KR20000063617A

KR20000063617A - 한국산 해조류 유래의 면역증강용 추출물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20000063617A
Application number: KR1020000043104A
Authority: KR
Inventors: 허억; 왕종근; 황성구
Original assignee: 왕종근; 주식회사 선진애드
Priority date: 2000-07-26
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2000-11-06
Also published as: KR100397531B1

Abstract

본 발명은 해조류 유래의 면역증강용 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 해조류에 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 수용성 추출물을 1차 분리하고, 또한 상기 수득한 상등액에서 크로마토그래피법에 의해 단백질 성분인 렉틴 분획을 2차 분리하여 면역증강 효과를 시험한 결과, 각 추출물은 면역세포를 활성화시키며 세포독성이 없는 매우 뛰어난 효과가 있어 음료수 첨가제, 사료 첨가제, 음식물 등에 면역증강제로 사용할 수 있다.

Description

한국산 해조류 유래의 면역증강용 추출물 및 그 제조방법{Seaweed extract product having immuno-enhancement activity and methods of producing and utilizing the same}

본 발명은 한국산 해조류 유래의 면역증강용 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 해조류로부터 물로 분리한 수용성 추출물 및 상기 추출물로부터 크로마토그래피에 의해 분리한 단백질 성분인 렉틴분획의 면역증강제로서의 용도와 상기 면역증강용 추출물 및 그 제조방법, 유효성분으로 상기 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

면역반응이란 동물체내에 존재하는 자기방어체계로서, 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상이다. 이러한 자기방어를 위한 감시체계는 크게 두 가지 기작에 의해 이루어지는데 하나는 체액성 면역, 그리고 다른 하나는 세포성 면역이다. 체액성 면역은 혈청내에 존재하는 항체에 의해 이루어지는데, 항체는 침입한 외부 항원물질과 결합하여 그것을 제거하는 중요한 기능을 한다. 한편, 세포성 면역은 림프계에 속하는 몇 종류의 세포에 의해 이루어지는데 이러한 세포는 침입해온 세포나 조직을 직접 파괴하는 기능을 담당한다. 그리하여 체액성 면역은 주로 세포 외부에 존재하는 세균이나 바이러스, 단백질, 복합탄수화물과 같은 외부물질에 대해 효과적이며, 세포성 면역은 각종 기생충, 조직, 세포내 감염, 암세포 등에 그 기능을 발휘한다. 이러한 이중 방어체계는 B세포나 T세포 등의 주로 두 종류 림프구에 의해 수행되는데 B세포는 항체를 생산하고, T세포는 세포성 면역에 가담하고 있다. 이러한 B세포나 T세포에 의한 면역반응은 일단 체내로 침입한 항원에 대하여 반응을 하되, 반드시 같은 종류의 항원이 계속 존재하거나 반복 침입해왔을 경우에 작용하는 면역체계이다. 따라서, 이러한 면역반응은 특정 항원에 대한 특이한 반응이다. 이러한 항원특이적 면역반응 이외에도 체내에는 어떤 항원에 대해 노출되어진 경험이 없는 경우라도 직접적으로 반응하여 공격세포를 파괴하는 일종의 자연 면역반응도 있는데, 이러한 면역반응에는 neutrophil, macrophage, NK(natural killer)세포 등이 관여하여 공격대상 세포의 종류에 별로 구애됨이 없이 다양한 기능을 발휘하는 것이 특징이다.

면역기능을 증강시키기 위한 면역증강제의 개념은 로만(Roman)에 의해 제시되었으며, 어떠한 증강물질을 백신과 함께 투여하면 백신만을 투여한 경우에 비해 백신의 효과가 더 증진되는 것을 밝혀내면서 알려지기 시작했다(Roman, G., Bull. Soc. Centr. Med. Vet., 101, 277, 1925). 또한 면역증강제란 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 물질을 말하는데, 최근에 감염이나 종양의 치료에 면역강화가 이용되면서 많은 관심을 불러일으키고 있다. 면역강화에 이용되는 제제들은 특이성에 따라 일반면역강화제와 특이면역강화제로 구분되며, 또 기능에 따라 능동면역강화제와 수동면역강화제로 구분할 수 있다. 면역원성은 없으면서 생체내에서 일어나는 여러 가지 면역작용을 상승시키는 면역증강제의 작용방식은 면역증강제에 따라 다양한데, 몇 가지 열거하면 다음과 같다.

첫째로는 면역증강제에 의한 대식세포 활성화를 들 수 있는데, 이러한 작용을 하는 기존 보강제로는 muramyl dipeptide와 Tuftsin 등이 있다. 저장작용에 의해 세포내에 항원이 장시간 존재하게 되면 그 세포는 계속적으로 활성화되며 특히 항원에 의해 감작된 세포의 경우에는 계속 분열함으로써 그 딸세포들은 항원에 의해 더욱 확실히 자극받게 된다. 활성화된 대식세포는 그 표면의 항원의 발현량을 증가시킴으로서 림프구에 대한 제시효율을 향상시키며 림프구의 면역응답을 유도하게 되며, 또한, 항원제시 세포 등에 의해 분비되는 IL-1이 이러한 작용을 향상시킨다(Waksman, B. H., Springer Semin, Immunopathol. 2: 5, 1979). 둘째로 면역증강제의 림프구에 대한 특이적인 면역증강 효과이다. 즉, 동물에 주로 많이 사용되고 있는 면역증강제인 Freund's complete adjuvant(FCA)는 항원을 천천히 그리고 지속적으로 분비하게 하며, 항원제공세포 특히 대식세포의 항원제공능력을 활성화시켜 T 림프구의 활성을 증대시킨다. 또한 bacille Calmette-Guerin(BCG), Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis들은 단핵구, 림프구 그리고 NK세포들을 자극시키며, 특히 BCG는 종양환자에게 비특이적 면역강화를 위해 많이 사용되고 있다. 또한 T 림프구의 중식을 강화하는 Isoprinosine이라는 인조 면역증강제가 있으며, B 림프구를 활성화시키는 lipopolysaccharide(LPS)도 있다. 마지막으로 항종양효과가 있는 물질, 세포내 사이클릭 뉴클레오티드의 농도를 변화시키는 물질, 프로스타그란딘 합성을 저해하는 물질 등이 면역증강제로 사용되어지고 있다. 기존의 면역증강제에 있어서나, 면역증강제 개발에 있어서 대두되는 커다란 문제들은 이들 면역증강제에 의한 면역반응의 차이 또는 그 자체의 독성 등 여러 가지 부작용 때문에 현재 인간에게 사용할 수 있는 물질은 알룸(aluminum potassium sulfate)으로 극히 제한된 실정이고 그 효능이 단지 백신의 침전을 유발해 백신의 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있으나 그 효능이 별로 크지 않다.

기존의 면역증강제들의 부작용과 문제점들을 열거하면 다음과 같다. 오일 에멀젼(oil emulsion) 형태의 면역증강제로서 가장 대표적인 것은 프로인트 완전보조액(Freund complete adjuvant: FCA)이다. 그러나, 실험실에서의 동물실험 결과 죽은 마이코박테리아에 광유인 파라핀을 혼합하여 제조한 FCA 는 가장 강력한 면역증강제로서 알려져 있지만 인간에게는 그 부작용 때문에 사용하지 못하고 있다. 즉, 주사부위의 강력한 염증반응으로 인한 고통, 발열, 여러기관에서의 전신화된 육아종성증식(generalized granulomatous proliferation)에 의한 영구적 상태, 자가면역질병, 아밀로이드증(amyloidosis), 아쥬번트 관절염(adjuvant arthritis) 및 과민증을 동반하게 된다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 개발된 FIA(Freund's incomplete adjuvant)는 마이코박테리아를 첨가하지 않는 것으로 항원이 면역담당 세포에 노출되는 시간을 연장함으로서 효과를 얻으려 하였다. 그러나 FIA는 아데노바이러스 백신(adenovirus vaccine)등에 응용하였을 경우에는 면역반응을 매개하지 못하였을 뿐 아니라 조직 중에 기름이 평생 잔존하며 주사부위의 국소적 발열반응및 파라핀 오일에 의한 종양의 유기로 인하여 특수한 경우를 제외하고는 인간에 적용하지 못하는 실정이다(Kimura,J. et al., Jpn. J. Exp. Med. 48: 149, 1978).

무기화합물 면역증강제는 인간에게 허용될 수 있는 면역증강제로서 무기화합물에는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄이 포함된다. 면역증강제로서 알루미늄은 약 60년 전에 글레니(Glenny) 등(J. Pathol. Bacterial 29:38, 1926)에 의하여 디프테리아 독소의 백신제조시에 사용된 이래로 사람에게 일반적으로 알룸 면역증강제(alum adjuvant)가 사용되어 왔으나 백신에 대한 면역증강제로서 큰 효과가 없는 것으로 보고되고 있다(April, M. A. and Wardlaw, Can, J. Pibl. HITH., 57, 343, 1966). 알루미늄 면역증강제는 알루미늄이 항원에 결합하여 침전됨으로서 주사부위에서 지속적인 면역반응이 일어나게 하고, 보체를 활성화시킴으로서 B세포의 작용을 높이는 역할을 한다. 즉, 알루미늄 화합물은 체액성 면역상승은 유도할 수 있으나, 세포성 면역반응에는 영향을 미치지 못하는 것으로 알려져 있다. 그리고 몇가지 부작용, 즉 홍반, 피하결절, 접촉성 과민반응, 육아종성 염증 등의 부작용을 수반하게 된다. 따라서, 이러한 알룸 면역증강제는 인간에게 사용할 수 있으나 그 효과는 미미하다.

불활성화시킨 박테리아나 박테리아 대사산물이 항원에 대한 면역반응을 상승시킨다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 이들을 면역증강제로 이용하려는 시도는 오랫동안 계속되어 왔다. 즉, 리포폴리사카라이드(LPS), 마이코박테리아 (Mycobacteria spp.) 마이코박테리아성 화합물(Mycobacteria compounds), 코리네박테리움 파룸(Corynebacterium paruum), 코리네박테리움 그래뉼로섬(Corynebacterium granulosum)등은 그 자체를 항원으로 이용할 경우 부작용을 일으키기 않지만 다른 백신에 대한 면역증강제를 사용할 경우 큰 부작용을 일으키고 있는 실정이다. 따라서, 박테리아 생성물을 이용한 면역증강제는 주사제가 아닌 경구투여용 형태로의 개발에 초점을 맞추고 현재 연구를 계속하고 있는 실정이다(Azuma, I., Vaccine 10: 1000, 1992).

이들 이외에도 포유동물 세포막 유래의 리포좀이나 사포닌, 콜레스테롤, 항원복합체로 만들어진 면역자극성 복합체(immunostimulaticy complexes: ISCOMS)등을 이용하여 면역증강제로 사용하고 있으나 면역증강능이 기존의 것들 보다 약하고 부작용이 있기 때문에 아직 개발단계에 있다(Lovgren, K., Scand. J. Immunol. 27: 241, 1988). 따라서, 부작용이 없으면서 유용한 면역증강효과를 나타내는 신물질의 개발은 대단히 중요한 의미를 가져, 그 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 천연물질을 대상으로 하여 면역증강제 물질을 검색한 결과, 한국산 해조류로부터 추출한 추출물이 면역계를 강력하게 자극할 뿐 아니라 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역능을 상승시킴을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 해조류로부터 면역증강용 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명 방법에 따라 제조된 해조물 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획의 전기영동 결과를 나타내는 그림이다.

M: 표준 단백질. A: 환원 겔. B: 비환원 겔.

도 2는 본 발명 방법에 따라 제조된 Immunogold-α 분획의 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램을 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명 방법에 따라 제조된 Immunogold-ω 분획의 UV(280nm) 분광분석 크로마토그램을 나타낸 그림이다.

도 4는 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획의 대식세포에 있어서 TNF-α분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 5는 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획의 대식세포에 있어서 interleukin-1β(IL-1β)의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 6은 면역블로팅 기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획의 대식세포에 있어서 TNF-α 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다. M: 표준 단백질.

도 7은 면역블로팅 기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획의 대식세포에 있어서 interleukin-1β(IL-1β)의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다. M: 표준 단백질.

도 8은 RT-PCR기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획의 대식세포에 있어서 TNF-α와 interleukin-1β(IL-1β)의 유전자발현능에 관한 결과를 나타낸 그림이다. C: 대조군 표시.

도 9는 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획의 소장상피세포(IEC-6)에 있어서 interleukin-1β(IL-1β)의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 10은 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획의 소장상피세포(IEC-6)에 있어서 interleukin-6(IL-6)의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 11은 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획에 자극된 IEC-6의 배양상등액이 대식세포로부터 TNF-α의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 12는 ELISA기법에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획에 자극된 IEC-6의 배양상등액이 대식세포로부터 interleukin-1β(IL-1β)의 분비능에 관한 결과를 나타낸 그림이다.

도 13은 FACScan 분석에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α(13-2)와 Immunogold-ω(13-3) 분획이 ovalbumin 항원에 의한 보조 T 림프구 및 살해 T 림프구 증식에 미치는 영향에 관한 분석결과를 나타낸 그림이다. 대조군표시: 13-1.

도 14는 FACScan 분석에 의한 본 발명의 추출물 Immunogold-α(14-2)와 Immunogold-ω(14-3) 분획이 ovalbumin 항원에 의한 B 림프구 증식에 미치는 영향에 관한 분석결과를 나타낸 그림이다. 대조군표시: 14-1.

도 15는 본 발명 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω 분획이 keyhol limpet hemocyanin(KLH) 항원에 대한 항체생산 유도에 미치는 영향를 나타낸 그림이다.

도 16은 본 발명 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획이 비장세포에 미치는 독성을 검사한 결과를 나타낸 그림(Con: 대조군 표시)이다.

도 17은 본 발명 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획이 간조직에 미치는 독성을 검사한 결과를 나타낸 그림(Con: 대조군 표시)이다.

도 18은 본 발명 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획이 신장조직에 미치는 독성을 검사한 결과를 나타낸 그림(Con: 대조군 표시)이다.

도 19는 본 발명 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획이 미성숙 마우스에 미치는 독성을 체중변화로 검사한 결과를 나타낸 그림(Con: 대조군 표시)이다.

도 20은 본 발명 추출물 Immunogold-α(표시: α)와 Immunogold-ω(표시: ω) 분획이 성숙 마우스에 미치는 독성을 체중변화로 검사한 결과를 나타낸 그림( Con: 대조군 표시)이다.

지금까지 해조류에 대한 연구가 많이 이루어졌지만 주로 영양적인 측면에서 많이 수행되었다. 최근에 와서 해조류의 생체 기능성 효과에 대한 연구가 이루어지고 있는데, 대표적으로 해조류의 추출물의 함암효과(Perryet al. J. Nat. Prod. (USA) 54(4)978-985. 1992; Inagawa, et al., Chem Pharm Bull (Tokyo, Japan) 40(4) 994-997, 1992)와 혈전용해효과(Nishino, et al., Carbohydrate Res(Netherlands) 214(1) 193-197, 1991) 등이 보고되고 있다. 또한 동물실험에 있어서 해조류가 바이러스에 대한 내병성 증가(Babe et al., Proc. Natl. Acad. USA. 85:6132-6136, 1988), 암발생의 억제효과(Teas, J, Hypotheses, 7:601-613, 1981), 고지혈증의 치료효과(Murata et al. J. Nutr., 129:146, 1998)가 있다는 것이 발표되었다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 하여, 본 발명자들은 한국산 해조류의 활성성분과 그의 약물학적 효과를 밝히기 위하여 집중적인 연구를 수행한 결과 하기 실시예를 통하여 상세히 설명한 바와 같이 한국산 해조류에서 우수한 면역증강 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 있어서 면역증강용 추출물을 제조하는 방법은 다음과 같다.

a)면역증강용 수용성 추출물의 제조

한국산 해조류를 일광건조하는 것 외에 거의 모든 과정은 물질의 변성을 막기 위해 저온(4℃)에서 이루어진다. 건조된 해조류를 찬 이차증류수(double distilled water)로 세척한 후, 이차증류수를 시료중량 6-12배 정도로 첨가하여 저온실에서 8-12시간 배양한다. 배양한 후 저온실에서 분쇄한 후 교반한다. 그 다음 원심분리한 후, 침전물을 제거하고 수득한 상등액을 공극크기를 달리하는 여과막(60㎛ ∼ 0.45㎛)에 통과시킨 후 동결건조시켜 면역증강용 수용성 추출물을 수득한다.

b)당단백질 성분인 면역증강용 렉틴분획의 제조

한국산 해조류를 일광건조하는 것 외에 거의 모든 과정은 물질의 변성을 막기 위해 저온(4℃)에서 이루어진다. 해조류를 찬 이차증류수로 세척한 후, 이차증류수를 시료중량 10배로 첨가하여 저온실에 8-12시간 배양한다. 배양한 후 저온실에서 분쇄한 후 교반한다. 그 다음 원심분리한 후 침전물을 제거하고 수득한 상등액을 여과시킨 후 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 저온실에서 저속으로 교반배양 후 원심분리한 후 얻은 침전물에 이차증류수(4℃)를 첨가하고 투석시켜 황산암모늄을 제거한다. 투석한 용액을 원심분리한 후 상층액을 동결건조하여 -20℃에 보관한다. 동결건조된 갈색분말을 PBS로 녹여 0.45㎛로 여과한 후 0.2N HCl로 가수분해된 세파로즈 4B(Sepharose-4B) 칼럼에 적용시켜 1.5시간 고정시킨다. 고정 후 cold-PBS로 세척하고 0.1M 갈락토즈 용액으로 용출시켜 280 nm UV분광계로 흡광도를 측정하한다. 피크가 높은 분획을 회수하여, 갈락토즈를 제거하기 위해 투석여과막에 주입한 후 이차증류수로 저온실(4℃)에서 6시간씩 교환하면서 4회 투석한다. 투석한 후, 원심분리(10,000g, 30분, 4℃)하여 렉틴 분획을 수득한다.

본 발명 명세서에 사용된 "해조류(seaweed)"는 녹조류(green seaweed), 갈조류(brown seaweed), 홍조류(red seaweed) 및 다른 어떠한 종류의 해조류도 포함하는 개념이다.

본 발명의 해조류로는 특히 갈조류에 속하는 감태(Ecklonia cava), 모자반(Sargassum fulvellum), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinatifida) 등이 바람직하며, 본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 감태를 물로 추출한 해조류 수용성 성분(이하, 'Immunogold-α'라 함)과 당단백질 성분인 렉틴 분획(이하, 'Immunogold-ω'라 함)이 개시되는 바, 본 발명에 따르는 수용성 성분(Immunogold-α)은 저온에서 감태에 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 동결건조시킴으로써 수득되는 갈색 분말성분이다. 상기 성분에는 해조류 성분중에서 수용성인 모든 성분, 예를 들면 단백질류, 당류, 일부 지질 및 비타민류 등이 포함되어 있는 것으로 나타났다.

본 발명 감태으로부터 분리한 당단백질 성분인 렉틴 분획(Immunogold-ω)은 상기 물로 추출한 수용성 상등액에 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 교반함으로서 상등액중의 단백질 성분을 침전시키고, 원심분리한 후 회수한 침전물 중의 황상암모늄을 투석에 의해 제거한 후에 가수분해된 세파로즈(Sepharose) 4B칼럼에 적용시키고 칼럼을 PBS 로 세척하고 갈락토즈 용액으로 용출되는 물질(분광광도계에 의해 280nm에서 흡광도 측정)을 분리하여 동결건조시킴으로써 수득된다. 상기 방법에 의해 제조되는 분획은 해조류의 당단백질인 렉틴이 주성분인 것으로 확인되었다. 전기영동에 의한 분자량 측정결과 물 추출물인 수용성 성분 Immunogold-α는 환원상태에서 넓은 범위 (7∼150kD)에서 단백질 밴드가 관찰되었으나, 특히 분자량 32kD와 33kD 범위의 단백질이 뚜렷하게 나타났으며, Immunogold-ω에서는 이들 단백질 밴드만 나타났다, 비환원상태에서 Immunogold-ω는 약 65kD인 하나의 밴드만이 나타났다. 이로부터 상기 두 물질(32kD와 33kD 단백질들)은 이황화결합을 형성하고 있는 이형이합체 (heterodimer) 단백질로 판단되었다.

상기 방법에 의해 제조된 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω는 모두 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이 강력한 면역증강작용을 가지고 있다. 따라서, 본 발명 추출물을 임상적인 목적으로 면역증강제로서 사용하고자하는 경우에 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 이들 추출물을 유효성분으로 유효량 함유하는 적합한 약제학적 제제 형태로 제형화시켜 이용할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 약제학적 제제로는 경구투여에 적합한 정제, 캅셀제, 액제 등, 및 비경구투여에 적합한 정맥 또는 피하 주사용 액제 또는 현탁제 등이 포함될 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 한국산 해조류 각 추출물 분획의 유효량 범위는 사용하고자 하는 각 분획의 종류 및 환자의 연령, 성별, 건강상태 등에 따라 달라 질 수 있다. 또한, 본 발명 해조류 추출물은 음료 첨가제, 가축의 사료첨가제, 음식물 등에 첨가하여 면역증강 효과를 달성할 수도 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 해조류 추출물의 제조

본 실시예에서는 해조류인 톳으로부터 물로 추출한 수용성 성분(Immunogold-α분획)과 렉틴 분획(Immunogold-ω)을 제조하는 방법을 제공하며, 또한 상기 추출물들의 물리화학적 특성을 조사할 수 있는 전기영동 및 크로마토그래피 실험결과를 제공한다.

실험예 1: 감태으로부터 Immunogold-α분획 추출

감태을 일광건조하는 것 외에 거의 모든 과정은 물질의 변성을 막기 위해 저온(4℃)에서 이루어졌다. 한국산 톳을 수집하여 햇볕에 건조한 후 실험에 사용할 때까지 저온(4℃)에 보관하였다. 건조된 톳을 찬 이차증류수(double distilled water)로 2회 세척한 후, 이중증류수를 시료중량 10배로 첨가하여 저온실에서 12시간 배양하였다. 배양한 후 저온실에서 2분 동안 2회씩 믹서기 (솔잎8282A, 대구)로 분쇄한 후 12시간 Disper(교반기, 제일과학, 서울)를 사용해 저속으로(40V) 교반하였다. 그 후 30분 간 원심분리(20,000g, Rotor A6.14, Kontron, Italy)한 후, 수득한 상등액을 공극크기(pore size)를 달리하는 여과막(60㎛ ∼ 0.45㎛, Millipore)에 통과시킨 후 동결건조시켜 얻은 갈색분말을 'Immunogold-α(alpha)'라 칭하였다. 이를 다음 실험 때까지 -20℃에 보관하였다.

실험예 2: Immunogold-ω 분획 추출

본 실험예 과정은 물질의 변성을 막기 위해 거의 모든 과정이 저온(4℃)에서 이루어졌다. 한국산 톳을 수집하여 햇볕에 건조한 후 실험에 사용할 때까지 저온(4℃)에 보관하였다. 건조된 감태를 찬 이차증류수(double distilled water)로 2회 세척한 후, 이중증류수를 시료중량 10배로 첨가하여 저온실에 12시간 배양하였다. 배양한 후 저온실에서 2분 동안 2회씩 믹서기(솔잎8282A, 대구)로 분쇄한 후 12시간 Disper(교반기, 제일과학, 서울)를 사용해 저속으로(40V) 교반(하였다. 그 후 30분 간 원심분리(4℃, 20,000g, Rotor A6.14, Kontron, Italy)한 후, 수득한 상등액을 Whatman filter(NO2(11㎛) , NO3(6㎛), NO5(2.5㎛))로 순차적적으로 여과한 후 황산암모늄을 70%의 농도가 되도록 가하여 저온실에서 4시간정도 저속으로 교반배양하였다. 교반배양 후 30분간 원심분리(4℃, 20,000g, Rotor A6.14, Kontron, Italy)한 후 얻은 침전물에 이차증류(4℃)를 첨가하여 투석여과막 (Spectra/Por-CE, MWCO 3,500)에 주입한 후 이차증류수로 저온실(4℃)에서 6시간씩 교환하면서 4회 투석하여 황산암모늄을 제거시켰다. 투석한 용액을 원심분리 (10,000g, 30분, 4℃)한 후 상층액을 동결건조하여 -20℃에 보관하였다. 동결건조된 갈색분말을 PBS로 녹여 0.45㎛로 여과한 후 0.2N HCl로 가수분해된 세파로즈 4B(Sepharose-4B) 칼럼에 적용시켜 1.5시간 고정시켰다. 고정 후 cold-PBS로 세척하고 0.1M 갈락토즈 용액으로 용출시켜 280 nm UV분광계로 흡광도를 측정하였다. 피크가 높은 분획을 회수하여, 갈락토즈를 제거하기 위해 투석여과막(Spectra/Por-CE, MWCO 3,500)에 주입한 후 이차증류수로 저온실(4℃)에서 6시간씩 교환하면서 4회 투석하였다. 투석한 후, 원심분리(10,000g, 30분, 4℃)하여 상층액을 동결건조한 분말을 'Immunogold-ω(omega)'라 칭하였으며, 이를 다음 실험 때까지 -20℃에 보관하였다.

실험예 3 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 전기영동

전기영동은 Lammli방법에 따라 환원 및 비환원 폴리아크릴아미드겔을 전기영동기(Hoefer, USA)에 장착해 이루어졌으며, 간단히 설명하면 다음과 같다. 실험예 1 및 2에 의해 제조된 추출물 Immunogold-α와 Immunogold-ω는 16% 분리 겔과 3% 상단 겔을 상용해 수행했으며, 각 시료는 전기영동 시료완충액에 혼합(시료: 시료완충액=1:3)한 후 100℃에 5분간 열을 가하였다. 열을 가한 후 얼음물에 2-3분간 배양한 후 각 시료는 그룹당 30㎕씩 겔에 적용하였으며, 열안정 순환기 (thermostatic circulator; LKB, Bromma, Sweden)를 이용해 전기영동완충액은 4℃를 유지하도록 하면서 50㎃로 4시간 전류를 흘려 각 시료내의 단백질을 분리하였다. 단, 비환원 겔은 환원을 위해 사용하는 물질을 사용하지 않았으며, 그리고 비환원 겔에 적용하는 시료는 열을 가하지 않았으며, 환원물질을 첨가하지 않았다. 겔의 염색은 은염색법(silver staining)을 사용해 이루어졌으며, 분리된 단백질은 단백질 표준시약(Sigma, USA)에 의해 분자량이 측정되었다. 1도에 도시된 바와 같이 물 추출물인 수용성 성분 Immunogold-α는 환원상태에서 넓은 범위 (7∼150kD)에서 단백질 밴드가 관찰되었으나, 특히 분자량 32kD와 33kD 범위의 단백질이 뚜렷하게 나타났으며, Immunogold-ω에서는 이들 단백질 밴드만 나타났다, 비환원상태에서 Immunogold-ω는 약 65kD인 하나의 밴드만이 나타났다. 이로부터 상기 두 물질(32kD와 33kD 단백질들)은 이황화결합을 형성하고 있는 이형이합체 (heterodimer) 단백질로 판단되었다.

실험예 4 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 크로마토그래피

동결건조된 분말 Immunogold-α와 Immunogold-ω를 1mg/ml 농도가 되도록 PBS로 녹여 0.45μm 여과막(Milipore, USA)를 이용해 여과하였다. 여과된 Immunogold-α와 Immunogold-ω용액들을 각각 30㎕ 분취해서 Protein-Pak column (7.8mm x 300mm, 10,000∼300,000 Datons, Waters, USA)이 장착된 HPLC(Alliance 2690, Waters, USA)에 적용하였다. 동상액은 PBS(pH 6)로 하였으며, 유속은 1ml/min하여 UV검출기(Waters 2487, MA, USA)내에서 흡광도(280nm)를 측정하였다. Immunogold-α 분획을 흡광도 280에서 검사한 크로마토그램을 도 2에 도시하였으며, Immunogold-ω 분획을 흡광도 280에서 검사한 크로마토그램을 도 3에 도시하였다. 도 2 및 도3에 도시된 바와 같이 상기 실험예 3의 전기영동에서 얻은 결과와 아주 유사하였다. 즉, 본 실험예의 실험결과 Immunogold-α 분획은 단백질류, 당류, 일부 지질 및 비타민류 등 여러 물질이 포함되어 있고, Immunogold-ω분획은 단일 단백질인 이형이합체(33kD와 32kD)인 것으로 판단되어졌다.

실시예 2 : 해조류 추출물의 면역증강활성 조사

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 일차면역 반응세포인 대식세포부터 TNF-α의 분비유도능과 interleukin-1β의 분비유도능, 대식세포에 있어 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현능, 소장상피세포들로부터 면역활성인자 시토카인 interleukin-1β와 interleukin-6(IL-6)의 분비능, 소장상피세포와 대식세포의 상호작용에 미치는 면역능, 말초혈액내 T-림프구의 증가능, 말초혈액내 B-림프구의 증가능 항원 keyhol limpet hemocyanin (KLH)에 대한 항체생산능, 정상세포에 대한 세포독성, 생체에 미치는 독성검사를 위해 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 영향, 안정성 검사를 위해 미숙한 혹은 성숙한 마우스의 체중증감 효과를 조사하였다.

실험예 1 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 일차면역 반응세포인 대식세포부터 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-α; TNF-α)의 분비유도능과 interleukin-1β의 분비유도능에 대한 실험

실시예 1에 의해 제조된 Immunogold-α와 Immunogold-ω가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 대식세포(Macrophage)의 활성화에 미치는 영향을 검사하였다. 이때, 대식세포의 활성화의 지표로서 대식세포가 분비하는 주요한 사이토카인인 종양괴사인자인 TNF-α의 분비유도능과 T-림프구 및 B-림프구의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β의 분비유도능을 검사하였다.

대식세포를 추출하기 위해 사육된 동물은 6∼10주령의 Balb/c 마우스 였으며, 2개월 이상 배양된 티오글리콜레이트 배지(thioglycollate medium; Gibco, USA)을 마우스에 투여한지 4일 후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시켰다. 희생시킨 마우스의 복강에 incomplete RPMI-1640 medium(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, USA)을 주입하여 복강 내에 있던 대식세포를 추출하고 원심분리한 후, 24 well plate에 1×10⁶cell/well으로 분주하였다. 이것을 약 1시간 가량 CO₂배양기에서 배양한 후, 플레이트에 부착하지 않은 세포와 다른 부유물들을 incomplete RPMI-1640을 사용하여 2번 세척하였다. 그 후 1.5㎖/well complete RPMI-1640 medium(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청(FBS)을 추가, Gibco, USA)을 주입하고 3일간 CO₂배양기(100% 습도, 37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 대식세포의 순수도 측정은 부착된 세포들을 분리한 후, Cytospin-Ⅲ(500rpm, 5분)을 이용해 슬라이드 글라스에 부착시켜 Wright's and Giemsa 염색법으로 염색하여 측정하였으며, 순수도는 95%이상이였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete RPMI-1640 배지조건하에서 대식세포들을 Immunogold-α와 Immunogold-ω를 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 lipopolysaccharide(10㎍/㎖; Sigma, USA)를 사용하였다. 자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하여 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon, USA)을 사용해 배양상등액에 존재하는 TNF-α와 IL-1β의 량을 조사하였다. ELISA kit에 의한 검사결과를 재검증하기 위해 면역블로팅(immunoblotting)방법을 이용해 검증하였다.

(1) ELISA를 이용한 TNF-α와 IL-1β assay

준비된 5종류의 TNF-α와 IL-1β 표준용액(standard solution)을 96 웰(precoated with rat anti-마우스 TNF-α와 IL-1β)에 100㎕ 넣었고, 100㎕ 대식세포 배양상등액을 각 disigned well에 넣었다. 그 후 제1차 항체(primary antibody)인 rabbit anti-마우스 TNF-α와 IL-1β 각각 25㎕을 pre-coated 96well 에 첨가하여 mix한 뒤, 4시간동안 실온에서 배양한 후, 세척 완충액(250㎕/well)로 5번 씻어내었다. 이후에 제2차 항체(second antibody)인 50㎕ goat anti-rabbit conjugated alkaline phosphatase를 pre-coated 96well 넣어 45분간 배양하였고, 세척 완충액(250㎕/well)로 5번 씻어낸 후, color reagent 200㎕을 pre-coated 96well에 넣고 각 웰별로 차별성이 있는 붉은 색깔이 나타나면(약 35분간 배양) stop solution 50㎕를 넣어 color reagent의 반응을 고정시키고, 490nm에서 ELISA reader로 측정하여 TNFα와 IL-1β의 양을 분석하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5에 도시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 Immunogold-α와 Immunogold-ω는 대식세포 자극제로서 우수한 효과가 입증되었으며, 대식세포 활성화에 있어서 농도에 의존하는 경향을 보였다. 그리고 Immunogold-α분획의 최고 효고적인 농도는 300㎍/㎖이였고 Immunogold-ω는 30∼100㎍/㎖이였다. 이 두 발명물질은 TNF-α분비에 있어서는 양성대조군으로 사용한 세균내독소인 LPS보다는 낮았지만, IL-1β분비에 있어서는 높았다. 이 두 발명물질이 TNF-α분비 작용에 있어서 LPS보다는 약한 작용을 하는 것은 생체 면역반응에 있어서 아주 좋은 현상인데, 이는 왜냐하면 적당한 TNF-α분비는 생체방어기전에 유익하지만, 과다한 분비는 생체에 치명적인 Septic shock를 일으키게 하는 등 부작용이 크기 때문이다.

(2) 면역블로팅을 이용한 TNF-α와 IL-1β assay

본 실험에서는 도 4 및 도 5의 결과가 확실한 것인지 그리고 이후 모든 실험을 ELISA실험기법에서 얻은 결과만으로 의심없이 결론을 내닐 수 있는 지 등을 검증하기 위해 면역블로팅 기법을 이용해서 재검사하였다. 실험과정을 간단히 설명한다면 다음과 같다. 0.1% SDS 포릴아크릴아미드 전기영동 분리겔과 상단겔은 각각 16%, 3%였으며, 전기영동 시 current는 55mA(Powersupply, Pharmacia; Uppsala, Sweden), 온도는 cooling system (LKB; Bromma, Sweden)로 4℃를 유지하면서 약 4∼5시간 running하였다. 여기에 사용된 전기영동 system은 Hoefer SE 600(CA, USA)제품을 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 transfer buffer(39mM glycin 2.9g, 48mM tris-base 5.8g, 0.037% SDS, 20% methanol; pH8.3)에 미리 적셔진 nitrocellulose membrane(NC)을 올려놓은 후 fiber pad에 넣고 조립하였다. 그 후 immunoblotting transfer cassette를 nitrocellulose membrane이 positive charge 방향으로, gel이 negative charge쪽으로 오도록 하여 transfer chamber에 넣었고, current는 1A, 온도는 cooling system으로 4℃를 유지하면서 1시간 30분간 transfer시켰다. 그 후, NC는 blocking buffer(5% nonfat dry milk in TBS-T (20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20) buffer 약 200㎖에 1시간동안 rocking(Hoefer; CA, USA)하여 antibody의 비 특이적 결합(non-specific binding)을 blocking한 후, TBS-T로 다시 wash(15분간 1회, 10분간 2회)하였다. 그 후, 3㎖ TBS-T를 siliconized bottle에 분주하고 여기에 rabbit anti-murine TNF-α polyclonal primary antibody(500㎍/1.5㎖ in PBS) 30㎕(1:300 dilution)와 rabbit anti-마우스 IL-1β polyclonal primary antibody(10㎍/200㎕ in PBS) 30㎕(1:2000 dilution)를 각각 첨가한 후, NC를 siliconized bottle에 넣었고 4℃, hybridization incubator(Robbins; CA, USA; speed 10rpm)에서 12시간동안 incubation 하였다. 그 후, 70㎖ TBS-T로 20분간 각각 3번 hybridization incubator(speed : 12rpm)에서 씻어낸 후, secondary antibody(goat anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugated affinity purified antibody; stock solution-0.02mg/4㎖ in PBS)를 3㎖ TBS-T에 30㎕(1:20,000 dilution)를 첨가하여 4℃, hybridization incubator에서 3시간 동안 배양하였고, 70㎖ TBS-T로 20분간 각각 4번 씻어내었다. 그 후, NC를 얇고 투명한 비닐에 넣고 ECL (peroxidase substrate) reagents 1과 2를 50%씩 혼합한 3㎖을 NC에 분주한 후, 5분간 배양하였다. 그 후, 암실(10W safety lamp; Kodak; USA)에서 NC가 들어있는 cassette에 X-ray film을 넣고 5분 또는 10분 이상 감광 시킨 후 X-ray film을 현상용 box의 deveolp solution에 약 3분간 넣고 반응시켰다. 그 후, 이 X-ray film을 다시 물에서 2분간 washing 후, fixing solution에서 3분간 반응시키고 다시 2분간 물로 washing 하고 난 뒤 band를 분석하였다. 도면 6도 7도에서 보는 바와 같이 ELISA기법에서 얻은 결과 즉 두 발명물질이 대식세포을 활성화시켜 사이토카인 TNF-α와 IL-1β를 분비하게 한다는 것을 재확인했다. 이러한 실험결과로서 본 실험에서 검사한 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6 측정은 ELISA기법만으로 수행하기로 하였다.

실험예 2 : RT-PCR를 이용한 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 대식세포에 있어 TNF-α와 IL-1β의 유전자 발현능에 대한 실험

Immunogold-α와 Immunogold-ω가 면역계의 일차적인 면역반응에 주요한 대식세포의 활성화의 지표인 TNF-α의 유전자발현유도능과, T-림프구 및 B-림프구의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β의 유전자발현유도능을 검사하였다.

(1) Total RNA분리

실험과정을 간단히 기술하면 다음과 같다. 위에 열거한 마우스 대식세포 분리과정에서 얻은 대식세포를 6 웰 플레이트(3x10⁶/well; Falcon, USA)에 도말하여 complete RPMI-1640(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아 혈청을 추가, Gibco, USA)를 사용해 3일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete RPMI-1640(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, USA) 배지조건하에서 대식세포들을 Immunogold-α와 Immunogold-ω로 자극시켰다. 자극이 끝난 후, cold PBS로 2회 씻고 PBS를 제거한 후 각 웰에 1ml의 Trisol을 투여하고 5분간 항온에서 배양하였다. 배양이 끝난 후, Trisol로 녹인 세포용액을 3회 피펫팅을 한 후 E-tube에 넣은 다음 0.2ml 클로로포름을 첨가하였다. 10초 정도 잘 vortex하고 잘 mixing한 후 원심분리 하였다(12,000 rpm/60min, 4℃). Total RNA층인 상층액만을 떠내 E-tube에 옮긴 후, cold 100% isoprophanol을 넣은 후 적어도 하루 침전을 시킨 다음 다시 같은 조건에서 20분 정도 원심분리를 한 다음 supernatant을 버렸다. 순수한 total RNA를 분리하기 위해 상기 과정을 반복하였다. 그리고 나서 75% E-OH을 넣고 손으로 잘 mixing해서 원심분리를 한 다음 원심분리가 끝나면 supernatant을 버리고 0.1% DEPC-H₂O을 넣고 65℃에서 10분간 가열한 후에 -20℃에서 사용할 때까지 저장하였다.

(2) RT-PCR

이하 모든 primer는 주식회사 바이오니아(청원, 충북)에 의뢰 주문해 합성했다. TNF-α의 forward primer는 5'-GGCAGGTCTTTGGAGTCATTGC-3'이고, reverse primer는 5'-CATTCGAGGCTCCAGTGAATTCCAG-3'이였다. IL-1β forward primer는 5'-ATGGCCAACTGTTCCTGAACTCAAC-3'이고 IL-1β reverse primer는 5'-CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3'였다. β-actin forweard primer는 5`-CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG-3`이고 β-actin reverse primer는 5`-CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG -3`였다. cDNA를 합성하기 위해 5x reverse transcriptase buffer, 2.5mM dNTP, 500ng primer/㎕, 200U/㎕ MMLV resverse trancriptiase, total RNA, 0.1% DEPC treated DDW를 사용해 reaction mixture를 준비하였다. 이 때 사용한 primer는 reverse primer였다. 그리고 나서 42℃에서 30분간 배양, 75℃에서 30분간 배양을 하여 cDNA를 얻었다. Reverse transcription반응과정에서 생성된 cDNA가 있는 RT mixture, 10x Taq polymerase buffer, 2.5mM dNTP, forward primer(25pmol/㎕), reverse primer(25pmol/㎕), Taq polymerse(2.5units/㎕), DDW을 잘 섞은 후 반응조건 95℃에서 30초 53∼68℃(primer에 따라 다름)에서 1분 72℃에서 30초를 30 cycle로 하여 cDNA를 증폭하였다. 검사 결과를 도 8에 나타내었다. 본 발명 해조류 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω이 TNF-α와 IL-1β의 유전자발현 효과가 많음을 보여주며, ELISA와 immunoblotting에서 얻은 결과와 같이 Immunogold-ω가 Immunogold-α보다 강한 약리활성을 보였었다. 또한, 실험예 1의 ELISA와 면역블로팅 결과 및 결론들을 재 입증해 주었다.

실험예 3 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 소화기면역계통에 주요한 소장상피세포들로부터 면역활성인자 시토카인 interleukin-1β(IL-1β)와 interleukin-6(IL-6)의 분비능에 대한 실험

약물이란 주사제로서의 효과도 중요하지만 경구투여제로서의 약리효과도 매우 중요한다. 본 발명 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω가 경구면역촉진제 즉 소화기면역활성제로서 면역약리효능을 알아보기 위한 목적으로 이 실험을 수행했으며, 이를 위해 Immunogold-α와 Immunogold-ω가 소화기면역계에 주요한 장상피세포의 활성화에 미치는 명향을 검사하였다. 본 실험에 사용된 장상피세포는 쥐 소장상피세포인 IEC-6(intestinal epithelial cell-6, ATCC CRL-1592)였으며, 이 IEC-6의 활성화의 지표로서 T-림프구, B-림프구, NK 세포의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-1β와, T-림프구, B-림프구, 대식세포의 증식, 분화, 활성화에 관여하는 IL-6의 분비유도능을 검사하였다.

24 웰 플레이트에 분주하여 세포가 웰 바닥에 완전히 깔리도록(confluent condition) 3일정도 complete DMEM(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아혈청을 추가, Gibco, USA)으로 배양하였다. 배양이 끝난 후, 배양배지를 제거하고 새로운 incomplete DMEM(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신을 추가, Gibco, USA) 배지조건하에서 대식세포들을 Immunogold-α와 Immunogold-ω를 농도별 및 시간별로 자극시켰다. 이때 양성대조군으로는 기존에 잘 알려진 LPS(10㎍/㎖; Sigma, USA)를 사용하였다. 자극을 위한 배양이 끝난 즉시 각 배양액을 채취한 후 원심분리 (1000g, 4℃, 5분)하여 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon, USA)을 사용해 배양상등액에 존재하는 IL-1β와 IL-6의 량을 조사하였다. ELISA kit에 의한 검사결과의 신뢰도가 대식세포의 실험에서 높게 입증되었기에 이 실험결과에 대한 재검증은 생략하였다.

ELISA를 이용한 IL-1β와 IL-6 assay

준비된 5종류의 IL-1β와 IL-6의 standard solution을 96 well(precoated with rat anti-마우스 IL-1β와 IL-6)에 100㎕ 넣었고, 100㎕ IEC-6의 배양상등액을 각 disigned well에 넣었다. 그 후 primary antibody인 rabbit anti-마우스 IL-1β와 IL-6를 각각 25㎕을 pre-coated 96well 에 첨가하여 mix한 뒤, 4시간동안 room temp 에서 배양한 후, wash buffer (250㎕/well)로 5번 씻어내었다. 이후에 second antibody인 50㎕ goat anti-rabbit conjugated alkaline phosphatase를 pre-coated 96well 넣어 45분간 배양하였고, wash buffer (250㎕/well)로 5번 씻어낸 후, color reagent 200㎕을 pre-coated 96well에 넣고 각 well별로 차별성이 있는 붉은 색깔이 나타나면(약 35분간 배양) stop solution 50㎕를 넣어 color reagent의 반응을 고정시키고, 490nm에서 ELISA reader로 측정하여 IL-1β와 IL-6의 양을 분석하고 그 결과를 도 9 및 도 10에 도시하였다. 본 발명 추출물은 장기면역에서 주요한 세포인 소장상피세포(IEC-6)를 활성화 시켰으며, 활성화의 표지인 IL-1β와 IL-6를 많이 분비시키는 효과가 있었다. 이 두 사이토카인은 1차면역세포인 T림프구, B 림프구, 각종 항원제공세포들을 활성화시키는 물질이기에, 본 발명물질이 소장사피세포로 하여금 이들 사이토카인들을 많이 분비하게 함으로서 장기면역을 증가시키는 것으로 판단되었다.

실험예 4 : Immunogold-α와 Immunogold-ω가 소화기면역계통에 주요한 소장상피세포와 대식세포의 상호작용에 미치는 면역능에 대한 실험

소장사피세포 부위에는 생체방어를 위한 체액성과 세포성 면역활성을 위해 많은 항원제공세포들이 있는데 이 중에서 대식세포가 중요한 항원제공세포이다. 그래서 소장상피세포가 실험예 3에서 본 것처럼 본 발명 추출물에 의해 활성화된다면 연이여 대식세포활성화에 기여하는지도 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. 실시예 4에서 얻은 IEC-6 배양상등액을 대식세포에 자극시킨 후 각 배양액을 채취하여 원심분리(1000g, 4℃, 5분)하고 배양상등액을 수거하여 ELISA kit(Chemicon, USA)을 사용해 배양상등액에 존재하는 TNF-α와 IL-1β의 량을 조사하였다. 도 11및 도 12에 도시된 바와 같이 본 발명 추출물에 의해 자극된 IEC-6 세포의 배양액이 대식세포로부터 TNF-α와 IL-1β를 분비하게 했다.

실시예 3과 본 실험예 4의 결과들을 종합해보면 본 발명 추출물은 경구투여제로서도 휼륭한 역할을 할 수 있음을 예시해 주었다.

실험예 5 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 말초혈액내 T-림프구의 증가에 대한 효과

평상시에 조직이 아닌 혈관에 존재하는 T 림프구의 활성화에 본 발명 추출물이 어떠한 효과를 가지고 있는 지 알아보기 위함과 그리고 생체외가 아닌 생체내에서 어떻게 기여하는 지 알아보기 위해 본 실험을 실시하였다. Ovalbumin을 항원으로 하여 6 주령-마우스(Blab/c; 대한실험동물센타, 음성)에 마우스당 ovalbumin 30㎍을 단독으로 또는 ovalbumin 30㎍과 Immunogold-α 50㎍ 또는 Immunogold-ω 1㎍을 피하주사하였다. 주사 7일 후에 마우스를 경추탈골하여 희생하여 무균상태에서 비장을 수거하였다. 얼음을 이용하여 PBS를 4℃로 유지하면서 균질기 (homogenizer; Daunce, USA)을 이용해 비장으로부터 세포를 분리하였다. 분리한 후 anti-CD4 antibody-FITC(Serotec, UK)와 anti-CD8 antibody-PE(Serotec, UK)를 세포에 loading하고 1시간 배양한 후 2회 원심분리하여 PBS로 씻은 후, FACScan(Becton and Dickinson, NJ. USA)을 이용하여 T-림프구 수를 검사하였다. 도 13-1(대조군), 13-2(Immunogold-α 투여군), 13-3(Immunogold-ω)에서 보여 주는 바와 같이 두 발명물질이 외부 항원 즉 ovalbumin이 투여되었을 때 보조 T 림프구(helper T cell)와 살해 T 림프구(cytotoxic/suppressive T cell)를 증가시켰다. 상기 결과는 본 발명 추출물이 병원체 감염 시 보조 T 림프구와 살해 림프구를 활성화 시키고 증식시켜 세포성 및 체액성 면역을 활성화함을 예시해 주고 있다.

실험예 6 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 말초혈액내 B-림프구의 증가에 대한 효과

특히 보조 T 림프구의 활성화는 B 림프구의 활성화를 불러오기에 실험예 5에서 보여 준 결과가 연쇄 면역반응을 일으키는 지 알아보기 위해 본 발명 추출물을 투여한 후 B 림프구의 증감을 조사하였다. 특히 B 림프구는 비장에 많이 모여 있기에 비장을 이용해 검사하였다. Ovalbumin을 항원으로 하여 6 주령-마우스 (Blab/c; 대한실험동물센타, 음성)에 마우스당 ovalbumin 30㎍을 단독으로 또는 ovalbumin 30㎍과 Immunogold-α 50㎍ 또는 Immunogold-ω 1㎍을 피하주사하였다. 주사 7일 후에 마우스를 경추탈골하여 희생하여 무균상태에서 비장을 수거하였다. 얼음을 이용하여 PBS를 4℃로 유지하면서 homogenizer(Daunce, USA)을 이용해 비장으로부터 세포를 분리하였다. 분리한 후 anti-마우스마우스 antibody-PE(Serotec, UK)를 세포에 loading하고 1시간 배양한 후 2회 원심분리하여 PBS로 씻은 후, FACScan(Becton and Dickinson, NJ. USA)을 이용하여 B-림프구 수를 검사하였다. 그 결과를 도 14-1(대조군), 도 14-2(Immunogold-α), 도 14-3(Immunogold-ω)에 도시하였다. 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 Immunogold-α와 Immunogold-ω이 대조군(ovalbumin 단독투여)보다 B 림프구를 유의한 차이로 증가시켰다. 또한 Immunogold-ω이 Immunogold-α보다 좋은 효과를 보여주었다.

실험예 7 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 항원 keyhol limpet hemocyanin (KLH)에 대한 항체생산능에 대한 실험

항체 생산에 있어 다당류인 항원 외에는 helper T cell 의존성이다. 그러면 본 발명 단백질(Immunogold-ω) 혹은 단백질 혼합물질(Immunogold-α)이 T cell 의존성 항체생산에 관여할 것으로 판단되어, 실험예 5, 6에서 보여준 바와 같이 Immunogold-α와 Immunogold-ω가 T, B 림프구들을 활성화, 증가시키고, 또한 실험예 1, 2 등에서 본 바와 같이 주요한 항원제공세포인 대식세포도 활성화시키는데 항체생산에 많이 기여하리라 예견하고 본 연구를 다음과 같이 실시하였다.

본 발명 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 항원에 대한 특이적 면역능의 증진효과를 조사하였다. 이 실험은 항원특이적인 면역반응에 관한 것으로서, 특히 항체 생산과 관련이 있는 B세포에 의한 체액성 면역반응(humoral immune response)에 미치는 영향을 조사한 것이다. 즉 KLH(Keyhol Limpet Hemocyanin)을 항원으로 하여 Blab/c마우스(6 주령)에 마우스당 KLH 20㎍을 단독으로 하는 대조군과 KLH 20㎍과 Immunogold-α 50㎍ 또는 Immunogold-ω 1㎍을 혼합해 피하주사로 투여한 실험군으로 나누었다. 후에 각 주별로 마우스의 혈청을 채취하여 혈청중의 KLH에 대한 항체의 역가(titer)를 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)법으로 측정하였다. 항원 KLH, 혈청, 효소(HRP, Horse raddish peroxidase)가 부착된 2차 항체 rabbit-안티-마우스 IgG-HRP, 이 효소에 대한 기질인 ABTS (2,2-azinobis(3-ethylben- zthiazolinesulfonic acid))를 이용한 ELISA에서 항체의 역가를 구하였다. 항체의 역가는 대조군보다 2배 이상의 발색광을 나타내는 최대 희석비로 결정하였다. 항체역가는 도 15에 도시된 바와 같이 부스터 주사는 2주 후에 1차와 같이 시행하였으며 부스터 3∼5주후에는 KLH 단독투여한 대조군에 비해서 약 100∼200배 가량의 높은 항체역가를 보였다. 그리고 항체역가 상승에 대한 지속성을 최초 주사후 최소한 10주 까지는 대조군에 비하여 유의하게 증진된 결과를 보였다. 그리고 B세포에 관련된 체액성 면역의 상승효과에는 Immunogold-ω가 Immunogold-α보다 항상 높았다.

실험예 8 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 정상세포에 대한 세포독성유무검사를 위한 실험

본 발명 추출물이 세포성 및 체액성 면역에 지대한 효과가 있다해도 생체내에 독성이 있으면 아니 되기에 다음과 같이 세포 독성에 대한 안정성 검사를 실시하였다. 본 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω가 정상세포에 대한 세포독성 유무를 알기 위해 마우스의 비장세포를 가지고 연구를 수행하였다.

세포독성검사 방법은 다음과 같다. 7 주령의 Balb/c 마우스(대한실험동물센타, 음성)를 경추탈골해서 희생시킨 후, 비장을 무균상태에서 회수하여 cold incomplete RPMI-160 medium((100U/ml 페니실린-스트렙토마이신 추가, Gibco, USA)로 2회 씻은 후, cold incomplete RPMI-160 medium을 첨가하여 Daunce 균질기(Wheaton, USA)로 하나의 세포를 만든 후 얼음물에 10분간 배양하였다. 배양이 끝난 후, 상층만 수집하여 원심분리(1000g, 5분, 4℃)한 후 상등액을 버리고 세포를 얻었다. 비장세포를 96-well 플레이트(1.5x10⁵splenocytes/well; Falcon, USA)에 분주하여 complete RPMI-1640 배지액(100U/ml 페니실린-스트렙토마이신과 10% fetal bovine serum을 추가, Gibco, USA)으로 배양하였다. 배양 1시간 후, B 및 T 세포의 자극물질(mitogen)로 알려진 ConA(Concanavallin A)를 10㎍/㎖가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 그리고 각 웰에 시료로서 Immunogold-α와 Immunogold-ω을 농도별로 첨가하고 3일간 배양하였다. 비교구에는 Immunogold-α또는 Immunogold-ω를 첨가하지 않고 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 MTT(1㎎/㎖) 50㎕씩을 첨가하여 4시간 동안 CO₂incubator(37℃)에서 다시 배양한다. 이러한 반응은 살아있는 세포가 MTT와 반응하여 formazan crystals을 생성하게 한다. 4시간 배양 후, medium을 완전히 버리고 남아있는 solution을 kimwipe에 흡착시켜 제거했다. 그 후 DMSO 100㎕를 각 well에 첨가하였고 mixer로 몇 분 동안 잘 섞어주었다. 이렇게 하여 생성된 보라색 색소는 540nm wavelength의 ELISA reader (Pharmasia)를 흡광도(OD₅₄₀)를 측정하였다. 세포독성(cytotoxicity) 계산은 다음 공식과 같다. 100%에서 독성퍼센트를 삭감한 것을 도면 16에서 보여 준 것과 같이 생존율로 계산하였다.

검사결과는 도 16에 도시된 바와 같이 본 발명 추출물이 높은 농도(100㎍/㎖) 에서도 정상세포에 세포독성효과가 없는 것으로 나타났다.

실험예 9 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 생체에 미치는 독성검사을 위해 독성에 민감한 장기인 간과 신장에 미치는 영향을 알기 위한 실험

실험예 8에서 보여 준 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 세포독성결과만으로 안정성에 안심할 수 없어 다음과 같이 생체 신진대사와 독성에 민감한 주요한 장기인 간 및 신장에 대한 검사를 실시하였다.

신장기능은 CRE(blood creatinin)와 BUN(blood urea nitrogen)의 혈중농도를 측정하여 조사하고, 간기능은 간세포가 함유하는 GOT(glutamic-oxalacetate transaminase)와 GPT(glutamic pyruvic transaminase)의 두 효소를 측정하였다. 7주령의 마우스(Balb/c; 대한동물실험센타, 음성)에 실험군에는 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 분획 10㎍과 100㎍을 0.01M PBS 1㎖에 용해시켜 정맥에 2㎖ 투여하고, 정상군에는 PBS 2㎖만을 투여하여 동일한 실험을 수행하였다. 정맥주사 1, 2, 5, 10일 후에 마우스의 눈으로부터 채혈해서 얻은 혈청으로 각종 검사를 하였다. CRE와 BUN측정은 CRE autotest kit(주식회사 MBL, 서울)와 BUN autotest kit(주식회사 MBL, 서울)을 이용해 화학반응한 후 비색법측정기(Abbott, USA)로 측정하였다. 그리고 GOT와 GPT측정은 GOT autotest kit(주식회사 MBL, 서울)와 GPT autotest kit(주식회사 MBL, 서울)를 이용해 화학반응한 후 UVrate측정기(Beckman, USA)로 측정하였다. 검사결과는 도 17, 도 18에 도시된 바와 같이 본 발명의 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 분획은 GOT, GPT 그리고 CRE 및 BUN 각 효소의 혈중농도가 정상군에 비하여 유의한 차이를 보이지 않았으므로, 본 발명 추출물은 두 장기 세포에 유해한 독성영향을 미치지 않는 것으로 판단되었다.

실험예 10 : Immunogold-α와 Immunogold-ω의 안정성 검사를 위해 미숙한 혹은 성숙한 마우스의 체중증감조사

본 발명 추출물인 Immunogold-α와 Immunogold-ω의 안정성 검사일환으로 신체발육에 미치는 영향을 알기 위해 미숙한 혹은 성숙한 마우스의 체중증감조사를 실시하였다.

Immunogold-α와 Immunogold-ω를 각각 30㎍/㎖, 300㎍/㎖ 농도가 되도록 0.01M PBS에 녹여 생후 1일째의 미성숙 마우스는 피하주사하고, 생후 7주령된 성숙 마우스는 복강내 주사하였다. 본 실험에서 대조군은 0.01M PBS를 피하주사 혹은 복강내 주사하였다. 도 19(미성숙 마우스군)과 도 20(성숙 마우스군)에서 보는 바와 같이 대조군보다 유의한 증가는 아니었으나 체중이 증가하는 경향을 보였으므로, 본 발명 Immunogold-α와 Immunogold-ω는 신체발육에 유해한 독성영향을 미치지 않고 조금이나마 이로운 영향을 미치는 경향이 있는 것으로 판단되었다.

이상 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명 해조류 추출물은 면역세포를 활성화시키는 면역증강 활성이 있고, 또한 정상세포에 대해 세포독성이 없는 매우 뛰어난 효과가 있어 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

해조류에 4℃의 저온상태에서 물을 가하여 교반하고, 원심분리한 후, 상등액을 분리하여 동결건조시켜 수득함을 특징으로 하는 면역증강용 해조류 추출물의 제조방법.
해조류를 4℃의 저온상태에서 분쇄한 후, 인산염 완충식염수를 첨가하여 교반하고 원심분리하여 침전물을 분리시켜 수득한 상등액에 황산암모늄을 가하여 단백질 성분을 침전시키고, 상기 분리된 침전물중의 황산암모늄을 투석시켜 제거하고, 가수분해된 세파로즈(Sepharose) 4B 칼럼에 적용시켜 갈락토즈 용액으로 용출시켜 U.V. 분광광도계에 의해 280nm에서 흡광도를 나타내고, 비환원 상태에서 분자량이 65kDa인 렉틴 분획을 분리함을 특징으로 하는 면역증강용 해조류 추출물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 해조류는 갈조류인 감태(Ecklonia cava), 모자반(Sargassum fulvellum), 톳(Hizikia fusiforme), 미역(Undaria pinatifida) 등으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 해조류 추출물의 제조방법.
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 면역증강용 해조류 추출물
제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물.