KR19990071079A

KR19990071079A - 동물췌장으로부터 판크레아틴 및 소화효소제의 제조방법

Info

Publication number: KR19990071079A
Application number: KR1019980006313A
Authority: KR
Inventors: 안병근; 김현수; 이백천; 전병수
Original assignee: 이백천; 주식회사 순천당제약
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 1999-09-15
Also published as: KR100251816B1

Abstract

본 발명은 동물췌장을 동결건조시켜 분쇄한후, 가압가스인 이산화탄소로 1차 추출하여 지질 및 콜레스테롤을 제거하고, 추출물을 이산화탄소와 에탄올로 2차 추출하여 고역가의 판크레아틴을 제조하는 것이며, 나아가 얻어진 판크레아틴을 계면활성제와 이소옥탄의 역미셀 용액으로 추출한후, 염화칼륨액으로 역추출하여 아밀라제, 푸로테아제, 리파제를 제조하는 방법이다.

본 발명에 따르면 고역가의 판크레아틴 및 판크레아틴에 함유된 개개소화효소제인 아밀라제, 푸로테아제, 리파제를 대량 생산할 수 있으며, 이산화탄소는 재사용할 수 있는 특장점이 있다.

Description

동물췌장으로부터 판크레아틴 및 소화효소제의 제조방법

동물췌장에는 유용한 소화효소가 다량 함유되어 있음에도 불구하고 국내에서는 산업폐기물로 처리되고 있으며, 의약품 원료로 사용되고 있는 판크레아틴등 소화효소제는 전량 수입에 의존하고 있는 안타까운 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 고순도의 품질과 공정의 단순화에 의한 판크레아틴 등의 소화효소제를 대량 생산할 수 있는 제조방법을 제공하여 수입대체 효과는 물론 폐자원활용, 의약품산업발전에 기여함을 목적으로 한다.

본 발명은 동물췌장으로부터 판크레아틴(pancreatin) 및 소화효소제의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세히는 가압가스와 보조용매를 사용하여 동물췌장으로부터 고역가의 판크레아틴 및 판크레아틴을 조성하는 α-아밀라제, 푸로테아제, 리파아제등 각종 소화효소제를 대량 생산하는 제조방법에 관한 것이다.

의약용 원료로 사용되고 있는 판크레아틴(pancreatin)은 전분을 분해시키는 알파-아밀라제(α-amylase, 24,000 FIP/g), 카제인(casein)을 분해시키는 프로테아제(protease, 1,267 FIP/g), 및 지방을 분해시키는 리파아제(Lipase, 30,667 FIP/g)가 주요성분으로 구성되어 있다.

여기서 FIP는 1분 동안에 1 마이크로당량의 특정물질을 분해시키는데 필요한 효소의 양을 1 FIP 효소역가단위를 뜻한다. 동물중 특히 돼지췌장에는 위의 효소들이 다량 함유되어 있어 의약품의 소화효소제 원료로 사용되고 있으며 이들은 외국에서 전량 수입되고 있는바, 1996년도 기준 약 200톤(약 750만불)의 판크레아틴이 수입되었으며 약 120개 제약회사에서 140여 품목의 판크레아틴을 주성분으로하는 의약품을 발매중임을 감안하여 볼 때 향후 수입물량은 대단히 많아질 것이며 이로인한 외화소비량도 무시할 수 없는 금액인 것이다.

일반적으로 효소류의 본체는 단백질 또는 단백질과 다른 물질과의 복합체로 구성된 화학구조를 가지므로 특정효소를 분리 및 정제하기 위해서는 불순한 구성성분을 제거하여야 한다. 주요 불순물로는 지질(Lipid), 콜레스테롤의 비극성물질이 주로 함유되어 있고 소수의 극성물질도 함유되어 있다. 이때 특정효소를 분리, 정제하기 위하여는 여러 가지 시약을 사용하여야 하는바 이들에 의해 효소의 활성이 파괴될 수도 있으며, 구조내에는 반응을 쉽게 유도하는 산화환원 물질들이 효소의 활성을 저해시키기도 한다. 따라서 불안정한 구조를 가진 단백질은 정제과정에서 효소의 활성을 잃지 않도록 해야한다.

종래의 방법으로는 자가효소법, 리소짐(lysozyme)처리법, 기계적마쇄법, 삼투압차법, 동결용해법, 초음파처리법, 가압법, 화학적추출법 등에 의해 추출되어 왔으나, 이들 방법들은 복잡한 공정에 의한 비경제성과 효소의 불안정성 등에 의한 문제점을 가지고 있다.

특히 추출된 단백질의 농도는 묽기 때문에 농축조작이 요구되므로 효소단백질을 침전시키기 위해 널리 사용되고 있는 황산나트륨(Na₂SO₄), 황산암모늄((NH₄)₂SO₄) 등에 의한 염석법은 분획효과는 우수하나 염의 다량 함유로인한 탈염조작의 문제점이 있으며,

유기용매 침전제로 사용되는 에탄올(ethanol), 이소푸로판올(isopropanol) 또는 아세톤(acetone)등은 효소의 역가를 저하시키고 온도조절의 어려움이 있다. 그리고 흡착, 겔여과, 이온교환법에 의한 효소농축은 대량 생산이 어렵다는 결점이 있다.(참조, 미국특허 제3223594호, 공개특허 제91-12236호, 공개특허 제95-18450호)

본 발명은 상기와 같은 종래방법의 결점인 복잡한 공정, 효소의 변성, 저역가, 안정성문제 등을 해결하여, 간단한 조작공정으로 고역가의 효소안정성이 뛰어난 판크레아틴 및 소화효소제를 대량 생산할 수 있는 분리, 추출, 정제하는 방법을 개선, 안출하고자 함이다.

도 1은 본 발명의 제조공정개략도.

도 2는 본 발명의 제조공정에 따른 장치도.

주요부호에 대한 설명

1.가압가스탱크 2.냉온조 3.고압펌프

4.압력표시기 5.추출탑 6.온도감지기

7.압력조절기 8.분리조 9.가스미터기

10.열교환기 11.팽창코일 12.보조용매탱크.

본 발명의 동물췌장으로부터 판크레아틴 및 이에 함유된 소화효소제의 추출 및 제조공정의 기술적 구성을 요약하면,

동물췌장을 동결건조 및 분쇄한후, 동물췌장내의 지질 및 콜레스테롤류를 이산화탄소로 압력 50∼200 bar, 온도 30∼40℃ 조건하 1∼2시간 추출하여 제거하고, 추출잔사에 이산화탄소와 보조용매의 혼합물로 압력 50∼200 bar, 온도 30∼40℃ 조건하 2차 추출, 분리하여 단백질의 함량이 60∼85 %인 판크레아틴을 제조한다.

나아가 2차 추출하여 얻은 판크레아틴 원료를 계면활성제와 유기용매로 역미셀 추출정제하여 α-아밀라제, 푸로테아제 및 리파아제를 각각 분리제조하는 것이다.

본 발명에 있어서, 동물췌장으로는 주로 건강한 돼지를 도살하여 얻은 돼지췌장을 사용한다. 수집된 돼지췌장을 깨끗이 수세하여 지방과 피 등을 제거한다. 지방이 제거된 동물췌장을 -70℃로 냉동시킨후 보관토록 한다.

냉동된 췌장을 동결건조시켜 추출이 용이하도록 0.1∼2 mm 크기로 분쇄한다. 이때 수분함량을 2∼3 %가 되도록 유지하여야 작업이 편리하고 수율이 좋다.

이와같이 전처리된 동물췌장을 가압가스를 통과시켜 비극성 물질인 지질 및 콜레스테롤을 추출제거한다. 효소로 구성된 다량의 단백질과 함께 지질 및 콜레스테롤류등으로 결합되어 있으며 이 지질은 산화 또는 환원을 야기시키는 반응성물질로 효소단백질의 변성을 유발시킨다. 단백질의 변성 없이 지질 및 콜레스테롤류를 제거할 수 있을 경우 효소의 안정성 및 효소의 역가를 상승시킬 수 있는데, 물론 불순물인 지질등 비극성 물질은 종래의 방법인 속슬레트(soxhlet) 추출장치와 노말-헥산(n-hexane), 에탄올(ethanol) 또는 에텔(ether) 등을 추출용매로 하여 추출을 수행할 수 있지만 추출후 용매의 완전한 회수가 어려울뿐만아니라 효소단백질의 변성을 초래하므로, 본 발명에서는 가압가스를 용매로서 사용하여 지질 및 콜레스테롤을 추출제거하고 가압가스는 회수하므로서 유기용매추출로 인한 결점을 해결할 수 있었던 것이다.

본 발명에서 사용하는 가압가스로는 이산화탄소, 에틸렌, 에탄, 프로판, 아세틸렌 또는 암모니아가스등 효소에 변성을 주지 않는 범위내에 가스를 사용할 수 있으나 이중에서도 이산화탄소 가압가스의 사용이 효소의 안정성 면에서 가장 바람직하였다.

가압가스는 주어진 온도에서 포화압력(saturation pressure)에 도달하면 기체에서 액체로 변화게 되어 이상기체(ideal gas)에서 실제기체(real gas)로 물성이 바뀌게 된다. 포화압력 이상의 압력에서 가압가스는 밀도(density)가 증가된 비극성 유체로 되어 혼합물질내의 지질, 콜레스테롤류등 비극성물질들을 용해할 수 있는 용매력(solvating power) 증가와 일반적인 액체들에 비해 점도(viscosity)가 작아 빠른 이동특성과 확산능력을 수반하여 추출속도를 향상시킨다. 본 발명에서 수행시 추출온도는 10∼60℃이나, 수율고려시 30∼40℃가 가장 바람직하며, 추출압력은 50∼200 bar 조건이 수율이 좋으나 80∼130 bar 범위내가 더욱 바람직하였다.

가압 이산화탄소로 추출이 수행되면 효소단백질을 포함한 추출잔류물질은 추출탑에 남게 되고 비극성물질인 지질과 콜레스텔류는 이산화탄소와 함께 추출탑에서 분리조로 보내지게 되어 여기서 지질과 콜레스텔류는 분리제거되고 이산화탄소는 다음 공정을 위하여 회수되어 재사용하게 된다.

추출잔류물질(이하 추잔물질이라 한다)은 가압 이산화탄소와 보조용매로 2차 추출하게 되는데, 이때 보조용매로는 물 또는 에탄올중 에탄올이 좋은데 사용량은 이산화탄소와 약 10:1 비율로 혼합하여 사용하는 것이 좋다. 2차 추출시 보조용매(에탄올)만을 사용하여(유황 500ml/min) 순수단백질을 정제할 수 있다.

2차 추출시 온도와 압력은 1차 추출시와 동일하다.

이산화탄소는 1차 추출시와 마찬가지로 분리조로 보내어 회수되고 사용된 보조용매는 여과하여 재사용한다.

최종적으로 남은 단백질은 분리조에서 회수되고 단백질 함량 및 효소역가 등을 검정한 결과 고순도, 고역가의 판크레아틴임을 확인하였다.

2차 추출후 분리된 단백질은 판크레아틴으로서 이에 함유된 α-아밀라제, 푸로테아제, 리파아제 각각의 개개성분으로 분리할 수 있는바, 하기 표 1의 각각의 효소별로 계면활성제의 종류와 추출조건을 달리하는 역미셀 방법을 수행하여 간단히 수행할 수 있다.

* Forward extraction : 추출탑에 남아 있는 추잔물질을 수용액상에 용해시 켜 동물췌장의 효소를 표 1에 나타낸 추출조건으 로 추출한다.

* Backward extraction : Forward extraction에 의해 유기상으로 추출된 효 소를 표 1에 나타낸 추출조건하에서 효소를 역추 출 수용액으로 분리정제한다.

본 발명의 제조공정과 장치에 대하여 도면과 함께 설명하면 다음과 같다.

도 1은 본 발명의 제조공정개략도이고,

도 2는 본 발명의 제조공정에 따른 장치도로서, 주요부분에 대한 설명을 하면, 1은 가압가스탱크, 2는 냉온조, 3은 고압펌프, 4는 압력표시기, 5는 추출탑, 6은 온도감지기, 7은 압력조절기, 8은 분리조, 9는 가스미터기, 10은 열교환기, 11은 팽창코일이고 12는 보조용매탱크이다.

상기 장치구조는 용매저장고로부터 가압가스를 고압으로 전달시키는 압착장치, 추출온도를 일정하게 유지시키기 위한 열교환장치, 원료로부터 용매속으로 선택적인 물질이동이 일어나는 추출탑, 압력조절기를 통과하여 용매와 용질(추출물질)이 분리되는 분리조, 그리고 분리조를 통과하는 가압가스를 용매로 다시 사용케하는 재순환장치등으로 이루어진다. 본 발명장치에 사용된 수송관은 부식을 방지할 수 있는 스테인레스강-316을 사용하였으며, 또한 밸브, 필터류는 고압용 스테인레스강-316을 사용한다. 추출탑은 병열로 연결되어 생산량을 조절할 수 있으며, 분리조는 파이렉스 유리 또는 스테인레스강-316으로 제작된다. 가압가스는 원료내의 고분자, 휘발성 비극성 물질들을 추출할 수 있지만 극성물질 등을 추출하기 위해 보조용매를 투입한다.

본 발명에 따른 추출공정을 장치와 함께 개략적으로 설명하면, 추출용매인 가압가스가 탱크로부터 방출되어 냉온조(2)를 통과하는 동안 가압가스내의 기포가 제거되어 고압펌프(3)에 의해서 가압되어지며, 추출탑(5)내의 압력은 압력조절기(7)와 밸브에 의해 유지되어 압력표시기(4)에 나타내어진다. 주용매인 가압가스와 보조용매는 예열(preheat)되어 온도감지기(6)에 의해 추출탑에 유입되는 온도와 추출탑을 나가는 온도가 측정된다. 가압가스는 압력조절기에 의해 팽창되어 열교환기(10)를 통과하여 분리조(8)에서 추출물질을 침적시킨후 재사용되어 반복공정이 진행되게 되는 것이다.

이하 본 발명의 실시예를 구체적으로 기재한다.

실시예 1.

판크레아틴의 제조

(전처리공정)

건강한 돼지를 도살하여 췌장을 얻은후 깨끗이 수세하여 지방과 피등을 제거한다. 지방이 제거된 췌장을 미세하게 절편하여 -70℃의 냉동고에 넣고 보관한다. 냉동된 돼지췌장을 적당한 크기로 해서 -50℃, 10μHg 이하의 동결건조기에 넣고 3일정도 동결건조시킨다. 동결건조된 돼지췌장을 분쇄기로 마쇄한후 35 매쉬의 체로 친다. 이와같이 전처리된 돼지췌장의 수분이 2-3% 되게 유지하기 위하여 30℃의 항온건조기에서 24시간 방치한다. 향후, 수율관리를 위하여 수분 및 지질 등의 함량을 측정한다.

(동결건조된 돼지췌장으로부터 판크레아틴의 제조)

전처리된 돼지췌장 20g을 취해서 스테인레스강(SS-316) 재질의 75ml 용량의 추출탑에 넣은후 추출온도 40℃, 추출압력 103 bar 조건하에서, 고압펌프로 가압(유량: 150 ml/min, 압력용량: 500 bar)된 액체 이산화탄소를 유량 30∼100 ml/min로 1시간 통과시켜 추출하면 지질 및 콜레스테롤은 이산화탄소에 용해되어 추출탑에서 분리조로 이송되면서 열교환기에 의해 분리조에서 지질 및 콜레스테롤은 침적되어 이산화탄소와 분리제거되고 이산화탄소는 회수되어 재사용되어 반복공정이 진행된다. 분리조에서 수거된 지질이나 콜레스테롤은 제거정도를 확인하기 위하여 정성 및 정량분석한다.

상기 추출공정이 완료된후 추출탑에 남은 추출잔류물질(추잔물질)은 가압된 이산화탄소와 에탄올의 혼합용매로 이산화탄소 30∼100ml/min와 에탄올 3-10ml/min, 추출온도 40℃, 추출압력 103 bar 조건하에서 2차 추출하고 가압가스와 보조용매를 분리조에서 회수한후 최종 추출잔류물의 수분을 제거하고 초고속분쇄기로 분쇄하여 균일한 입자의 단백질 함량이 85%인 판크레아틴을 얻었다. 판크레아틴중의 단백질함량을 분석하기 위해서 단백질 검출법인 BCA 방법으로 562 nm에서 단백질의 흡광도를 측정하여 분석하였고(표 2 참조), 지질분석은 가스크로마트그라법으로 분석한결과 다음과 같았다(표 3 참조).

실시예 2-6.

실시예 1과 동일하게 실시하면서 추출온도만 10, 25, 30, 35, 50℃로 조절하여 수행한 결과 얻은 단백질함량 및 추출된 지질함량은 다음 표4와 같았다.

실시예 7.

실시예 1에서 얻은 추잔물질(판크레아틴 1g에 해당량)을 증류수에 용해시킨 용액과 효소추출용매로서 계면활성제 AOT(소디움디에틸헥실설포숙신에이트)를 유기용매인 이소옥탄(iso-octane)에 용해하여 얻은 역미셀 용액을, 약 1:1의 비율로 혼합하여 pH 4로 조정하고 0.1 mol 염화칼륨(KCl)를 첨가한후 교반하여 3000 rpm 10분간 원심분리하여 1차적으로 효소를 추출하고, 3차 증류수에 1 mol 염화칼륨(KCl)을 넣은후 pH 10의 역추출액을 제조하여 역추출액과 효소가 함유된 유기상을 1:1로 혼합한 다음 교반하여 3000 rpm에서 20분간 원심분리하여 2차적으로 효소를 역추출한 결과 α-아밀라제 47,333 FIP를 얻었다.

이어서, 계면활성제로 TOBAC(트리옥틸메틸암모늄클로라이드)를 사용하고, 1차 추출시 pH 7.5, 2차 역추출시 pH 3.5로 조정하는 외에는 위와 동일한 조건으로 추출하여 푸로테아제 3,652 FIP를 얻었고, 계면활성제로 CTAB(세틸트리메틸암모늄브로마이드)를 사용하고, 1차 추출시 pH 7.5, 2차 역추출시 pH 3.5로 조정하는 외에는 동일한 조건으로 추출하여 리파아제 76,905 FIP를 얻었다.

본 발명에 따라 제조된 판크레아틴의 효소함량과 국내의약품규격, 수입된 판크레아틴의 효소함량을 비교하여 표 5에 기재하였다.

상기 표5에서 알수 있듯이 기존국내에 수입되어지는 판크레아틴(pancreatin)의 소화효소역가대비 본발명에 따라 제조된 판크레아틴 소화효소역가가 약 1.8이상 증가되는 특징점을 발견할 수 있다.

따라서, 본 발명은 추출효율을 높여 고역가의 판크레아틴을 변성없이 대량 생산할 수 있어 원료의 수입대체효과, 폐자원활용등 의약품산업발전에 매우 유용한 발명임이 틀림없다.

Claims

돼지췌장을 동결건조 및 분쇄한후, 이산화탄소로 압력 50∼200 bar, 온도 30∼40℃의 조건하 1-2시간 추출하여 지질 및 콜레스테롤류를 제거하고, 추출잔류물에 이산화탄소와 에탄올의 혼합용매로 압력 50∼200 bar, 온도 30∼40℃의 조건하 2차 추출, 분리하여 단백질의 함량이 60∼85 %인 고역가의 판크레아틴을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 이산화탄소와 에탄올의 혼합비율이 10:1인 혼합용매로 판크레아틴을 제조하는 방법.
제1항에 따라 제조된 단백질의 함량이 60∼85%인 고역가의 판크레아틴 원료를 증류수에 용해시킨 용액과, 효소추출용매인 AOT(소디움디에틸헥실설포숙신에이트)와 이소옥탄의 역미셀 용액을, 1:1의 비율로 혼합하고 pH 4로 조정하고 염화칼륨을 첨가하여 1차 추출하고, 증류수에 염화칼륨을 첨가하고 pH 10으로 조절한 역추출액과 효소가 함유된 유기상을 1:1로 혼합한 다음 2차 역추출하여 α-아밀라제를 얻고,

나아가 상기 공정중 TOBAC, 1차 추출시 pH 7.5, 2차 역추출시 pH 3.5로 조정하여 푸로테아제를 얻으며,

상기 공정중 CTAB(세틸트리메틸암모늄브로마이드), 1차 추출시 pH 7.5, 2차 역추출시 pH 3.5로 조정하여 리파아제를 분리, 정제하는 방법.