KR20130023445A

KR20130023445A - 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130023445A
Application number: KR1020110086202A
Authority: KR
Inventors: 전주홍; 서인석; 박종관; 이성원; 김혜경; 박은정; 천정녀
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-08-29
Filing date: 2011-08-29
Publication date: 2013-03-08
Also published as: KR101452863B1

Abstract

본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 TGFβ1 신호전달을 억제함으로써 혈관 섬유증 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다. 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

Description

오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증의 예방 및 치료용 조성물{Compositions for Treatment and Prevention of Vascular Diseases Comprising Extract of Schisandra chinensis}

본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

TGFβ1(Transforming growth factor beta 1)은 세포의 증식, 이동, 사멸 및 세포 외 기질 리모델링을 통한 다양한 세포 공정을 통해 조직 항상성을 조절한다(Massague J et al., Cell 103:295-309(2000), Derynck R et al., Nat Cell Biol 9:1000-1004(2007)). 비정상적인 TGFβ1 신호전달은 심혈관 질환, 암, 자가면역 질환 및 섬유증을 포함하는 다양한 질병과 관련이 있다(Cain K et al., Toxicol Lett 120:307-315(2001), Sookoian S et al., Atherosclerosis(2011), Doyle KP et al., J Neuroinflammation 7:62(2010), Blobe GC et al., N Engl J Med 342:1350-1358(2000)). 특히, TGFβ1는 정지 수축성 표현형에서 합성이 급증하는 표현형으로 변화를 유도하는 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 활동을 통해 혈관 섬유증(예를 들어, 고혈압, 협착증 및 아테롬성 동맥 경화증)의 발병에 중요한 역할을 한다(Ryan ST et al., J Vasc Res 40:37-46(2003), Ruiz-Ortega M et al., Cardiovasc Res 74:196-206(2007)). TGFβ1 신호전달의 억제제는 혈관 섬유증에 대한 가능성 있는 치료법으로 대두되고 있다(Khanna A et al., Kidney Int Suppl 53:S2-6(1996), Dhanani S et al., Inflammation 18:301-309(1994), Chan W et al., Mol Genet Metab 63:224-229(1998)).

TGFβ1이 세포막에 존재하는 TGFβ1의 수용체에 결합하면 TGFβ1 고유 기능의 신호를 전달하게 되며, 활성화된 TGFβ1 수용체는 Smad 2 및 Smad 3를 인산화시켜 Smad 4와 결합하여 복합체를 형성한다(Heldin CH et al., Nature 390:465-471(1997), Shi Y et al., Cell 113:685-700(2003). Smad 복합체는 세포핵 속으로 전위(translocation)되어 섬유결합소(fibronectin) 및 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질의 전사를 일으킨다(Schiller M et al., J Dermatol Sci 35:83-92(2004), Ryer EJ et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 26:780-786(2006)). 또한 TGFβ1은 Smad2/3에 비의존적인 방식으로 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제를 활성화 시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 TGFβ1에 의해 유도된 MAP 키나아제 활성화는 특징되어지지 않은 메커니즘을 통해 Smad 복합체의 전사 활성을 조절한다고 알려져 있다(Engel ME et al., J Biol Chem 274:37413-37420(1999), Derynck R et al., Nature 425:577-584(2003)).

오미자(Schisandra chinensis)는 다양한 생물학적 활성을 가지고 있어 천연 의약품으로 널리 이용되고 있다(Panossian A et al., J Ethnopharmacol 118:183-212(2008)). 다수의 연구에서 오미자가 간염(Melhem A et al., J Clin Gastroenterol 39:737-742(2005)), 암(Yasukawa K et al., Oncology 49:68-71(1992), Min HY et al., Bioorg Med Chem Lett 18:523-526(2008)) 및 혈관 손상(Chiu PY et al., Mol Cell Biochem 266:139-144(2004), Kim EY et al., J Ethnopharmacol 134:668-675(2011))을 포함하는 다양한 질병 치료에 효과가 있음을 나타내고 있다. 그러나 오미자 추출물의 근본적인 활성에 대한 메카니즘은 명확하게 밝혀지지 않았다. 또한, TGFβ1 신호전달에 대한 오미자의 영향도 밝혀진 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈관 섬유증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 종래부터 한약재로 사용되고 있는 오미자가 혈관 섬유증을 예방 또는 치료하는 데 매우 유효하다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 오미자 추출물, 시잔드린 B(Schisandrin B) 또는 고미신 N(Gomisin N)을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B(Schisandrin B) 또는 고미신 N(Gomisin N)을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 혈관 섬유증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 종래부터 한약재로 사용되고 있는 오미자가 혈관질환을 치료 또는 예방하는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 오미자는 낙엽 활엽 덩굴나무로 잎은 어긋나고 난형(卵形) 또는 도란형(倒卵形)이며 끝은 급히 뾰족하고 톱니가 있으며 뒷면 맥상에 다소 털이 있다. 꽃은 홍백색으로 6-7월에 피며 자웅이주이다. 과실은 식용으로 쓰이고 가지 끝에 이삭모양으로 늘어지며 8-9월에 붉게 익는다. 과실을 오미자(오매자), 북오미자(Schizandrae Fructus)라 한다. 표고 200-1,600m 지리산, 전북, 강원도가 주산지이며 충남, 충북을 제외한 전국에 야생하고, 지리적으로 일본, 사할린, 만주, 중국에 분포한다. 과실에는 시잔드롤(Schizandrol), 시잔드린(Schizandrin) A, B, C, 안질로일고미신(angeloylgomisin) O, P, 에피고미신(epigomisin), 프레고모이신(pregomoisin), 데옥시시잔드린(Deoxyschizandrin) 등을 함유한다. 오미자는 오래전부터 수렴, 자양, 강장, 진해약, 해주독, 목마름, 수렴고삽, 익기생진, 보신염심 등의 약효를 가져 생약원료로 한방에서 사용해오던 재료이며, 오미자주의 원료로 오래전부터 사용되어 온 것으로서 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다. 오미자 추출물은 중추신경계를 흥분시켜 강장작용과 지력활동과 노동능력을 향상시키며, 당질대사에 영향을 주어 간장 글리코겐의 이화를 촉진하여 글리코겐의 함량 증가작용, 피로회복 촉진작용, 혈압조절작용, 위액분비 조절작용이 있어 저혈압, 동맥경화, 당뇨병, 간염등에 사용되며, 항산화 효과, 항생 해독 기능, 습진 및 피부의 염증을 가라앉히는 기능, 피부노화억제, 항균, 미백 효과가 있어 화장품에도 사용되고 있다.

본 발명에서의 오미자는 오미자(Schisandra chinensis), 남오미자(Kadsura japonica), 청오미자(Schisandra viridicarpa), 흑오미자(Schisandra repanda) 또는 흰흑오미자(Schisandra nigra)이며, 바람직하게는 오미자(Schisandra chinensis)이다.

본 발명의 조성물은 유효성분으로써 오미자 추출물을 포함한다. 본 명세서에서 오미자를 언급하면서 사용되는 용어 ‘추출물’은 오미자에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 오미자 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화(예컨대, 분말화)된 오미자 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 오미자 추출물을 오미자에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 오미자에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 오미자 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 오미자 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 오미자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 시잔드린 B 및 고미신 N 은 오미자의 기능성을 나타내는 대표적인 화합물인 리그란 물질 중 하나이다.

리그난은 어답토겐(adaptogenic) 작용, 간 보호, 간 안정화 및 간 재생 효과를 나타낸다. 어답토겐 작용은 활력제(energizer), 신경계 촉진제, 산소공급기(oxygenator), 면역조절제, 항산화제 및 피부보호제로서 작용하는 것을 포함한다. 리그난은 간의 아스코르브산 수치 증가, NADPH 산화와 지질 과산화의 억제 및 간의 마이크로좀 시토크롬 P-450 효소의 유도 효과와 밀접하게 관련되어 있으며, 독성 물질에 의해 유도되는 담즙울체(cholestasis)로부터 간을 보호하는 것으로 알려져 있다. 또한 리그난이 간세포 성장 인자 mRNA 전사의 유도, 간세포 증식의 촉진 및 간으로 혈류의 증가를 통해 간의 재생 과정에 기여한다는 것이 입증되었으며, 간 글루코겐의 합성과 글루타치온의 감소를 통한 재생능력을 증진시키기 위하여, 미토콘드리아 환원효소 글루타치온의 활성과 미토콘드리아 간 글루타치온의 수준의 증가를 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 구현예에 따르면, 고미신 N은 고농도에서 세포 독성이 나타났으나, 시잔드린 B는 처리 농도에 따른 세포독성이 나타나지 않았다.

본 발명의 혈관 섬유증 예방 또는 치료용 조성물은, Smad2/3의 핵 전위(nuclear translocation) 및 인산화를 억제하고, TGFβ1으로 유도되는 MAP 키나아제 활성을 저해하여 TGFβ1 신호전달 과정을 억제시키는 작용을 하며, 이러한 작용을 통하여 다양한 혈관 섬유증을 예방 또는 치료한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 혈관 섬유증의 예는 간 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증 또는 발기부전이다.

섬유증(fibrosis)은 예를 들면 신장, 심장, 폐, 위 및 관절을 포함하는 내장기관들에서 콜라겐의 과잉생산과 관련 있는 상태로 섬유성 조직, 상처 조직, 결합 조직 및/또는 세포외 매트릭스(ECM) 물질이 조직 손상(예를 들어, 감염증, 자가면역 반응, 물리적 손상, 화학적 손상, 당뇨병, 고혈압 등)에 반응하는 체내 하나 이상의 조직 상에 또는 내부에 축적되는 임의의 증상을 의미한다.

간 섬유증은 C형 간염 바이러스(HCV) 또는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염, 자가면역 손상, 및 알콜 같은 독소에의 만성적 노출과 같은 간에 대한 만성적인 독성 손상으로 인해 일어난다. 만성적인 독성 손상은 만성 염증을 수반하는 간세포 손상과 수선의 반복된 순환을 가져온다. 가변적인 시간 기간에 걸쳐, 숙주의 상처 수선 반응의 결과로서 이상세포외 매트릭스가 점진적으로 축적된다. 간 내에 흉터 조직의 점진적 축적은 결국, 미세결절의 형성과 함께 간 전체에서의 섬유질 사이막의 형성으로 정의되는 경화증의 조직병리학적 특징을 나타낸다.

폐 섬유증은 주요한 섬유화 질병의 하나로 특발성 폐 섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis)은 알려지지 않은 병인의 진행성 섬유증으로 꽈리 벽의 만성 염증으로 특징된다.

신장 섬유증은 세포외 기질의 생성 및 분해의 불균형으로 발생하고 미리 존재하는 섬유의 붕괴 및 농축에 의해 두드러지는 결합 조직의 간에서의 축적과 관련이 있다.

발기부전의 의학적 정의는 '만족스러운 성행위를 이루기 위해 필수적인 음경 발기 상태를 획득하거나 유지할 수 있는 능력이 반복, 지속적으로 결여된 상태'이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 상기 심인성 원인은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노아드레날린이 과다하게 분비 및 음경해면체 평활근 긴장도 증가와 신경 전달물질의 분비 억제에 기인한다. 상기 기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성, 내분비성 발기부전으로 분류된다. 상기 신경인성 발기부전은 발기 신경이나 섬유가 손상되어 발기 신경의 말단에서 발기를 위한 아세틸콜린, NO 등의 이완성 신경전달물질 등의 분비가 원활하지 않아 생기는 장애로서, 척추손상, 다발경 경화증 등의 중추신경질환, 당뇨병, 골반수술 등의 말초신경질환 등에 의해 유발될 수 있다. 발생 빈도가 가장 높은 신인경성 발기부전의 원인은 당뇨병으로서, 당뇨병의 합병증으로 말초신경질환이 있는 경우 발기부전이 된다. 상기 혈관성 발기부전은, 동맥성 원인에 의한 충만장애와, 정맥성 원인에 의한 저장 장애로 분류될 수 있고, 상기 동맥성 원인은 동맥경화증 등으로 발기동맥의 내경이 좁아지거나 막히게 되어 음경해면체내로 혈액의 유입이 불충분하여 발생되는 것으로서, 이는 고혈압, 당뇨병, 고지질혈증, 흡연 등에 의해 유발될 수 있다. 상기 정맥성 원인은 정맥의 폐쇄 기능이 장애를 일으켜 해면체 내 혈액이 저장되지 못하고 누출되어 발기가 완전하지 못하거나 유지되지 못하는 경우이다. 이는, 음경의 발기 조직인 음경해면체 평활근이 손상되었거나, 당뇨병, 심한 동맥 질환 또는 음경지속발기증의 후유증으로 섬유성 증식을 일으켜 해면체 평활근이 섬유성 조직으로 대치된 경우를 들 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 TGFβ1 신호전달을 억제함으로써 혈관 섬유증 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다.

TGFβ는 손상된 조직의 복구를 시작하고 종결시키는 핵심적인 사이토카인으로서 이 TGFβ가 계속적으로 생산되면 조직의 섬유화가 초래된다. 만성간질환의 간조직 소견에서 TGFβ1 mRNA는 콜라겐 I mRNA와 밀접하게 연관되어 있으며, TGFβ1 단백질은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고, 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않음으로써, 간섬유증과 간경변에서 TGFβ가 중요한 역할을 담당하고 있음을 보여준다(Border WA et al., N Engl J Med 331:1286-1292(1994), Roth S, et al., Hepatology 27:1003-1012(1998)). TGFβ1에 의한 세포 활성화에는 smad 경로가 잘 알려져 있는데, TGFβ1이 리간드로서 막관통 세린(transmembrane serine)/트레오닌 키나아제(threonine kinase)의 활성을 갖는 TGFβ 수용체 II에 결합하면 TGFβ 수용체 I(ALK5)를 인지하여 헤테로-올리고머릭 혼합체(헤테로테트라머)를 형성하고 TGFβ 수용체 I을 인산화시킨다. 이러한 과정은 TGFβ1의 세포내 신호전달을 위한 중요한 상류(upstream) 과정으로 세포질 내 Smad 단백을 통한 세포핵 내로의 신호전달을 시발하게 된다. 이렇게 활성화된 헤테로테트라머 TGFβ 수용체는 경로-제한적(pathway-restricted) Smad인 Smad 1, Smad 2 및 Smad 3를 인산화시켜 DPC4/Smad 4와 결합하여 세포핵 속으로 전위(translocation)되어 DNA 결합 단백과 결합함으로써 세포 사멸에 관여하는 표적 유전자의 전사(transcription)를 일으키게 된다. 즉, Smad는 전사 인자로서의 기능을 가지고 있으며 이중 DPC4/Smad 4는 각각의 Smad 및 헤테로-올리고머를 형성하여 고유의 신호전달을 담당하게 된다. 또한, TGFβ1이 세포내 활성산소족 생성을 유발하고 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제를 활성화시키므로써 다양한 경로의 세포 활성화를 유발하는 것이 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 오미자 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 오미자 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 오미자 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 식품학적 조성물이다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 오미자 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 오미자 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 TGFβ1 신호전달을 억제함으로써 혈관 섬유증 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다.

(ⅲ) 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅳ) 본 발명은 오미자 추출물, 시잔드린 B 또는 고미신 N을 유효성분으로 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

도 1은 A7r5 세포에서 오미자 추출물에 의한 TGFβ1 신호전달의 억제를 확인한 결과이다.
(A) 3TP-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물 처리하고 루시퍼라제 활성 측정, (B) SBE4-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물 처리하고 루시퍼라제 활성 측정, ** p<0.01,***,p<0.005 (C) 세포에 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물을 1시간 처리한 후 웨스턴 블롯, (D) 세포에 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물을 1시간 처리한 후 공초점 현미경으로 촬영, (E) Smad3 염색에서 핵/세포질 비율, ***,p<0.005, (F) 세포에 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물을 48시간 처리한 후 RT-PCR 분석
도 2는 A7r5 세포에서 오미자 추출물의 Smad2/3 인산화 및 세포 생존력에 대한 영향을 확인한 결과이다.
(A) 세포에 오미자 추출물을 농도별로 48시간 처리한 후 MTT 어세이 수행, (B) Smad2/3 수준의 인산/총 비율, ** p<0.01
도 3은 A7r5 세포에서 시잔드린 B에 의한 TGFβ1 신호전달의 억제를 확인한 결과이다.
(A) 3TP-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 오미자 구성성분들을 각각 처리하고 루시퍼라제 활성 측정,(B) 3TP-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 시잔드린 B를 처리하고 루시퍼라제 활성 측정, (C) SBE4-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 시잔드린 B를 처리하고 루시퍼라제 활성 측정, ** p<0.01,***,p<0.005 (D) 세포에 시잔드린 B를 48시간 처리한 후 RT-PCR 분석
도 4는 A7r5 세포에서 시잔드린 B 및 고미신 N의 세포 생존력에 대한 영향을 확인한 결과이다. 세포에 시잔드린 B 또는 고미신 N을 농도별로 48시간 처리한 후 MTT 어세이를 수행하였다. ***,p<0.005 - 삭제
도 5는 A7r5 세포에서 시잔드린 B에 의한 Smad2/3의 억제를 확인한 결과이다.
(A) 세포에 TGFβ1 및/또는 시잔드린 B를 처리한 후 웨스턴 블롯 (B) Smad2/3 수준의 인산/총 비율, ** p<0.01 (C) 세포에 TGFβ1 및/또는 시잔드린 B를 2시간 처리한 후 공초점 현미경 촬영, (D) Smad3 염색에서 핵/세포질 비율, ***,p<0.005
도 6은 A7r5 세포에서 ALK5 및 MAP 키나아제 억제제들의 세포 생존력에 대한 영향을 확인한 결과이다. 세포에 억제제들을 24시간 처리한 후 MTT 어세이를 수행하였다. SB431542, ALK5 inhibitor; SB203580, p38 kinase inhibitor; SP600125, JNK inhibitor; PD98059, ERK inhibitor.
도 7은 A7r5 세포에서 시잔드린 B에 의한 TGFβ1-유도 MAP 키나아제 활성화 억제를 확인한 결과이다.
(A) 세포에 TGFβ1을 처리한 후 웨스턴 블롯, (B) 3TP-Luc 리포터 컨스트럭트 형질도입 후 TGFβ1 및/또는 억제제를 각각 처리하고 루시퍼라제 활성 측정, ***,p<0.005, SB431542, ALK5 inhibitor; SB203580, p38 kinase inhibitor; SP600125, JNK inhibitor; PD98059, ERK inhibitor, (C) 세포에 TGFβ1 및/또는 시잔드린 B를 1시간 처리한 후 웨스턴 블롯, (D) JNK 및 p38 수준의 인산/총 비율, ***,p<0.005
도 8은 MAP 인산화 효소의 TGFβ1-유도 Smad2/3 인산화 및 핵 전위에 대한 영향을 확인한 결과이다.
(A) 세포에 TGFβ1 및/또는 억제제를 1시간 처리한 후 웨스턴 블롯, (B) 공초점 현미경 촬영

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

세포 배양

A7r5(rat aortic smooth muscle cell line)을 ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 구입하고, 제조사의 표준 배양방법에 따라 배양하였다. TGFβ1(Transforming growth factor beta 1, R & D Systems)의 처리(1 ng/ml)에 앞서, 세포는 0.2% 우태아혈청(Fatal bovine serum)을 포함하고 있는 DMEM에서 12시간 동안 배양하였다.

오미자로부터 리그난 추출물 준비

시잔드린 B를 포함하는 6가지 오미추출자 리그난은 공지된 방법(Kim HK et al., Phytother Res(2011))에 따라 분리 및 정제하였다. 상세하게는 9월과 10월 사이에 수확되는 오미자 열매(전북 장수) 20kg을 음건하여 분쇄한 후 오미자를 500g씩 2 L의 95% 에탄올로 50℃에서 3시간씩 2회에 걸쳐 초음파 추출하여 여과하였고, 얻어진 추출액을 50℃ 수욕상에서 감압 농축한 후 동결 건조과정을 거쳐 수득하였다. 오미자 물 및 시잔드린 B는 오픈 컬럼 크로마토그래피 및 semi-preparative HPLC에 의해 정제되었고, 화학 구조는 ¹HNMR 및 ¹³HNMR 데이터에 의해 결정되었다. 분리된 리그난은 HPLC-DAD 및 ¹HNMR 스펙트럼에 의해 95% 이상의 순도로 정제되었다.

루시퍼라제 어세이

세포에 pGL2-3TP-Luc 또는 pGL3-SBE-4-Luc 리포터 유전자 플라스미드를 형질주입(transfection) 시켰다(Shin DM et al., FASEBJ 22:2498-2507(2008)). 형질주입 24시간 후, 세포는 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물 또는 시잔드린 B를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수득하고 루시퍼라제 검출 키트(Promega)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 베타-갈락토시데이즈 활성을 이용하여 평형화시켰다.

웨스턴 블롯 분석

수득한 세포에 단백질 분해효소 및 인산가수분해효소 억제제 혼합제(Calbiochem)가 포함된 RIPA 버퍼를 처리하여 준비하였다. 단백질 정량 후 단백질을 8% 또는 10% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔의 각 웰에 주입하여 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔은 멤브레인에 블로팅(blotting)하고 이 멤브레인에 5% 스킴 밀크 용액을 가하여 블로킹시켰다. 반응이 끝나면 1X TBST액으로 세척한 후 1차 항-pSmad2, pSmad3, pp38, pJNK, pERK, smad2, smad 3 p38 또는 ERK(Cell Signaling) 항체를 희석하여 반응시켰다. 반응이 끝나면 세척 후 마우스 또는 토끼 2차 항체(cell signaling)를 반응시켰다. 반응이 완료되면 세척 후 적당히 건조된 멤브레인에 기질-발색 용액(Thermo)을 첨가하고 발색시켰다.

공초점 현미경

세포를 24웰 플레이트의 글라스 커버슬립에 배양시켜 준비하였다. 세포에 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물 또는 시잔드린 B를 1시간 동안 처리한 후, 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS에서 30분간 고정하고, 0.1% Triton X-100 및 0.2% 소 혈청 알부민을 포함하는 PBS를 15분간 처리하였다. 세포에 항-Smad3 항체를 16시간 반응시킨 후, FITC-결합 항-토끼 IgG 항체(Invitrogen) 및 DAPI(Roche)를 반응시키고 공초점 현미경(Olympus, FluoView 1000)을 이용하여 촬영하였다.

RT-PCR

RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 TGFβ1 및/또는 오미자 추출물 또는 시잔드린 B를 24시간 처리한 세포로부터 총 RNA를 수득하였다. 역전사는 제조사(Invitrogen)의 지시에 따라 수행하였으며, PCR은 섬유결합소 또는 GAPDH 프라이머를 이용하여 실시하였다(Gao DF et al., Biochem Pharmacol 73:185-197(2007), Kim SH et al., Biochem Biophys Res Commun 407:129-134(2011)).

통계학적 분석

모든 데이터는 평균±표준오차 값으로 나타내었고, 실험 그룹간의 평균값의 비교는 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 통해 수행하였으며, P<0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 평가한다.

실험결과

오미자 추출물의 TGF β1/ Smad 신호전달 저해

오미자 추출물의 TGFβ1/Smad 신호전달에 미치는 영향을 확인하기 위해, Smad2/3 프로모터를 포함하는 리포터 유전자 컨스트럭트를 이용하여 루시퍼라제 어세이를 수행하였다. 오미자 추출물은 처리한 양에 비례하여 TGFβ1에 의해 증가된 루시퍼라제 활성을 억제시켰고(도 1A-B), 세포 독성을 나타내지 않았다(도 2A). 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 오미자 추출물은 Smad2/3의 인산화 수준을 감소시켰다(도 1C 및 2B). 또한, 오미자 추출물은 TGFβ1에 의해 유도된 Smad3의 핵으로의 전위를 저해하였으며(도 1D-E), RT-PCR 분석 결과, 오미자 추출물이 TGFβ1에 의해 유도된 섬유결합소(fibronectin)의 전사를 억제하는 것을 확인하였다(도 1F). 이러한 결과들로 볼 때, 오미자 추출물은 Smad2/3 인산화 및 핵 전위를 저해함으로서 TGFβ1/Smad 신호전달을 억제한다.

시잔드린 B의 TGF β1/ Smad 신호전달 저해

오미자의 구성요소 중 TGFβ1/Smad 신호전달에 작용하는 성분을 밝히기 위해, 오미자의 활성 구성성분으로 알려진 6가지 리그난을 준비하였다(Kim HK et al., Phytother Res, (2011)). 루시퍼라제 어세이 결과, 6가지 리그난, 고미신 N 및 시잔드린 B는 TGFβ1/Smad 신호전달에 있어 억제 효과를 갖는다(도 3A). TGFβ1/Smad 신호전달에 대한 시잔드린 B의 억제 효과는 2가지의 다른 리포터 컨스트럭트를 이용하여 확인하였다(도 3B-C). 또한, 오미자 추출물이 TGFβ1-유도 섬유결합소의 전사를 억제하는 것을 확인하였다(도 3D). 고미신 N은 고농도에서 세포 사멸이 유도되었으나, 시잔드린 B는 농도 증가에 따른 세포 사멸은 크게 증가하지 않았다(도 4).

시잔드린 B의 Smad2 /3 핵 전위 및 인산화 저해

TGFβ1/Smad 신호전달에 있어 시잔드린 B의 메카니즘을 확인하기 위해, Smad2/3의 인산화 수준을 측정하였다. 시잔드린 B가 존재함에도 불구하고, TGFβ1는 Smad2/3 인산화를 유도하였다(도 5A). 그러나, TGFβ1 처리하고 2시간 후에 시잔드린 B는 인산화된 Smad2/3 수준을 현저하게 저하시켰다(도 5A-B). 이러한 결과는 시잔드린 B가 Smad2/3의 탈인산화를 증가시킬 뿐만 아니라 TGFβ1 수용체 ALK5의 활성을 억제하는 것을 의미한다. 본 발명자들은 시잔드린 B가 TGFβ1에 의해 유도된 Smad3의 핵 전위를 억제하는지를 확인하기 위해 실험을 수행한 결과, Smad3의 핵 전위는 시잔드린 B가 처리된 세포에서는 발견되지 않았다(도 5C-D). 이러한 결과는 시잔드린 B가 Smad2/3의 지속적인 인산화 및 핵 전위를 저해하여 TGFβ1/Smad 신호전달을 억제하는 것을 설명하고 있다.

시잔드린 B의 TGF β1-유도 MAP 키나아제 활성화 억제

TGFβ1은 MAP 키나아제를 활성화시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 TGFβ1-유도 MAP 키나아제의 활성화가 A7r5 세포에서 발견되는지 확인하였다. 도 7A를 보면, TGFβ1는 p38 및 JNK의 인산화를 현저하게 증가시킨다. 반면, ERK는 TGFβ1에 의해 조금 영향을 받는다. TGFβ1/Smad 신호전달에서 MAP 키나아제의 역할을 확인하기 위해, ALK5 및 MAP 키나아제 억제제를 이용하여 루시퍼라제 어세이를 수행하였다. 도 6을 보면, 사용된 억제제들의 농도에서 세포독성은 발견되지 않았다. ALK5, p38 및 JNK 억제제는 ERK 억제제에 비해 TGFβ1에 의해 증가된 루시퍼라제 활성을 저해하였다(도 7B). 그러나, p38 및 JNK 억제제는 Smad2/3의 인산화 수준에는 영향을 끼치지 않았으며(도 8A), Smad3의 핵 전위를 저해하지 않았다(도 8B). 이러한 결과는 p38 및 JNK 활성화가 핵 내부의 Smad2/3의 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

시잔드린 B가 TGFβ1에 의해 유도된 p38 및 JNK 인산화를 억제하였다(도 7C-D). 결론적으로, 시잔드린 B는 Smad2/3 및 MAP 키나아제 신호전달을 저해함으로써 TGFβ1/Smad 신호전달을 억제한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

오미자 추출물, 시잔드린 B(Schisandrin B) 또는 고미신 N(Gomisin N)을 유효성분으로 포함하는 혈관 섬유증 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 혈관 섬유증은 간 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증 또는 발기부전인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 TGFβ1(Transforming growth factor beta 1) 신호전달을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Smad2/3의 핵 전위(nuclear translocation) 및 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 TGFβ1으로 유도되는 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 조성물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.