ES2297841T3 - Nuevas composiciones de saponina y usos de las mismas. - Google Patents
Nuevas composiciones de saponina y usos de las mismas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2297841T3 ES2297841T3 ES96943568T ES96943568T ES2297841T3 ES 2297841 T3 ES2297841 T3 ES 2297841T3 ES 96943568 T ES96943568 T ES 96943568T ES 96943568 T ES96943568 T ES 96943568T ES 2297841 T3 ES2297841 T3 ES 2297841T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- saponin
- saponins
- antigen
- substantially pure
- adjuvant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION CONCIERNE AL CAMPO DE LA QUIMICA MEDICA Y SE REFIERE, EN PARTICULAR, A UNAS VACUNAS QUE COMPRENDEN NUEVAS COMPOSICIONES DE ADITIVOS A BASE DE SAPONINA, A UNAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y A UNAS VACUNAS QUE COMPRENDEN NUEVAS COMBINACIONES, A UNOS PROCEDIMIENTOS DE USO DE DICHAS NUEVAS COMBINACIONES PARA REFORZAR LA RESPUESTA INMUNITARIA DE UN INDIVIDUO A UN ANTIGENO Y AL USO DE ESTAS NUEVAS COMPOSICIONES PARA AUMENTAR LA INMUNOGENICIDAD DE LAS VACUNAS.
Description
Nuevas composiciones de saponina y usos de las
mismas.
La presente invención se sitúa dentro del campo
de la química farmacéutica. En particular, la invención se refiere a
vacunas que comprenden nuevas combinaciones de adyuvantes de
saponina, a composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden
estas nuevas combinaciones, a métodos para emplear estas nuevas
combinaciones con el fin de intensificar la respuesta inmunitaria de
un individuo a un antígeno, y al uso de las nuevas combinaciones
para incrementar la inmunogenia de vacunas.
Las saponinas de Quillaja son una mezcla
de glicósidos triterpénicos extraída de la corteza del árbol
Quillaja saponaria. Han sido reconocidos desde tiempo atrás
como estimuladores inmunitarios que se pueden emplear como
adyuvantes de vacunas (Campbell, J.B., y Peerbaye, Y.A., Res.
Immunol. 143(5):526-530 (1992)), y se han
utilizado como adyuvantes diversos extractos complejos de saponinas
disponibles comercialmente. Las saponinas brutas se han utilizado
ampliamente como adyuvantes en vacunas contra la glosopeda, y en la
amplificación de la inmunidad protectora conferida por vacunas
experimentales contra parásitos protozoarios tales como el plasmodio
Trypanosoma cruzi y también de la respuesta humoral contra
eritrocitos de oveja (siglas inglesas SRBC) (Bomford, Int. Arch.
Allerg. Appl. Immun. 67:127 (1982)).
Los primeros adyuvantes de saponinas de
Quillaja disponibles comercialmente fueron extractos brutos
que, por su variabilidad, no eran deseables para el uso en la
práctica veterinaria ni en composiciones farmacéuticas para seres
humanos. Uno de los primeros intentos para purificar adyuvantes de
saponinas de Quillaja lo realizó Dalsgaard, Archiv fuer
die gesamte Virusforschung 44:243 (1974). Dalsgaard purificó
parcialmente un extracto acuoso del material adyuvante de saponina
procedente de Quillaja saponaria Molina. No obstante, aunque
la preparación de Dalsgaard, "Quil-A",
constituyó una clara mejora sobre las saponinas disponibles
comercialmente antes de la misma, aún presentaba una considerable
heterogeneidad.
Un análisis posterior mediante cromatografía
líquida a alta presión evidenció que Quil-A era en
realidad una mezcla heterogénea de compuestos estructuralmente
relacionados (patente de EE.UU. número 5,057,540; Kersten, G.F.A., y
otros, Infect. Immun. 56:432-438 (1988);
Kensil, C.R., y otros, J. Immunol.
146:431-437 (1991); Kensil, C.R., y otros, J.
Am. Vet. Med. Assoc. 199:1423-1427 (1991)). Sin
embargo, no todas estas saponinas eran activas como adyuvantes.
Las cuatro saponinas purificadas de
Quillaja más predominantes son QS-7,
QS-17, QS-18 y QS-21
(identificadas de manera alternativa como QA-7,
QA-17, QA-18 y
QA-21). Se han purificado estas saponinas mediante
HPLC y cromatografía a baja presión en sílice, y se ha encontrado
que son activas como adyuvantes, aunque difieren en actividades
biológicas tales como hemólisis y toxicidad en ratones. En
particular, se ha encontrado que QS-21 y
QS-7 son las menos tóxicas en ratones (Kensil, C.R.,
y otros, J. Immunol. 146:431-437 (1991)).
Debido a su potente actividad adyuvante y baja
toxicidad, la QS-21 (disponible comercialmente bajo
la denominación de adyuvante "Stimulon®") ha sido identificada
como un adyuvante inmunológico útil (Kensil, C.R., y otros,
"Structural and Immunological Characterization of the Vaccine
Adjuvant QS-21", en Vaccine Design: The
Subunit and Adjuvant Approach, compilado por Powell, M.F. y
Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York (1995)). La
QS-21 es un glicósido triterpénico complejo del
ácido quillaico. La QS-21 está glicosilada en el
carbono triterpénico 3, en el carbono triterpénico 28, y en el
carbono 5 de la segunda unidad acílica grasa en un dominio de ácido
graso.
Más recientemente, se ha purificado
adicionalmente QS-21 por medio de cromatografía de
interacción hidrófila (HILIC), y se ha resuelto en dos picos:
QS-21-V1 y
QS-21-V2, de los cuales se ha
demostrado que son compuestos químicamente distintos. En ratones
C57bl/6 inmunizados con vacunas compuestas por ovoalbúmina y
respectivamente QS-21,
QS-21-V1 o
QS-21-V2, los dos componentes
individuales QS-21-V1 y
QS-21-V2 son comparables en efecto
adyuvante al pico QS-21 original (que contiene una
mezcla 3:2 de QS-21-V1 y
QS-21-V2) en la estimulación de las
subclases de IgG IGg1, IgG2b e IgG2, así como del título total de
IgG (Solicitud de Patente de EE.UU. número 07/906,880, en
tramitación junto con la presente y admitida con tasas de concesión
pagadas, para ser concedida como Patente de EE.UU. número
5,583,112, cuyo contenido completo se incorpora aquí por
referencia).
Las saponinas de Quillaja son
estructuralmente distintas de las saponinas derivadas de otras
especies vegetales. Dos características estructurales que distinguen
a las saponinas de Quillaja saponaria de las de otras
especies vegetales son un dominio de ácido graso y un aldehído
triterpénico en el carbono 4 del triterpeno (Kensil, C.R., y otros,
"Structural and Immunological Characterization of the Vaccine
Adjuvant QS-21", en Vaccine Design: The
Subunit and Adjuvant Approach, compilado por Powell, M.F. y
Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York (1995)). Las modificaciones
del aldehído del triterpeno indican que este grupo funcional puede
estar implicado en el mecanismo de la adyuvancia (Soltysik, S., y
otros, Vaccine 13(15):1403-1410
(1995)).
Se ha hallado que las saponinas de
Quillaja, en particular QS-7,
QS-17, QS-18 y
QS-21, son excelentes estimulantes de la respuesta
de anticuerpos a antígenos de proteína T-dependiente
soluble, "antígenos de subunidad", que son escasamente
inmunogénicos y requieren un potente adyuvante para maximizar la
respuesta inmunitaria. Los ejemplos de antígenos de subunidad
purificados para los cuales los adyuvantes de saponina aumentan la
respuesta de IgG en ratones incluyen la hemocianina de lapa
californiana (KLH), HIV-1 gp120 (Bomford, R., y
otros, AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:1765 (1992)), y la
nucleoproteína de la gripe (Brett, S., y otros, Immunology
80:306 (1993)). También se ha demostrado que
QS-7, QS-17, QS-18 y
QS-21 estimulan, en ratones, potentes respuestas de
anticuerpos contra los antígenos seroalbúmina de bovino y citocromo
b_{5} (Kensil, C.R., y otros, J. Immunol. 146:431
(1991)). El nivel de respuesta de anticuerpos inducida por estas
saponinas purificadas era comparable al de otros adyuvantes
comúnmente empleados, por ejemplo el adyuvante de Freund completo,
y superior al hidróxido de aluminio.
También se ha demostrado que
QS-21 intensifica las respuestas de anticuerpos
contra antígenos T-independientes, entre ellos
polisacáridos bacterianos no conjugados (White, A.C., y otros, "A
purified saponin acts as an adjuvant for a
T-independent antigen", en Immunology of
Proteins and Peptides, volumen VI (compilado por M.Z. Atassi)
Plenum Press, Nueva York, páginas 207-210 (1991)).
La inmunogenia de la vacuna se incrementó adicionalmente conjugando
toxoide diftérico al polisacárido. La QS-21
incrementó la respuesta de anticuerpos contra el polisacárido y
contra el vehículo, inclusive las respuestas de IgG2a, IgG2b e IgG3
(Coughlin, R.T., y otros, Vaccine
13(1):17-21 (1995)).
La capacidad de los adyuvantes para modular la
distribución por isotipos y la distribución por subclases de IgG de
la respuesta de anticuerpos a un antígeno a través de la promoción
del cambio entre subclases de Ig presenta importantes implicaciones
para la inmunidad conferida por numerosas vacunas bacterianas y
víricas. La QS-7, QS-17,
QS-18 y QS-21 estimulan la respuesta
de IgG2a contra el citocromo b_{5} tras la administración
junto con dosis de saponina de 20 \mug (Kensil, C.R., y otros,
J. Immunol. 146:431 (1991)). Con relación a este dato, la
QS-21 desplaza las respuestas de IgG1 predominantes
hacia un perfil que incluye respuestas de IgG2b e IgG2a
significativas. Por ejemplo, se ha demostrado que la
QS-21 estimula IgG2A específica de antígeno contra
diversos antígenos, entre ellos proteínas OspA y OspB de la
superficie externa de Borrelia burgdorferi (Ma, J., y otros,
Vaccine 12(10):925 (1994)), virus de la leucemia
felina (FeLV), gp70 de envoltura (Kensil, C.R., y otros, J. Am.
Vet. Med. Assoc. 10:1243 (1991)), proteína gB de envoltura de
citomegalovirus humano (HCMV) (Britt, W., y otros, J. Infect.
Dis. 171:18 (1995)), proteína de fusión purificada de virus
sincitial respiratorio (RSV) (Hancock, G.E., y otros, Vaccine
13(4):391 (1995)), y toxoide del tétanos (Coughlin, R.T.,
y otros, Vaccine 13(1):17 (1995)). También se ha
demostrado que la QS-21 induce respuestas de
anticuerpos intensificables (Britt, W., y otros, J. Infect. Dis.
171:18-25 (1995); Helling y otros, Cancer
Res. 55:2783-2788 (1995)).
La capacidad del adyuvante QS-21
para inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos (siglas inglesas
CTL) restringidos por antígenos del complejo principal de
histocompatibilidad (siglas inglesas MHC) de clase I, tras la
inmunización con proteínas solubles, constituye una característica
de los adyuvantes de saponina. Varios estudios han demostrado la
capacidad de QS-21 para inducir potentes respuestas
de linfocitos T citotóxicos (CTL) frente a diversos antígenos, entre
ellos la ovoalbúmina (Wu, J.-Y., y otros, Cell. Immunol.
154:394-406 (1994); Newman, M.J., y otros,
J. Immunol. 148(8):2357-2362 (1992)),
proteína gp160 de HIV-1 recombinante (Wu, J.-Y., y
otros, J. Immunol. 148:1519 (1992)), y gag y
env de subunidad SIV_{mac251} (Newman, M.J., y otros,
AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(7):853 (1994)).
La mayoría de los estudios con adyuvantes de
saponina se han realizado con ratones. Si embargo, la actividad
adyuvante de las saponinas no se limita a los ratones; se ha
demostrado también en cobayas, conejos, cerdos, ovejas y primates no
humanos. Se ha observado efecto adyuvante de QS-21
en gatos, cobayas, perros, primates no humanos y seres humanos
(Kensil, C.R., y otros, "Structural and Immunological
Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21",
en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach,
compilado por Powell, M.F. y Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York
(1995)).
Los ensayos de fase I con QS-21
en personas, realizados con vacuna de conjugado de gangliósido GM2 y
hemocianina de lapa californiana, se han llevado a cabo en pacientes
con melanoma maligno (Livingston, P.O., y otros, Vaccine
12:1275-1280 (1994). Se observó, tras la
administración con QS-21, una inmunogenia
incrementada (Helling, F., y otros, Cancer Res.
55:2783-2788 (1995)). En otro conjunto de
ensayos clínicos se halló que la QS-21 es un potente
adyuvante inmunológico que incrementa significativamente la
respuesta serológica de pacientes con melanoma al anticuerpo
antiidiotípico murino MELIMMUNE-1 (Livingston, P.O.,
y otros, Vaccine Res. 4(2):87 (1995)).
Varios estudios discuten el empleo de saponinas
de Quillaja, en particular QS-21, en
combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, se ha demostrado que
QS-21 es un eficaz coadyuvante con antígenos
absorbidos sobre hidróxido de aluminio (alúmina) (Ma, J.-Y., y
otros, Vaccine 12(10):925-933 (1994);
Newman, J., y otros, J. Immunol.
148(8):2357-2362 (1992); Kensil, C.R., y
otros, "Structural and Immunological Characterization of the
Vaccine Adjuvant QS-21", en Vaccine Design:
The Subunit and Adjuvant Approach, compilado por Powell, M.F. y
Newman, M.J., Plenum Press, Nueva York (1995); Kensil, C.R., y
otros, J. Am. Vet. Med. Assoc. 199:1423-1427
(1991); Wu, J.-Y., y otros, J. Immunol.
148:1519-1525 (1992); Kensil y otros, Vaccine
Res. 2:273-281 (1993)). Además, en la patente de
EE.UU. número 5,057,540 y en la Solicitud de Patente de EE.UU.
número 07/906,880, en tramitación junto con la presente (admitida
con tasas de concesión pagadas, para ser concedida como Patente de
EE.UU. número 5,583,112), se discute el empleo de mezclas de dos o
más adyuvantes de saponina.
El efecto adyuvante inmunitario de las saponinas
depende de la dosis. Para conseguir una respuesta óptima se requiere
un nivel de dosis mínimo de QS-21, dependiendo del
antígeno y de la especie (Kensil, C.R., y otros, J. Immunol.
(1991); Kensil, C.R., y otros, Vaccine Res. (1993); Newman y
otros, J. Immunol. (1992); Livingston y otros, Vaccine
(1994). Por debajo de esta dosis mínima, el efecto adyuvante es
subóptimo (de bajo nivel o ausente). La QS-7 tiene
también una curva de respuesta a la dosis (Kensil, C.R., y otros,
J. Immunol. (1991)).
Sin embargo, hasta la fecha era desconocida en
la técnica la identificación de combinaciones de dos o más saponinas
de Quillaja en dosis subóptimas para producir un efecto
adyuvante sinérgico.
La Figura 1 muestra un análisis HPLC en fase
invertida de un extracto típico de corteza de Quillaja
saponaria que es adecuado para la purificación de las saponinas
empleadas en la presente invención. Los principales adyuvantes de
saponina QS-7, QS-17,
QS-18, y QS-21 se han marcado en el
cromatograma como "a", "b", "c" y "d",
respectivamente.
La Figura 2, cuadro A, muestra el análisis de
QS-21 mediante espectrometría de masas por bombardeo
con átomos rápidos en modo negativo. El ion seudomolecular
predominante es 1988, que corresponde a m/z =
[M-H]^{-}, en donde M =
C_{92}O_{46}H_{148}. El cuadro B muestra el espectro del pico
de QS-7 mediante espectrometría de masas por
bombardeo con átomos rápidos. El ion seudomolecular predominante es
1862, que corresponde a m/z = [M-H]^{-}.
Una fórmula consistente con esta estructura es
C_{83}O_{46}H_{130}.
La Figura 3, cuadro A, muestra la estructura
propuesta de QS-7. El cuadro B muestra la estructura
de QS-21, determinada por resonancia magnética
nuclear ^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR
bidimensional. La variación entre los componentes individuales
QS-21-V1 y
QS-21-V2 está indicada por los
restos terminales alternativos de
\beta-D-apiosa
(QS-21-V1) o de
\beta-D-xilosa
(QS-21-V2) (cuadro B).
La Figura 4 muestra la lisis de células diana
E.G7-OVA mediada por linfocitos T citotóxicos,
inducida por la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (0,625 \mug) y QS-7 (10
\mug) en comparación con la respuesta CTL inducida por dosis
idénticas de estas saponinas, administradas por separado. También se
muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida por 20
\mug de QS-21.
La Figura 5 muestra la lisis de células diana
E.G7-OVA mediada por linfocitos T citotóxicos,
inducida por la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (1, 25 \mug) y QS-7 (10
\mug) en comparación con la respuesta CTL inducida por dosis
idénticas de estas saponinas, administradas por separado. También se
muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida por 20
\mug de QS-21.
La Figura 6 muestra la lisis de células diana
E.G7-OVA mediada por linfocitos T citotóxicos,
inducida por la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (0,625 \mug) y QS-7 (20
\mug) en comparación con la respuesta CTL inducida por dosis
idénticas de estas saponinas, administradas por separado. También se
muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida por 20
\mug de QS-21.
La Figura 7 muestra la lisis de células diana
E.G7-OVA mediada por linfocitos T citotóxicos,
inducida por la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (1,25 \mug) y QS-7 (20
\mug) en comparación con la respuesta CTL inducida por dosis
idénticas de estas saponinas, administradas por separado. También se
muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida por 20
\mug de QS-21.
La Figura 8 muestra el título, en logaritmo
decimal, de un promedio de cinco ratones que recibieron estas
mezclas, en comparación con dosis individuales subóptimas.
La Figura 9 muestra la respuesta de linfocitos T
citotóxicos a la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (1,25 \mug) y QS-7 (18,8
\mug) comparada con las dosis de 1,25 \mug y 20 \mug,
respectivamente, de las mismas saponinas, administradas por
separado, y con el efecto aditivo predicho de la combinación de
QS-21 (1,25 \mug) y QS-7 (20
\mug). Se muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida
por 20 \mug de QS-21.
La Figura 10 muestra la respuesta de anticuerpos
en el suero, de la combinación de dosis subóptimas de
QS-21 (1,25 \mug) y QS-7 (18,8 g),
en combinación con dosis de 1,25 \mug y 20 \mug,
respectivamente, de las mismas saponinas, administradas por
separado. Se muestra, para comparación, la respuesta óptima inducida
por 20 \mug de QS-21.
Los autores de la presente solicitud han
descubierto ahora, inesperadamente, que la combinación de dosis
subóptimas de las saponinas QS-7 y
QS-21 sustancialmente purificadas produce un efecto
adyuvante sinérgico en lugar del efecto aditivo esperado.
Por tanto, la presente invención está dirigida a
una composición de saponina que tiene actividad adyuvante
inmunitaria, que comprende dos o más saponinas sustancialmente
puras.
La presente invención está dirigida también a
una composición de saponina que tiene actividad adyuvante
inmunitaria, que comprende dos o más saponinas sustancialmente puras
procedentes de Quillaja saponaria, en dosis que de otro modo
serían subóptimas para las saponinas individuales.
En una realización preferida, la nueva
composición de saponina consta esencialmente de saponinas
QS-7 y QS-21 sustancialmente
puras.
La presente invención está dirigida también a
una composición de saponina que tiene actividad adyuvante
inmunitaria, que consta esencialmente de saponinas
QS-7 y QS-21-V1
sustancialmente puras.
La presente invención está dirigida también a
una composición de saponina que tiene actividad adyuvante
inmunitaria, que consta esencialmente de saponinas
QS-7 y QS-21-V2
sustancialmente puras.
La presente invención está dirigida además a una
composición farmacéutica útil para inducir en un individuo una
respuesta inmunitaria a un antígeno, que comprende estas
composiciones de saponina y una cantidad inmunogénicamente eficaz de
un antígeno. En una realización, el antígeno está conjugado con al
menos una de las saponinas sustancialmente puras, o bien
directamente, o bien a través de un grupo enlazador.
La presente invención está dirigida además a una
vacuna que comprende tales composiciones farmacéuticas y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención está dirigida además a un
método para intensificar en un individuo una respuesta inmunitaria a
un antígeno, que comprende coadministrar dos o más saponinas
sustancialmente puras procedentes de Quillaja saponaria, en
dosis que de otro modo son subóptimas para las saponinas
individuales.
La presente invención está dirigida además a un
método para intensificar en un individuo una respuesta inmunitaria a
un antígeno, que comprende coadministrar una cantidad eficaz de de
saponinas QS-7 y QS-21
sustancialmente puras.
La presente invención está dirigida además a un
método para intensificar en un individuo una respuesta inmunitaria a
un antígeno, que comprende coadministrar una cantidad eficaz de de
saponinas QS-7 y
QS-21-V1 sustancialmente puras.
La presente invención está dirigida además a un
método para intensificar en un individuo una respuesta inmunitaria a
un antígeno, que comprende coadministrar una cantidad eficaz de de
saponinas QS-7 y
QS-21-V2 sustancialmente puras.
En una realización preferida se coadministra una
cantidad inmunogénicamente eficaz de un antígeno con
QS-7 y, o bien QS-21,
QS-21-V1 o
QS-21-V2, o bien
QS-7 y una mezcla de QS-21,
QS-21-V1 y/o
QS-21-V2.
Las saponinas de la presente invención se pueden
obtener del árbol Quillaja saponaria Molina.
Tal como se emplea en el presente documento, el
término "saponina" incluye compuestos triterpenoides
glicosídicos que producen espuma en disolución acuosa, tienen en la
mayoría de los casos actividad hemolítica, y poseen actividad
adyuvante inmunitaria. La invención abarca la saponina en sí, así
como sales naturales y farmacéuticamente aceptables y derivados
farmacéuticamente aceptables. El término "saponina" abarca
también fragmentos biológicamente activos de la misma.
Se ha descubierto ahora que cuando se
coadministran con antígeno dosis de las saponinas
QS-7 y QS-21 (y/o
QS-21-V1 y/o
QS-21-V2) que son subóptimas para
conseguir un efecto adyuvante cuando se administran de manera
independiente entre sí, la combinación produce un efecto adyuvante
sinérgico que es considerablemente superior al efecto adictivo
esperado de tal combinación.
La invención se refiere a composiciones que
comprenden una combinación de dos o más saponinas sustancialmente
purificadas procedentes de Quillaja saponaria, empleadas
juntas en una mezcla, en dosis que serían subóptimas si estas
saponinas se utilizasen por separado. La invención se refiere a
composiciones, por ejemplo composiciones inmunológicas, que
comprenden una combinación de saponinas sustancialmente puras
QS-7 y QS-21,
QS-21-V1 o
QS-21-V2, o fracciones o productos
de hidrólisis de las mismas, que pueden estar unidos a un antígeno,
y a métodos para emplear estas composiciones como vacunas y
adyuvantes inmunitarios. También se pueden emplear mezclas de
QS-21, QS-21-V1 y
QS-21-V2 en combinación con
QS-7, en lugar de las saponinas individuales.
Tal como se emplea en el presente documento, la
expresión "adyuvante inmunitario" se refiere a compuestos que,
cuando se administran a un individuo o se ensayan "in
vitro", incrementan la respuesta inmunitaria a un antígeno en
el individuo o en el sistema de ensayo al cual se administra dicho
antígeno. Algunos antígenos son débilmente inmunógenos cuando se
administran solos, o bien son tóxicos para el individuo a las
concentraciones que originan respuestas inmunitarias en dicho
individuo. Un adyuvante inmunitario puede intensificar la respuesta
inmunitaria del individuo al antígeno, haciendo que al antígeno sea
más fuertemente inmunógeno. El efecto adyuvante también puede
disminuir la dosis de dicho antígeno necesaria para conseguir una
respuesta inmunitaria en dicho individuo.
Con los términos "coadministrar" o
"coadministración" se quiere significar que cada uno de al
menos dos componentes es administrado dentro de un marco temporal en
el cual se solapan los respectivos períodos de actividad biológica.
Así, el término incluye la administración secuencial y coextensiva
de las saponinas y composiciones de saponina de la presente
invención.
La actividad inmunógena de las composiciones de
saponina de la presente invención se puede determinar mediante
cualquiera de diversos métodos conocidos por los especialistas
ordinarios en la técnica. Se puede emplear como criterio de
actividad inmunógena el incremento en el título de anticuerpo contra
un antígeno particular tras la administración de vacunas y/o
adyuvantes de la invención (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria
Scandinavica 69:1-40 81978); Scott y otros,
Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77:409-412
(1985)). En resumen, uno de estos ensayos implica inyectar por vía
intradérmica a ratones CD-1 un conjugado de
composición de saponina y antígeno que puede estar mezclado con
diversas cantidades de un adyuvante potencial. Dos semanas después
se extrae suero de los ratones y se analiza mediante ELISA en busca
de anticuerpos anti-inmunógeno.
La expresión "sustancialmente puro"
significa que está sustancialmente exento de compuestos normalmente
asociados con la saponina en su estado natural, y que exhibe una
respuesta cromatográfica, perfiles de elución, y actividad
biológica, constantes y reproducibles. No se pretende que la
expresión "sustancialmente puro" excluya mezclas artificiales o
sintéticas de la saponina con otros compuestos.
"QS-21" designa la mezcla
de componentes QS-21-V1 y
QS-21-V2 que aparece como un pico
único en HPLC de fase invertida con una columna Vydac C4 (tamaño de
partícula 5 \mum, poro de 300 \ring{A}, diámetro interno 4,6 mm
x 25 cm de longitud) en ácido acético 40 M en metanol/agua (58/42,
v/v). Cuando se describen experimentos realizados o resultados
obtenidos con los componentes más purificados, las fracciones de
componente son denominadas específicamente
QS-21-V1 y
QS-21-V2.
Existen muchas técnicas aceptables para la
extracción y el aislamiento de saponinas de la corteza de
Quillaja saponaria Molina. En la Patente de EE.UU. número
5,057,540 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. número 07/906,880
(admitida con tasas de concesión pagadas, para ser concedida como
Patente de EE.UU. número 5,583,112) se describen procedimientos
aceptables para purificar las saponinas de la presente invención a
partir de corteza de Quillaja saponaria Molina, para
determinar la actividad adyuvante inmunitarias de las saponinas, y
para caracterizar las saponinas sustancialmente puras.
También están disponibles comercialmente
extractos acuosos de corteza de Quillaja saponaria. Son éstos
unos extractos espumosos, de color pardo oscuro, que contienen
muchos compuestos (taninos, polifenoles, saponinas) y que pueden ser
analizados mediante un método tal como la HPLC en fase
invertida.
En la Figura 1 se muestra un ejemplo de un
análisis mediante HPLC en fase invertida de un extracto de corteza
típico que es adecuado para la purificación de saponinas. Se marcan
como "a", "b", "c" y "d", respectivamente, los
adyuvantes de saponina QS-7, QS-17,
QS-18 y QS-21. También se han
descrito otras saponinas menos importantes con actividad
adyuvante.
Mediante diálisis del extracto frente a agua a
través de una membrana de peso molecular 10.000 se puede realizar
una purificación parcial para enriquecer la fracción de saponina y
eliminar la mayoría de los taninos y polifenoles. La fracción de
saponina se conserva.
Como alternativa, se puede tratar previamente
con polivinilpirrolidona un extracto acuoso de saponina para
eliminar taninos y polifenoles de alto peso molecular mediante la
absorción de estos compuestos.
Los taninos y polifenoles residuales se pueden
eliminar de la fracción de saponina por diafiltración frente a agua.
La fracción de saponina, que forma micelas, es retenida por
membranas de ultrafiltración con corte de tamaño de poro en un peso
molecular de 10.000 a 30.000. Ello proporciona un extracto
parcialmente purificado que se compone predominantemente de diversas
saponinas.
La separación de las saponinas se puede
conseguir mediante cromatografía en disolventes orgánicos o en
mezclas de disolventes orgánicos y agua. En la Patente de EE.UU.
número 5,057,540 se ha descrito una separación de saponinas sobre
sílice. Esta proporciona saponinas de pureza intermedia
(enriquecidas en una saponina individual, pero con una pureza que no
llega a sustancial).
De manera alternativa, para realizar la
separación inicial de saponinas se pueden emplear otros sistemas de
disolventes sobre gel de sílice, o bien usar la cromatografía en
fase invertida. Típicamente, este paso inicial de purificación puede
ir seguido de un paso de cromatografía en fase invertida o de HPLC
similar, para purificar las saponinas hasta llegar cerca de la
homogeneidad.
Las saponinas sustancialmente puras útiles en la
presente invención pueden ser aisladas también desde material
vegetal fresco compuesto sustancialmente por células vivas, tal como
se describe en el documento WO 95/09179. Por ejemplo, se puede
obtener extracto de saponina a partir de material de células
vegetales recientemente extraído de árboles de Quillaja de
aproximadamente 15 años de edad. Después se purifica en una columna
de intercambio iónico, por ejemplo del tipo DE-52,
el extracto dializado, y a continuación se somete a filtración en
gel Sephadex G50. Se puede utilizar ultrafiltración en lugar de
filtración en gel. Luego se somete la composición de saponina
purificada a análisis mediante HPLC en fase invertida en una columna
VYDAC C4, eluyendo con acetonitrilo al 30-45% en una
disolución acuosa de TFA al 0,15%.
Se puede realizar el mismo procedimiento sobre
material celular vegetal obtenido por medio de cultivo de tejidos o
cultivo de células en suspensión.
Las composiciones de saponina de la invención
son útiles como vacunas que inducen inmunidad activa contra
antígenos en individuos. Preferiblemente, dichos individuos son
seres humanos, pero no se pretende que la invención sea tan
limitante. Cualquier animal que pueda experimentar los efectos
beneficiosos de las vacunas de la invención está dentro del ámbito
de animales que pueden ser tratados de acuerdo con la invención que
se reivindica.
Las composiciones de saponina de la presente
invención muestran efectos adyuvantes cuando son administradas
dentro de un amplio intervalo de dosificaciones y de un amplio
intervalo de proporciones respecto al antígeno que se está
administrando. En una realización, la composición de saponina se
administra en una proporción de adyuvante respecto a inmunógeno (en
peso/peso) de 3,0 o menos, preferiblemente 1,0 o menos.
Para conseguir la intensificación de la
respuesta inmunitaria a un antígeno, las composiciones de saponina
de la invención se pueden administrar, o bien por separado, o bien
mezcladas con otros adyuvantes sustancialmente puros.
En la presente invención, las dos saponinas
sustancialmente puras eficaces para producir un efecto sinérgico
cuando son coadministradas son la QS-7 y la
QS-21. La combinación de QS-7 y
QS-21 se puede administrar también junto con
adyuvantes no saponínicos. Estos adyuvantes no saponínicos útiles
con la presente invención son adyuvantes oleosos (por ejemplo
adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund),
liposomas, colesterol, sales minerales (por ejemplo
AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4} (SO_{4}), sílice,
alúmina, Al(OH)_{3},
Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín y carbono),
polinucleótidos (por ejemplo ácidos poli-IC y
poli-AU), y ciertas sustancias naturales o derivados
(por ejemplo cera D de Mycobacterium tuberculosis, lípido
monofosforílico A (Salmonella minnesota), así como sustancias
encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella
pertussis, y miembros del género Brucella), seroalbúmina
de bovino, toxoide diftérico, toxoide tetánico, edestina,
hemocianina de lapa californiana, toxina pseudomónica A,
coleragenoide, toxina colérica, toxina tosferínica, proteinas
víricas, y proteínas eucarióticas tales como interferones,
interleucinas, o factor de necrosis tumoral. Estas proteínas o
fragmentos activos se pueden obtener de fuentes naturales o
recombinantes por métodos conocidos por los especialistas en la
técnica. Otras macromoléculas inmunopotenciadoras conocidas que se
pueden emplear en la práctica de la invención incluyen, pero sin
quedar limitadas a éstas, polisacáridos, nucleótidos de ADN/ARN,
tARN, polímeros sintéticos no metabolizables tales como
poli(vinilamina), poli(ácido metacrílico),
polivinilpirrolidona, policondensados mixtos (con peso molecular
relativamente alto) de ácido
4',4'-diaminodifenilmetano-3',3'-dicarboxílico
y ácido
4-nitro-2-aminobenzoico
(véase Sela, M., Science 166:1365-1374
(1969)) o bien glicolípidos, lípidos o hidratos de carbono.
Las composiciones de saponina de la presente
invención pueden estar unidas al antígeno directamente, o bien
pueden estar unidas a través de un grupo enlazador tal como se
describe en la Patente de EE.UU. número 5,057,540 y en la Solicitud
de Patente de EE.UU. número 07/906,880 (admitida con tasas de
concesión pagadas, para ser concedida como Patente de EE.UU. número
5,583,112).
Las composiciones de saponina de la presente
invención se pueden utilizar para intensificar la respuesta
inmunitaria a cualquier antígeno. Los antígenos típicos adecuados
para las composiciones inductoras de respuesta inmunitaria, de la
presente invención, incluyen antígenos derivados de cualquiera de
las siguientes fuentes, así como de otras: virus, tales como el
virus de la gripe, virus del herpes simple, virus de la leucemia
felina, virus de la inmunodeficiencia felina, HIV-1,
HIV-2, virus de la rabia, virus del sarampión, virus
de la hepatitis B, o virus de la glosopeda; bacterias, tales como
Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphteriae, Borrelia
burgdorferi, Mycobacterium tuberculosis, o Ehrlichia
granulocítica y monocítica; protozoos, tales como Babeosis
bovis o Plasmodium; cáncer, por ejemplo melanoma;
parásitos, priones (por ejemplo de la encefalitis espongiforme
bovina o "enfermedad de las vacas locas"), y enfermedades
autoinmunitarias. Los antígenos pueden ser proteínas, péptidos,
monosacáridos, polisacáridos, lipopolisacáridos, lipoproteínas, y
nucleótidos de ADN o de ARN. Las proteínas, péptidos y ácidos
nucleicos se pueden purificar a partir de una fuente natural, se
pueden sintetizar mediante síntesis en fase sólida, o se pueden
obtener por medio de genética recombinante.
La administración de las composiciones de
saponina útiles en el método de la presente invención puede hacerse
por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intranasal, oral, o por cualquier otro medio adecuado. La dosis
administrada puede depender de la especie, edad, peso, tipo de
tratamiento concurrente, si lo hay, y de la naturaleza del antígeno
administrado. Las composiciones de saponina de la presente invención
se pueden administrar en cualquier dosis terapéuticamente eficaz.
Una dosis terapéuticamente eficaz es cualquier dosis que tienda a
estimular la respuesta inmunitaria a un antígeno. Preferiblemente,
las nuevas composiciones de saponina de la presente invención se
administran a un paciente humano en una dosis de 5 \mug a 25
\mug de QS-21 y de 100 \mug a 400 \mug de
QS-7. Se pueden definir otras composiciones
terapéuticas que pueden caer fuera de este intervalo (por ejemplo
por emplear saponinas purificadas diferentes, diferente antígeno o
diferente especie), determinando las dosis subóptimas y óptimas de
cada una de las dos saponinas purificadas cuando se emplean solas,
en un estudio de evaluación de dosis con un antígeno dado en una
especie dada. La composición terapéutica consistiría en dosis de dos
o más saponinas, en donde cada una esté combinada en dosis dentro
del intervalo subóptimo cuando se utiliza individualmente, pero en
donde las mismas dosis, mezcladas en una composición, proporcionen
la actividad deseada.
Se puede definir el máximo efecto adyuvante
posible para un adyuvante tal como QS-21,
QS-7 u otras saponinas purificadas, mediante el
empleo de una curva de dosis-respuesta para un
antígeno o especie dados. Esta curva definirá típicamente dosis que
proporcionen la máxima intensificación posible de la respuesta
inmunitaria. Se puede definir como valor "x" la diferencia
entre esta respuesta inmunitaria máxima y la respuesta inmunitaria a
una formulación sin adyuvante. Este valor "x" puede medirse
como título de anticuerpo específico para un antígeno (sin
transformación logarítmica) y/o como el porcentaje de actividad
citolítica debida a linfocitos T citotóxicos para una proporción
efector:diana dada. Típicamente, una respuesta adyuvante subóptima
será un "x" de 20% o menor. La respuesta adyuvante deseada
será típicamente un "x" de al menos 50% o más.
Las composiciones de saponina útiles en el
método de la presente invención se pueden emplear en formas tales
como cápsulas, disoluciones, suspensiones o elixires líquidos para
la administración por vía oral, o formas líquidas estériles tales
como disoluciones o suspensiones. Se emplea preferiblemente
cualquier vehículo inerte, por ejemplo disolución salina, o
disolución salina tamponada con fosfato, o cualquier otro vehículo
en el cual los compuestos empleados en el métodos de la presente
invención tengan propiedades de solubilidad adecuadas para el uso en
los métodos de la presente invención.
Las composiciones de saponina de la presente
invención se pueden combinar satisfactoriamente con adyuvantes
vehículos. Por ejemplo, se pueden combinar las composiciones de
saponina en complejos inmunoestimulantes (siglas inglesas ISCOM) de
antígeno/saponina/esterol (preferiblemente colesterol) y matrices
ISCOM tales como las descritas en Morein, B, y otros, Nature
308:457 (1984). Un procedimiento aceptable para preparar ISCOMs
comprende la solubilización del antígeno anfipático en detergente
preferiblemente no iónico, seguida de la adición de saponinas de
Quillaja, por ejemplo QS-21 y
QS-7, un esterol, por ejemplo colesterol, y
fosfatidilcolina. En presencia de antígeno anfipático, se forman
partículas de ISCOM al eliminar el detergente. Si no hay antígeno en
la mezcla, se forma matriz ISCOM. El antígeno transportado por ISCOM
induce una respuesta inmunitaria mediada por células, reacción de
hipersensibilidad de tipo retardado, y respuesta de linfocitos T
citotóxicos (siglas inglesas CTL) con restricción de MHC de clase I,
intensificadas.
También se pueden encapsular las composiciones
de saponina de la presente invención dentro de microesferas
polímeras. Por ejemplo, se ha demostrado que microesferas polímeras,
tales como ácido
poli(láctico-co-glicólico)
(siglas inglesas PLGA) son una combinación compatible con
QS-21 (Cleland, J.L., y otros, AIDS Res. Hum.
Retroviruses 10(S2):S21 (1994).
También se han combinado saponinas con liposomas
y con liposomas preparados a partir de lípidos naturales y
sintéticos de acuerdo con la Patente de EE.UU. número 4,235,877 de
Fullerton. También se han empleado, como vehículos para antígenos
hidrófilos, liposomas que contienen Quil A intercalada (Lipford,
G.B., y otros, Vaccine 12(1):73 (1994).
Las composiciones de saponina de la presente
invención se pueden emplear también en un equipo o "kit" para
inmunizar a un individuo, que comprende un envase
compartimentalizado para recibir, en un alojamiento próximo dentro
del mismo, uno o más medios recipientes, en donde un primer
recipiente contiene una composición de saponina de la invención. El
kit puede incluir también al menos otro medio recipiente que
contenga un adyuvante de saponina u otro adyuvante tal como se ha
descrito en el presente documento.
Habiendo ya descrito la invención en general, se
podrá entender la misma con más detalle por referencia a los
siguientes Ejemplos.
Se disolvieron 20 g de extracto de Quillaja
saponaria, dializado y liofilizado, en 150 ml de una mezcla de
62% de cloroformo, 32% de metanol, 6% de agua, y 0,23% de ácido
acético (volumen/volumen/volumen/volumen). Se cargó un volumen total
de 100 ml en una columna de 10 cm de diámetro cargada con 450 g de
sílice (EM Lichroprep, Si 60, 40-63 micrómetros) en
la misma mezcla de disolventes. Las fracciones de
QS-21 y QS-7 separadas se
identificaron mediante análisis por HPLC en fase invertida, se
combinaron, y se secaron mediante evaporación rotatoria seguida de
liofilización. El rendimiento total de QS-21
intermedia fueron 3,2 gramos con una pureza aproximada de 51% según
HPLC en fase invertida. La QS-7 eluyó en una
fracción posterior (0,66 gramos con 17% de pureza).
Se continuó purificando QS-21
intermedia, preparada en el Ejemplo 1, mediante HPLC preparativa en
fase invertida, en una columna Vydac C18 (tamaño de partícula 10
micrómetros, tamaño de poro 300 angstrom, longitud 25 cm, diámetro
2,2 cm). Se preparó una disolución de concentración 100 mg/ml de la
QS-21 intermedia en una mezcla de 38% de
acetonitrilo/62% de agua/0,15% de ácido trifluoroacético
(volumen/volumen/volumen). Una porción alícuota de 20 mg se separó
después en la columna Vydac en condiciones cromatográficas
isocráticas, con 38% de acetonitrilo/62% de agua/0,15% de ácido
trifluoroacético. Se realizaron dieciséis procesos cromatográficos
en idénticas condiciones de cromatografía isocrática. Se recogieron
las fracciones que contenían QS-21 sustancialmente
pura (según el análisis en proceso mediante HPLC en fase invertida),
y se combinaron, proporcionando un volumen total de 930 ml. Se
diluyó éste hasta 1860 ml mediante la adición de agua de calidad
para HPLC. Se cargó el combinado diluido en una columna Vydac C18
(20-30 micrómetros, 15 cm de longitud x 2,5 cm de
diámetro interno) equilibrada en agua. Se cargó el combinado diluido
en la columna a un ritmo de 10 ml/minuto, se hizo pasar 100% de agua
durante 30 minutos más a un caudal de 10 ml/minuto, y después se
eluyó la QS-21 con un gradiente lineal desde 100%
de agua hasta 100% de metanol en el transcurso de 60 minutos. La
QS-21 eluyó como un pico único. Se trasladó la
mezcla de QS-21/metanol/agua a un matraz de
liofilización, se evaporó bajo una corriente continua de nitrógeno,
para eliminar el metanol, y se liofilizó. El rendimiento final
fueron 59 mg de QS-21 con una pureza
aproximada
de 98%.
de 98%.
Se continuó purificando QS-7
intermedia, preparada de la manera descrita en el Ejemplo 1, en una
columna Waters C18. Se preparó una disolución de concentración 100
mg/ml de la QS-21 intermedia en agua. 20 mg de esta
solución se eluyeron en la columna C18 (0,78 cm de diámetro interno
x 30 cm de longitud, 10 micrómetros) con un gradiente lineal desde
80% de agua/20% de acetonitrilo/0,15% de ácido trifluoroacético
hasta 40% de agua/60% de acetonitrilo/0,15% de ácido
trifluoroacético, en el transcurso de 75 minutos, con un caudal de 2
ml/minuto. Se realizaron un total de cuatro procesos
cromatográficos, y se combinaron las fracciones que contenían
QS-7, proporcionando un total de 19 g con una
pureza aproximada de 54%. Se disolvió en agua esta preparación, a
una concentración de 4 mg/ml, y se continuó purificando mediante
HPLC isocrática en la misma columna, equilibrada en 67% de agua/33%
de acetonitrilo/0,15% de ácido trifluoroacético. Se diluyeron con un
volumen igual de agua las fracciones combinadas, y se adsorbieron en
una resina C18 (de 20 - 30 micrómetros) en un embudo Buchner, y se
lavaron con 90 ml de agua. Después se eluyó QS-7 con
40 ml de metanol. Se evaporó el metanol bajo una corriente de
nitrógeno, se redisolvió la QS-7 en agua, y se
liofilizó, proporcionando un total de 8 mg de QS-7
purificada.
Otras resinas de fase invertida, disolventes y
gradientes de separación han resultado ser adecuados para la
purificación de QS-7 y QS-21, así
como otras saponinas de Q. saponaria (Kensil, J. Immunol.,
146:431-437 (1991).
Mediante la espectrometría de masas se pueden
identificar distintas saponinas. La Figura 2A muestra el análisis de
QS-21 por bombardeo con átomos rápidos en modo
negativo. El ion seudomolecular predominante es 1988, que
corresponde a m/z = [M-H]^{-}, en donde M =
C_{92}O_{46}H_{148}. La Figura 2B muestra el espectro del pico
de QS-7 mediante espectrometría de masas por
bombardeo con átomos rápidos. El ion seudomolecular predominante es
1862, que corresponde a m/z = [M-H]^{-}.
Una fórmula consistente con esta estructura es
C_{83}O_{46}H_{130}.
Las saponinas de Q. saponaria son
glicósidos triterpénicos bisdesmódicos acilados. Se ha determinado
la estructura de QS-21 mediante
^{1}H-NMR y ^{13}C-NMR
bidimensional (Jacobsen, N.E., y otros, Carbohydrate
Research, volumen 280:1-14 (1996)). En la Figura
3B se muestra esta estructura. En la Figura 3A se muestra una
estructura propuesta para QS-7.
Ya se han descrito con anterioridad
composiciones inmunológicas que comprenden una o más fracciones
sustancialmente puras de saponina de Quillaja saponaria, y
métodos de uso de tales composiciones como adyuvantes inmunitarios,
en la Ptente de EE.UU. número 5,057,540, y en la Slicitud de Ptente
de EE.UU. número 07/906,880, en tramitación junto con la presente
(admitida con tasas de concesión pagadas, para ser concedida como
Ptente de EE.UU. número 5,583,112), de Kensil y otros. En Vaccine
2:273-281 (1993), Kensil, C.R., y otros enseñan
que dosis inferiores a 2,5 \mug de QS-21 son
ineficaces como adyuvantes para incrementar la respuesta de
anticuerpos a antígeno de ovoalbúmina en ratones. De manera similar,
Newman, M., y otros, muestran en J. Immunol.
148:2357-2362 (1992), para
QS-21, una curva dosis/respuesta correspondiente,
para la respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) a ovoalbúmina.
Nuevamente, a una dosis de 2,5 \mug o inferior, la respuesta en
ratones es mínima.
Los presentes inventores han descubierto ahora
que dos saponinas sustancialmente puras producen, inesperadamente,
un efecto adyuvante sinérgico cuando se combinan en dosis
subóptimas.
Las dos saponinas que producen una respuesta
sinérgica cuando se combinan en dosis subóptimas son
QS-7 y QS-21. En resumen, se
ensayaron cinco mezclas de dosis subóptimas de QS-7
y QS-21 en cuanto a su capacidad para producir una
respuesta sinérgica. Se esperaba que el efecto fuera un efecto
adyuvante aditivo.
Todos los experimentos se llevaron a cabo en
ratones C57BL/6 (hembras, de 8-12 semanas de edad).
El efecto adyuvante sinérgico de las mezclas
QS-7/QS-21 se evaluó mediante dos
parámetros: (1) la capacidad de estas mezclas para mejorar, en
ratones, los títulos de anticuerpos frente a un antígeno de
subunidad, la ovoalbúmina; y (2) la capacidad de estas mezclas para
mejorar, en ratones, una respuesta de linfocitos T citotóxicos
(células asesinas) específica contra ovoalbúmina.
Las técnicas experimentales fueron las
siguientes. Se inmunizó por vía subcutánea a los ratones, en las
semanas 1, 3 y 5, con 0,2 ml de las formulaciones indicadas, en
disolución salina tamponada con fosfato. Se inmunizó a los ratones
en grupos de cinco. Se les extrajo suero y el bazo en las semanas 7
a 9. Se analizaron los sueros, por inmunoensayo enzimático, en busca
de respuesta de anticuerpos anti-ovoalbúmina. En
resumen, se revistió una placa Immulon de 96 pocillos con
ovoalbúmina a una concentración de 10 \mug/ml en disolución salina
tamponada con fosfato (siglas inglesas PBS), durante una noche, a
4ºC. Se bloquearon estas placas con suero normal de cabra al 10% en
PBS (diluyente) durante una hora a temperatura ambiente. Se
prepararon diluciones 1:10 en serie, en diluyente, y se incubaron en
las placas durante una hora a temperatura ambiente, o bien durante
una noche, a 4ºC. Se diluyó en diluyente un conjugado enzimático de
IgG anti-ratón (o una subclase IgG
anti-ratón), y se incubó en la placa. Para evaluar
la fijación del anticuerpo anti-ovoalbúmnia se
empleó un sustrato de enzima coloreado, la tetrametilbencidina. Se
emplearon los bazos de los ratones inmunizados para evaluar la
respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL). Las células efectoras
para el ensayo CTL fueron células esplénicas mononucleares
procedentes de los bazos extraídos. Las células diana para el
ensayo, positivas en cuanto al antígeno, fueron células
E.G7-OVA, que son una línea celular de ratón EL4
negativa en cuanto a antígeno de MHC clase II, transfectadas con el
gen de ovoalbúmina. Esta línea celular expresa un péptido de
ovoalbúmina sobre antígeno de MHC clase I, y es por tanto una diana
para linfocitos T citotóxicos específicos para ovoalbúmina (Moore,
M., y otros, Cell 54:777 (1998)). Se emplearon células EL4
como línea celular diana negativa en cuanto a ovoalbúmina. Antes del
ensayo, se estimularon con antígeno las células esplénicas
mononucleares, para inducir la maduración de CTL precursores en la
población de células efectoras. Los antígenos usados para la
estimulación fueron células E.G7-OVA tratadas con
mitomicina C (incubadas junto con las células esplénicas en una
proporción 20:1 de células esplénicas:células
E.G7-OVA) o bien ovoalbúmina desnaturalizada (25
\mug/ml). El cultivo celular a granel se realizó en un volumen de
2 ml a razón de 10^{6}/ml, empleando medio RPMI 1640
complementado, a 37ºC. Se cosecharon las células tras seis días de
cultivo, se resuspendieron en medio nuevo, y se emplearon en el
ensayo CTL. Las células diana (E.G7-OVA o EL4) se
prepararon para el ensayo CTL marcándolas con Na_{2}CrO_{4}
(^{51}Cr) mediante incubación durante 1 hora a 37ºC en medio de
cultivo RPMI 1640 con sacarosa 0,3 M. Se utilizó un ensayo habitual
de citotoxicidad con 10^{4} células diana por pocillo, y una
titulación de proporciones efectora/diana de 25:1, 12:1, 6:1 y 3:1.
Se convirtieron los datos experimentales a porcentaje de lisis. Para
determinar el porcentaje de lisis específica por el antígeno se
restó de la lisis de E.G7-OVA el porcentaje de lisis
de las células EL4.
En primer lugar se identificaron las dosis
subóptimas de los adyuvantes de saponina QS-7 y
QS-21. Las Figuras 4 y 5 muestran que 0,625 \mug y
1,25 \mug de QS-21 no son eficaces para estimular
una respuesta CTL. Por el contrario, una dosis de 20 \mug de
QS-21 es sumamente eficaz para estimular una
respuesta CTL. Las Figuras 4 y 5 muestran que 10 \mug y 20 \mug
de QS-7 no son eficaces para estimular una respuesta
CTL intensa.
Después se combinaron estas dosis subóptimas de
QS-21 y QS-7 de la manera
siguiente:
Inesperadamente, estas mezclas originaron
respuestas de linfocitos T citotóxicos considerablemente mayores que
las predichas por la simple suma de las respuestas a las dosis de
QS-21 y QS-7. La respuesta más
dramática se da con la dosis más baja de QS-7 (10
\mug). En las Figuras 4 a 7 se muestra la respuesta a estas cuatro
mezclas.
Estas mezclas originaron también títulos
inesperadamente altos de anticuerpos contra ovoalbúmina,
particularmente en la subclase IgG2b. En la Figura 8 se muestra la
media del título en logaritmo decimal de un promedio de cinco
ratones que han recibido dichas mezclas, en comparación con dosis
individuales subóptimas. Por ejemplo, ni 10 \mug de
QS-7 ni 0,625 \mug de QS-21, por
separado, originan un título que sea superior al del caso en donde
no se administra adyuvante, lo que demuestra que estas dosis son
subóptimas. Sin embargo, la combinación de 0,625 \mug de
QS-21 con 10 \mug de QS-7 origina
un incremento de una unidad, en logaritmo decimal, del título (un
incremento de diez veces en el título), lo que indica que la
combinación de ambas es una mezcla eficaz de adyuvantes que origina
una respuesta comparable a la de una dosis óptima de
QS-21 conocida (20 \mug).
También se observó efecto sinérgico en otro
experimento con el mismo modelo experimental. En este experimento se
comparó una mezcla de 1,25 \mug de QS-21 y 18,8 g
de QS-7 con, respectivamente, 1,25 \mug de
QS-21 y 20 \mug de QS-7. La mezcla
produjo una respuesta de linfocitos T citotóxicos, y una respuesta
de anticuerpos séricos, superiores a las predichas a partir de las
respuestas a estas saponinas por separado (Figuras 9 a 10).
Claims (10)
1. Una composición de saponina para intensificar
en un individuo una respuesta inmunitaria a un antígeno, que
comprende una combinación de una saponina QS-7
sustancialmente pura y una o más saponinas sustancialmente puras
seleccionadas del grupo consistente en
- a)
- QS-21
- b)
- QS-21 V1 y
- c)
- QS-21 V2
en donde dichas saponinas
sustancialmente puras tienen actividad adyuvante inmunitaria en
presencia de una cantidad inmunológicamente eficaz de dicho
antígeno.
2. La composición según la reivindicación 1, que
comprende dichas saponinas sustancialmente puras, en donde dichas
saponinas sustancialmente puras están presentes en dosis subóptimas
para intensificar una respuesta inmunitaria en un individuo.
3. La composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende una combinación de una saponina
QS-7 sustancialmente pura y una saponina
QS-21 sustancialmente pura.
4. La composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende una combinación de una saponina
QS-7 sustancialmente pura y una saponina
QS-21 V1 sustancialmente pura.
5. La composición según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende una combinación de una saponina
QS-7 sustancialmente pura y una saponina
QS-21 V2 sustancialmente pura.
6. La composición farmacéutica que comprende la
composición de saponina según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
7. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además una cantidad
inmunológicamente eficaz de un antígeno, para uso como
medicamento.
8. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el antígeno es una proteína,
péptido, monosacárido, polisacárido, lipopolisacárido, lipoproteína
o un nucleótido.
9. La composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el antígeno se deriva de un virus,
una bacteria, un parásito, un prión o cáncer.
10. Utilización de una composición según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la fabricación de un
medicamento para intensificar una respuesta inmunitaria a un
antígeno.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US1996/019252 WO1998024319A1 (en) | 1996-12-02 | 1996-12-02 | Novel saponin compositions and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2297841T3 true ES2297841T3 (es) | 2008-05-01 |
Family
ID=22256230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96943568T Expired - Lifetime ES2297841T3 (es) | 1996-12-02 | 1996-12-02 | Nuevas composiciones de saponina y usos de las mismas. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0952771B1 (es) |
| JP (1) | JP4138884B2 (es) |
| AT (1) | ATE385809T1 (es) |
| AU (1) | AU730230B2 (es) |
| CA (1) | CA2273922C (es) |
| DE (1) | DE69637435T2 (es) |
| DK (1) | DK0952771T3 (es) |
| ES (1) | ES2297841T3 (es) |
| HK (1) | HK1025220A1 (es) |
| WO (1) | WO1998024319A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009233757B2 (en) | 2008-04-08 | 2015-05-07 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Triterpene saponins, methods of synthesis, and uses thereof |
| GB201213364D0 (en) * | 2012-07-27 | 2012-09-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Purification process |
| CN109996637A (zh) | 2016-11-18 | 2019-07-09 | Sms集团有限公司 | 用于制造连续的带状复合材料的方法以及设备 |
| WO2019106192A1 (en) * | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Saponin purification |
| WO2019106191A1 (en) * | 2017-12-01 | 2019-06-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Saponin extraction |
| JP2022535091A (ja) * | 2019-06-05 | 2022-08-04 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | サポニン精製 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057540A (en) * | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| US5650398A (en) * | 1992-07-02 | 1997-07-22 | Cambridge Biotech Corporation | Drug delivery enhancement via modified saponins |
| US5273965A (en) * | 1992-07-02 | 1993-12-28 | Cambridge Biotech Corporation | Methods for enhancing drug delivery with modified saponins |
| AUPM873294A0 (en) * | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
-
1996
- 1996-12-02 DK DK96943568T patent/DK0952771T3/da active
- 1996-12-02 AU AU12778/97A patent/AU730230B2/en not_active Ceased
- 1996-12-02 CA CA002273922A patent/CA2273922C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-02 JP JP52553498A patent/JP4138884B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-02 DE DE69637435T patent/DE69637435T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-02 ES ES96943568T patent/ES2297841T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-02 EP EP96943568A patent/EP0952771B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-12-02 WO PCT/US1996/019252 patent/WO1998024319A1/en active IP Right Grant
- 1996-12-02 AT AT96943568T patent/ATE385809T1/de active
-
2000
- 2000-05-03 HK HK00102685A patent/HK1025220A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0952771A4 (en) | 2004-11-03 |
| WO1998024319A1 (en) | 1998-06-11 |
| DE69637435D1 (de) | 2008-03-27 |
| EP0952771B1 (en) | 2008-02-13 |
| DK0952771T3 (da) | 2008-05-19 |
| CA2273922A1 (en) | 1998-06-11 |
| AU730230B2 (en) | 2001-03-01 |
| CA2273922C (en) | 2008-08-05 |
| HK1025220A1 (en) | 2000-11-10 |
| JP2001505573A (ja) | 2001-04-24 |
| AU1277897A (en) | 1998-06-29 |
| ATE385809T1 (de) | 2008-03-15 |
| DE69637435T2 (de) | 2009-02-19 |
| JP4138884B2 (ja) | 2008-08-27 |
| EP0952771A1 (en) | 1999-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6524584B2 (en) | Saponin compositions and uses thereof | |
| Barr et al. | ISCOMs and other saponin based adjuvants | |
| Kensil et al. | QS-21: a water-soluble triterpene glycoside adjuvant | |
| Kensil et al. | Structural and immunological characterization of the vaccine adjuvant QS-21 | |
| Sun et al. | Advances in saponin-based adjuvants | |
| US6080725A (en) | Immunostimulating and vaccine compositions employing saponin analog adjuvants and uses thereof | |
| JP4636877B2 (ja) | 免疫刺激複合体の調製及びその使用 | |
| KR100578317B1 (ko) | 면역보강성 및 면역자극 활성을 갖는 트리테르펜 사포닌유사체 | |
| ES2331952T3 (es) | Fraccion de quil a con baja toxicidad y su uso. | |
| ES2630205T3 (es) | Uso de partículas que contengan lípidos que comprenden saponínas quillaja para el tratamiento del cáncer | |
| JPH10508301A (ja) | サポニン製剤およびｉｓｃｏｍでのその使用 | |
| EP1385541B1 (en) | Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and qs-21 | |
| US20030147920A1 (en) | Immunostimulant compositions comprising an aminoalkyl glucosaminide phosphate and QS-21 | |
| ES2331025T3 (es) | Hexosilceramidas como adyuvantes y sus usos en composiciones farmaceuticas. | |
| Sun et al. | Haemolytic activities and adjuvant effect of Anemone raddeana saponins (ARS) on the immune responses to ovalbumin in mice | |
| ES2297841T3 (es) | Nuevas composiciones de saponina y usos de las mismas. | |
| Lacaille-Dubois | Saponins as immunoadjuvants and immunostimulants | |
| AU772517B2 (en) | Novel saponin compositions and uses thereof | |
| Milicic et al. | Adjuvants, immunomodulators, and adaptogens | |
| EP4213943A1 (en) | Compositions and methods targeting filamentous bacteriophage | |
| JP2002525339A (ja) | ウイルス疾患のための炭水化物ワクチン | |
| Ragupathi et al. | Saponin QS-21 adjuvants in cancer vaccines |