KR20100073528A - 디에콜 화합물을 함유하는 퇴행성 신경질환 치료 및 예방용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디에콜(Dieckol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 활성화된 미세아교세포(microglia)에 있어서 활성산소종(reactive oxygen species:ROS)의 생성 및 NF-κB의 활성화를 억제하는, 갈조류 유래의 디에콜(Dieckol) 화합물의 용도에 관한 것이다. 상기 디에콜 화합물은 퇴행성 신경질환에 대한 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

에클로니아 카바, 디에콜(Dieckol), NF-κB, 퇴행성 신경질환

Description

디에콜 화합물을 함유하는 퇴행성 신경질환 치료 및 예방용 조성물 {Composition containing Dieckol for treating and preventing neurodegenerative disease}

본 발명은 디에콜(Dieckol) 화합물의 신규한 용도에 관한 것이다.

신경교세포 중 미세아교세포(microglia)는 중추신경계 신경교세포의 10-12%를 차지하는 세포로서 1932년 리오 오르테가(Rio-Hortega)의 형태학적인 연구와 조직염색 방법에 의해 처음으로 보고되었다. 미세아교세포(microglia)는 조직내에서 변성된 뉴런(neuron)과 이물질 등을 잡아먹는 작용을 하여 물질의 운반과 파괴, 제거 및 병적 대사 물질의 청소 등중요한 역할을 하여 일반적으로 중추신경계에 존재하는 대식세포(macrophage)로 여겨진다.

또한, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron)와 다른 신경교세포들(astrocytes, oligodendrocytes)과 구별되는 특징적인 세포표면 항원을 발현하고, 탐식작용 등 대식세포와 유사한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미세아교세포는 발생과정 중에 이들세포의 전구 세포로 여겨지는 단핵구세포(monocyte)들이 중추신경계에 들어와 분화한 것으로 알려져 있는데, 중추신경계내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하 며, 이때 감염 장소로 이동하거나 국소적인 증식을 통해 감염미생물을 탐식하고 손상된 신경세포들의 잔유 물질들을 소화하게 된다.

미세아교세포는 중추신경계에서 자기방어라는 본래의 기능을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β, 반응성 산소 (ROS) 혹은 질소 화합물 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래하게 된다.

최근, 알츠하이머(Alzheimer), 파킨슨병(Parkinson) 등의 퇴행성 신경질환뿐 아니라 외상 및 허혈 상태에 따른 신경세포 손상에도 이러한 미세아교세포의 과민 활성화가 관련되어있다는 연구 보고가 나오고 있으며[Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases. Gonzalez-Scarano, F and Baltuch, G. Annu. Rev. Neurosci. 22:219-40 (1999)], 이들 활성화된 미세아교세포를 억제하거나 활성화된 미세아교세포가 분비하는 염증유발 물질들의 작용을 막는 치료법이 개발되고 있다.

즉, 미세아교세포의 활성화로 대변되는 신경염증반응이 다양한 신경조직손상에 있어서 중요한 병리적 역할을 수행하며, 궁극적으로 이러한 미세아교세포의 염증 활성화를 저해함으로써 신경조직손상 억제방안을 모색할 수 있고, 임상적으로 적용할 수 있는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료제의 개발이 가능할 것이다.

한편, 에클로니아 카바(Ecklonia cava)는 미역과에 속하는 해조류로서 우리나라 동해 남부와 제주도를 포함한 남해안 일대에 서식한다. 에클로니아 카바는 바 다식물의 폴리페놀(polyphenol)이라하는 플로로탄닌(phlorotannin)이 많이 함유되어있다. 특히 최근 노화를 비롯한 여러 가지 성인병의 원인이 자유 라디칼(free-radical) 에 의한 산화임이 밝혀지면서, 플로로탄닌과 같은 강한 항산화 활성 물질을 다량 함유한 에클로니아 카바가 새로운 기능성 소재로서 주목을 받고 있다. 에클로니아 카바에는 플로로탄닌 외에도 알파-토코페롤과 같은 항산화물질도 함유되어있다.

최근 에클로니아 카바의 생리활성 성분과 이의 이용에 대한 연구가 진행되고 있다. 에클로니아(Ecklonia) 종으로부터 분리된 주요한 플로로탄닌 중 하나인 디에콜은 다양한 생물학적 및 병리학적 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있는데, 예를 들어, 자유 라디칼 제거활성(Joe et al., 2006), 간 보호 활성(hepatoprotecive activity)(Kim, An, Yoon, Nam & Choi, 2005), 기억 강화 능력(Myung et al. 2005), 살균활성(Nagayama, Iwamura, Shibata, Hirayama & Makamura, 2002), HIV 역전사 및 프로테아제 저해 활성(Ahn et al., 2004), 티로시나아제 억제 활성(Kang et al., 2004) 등이 알려져 있다.

이처럼, 종래 연구에서 디에콜이 현저한 항염증 및 항산화 성질을 가지는 것이 알려져 있지만(Hwang et al., Shin & Stoner, 2006;Myung et al., 2005; Kang et al., 2004), 염증 매개의 신경퇴행에서 디에콜의 영향 및 분자적 메카니즘은 규명되지 않았었다.

이에 본 발명자들은 에클로니아 카바로부터 추출한, 플로로타닌 성분인 디에 콜이 NO, PGE₂, ROS, iNOS 및 COX-2 발현, 사이토카인(TNF-α, IL-1β)의 생성을 억제하는 것을 확인하고, 즉, 미세아교세포에서의 염증 매개체의 생성 및 활성화를 저해하는 디에콜의 영향 및 분자적 메카니즘을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 디에콜 화합물의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료적 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 디에콜 화합물의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 디에콜 화합물을 이용하여 활성산소종의 생성 및 NF-κB의 활성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 식 중, R은 수소, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알케닐, 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐이고, 바람직하게는 수소이다.

상기 디에콜(dieckol) 화합물은 갈조류 유래, 바람직하게는 아이세니아(Eisenia) 또는 에클로니아(Ecklonia) 유래인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 디에콜(dieckol) 화합물은 활성산소종 생성 및 NF-κB의 활성 억제; NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65 단백질의 핵으로의 전이(translocation) 억제; TNF-α 또는 IL-1β의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 활성 억제; 일산화질소(NO) 및 PGE₂의 생성 억제; iNOS(inducible NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2) 유전자의 발현 억제; 및 p38키나아제의 활성을 억제한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 디에콜 화합물을 이용하여 활성산소종(reactive oxygen species:ROS)의 생성 및 NF-κB의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

갈조류 유래의 디에콜 화합물 화합물은, 활성화된 미세아교세포에 의해 생성되는 NO, PGE_2, TNF-α나 IL-1β의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 등의 염증 매개체의 생성 및 활성을 전사 수준에서 억제하므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 디에콜(Dieckol)화합물의 신규 용도에 관한 것이다. 디에콜(Dieckol)은 폴리페놀계 화합물인 플로로탄닌(phlorotannins)의 일 종류로 항산화 작용 및 항염증 작용을 한다.

특히, 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 및 NF-κB의 활성 억제; TNF-α 또는 IL-1β의 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 활성 억제; 일산화질소(NO) 및 PGE₂의 생성 억제; iNOS(inducible NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2) 유전자의 발현 억제; 및 p38키나아제의 활성을 억제하고, 실험동물에서 독성을 나타내지 않으므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증과 같은 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다

본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 나타내는 디에콜 화합물의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료적 용도에 관한 것이다.

<화학식 1>

상기 식 중, R은 수소, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알케닐, 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐이다. 가장 바람직하게는 상기 R은 수소이다. 대표적인 화합물1은 디벤조-1,4-디옥신(dibenzo-1,4-dioxin)을 포함한다.

"알킬"은 접두어에 명시된 탄소수를 지니는 선형의 포화된 일가 탄화수소 라디칼 또는 분지형의 포화된 일가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들어, C₁-C₆ 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 2 프로필, 3차-부틸, 및 펜틸 등을 포함함을 의미한다.

"알케닐"은 접두어에 명시된 탄소원자의 수를 지니며 하나 이상의 이중 결합을 지니지만 3 초과의 이중 결합은 지니지 않는 선형의 일가 탄화수소 라디칼 또는 분지형의 일가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들어, C₂-C₆ 알케닐은 에테닐,프로페닐, 및 1,3-부타디에닐 등을 포함함을 의미한다.

본원에서의 정의 각각의 경우(예, 알킬, 알케닐, 알콕시, 아르알킬옥시), 접두어가 알킬 부분에서의 주쇄 탄소원자의 수를 명시하지 않고 있으면, 이의 라디칼 또는 부분은 6 이하의 주쇄 탄소원자를 지니는 것이다.

"페닐(phenyl)"은 탄소와 수소로 이루어진 작용기로 -C₆H₅ 의 화학식을 가지고, 6개의 탄소 원자는 순환 고리 구조를 이루며 배열되어 있는 라디칼을 의미한다. 페닐기는 아릴기의 일종이다. 페닐기에 히드록시기가 한 개 결합되어 있는 경우를 히드록시페닐이라 하고, 히드록시기가 두 개 결합되어 있는 경우를 히드록시페닐이라 한다.

본 발명의 상기 디에콜 화합물은 화합물은 갈조류, 특히 아이세니아(Eisenia) 또는 에클로니아(Ecklonia) 패밀리로부터 분리하여 제조할 수 있다.

상기 갈조류에 대하여 구체적으로, 아이세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 아이세니아 아르보레아(Eisenia arborea), 아이세니아 데스마레스티오데스(Eisenia desmarestioides), 아이세니아 갈라파제니스(Eisenia galapagensis), 아이세니아 매소니(Eisenia masonii), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome), 에클로니아 카바(Ecklonia cava), 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 에클로니아 라디아타(Ecklonia radiata), 에클로니아 바이시클리스(Ecklonia bicyclis), 에클로니아 바이런시네이트(Ecklonia biruncinate), 에클로니아 부시날리스(Ecklonia buccinalis), 에클로니아 카에파에스팁스(Ecklonia caepaestipes), 에클로니아 엑사스퍼타(Ecklonia exasperta), 에클로니아 파스티기아타(Ecklonia fastigiata), 에클로니아 브레빕스(Ecklonia brevipes), 에클로니아 아라보레아(Ecklonia arborea), 에클로니아 라티폴리아(Ecklonia latifolia), 에클로니아 무라티(Ecklonia muratii), 에클로니아 라디코사(Ecklonia radicosa), 에클로니아 리타디아나(Ecklonia richardiana) 또는 에클로니아 라이티(Ecklonia wrightii)을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 에클로니아 카바(Ecklonia cava)를 사용할 수 있다.

상기 디에콜 화합물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 디에콜 화합물은,

(a) 에클로니아 카바 분말을 유기용매로 추출하는 단계; 및

(b) 상기 유기용매 추출물을 분획하여 크로마토그래피로 화합물을 분리하고 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

단계 (a)에서 유기 용매로, 에탄올, 메탄올 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 메탄올을 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 일구체예에서 E.cava는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있으며, 깨끗이 세척하고 건조하여 사용한다. 건조된 E.cava의 분말을 적당한 량의 유기용매, 바람직하게는 메탄올로 추출하고, 수득한 메탄올 추출물을 에틸 아세테이트로 분획한 한다. 그리고 용매의 단계적 기울기(stepwise gradient)를 이용하여 크로마토그래피로 본 발명에 따른 디에콜 화합물을 분리하고 정제한다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 화합물의 분리 및 정제는 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해, 예를 들면, 간섭기를 적절히 보호하거나, 당분야에 공지된 다른 적당한 시약으로 교체하거나, 또는 반응 조건을 통상적으로 변화시킴으로써 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 화 합물1의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 제조예들과 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

상기와 같은 방법으로 수득할 수 있는 본 발명의 상기 화학식 1의 디에콜 화합물은 염증 매개의 신경 퇴행과 관련하여 이하와 같은 기능을 가진다.

(1) 본 발명의 상기 화학식 1의 디에콜 화합물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 자극된 미세아교세포(microglia)에서 활성산소종 생성 및 NF-κB의 활성을 억제한다.

미세아교세포(microglia)는 중추신경계내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β 과 같은 전염증성 사이토킨(cytokine); 활성산소종 (ROS); 혹은 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2) 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래한다. 그 중에서도, NO 합성효소(NO synthase), 특히 유도성 일산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)는 LPS 또는 상기의 전염증성 사이토카인 등의 자극에 의해서 과다발현되어 NO의 생성을 증가시킴으로써 미세아교세포에서의 염증에 관련된 병리학적 증상에 관여한다. 또한, PGE2는 COX-2의 활성에 의해 생성되는 염증 산물로서, COX-2는 생체내 염증부위에서 미토겐, 시토신 및 LPS의 자극에 의해 유도된다.

내독성 물질인 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 이러한 미세아교세포 에서의 염증유발 물질의 유도물질로서, NF-κB의 활성화를 유도하여 염증반응을 일으키는 상기 물질들의 생성을 촉진한다.

상기 NF-κB는 면역 및 항염증 반응과 관련한 다양한 유전자의 다면발현성 조절자(pleiotropic regulator)로 알려져 있으며, NF-κB 활성은 다양한 사이토카인 및 효소의 발현에 결정적인 요인으로 작용한다(Roshak et al., 1996). NF-κB는 iNOS와 COX-2 프로모터 상류에 위치한 NF-κB 사이트에 결합하여 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2 유전자의 상향조절에서 중요한 역할을 한다(Lee, Sung, Kim, 2003). 저해 단백질(inhibitory protein), IκB 유사 단백질과 결합된 비활성의 전구체로서 이가동의 NF-κB 복합체(heteromeric NF-κBcomplex)가 세포질에 격리되고, 시토졸 IκB 단백질(cytosolic IκB protein)의 감소와 관련된 핵내 p65 단백질의 증가에 따라 LPS가 NF-κB의 활성을 유도하고, 특정 위치에 결합한 NF-κB로 유전자를 활성화시키기 위해 NF-κB의 핵내 이동이 이루어진다(Akira & Takeda, 2004).

즉, 염증반응을 일으킬 수 있는 외부자극이 가해지는 경우, 세포 내에서 NF-κB가 활성화되고, 이에 의해 TNF-α, IL-1β 등의 프로-염증성 사이토카인들의 발현이 유도되고, 생성된 프로-염증성 사이토카인들은 iNOS 및 COX-2를 코딩하는 유전자의 발현을 자극시켜, 염증반응에 관여하는 NO 및 PGE₂ 물질을 생성하여 염증반응을 일으킨다. 이러한 기작 이외에도, NF-κB는 iNOS 유전자의 발현을 직접적으로 활성화시킬 수 있고, 이외 다른 염증에 관련된 유전자를 발현할 수 있으며, TNF- α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들도 염증반응에 관련하는 다른 생물학적 반응들도 활성화시킨다.

본 발명에 따른 디에콜 화합물은 농도 의존적으로 상기와 같은 NF-κB 활성을 억제하는 기능을 가지는데, 디에콜은 IκB의 분해를 방지함에 따라 LPS에 의해 유도되는 NF-κB 활성화를 방지한다. 그리고, NF-κB의 핵으로의 이동은 NF-κB 활성화에 따른 의존적 전사를 요하므로, 디에콜의 NF-κB 활성화를 저해효과는 NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65 단백질의 핵으로의 전이(translocation)를 억제하는 효과로 이어진다.

따라서, 결과적으로 상기 기작에 따라, NF-κB의 염증반응 관련 전사인자, TNF-α, IL-1β 등의 프로-염증성 사이토카인들, iNOS 및 COX-2를 코딩하는 유전자의 발현이 억제된다.

한편, 세포에 산화적 손상을 일으키는 요인이 되는 활성산소종(ROS)은, 산소의 분압이 높을 때, 포유동물 등의 유산소호흡을 하는 생명체의 호기성 물질대사에서 발생하는 부산물이다.

ROS의 과잉 발생은 NF-κB의 활성을 경유하여 전염증성 사이토카인의 생성을 자극한다. 항산화제의 신경 보호 효과는 결국 항산화 효소의 증가와 ROS의 감소에 의한 것이다(Bastianetto & Quirion 2004; Rosenstock, Carvalho, Jurkiewicz,Frussa-Filho, & Smaili, 2004).

게다가, 세포내 ROS는 NF-κB 활성 조절에 관여하는 NF-κB 신호 변환 경로를 조절할 수 있다. 항산화제에 의한 ROS의 제거는 전염증성 매개체의 NF-κB-의존 적 생성을 억제하고, 이에 따라 LPS 독성을 방지한다(Victor, Rocha, Esplugues, De la Fuente, 2005; Park et al., 2004))

과산화 음이온, 하이드록시 라디칼, 과산화수소를 포함하는 ROS는 많은 신경 퇴행성 질환의 발병에서 복합적인 역할을 하고 있으므로, ROS는 미세아교세포에서 신호분자로 기능할 수 있다. 종래 연구에서 디에콜이 현저한 항염증 및 항산화 성질을 가지는 것이 알려져 있지만(Hwang, Chen, Nines, Shin & Stoner, 2006), 염증 매개의 신경퇴행에서 디에콜의 영향 및 분자적 메카니즘은 규명되지 않았었다. 또한, 이미 생성된 활성산소종을 제거하는 것보다는 미리 활성산소종의 생성을 억제하는 것이 질병의 예방차원에서 더욱 바람직하나, 활성산소종의 생성을 억제하는 방법에 대한 연구개발은 아직까지 미진한 상황이다. 더구나, LPS에 의하여 생성되는 활성산소종의 생성과 활성산소종에 의한 NF-κB의 활성화만을 선택적으로 억제하는 것은 쉽지 않다.

본 발명에 따른 디에콜 화합물은 미세아교세포에서 ROS를 제거하는 기능을 가지고 있고, 이는 NF-κB 활성에서의 디에콜 억제효과에 대한 메카니즘과 관련이 있다. 즉, 디에콜에 의한 ROS 생성 억제는 결국 NF-κB 의존적 사이토카인, iNOS 및 COX-2 발현의 억제로 이어져 미세아교세포에서의 염증을 감소시키게 되는 것이다.

(2) 따라서, 본 발명의 상기 화학식 1의 디에콜 화합물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 자극된 미세아교세포(microglia)에서, 활성산소종 생성 및 NF-κB의 활성을 억제에 의해 일산화질소(NO), 프로스타글란 딘(prostaglandin) E2(PGE2) 및 전염증성 사이토카인의 생성을 억제한다.

본 발명의 갈조류로부터 분리된 디에콜은 미세아교세포에서 NO, PGE₂을 농도 의존적으로 현저하게 억제할 수 있으며, 신경 세포 손상을 유도하는 TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성 역시 어떠한 세포 독성없이 농도 의존적으로 억제하므로, 염증 매개의 퇴행성 신경질환에 유효한 치료 및 예방효과를 나타낸다.

또한, 상기 디에콜은 iNOS와 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현을 억제시키는데, 이는 디에콜의 작용이 전사 수준에서 일어남을 의미한다.

(3) 본 발명의 상기 화학식 1의 디에콜 화합물은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의하여 자극된 미세아교세포(microglia)에서, p38키나이제의 활성을 저해하여 염증성 매개체의 활성을 억제한다.

MAPK(mitogen-activated protein kinase)는 세포 성장 및 분화 조절에 결정적인 역할을 하고, 사이토카인 및 스트레스에 대한 세포적 반응의 영향을 받는 것으로 알려져 있고, NF-κB의 활성화에도 중요한 역할을 할 뿐 아니라 iNOS 및 COX-2 유전자 발현에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 디에콜에 의한 NF-κB 활성의 저해는 MAPK 경로를 통해 매개될 수도 있다. 즉, LPS에 의한 자극에 의해서 인산화된 ERK-1/2, JNK 및 p38 키나아제에 대하여 디에콜을 처리하면, p38 키나이제의 활성이 현저히 억제된다. 반면, ERK-1/2, JNK는 디에콜의 영향을 받지 않는다.

그러므로 본 발명에 따른 디에콜은 p38의 인산화를 저해하는 기작을 통해서 도 NF-κB의 활성을 억제하고 iNOS 및 COX-2 유전자 발현을 억제할 수 있다.

따라서, 본 발명은 NO, PGE₂, ROS, iNOS 및 COX-2 발현, 사이토카인(TNF-α, IL-1β)등의 다양한 염증 매개체에 따른 신경 퇴행에 있어서, ROS, NF-κB 신호 경로, 및 MAPK(p38)의 억제 기작에 따라 결정되는 NF-κB 활성의 저해에 기반을 둔 디에콜의 신규한 항염증 메카니즘을 보여준다.

(4) 염증 매개체에 따른 신경 퇴행에 있어서, 본 발명의 상기 화학식 1의 디에콜의 신규한 항염증 메카니즘은 농도(concentration) 또는 용량(dose)-의존적이다.

염증 매개의 신경 퇴행에 효과적인 디에콜 화합물의 용량은 50 ~ 300㎍/㎖으로서, 300㎍/㎖을 초과하면 세포독성을 일으킬 염려가 있고, 50㎍/㎖ 미만의 경우에는 유효한 효과를 발휘하기 어려운 점이 있다.

그리고 상기 범위 내에서 디에콜 화합물의 농도(용량)에 따라 ROS, NF-κB 신호 경로 및 MAPK(p38)의 억제 기작에 따라 결정되는 NF-κB 활성의 저해효과는 증가한다.

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 용어 "본 발명에 따른 디에콜 화합물" 또는 "화학식 1의 화합물"은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제 형을 의미한다. 용어 "수화물", "용매화물" 및 "이성질체" 역시 상기와 같은 의미를 가진다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 석신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.

용어 "이성질체(isomer)"는, 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 화학식 1에 따른 화합물은 치환기들의 종류에 따라서는 입체생성 중심(asymmetric center, 비대칭 탄소 원자)을 가질 수 있는 바, 이 경우 화학식 1의 화합물은 거울상 이성질체 및 부분 입체 이성질체와 같은 광학 이성질체로서 존재할 수 있다.

용어 "프로드럭(prodrug)"은 생체내에서 모 약제(parent drug)로 변형되는 물질을 의미한다. 프로드럭은, 몇몇 경우에 있어서, 모 약제보다 투여하기 쉽기 때문에 종종 사용된다. 예를 들어, 이들은 구강 투여에 의해 생활성을 얻을 수 있음에 반하여, 모 약제는 그렇지 못할 수 있다. 프로드럭은 또한 모 약제보다 제약 조성물에서 향상된 용해도를 가질 수도 있다. 예를 들어, 프로드럭은, 수용해도가 이동성에 해가 되지만, 일단 수용해도가 이로운 세포에서는, 물질대사에 의해 활성체인 카르복실산으로 가수분해되는, 세포막의 통과를 용이하게 하는 에스테르("프로드럭")로서 투여되는 화합물일 것이다. 프로드럭의 또 다른 예는 펩티드가 활성 부위를 드러내도록 물질대사에 의해 변환되는 산기에 결합되어 있는 짧은 펩티드(폴리아미노 산)일 수 있다.

본 발명은 일 태양에서 상기 화합물 1을 이용한, 퇴행성 신경질환의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다. 상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하며, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸증 또는 다발성 경화증 등이 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 화학식1의 화합물을 투여하여 활성산소종 생성 및 NF-κB 활성을 감소시키거나 억제시키는 방법에 관한 것이다. 즉, 상기 화학식1의 화합물을 사용하여 활성산소종 생성 및 NF-κB 활성으로 인한 질병들의 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

본 발명의 또다른 태양으로는, 상기 화학식 1로 표시되는 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 생물체내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.

용어 "약리학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 화합물의 량이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것 을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 량을 의미한다.

용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

용어 "약리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다.

여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서, 투여될 수 있다.

(a) 투여 경로

적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함한다.

또한, 예를 들어, 종종 침적 또는 서방성 제형으로, 충실성 종양에 직접적으로 주사하는 것에 의해, 전신 방식보다는 국소 방식으로 화합물을 투여할 수도 있다.

(b) 조성물/제형

본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 약학적 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게 사용될 수 있다.

주사를 위해서, 본 발명의 성분들은 액상 용액으로, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여를 위해서, 화합물들은 당업계에 공지된 약리학적으로 허용되는 담체들을 활성 화합물들과 조합함으로써 용이하게 제형될 수 있다. 이러한 담체들은 본발명의 화합물들이 정제, 알약, 당제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있도록 하여 준다. 경구 사용을 위한 약제 준비는 본 발명의 하나 또는 둘 이상의 화합물들과 하나 또는 둘 이상의 부형제를 혼합하고, 경우에 따라서는 이러한 혼합물을 분쇄하고, 필요하다면 적절한 보조제를 투과한 이후 과립의 혼합물을 처리하여 정제 또는 당체 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제들은 락토스, 수크로즈, 만니톨, 또는 소르비톨과 같은 필러 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 겔라틴, 검 트래거켄스, 메틸 셀룰로우즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로우즈, 소듐 카르복시메틸 셀룰로우즈, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)와 같은 셀룰루오즈계 물질 등이다. 필요하다면, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 우뭇가사리, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그것의 염 등의 디스인터그레이팅 에이전트가 첨가될 수도 있다.

당제 코아는 적절히 코팅하여 공급한다. 이러한 목적을 위해, 경우에 따라서는 아라비드 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 락커 용액, 및 적합한 유기용매 또는 용매혼합물을 포함하기도 하는 농축 설탕 용액이 사용될 수 있다. 활성 화합물 용량의 확인 또는 이들의 다른 조합을 특징지우기 위해 염료나 안료가 정제 또는 당제에 포함되기도 한다.

경구에 사용될 수 있는 제약 준비물은, 겔라틴 및 글리콜 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만들어진 부드러운 밀봉 캡슐뿐만 아니라, 겔라틴으로 만들어진 밀 어 고정하는 캡슐을 포함할 수도 있다. 밀어 고정하는 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 녹말과 같은 바인더, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제와의 혼합물로서, 활성 성분들을 포함할 수도 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물들은 지방산, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 용체에 용해 또는 분산될 수도 있다. 또한, 안정화제가 포함될 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 조제들은 그러한 투여에 적합한 함량으로 되어 있어야 한다.

협측 투여를 위해, 조성물들은 통상적인 방법에 따라 제형화된 정제 또는 마름모꼴 정제의 형태를 취할 수도 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따른 사용 화합물들은 통상적으로, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 추진제를 사용하여, 가압 팩 또는 네불라이절(nebulisher)로부터 에어졸 분사 제공의 형태로 전달될 수도 있다. 흡입제 또는 취분기에서의 사용을 위해, 화합물과 락토오스 또는 녹말과 같은 적절한 분말의 분말상 혼합물을 포함하는, 예를 들어, 겔라틴과 같은 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수도 있다.

화합물들은, 주사에 의해, 예를 들어, 큰 환약 주사나 연속적인 주입에 의해, 비경구 투입용으로 제형화될 수도 있다. 주사용 제형은, 예를 들어, 방부제를 부가한 앰플 또는 멀티-도스 용기로서 단위 용량 형태로 제공될 수도 있다. 조성물은 유성 또는 액상 비히클상의 현탁액, 용액, 에멀션과 같은 형태를 취할 수도 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형용 성분들을 포함할 수도 있 다.

비경구 투여용 액제 제형들은 수용성 형태로 활성화합물들의 액상 용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 준비될 수도 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클에는, 참기름과 같은 지방산, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀 등이 있다. 액상 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 높이는 물질들, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로우즈, 소르비톨, 또는 덱스트란 등을 포함할 수도 있다. 경우에 따라서는, 현탁액에 고농축 용액의 제조를 가능케 하도록 화합물의 용해도를 증가시키는 성분들이나 안정화제가 포함될 수도 있다.

또한, 활성 성분은, 사용 전에 멸균 무 발열물질의 물과 같은 적절한 비히클와 구성을 위해 분말의 형태일 수도 있다.

화합물들은, 예를 들어, 코코아 버터나 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기재를 포함하고 있는 좌약 또는 정체관장과 같은 직장 투여 조성물로 제형될 수도 있다.

상기 설명한 제형들 이외에, 화합물들은 침적체로서 제형될 수 있다. 그와 같이 오랫동안 활성을 나타내는 제형들은 이식(예를 들어 피하에 또는 근육내에) 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수도 있다. 따라서, 화합물들은, 예를 들어, 적절한 고분자 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일내의 에멀션과 같이), 또는 이온 교환 수지를 가지고, 또는 예를 들어 저용해성 염과 같은 저용해성 유도체로서 제형될 수도 있다.

본 발명의 소수성화합물용 제형 담체는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 고분자, 및 액상으로 이루어진 공용매계이다. 공용매계는 V팔라듐 공용매계일 수도 있다. 이러한 공용매계는 소수성 화합물을 잘 용해시키고, 전신 투여시 저독성을 그 자체가 제공한다. 자연적으로, 공용매계의 비율은 그것의 용해도 및 독성 특성들을 저해하지 않으면서 상당히 변화될 수도 있다. 더욱이, 공용매 성분들의 확인은 변화될 수 있다.

또한, 소수성 약제화합물용의 다른 전달계가 채용될 수도 있다. 리포좀과 에멀션은 소수성 약제들용 전달 비히클의 공지 예들이다. 통상 더 높은 독성을 희생시킬지라도, 디메틸술폭사이드와 같은 임의의 유기 용매들이 채용될 수도 있다. 추가적으로, 치료 성분을 포함하고 있는 고상의 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스와 같은 서방계를 사용하여 화합물이 전달될 수도 있다. 다양한 서방 물질들이 계발되어있고 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 많은 화합물들은 약학적으로 허용되는 반대이온과의 염으로서 제공될 수도 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 다음의 것으로 한정되지는 않지만, 염산, 황산, 아세트산, 젖산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함한 많은 산에 의해 형성될 수 있다. 염은 그것에 대응하는 무산 또는 염기 형태보다도 수성 또는 양성자 용액에서 더 잘 용해되는 경향이 있다.

(c) 유효량

본 발명에서 사용에 적합한 약제 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 량으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다. 본 발명의 방법들에서 사용되는 임의의 화합물에 대한 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 예를 들어, 용량(dose)은 세포 배양에서 결정된 IC₅₀를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.

투여량은 채용된 투여 형태와 이용된 투여루트에 따라 상기범위에서 변화될 수 있다. 정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 선량 범위는 환자 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 투여량은, 환자에게 요구되는 정도에 따라, 한번에 또는 하루 또는 그 이상의 과정으로 일련의 둘 또는 그 이상으로 제공될 수도 있다.

투여량과 간격은 키나아제 조절 효과 또는 최소 유효 농도(MEC)를 유지하기에 충분한 활성 부위의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수도 있다. MEC는 개개의 화합물에 따라 달라지지만, 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 분석법을 사용하여 키나아제의 50~90% 억제를 달성하는데 필요한 농도와 같이 생체외 데 이터로부터 예측될 수도 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 각자의 특성들과 투여 경로에 따라 달라지게 된다. 그러나, HPLC 정량 또는 생물학적 정량이 혈장 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.

투여 간격은 MEC 값을 사용하여 결정할 수도 있다. 화합물들은, 한번에 10~90%, 바람직하게는 30~90%, 특히 바람직하게는 50~90%로 되도록, 혈청 수준을 상기 MEC 이상으로 유지하는 투여 계획을 사용하여, 투여되어야 한다.

물론, 투여되는 조성물의 량은 치료될 개체에 따라, 객체의 체중에 따라, 통증의 심각에 따라, 투여 방식 및 의사의 판단에 따라 달라지게 된다.

본 발명은 하기 실시예, 제조예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명되어진다. 그러나 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 국한되는 것은 아니다.

이하 실시 예에서 수득한 값은 평균값±표준오차(S.E.M.)로 표시하였고, 통계적 유의도(Statistical significance)는 Scheffe test에 따라 가변조건을 분석하여 결정하였다(p < 0.05).

제조예 1: 에클로니아 카바로부터 디에콜 ( Dieckol ) 분리

2005년 10월부터 2006년 3월까지 한국의 제주도 해변을 따라서 갈조류 Ecklonia cava 를 채취하였다. 상기 샘플을들 tap water로 3회 세척하여 표면에 붙어있던 염(salt), 기착식물(epiphytes) 및 모래를 제거하고, 물로 조심스럽게 헹군 후, -20~0℃에서 냉동 보관하였다. 상기 샘플을 동결 건조한 후, 추출전에 글라인더로 균질하게 갈았다.

상기 에클로니아 카바(E. cava) 분말(500g)을 80% MeOH으로 3회 추출한 후, 여과하였다. 상기 여과물을 40 ℃에서 증발시켜 메탄올 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 증류수로 현탁하고, 에틸 아세테이트로 분획하였다. 에틸 아세테이트 분획물을 셀라이트(celite)와 혼합한 후, 건조시키고 글래스 컬럼(glass column)내로 채워 넣었다. 그 다음, 클로라이드(chloride), 디에틸 에테르(diethyl ether) 및 메탄올(methanol)을 순서대로 용매로 사용하여 용출시켰다. 디에틸 에테르 분획물에 대하여, 클로로포름/메탄올(2/1→0/1) 용매 시스템의 단계적 기울기(stepwise gradient)를 이용하여 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다.

HPLC 시스템을 이용하여 추가 정제하여 플로로타닌의 한 종류인 디에콜(Dieckol)을 수득하였고(화학식 1), 상기 디에콜 화합물에 대하여 1H 및 13C NMR 데이터를 비교하였다.

1H NMR (400 MHz, methanol-d4) δ 6.15 (1H, s), 6.13 (1H, s), 6.09 (1H, d, 2.9 Hz), 6.06 (1H, d, 2.9 Hz), 6.05 (1H, d, 2.9 Hz), 5.98 (1H, d, 2.8 Hz), 5.95 (1H, d, 2.8 Hz), 5.92 (3H, m); 13C NMR (100 MHz, methanol-d4) δ 161.8, 160.1, 157.8, 155.9, 154.5, 152.4, 147.3, 147.2, 147.1, 146.9, 144.3, 144.1, 143.4, 143.3, 138.6, 138.5, 126.5, 126.2, 125.6, 125.5, 124.9, 124.6, 124.5, 99.9, 99.7, 99.5, 99.4, 97.6, 96.2, 95.8, 95.7, 95.3.

제조예 2: BV2 미세아교세포 준비

쥐의 BV2 세포주(인제대 의과대학 미생물학교실로부터 입수함)를 10% FBS, 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100μg/ml가 보충된 DMEM(Dulbeco's Modified Essential Medium) 배지에 두고, 37 ℃ 및 5% CO₂ 하 습식 배양기에서 배양하였다. 세포가 컨플루언트한 상태가 되었을 때 트립신으로 처리한 후, 세포들을 페놀 레드(phenol red) 없는 따뜻한 DMEM으로 2번 세척하였다. 그 다음 무혈청 배지로 옮겨 배양하였다.

모든 실시예에서 상기 세포들에 LPS (1 μg/ml)를 첨가한 후, 규정된 시간동안 디에콜을 처리하여 사용하였다.

실시예 1: NO 및 PGE ₂ 생성에 대한 디에콜의 영향

5x10⁵ cells/well의 BV2 미세아교세포에 LPS (1㎍/㎖) 첨가전에 다양한 농도의 디에콜(0, 50, 100, 300㎍/㎖)을 2시간 동안 처리하고 24시간 동안 LPS로 자극하였다.

그리고, 배양 상청액에서의 NO의 농도를, 주요 NO의 산화산물인 아질산염(nitrite)으로 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 각 세포 배양배지 100㎕를 동일한 부피의(100㎕) Griess 시약[1% 설파닐아미드(sulfanilamide)/0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민디하이드로클로라이드(naphthylethylenediaminedihydorchlorid e)/2.5% 인산]으로 혼합하였다. 아질산염의 수준을 ELIZA 플레이트 리더기를 이용하여 540㎚에서 착색미터법으로(colorimetrically) 측정하고, 공지의 아질산 나트륨 농도로부터 제작된 아질산염 표준곡선을 참고하여 아질산염 농도를 산출하였다

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 LPS 및 디에콜의 다양한 용량의 전-처리는 NO형성에 있어 현저한 감소를 가져왔다(도 1의 A). NO 검출 분석에 따르면, 24시간의 LPS 자극 후 NO는 BV2 미세아교세포에서 자극이 없는 경우(basal level)에 비하여 5.7배만큼 현저히 증가하였고, 이러한 증가는 용량-의존 방식으로 디에콜을 처리함에 따라 저해(억제)됨을 확인하였다.

한편, BV2 미세아교세포에서 디에콜이 LPS에 의해 유도된 PGE₂의 생성을 억제할 수 있는지를 알아보기 위하여, 세포들을 2시간 동안 디에콜로 전처리하고 LPS (1㎍/㎖)로 자극하였다. 24시간의 배양 후, 세포 배양 배지를 수거하고 PGE₂ 생성물을 Cayman Chemical ELISA 키트(Ann Arbor, MI, USA)로 측정하였다.

그 결과, 디에콜의 전처리(0, 50, 100, 300㎍/㎖) 및 LPS의 자극은 PGE₂ 생성에 있어서 유의미한 용량-의존적 감소를 나타내었다(도 1의 B).

이러한 결과들은 디에콜 전처리가 LPS에 의해 자극된 전염증성(proinflammatory) 매개체의 발현을 현저히 억제함을 보여준다.

참고예1: 세포 생존율 분석(Cell viability assay)

실시예 1에서의 NO 및 PGE2 생성 억제가 디에콜 처리에 따른 세포 독성에 의 한 것인지를 알아보기 위하여, 24h 동안 디에콜 처리한 BV2 미세아교세포에 대하여 MTT 분석을 수행하였다.

미토콘드리아-탈수소효소(mitochondrial dehydrogenases)에 의해 무색의 3-(4,5- 디메틸- 티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5- dimethyl- thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT)[Sigma (St Louis, MO, USA)]로부터 물질 대사하여 blue formazan으로 분해된 양을 측정함으로써 세포의 생존율을 평가하였다.

5x10⁵ cells/well의 BV-2 세포를 24-웰 플레이트에서 24시간 전배양(preincubation)한 후 세척하였다. 제조예1에서 수득한 디에콜을 다양한 농도로 LPS(Escherichia coli serotype 0111 유래)와 함께 24시간 동안 처리하고, 0.5 mg/ml MTT 용액에서 배양하였다. 3시간 후에, 상청액를 제거하고 540nm에서 마이크로플레이트 리더기(Dynatech MR-7000; Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, USA)로 formazen 형성을 측정하였다.

그 결과, 사용된 농도에서 디에콜은 세포의 생존율에 영향을 끼치지 않았다.즉,디에콜의 NO 및 PGE2 생성 억제 활성은 BV2 미세아교세포에서의 어떠한 세포 독성 작용에 의한 것이 아님을 확인하였다(도 1의 C).

실시예 2: iNOS 및 COX -2 단백질의 발현에 대한 디에콜의 영향

NO 및 PGE2 생성 억제가 iNOS 및 COX-2의 감소된 수준에 의한 것인지를 확인 하기 위하여, iNOS 및 COX-2 단백질에 대한 디에콜의 영향을 웨스턴 블럿을 통해서 알아보았다.

제조예 2에서 수득한 BV2 미세아교세포들을 Cells were washed three times with PBS로 3회 세척하고 세포용해 버퍼(1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% NaN3)로 용해하였다. 동일 양의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 미니겔 상에서 분리하여 Immobilon polyvinylidene difluoride membranes (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 적합한 일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 상기 멤브레인을 상온에서 1시간 동안 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. TBST(Tris-Buffered Saline Tween-20)로 3번 세척하고, 면역반응성 밴드를 ECL 검출 시스템(Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 가시화하였다.

그 결과, iNOS 및 COX-2 단백질의 발현은 자극하지 않은 BV2 미세아교세포에서는 거의 검출되지 않았으나, LPS 처리 24h 후에는 그 발현이 뚜렷하게 증가하였다. 그러나, 디에콜이 LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포에서의 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 현저히 완화시켰다(도 2의 A).

실시예 3: iNOS 및 COX-2 mRNA 수준에 있어서의 디에콜의 영향

iNOS 및 COX-2 mRNA 수준에 있어서의 디에콜의 효과를 평가하였다.

TRIzol 시약(Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 제조예2에서 수득한 세포에 대하여 M-MLV 역전사효소(Promega,Madison, WI, USA)를 이 용하여 cDNA를 제작한 후, 역전사된 전체 RNA(1.0 μg)를 수득하였다. iNOS, COX-2, 및 p65에 대한 항체들을 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cuz, CA, USA)로부터 구입하였고, iNOS, COX-2 유전자를 코딩하는 RT-generated cDNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR에 사용된 쥐의 선택적인 프라이머는 이하와 같으며, 증폭 후, PCR 반응물을 아가로스 겔에 전기영동하였다.

PCR 프라이머들의 서열

유전자	서열
iNOS	5'-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3'(서열번호 1)
	5'-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3'(서열번호 2)
COX-2	5'-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3'(서열번호 3)
	5'-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3'(서열번호 4)

그 결과, iNOS 및 COX-2 mRNA 발현이 그들의 단백질 수준과 동일하게 억제되는 것으로 나타났다(도 2의 B). 이러한 결과들은 LPS에의 노출이 iNOS와 COX-2의 mRNA의 발현을 증가시키나, 디에콜이 LPS에 의해 자극된 전염증성 매개체의 유도를 전사 억제(transcriptional inhibition)를 통해 효과적으로 억제함을 의미한다.

실시예 4: 전염증성 사이토카인의 생성에 대한 디에콜의 영향

다음으로, TNF-α 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인의 생성에 있어서의 디에콜의 영향을 알아보았다.

BV2 미세아교세포를, 24시간동안 LPS의 존재 또는 부존재 하에 디에콜(0, 50, 100, 300㎍/㎖)로 배양하고, 배양 배지에서의 상기 사이토카인 수준을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정하였다. R&D 시스템의 ELISA 키트(Minneapolis, MN, USA)로, IL-1β 및 TNF-α를 측정하였고, Cayman Chemical 키트(Ann Arbor, MI, USA)로 PGE₂를 측정하였고, 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3의 A에서 나타난 바와 같이, LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포의 배양배지에서의 TNF-α 및 IL-1β 수준이 증가하였고, 이러한 증가는 디에콜의 농도-의존 방식에 따라 두드러지게 감소하였다.

한편, 디에콜이 전사 수준에서 상기 사이토카인의 발현을 억제하는지 여부를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.

IL-1β 및 TNF-α 유전자를 코딩하는 RT-generated cDNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR에 사용된 쥐의 선택적인 프라이머는 이하와 같으며, 증폭 후, PCR 반응물을 아가로스 겔에 전기영동하였다.

PCR에 사용된 선택적인 프라이머들의 서열

유전자	서열
IL-1β	5'-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3'(서열번호 5)
	5'-TTTCCTTTCTTAGATATGGACAGGAC-3'(서열번호 6)
TNF-α	5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3'(서열번호 7)
	5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'(서열번호 8)

그 결과 도 3의 B에서 나타난 바와 같이, LPS 자극 전에 디에콜을 다양한 농도로 2시간 동안 BV2 미세아교세포에 처리한 결과, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA가 용량 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과는 디에콜이 전사 수준에서 전염증성 사이토카인의 축적을 음성적으로 조절함을 시사한다

실시예 5: NF-κB 활성에 대한 디에콜의 영향

디에콜의 iNOS 및 COX-2 단백질 수준에서의 억제에 대해 분자적 메카니즘을 규명하기 위하여 NF-κB 결합 활성을 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)로 분석하였다.

우선, 제조업자의 프로토콜에 따라 NE-PER 핵 추출용 시약(Pierce)을 이용하여 핵 추출물을 준비하였다. 겔지연 분석법(Gel retardation assay)을 위한 프로브로서 immunoglobulin κ-chain binding site [κB, 5'-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3'(서열번호 9)]를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 프로브의 3'말단을 비오틴으로 표지하는, 비-방사성 방법을 사용하였다.

결합반응(binding reation)은 10μg의 핵추출 단백질, 완충용액(10 mM Tris, pH 7.5, 50mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol, 0.05% Nonidet P-40, and 2.5% glycerol), 50ng의 poly (dI-dC), 및 20 fM의 비오틴-표지된 DNA를 이용하였다. 최종 부피 20μl로 상온에서 20분동안 인큐베이션한 다음, 상기 반응 혼합물을 0.5 x Tris-borate 완충용액에서 11.5% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동으로 분석하였다. 상기 반응물을 나이론 멤브레인에 옮기고, 비오틴-표지된 DNA를 광편이 화학발광(Light Shift chemiluminescent) EMSA 키트(Pierce)를 이용하여 분석하였다. DNA-결합 특이성은 표지된 프로브 첨가전에 반응 혼합물에 대해 비오틴-미표지 NF-κB(cold κB) 프로브의 50배 초과량을 사용하여 확인하였다.

그 결과, LPS 처리는 NF-κB의 DNA 결합 활성을 현저히 증가시키고, 대조적으로 디에콜의 처리는 LPS에 의해 유도된 NF-κB 활성을 크게 억제하였다(도 4의 A).

LPS에 의해 유도된 NF-κB p65 핵내 이동의 효과를 웨스턴 블럿 분석으로 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 LPS 자극 후 15분이 지나자, 핵에 NF-κB p65이 현저한 수준으로 나타남을 확인되었지만, LPS 및 디에콜에 노출된 세포의 핵내에서 p65 단백질은 현저히 감소하였다. 이는 디에콜이 p65 단백질의 핵내 이동을 저해한다는 것을 의미한다.

또한, NF-κB p65 핵내 이동에서의 디에콜 영향을 더욱 명확히 알아보기 위하여, BV2 미세아교세포에서 NF-κB p65 핵내 이동을 면역형광 분석법을 통해서 관찰하였다.

우선, BV2 미세아교세포를 24-웰 플레이트 내에서 24시간 동안 직접적으로 글래스 커버슬립 위에서 배양하였다 . 1 μg/ml LPS 및/또는 300 μg/ml 디에콜로 상기 세포들을 자극한 후, PBS에서 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 그리고, PBS에서 0.2%의 Triton X-100로 투과성을 부여하고 1.5% 정상 당나귀 혈청(Sigma)으로 블로킹시켰다. 1시간 동안 NF-κB p65(1 μg/well)에 대한 폴리클로날 항체와 반응시킨 후, donkey anti rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch Laborities, Inc., West Grove, PA, USA)와 결합된 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척하고, 커버 슬립을 Fluoromount-G (Southern Biotechnology Associates Inc.,Birmingham, AL, USA)에 마운팅한 후, Zeiss LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 장치를 이용하여 형광물질을 가시화하여 400x 배율에서 관찰하였다.

공초점 이미지를 통해 볼 때, NF-κB p65는 정상적으로 세포질 영역으로 격리되고(도 4의 B, Medium panel) NF-κB p65의 핵내 축적은 LPS의 자극 이후 강하게 유도되었다(도 4의 B, LPS panel). LPS에 의해 유도된 NF-κB p65의 이동은 세포를 디에콜로 전처리하자 완전히 없어졌다.(도 4의 B, LPS+ dieckol panel). NF-κB p65의 이동은 LPS 자극없이 디에콜 단독으로 전처리한 경우에도 유도되지 않았다(도 4의 B, dieckol panel).

그리고, 디에콜에 의한 NF-κB DNA 결합억제가 I-κBα의 분해와 관련이 있는지 여부를 알아보기 위하여 I-κBα의 세포질 수준을 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인하였다. IκB에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly,15 MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

그 결과, 디에콜로 BV2 미세아교세포를 전처리하면 LPS에 의해 유도된 I-κBα의 분해가 방지되었다(도 5). BV2 미세아교세포에서의 I-κBα 단백질 복구는 디에콜이 NF-κB의 활성화를 저해한다는 증거가 된다.

이러한 결과들은 디에콜이 NF-κB p65의 이동을 저해하는 것을 보여준다. 또한, 디에콜에 의한 NF-κB 활성의 억제가 BV2 미세아교세포에서의 NO, PGE2 및 전염증성 사이토카인과 관련있는 메카니즘일 수 있음을 시사한다.

실시예 6: MAPK(mitogen-activated protein kinase)에 대한 디에콜의 영향

LPS의 자극에 반응하여 BV2 미세아교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현을 작동시키는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)과 관련된 일련의 신호적 반응(signaling cascade)을 규명하고자 하였다.

디에콜에 의한 NF-κB 활성의 저해가 MAP 키나아제 경로를 통해 매개되는지 여부를 알아보기 위해서, 웨스턴 블럿 분석을 이용하여 BV2 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 ERK-1/2, JNK 및 p38 키나아제의 인산화에 있어 디에콜의 영향을 조사하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 ERK-1/2, JNK 및 p38 키나아제는 LPS에 의한 자극에 의해서 인산화되었다. 그리고, 디에콜(300㎍/㎖)은 p38키나이제의 활성을 현저히 억제하였으나, ERK-1/2, JNK의 활성에는 영향을 주지 않았다. 이러한 결과는 디에콜의 p38의 인산화 억제에 의해 NF-κB 활성이 저해되고, 나아가 iNOS 및 COX-2 발현이 억제되는 일련의 메카니즘을 예측할 수 있게 한다.

실시예 7: 활성산소종 생성에 대한 디에콜의 영향

디에콜이 ROS(활성 산소종) 생성을 저해하는지를 알아보았다.

공지의 방법(Cho et al.,Toxicology and applied pharmacology , vol .168, p. 64-71, 2000)을 변형하여 ROS를 측정하였다. BV2 미세아교세포에 디에콜(0, 50, 100, 300㎍/㎖)을 처리하여 24시간동안 LPS의 존재 또는 부존재 하에 배양하였다. BV2 미세아교세포를 PBS로 세척하고, 상기 세포들을, 5μM의 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 함유하는 PBS로 4시간 동안 37℃에서 배양하여 세포내 ROS를 표지하였다. 그 후, 상기 세포들을 즉시 FACS 분석(fluorescence-activated cell sorting analysis)(BD Biosciences, Rutherford, NJ, USA)를 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포는 ROS 생성의 증가를 보여주었다. 대조적으로, 디에콜로 세포를 전처리한 경우는 LPS에 의한 ROS 생성의 현저한 제거를 나타냈다. 그리고 세포를 디에콜(300㎍/㎖)로 단독 처리하여 배양한 경우에는 ROS의 농도가 자극이 없는 샘플과 유사한, 주위와 동일한 수준에서 유지되었다.

도 1은 LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포에서의 NO 생성(A), PGE₂ 생성(B) 및 세포 생존율(C)에 미치는 디에콜의 영향을 분석한 결과이다.

도 2는 BV2 미세아교세포에서의 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 단백질 발현(A) 및 iNOS와 COX-2의 mRNA에 대한 RT-PCR 분석 결과(B)이다.

도 3은 BV2 미세아교세포에서의 LPS에 의해 유도된 TNF-α 및 IL-1β 생성에 미치는 디에콜의 영향을 분석한 결과이다.

도 4는 LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포에서의 NF-κB 결합 활성을 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)로 분석한 결과(A) 및 NF-κB p65 핵내 이동에 대한 면역형광 분석 결과(B)이다.

도 5는 LPS에 의해 유도된 NF-κB p65 핵내 이동의 효과에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 6은 BV2 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 ERK-1/2, JNK 및 p38 키나아제에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 7은 LPS에 의해 자극된 BV2 미세아교세포에서의 ROS(활성 산소종) 생성에 대한 FACS 분석결과이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Composition containing Dieckol for treating and preventing neurodegenerative disease <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS primer1 <400> 1 atgtccgaag caaacatcac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS primer2 <400> 2 taatgtccag gaagtaggtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2 primer1 <400> 3 cagcaaatcc ttgctgttcc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX2 primer2 <400> 4 tgggcaaaga atgcaaacat c 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta primer1 <400> 5 atggcaactg ttcctgaact caact 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta primer2 <400> 6 tttcctttct tagatatgga caggac 26 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer1 <400> 7 atgagcacag aaagcatgat c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer2 <400> 8 tacaggcttg tcactcgaat t 21

Claims (10)

1. 화학식 1의 디에콜 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물:

   <화학식 1>

   

   상기 식 중, R은 수소, C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 알케닐, 페닐, 페닐알킬, 히드록시페닐, 또는 디히드록시페닐이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 R은 수소인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 디에콜(dieckol) 화합물은 갈조류 유래인 것을 특징으로 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 갈조류는 아이세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 아이세니아 아르보레아(Eisenia arborea), 아이세니아 데스마레스티오데스(Eisenia desmarestioides), 아이세니아 갈라파제니스(Eisenia galapagensis), 아이세니아 매소니(Eisenia masonii), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome), 에클로니아 카바(Ecklonia cava), 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 에클로니아 라디아타(Ecklonia radiata), 에클로니아 바이시클리스(Ecklonia bicyclis), 에클로니아 바이런시네이트(Ecklonia biruncinate), 에클로니아 부시날리스(Ecklonia buccinalis), 에클로니아 카에파에스팁스(Ecklonia caepaestipes), 에클로니아 엑사스퍼타(Ecklonia exasperta), 에클로니아 파스티기아타(Ecklonia fastigiata), 에클로니아 브레빕스(Ecklonia brevipes), 에클로니아 아라보레아(Ecklonia arborea), 에클로니아 라티폴리아(Ecklonia latifolia), 에클로니아 무라티(Ecklonia muratii), 에클로니아 라디코사(Ecklonia radicosa), 에클로니아 리타디아나(Ecklonia richardiana) 및 에클로니아 라이티(Ecklonia wrightii)로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 갈조류는 에클로니아 카바(Ecklonia cava)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성 물.
7. 제6항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 활성산소종 생성 및 NF-κB의 활성; NF-κB의 서브유닛(subunit)인 p65 단백질의 핵으로의 전이(translocation); 전염증성 사이토카인의 생산, 일산화질소(NO)의 생성; iNOS(inducible NO synthase) 유전자의 발현; 프로스타글란딘 E2(PGE₂)의 생성; 및 p38키나아제의 활성 중 하나 이상을 억제함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α 또는 IL-1β인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 COX-2(cyclooxygenase-2) 유전자의 발현을 억제함을 특징으로 하는 약학적 조성물.

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