CN106636039A - 一种菠萝蛋白酶的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种菠萝蛋白酶的提取方法,操作步骤为:1)预处理;2)酶解;3)等电点沉淀;4)超滤;5)干燥保存。有益效果为:将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理,能减少菠萝蛋白酶酶活力损失;采用的稳定剂能增强酶分子构象的稳定性,提高酶的贮藏稳定性;具有较好的抗氧化性,清除自由基,保护巯基;对重金属具有络合作用,防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性;最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准;操作步骤简单,成本低廉,适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白酶提取技术领域,具体是一种菠萝蛋白酶的提取方法。
背景技术
菠萝蛋白酶(bromelain,EC3.4.22.33)是存在于菠萝植株(包括果、茎、柄和叶片)中的蛋白水解酶,有多个同工酶,其活性中心含有巯基(-SH),所以属巯基蛋白酶。菠萝蛋白酶广泛用于医药、食品、化妆品、纺织、饲料、皮革等行业。它能分解纤维蛋白、血红蛋白等蛋白质,能在副作用较小的情况下使纤维蛋白和血凝块溶解,进而改善体液循环,增加组织通透性,导致炎症、水肿消退 ;与抗生素、化疗药物合用可促进药物对病灶的渗透和扩散,从而增强疗效。
蛋白质的提取纯化方法主要有盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、单宁 ( 鞣酸 )沉淀、离子交换层析、亲和层析、超滤浓缩等方法。菠萝蛋白酶的生产工艺主要有硫酸铵沉淀法、单宁沉淀法、超滤法等,这些方法都有其缺点 :硫酸铵沉淀法需要使用大量的硫酸铵,环境污染严重;单宁沉淀法所得的酶制剂难溶于水,酶活力低;超滤法所需设备投资大,菠萝汁超滤浓缩过程中黏度逐渐加大,超滤膜极易堵塞,因此生产周期长,提取收率低。
现有技术如授权公告号为CN103305492B的中国发明专利,公开了一种菠萝蛋白酶的制造方法,特别是一种高纯度医药级菠萝蛋白酶的提取方法。它包括以下步骤 :菠萝预处理、粗粉碎、酶解、榨汁、过滤、添加辅料、精过滤、添加稳定剂、吸附剂吸附、洗脱、超滤、冷冻干燥获得成品。该方法的优点在于:利用纤维素吸附法替换传统菠萝蛋白酶提取中高岭土吸附法、单宁沉淀法、有机溶剂萃取法,产率高、工艺简单、能耗低,所生产的菠萝蛋白酶酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。此外,吸附纤维素经洗脱再生后可以重复使用,能够极大的降低生产成本。但采用纤维素吸附,菠萝蛋白酶的提取率低,损失率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取率高、不采用有机溶剂,绿色环保,提取的菠萝蛋白酶纯度高,酶活力强,细菌和重金属含量很少的菠萝蛋白酶的提取方法。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:
一种菠萝蛋白酶的提取方法,具体步骤为:
1)预处理:将新鲜菠萝或菠萝茎清洗,预冷处理,预冷处理的温度为0~2℃,预冷时间为21~25h。粉碎,榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理,能减少菠萝蛋白酶酶活力损失;
2)酶解:在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂,带有果肉的菠萝汁:蒸馏水质量比为1:6~10。木质素酶加入量为0.2~0.4%,稳定剂的加入量为0.004~0.007%,pH为3.5~4.2,温度为38~43℃,酶解时间为3~3.4h,酶解结束后沸水浴灭酶,调节pH,加入0.3~0.5%纤维素酶和0.1~0.2%果胶酶,酶解温度为53~56℃,pH为2.7~3.2,酶解时间为2.0~2.3h。酶解结束后沸水浴灭酶,过滤。木质素酶将木质素水解,菠萝细胞失去支持,分散开来,增大与酶液的接触面积;纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁,使菠萝细胞质流出;果胶酶继续酶解细胞质,使菠萝蛋白酶分散在水溶液中,增大菠萝蛋白酶的提取率;
3)等电点沉淀:调节滤液pH值为9.5~9.6,搅拌,静置,过滤。pH为9.5~9.6时菠萝蛋白酶呈电中性,在水中的溶解度急剧下降,对菠萝蛋白酶作初步分离纯化;
4)超滤:沉淀中加入蒸馏水,超滤,先用6~8kDa的超滤膜超滤,取滤过液,再用0.9~1.2kDa的超滤膜超滤,取滞留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的杂质;对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩,减短干燥时间,节省能源;
5)干燥保存:将滞留液旋蒸浓缩,于-40~-50℃冷冻干燥,研磨,加入稳定剂,稳定剂:菠萝蛋白酶粉末体积比为1:300~400,搅拌,得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
优选的,稳定剂成份及其重量份为:110~20份B-1稳定剂、0.004~0.005份茄红素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亚硫酸和0.001~0.003份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用,隔离氧和水,同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧,能防止巯基被氧化,形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性;蛋白质相互作用区域隔离了水,降低了自由能,使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高;具有较好的抗氧化性,清除自由基,保护巯基;叶酸和茄红素通过偏亚硫酸、EDTA起到促进对重金属的络合作用,防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性。
优选的,用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种调节溶液pH。不会引入重金属或其他会抑制菠萝蛋白酶活性的物质,调节pH效果好。
与现有技术相比,本发明的优点在于:将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理,能减少菠萝蛋白酶酶活力损失;木质素酶将木质素水解,菠萝细胞失去支持,分散开来,增大与酶液的接触面积;纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁,使菠萝细胞质流出;果胶酶继续酶解细胞质,使菠萝蛋白酶分散在水溶液中,增大菠萝蛋白酶的提取率;采用的稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用,隔离氧和水,同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧,能防止巯基被氧化,形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性;蛋白质相互作用区域隔离了水,降低了自由能,使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高;具有较好的抗氧化性,清除自由基,保护巯基;对重金属具有络合作用,防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性;最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准;操作步骤简单,成本低廉,适合大规模生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
一种菠萝蛋白酶的提取方法,具体步骤为:
1)预处理:将新鲜菠萝或菠萝茎清洗,预冷处理,预冷处理的温度为0~2℃,预冷时间为21~25h。粉碎,榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理,能减少菠萝蛋白酶酶活力损失;
2)酶解:在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂,带有果肉的菠萝汁:蒸馏水质量比为1:6~10。木质素酶加入量为0.2~0.4%,稳定剂的加入量为0.004~0.007%,pH为3.5~4.2,温度为38~43℃,酶解时间为3~3.4h,酶解结束后沸水浴灭酶,调节pH,加入0.3~0.5%纤维素酶和0.1~0.2%果胶酶,酶解温度为53~56℃,pH为2.7~3.2,酶解时间为2.0~2.3h。酶解结束后沸水浴灭酶,过滤。木质素酶将木质素水解,菠萝细胞失去支持,分散开来,增大与酶液的接触面积;纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁,使菠萝细胞质流出;果胶酶继续酶解细胞质,使菠萝蛋白酶分散在水溶液中,增大菠萝蛋白酶的提取率;
3)等电点沉淀:调节滤液pH值为9.5~9.6,搅拌,静置,过滤。pH为9.5~9.6时菠萝蛋白酶呈电中性,在水中的溶解度急剧下降,对菠萝蛋白酶作初步分离纯化;
4)超滤:沉淀中加入蒸馏水,超滤,先用6~8kDa的超滤膜超滤,取滤过液,再用0.9~1.2kDa的超滤膜超滤,取滞留液。先后去除分子量大于6~8kDa、分子量小于0.9~1.2kDa的杂质;对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩,减短干燥时间,节省能源;
5)干燥保存:将滞留液旋蒸浓缩,于-40~-50℃冷冻干燥,研磨,加入稳定剂,稳定剂:菠萝蛋白酶粉末体积比为1:300~400,搅拌,得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
稳定剂成份及其重量份为:10~20份B-1稳定剂、0.004~00005份茄红素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亚硫酸和0.001~0.003份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用,隔离氧和水,同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧,能防止巯基被氧化,形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性;蛋白质相互作用区域隔离了水,降低了自由能,使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高;具有较好的抗氧化性,清除自由基,保护巯基;对重金属具有络合作用,防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性,以上实验数据呈非线性,所产生的优异效果其结果有待验证。
用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种调节溶液pH。不会引入重金属或其他会抑制菠萝蛋白酶活性的物质,调节pH效果好。
实施例2:
一种菠萝蛋白酶的提取方法,最优选步骤为:
1)预处理:将10kg新鲜菠萝或菠萝茎清洗,预冷处理,预冷处理的温度为1℃,预冷时间为22h。粉碎,榨汁。将菠萝或菠萝茎先进行预冷处理,能减少菠萝蛋白酶酶活力损失;
2)酶解:在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂,带有果肉的菠萝汁:蒸馏水质量比为1:7。木质素酶加入量为0.4%,稳定剂的加入量为0.006%,pH为4.0,温度为40℃,酶解时间为3.4h,酶解结束后沸水浴8min灭酶,调节pH,加入0.5%纤维素酶和0.1%果胶酶,酶解温度为55℃,pH为3.0,酶解时间为2.2h。酶解结束后沸水浴8min灭酶,过滤。木质素酶将木质素水解,菠萝细胞失去支持,分散开来,增大与酶液的接触面积;纤维素酶破坏菠萝细胞的细胞壁,使菠萝细胞质流出;果胶酶继续酶解细胞质,使菠萝蛋白酶分散在水溶液中,增大菠萝蛋白酶的提取率;
3)等电点沉淀:用1M氢氧化钠调节滤液pH值为9.55,搅拌,静置,过滤。pH为9.55时菠萝蛋白酶呈电中性,在水中的溶解度急剧下降,对菠萝蛋白酶作初步分离纯化;
4)超滤:沉淀中加入蒸馏水,超滤,先用7kDa的超滤膜超滤,取滤过液,再用1kDa的超滤膜超滤,取滞留液。先后去除分子量大于7kDa、分子量小于1kDa的杂质;对菠萝蛋白酶溶液去盐浓缩,减短干燥时间,节省能源;
5)干燥保存:将滞留液旋蒸浓缩,于-46℃冷冻干燥,研磨,加入稳定剂,稳定剂:菠萝蛋白酶粉末体积比为1:320,搅拌,得到菠萝蛋白酶。最后得到的菠萝蛋白酶的酶活力、细菌含量、重金属含量、外观等指标达到或超过医药级标准。
稳定剂成份及其最优选重量份为:12份B-1稳定剂、0.004份茄红素、3份EDTA、0.003份偏亚硫酸和0.002份叶酸。巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基是菠萝蛋白酶催化活性必需基团。酶分子的构象和催化部位的微环境的变化均影响酶的催化活力。上述稳定剂对菠萝蛋白酶有包埋作用,隔离氧和水,同时和蛋白质形成氢键。由于隔离了氧,能防止巯基被氧化,形成的氢键增强了酶分子构象的稳定性;蛋白质相互作用区域隔离了水,降低了自由能,使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高;具有较好的抗氧化性,清除自由基,保护巯基;对重金属具有络合作用,防止重金属抑制菠萝蛋白酶的活性。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于以下步骤:
1)预处理:将新鲜菠萝或菠萝茎清洗,预冷处理,粉碎,榨汁;
2)酶解:在带有果肉的菠萝汁中加入蒸馏水、木质素酶和稳定剂,酶解结束后灭酶,加入纤维素酶和果胶酶,酶解,酶解结束后灭酶,过滤;
3)等电点沉淀:调节滤液pH值,搅拌,静置,过滤;
4)超滤:沉淀中加入蒸馏水,超滤;
5)干燥保存:将滞留液旋蒸浓缩,冷冻干燥,研磨,加入稳定剂,搅拌,得到菠萝蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤1中预冷处理的温度为0~2℃,预冷时间为21~25h。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤2中带有果肉的菠萝汁:蒸馏水质量比为1:6~10。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤2中木质素酶加入量为0.2~0.4%,pH为3.5~4.2,温度为38~43℃,酶解时间为3~3.4h;纤维素酶和果胶酶的加入量分别为0.3~0.5%和0.1~0.2%,酶解温度为53~56℃,pH为2.7~3.2,酶解时间为2.0~2.3h。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤2和步骤5中稳定剂成份及其重量份为:10~20份B-1稳定剂、0.004~0.005份茄红素、2~5份EDTA、0.002~0.005份偏亚硫酸和0.001~0.003份叶酸。
6.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤3中用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或多种调节溶液pH为9.5~9.6。
7.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤4中先用6~8kDa的超滤膜超滤,取滤过液,再用0.9~1.2kDa的超滤膜超滤,取滞留液。
8.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤2中稳定剂加入量为0.004~0.007%,步骤5中稳定剂:菠萝蛋白酶粉末体积比为1:300~400。
9.根据权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的提取方法,其特征在于:所述的步骤5中冷冻干燥温度为-40~-50℃。
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