시예에서는 TNFα는 IL8, IL1β, MCP1와 같은 유전자들의 발현을 유도하였으며, 가자 추출물과 I3C는 이 유전자들의 발현을 급격하게 감소시켰다(도 9). 가자 추출물은 또한 p65 유전자의 발현을 억제하였다.

실시예 8: 서로 다른 가자 추출물 분획의 Jurkat - NF -κB 에 대한 효과

가자 추출물 분획을 서로 다르게 수행하여, 어떤 분획물이 Jurkat-NF-κB 세포에서 적절한 억제 효과를 나타내는지 살펴보았다. 서로 다른 용매를 사용하여 4개의 가자 추출물 분획물을 분리하였다. 분획물 1, 2, 3 및 4는 각각 100% 증류수, 50%(v/v)수용성 메탄올, 50%(v/v)수용성 아세톤, 100%(v/v) 아세톤 용매를 이용하여 분리하였다. 세포 기반 분석을 수행하여 NF-κB에 대한 각각의 분획물의 효과를 분석하였다. Jurkat-NF-κB는 4 가지 서로 다른 분획 추출물로 5 시간 동안 처리되었는데, 분획물 2(10 μg/ml)가 가장 높은 NF-κB 활성 세포 감소율(46.67%)을 보여주었다(도 10).

실시예 9: 가자 추출물의 IκBα 인산화 저해 효과

도 11은 가자 추출물(TC)과 TNFα를 함께 처리했을 때 IκBα 인산화의 저해를 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. 가자 추출물(TC) 50 μg/ml 과 TNFα(10 ng/ml)을 함께 처리했을 때, 인산화 IκBα의 밴드가 I3C와 TNFα를 처리했을 때보다 감소함을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 가자 추출물이 NF-κB의 활성을 억제하고 NF-κB에 의해 조절되는 유전자의 발현을 억제함을 알 수 있다. 따라서, 가자 추출물은 염증반응과 암의 치료에 있어서 필수적인 성분으로 기능할 가능성이 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 가자 추출물을 포함하는 NF-κB 억제제는 암, 면역질환 및 신경계 질환의 예방, 개선 및 치료를 위해 의학적 분야에서 이용될 수 있다.

Claims

열수추출한 가자 열매 추출물을 활성 성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 NF-κB 활성 억제제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 NF-κB 의 활성 억제는 IκBα의 분해 및 인산화를 억제하여 NF-κB 가 핵 내로 이동하는 것을 저해함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 NF-κB 활성 억제제.
제1항에 있어서, 상기 NF-κB 의 활성 억제는 p65의 인산화를 억제하여 NF-κB 가 핵 내로 이동하는 것을 저해함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 NF-κB 활성 억제제.
열수추출한 가자 열매 추출물을 활성 성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 및 치료용으로 이용되며, NF-κB에 의해 조절되는 유전자의 전사 억제제.
제5항에 있어서, 상기 NF-κB에 의해 조절되는 유전자는 TNF-α, 인터루킨-1β, 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인터루킨-8, GMCSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), RANTES, MIP-1α(macrophage inflammatory protein-1α), MCP-1(macrophage chemotatic protein-1), Eotaxin, iNOS, COX-2, 5'-리폭시제나아제(5'-lipoxygenase), cPLA2, ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴(E-selectin), 인터루킨-2 수용체, T-세포 수용체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 염증성 질환의 예방 및 치료용으로 이용되는, 유전자의 전사 억제제.
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