KR101340940B1 - 데커시놀 또는 데커시놀 엔젤레이트를 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의하여 활성화된 미세아교세포(microglia)에 있어서, 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해; 및 ERK1/2 MAPK 경로 활성화의 효과를 발휘하는 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물의 새로운 용도에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 상기 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물은 퇴행성 신경질환에 대한 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

데커시놀 또는 데커시놀 엔젤레이트를 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing decursinol or decursinol angelate for preventing or treating neurodegenerative diseases}

본 발명은 데커신 또는 이의 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의하여 활성화된 미세아교세포(microglia)에 있어서, 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK 신호전달 경로 저해; 및 ERK1/2 경로 활성의 효과를 발휘하는 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물의 새로운 용도에 관한 것이다.

신경교세포 중 미세아교세포(microglia)는 중추신경계 신경교세포의 10-12%를 차지하는 세포로서 1932년 리오 오르테가(Rio-Hortega)의 형태학적인 연구와 조직염색 방법에 의해 처음으로 보고되었다. 미세아교세포(microglia)는 조직 내에서 변성된 뉴런(neuron)과 이물질 등을 잡아먹는 작용을 하여 물질의 운반과 파괴, 제거 및 병적 대사 물질의 청소 등 중요한 역할을 하여 일반적으로 중추신경계에 존재하는 대식세포(macrophage)로 여겨진다.

또한, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron)와 다른 신경교세포들(astrocytes, oligodendrocytes)과 구별되는 특징적인 세포표면 항원을 발현하고, 탐식작용 등 대식세포와 유사한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미세아교세포는 발생과정 중에 이들 세포의 전구 세포로 여겨지는 단핵구세포(monocyte)들이 중추신경계에 들어와 분화한 것으로 알려져 있는데, 중추신경계내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하며, 이때 감염 장소로 이동하거나 국소적인 증식을 통해 감염미생물을 탐식하고 손상된 신경세포들의 잔유 물질들을 소화하게 된다.

미세아교세포는 중추신경계에서 자기방어라는 본래의 기능을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β, 반응성 산소 (ROS) 혹은 질소 화합물 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래하게 된다.

최근, 알츠하이머(Alzheimer), 파킨슨병(Parkinson) 등의 퇴행성 신경질환뿐 아니라 외상 및 허혈 상태에 따른 신경세포 손상에도 이러한 미세아교세포의 과민 활성화가 관련되어있다는 연구 보고가 나오고 있으며[Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases. Gonzalez-Scarano, F and Baltuch, G. Annu. Rev. Neurosci. 22:219-40 (1999)], 이들 활성화된 미세아교세포를 억제하거나 활성화된 미세아교세포가 분비하는 염증유발 물질들의 작용을 막는 치료법이 개발되고 있다.

즉, 미세아교세포의 활성화로 대변되는 신경염증반응이 다양한 신경조직손상에 있어서 중요한 병리적 역할을 수행하며, 궁극적으로 이러한 미세아교세포의 염증 활성화를 저해함으로써 신경조직손상 억제방안을 모색할 수 있고, 임상적으로 적용할 수 있는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료제의 개발이 가능할 것이다

한편, 한편, 당귀는 미나리과에 속한 다년생 초본으로 우리나라에서는 참당귀(Angelica gigas NAKAI)를 사용하고 중국에서는 당귀(Angelica sinensis DIELS)를 사용하고 일본에서는 대화당귀 (Angelica acutiloba KITAGAWA)를 이용하고 있다.

참당귀(Angelica gigas NaKai)는 피가 부족할 때 피를 생성해 주는 보혈작용(補血作用)을 가지고 있다. 중국당귀나 왜당귀의 뿌리는 보혈작용이 뛰어나고 참당귀의 뿌리는 보혈작용보다는 피를 원활히 순환하게 해주는 활혈작용(活血作用)이 더 뛰어나며 항암효과 및 혈압강하작용이 강하다. 약리학적으로 당귀는 관상동맥의 혈류량을 촉진시키고, 적혈구 생성을 왕성하게 한다. 예부터 진정, 진통, 빈혈 및 월경통, 냉대하증 등의 부인과 질환에 보혈, 청허약으로 널리 임상에 사용되어 왔고 성분으로는 쿠마린계 화합물인 데커신, 데커시놀, 움벨리페론 등이 보고되어 있으며, 최근 항돌연변이 활성, 간 해독 활성, 신경 보호 작용 등이 보고되어 있다(Kang et al., J Nat Prod 68, 56-59, 2005).

참당귀(Angelica gigas Nakai)의 주요 성분인 데커신(decursin), 데커시놀 안젤레이트(decursin angelate), 데커시놀(decurcinol), 또는 이들을 2종 이상 포함하는 당귀추출물의 약리작용에 대하여는 많은 연구가 있어 왔다. 그 중 백혈병 암세포에 유효한 것(특허 공개공보 제2001-0080265호), 진통작용이 있는 것(특허 등록공고 제10-0397950호), 폐암, 간암 등에 유효한 것(특허 등록공고 제10-0187881호) 및 항암제 사용시의 신장독성 억제성분으로 작용하는 것(특허공개공보 제2000-0026683호)을 밝혀낸 연구가 두드러진다.

이처럼, 종래 연구에서 데커신 화합물이 항암 및 해독 성질 등을 가지는 것이 알려져 있지만, 염증 매개의 신경퇴행에서 데커신 화합물의 영향 및 분자적 메카니즘은 아직까지 명확히 규명되지 않고 있다.

이에 본 발명자들은 당귀로부터 추출한 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물이 IL-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해; 및 ERK1/2 경로 활성의 효과를 발휘하는 것을 확인하고, 미세아교세포에서의 염증 매개체의 생성 및 활성화를 저해하는 데커신의 영향 및 분자적 메카니즘을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 데커신 또는 이의 유도체 화합물의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 데커신 또는 이의 유도체 화합물의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 데커신 또는 이의 유도체 화합물을 이용하여 IL-1β의 발현, SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 데커신 또는 이의 유도체 화합물을 이용하여 ERK1/2 경로를 활성화하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 데커신(decursin) 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 데커신 화합물 또는 그 유도체는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나일 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 데커신 화합물 또는 그 유도체 화합물은 당귀 유래인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 데커신 화합물 또는 그 유도체 화합물은 0.5 내지 20μM의 농도 범위로 함유되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 미세아교세포의 활성화에 의하여 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세아교세포의 활성화는 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현에 의해 조절되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β, MCP-1 및 MIP-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK 신호전달 경로를 저해; NK-kB의 활성 억제; 및 ERK1/2 경로 등을 활성화 시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 데커신 화합물은, (a) 당귀 분말을 유기용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 유기용매 추출물을 분획하여 크로마토그래피로 화합물을 분리하고 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 데커신 화합물 또는 이의 유도체를 이용하여 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 SAPK/JNK 경로 저해; p38 MAPK신호전달 경로 저해; NK-kB의 활성 억제; 및 ERK1/2 경로 활성화 등에 의해 이루어지는 것일 수 있다.

당귀 유래의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은, 미세아교세포의 활성화에 관여하는 전염증성 사이토카인 IL-1β 발현조절, SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로, ERK1/2 경로조절 등 염증 매개체의 생성 및 활성을 전사 수준에서 억제하므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Aβ_25-35 자극된 THP-1 유도된 대식세포 및 단핵구에서 데커신(A), 데커시놀 엔젤레이트(B), 데커시놀(C)의 세포 생존능에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 2는 대식세포 및 단핵구에서의 IL-1β 발현에 미치는 Aβ_25-35 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 5는 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 IL-1β 발현에 미치는 데커신(도 3), 데커시놀 엔젤레이트(도 4), 데커시놀(도 5)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6 내지 8은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 인산화된 ERK1/2 수준에 미치는 데커신(도 6), 데커시놀 엔젤레이트(도 7), 데커시놀(도 8)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9 내지 11은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 인산화된 JNK 수준에 미치는 데커신(도 9), 데커시놀 엔젤레이트(도 10), 데커시놀(도 11)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12 내지 14은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 인산화된 p38 MAPK 수준에 미치는 데커신(도 12), 데커시놀 엔젤레이트(도 13), 데커시놀(도 14)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 IL-1β 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 IL-6의 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 TNF-α의 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 IL-8의 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 MCP-1의 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서의 MIP-1β의 발현정도를 처리별, 시간별, 그리고 주요작용경로 저해제의 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 조직 샘플은 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미할 수 있다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.

"세포사멸"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 대상 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다.

치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 데커신(Decursin) 또는 이의 유도체 화합물의 신규 용도에 관한 것이다. 데커신은 당귀에 들어있는 쿠마린(coumarin) 유도체로서 종래 연구에서 데커신의 항암 및 항산화 성질을 가지는 것이 알려져 있지만, 염증 매개의 신경퇴행에서 데커신의 영향 및 분자적 메카니즘은 규명되지 않았었다.

이에 본 발명은 데커신(Decursin) 또는 이의 유도체 화합물의 염증 매개의 신경퇴행을 억제하는 새로운 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

특히, 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해; ERK1/2 경로를 활성화하고, 실험동물에서 독성을 나타내지 않으므로, 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸증 및 다발성 경화증과 같은 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다

따라서 본 발명은 일 관점에서 하기 화학식 1로 나타내는 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료적 용도에 관한 것이다.

<화학식 1>

또한, 본 발명에 따른 상기 데커신 화합물은 데커신 유도체 화합물을 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 데커신 유도체 화합물은 화학식 2 및 3으로 나타내는 데커시놀 안젤레이트와 데커시놀 화합물일 수 있다.

<화학식 2>

<화학식 3>

이들 중 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 피라노쿠마린(pyranocoumarin)의 일종으로 C₁₉H₂0O₅의 분자식으로 나타내어지고 동일한 구조의 쿠마린 핵을 가지고 있으며, 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 각각 쿠마린 핵에 세네시오일릭 산(senecioylic acid)이 에스터 결합(ester bond)에 의해 결합된 구조와 세네시오일릭 산의 구조 이성질체인 안젤로산(angeloic acid)이 결합된 구조를 가진다.

이 밖에도 데커신 유도체 화합물로써 상기 설명한 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료적 기능을 발휘하는 것이라면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물은 당귀로부터 분리하여 제조할 수 있다. 상기 당귀는 한국 참당귀(Angelica gigas NAKAI), 중국의 당귀(Angelica sinensis DIELS) 및 일본의 대화당귀 (Angelica acutiloba KITAGAWA)를 모두 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 한국 참당귀(Angelica gigas NAKAI)를 사용하였다.

상기 데커신 화합물 등은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 상업적으로 판매하는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 데커신 화합물은 일 예로써,

(a) 당귀 분말을 유기용매로 추출하는 단계; 및

(b) 상기 유기용매 추출물을 분획하여 크로마토그래피로 화합물을 분리하고 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

단계 (a)에서 유기 용매로 알코올을 사용할 수 있고, 알코올은 C1 내지 C4의 저급 알코올로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 에탄올인 것이 더욱 바람직하다.

상기 본 발명의 일 구체예에서 당귀는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있으며, 당귀 뿌리를 깨끗이 세척하고 건조하여 사용한다. 건조된 당귀 분말을 적당한 량의 유기용매, 바람직하게는 에탄올로 추출하고, 수득한 에탄올 추출물을 아세토니트릴 등으로 분획한다. 그리고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 쿠마린(coumarine) 계열의 혼합물을 얻은 뒤 이를 헥산:에틸아세테이트로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행함으로써 에틸아세테이트 분획에 존재하는 상기 화합물들을 얻는 방법 등이 있다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서 상기 화학식 1 내지 3의 화합물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 화합물의 분리 및 정제는 당분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해, 예를 들면, 간섭기를 적절히 보호하거나, 당분야에 공지된 다른 적당한 시약으로 교체하거나, 또는 반응 조건을 통상적으로 변화시킴으로써 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 화합물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 제조예들과 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

상기와 같은 방법으로 수득할 수 있는 본 발명의 상기 화학식 1 내지 3의 데커신 및 이의 유도체 화합물은 염증 매개의 신경 퇴행과 관련하여 이하와 같은 분자적 기능을 가진다.

즉, 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현에 의해 미세아교세포(microglia)의 활성을 조절하는 특징이 있다.

미세아교세포(microglia)는 중추신경계내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β 과 같은 전염증성 사이토킨(cytokine); 활성산소종 (ROS); 혹은 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2) 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래한다.

이 중에서 특히, 본 발명과 관련된 분자적 기작은 미세아교세포의 활성화를 가져오는 원인이 되는, 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현 메커니즘이다.

아밀로이드-β 펩티드(Aβ)는 베타 아밀로이드 전구체 단백질("βAPP")로 알려진 거대 단백질에서의 단백질분해에 의해 유도된 39-43 아미노산 펩티드이다. βAPP에서의 돌연변이는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 Aβ 원섬유 및 다른 성분으로 구성된 판의 뇌 침착을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환, 다운 증후군, 뇌 아밀로이드 혈관병증 및 노인성 치매의 가족형을 야기한다. 알츠하이머 질환과 관련된 APP에서의 알려진 돌연변이는 β 또는 γ-세크레타제의 분열 부위에 근접하거나 또는 Aβ 내에서 발생한다.

본 발명의 실험에 사용한 Aβ_25-35 펩타이드는 베타-아밀로이드의 25~35 프래그먼트 펩타이드이다. 이 펩타이드는 전체 길이의 베타 아밀로이드 펩타이드의 많은 특성을 보유하고 있다. 예를 들어 양친성(amphiphilic nature), 응집력(aggregate), 알츠하이머 질병에 포함되어 있는 구조적 변화(conformational change) 연구 모델 시스템으로 제공될 수 있다

특히, 상기 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 발현이 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β는 미세아교세포에서의 염증유발 유도물질로서, 외부자극이 가해지는 경우, 여러가지 신호 경로들, 예를 들어 SAPK/JNK 경로, p38 MAPK신호전달 경로, ERK1/2 경로 등의 억제 또는 활성을 통해 발현이 유도되고, 생성된 전-염증성 사이토카인은 iNOS 및 COX-2를 코딩하는 유전자의 발현을 자극시켜, 염증반응에 관여하는 NO 및 PGE₂ 물질을 생성하여 뇌의 미세아교세포에서 염증반응을 일으키게 된다.

본 발명에 따른 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 농도 의존적으로 상기와 같은 전염증성 사이토카인 IL-1β 발현을 억제하는 기능을 가지는데, 상기 기작에 따라, SAPK/JNK 경로, p38 MAPK신호전달 경로, ERK1/2 경로 등의 활성에도 영향을 끼치게 된다.

다시 말해, 본 발명에 따른 데커신 화합물은 미세아교세포에서의 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ) 활성을 억제하는 기능을 가지고 있고, 이는 IL-1β 발현을 억제하는 효과에 대한 메카니즘과 관련이 있다. 데커신 등에 의한 SAPK/JNK 경로 저해, p38 MAPK신호전달 경로저해, ERK1/2 경로 활성화 등의 기능이 IL-1β 발현 억제로 이어져 미세아교세포에서의 염증을 감소시키게 되는 것이다.

따라서 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 Aβ에 의하여 자극된 미세아교세포(microglia)에서, 전염증성 사이토카인 IL-1β의 생성을 억제한다.즉, 신경 세포 손상을 유도하는 IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 세포 독성없이 농도 의존적으로 억제하므로, 염증 매개의 퇴행성 신경질환에 유효한 치료 및 예방효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 Aβ에 의해 유도된 ERK1/2 인산화 억제를 저해함으로써 ERK1/2 경로를 활성화시켜 염증성 매개체 IL-1β의 생성을 억제하는 특징이 있다.

ERK1/2 경로는 성장 인자가 세포 표면 수용체와 결합하는 세포내 반응과 관련된 신호 전달 경로이다. 이 경로는 매우 복잡하고 많은 단백질 요소들을 포함하는데, 많은 세포 타입에서 이 경로의 활성은 세포 분할을 촉진한다. 특히, Aβ에 의해 세포 분할이 억제되는데, 이러한 기작은 ERK 1/2 단백질의 하향조절 메커니즘에 의한 것이다.

본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 용량-의존적 방법으로 ERK1/2 단백질의 인산화를 회복시킨다. 즉, 데커신 등이 ERK1/2의 인산화의 억제를 매우 효과적으로 저해하여 ERK1/2 경로를 활성화시킴으로써 Aβ-유도된 IL-1β 생산 억제에 기여한다.

나아가 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 미세아교세포(microglia)에서 SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로를 저해하여 Aβ에 의해 유도된 염증성 매개체 IL-1β의 생성을 억제하는 특징이 있다.

JNK(C-Jun N-terminal kinases)는 스트레스-활성화된 단백질 키나아제 (stress-activated protein kinase, SAPK)라고 불리고, 원래 사이토카인,UV, 열충격, 삼투압 충격 등과 같은 스트레스 자극에 반응하여 전사 활성 영역 내 Ser63 및 Ser73 상에서 c-Jun과 결합하고 인산화시키는 키나아제로서 알려져 있고, T 세포 분화 및 세포사멸에 관여한다.

본 발명의 데커신 및 이들의 유도체 화합물은 Aβ-유도된 JNK 인산화에 대하여 억제활성을 가지므로 전염증성 사이토카인 IL-1β 생산의 감소에 기여할 수 있고, 이에 뇌의 미세아교세포에서 Aβ 축적에 의해 유도된 염증에 대해 억제활성을 가진다.

한편, p38 MAPK(P38 mitogen-activated protein kinases)도 사이토카인,UV, 열충격, 삼투압 충격 등과 같은 스트레스 자극에 반응하는 미토젠-활성화된 단백질 키나아제 군으로 세포 분화 및 세포사멸에 관여한다.

본 발명에 따른 데커신 또는 이의 유도체 화합물에 의한 IL-1β 발현 억제는 상기 p38 MAPK 경로를 통해 매개될 수도 있다. 즉, 데커신 등을 처리하면, Aβ-자극된 세포에서 p38 단백질의 인산화가 매우 효과적으로 억제된다. 즉, 데커신, 데커시놀 엔젤레이트 및 데커시놀이 Aβ-유도된 p38 단백질 인산화에 대하여 억제활성을 가지고, 이는 Aβ-자극된 세포에서 IL-1β 생산을 감소시키므로 결과적으로 뇌의 신경교세포에서 Aβ 축적에 의해 유도된 염증을 억제시키게 된다.

그러므로 본 발명에 따른 데커신 화합물은 p38의 인산화를 저해하는 기작을 통해서도 IL-1β 생성을 억제하고 iNOS 및 COX-2 유전자 발현을 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 염증 매개체에 따른 신경 퇴행에 있어서, SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해; 및 ERK1/2 경로 활성화 기작에 따라 결정되는 IL-1β 생성의 저해에 기반을 둔 데커신의 신규한 항염증 메카니즘을 보여준다.

뿐만 아니라 염증 매개체에 따른 신경 퇴행에 있어서, 본 발명의 데커신 또는 이의 유도체 화합물은 상기 화합물의 농도가 0.01nM ~ 15μM의 양으로 조성물에 포함되어 있거나 또는 대상에 상기 농도로 처리할 경우, 유효한 효과를 얻을 수 있는 반면, 15μM을 초과하면 세포독성을 일으킬 염려가 있고, 0.01nM 미만의 경우에는 유효한 효과를 발휘하기 어려운 단점이 있다.

또한, 상기 범위 내에서 데커신 또는 이의 유도체 화합물의 농도(용량)에 따라 SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해; 및 ERK1/2 경로 활성 기작에 의해 결정되는 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)-유도된 IL-1β의 발현 억제효과는 증가하는데, 바람직하게는 5.0 내지 10μM의 농도 범위로 사용할 수 있다.

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 용어 "본 발명에 따른 데커신 화합물 또는 데커신 유도체 화합물" 또는 "화학식 1 내지 3의 화합물"은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 수화물, 용매화물, 이성질체 및 프로드럭을 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다.

용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 용어 "수화물", "용매화물" 및 "이성질체" 역시 상기와 같은 의미를 가진다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 석신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨 염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘 염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.

용어 "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

용어 "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 량의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이다.

용어 "이성질체(isomer)"는, 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 화학식 1에 따른 화합물은 치환기들의 종류에 따라서는 입체생성 중심(asymmetric center, 비대칭 탄소 원자)을 가질 수 있는 바, 이 경우 화학식 1 내지 3의 화합물은 거울상 이성질체 및 부분 입체 이성질체와 같은 광학 이성질체로서 존재할 수 있다.

용어 "프로드럭(prodrug)"은 생체내에서 모 약제(parent drug)로 변형되는 물질을 의미한다. 프로드럭은, 몇몇 경우에 있어서, 모 약제보다 투여하기 쉽기 때문에 종종 사용된다. 예를 들어, 이들은 구강 투여에 의해 생활성을 얻을 수 있음에 반하여, 모 약제는 그렇지 못할수 있다. 프로드럭은 또한 모 약제보다 제약 조성물에서 향상된 용해도를 가질 수도 있다. 예를 들어, 프로드럭은, 수용해도가 이동성에 해가 되지만, 일단 수용해도가 이로운 세포에서는, 물질대사에 의해 활성체인 카르복실산으로 가수분해되는, 세포막의 통과를 용이하게 하는 에스테르("프로드럭")로서 투여되는 화합물일 것이다. 프로드럭의 또 다른 예는 펩티드가 활성 부위를 드러내도록 물질대사에 의해 변환되는 산기에 결합되어 있는 짧은 펩티드(폴리아미노 산)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 화합물들을 이용한, 퇴행성 신경질환의 치료 또는 예방 방법을 제공할 수 있다. 상기 퇴행성 신경질환은 미세아교세포의 활성화에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하며, 상기 미세아교세포의 활성화는 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 의해 유도되는 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현에 의해 조절되며, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸증 또는 다발성 경화증 등이 있다.

또한, 본 발명은 환자에게 유효량의 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물을 투여하여 IL-1β의 발현 억제; SAPK/JNK 경로 및 p38 MAPK신호전달 경로 저해하는 방법을 제공할 수 있으며, ERK1/2 경로의 활성 방법을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 화합물을 사용하여 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)에 유도된 IL-1β 발현에 관련된 분자적 메커니즘을 조절함으로써, Aβ-유도된 IL-1β 발현과 관련된 질병들의 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 데커신 화합물 또는 이의 유도체 화합물 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게 상기 화합물은 본 명세서 상에 개시된 화학식 1 내지 3의 화합물, 더욱 바람직하게는 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유할 수 있다. 나아가, 상기 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제 등을 추가로 더 포함할 수 있다.

용어 "약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

상기 약학적 조성물은 생물체내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.

용어 "약리학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 화합물의 량이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감하는 것을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키거나 (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키게 하는 것을 의미하며, (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 량을 의미한다.

용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다. 용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 용어 "약리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제로 정의된다.

여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서, 투여될 수 있다. 또한, 투여 시 적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함한다. 또한, 예를 들어, 종종 침적 또는 서방성 제형으로, 충실성 종양에 직접적으로 주사하는 것에 의해, 전신 방식보다는 국소 방식으로 화합물을 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 사용을 위한 약학적 조성물은, 약학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용에 적합한 약제 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 량으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다. 본 발명의 방법들에서 사용되는 임의의 화합물에 대한 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 측정될 수 있다. 예를 들어, 용량(dose)은 세포 배양에서 결정된 IC₅₀를 포함하는 순환 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 계산될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서의 유용한 선량을 더욱 정확히 결정하는데 사용될 수 있다.

투여량은 채용된 투여 형태와 이용된 투여루트에 따라 상기범위에서 변화될 수 있다. 정확한 산정, 투여 루트 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 조성물의 선량 범위는 환자 체중의 약 0.5 내지 1000 mg/kg 일 수 있다. 투여량은, 환자에게 요구되는 정도에 따라 한번에 또는 하루 또는 그 이상의 과정으로 일련의 둘 또는 그 이상으로 제공될 수도 있으며, 투여 농도를 기준으로 선택될 수도 있다. 통상적으로, 환자에게 투여되는 데커신 또는 이의 유도체 화합물의 농도 범위는 약 1.0 내지 15μM, 바람직하게는 5.0 내지 10μM, 더욱 바람직하게는 약 10μM일 수 있다.

투여량과 간격은 키나아제 조절 효과 또는 최소 유효 농도(MEC)를 유지하기에 충분한 활성 부위의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수도 있다. MEC는 개개의 화합물에 따라 달라지지만, 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 분석법을 사용하여 키나아제의 50~90% 억제를 달성하는데 필요한 농도와 같이 생체외 데이터로부터 예측될 수도 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 각자의 특성들과 투여 경로에 따라 달라지게 된다. 그러나, HPLC 정량 또는 생물학적 정량이 혈장 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.

투여 간격은 MEC 값을 사용하여 결정할 수도 있다. 화합물들은, 한번에 10~90%, 바람직하게는 30~90%, 특히 바람직하게는 50~90%로 되도록, 혈청 수준을 상기 MEC 이상으로 유지하는 투여 계획을 사용하여, 투여되어야 한다.

물론, 투여되는 조성물의 량은 치료될 개체에 따라, 객체의 체중에 따라, 통증의 심각에 따라, 투여 방식 및 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

이하 실시예에서 수득한 값은 평균±SD로 표시하였고, 통계학적 분석은 윈도우용 SPSS 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL)를 이용하여 수행하였다. 일원 분산분석(one-way ANOVA) 후, 사후 Bonferroni 수정 테스트를 적용하여 시험 그룹간 유의한 차이점을 분석하고 서로 다른 그룹들을 비교하였다. P < 0.05 값은 통계학적으로 유의한 것으로 받아들여진다.

< 제조예 1>

당귀로부터 데커신 및 이의 유도체 화합물 분리

지방 시장에서 당귀(gigas Nakai) 뿌리를 구입하고 건조시켜 분말로 만든 후, 상기 당귀 분말 100kg을 상온에서 하루 동안 500 L 95% 에탄올에서 교반시킨 다음 약 5kg 추출물을 수득하였다. 에탄올 추출물로부터 아세토니트릴-수용액으로 (v/v, 70:30) 분취용 액체 크로마토그래피(Recycling preparative HPLC)를 이용하여 데커신(화학식 1) 및 데커시놀 엔젤레이트(화학식 2)를 정제하여 수득하였고, 데커시놀(화학식 3)을 아세토니트릴-수용액(v/v, 40:60)으로 재-HPLC에 의해 정제하여 수득하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

HPLC (Ultimate 3000, USA)에 의해 정량을 수행하였다.

< 제조예 2>

세포 및 시약 준비

(1) 재료 준비

THP-1 세포주를 한국 세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB; Seoul, Korea)로부터 수득하였다. 아밀로이드 β-펩타이드 (25-35) 트리플루오로아세테이트 염 (Aβ25-35) 을 Bachem California (Torrence, CA)로부터, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 세포독성 검출 키트 (LDH)는 Roche (Mannheim, Germany)에서 구입하였고. Pro-Prep TM 단백질 추출 용액은 iNtRon로부터 구입하였다. 그리고 complete Mini Protease inhibitor cocktail tablets를 Roche에서 구입하였다. IL-1β 항체, SAPK/JNK 래빗 단클론 항체(mAb), 포스포-SAPK/JNK 래빗 mAb, p44/42 MAPK (Erk1/2) 래빗 mAb, 포스포-p44/42 MAPK (Erk1/2) 래빗 mAb, p38 MAP 키나아제 항체, 포스포-p38 MAP 키나아제 래빗 mAb, 포스포-IkB-α(Ser32)(14D4) 래빗mAb, 포스포-NF-kB p65 (Ser536)(93H1) 래빗mAb, GAPDH 래빗 mAb, 항-래빗 IgG AP-연결 항체, U0126(MEK 1/2 억제제) 모두 Cell Signaling (Danvers, MA)로부터 구입하였다.

① Aβ_25-35

상기 펩타이드의 활성화 형태를 얻기 위해 섬유성 Aβ_{25- 35} 를 멸균 증류수에서 펩타이드를 재현탁하고 37℃에서 1주일 동안 인큐베이션하여 준비하였다. 그 후, 1mM Aβ_{25- 35}스톡 솔루션 (각 1 ml)을 표본으로 하여 사용을 위해 -80 ℃에서 저장하였다.

② PMA

PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 1ml DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 10mg/ml 농도에서 용해시키고 멸균한 마이크로 원심분리 튜브에 넣어 -20℃에서 저장하였다.

③ MAPK 억제제

SB203580, SP600125 및 U0126은 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에서 각각 용해시키고 스톡솔루션(stock solution)농도가 10mM이 되도록 제조하였다, 제조된 스톡솔루션은 일정 양으로 분주한 후 -20℃에서 저장하였다.

(2) 세포배양

Aβ 전-염증성 활성을 위한 유용한 모델로서, THP-1 세포(Human acute monocytic leukemia cell line)를 100 IU/ml 페니실린-스트렙토마이신, 10% 열처리로 불활성화된 FBS(fetal bovine serum)이 보충된 RPMI+GlutaMAX TM-l 배지(Gibco, Invitrogen)로 95% 습식(humidified), 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃ 하 증식시켰다.

(3) 세포 분화

먼저 예비실험을 통해서 Aβ_25-35 와 데커신을 함께 또는 따로 처리한 후의 THP-1 단핵구 세포 및 마크로파지 세포 유래의 THP-1 세포에서의 반응이 다른지 확인하기 위하여 단핵구 세포를 대식세포로 분화를 유도하였다.

단핵구에 PMA를 처리하면, 대식세포(macrophages) 및 미세아교세포(microglia)와 유사한 생화학적 특성을 가진, 아메바 형태(ameboid morphology)를 가진 세포로 분화한다. 이에, THP-1 단핵구 세포에서 대식세포로의 분화를 위하여, 세포들을 6-웰 플랫 버텀 조직 배양 플레이트에 각 웰당 5×10⁶ cells/2 ml의 밀도로 씨딩하여 부착시키고, 50ng/ml PMA 존재 하에서 37 ℃에서 24시간 동안 분화시켰다. 분화 후, 상기 세포들을 CM(complete medium)으로 세척하고 추가로 24시간 동안 배양하여 자극을 위해 준비하였다. 본 실험에 있어서, 세포들에 다른 농도의 데커신, 데커신 엔젤레이트 또는 데커시놀을 3시간 동안 전-처리하고, 10μM Aβ_25-35로 추가 3시간 동안 배양하였다.

(4) 세포 처리

예비 실험에서는 데커신, 데커신 엔젤레이트 또는 데커시놀을 각각 다른 농도(1.25, 2.5, 5, 10)에서 3시간 동안 처리하고 10의 Aβ_25-35 을 3시간 동안 배양하여 세포를 전 처리 하였다. 전-처리한 세포는 THP-1 단핵구만 사용한 것을 제외하고는 예비실험 동안 단핵구와 대식세포 사이에 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 이 중 가장 효과적인 쿠마린(coumarin)화합물은 데커신인 것을 확인할 수 있었다.

예비실험 후, THP-1 세포를 6웰-플랫 바텀 플레이트에서 각 웰당 5×10⁶ cells/0.5 ml의 밀도로 분주한 후, 0.5ml의 억제제인 SB203580 1, SP600125 0.1또는 U0126 10를 1시간 동안 처리하였고, 대조군으로는 처리하지 않은 군을 사용하였다. 그런 다음 10농도의 데커신 0.5ml를 3시간 처리하였고, 이후 10의 Aβ_25-35 0.5ml를 첨가하였다. 이후 각 세포들로부터 시간 간격으로(0hr, 0.5hr, 1hr, 3hr) 총 단백질 추출물을 수득하였다.

(5) 웨스턴 블럿 분석을 위한 단백질 추출

세포들을 PBS로 2회 세척하고 10분동안 원심분리하여(1,000×g) 수득한 후, 상청액을 뽑아냈다. 80μL PRO-PREPTM 용액(complete mini protease inhibitor cocktail tablets, 1 tablet/10ml solution)으로 세포 현탁액을 준비하여 잘 섞은 후 얼음 상에서 20분 동안 배양함으로써 세포 용해물(cell lysate)을 유도하고, 원심분리를 15분 동안 하였다(16,000×g, 4℃). 그리고 조(crude) 세포성 단백질을 함유하고 있는 상청액을 신선한 1 ml 튜브로 옮겼다. BCA TM Assay Kit (Therom)를 사용하여 상청액의 단백질을 확인하고, 상기 단백질 용액을 -20℃에서 저장하였다.

< 실시예 1>

세포 생존능 분석( Cell viability assay )

세포독성 검출 키트 (LDH, Roche)를 이용하여 세포에 의한 LDH(Lactate dehydrogenase)의 분비를 측정함으로써 세포 생존능을 분석하였다.

A 그룹으로, 96-웰 플랫 버텀 플레이트에서 각 웰당 10 cells/200μl 농도로 세포들을 씨딩하고 PMA를 처리하여 대식세포로 활성화시켰다. 그리고, 그룹 B에다른 96-웰 플레이트에서 단핵구 세포들을 1% FBS 배지에서 동일 밀도로 씨딩한 후, 다른 농도의 데커신, 데커신 엔젤레이트 또는 데커시놀을 3시간 동안 처리하고 Aβ_25-35 출현과 함께 또는 출현없이 3시간 동안 배양하였다. 그 후 30분 동안 플레이트를 원심분리하고(1,000×g), 새로운 96-웰 플레이트로 200μl/well 상청액을 첨가한 후, 100μl/well 검출시약을 첨가한 다음 30분 동안 25 ℃ 에서 배양하였다. 또한, ELISA 리더기를 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다. % 생존능을 미처리한 대조군(100%)과 비교하여 계산하였다.

그 결과, LDH 분석을 이용하여 사용한 화합물들에 대한 세포독성을 분석한 결과를 도 1에 나타내었는데, 도 1을 통해 알 수 있는 바와 같이, 3시간 동안 10μM Aβ_25-35 을 세포에 처리하였을 때, 세포 생존능의 약 70%가 관찰되었고, 이는 단핵구 및 유도된 대식세포 사이에는 차이가 없었다.

그리고 데커신, 데커신 엔젤레이트 및 데커시놀과 같은 쿠마린계 화합물의 다른 농도별로 세포들을 3시간 동안 전처리하였을때, 상기 세포 생존능은 미처리된 대조군의 80% 이상이었고, 10μM Aβ_25-35으로 처리된 그룹에서는 그 이상으로 나타났다. 이러한 데이터는 상기 3가지 화합물이 Aβ의 세포독성에 대하여 보호효과를 가지는 것을 시사한다. 그리고 상기 결과는 또한 데커신 화합물들의 IL-1β 생산 억제효과는 샘플 처리에 의한 세포 죽음때문이 아니라는 것을 포함한다.

< 실시예 2>

바이오- 플렉스 사이토카인 분석( Bio - Plex Cytokine Assay )

본 발명자들은 Aβ 또는 데커신의 처리에 의해 THP-1 세포의 전 염증성 사이토카인/케모카인의 패턴을 분석하기 위해 사용된 ELISA키트(KIT)의 제조사인Bio-Rad사의 사용매뉴얼을 이용하여 실험을 수행하였다. 이를 위해 먼저, 50μg의 총 단백질은 바이오-플렉스 시스템을 이용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-8, MCP-1과 MIP-1β의 분석을 하였다.

단백질의 농도가 1 mg/ml이 되도록 5% BSA를 포함하는 PRO-PREP^TM 세포 용균 버퍼로 희석시키고, 표준 곡선을 위해 표준 용액을 준비하였다. 그런 다음, 50 μl의 각 샘플은 희석된 항체로 코팅된 비드 복합체와 배양 버퍼가 함유된 용액으로 옮긴 다음 2시간 동안 배양하였다. 이후 세척 용액(200 μL/well)으로 세척한 후 100 μL의 희석된 바이오틴화 2차 항체를 각 웰에 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 다시 세척 후 100 μL의 Streptavidinphycoerythrin을 각 웰에 추가하고 30분 동안 더 반응시켰다, 이후 최종 세척이 완료되면 루미넥스 100 분석기(Luminex Corp., Austin, TX)를 이용하여 분석하였다. 또한 이때 최소 400개의 비드가 각 사이토카인/샘플에 대해 모아졌고, 중간정도의 형광강도를 보였으며, 사이토카인 농도는 마스터플렉스 QT 분석 버전2(MiraiBio, Alameda, CA)를 이용하는 표준 곡선 데이터에 기초하여 계산하였다. 각 결과들은 평균± SE(n=5)로 표시하였으며, 모든 그룹들의 각 사이토카인간의 비교는 p<0.05가 되는 것을 유의치로 하였다.

< 실시예 3>

Aβ _25-35 에 의한 전-염증성 사이토카인 IL -1β의 유도

Aβ이 인간 단핵구 및 대식세포에서 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 발현을 조절하는지 알아보기 위해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 세포들을 Aβ_25-35을 다른 농도로 3시간 동안 처리하고(0.5, 1.0, 5.0, 10, 및 20μM) 전-염증성 사이토카인 IL-1β 생산을 확인하였다.

웨스턴 블럿 분석 공정을 Katsuyama et al의 보고서에 기재된 방법에서 약간 변형하여 사용하였다.[D.G. Walker, S.U. Kim and P.L. McGeer.: Complement and cytokine gene expression in cultured microglial derived from postmortem human brains. J. Neurosci. Res. 1995. 40, 478-493]

IL-1β 생산 분석을 위해, 각 용해물로부터 단백질 샘플 (50 μg)을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리하고 면역-블럿 TM PVDF 멤브레인(Bio-Rad)으로 전기이동(electrotransferred)시켰다. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20을 함유하고 있는 완충액에서 4℃ 에서 5% Bovine Serum Albumin (BSA, Santa Cruz)으로 멤브레인을 밤새 블로킹시켰다. 블로킹 완충액에서 상기 멤브레인을 4℃에서 2시간 동안 항-인간 IL-1β 항체의 1:500 희석액, GAPDH Rabbit mAb의 1:1000 희석액으로 배양시켰다. 상기 멤브레인을 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 anti-rabbit IgG AP-linked 2차 항체의 1:2000 희석액으로 추가 배양시켰다.

상기 블럿들을 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate (BCIP)/nitroblue tetrazolium (NBT) 컬러 현상 용액으로 현상하거나 ECL 방법에 의해 신호를 검출하였다. 신호의 밴드 강도를 Quantity One System (Bio-Rad) 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 내부 대조군으로 하우스키핑 유전자, GAPDH의 단백질 수준으로 모든 데이터를 표준화하고 비율로 표현하였다.

그 결과, Aβ_25-35가 낮은 용량에서, 대식세포 및 단핵구에서 각각 10μM 및 5μM 까지 용량-의존적으로 IL-1β의 발현을 유도함을 확인하였다(도 2). 그리고 10μM 및 20μM 그룹 사이에는 유의한 차이를 보이지 않았다.

이는 상기 Aβ_25-35 펩타이드가 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 유도를 위한 잠재적인 자극 중 하나임을 의미한다. 그러므로 10μM Aβ_25-35를 이후 연구에서 추가로 사용하였다. 10μM Aβ_25-35에서 IL-1β 발현의 배가적인 유도비율은 미처리 대조군과 비교하여 대식세포 및 단핵구에서 각각 약 7배 및 10배였다.

< 실시예4 >

Aβ 유도에 의한 사이토카인 생성과정에서 NF - kB 의 역할규명

본 발명자들은 Aβ 유도에 의한 사이토카인 생성 과정에서 전사 인자인 NF-kB의 작용을 확인하기 위해, 웨스턴 블럿을 수행하였는데, 이를 위해 상기 실시예 3에서 사용한 세포들을 동일하게 사용하였으며, 단지 일차 항체로서 1:1000으로 희석된 IκB-α (Ser32) (14D4) Ab와 항-포스포-NF-κB p65 (Ser536) (93h1) Ab를 사용하였다는 차이점이 있다.

그 결과, Aβ가 처리된 세포들의 경우, IκB 및 NF-κB의 인산화 정도는 증가한 것으로 나타났으며, 특히 Aβ를 처리하고 1시간이 경과된 경우 인산화 정도는 최대치를 보였다. 반면, 데커신을 처리한 경우, IκB 및 NF-κB의 인산화는 억제되는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 데커신 화합물은 IκB 및 NF-κB의 인산화를 억제함을 통해 IκB 및 NF-κB의 활성화를 억제하는 작용을 한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

Aβ 유도에 의한 사이토카인 생성과정에서 p38 MAPK 의 역할규명

Mitogen-activated protein kinase (MAPK)는 세포의 성장과 분화, 사이토카인과 외부자극에 대한 세포의 반응 조절에 있어서 중추적인 역할을 한다. 데커신에 의한 염증성사이토카인의 분비 억제 효과가 MAPK 신호전달 경로 (signaling pathway)를 통하여 매개되는지 확인하기 위하여 Aβ로 전처치한 대식세포를 LPS로 자극하여 ERK, JNK, p38 MAPK의 인산화에 나타난 변화를 웨스턴블롯 (western blot)으로 분석하였다. 웨스턴 블럿 방법은 위 실시예와 동일하게 하였고 세포들을 Aβ_25-35을 다른 농도로 3시간 동안 처리하고(0.5, 1.0, 5.0, 10, 및 20μM) MAPKs의 활성 정도를 분석하였다. 이때 상기 MAPKs의 활성화 측정을 위해 1:1000으로 희석된 항-포스포-p42/44 MAPK(E가1/2) Ab, 항-포스포-SAPK/JNK Ab, 항-포스포-p38 MAPK Ab를 각각 이용하였다.

그 결과, 10 μM Aβ25-35-유도된 p38MAPK 발현은 데커신에 의해 용량 의존적으로 감소하였다. 특히, 10μM의 Aβ처리 시 p38MAPK은 현저하게 감소되었다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 데커신이 Aβ로 유도되는 p38의 인산화를 억제하는 활성을 가지며, 이는 염증성 사이토카인인 IL-Ibeta, MCP-1 및 MIP-1beta의 생성을 Aβ로 자극된 세포, 즉, 뇌의 신경교세포 내에서 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 이러한 결과는 데커신 및 이의 이성질체가 뇌의 신경교세포에서 Aβ-축적에 의해 유도된 염증에 대해 활성을 억제하는 잠재력을 가지고 있음을 의미한다.

< 실시예 6>

Aβ _25-35 -유도된 IL -1β 발현에서 데커신 및 이의 이성질체의 효과

데커신 및 이의 이성질체가 Aβ_25-35-자극된 대식세포 및 단핵구에서 항-염증성 반응을 가지는지 여부를 알아보기 위하여 IL-1β 단백질의 발현을 조사하였다. 3시간 동안 상기 세포들을 데커신 또는 이들의 이성질체로 다른 농도로 전처리하고 (1.25, 2.5, 5.0, 및 10μM), 10 μM Aβ_25-35.의 존재하에서 3시간 동안 추가로 배양하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 두 가지 타입의 세포 모두에서 10 μM Aβ_25-35-유도된 IL-1β 발현이 데커신에 의해 용량 의존적 방법으로 감소하였다. 그리고 특히, 실험한 가장 높은 용량인 10μM에서 최고로 감소하였다.

이러한 결과는 데커신이 전-염증성 사이토카인 IL-1β 발현을 효과적으로 억제할 수 있고, 10 μM 데커신은 거의 완전히 대조군 그룹에서 보여주는 수준으로 회복시킬 수 있음을 나타낸다. 이는 데커신이 세포에서 Aβ-축적에 의해 유도된 염증에 대하여 매우 효과적인 활성을 가지는 것을 의미한다.

뿐만 아니라, 다른 두 화합물, 데커시놀 엔젤레이트 및 데커시놀도 Aβ_25-35-유도된 IL-1β 발현상에서 세포의 타입과 무관하게 용량 의존적 방법으로 억제 효과를 보여주었다(도 4 및 5). 그리고 최대 효과 역시 각 화합물의 최고 용량 10 μM에서 관찰되었고, 이는 데커신 실험의 경우와 매우 유사한 패턴이었다.

이러한 결과는 데커신 및 이의 이성질체가 뇌의 신경교세포에서 Aβ-축적에 의해 유도된 염증에 대해 활성을 억제하는 잠재력을 가지고 있음을 의미한다.

< 실시예 7>

Aβ-유도된 사이토카인 IL -1β 생산에서의 ERK1 /2의 역할

Aβ에의해 유도되는 세포독성 메커니즘 및 데커신과 이들의 이성질체의 전처리에의한 효과를 규명하기 위하여, ERK1/2 경로를 인산화된 ERK1/2의 웨스턴 블럿 분석에 의해 조사하였다.

그 결과, 3시간 동안 10μM의 Aβ_25-35를 처리하였을 경우, 대식세포 및 단핵구에서 대조군 수준과 비교하여 ERK1/2의 인산화 수준이 각각 약 5배 및 6 배 하향-조절되었다(도 6, 7, 8). 이는 Aβ_25-35 에 의해 억제된 세포 분할이 하향-조절된 ERK 1/2 단백질에 의한 것임을 의미한다.

그러나 세포들을 3시간 동안 데커신의 다른 농도로 전처리한 경우 (1.25, 2.5, 5.0, 10.0 μM), 용량-의존적 방법으로 ERK1/2 단백질의 인산화가 회복되었다. 게다가 실험한 최고 농도, 데커신의 10 μM에서 대조군의 수준까지 거의 완전히 회복되었고 (도 6), 이는 데커신이 Aβ_25-35-자극된 세포에서 ERK1/2의 인산화 억제를 매우 효과적으로 저해함을 시사한다.

또한, 다른 두 화합물 데커시놀 엔젤레이트 및 데커시놀 역시 Aβ_25-35-유도된 ERK1/2 단백질의 인산화 억제에서 저해효과를 보여주었다 (도 7 및 8). 그리고 최대 효과 역시 각 화합물의 가장 높은 10 μM 용량에서 관찰되었고, 이는 데커신 실험과 유사한 패턴이었으며, 특히 대식세포에서 이러한 패턴을 보였다.

상기와 같은 결과들은 데커신 및 이들의 이성질체가 Aβ_25-35-유도된 ERK1/2 인산화 억제에 대하여 저해 활성을 가짐을 의미하고, 이는 상기 화합물들이 Aβ-유도된 세포독성 및 IL-1β 생산으로부터의 회복에 기여할 수 있음을 시사한다.

< 실시예 8>

Aβ-유도된 사이토카인 IL -1β생산에서 JNK 의 역할

Aβ에의해 유도된 신호경로의 활성화 메커니즘 및 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 JNK 단백질의 인산화 상에서의 저해 효과를 규명하기 위해 SAPK/JNK 경로에서의 매개자들을 조사하였다.

그 결과, 3시간 동안 10 μM Aβ_25-35 단독 처리한 경우, JNK 인산화 수준은 대조군과 비교하여 약 2배 상향 조절되었다(도 9, 10, 11). 이는 Aβ_25-35 에 의해 유도된 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 상향 조절이 인산화된 JNK 단백질의 상향 조절에 의함을 시사한다.

한편, 3시간 동안 데커신의 다른 농도로 세포들을 전처리하고 (1.25, 2.5, 5.0, 10.0 μM), 10μM-Aβ _25-35 존재 하에 3시간 동안 추가 배양하였을 때는 용량-의존적 방식으로 JNK 단백질의 인산화가 감소하였다. 게다가, 5 및 10μM 데커신 사이에서는 거의 대조군 수준까지 완전히 감소하였고 (도 9), 이는 데커신이 Aβ _25-35-자극된 세포에서 JNK 단백질 인산화에 대하여 매우 효과적인 억제활성을 가짐을 시사한다.

다른 두 화합물 데커시놀 엔젤레이트 및 데커시놀 역시 JNK 단백질의 Aβ_25-35-유도된 인산화 상에서 용량 의존적으로 억제 활성을 보여주었다 (도 10, 11) 그리고 최대 효과 역시 각 화합물의 가장 높은 10 μM 용량에서 관찰되었고, 이는 데커신 실험과 유사한 패턴이었다.

이러한 결과들은 데커신 및 이들의 이성질체가 Aβ_25-35-유도된 JNK 인산화에 대하여 억제활성을 가짐을 의미하고, 이는 Aβ-자극된 세포에서 전염증성 사이토카인 IL-1β 생산의 감소에 기여할 수 있고, 또한, 뇌의 신경교세포에서 Aβ 축적에 의해 유도된 염증에 대해 억제활성을 가짐을 시사한다.

< 실시예 9>

Aβ-유도된 사이토카인 IL -1β 생산에서 p38 MAPK 의 역할

Aβ에의해 유도된 신호경로의 활성화 메커니즘 및 Aβ_25-35 자극된 대식세포 및 단핵구에서 p38 단백질의 인산화 상에서의 저해 효과를 규명하기 위해 인산화된 p38 MAPK 수준을 조사하였다. 즉, MAPKs 활성 분석을 위해, 각 일차 항체만을 제외하고 모든 공정을 실시예 2에서 기술한 바와 같이 수행하였다. ERK-1/ERK-2, JNK, 및 p38 MAPK 활성화를 위하여, anti-phospho-p42/44 MAPK (Erk1/2) Ab의 1:1,000 희석, anti-phospho-SAPK/JNK Ab, 및 anti-phospho-p38 MAPK Ab를 각각 사용하였다.

그 결과, 3시간 동안 10μM Aβ_25-35 단독 처리한 경우, p38 인산화 수준은 대조군과 비교하여 약 2배 이하로 상향 조절되었다(도 12, 13, 14). 이는 Aβ_25-35 에 의해 유도된 전-염증성 사이토카인 IL-1β의 상향조절이 인산화된 p38 단백질의 상향 조절된 수준에 의함을 시사한다.

또한, 3시간 동안 데커신 또는 이의 이성질체의 다른 농도로 전처리한 (1.25, 2.5, 5.0, 10.0μM) 세포들을 10μM Aβ _25-35 존재하 3시간 동안 추가 배양하였는데, 그 결과, 용량-의존적 방식으로 p38 단백질의 인산화가 감소하였다. 게다가, 데커신 및 이의 이성질체 10μM에서 대조군 수준까지 또는 그 이하 수준으로 완전히 감소하였고 (도 12, 13, 14), 이는 세 화합물이 Aβ_25-35-자극된 세포에서 p38 단백질의 인산화에 대하여 매우 효과적인 억제활성을 가짐을 시사한다.

이러한 결과는 데커신, 데커시놀 엔젤레이트 및 데커시놀이 p38 단백질의 Aβ_25-35-유도된 인산화에 대하여 억제활성을 가지고 Aβ_25-35-자극된 세포에서 IL-1β 생산을 감소시키는데 기여할 수 있으며, 뇌의 신경교세포에서 Aβ 축적에 의해 유도된 염증에 대해 억제활성을 가짐을 시사한다.

또한, 이와 같은 결과는 상기 화합물들이 Aβ-유도된 p38 단백질 인산화의 억제에 대하여 저해활성을 가지고, 알츠하이머 진행에 대항하여 항-염증 효과에 기여할 수 있음을 의미한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

1. 삭제
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9. 삭제
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11. 데커시놀 엔젤레이트를 이용하여 시험관(In vitro) 상의 대식세포 또는 단핵구에서 전염증성 사이토카인 IL-1β의 발현을 억제하는 방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 방법은 SAPK/JNK 경로 저해; p38 MAPK신호전달 경로 저해; NK-kB의 활성 억제 및 ERK1/2 경로 활성화에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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