KR19990022369A - 어뎁터 단백질/티로신 카이나제 상호작용을 방해하는 조성물과그 방법 - Google Patents

어뎁터 단백질/티로신 카이나제 상호작용을 방해하는 조성물과그 방법 Download PDF

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KR19990022369A
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제랄드 맥마혼
쥐. 데이비스 헤리스
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스테판 이반스-프레크
서젠, 인크.
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Abstract

본 발명은 어뎁터 단백질/단백질 티로신 카이나제 단백질 상호작용은 저해하는 조성물과 그 방법에 관계하는데 특히, 이들 상호 작용은 세포 증식성 질환과 연관된 SH2와 SH3를 포함하는 어뎁터 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 단백질 티로신 카이나제와 관계한다. 특히 본 발명은 특정 화합물, 특히, 퀴나졸린 유도체 화합물과 이 화합물을 이용하는 방법에 관계한다.

Description

어뎁터 단백질/티로신 카이나제 상호작용을 방해하는 조성물과 그 방법
2.1. 단백질 포스포릴화반응과 시그날 유도.
세포는 이들의 즉각적인 환경으로부터 자극을 수용하기 위한 수단으로 세포외 분자를 의지한다. 이와 같은 세포외 시그날은 분화, 접촉성, 분비, 세포분열, 접촉저해성, 대사와 같은 다양한 세포 공정을 정확하게 조정하기 위해 필수적이다. 세포외 분자에는 특정 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 리간드로써 호르몬, 성장인자, 림포킨, 또는 신경전달물질을 포함한다. 이들 수용체에 리간드가 결합함으로써 일련의 연속적인 반응을 촉진시켜 고유 자극을 증폭시키거나 전술한 것과 같이 별도의 세포 공정에 추가하여, 수용체와 이들의 세포외 리간드는 바이러스-수용체 상호작용, 염증과 암 상태로 세포 변형 등과 같은 비정상적인 또는 유해한 공정에도 관여한다.
이와 같은 공정의 주요 특징인 시그날 유도(Posada, J. and Cooper, J.A., 1992, Mol. Biol. Cell 3:583-592; Hardie, D.G., 1990, Symp. Soc. Exp. Biol. 44:241-255)는 특정 단백질의 가역적인 포스포릴화 반응이다. 아미노산의 포스포릴화 또는 디포스포릴화는 이들의 생물학적 특징을 변경시킬 수 있는 조절 단백질에서 형태적인 변화를 촉진시킨다. 단백질은 단백질 카이나제에 의해 포스포릴화되고 단백질 포스포타제에 의해 디포스포릴화된다. 단백질 카이나제와 포스포타제는 이들이 작용하는 아미노산 잔기에 따라 분류하는데 이중 하나가 세린-트레오닌 카이나제와 포스포타제로써 세린과 트레오닌 잔기에 작용하고(Scott, J.D. and Soderling, T.R., 1992, 2:289-295) 다른 한 종류로는 티로신 카이나제와 포스포타제로써 티로신잔기에 작용한다(Fischer, E.H. et al., 1991 Science 253:401-406). 단백질 카이나제와 포스포타제는 수용체로써 정의될 수 있는데 예를 들면 호소는 막통과의 일부분, 리간드-결합분자 또는 비수용 체로써, 이들은 리간드-결합된 수용체에 의해 작용함으로써 간접적으로 세포외 분자에 반응한다는 의미이다. 포스포릴화 반응은 포스포릴화 반응과 디포스포릴화 반응이 경쟁하고, 주어진 순간에 포스포릴화 반응 수준과 이들 반응을 촉매 하는 단백질 카이나제와 포스포타제의 수준은 관견 활성을 반영하는 동적인 공정이다.
단백질 포스포릴화과정의 대부분은 레린과 트레오닌 아미노산 잔기에서 일어나는 반면에, 티로신 잔기에서도 포스포릴화반응이 일어나고 상당한 정도로 관심을 끄는데 이는 많은 온코겐 생성물과 성장 인자 수용체가 고유의 단백질 티로신 카이나제 활성을 보유하고 있다는 발견에 기초한다. 성장인자 시그날 유도와 세포과정 진행 그리고 신조직 형성 형질 변형에서 단백질 티로신 포스포릴화의 중요성은 이미 알려진바 있다(Cantley, L.C. et al., 1991, Cell 64:281-302; Hunter T., 1991, Cell 64:249-270; Nurse, 1990, Nature 344:503-508; Schlessinger, J. and Ullrich, A., 1992, Neuron 9:383-391; Ullrich, A. and Schlessinger, J., 1990, Cell 61:203-212). 정상적인 성장인자 제어 과정의 파괴는 온코겐 형성을 유도하고 이는 상당 부분이 주요 온코겐 단백질로 구성된 단백질 티로신 카이나제의 활성 또는 과다발현이 원인이 되는 것으로 나타났다(Hunter, T., 1991, Cell 64:249-270).
2.2. 단백질 티로신 카이나제.
단백질 티로신 카이나제는 많은 성장 인자 수용체와 잠재적인 온코진을 포함하는 상당히 큰 단백질로 구성되는데 이들은 고유의 세린/트레오닌 특이적인 단백질 카이나제를 공유하나 실제 상당히 다르다(Hanks et al., 1988, Science 241:42-52).
막경유 위상을 가지는 수용체-형 단백질 티로신 카이나제는 상당히 연구가 된 바 있다. 수용체 단백질 티로신 카이나제의 세포외 도메인에 특이적 리간드의 결합으로 수용체 이량체형성과 이들의 고유 티로신 잔기의 포스포릴화반응을 유도하는 것으로 보인다. 수용체의 세포질 도메인의 개벽 포스포티로신 잔기는 세포질 시그날 분자 발생 분자와 상호작용 하는 특이적인 결합부위로 작용하여 다양한 시그날 유도 결로를 활성화시킨다(Ullrich, A. and Schlessinger, J., 1990, Cell 61:203-212).
세포내, 세포질, 비-수용체 단백질 티로신 카이나제는 소수성 막경유 도메인을 포함하지 않는 단백질 티로신 카이나제로 넓게 정의할 수 있다. 이와 같은 광의의 분류 내에, 공지의 세포질 단백질 티로신 카이나제는 11개의 별도 형태별로 분류할 수 있는데 SRC족 (Martinez, R. et a., 1987, Science 237:411-414, Sukegawa, J. et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:41-47; Yamanishi, Y. et al., 1987, 7.273-243; Marth, J.D. et al., 1985, Cell 43:393-404; Dymecki, S.M. et al., 1990, Science 247:332-336); FES족 (Ruebroek, A.J.M. et al., 1985, EMBO J. 4:2897-2903; Hao, Q. et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:1587-1593); ABL족 (Shtivelman, E. et al., 1986, Cell 47:277-284; Kruh, G.D. et a., 1986, Science 234:1545-1548); Zap70족 그리고 JAK족을 포함한다. 이들의 전반적인 분자 구조에서 차이가 있으면서 세포질 단백질 티로신 카이나제의 이들 형태별 족의 각 구성원을 촉배성 카이나제 도메인을 공유하면서 비-촉매성 도메인도 공유한다. 이와 같은 비-촉매성 도메인을 SH2 도메인 (SRC homology domain 2; Sadowski, I. et al., Mol. Cell. Biol. 6:4396-4408; Koch, C.A. et al., 1991, Science 252:668-674)과 SH3 도메인 (Mayer, B.J. et al., 1988, Nature 332:269-272)이다. 이와 같은 비-촉매성 도메인은 시그날 유도 동안에 단백질-단백질 상호작용의 조절에 중요한 것으로 보인다(Pawson, T. and Gish, G., 1992, Cell 71:359-362).
세포질 단백질 티로신 카이나제의 대사적 역할은 수용체형 단백질 티로신 카이나제의 것보다는 잘 밝혀지지 않고 있으나, 이들 분자류가 연관된 일부 공정을 밝히는데 상당한 진보가 있었다. 예를 들면 Src족의 구성원, lck, fyn은 CD4/CD8 그리고 T세포 수용체 복합체와 상호 작용을 하여 T세포 활성화에 연루되고(Veillette, A. and Davidson, D., 1992, TIG 8:61-66), 특정 세포질 단백질 티로신 카이나제는 세포과정의 특정상에 연결되고 (Morgan, D.O. et al., 1989, cell 57: 775-786; Kipreos, E.T. et al., 1990, Science 248:217-220; Weaver et al., 1991, Mol. Cell, Biol. 11:4415-4422) 그리고 세포질성 단백질 티로신 카이나제는 신경 발생에 연루되었다(Maness, P., 1992, Dev. Neurosci 14:257-270). 돌연변이를 통한 카이나제 활성의 미제어 또는 과다발현은 세포 형질 변형의 기작에 대해 잘 밝혀져 있다(Hunter et al., 1985, supra: ullrich et al., supra).
2.3. 어뎁터 단백질
어뎁터 단백질은 시그날 유도 경로에서 중요한 특징이 보존된 펩티드 도메인(SH2/SH3 도메인)을 가지는 세포내 단백질이다. 이와 같은 어뎁터 단백질은 단백질 티로신 카이나제에 연결되는 작용을 하는데 특히, RAS 시그날 형성 경로와 같은 하류 세포내 시그날 형성 경류에 수용체-형 단백질 티로신 카이나제를 연결시킨다. 이와 같은 어뎁터 단백질은 혈장 막 또는 세포하위 격실에서 정확한 부위에 시그날 유도 단백질을 위치시키는 것에 관계하고 세포 내에 단백질 이동을 조정하는데 연관된 것으로 보인다.
이와 같은 어뎁터 단백질은 수용체-형 단백질 티로신 카이나제의 단백질 기질 중에 하나이고, 이들은 상대적으로 긴 약 100개 아미노산이 공통적으로 하나 또는 두 개 복사체를 가진다. 이와 같은 모티프는 c-Src-형 세포질에서 확인되었는데 비-수용체 티로신 카이나제는 Src 동질성 2(SH2) 도메인으로 칭하는 곳에서 확인하였다. SH2-포함 폴리펩티드는 다른 것과 비교할 때 구조적으로 그리고 기능적으로 상이하다 (Koch, C.A. et al., 1991, Science 252:668-674). SH2 도메인을 직접적으로 포스포릴화된 티로신 아미노산 잔기를 인지한다. 펩티드 도메인을 포스포티로신 잔기주변의 아미노산 잔기를 인지하는 독립적인 부분을 가진다.
수용체 단백질 티로신 카이나제는 세포외 리간드에 결합하여 수용체 이량체 형성을 유도하고, 이는 다시 이량체 형성된 카이나제의 세포간 자가 포스포릴화를 유도한다(Schlessinger, J. and Ullrich, A., 1992, Neuron 9: 383-391). 따라서 수용체 포스포릴화는 수용체 단백질이 결합할 수 있는 SH2-결합부위를 만든다.
SH2 펩티스 도메인에 추가하여, 시그날 유도에 연관된 어뎁터 단백질의 대부분에 50-75개 아미노산 잔기의 제 2보존된 모티프, SH3 도메인(Schlessinger, J. and Ullrich, A., 1992, Neuron 9:383-391; Pawson, T. and Gish, G.D., 1992, Cell 72:359-362; Mayer, B.J. and Baltimore, D., 1993, Trends in Cell Biol. 3 8-13; Mayer, B.J. et al., 1988, Nature 352:272-275)을 포함한다. SH2의 역할에 대해 공지된 것과 비교하면 SH3 도메인의 생물학적 역할에 대해서는 많이 알려지지 못했다. 현재로는 SH3 도메인의 기능을 시그날을 세포 표면으로부터 ras와 같은 하류 효과인자 유전자로 시그날을 연결시키는 작용을 하는 단백질-결합 도메인으로 보인다(Pawson, T. and Schlessinger, J., 1993 Current Biology, 3:434-442).
2.4. G-단백질과 시그날 유도.
구아닌-뉴클레오티드-결합 단백질(G-단백질; Simon) 예로써 Ras(for review, see Lowy, D.R. and Willumsen, B.M. 1993, Ann Rev. Biochem. 62:851-891)는 수용체 티로신 카이나제로부터 세포 분열성 시그날의 전달에 필수적인 역할을 하는 것으로 보인다. Ras를 예로 들자면, 리간드 결합에 의한 수용체 티로신 카이나제의 활성화는 Ras분자의 활성 GTP 결합형으로 축적된다(Gibbs, J.B. et al., 1990, J. Biol.. Chem. 265:20437-2044; Satoh, T. et al., 1990, Proc. NaTl. Acad, Sci. USA 87:5993-5997; Li, B.-Q. et al., 1992, Science 256:1456-1459; Buday, L. and Downward, J., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:1903-1920; Medeman, R.H. et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:155-162). Ras 활성화는 바이러스성 온코겐 티로신 카이나제에 의한 형질 변환에 요구된다(Smith, M.R. et al., 1986, Nature 320:540-43).
Ras 활성은 GTPase-활성화 단백질(GAPs)와 구아닌 뉴클레오티드 교환 인지의 반작용과 Ras에서 GTP 가수 분해의 느린 고유 속도를 GAPs가 지극하고 교환인자는 Ras에서 GTP에 대한 GDP의 기본적인 교환 속도를 자극함으로써 조절된다. 따라서, GAPs는 Ras기능의 음성 조절물질로써 작용하는 반면에 고환인자는 Ras 작용 물질로 작용한다.
최근에, 활성화된 수용체 티로신 카이나제와 Ras사이에 직접적인 연결은 단일 SH2와 두 개 SH3 도메인으로 구성된 26KDa 단백질인 포유류 GRB-2 단백질이 포유류와 초파리에서 Ras 교환인자 Sos에 수용체 티로신 카이나제에 직접적으로 됨을 발견하여 밝혀졌다(Buday, L. and Downward, J., 1993, Celll 73:611-620; Egan, S.E. et al., 1993, Nature 363:45-51; Li, N. et al., 1993, Nature 363:85-87; Gale, N.W. et al., 1993, Nature 363:88-92; Rozakis-Adcock et al., 1993, Nature 363:83-85; Chardin, P. et al., 1993, Science 260;1338-1343; Oliver, J.P. et al., Cell 73:179-191; Simon, M.A. et al., 1993, Cell 73:169-177). GRB-2 SH2 도메인은 수용체 티로신 카이나제에서 특이적인 티로신 포스포릴화된 서열에 결합하고 반면에 GRB-2 SH3 도메인은 Sos 교환인자에 있는 프롤린-풍부한 서열에 결합한다. 따라서 수용체 카이나제에 GRB-2의 결합으로 인하여 Ras가 위치해 있는 혈장막에 Sos의 재모집을 허용한다(Schlessinger, J., 1993, TIBS 18:273-275).
Grb2는 다른 단백질 가운데 CSF-1 수용체(vanderGeer and Hunter, 1993, EMBO J. 12(13):5161-5172), PDGF 수용체(Li et al., 1994, MCB 14(1):509-517), EGF-R(mATUOKA ET AL., 1993, embo j. 12(9):3467-3475)와 Fak(Schlaepfer et al., 1994, Nature 372:786-791)와 연관된 것으로 보인다.
2.5. 세포 증식성 질환
성장인자와 이들의 수용체는 정상적인 발생에도 중요하나 세포 형질 변환, 온코젠형성, 암을 포함하는 세포 증식성 질환을 유도하는 온코진으로써 작용한다. 단백질 티로신 카이나제와 같은 정상적인 세포 단백질의 온코젠 발생 활성은 단백질의 효소적 활성의 변경, 다른 세포 성분에 이들의 부적절한 결합 등에 의해 발생될 수 있다.
필라델피아 염색체-양성 사람 백혈병을 예로 들면, BCR-ABL 온코단백질은 이와 같은 백혈병의 병인형성에 연관이 있는 것으로 밝혀졌다. BCR-ABL 은 조절 안된 티로신 카이나제 활성을 나타낸다. 이는 최근에 BCR-ABL이 GRB-2 어뎁터 단백질을 포함하는 SH2/SH3 도메인에 결합한다는 것을 설명하였다(Pendergast, A.M. et al., 1993, Cell 75:175-185) 또한 BCR-ABL/GRB-2 결합은 GRB-2 SH2 도메인과 BCR-ABL 단백질의 포스포릴화된 부분의 직접적인 상호 작용에 의해 증가되고 Ras 시그날 형성 경로의 활성화에는 이와 같은 상호작용이 요구된다.
따라서, 전술한 백혈병의 형태와 같은 세포 증식성 질환의 최종적인 발현에 요구되는 것으로 보이는 시그날 유도 과정에는 많은 사건이 있다. 온코젠성 세포 증식성 질환을 치료하는 방법은 이와 같은 요구된 사건의 하나 이상을 간섭함으로써 이와 같은 질환이 출현하는데 기여하는 단기 비정상적인 시그날 유도에 의해 유도된다.
비정상적인 카이나제 활성의 개선은 세포 증식성 질환에 연관된 카이나제의 효소 활성을 직접적으로 방해하고 표적화 시킴으로써 간섭될 수 있다. 특정 화합물은 이와 같은 항-티로신 카이나제 활성을 가지는 것으로 제안하고 있다(See, for example, Levitzki and Gazit, 1995, Science 267:1782-1788). 이때 특정 퀴나졸린 유도체는 직접적으로 수용체 티로신 카이나제 효소적 활성을 저해하는 것으로 보인다.
소요의 시그날 유도 과정이 어뎁터 단백질/단백질 티로신 카이나제 상호 작용과 연관이 있는 경우에, 이와 같은 상호 작용의 저해는 세포 증식성 질환 증상의 개선을 유도한다. 이와 같은 방식을 이용하여 세포에서 시그날 형성 인컴피턴드 단백질의 발현을 이용하면 설명할 수 있다. 예를 들면, GrB2의 결합에 필수적인 티로신 잔기가 경여된 Bcr-Ab1의 돌연변이형을 발현하여 더 이상 시그날 인컴피턴트가 아닌 세포는 형질 전환된 표현형(REP)을 나타낸다(Pendergast at al., supra). 그러나 현재까지 어덥터 단백질/단백질 티로신 카이나제 상호 작용의 저해물질에 대해서는 확인되지 않았다.
3. 발명의 요약
본 발명은 어뎁터 단백질/단백질 티로신 카이나제 단백질 상호작용을 저해하는 방법과 조성물에 관계하는데 이때, 어덥터 단백질 족을 포함하는 SH2-와 SH3 구성원과 복합체를 형성할 수 있는 단백질 티로신 카이나제와 연관된 이와 같은 상호 작용은 세포 증식성 질환과 연관된다. 특히, 본 발명은 특정 유기 화합물과 이와 같은 화합물을 이용하는 방법에 관계한다.
단백질 티로신 카이나제는 PTK로 약칭한다. PTK는 다른 말이 없는 한 막 경유, 수용체-형 단백질 티로신 카이나제 또는 세포질성 단백질 티로신 카이나제를 말한다. 본 발명의 화합물은 PTK/어뎁터 단백질 상호작용 특히 PTK가 상피 성장 인자 수용체(EGF-R) 단백질 티로신 카이나제 분자, 혈소판 유도된 성장인자 수용체(PDGF-R) 단백질 티로신 카이나제 분자 또는 인슐린 성장 인자-형 수용체 티로신 카이나제 분자(IGF-1R)인 경우의 PTK/어뎁터 단백질 상호작용을 방해한다.
본 발명의 화합물은 다음의 화학식 I로 나타낸다.
ID 2,5-비신돌일-3-일-1,4-퀴논과 이의 제약학적 염
이때, R1과 R2는 각각 H, 아세테이트, 아릴, 알킬일과 고차 알킬산 에스테르이고; R3내지 R14는 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리 할로메틸, 아미드, 카르복사이드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노와 멀캅토이고 이는 적정위치에서 치환될 수 있다.
본 발명의 범위 내에 특정 화합물은 하기 화학식 2로 설명된다. 이때 R1과 R2는 다음의 표 1에 나타내었다. 실시 예에서 이들 화합물의 준비와 분리에 대해 설명한다.
실시예 R1 R2
1. H 2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)
2. 아세틸 2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)
3. 아세틸 2-(3-메틸-n-부틸)
4. H 2-(3-메틸-n-부틸)
5. H 5-브로모
6. H 2-알릴
7. H 2-n-프로필
8. H 2-아미노 카르보닐
9. 아세틸 2-아미노 카르보
10. 벤조일 2-알릴
11. H 2-시아노
12. H 4-메톡시카르보닐
13. H 5,7-디메톡시
14. H 4,7-디메톡시
15. H 5-니트로
16. H 4-(4-클로로벤조일아미노)
17. H 4-(4-클로로페닐)
18. H 4-(4-클로로페닐)
19. H 4,6-디메톡시
20. H 5-하이드록시-6-메톡시
21. H 4-시아노
22. H 5-(4-트리플로로메틸페닐 아미노카르보닐
23. H 2-(4-트리플로로메틸페닐 아미노카르보닐
24. H 2-에틸
25. H 5-니트로
26. OMe 2-(2-메틸무트-2-en-4-yl)
27. OMe 2-(3-메틸-n-부틸)
본 발명의 범위 내에 특이적인 화합물은 하기 화학식 3으로 나타낼 수 있다. 화학식에서 R1-R12는 다음의 표 2에 나타내었다. 실시 예에서는 이들 화합물의 준비 또는 분리에 대해 상술하고 있다.
Ex. R1=R2 R11 R12 R3-R101
28. H 2-(3-메틸-n-부틸 2-(3-메틸-n-부틸)
29. H 2-메틸 2-메틸
30. H 2-에틸 2-에틸
31. H 2-부틸 2-부틸
32. H 2-(but-1-en-4-yl) 2-(but-1-en-4-yl)
33. H 2-(4-메틸-n-펜틸) 2-(4-메틸-n-펜틸)
34. H 2-페닐에틸 2-페닐에틸
35. H H 2-(3-메틸-n-부틸
36. H 2-에틸 2-에틸 R5=R9=카르복시
37. H 2-(n-프로필) 2-(n-프로필) R5=R9=카르복시
38. H 2-(3-메틸-n-부틸) 2-(3-메틸-n-부틸) R5=R9=카르복시
39. H 2-(4-카르복시-n-부틸) 2-(4-카르복시-n-부틸)
40. H H 2-(3-메틸-n-부틸) R5=카르복시
41. H 2-에틸 2-에틸 R5=R9=아미노
42. H 2-(n-프로필) 2-(n-프로필) R5=R9=아미노
43. H 2-(3-메틸-n-부틸) 2-(3-메틸-n-부틸) R5=R9=아미노
44. 아세틸 2-(3-메틸-n-부틸) 2-(3-메틸-n-부틸)
45. H 2-에틸 2-에틸 R5=R9=(4-메틸페닐-설포닐아미노)
46. H 2-(n-프로필) 2-(n-프로필) R5=R9=(4-메틸페닐-설포닐아미노)
47. H 2-(3-메틸-n-부틸) 2-(3-메틸-n-부틸) R5=R9=(4-메틸페닐-설포닐아미노)
48. H 2-(2-메틸부트-1-en-4-yl) 2-(2-메틸부트-1-en-4-yl)
49. H 2-(2-메틸펜트-2-en-5-yl) 2-(2-메틸펜트-2-en-5-yl)
다른말이 없는한 R3-R10은 수소
여기에서 사용된 것과 같은 알킬은 메틸, 에틸, 이소프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-아밀, 이소아밀, n-헥실, n-옥틸 및 n-데실와 같은 1개 내지 20개 탄소원소를 가지는 직쇄 또는 분지쇄 사슬 포화된 탄화수소기를 말하고; 알케닌와 알키닐은 비닐, 알릴, 프로파르길, 1-메틸비닐, 부트-1-에닐, 부트-2-에닐, 부트-2-닐, 1-메틸부트-2-에닐, 펜트-1-에닐, 펜트-3-에닐, 3-메틸부트-1-닐, 1,1-디메틸알릴, 헥스-2-에닐과 1-메틸-1-에틸알릴과 같은 2내지 10개 탄소원자를 가지고 이중 또는 3중 결합이 있는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 사슬 탄화수소기를 말하고; 알킬아릴은 벤질, 페네틸, 페노프로필, 1-벤질에틸, 페노부틸과 2-벤질프로필과 같은 페닐기에 의해 치환된 전술한 알킬기; 여기에서 이용된 알릴은 한 개 고리 또는 두 개 고리를 포함하고 이때, 적어도 한 개 고리는 방향족 또는 이형-방향족 탄화수소를 포함하는 방향 족이고; 하이드록시-알킬은 2-하이드록시에틸, 2-하이드록시프로필, 3-하이드록시프로필, 4-하이드록시부틸, 1-하이드록시부틸과 6-하이드록시헥실과 같은 한 개 하이드록실기에의해 치환원 전술한 알킬기를 의미한다.
여기에서 이용된 치환원은 해당기에 할로겐, 하이드록시, 시아노, 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 아미노, 니트로, 멀캅토, 카르복시와 본 기술 분야에 공지의 다른 치환체를 포함하나 이에 국한되지 않은 하나 이상의 치환체를 가진다.
본 발명의 적절한 화합물에는 다음을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물로 구성된 제약학적 조성물과 본 발명의 화합물 또는 제약학적 조성물을 이용하여 동물에서 특히 사람에서 단백질 티로신 카이나제/어뎁터 단백질 상호작용이 연관된 세포 증식성 질환의 증상을 개선시키는 것을 포함한다.
본 발명은 상술한 화합물이 단백질 티로신 카이나제 효소적 활성에 저해 활성을 나타내지 않으면서 티로신 포스포릴화된 EGF 수용체에 SH2 함유 펩티드의 결합을 막는다는 발견에 기초한다. 이와 같은 발견을 나타내는 데이터는 실시예 6, 7, 8에 나타내었다. 실시예 5에서는 본 발명의 화합물을 생산하는 방법에 관계한다.
본 발명은 어뎁터 단백질과 단백질 티로신 카이나제 분자사이에 상호작용을 막을 수 있는 화합물의 발견에 기초한다.
본 발명은 어뎁터 단백질/포스포티로신 상호작용을 방해하기 위한 조성물과 그 방법에 관계하고 특히, 이들 상호작용은 세포 증식성 질환과 연관된 어뎁터 단백질 족을 포함하는 SH2 도메인과 복합체를 이룰 수 있는 단백질 티로신 카이나제와 관계한다. 특히, 본 발명은 특정 유기 화합물과 이와 같은 화합물을 이용하는 방법에 관계한다.
세포 증식성 질환과 연관된 상호 작용과 같은 어뎁터 단백질/단백질 티로신 카이나제 단백질 상호 작용을 방해하는 조성물과 그 방법에 대해서 상술한다. 특히, 특정 유기 화합물, 이 화합물을 합성하는 방법, 이와 같은 화합물을 이용하는 기술에 대해서 상술하고 있다.
4.1. 화합물
본 발명의 화합물은 다음의 화학식 4에 의해 설명할 수 있다.
이때, R1과 R2는 각각 H, 아세테이트, 아릴, 알킬일과 고차 알킬 산 에스테르이고; R3 내지 R14는 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사이드, 카르복시, 설포닐, 설포아미드, 아미노와 멀캅토이고 이는 적정위치에서 치환될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물의 알킬기는 하나 또는 2 이상의 카르복시 또는 아릴기로 치환된다. 본 발명 화합물의 알케닐기는 하나 이상의 카르복시기로 치환된다. 본 발명의 범위 내에 특정 화합물은 상기 표 1과 2에 나타내었다. 이와 같은 화합물의 준비 또는 분리는 실시 예에서 상술한다.
한 구체 예에서 본 발명의 화합물의 화학식 3과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 나타낼 수 있는데 이때 R1과 R2는 각 수소, 저가알킬, 아세틸, 아릴, 알킬아릴 또는 고차 알킬산 에스테르이고 이때 R1과 R2중 적어도 하나는 H가 아니고;
R3 내지 R12는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아닐, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 얼캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R11과 R12중 적어도 하나는 2-메틸부트-2-en-4-yl이다. R1-R12기는 적절한 위치에서 치환될 수 있다.
또다른 구체 예에서 본 발명의 화합물은 화학식 3과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 설명되는데 이때 R1과 R2는 모두 수소이고;
R3내지 R10은 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복스아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고; 이때 R11과 R12는 각 H 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R11와 R12중 적어도 하나는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고; 이때 R3 내지 R10중 적어도 하나는 H가 아니다.
또다른 구체 예에서 본 발명의 화합물의 화학식 3과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 나타낼 수 있는데 이때, R1과 R2는 각 아세틸, 아릴, 알킬아릴 또는 고차 알킬산 에스테르이고; R3 내지 R12는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미도, 멀캅토이다.
또다른 구체 예에서 본 발명의 화합물의 화학식3과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 나타낼 수 있는데 이때, R2, R11과 R12는 수소이고; R3 내지 R10은 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R3 내지 R10중 적어도 하나는 H가 아니고;
a) R4-R10이 H일 때, R3은 2-메틸부트-2-en-r-yl 또는 2-하이드록시-2-메틸부트-4-yl이 아니고;
b) R4-R6과 R8-R10이 각 H일 때, R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
c) R3-R4, R6-R8와 R10은 H일 때, R5와 R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl 또는 3-메틸-n-부틸이 아니고;
d) R3, R5, R7, R9-R10이 H일 때, R4와 R8은 모두 2-메틸부트-2-en-4-yl 또는 2-메틸부트-1,4-디엔-4-yl이 아니고 그리고 R4와 R8은 2-메틸부트-2-en-4-yl과 2-메틸부트-1,4-디엔-4-yl이 아니다.
본 발명은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염을 포함하고 이때 R3-R5와 R7-R9는 H이거나 R6 또는 R10은 2-메틸부트-2-en-4-yl이다.
또다른 구체 예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 이때,
R1과 R2중 적어도 하나는 아세틸이고;
R11과 R12중 H이고; 그리고
R3과 R10은 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬알릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설포아미드, 아미노와 멀캅토이고 이때
a) R1와 R2가 모두 아세틸인 경우 모든 R1과 R2중 하나가 아세틸이고, R3-R4, R6-R8과 R10-R12가 H인 경우, R5와 R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl 아니고;
b) R1과 R2가 아세틸이고, R4-R6과 R8-R10은 H인 경우 R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
c) R1과 R2가 모두 아세틸이고, R3, R5-R7, R9-R10이 H인 경우, R4와 R8은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니다.
또다른 구체 예에서 본 발명의 화합물은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 염으로써 이때
R1과 R2중 적어도 하나는 저가 알킬이고;
R11과 R12는 H이고; 그리고
R3 내지 R10은 각각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콜시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설포아미드, 아미노와 멀캅토이고 이때,
a) R1과 R2 모두 메틸인 경우 R3 내지 R10의 적어도 하나는 H이외의 기가 되고;
b) R1과 R2는 메틸이고 R4-R10이 H인 경우, R3은 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
c) R1과 R2가 메틸이고 R4-R6과 R8-R10이 H인 경우, R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
d) R1과 R2가 메틸이고, R3-R4, R6-R8과 R10이 H인 경우, R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니다.
본 발명은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염을 포함하고 이때 R4는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3과 R5-R10은 H이고; 또는
R5는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3-R4와 R6-R10은 H이고; 또는
R6는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3-R5와 R7-R10은 H이다.
또다른 구체 예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염에 대해 상술하고 있는 때 이때 특정 유기 화합물과 이와 같은 화합물을 이용하는 방법에 관계한다.
이때, R1과 R2는 각각 H, 아세테이트, 아릴, 알킬일과 고차 알킬 산 에스테르이고;
R3 내지 R10는 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토, 4-메틸페틸설포닐아미노 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고
R11과 R12는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 알릴, 알킬아릴, 알킬카르복시, 알케닐카르복시, 부트-1-en-4-yl, 2-메틸부트-1-en-4-yl, 4-메틸-n-펜틸, 2-페닐에틸, 2-메틸펜트-2-en-4-yl와 4-카르복시-n -부틸이고 이때 R11과 R12중 적어도 하나는 H가 아니다.
또다른 구체 예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염으로 이 때; R1과 R2는 각 수소, 저자 알킬, 아세틸, 아릴, 알킬일과 고차 알킬 산 에스테르이고; R3 내지 R10은 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할메틸, 아미드, 카르복사이드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멜칸톤, 4-메틸페닐설포닐아미노 또는 2-메킬부트-2-en-4-yl이고 R11과 R12는 모두 3-메틸-n-부틸이다.
본 발명의 또다른 구체 예에서, 본 발명의 화합물은 화학식 3의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염이고 이때 R1과 R2는 각 수소, 저가 알킬, 아세틸, 아릴, 알킬일과 고차 알킬산 에스테르이고; R3내지 R10 은 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사이드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멜캅토, 4-메틸페닐설포닐아미노 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3내지 R10 중 적어도 하나는 수소가 아니고; R11 과 R12는 각 수소 또는 3-메틸-n-부틸이다.
본 발명은 상기 설명한 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물은 여기에서 상술한 것과 같이 합성되거나 분리될 수 있다.
본 발명의 화합물은 이용 가능한 출발 물질을 이용하고 표준 유기 화학에 따라 합성될 수 있다. 또는 5.2에서 상술하는 것과 같이 화합물을 분리할 수 있다. 화학적 합성과 분리 방법은 설명을 위함이다. 이들 방법에 다양한 변화는 본 기술분야에 공지의 것이다.
4.2 화합물의 생산
4.2.1 천연 생성물의 분리
본 실시 예에는 곰팡이 배양물(PenLabs Inc #1592)를 이용하고 발효조건은 다음과 같다; 효모 맥아 즙과 미량 원소를 배지로 하여 22℃에서 배양하였다. 접종 배지는 만니톨 60.0g:콩즙 12.5g, 시트르산 2.5g, 효모 추출물 0.5g,H2O로 구성되고1l로 조정하였다. 접종 배지의 pH는 250ml플라스크(28℃ 6일간)에 분배하고, 포자/균사체 균질 용액 1ml에 접종하였다(2일간). 보존 배양 물은 포자 저장 용액에서 -80℃로 냉장 유지시킨다.
발효 혼합물(균사 체와 육즙)은 균질화 시키고 흡입 여과에 의해 올이 성긴 무명 천을 통하여 여과시킨다. 여과 물은 0.5v/v에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸 아세테이트 층은 복합시키고 용매는 회전 증발에 의해 제거한다. 균사 체는 0.4v/v에틸 아세테이트로 2회 추출한다. 에틸 아세테이트 층은 복합시키고 용매는 회전 증발에 의해 제거한다. 아스테리퀴논을 포함하는 오일 잔류 층은 복합시키고 진공 펌프를 통하여 하룻밤동안 건조시킨다.
상기 수득한 추출물은 PC Inc의 트리플 코일 칼럼을 포함하는 고속 역류 크로마토그래피(HSCC)에서 CPC분류를 한다. n-헥산, 에틸 아세테이트, 메탄올, 물을 1:3:3:3(v/v/v/v)으로 혼합시키고 하룻밤 동안 가라앉힌다. 정지상태인 하층은 HSCC 칼럼으로 펌프하고 상층은 이동 상으로 이용한다. 2시간 후에 상층과 하층을 바꾼다. HSCC는 4시간 후에 종료된다. 8내지 12분 사이에 대사물질이 용출된다. 활성부붐을 모우고 감압하에서 기화시켜 건조시킨다.
모아진 HSCC부분(8-12)는 다음과 같은 조건을 이용하여 반-준비된 HPLC(Millennium 소프트웨어를 이용하여 Water 996 광배열 감지기가 있는 Water HPLC 시스템) 분류를 한다;
2개 반-준비성 C18-카트릿지 (25 X 100㎜ Nova Pak, 6μ); 유속; 10 ㎖/min; DMSO 6㎖에 용해된 수득원 HSCC부분 8-12 250 ㎕; 270㎚에서 모니터한 PDA; 30분 이상 70% H2O/30% CH3CN 내지 100% CH3CN의 선형 농도 경사; 6분간 100% CH3CN에서 이소크래틱; 활성 물질은 19와 24분에 용출된다; 10회 운영에서 얻은 활성부분을 복합시키고 감압하에서 기화시켜 건조시킴으로써 17㎎ 아스테리퀴논 C-3 (화합물 1)과 3㎎ 프레아스테리퀴논 C-3 (화합물 2)을 생성한다.
질량 스펙트럼은 PE Sciex LS-MS 모델 API III(Ion Spray)에서 기록하고, 고해상도에서 (HR-FAB) 정확한 질량 분석을 실행한다. 화합물 1의 질량 스펙트럼 분석에서 507 (M+H)+분자이온 (분자량: 506)이 나왔다. 분자식 C32H31N2O4(M++H); 507.2289; 실제치 507.2291). Brucker DRX-500을 이용하여 500MHZ에서 CDCl3에서 화합물 1의1H NMR 스펙트럼을 기록하였다. 내부 표준으로써 7.26 ppm (CDCl3)에서 용매피크를 이용하여 0ppm에서 TMS에 대해 화학적 변이를 ppm에 나타내었다. 화합물 1: 8.18 (s, 2H), 8.05 (s, 2H), 7.35-7.10 (m, 8H), 5.40 (m. 2H), 3.45 (m. 4H), 1.81 (s, 6H) and 1.75 ppm (s, 6H) 화합물 1의13C NMR 스펙트럼은 Brucker DRX-500을 이용하여 125 MHz에서 DMSO-d6에서 기록하였다. 내부 표준으로써 39.5ppm (DMSO-d6)에서의 용매 피크를 이용하여 0에서 TMS에 대한 화학적 변이를 ppm에서 나타내었다. 138.8, 136.6. 136.3, 128.8, 128.2, 127.3, 122.3, 121.8, 121.0, 120.3, 119.5, 119.3, 112.3, 111.8, 111.6, 105.2, 102.2, 27.3, 26.4 and 18.5 ppm 화합물 1은 융점이 150-154℃였다.
화합물 2에 대한 질량 스펙트럼 분석에서 439 (M+H)+(분자량: 438) 분자 이온을 제공한다. 화합물 2의 'H NMR 스펙트럼을 Brucker DRX-500을 이용하여 500MHz에서 DMSO-d6에서 기록하였다. 내부 표준으로써 2.49 ppm (DMSO-d6)에서 용매 피크를 이용하여 0ppm에서 TMS에 대해 화학적 변이를 제공하였다. 11.35 (s, 1H), 10.96 (s, lH), 10.62 (s, 1H), 7.48 (dJ=1 Hz, 1H), 7.39 (d, J=10.0 Hz, 1H), 7.29 (d, J= 10.0Hz, 1H), 7.14 (d, J= 10 Hz, 1H), 7.07 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 6.99 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 6.93 (t, J=10.0 Hz, 1H), 6.88 (t, J= 10.0 Hz, 1H), 6.93 (t, J=10.0 Hz, 1H), 6.88 (t, J=10.0 Hz, 1H), 5.26 (m, 1H), 3.30(m, 2H) 1.64 (bs, 3H) and 1.61 ppm (bs, 3H). 화합물 2의13C NMR 스펙트럼은 Brucker DRX-500상에서 125MHz 에서 CDCl3상에서 기록하였다. 내부 표준으로써 77.0 ppm (CDCl3)에서의 용매 피크를 이용하여 0 ppm에서 TMS에 대해 화학적 변이를 ppm으로 나타내었다. 138.4, 138.3, 135,7, 135.2, 127.7, 121.6, 120.0, 119.8, 119.6, 110.7, 110.6, 100.5, 26.8, 25.8 and 18.0 ppm.
4.2.2 화합물 합성
실시예 1
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논
상업적으로 이용할 수 있는 2,4-디브로모-3,6-디하이드록시-1,4-퀴논과 Fisher 인돌 합성에 의해 준비된 180mg 3-[2-(2-메틸부트-2-en-4yl)인돌에서 만들 수 있는 2,5-디아세록시-3,6-디브로모-1,4-퀴논 또는 3,6-디브로모-2,5-디트리메틸실옥시-1,4-퀴논, 3,6-디브로모-2,5-디이소부트릴옥시-1,4-퀴논, 2,5-디벤질옥시-3,6-디브로모-1,4-퀴논 또는 2,5-디알릭옥시카르보닐옥시-3,6-디브로모-1,4-퀴논과 같은 다른 적절한 보로된 퀴논 100mg과 10ml 무수 디메틸포름아미드 또는 피리딘 또는 디메틸설폭시드 혼합물과 분말현 탄소 칼륨염을 24시간 동안 100℃에서 가열하였다. 냉각된 혼합물은 에틸 아세테이트와 물로 분류된다. 에틸 아세테이트층은 염으로 세척하고, 황산나트륨에서 건조시켜 여과시키고 농축시킨다. 생성물은 디클로메탄과 메탄올 용매 환합물에서 중간 압력 액체 크로마토그래피 칼럼에서 정제하여 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논 25 mg을 제공한다. 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논은 1N 수용성 수산화나트륨/메탄올 용액으로 가수분해시킨다. 상기 혼합물의 산성화 반응은 여과 후에 생성물을 만든다. 추가 에탄올과 물에서 결정화 반응에 의해 상기 표제 화합물을 얻는다. 다른 전술한 보호기는 희석된 산, 플로오르 칼륨 또는 팔란디움(0) 복합체 또는 수소와 탄소에서 팔란디움과 같은 통상적인 탈보로 방법에 의해 또는 Greene와 Wuts에 의해 설명된 방법(Protective groups in organic synthesis, John Wiley and Son, 1991)에 의해 제거될 수 있다.
또한 유사한 조건하에, 100℃에서 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드에서 탄산 칼륨과 산화알루미늄 존재 하에 테트라브로모-1,4-퀴논은 과량의 인돌과 반응시켜 치환된 2,5-디브로모-3,6-(3-인돌인)-1,4-퀴논을 만들고 이는 수산화나트륨과 같은 염기와 반응하여 치환된 2,5-디하이드록시-3,6-(3-인돌일)-1,4-퀴논을 제공한다(Hoerher, J.: Schwenner, E.; Franck, B., Liebigs Ann. Chem. 1986, 10: 1765-1771).
실시예 2
2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 1에 따라 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논을 준비하였다.
실시예 3
2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논/메탄올을 수소 1기압 하에서 탄소상의 5% 팔란디움으로 수소화 반응에 의해 상기 화합물이 생산된다.
실시예 4
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 1에서 상술하는 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논의 염기 가수분해로 상기 화합물을 만들다.
실시예 1내지 4에서 상술한 것과 유사한 조건하에 시발물질로써 2,5-디브로모-3,6-디하이드록시-1,4-퀴논 또는 2,3,5,6-테트라브로모퀴논을 이용하여 다음과 같은 화합물을 준비할 수 있다.
실시예 5
3,6-디-[5-(브로모)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논
실시예 6
3,6-디-[2-(알릴)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논
실시예 7
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(n-프로필)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 8
3,6-디-[2-(아미노카르보닐)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논
실시예 9
2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 10
3,6-디-[2-(알릴인돌-3-yl]-2,5-디벤조일옥시-1,4-퀴논
실시예 11
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(시아노)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 12
2,5-디하이드록시-3,6-디-[4-(메톡시카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 13
2,5-디하이드록시-3,6-디-[5,7-(디매톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 14
2,5-디하이드록시-3,6-디-[4,7-(디메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 15
2,5-디하이드록시-3,6-디-[5-(니트로)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 16
3,6-디-[4(4-클로로벤조일아미노)인돌-3-yl]-2,5-이다히드록시-1,4-퀴논
실시예 17
3,6-디-[2-(4-클로로페닐)인돌-3-yl]-2,5-이다히드록시-1,4-퀴논
실시예 18
2,5-디하이드록시-3,6-디-(2-클로로페닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 19
2,5-디하이드록시-3,6-디-(4,6-[디메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 20
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(5-하이드록시-6-메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 21
2,5-디하이드록시-3,6-디-[4-(시아노)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 22
2,5-디하이드록시-3,6-디-[5-(4-트리플로로메틸페닐아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 23
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(4-트리플로로메틸페닐아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 24
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(에틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 25
3,6-디-[2-(5-브로모-6-니트로)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논
실시예 26
2,5-디메톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-n-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 1을 디메틸포름아미드에 요오드 메틸과 탄산 칼륨으로 메틸화 반응후 정제과정에 의해 표제 화합물을 얻는다. 이 화합물은 분말형 탄산 칼륨 존재 하에 2,5-디브로모-3,6-디[2-(2-메틸부트-2-en-4yl)인돌-3-y]1,4-퀴논/메탄욜을 가열하여 준비할 수 있다.
실시예 27
2,5-디메톡시-3,6-디-[2(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
실시예 3에서 상술한 조건하에 실시예 26의 화합물을 수소화 반응시켜 표제 화합물을 만든다.
실시예 28
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-브틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
자석 교반기가 갖추어진 2-(3-메틸-n-부틸)인돌(400mg)), 브로마닐(431mg)와 탄산칼륨(703mg)을 포함하는 유리 튜브에 디메틸포름아미드(10mg)을 첨가한다. 혼합물은 40시간동안 실온에서 교반시킨다. 1N HC1 (100ml)로 희석시킨 후에 혼합물은 에틸 아세테이트 (200ml)로 추출한다. 유기 층은 소금물(100ml)로 세척하고 황산 나트륨으로 건조시킨다. 감압하에 용매를 제거하에 잔유물은 30% 에틸 아세테이트/헥산으로 용출시킴으로써 순간 실리카 짧은 플러그를 통하여 여과시킨다. 용매는 감압하에 제거하고, 잔유물은 순간 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제하여 청색 고체 결정으로써 2,5-디브로모-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논 (40mg, 7%)을 만든다.
2,5-디브로모-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논(40mg)/메탄올(1,5ml) 교반 용액에 2N 메탄올성 수산화나트륨 (0.251ml)을 첨가한다. 용액은 24시간동안 실온에서 교반시킨다음 물(50ml)로 희석한다. 생성물은 에틸 아세테이트(100ml)로 추출하고 소금물(50ml)로 세척하고 황산 나트륨으로 건조시킨다. 감압하에서 용매를 제거하여 황색 고체 결정의 2,5-메톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논(30mg, 90%)을 제공한다.
2,5-디메톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논(9mg)/에탄올(2ml) 교반 용액에 1N 수용성 수산화칼륨 (1ml)을 첨가한다. 혼합물은 3,5시간동안 85℃에서 가열하고 1N HCl (25ml)로 희석한다. 생성물은 에틸 아세테이트(50ml)로 추출하고, 소금물(25ml)로 세척하고 황산 나트륨으로 건조시킨다. 용매는 감압하에서 제거하여 적갈색 고체 결정으로 2,5-메톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논(8mg)을 제공한다.
28a)2-(2-메틸-1-부텐-4-yl)인돌의 준비
질소 하에 2-메틸인돌(1g)/디에틸에테르(76ml) 교반용액에 주사기를 통하여 서서히 한방울씩 n-부틸리튬/헥산 (14.3ml) 1.6N을 첨가한다. 포타슘 테트-부톡시드(1.711g)을 첨가하여 밝은 황색 혼합물을 만든다. 50분간 질소 하에 실온에서 교반하여, 혼합물은 -78℃로 냉각시키고, 주사기를 통하여 3-브로모-2-메틸프로펜 (1.54 ml)을 한 방울씩 떨어뜨려 적-오렌지 용액을 제공한다. 반응 혼합물은 2시간동안 -78℃로 교반시키고, 물(10ml)로 담금질한다. 실온으로 상승시킨 후에, 물(150ml)와 1N HCl (1ml)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시킨다. 혼합물을 에틸 아세테이트(250ml)로 추출하고 유기층은 소금물(100ml)로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시킨다. 용매는 감압하에서 제거하고 잔유물은 순간 크로마토그래피(4% 에틸 아세테이트/헥산)으로 정제하여 유연한 황색 고체인 2-(2-메틸-1-부텐-4-yl)인돌(664mg, 47%)을 얻는다.
28b) 2-(3-메틸-n-부틸)인돌의 준비
질소하에 세 가지 밑둥근 플라스크에 목탄(771 mg)에 5% 팔라디움 촉매를 넣는다. 프라스크에 2-(2-메틸-1-부텐-4-yl)인돌(671mg)/에탄올 (36㎖) 용액을 수수로 2회 충진한 프라스크내에 넣는다. 혼합물은 2시간 동안 수소(atm)하에 교반시키고 Celite 패드를 통하여 여과시킨다. 용매는 감압하에서 제거하고, 잔유물은 순간 크로마토그래피(3% 에틸아세테이트/헥산)으로 정제하여 황색고체 결정의 2-(3-메틸-n-부틸)인돌(400㎎, 59%)을 얻는다.
실시예 29
2.5-디하이드록시-3,6디-[2-(메틸)인돌-3-yl]-1.4-쾨논의 준비
출발 인돌로써 2-메틸인돌을 이용하여 실시예 28을 참조한다.
실시예 30
3.6-디-(2-에틸인돌-3-yl)-2.5-디하이드록시-1.4-퀴논
출발 인돌로써 2-에탄인돌을 이용하여 실시예 28을 참조한다.
30a) 2-에틸인돌의 준비
알킬화제로써 요오드 메틸을 이용하여 28a)를 참조
실시예 31
3,6-디-(2-부틸인돌-3-yl)2.5-디하이도록시-1,4-퀴논의 준비
출발인돌로써 2-부틸인돌을 이용하여 실시예 28을 참고한다.
31a) 2-(부트-1-en-4-yl)인돌의 준비
알킬화제로써 브롬화 알릴을 이용하여 28a)를 참조하다.
31b) 2-부틸인돌의 준비
출발물질로써 2-(부트-1-en-yl)인돌을 이용한 28b)를 참조한다.
실시예 32
3.6-디-[2-(부트-1-en-yl)인돌-3-yl]2.5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 2-(부트-1-en-4-yl)인돌을 이용한 실시예 28을 참조한다.
실시예 33
2.5-디하이드록시-3.6-디-[2-(4-메틸-n-펜틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논의 준비
출발인돌로써 2-(4-메틸-n-펜틸)인돌을 이용하여 실시예 28을 참조한다.
33a) 2-(2-메틸-2-펜틸-5-yl)인돌의 준비 알킬화제로써 4-브로모-2-메틸-2-부텐을 이용하여 28a)를 참조한다.
33b) 2-(4-메틸-n-펜딜)인돌의 준비
출발물질로써 2-(2-메틸-2-펜텐-5-yl)을 이용하여 28b)를 참조한다.
실시예 34
2.5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-페닐에틸)인돌-3-yl]-1,40-퀴논
출발인돌로써 2-(2-페닐에틸)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고한다.
34a) 2-(2-페닐에틸)인돌의 준비
알킬화제로써 브롬화 벤질을 이용하여 28a)를 참고한다.
실시예 35
2.5-디하이드록시-6-(인돌-3-yl)-3-{2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논.
디메틸포름아미드에서 탄산칼륨존재하에 2-(3-메틸-n-부틸)인돌을 브라마닐 2당량으로 처리하고 실시예 28 에서와 유사한 정제에 의해 이를 합성할 수 있다. 생성된 모노-인돌일 부가 생성물은 전술한 동일 조건하에 인돌 2 당량으로 처리하여 비스-인돌일 생성물을 제공한다.
실시예 36
3,6-디-(5-카르복시-2-에틸인돌-3-yl)-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발인돌로써 5-카르복시-2-에틸인돌을 이용하여 실시예 28을 참고한다.
36a) 5-카르복시-2-에틸인돌을 준비
이 합성은 5-클로로-2-메틸인돌로 시작하여 메틸 인돌로 알킬화시킨다(28a 참조). 생성물 염화인 돌은 Grignard 종으로 전환하고 이산화탄소에 노출되어 합성이 종료된다.
실시예 37
3,6-디-[5-카르복시-2-(n-프로필)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 5-카르복시-2-프로필인돌을 이용하여 실시예 28을 참조한다.
37a) 5-카르복시-2-프로필인돌의 준비.
알킬화제로써 요오드화 에틸을 이용하여 36a)를 참고한다.
실시예 38
3,6-디-[5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논
출발인돌로써 5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고로 한다.
38a) 5-카르복시-2-(2-메틸-1-부텐-4-yl) 인돌의 준비
알킬화제로써 3-브로모-2-메틸프로펜을 이용하여 36a)를 참고한다.
38b) 5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸)인돌의 준비
출발물질로써 5-카르복시-2-(2-메틸-1-부텐-4-yl)를 이용한 28b)를 참고한다.
실시예 39
3,6-디-[2-(4-카르복시-n-부틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발인돌로써 2-(4-카르복시-n-부틸)이돌을 이용하여 실시예 28 을 참고로 한다.
39a) 2-(4-카르복시-3-부텐-1-yl)인돌의 준비
출발물질로써 2-(4-카르복시-3-부테-1-yl)인돌을 이용하여 28b)를 참고로 한다.
실시예 40
3-[5-카르복시-2(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-6-(인돌-3-yl)-1,4-퀴논의 준비
제 1 단계에서 5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸) 인돌을 이용하여 실시예 35를 참고한다.
실시예 41
3.6-디-(5-아미노-2-에틸인돌-3-yl)-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 5-아미노-2-에틸인돌을 이용하여 실시예 28을 참고로 한다.
41a) 5-아미노-2-에틸인돌의 준비
Yokoyama; Tannaka; Yamane; Kurita; Chem. Lett.; 7: 1991: 1125-1128 에서 언급한 것과 같이 질산나트륨과 황산을 이용하여 2-에틸인돌의 표준 니트로화반응으로 출발하여 시작할 수 있다. 생성된 5-니트로-2-에틸인돌을 28b)에서와 같이 촉매 수소화반응을 이용하여 소요의 아미노 화합물로 환원될 수 있다.
실시예 42
3,6-디-[5-아미노-2-(-프로필)인돌-3-yl]2,5-디하이록시-1,4-퀴논의 준비
42a) 5-아미노-2-(n-프로필)인돌
2-n-프로필인돌을 이용한 41a)를 참고한다.,
실시예 43
3.6-디-[5-아미노-2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 5-아미노-2-(3-메틸-n-부틸)을 이용한 실시예 28을 참고한다.
43a) 5-아미노-2-(3-메틸-n-부틸)인돌의 준비
2-(3-메틸-n-부틸)인돌을 이용한 41a)를 참고한다.
실시예 44
2.5-디아세톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논의 준비
피리딘 존재하에 2,5-하이드록시-3,6-디[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4- 퀴논을 아세트 무수물로 처리하여 이를 합성할 수 있다.
실시예 45
3,6-디-[2-에틸-5-(4-메틸페닐설포닐아미노)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 2-에틸-5-(4-메틸페닐솔포닐 아미노)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고한다.
45a) 2-에틸-5-(4-메틸페닐솔포닐아미노)인돌의 준비
상기 화합물은 트리에틸아민존재하에 5-아미노-2-에틸인돌을 p-톨루엔설포닐클로라이드로 처리하여 합성할 수 있다.
실시예 46
2,5-디하이드록시-3,6-디-[5-(4-메틸페닐설포닐아미노)-2-(n-프로필)인돌-3-yl]-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 5-(4-메틸페닐솔포닐 아미노)-2-(n-프로필)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고한다.
46a) 5-(4-메틸페닐솔포닐아미노)-2-(n-프로필)인돌의 준비
5-아미노-2-프로필인돌을 이용하여 45a)를 참고한다.
실시예 47
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)-5-(4-메틸페닐설로닐아미노)인돌-3-yl]-1,4-퀴논의 준비
출발 인돌로써 2-(3-메틸-n-부틸)-5-(4-메틸페닐솔포닐아미노)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고로 한다.
47a) 2-(3-메틸-n-부틸)5-(4-메틸페닐솔포닐아미노)인돌의 준비
5-아미노-2-(3-메틸-n-부틸)인돌을 이용하여 45a)를 참고한다.
실시예 48
2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-1-en-4-yl)인돌-3-yl]-1,4-퀴논의 준비
출발물질로써 2-(2-메틸부트-1-en-4-yl)인돌을 이용하여 실시예 28을 참고로 한다.
4.3. 단백질 티로신 카이나제/어뎁터 단백질 복합체
본 발명의 방법과 조성물에 의해 파괴될 수 있는 PTK/어뎁터 단백질 복합체는 하기에서 상술한 것과 같이 PTK족 단백질중 적어도 하나의 구성원과 어뎁터 단백질의 적어도 하나의 구성원으로 구성된다. 표준 생리학적 조건하에서, 이와 같은 복합체의 성분은 다른 PTK/어뎁터 단백질 복합체 성분중 하나 이상에 안정한 비-공유 결합을 할 수 있다. 적절하게는 본 발명의 화합물은 PTK/어뎁터 단백질 복합체를 저해하는데 이때 PTK 성분은 상피 성장 인자(EGF-R) 단백질 티로신 카이나제 분자, 혈소판 유도된 성장인자 수용체(PDGF-R) 단백질 티로신 카이나제 분자 또는 인슐린 성장인자-유사 수용체 티로신 카이나제 분자(IGF-1R)이다.
PTK/어뎁터 단백질 복합체의 세포내, 세포질 PTK성분은 src, yes, fgr, fyn, lyn, hck, lck blk분자와 같은 Src족; fes, fer와 같은 Fes족; abl와 arg와 같은 Abl족; jak1와 jak2와 같은 Jak족을 포함한다. PTK/어뎁터 단백질 복합체의 막경유, 수용체 PTK성분은 FGF수용체, Sevenless/ROS, 인슐린 수용체, PDGF수용체 그리고 성장인자 수용체의 EGF 수용체와 같은 분자를 포함한다.
PTK/어뎁터 단백질 복합체의 어뎁터 단백질 성분은 하나 이상의 SH2 그리고/또는 하나 이상의 SH3 비-촉매성 도메인으로 구성된다. 전술한 것과 같이 PTK성분으로써 SH2와 SH3 도메인이 어뎁터 단백질의 일부가 된다. PTK/어뎁터 단백질 복합체의 성분인 어뎁터 단백질은 p85, c-CrK SHC, NcK, ISGF3α, 구아닌 트리포스포타제 활성물질 단백질 (GAP)와 GRB1, GRB-2, GRB-3, GRB-4, GRB-7와 GRB-10와 같은 GRB 아족 단백질 구성원을 포함한다.
4.4. PTK/어뎁터 단백질 복합체로 세포 증식성 질환의 치료.
본 발명의 화합물 또는 제약학적 조성물(하기 4.4.2에서 상술한)은 세포 증식성 질환의 치료에 이용되는데 이는 어뎁터 단백질의 SH2-와 SH3- 포함하는 족의 구성원과 복합체를 형성할 수 있는 PTK에 관계한다.
본 발명의 화합물은 PTK/어뎁터 단백질 복합체와 연관된 세포 증식성 질환의 치료에 적절하게 이용될 수 있는데 이때 PTK성분은 EGF-R, PDGF-R, MCT 또는 IGF-1R이다.
본 발명의 화합물에 의해 치료할 수 있는 온코겐 질환에는 BCR-ABL-관련된 암(예를들면, 만성 골수성 및 급성 임파성 백혈병), 신경교종, 신경교아종, 흑색종, 사람 난소암, 사람 유방암 (특히 HER-2/GRB-7 연관된 사람 유방암) 그리고 사람 전립선암이 있다.
PTK/어뎁터 단백질의 분포에서 화합물의 효과를 결정하는 검사는 4.4.1에서 상술한다. 환자에게 본 발명의 화합물 또는 제약학적 조성물을 투여하는 방법은 4.4.2에서 상술한다.
여기에서 사용하는 것과 같이 파열은 PTK/어뎁터 단백질 복합체 성분의 물리적인 분리와 PTK/어뎁터 복합체 활성의 혼란을 의미하는데 이때 이 복합체가 물리적인 형태를 유지할 수 있느냐는 무관하다. 여기에서 사용원 활성은 세포의 시그날 유도 과정에서 PTK/어뎁터 단백질 복합체의 기능을 말하는 것으로 이와 같은 복합체는 세포에 세포외 시그날 유도에 영향 주거나 저해하는데 있어서 복합체의 기능을 언급한다. 본 발명의 화합물과 제약학적 조성물은 소요의 단백질 티로신 카이나제의 효소 활성을 직접적으로 간섭하지 않는다(저해물질 또는 강화한다).
4.4.1. PTK/어뎁터 단백질 복합체의 분포에 대한 검사.
본 발명의 화합물이 PTK/어뎁터 단백질 복합체를 파괴시키는 능력을 검사하는데 다양한 방법이 이용된다. 예를들면, 시험관내 복합체 형성은 고형 서포트에 소요의 복합체의 한 성분 또는 이의 기능성 부분을 고정시켜 검사한다. 둘째, 고정된 복합체 성분은 상기 확인된 것과 같은 화합물에 그리고 소요의 복합체의 제2 성분 또는 이의 기능성 부분에 노출시킨다. 세 번째, 화합물의 존재하에 고정된 성분과 복합체를 형성할 수 있는 지를 결정하는 것이다.
또한, 생체에서 복합체 형성은 본 기술분야에 공지인 공동-면역침전 기술을 이용하여 검사할 수 있다. 간략하면, 소요의 PTK/어뎁터 복합체를 형성할 수 있는 세포주는 본 발명의 하나 이상의 화합물에 노출시키고 세포 용해물질은 이와 같은 노출된 세포주에서 준비할 수 있다. 소요의 복합체의 성분중 하나에 대해 생성된 항체를 세포 용해 물질에 첨가하여 표준 면역 침전 기술을 사용할 수 있다. 복합체가 형성된 경우에, 면역침전은 복합체를 침전시키고, 복합체가 파괴된 경우에, 항체가 생성된 복합체 성분만이 침전된다.
소요의 PTK/어뎁터 단백질의 형질전환 능력에 대한 본 발명의 화합물의 혀과는 직접적으로 검사할 수 있다. 예를들면, 본 발명 화합불중 하나 이상은 PTK/어뎁터 복합체를 형성할 수 있는 섬유아세포 또는 조혈 세포와 같은 세포에 투여할 수 있고 이는 본 발명의 화합물 없이는 세포의 형질전환을 유도할 수 있다(Muller, A.J. et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:1785-1792; McLaughlin, j. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6558-6562). 세포의 형질 변환 상태는 연성 한천에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 모니터함으로써 시험관에서 측정할 수 있다(Lugo and Witte, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:1263-1270; Gishizky, M.L. and Witte, O.N., 1992, Science 256:836-839) 또는 세포의 형질 전환 상태는 면역 결핍된 누드 또는 심각하게 복합원 면역결핍(SCID) 쥐에서 종양을 형성할 수 있는 능력을 측정함으로써 생체에서 모니터할 수 있다(Sawyers, C.L. et al., 1992, Blood 79:2089-2098). 또한, SC이인자형 이식체에서 만들어진 흑색종, 전립선, 폐와 유방종양 세포주와 같은 다양한 종양 세포주를 방해하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 검사하였다.
4.4.2. 제약학적 조성물과 투여방법.
5.1에서 상술한 것과 같이 본 발명의 화합물은 PTK/어뎁터 단백질 상호 작용과 연관된 세포 증식성 질환을 치료하거나 개선시키기 위해 치료요법적 효과량을 환자에 투여할 수 있다. 치료요법적으로 효과량은 세포 증식성 질환의 증상을 완화시킬 수 있는데 충분한 화합물의 양을 말한다.
5.4.2.1에서는 세포 증식성 질환의 치료를 위해 본 발명의 화합물 효과량을 결정하는 방법에 대해 상술한다. 5.4.2.2에서는 본 발명의 화합물을 구성된 제약학적 조성물의 조성 방법, 이와 같은 화합물, 조성물의 투여방법에 대해 상술한다.
4.2.1.1. 효과량
본 발명의 화합물의 독성과 치료요법상 효과는 LD50(집단의 50%를 치사하는 양)과 ED50(집단의 50%를 치료요법적 효과를 주는 양)을 경정하기 위해 세포 배양물 또는 실점 동물에서 표준 제약학적 과정에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료 요법적 효과사이에 약량 비율은 치료요법적 지수가 되고 이는 LD50/ED50으로 나타낸다. 치료요법적 지수가 큰 화합물이 적절하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 이용되는 경우에 감염안된 세포에 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 환부 조직에 이와 같은 화합물을 표적 시키는 수송 시스템이 적절하다.
세포 배양물 검사와 동물 연구에서 수득한 데이터는 사람에서 사용할 수 있는 약량 범위를 정하는데 이용할 수 있다. 이와 같은 화합물의 약량은 거의 독성이 없거나 무독성의 ED50을 포함하는 순환 농도 범위에 있게된다. 약량은 이용되는 약형과 이용되는 투여 경로에 따라 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 이용된 임의 화합물에 대해서 세포 배양물 검사에서 최초로 치료 요법적 효과 량을 측정할 수 있다. 세포 배양물에서 측정된 것과 같이 IC50(증상의 ½ 저해를 이루기 위한 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 얻기 위해 동물 모델에서 약량을 만들 수 있다. 이와 같은 정보를 이용하여 사람에서 유용한 약량을 정확하게 결정할 수 있다. HPLC에 의해 혈장 수준을 측정할 수 있다.
어뎁터 단백질/단백질 티로신 카이나제 상호 작용의 저해를 유지시키고 또는 최소 효과 농도(MEC)를 유지시키는데 충분한 활성 부분의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 약량과 간격을 조정할 수 있다. MEC는 각 화합물에 따라 다양할 수 있는데 여기에서 상술한 방법을 이용하여 상호작용과 같은 시험관애 데이터에서 평가될 수 있다. MEC를 얻는데 필수적인 약량은 개벽적인 특징과 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 혈장 농도를 결정하기 위해 HPLC 검사 또는 생검을 이용할 수 있다.
MEC값을 이용하여 투여 간격을 조정할 수 있다. 화합물은 혈장 수준이 시간의 10-90% 그리고 가장 적절하게는 50-90% 유지하도록 투여해야 한다.
4.4.2.2 조성과 투여
전술한 것과 같이 어뎁터 단백질은 세포내 단백질이다. 따라서, 소요의 PTK가 막경유 또는 세포내 형태와는 무관하게 PTK/어뎁터 단백질 상호 작용은 세포내의 것이다. 따라서 본 발명의 화합물은 PTK/어뎁터 복합체의 형성 또는 활성을 방해하기 위해 세포 내에서 작용한다. 본 단락에서 상술하는 것과 같이 세포 내에서 작용하는 화합물을 투여하는 다양한 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 화합물에 이용할 수 있는 제약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적 수용 가능한 운반체 또는 부형제를 이용하여 통상적인 방법으로 만들 수 있다.
따라서, 화합물과 이의 생리학적 수용 가능한 염과 용매는 흡입 또는 주입(입 또는 코를 통하여), 구강, 뺨, 비경구 또는 직장 투여할 수 있도록 조제된다.
경구투여를 위해서는 제약학적 조성물은 결합제(예로써 선젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈); 충전제(예로써 락토즈, 미소결정 셀룰로오즈 또는 수소 칼슘 인산염); 윤활제(예로써 스테아레이트 마그네슘, 활석 또는 실리카); 분해제 (옥수수 전분 또는 글리코레이트 나트륨 전분) 또는 가습제(SDS)와 같은 제약학적으로 수용가능한 수단에 의해 준비된 정제 또는 캡슐로 만들 수 있다. 정제는 공지의 방법을 이용하여 피복할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 조성물은 용액, 시럽 또는 현탄액의 형태가 되거나 사용하기 전에 물 또는 다른 적절한 담체로 구성될 수 있도록 건조 생성물로 제공될 수 있다. 이와 같은 액체 조성물은 현탁제(솔비톨 시럽, 셀룰로오즈 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(레시틴 또는 아카시아); 비-수용성 담체(알몬도 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별된 식용유) 그리고 보존제(메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)과 같은 제약학적 수용 가능한 첨가제를 사용한 통상적인 수단에 의해 준비할 수 있다. 조성물에는 완충염, 향료, 발색제 또는 적절한 감미제를 포함할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 활성 화합물의 제어된 방출을 제공하기 위해 적절히 만든다.
빰에 투여하기 위해서는 조성물은 통상적인 방법에서 조성된 정제 또는 당과 형태가 될 수 있다.
흡입에 의해 투여하기 위해서는, 본 발명에 사용하는 화합물은 가압 팩 또는 분구기에서 에어로졸 분무에 의해 통상적으로 제공될 수 있는데 이때 디클로로디플로로메탄, 트리클로로플로로메탄, 디클로로테트라플로로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체외- 같은 적절한 추진제를 이용할 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에 약량 단위는 예정된 양을 제공하기 위해 벨브를 제공하여 결정할 수 있다. 흡입기에서 사용할 수 있는 젤라틴 캡슐과 카트릿지는 락토즈 또는 전분과 같은 적절한 분말과 화합물의 분만 혼합물을 포함하도록 조제된다.
화합물은 거환주사 또는 연속 주입과 같은 주사에 의해 비경구 투여 될 수 있다. 주사용 조성물은 첨가된 보존제와 합께 앰플 또는 다중 약량 용기 등의 단위 약량형으로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 오일에 유제 또는 수용성 담체형이 될 수 있고 현탁제, 안정제, 분산제와 같은 조성제를 포함할 수 있다. 또는 활성 성분은 사용하기 전에 멸균 발열물질 없는 물과 같은 적절한 운반체로 재구성할 수 있는 분말형이 될 수 있다.
화합물은 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약을 포함하는 좌약 또는 관장약과 같은 직장 조성물로 조제될 수 있다.
전술한 조성물에 추가하여 화합물은 데포트 조성물로 조제될 수 있다. 이식(예를 들어 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 장기간 작용할 수 있는 조제물을 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 용해도가 적은 유도체 또는 불용성 염으로써 적절한 중합성 또는 소수성 물질(예로써 수용 가능한 오일) 또는 이온 교환 수지로 조제될 수 있다.
바랍직하게는 조성물은 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 약량을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜스 장치 내에 제공된다. 팩은 수포팩과 같은 금속 또는 플라스틱호일로 구성된다. 팩 또는 디스펜스는 투여지시에 따라 수반될 수 있다.
5. 화합물은 EGF-수용체/GRB-2 SH2 도메인 상호작용을 저해한다.
이 단락에서 제시하는 실시 예에서 화합물은 GRB-2 SH2 펩티드 도메인에 티로신 포스포릴화된 EGF 수용체의 결합을 효과적으로 저해하였다.
5.1. 재료와 방법
어뎁터-GST 융합 단백질: 여기에서 이용된 어뎁터-GST(글루타티온-S-전이효소)는 GRB-/pGEX 구조체에 의해 형질 전환된 대장균에서 발현하여 준비된 GRB-2-GST 융합 단백질이다. 이와 같은 융합 단백질의 GRB-2부분은 GRB-2 단백질의 SH2 도메인으로 구성된다. 형질 전환된 세포는 암피실린이 보충된 루리아 육즙(LB)에 생장시킨다. 600mm에서 O.D.가 0.3이된 후에, 세포가 융합 단백질을 발현시킬 수 있도록 6시간 동안 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 유도시킨다.
6시간 발현 후에, 세포는 침전시키고, 4℃에서 10,000 X g 10분간 원심 분리에 의해 제거하고, 상청액은 글루타티온-세파로즈 칼럼에 통과시킨다. 결합원 GRB-2-GST 융합 단백질은 5mM 환원된 글류타티온으로 칼럼 밖으로 용출시키고 PBS에 대해 투석시킨다.
고정된 EGF-R 티로신 카이나제 분자:
상피 성장 인자 수용체 티로신 카이나제(EGF-R). EGF-R은 EGF-R을 과발현 시키는 세포, 특히, A431(ATCC CRL1551) 세포 주에서 분리하였다. 세포는 HNTG완충액 (20mM Hepes/Hcl, pH 7.4, 150mH Nacl, 1.0% 트리톤 X-100, 5% 글리세롤, 1mH 페닐메틸설포닐 폴로라이드(PMSF), 1mg/L 아프로토닌, 1mg/L 루펩틴, 10mg/L 벤자아미딘)에서 용혈 시킨다.
EGF-R단백질은 하기에서 상술하는 것과 같이 미량적정 플레이트에서 고정시켜 세포 용해물질로부터 분리한다. EGF-R은 하기에서 설명하는 것과 같이 시험관에서 연속적으로 포스포릴화시킨다.
EGF-R분자는 미량적정 플레이트에서 고정시킨다. 미량적정 플레이트는 EGFR (UBI, #05-101)의 대한 항-FGF-R단클로 항체를 마이크로웰당 0.5㎍ 농도(PBS)에서 그리고 웰당 최종 용적이 150㎕되도록 플레이트의 웰에 우선 피복시켜 준비한다.
하룻밤동안 피복 후에, 미량적정 웰에서 피복용액을 제거하고, 실온에서 30분간 차단 완충액(5% 건유/PBS)으로 대체하고, 차단 완충 액을 제거한 후에 웰은 TBST 완충액(150mM Nacl, 50mM 트리스-Hcl, pH 7.2, 0.1% 트리톤 X-100)으로 4회 세척한다.
EGF-R0-발현 세포로부터 세포 용해 물질을 각 웰의 150㎕ PBS에 첨가하고 실온에서 교반하면서 30분간 배양시킨다. 결합 안된 EGF-R은 TBST 완충 액으로 5회 웰을 세척하여 제거한다. 웰당 약 50-100ng EGF-R단백질이 결합된다.
여기에서 이용된 A431 세포주와 같은 상당히 높은 내생 포스포타제 활성을 가지는 EGF-R 과발현 세포를 이용하는 것이 중요하다. 이는 용혈 동안에 그리고 고정된 항체로 배양하는 동안에 포스포타제는 EGF-R 분자로부터 인산기를 제거하여 GRB 단백질과 같은 내생 어뎁터 단백질이 EGFR에 결합하는 것을 저해하여 인위적인 결과를 유도한다. 또는 세포는 굶주린 세포주가 이용되는 경우에 용혈 전에 굶주리게 될 수 있다.
자가 포스포릴화된 EGF-R의 준비: 시험관에서 다음의 카이나제 반응에 의해 자가 포스포릴화된 EGF-R을 생산한다. 카이나제 반응은 총 용적 150㎕에 ATP/Mn2+혼합물을 (50mM MnCl2에서 최종 농도는 10μM ATP)을 첨가하여 개시한다. 플레이트는 실온에서 5분간 교반하면서 배양하고, 상청 액은 뽑아내고 플레이트는 TBST로 5회 세척해낸다.
검사과정: GRB-2-GST융합 단백질(EGF-R:GRB-2 단백질 1:1 비율) 또는 GRB-2-GST 융합 단백질 (EGF-R:GRB-2 단백질 4:1 비율)5ng은 화합물 1 존재하에 실온에서 30분간 배양 완충액 (0.1M 인산칼륨 완충액, pH 6.5)이 든 포스포릴화된 EGF-R 피복된 미량적정 웰에 첨가한다. 기준 웰에는 화합물 1이 없는 상태에서 GRB-2-GST 융합 단백질로 배양시킨다.
배양 후에, 웰은 TBST로 완전히 세척한다. 고정된 EGF-R에 결합된 GRB-2-GST 융합 단백질의 양은 융합 단백질의 GST 부분에 대해 정제된 토끼 항혈청으로 결정한다(AMRAD, New Victoria, Australia; Catalog No. 00001605). 실온에서 30분간 배양하였다. 시각적으로 보기 위해서는 웰은 그 다음에 30분간 실온에서 TAGO 염소-항-토끼 과산화효소 항체로 배양한다. 배양 후에, 항체를 제거하고, 웰은 수돗물로 씻어내고 TBST로 씻어낸다. 기질 용액, ABTA(2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린설폰산)/H202(1.2㎕ H202를 10ml ABTS)를 웰에 넣고 실온에서 20분간 배양한다. 5HN2SO4추가하여 반응을 종료시킨다. 410nm에서 각웰의 O.D를 측정한다. 이와 같은 기술을 이용하여 배경에 대해 2ng GRB-2-GST와 같은 상당히 적은 양을 감지가능하다.
또는 EGF-R웰에서 테스트 물질과 GRB-2-GST 융합 단백질의 배양 후에 EL-6 또는 EL-12와 같은 바이오티닐화원 단클론 항체를 이용하여 융합 단백질 결합에 대해 검사하였다. 이와 같은 항체에 의해 인지되는 에피토프는 GRB-2의 SH2 도메인에 배치하나 포스포릴화된 EGFR에 GRB-2 결합을 간섭하지는 않는다. 이들 항체에 대한 결합은 스트렙타이비딘-바이오티닐화원 호스래디쉬 과산화효소 반응물을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, EGF-R웰에서 테스트 물질과 GRB-2-GST 융합 단백질의 배양 후에, 고정된 EGFR에 융합 단백질의 결합은 배양 완충 액에서 1mM 1-클로로-2,4-디니트로벤젠 (CDNB)와 1.54ng/ml 환원된 글루타티온으로 배양시켜 검사하였다. 340nm에서 O.D.를 측정하였다. 이 반응은 OD 1.0까지 선형으로 나타났고, 이는 Mannervik and Danielson (Mannervik, B. and Danielson, U.H., 1988, CRC Critical Reviews in Biochemistry 23:238)에서 상술한 것과 같이 경쟁성 GST 저해물질로 중단되었다.
5.2. 결과
5.1에서 상술하는 검사에 따라 GRB-2 어뎀터 단백질의 SH2 펨티드 도멘인에 티로신 포스포릴화된 EGF-수용체의 결합을 저해하는 능력에 대해 화합물 1은 테스트하였다.
화합물 1은 IC50이 2.0μM로 GRB-2/SH2 결합의 저해물질임이 나타났다. (여기에서 IC50은 테스트 물질이 없을 때 발생하는 결합의 양에 대해 GRB-2/SH2 결합의 ½을 저해하는데 필요한 테스트 화합물의 농도를 말한다).
6. 화합물 1은 bcr/abl활성을 저해한다.
여기에서 설명하는 실시 예는 본 발명의 화합물이 bcr/ab1- 형질 전환된 세포주에서 세포 생존을 저해한다는 것을 설명한다.
6.1. 재료와 방법
1) 본 검사에 이용된 세포주는
32D cl.3: 쥐 임파아구 세포, IL-3 의존성.
32D cl.3 J2/leuk: 32D cl.3 raf and myc를 발현
IL-3 독립성.
32D bcr/abl: 32D bcr/abl kinase를 과발현,
IL-3 독립성
2) 상기 모든 세포주는 5% CO2, 37℃에서 배양에서 생장시켰다. 이들의 생장 배지는 다음과 같다.
32D cl.3: RPM1 + 10% FBS + 1 ng/ml IL-3 + 2 mM 글루타민
32D cl.3 J2/leuk: RPM1 + 10% FBS + 2 mM 글루타민
32D bcr/abl: RPM1 + 10% FBS + 2 mM 글루타민
IL-3: 인터루킨-3, 쥐 (UBI Cat. # 01-374)
3) PBS (Dulbecco's 인산 완충염) Gibco Cat. #450-1300EB
4) MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-yl]-2,5-디페틸테트라졸리움 브로마이드; 티아졸일 블루)
Sigma Cat. #M-2128
작동 용액: 5mg/ml PBS, 암상태, 4℃에서 저장.
5) 가용화 완충액
SDS 전기영동 등급, Fisher Cat. #BP 166
N,N-디메틸-포름아미르(DMF) Fisher Cat. #BP1160.
빙초산 Fisher Cat. #A38.
작동 용액: 온수 250ml와 500ml DMF에서 200g SDS를 용해시키고, 저온에서 교반. SDS가 거의 용해되었을 경우 용액에 80% 아세트산 25ml와 1N Hcl 25ml을 첨가하고 용적을 1000ml로 조정한다.
6.2. 과정
다음의 모든 과정은 특별한 언급이 없는한 실온에서 실행한다.
6.2.1. 세포 접종
1) 세포는 조직 배양 접시(10cm, Corning 25020-100)에서 생장시켜 1x106세포/ml이 되고, 매 2-3일마다 1:10에서 계대 배양한다(32D bcr/abl주의 경우에는 1:20).
2) 살아있는 세포는 표준과정에 따라 트립판 블루로 헤아린다.
3) 세포는 2x105세포/ml 밀도로 새로운 배지에 현탁시키고 웰당 50㎕에서 96-웰 조직 배양 플레이트(Corning, 25806-96)에 세포를 이동시켜 2x106세포/웰이 되게 된다. 각 세포주는 고유 양성 콘트롤과 음성 콘트롤로 도말 한다 (음성 콘트롤은 배지만을 말한다).
32D cl.3 접종 배지는 IL-3 ng/ml 이 포함되어 있다.
6.2.2. 검사과정
1) 화합물 1 약물 보존액(10mM/DMSO)은 1:50으로 희석한다. 조직 배양 플레이트의 각 라인에 남아있는 8개 웰에 1:2 연속 희석을 실행한다. 각 웰에 50㎕씩 첨가한다. 컨트롤 웰에는 배지만 넣는다. 세포는 15시간 동안 37℃, 5% CO2에서 약물과 배양시킨다.
2) 각 웰에 15㎕ MTT를 추가한다. 플레이트는 4시간 동안 37℃에서 배양시킨다.
3) 4시간 후에, 100㎕ 용해 액을 각 웰에 추가한다.
4) 플레이트는 알루미늄 호일로 덮고, ELISA 플레이트 쉐이크에 넣고, 실온에서 12시간 교반시켜 포르마잔 결정을 완전히 용해시킨다.
5) Dynatech ELISA plate reader, Model MR 500을 이용하여 630nm 참고파장으로 570nm 파장에서 흡수도를 읽는다.
6.3 결과
bcr/abl 활성에 영향을 줄 수 있는 화합물 1의 능력에 테스트하고 bcr/abl 기능을 저해하는 능력을 발견하였다.
bcr/abl기능에 화합물 1의 효과는 6.1에서 상술하는 것과 같이 성장 검사를 이용하여 테스트하였다. 간략하면, 이 검사에서는 세게 세포주가 이용되었다. 우선, IL-3 의존성 세포주(32D cl.3)이 이용되었는데 이는 생존을 위해 IL-3 사이토킨을 요구한다. 그 다음 두 개의 IL-3 독립성 세포주가 이용되는데 여기에는 32D cl.3 J2/leuk와 32D bcr/abl을 포함하는데 각각 raf와 myc 그리고 bcr/abl으로 형질 변환된 것이다. 이들 세포주들은 형질 변환된 유전자 서열에 의해 생성된 물질의 활성 때문에 IL-3 독립성이 되었다. 이와 같은 생성물이 비활성인 경우, 세포가 IL-3에 노출되지 않는 경우 세포는 살아남지 못한다. 따라서 예를 들면, 32D cl.3 bcr/abl 세포주에서 bcr/abl이 비활성인 경우에 세포는 IL-3없이는 생존할 수 없다.
화합물 1은 IL-3없이 32D cl.3 bcr/abl 세포주가 생존할 수 있는 능력을 방해한다. 이결과는 이들 세포주가 건강하기 때문에 중요하다.
7. 실시예: 화합물 1은 세포증식을 방해한다
본 실시 예에서는 본 발명의 화합물이 세포증식에 강력한 저해물질임을 설명한다.
7.1. 재료와 방법
설포로로다민 B(SRB) 성장검사
검사 1: MCF-7SBR 성장 검사
2mM 글루타민이 보충된 10% FBS/RPMI의 정상 생장 배지에서 96-웰 평편한 바닥 플레이트에서 2000 세포/웰 농도에서 접종하였다. 세포의 플레이트는 37℃ 24시간동안 배양하고 웰당 총 용적이 200㎕가 되도록 웰당 동량의 화합물 희석 액을 넣는다. 화합물은 원하는 최대 농도를 2회 준비하고 96-웰 밑 둥근 플레이트에서 정상 성장 배지에서 연속 희석하고 세포 플레이트에 옮긴다. DMSO는 최종 농도가 0.2%까지 되도록 벡터 콘트롤로 작용한다. 세포는 가습 5% CO2배양기에서 배양하었다. 화합물은 첨가한 후 배지는 버리고 고정원 세포에 냉동 10% TCA(트리콜로로아세트산) 200㎕/웰을 첨가한다. 4℃에서 60분뒤에, TCA를 버리고, 플레이트는 물로 5회 씻는다. 플레이트는 공기-건조시키고 4% SRB(설프로다민 B, Sigma) 20/1% 아세트산 100㎕/웰을 첨가하여 실온에서 10분간 세포를 착색시킨다. SRB는 버리고 플레이트는 1% 아세트산으로 5회 씻어낸다. 플레이트를 완전히 건조시킨 후에, 10mM 트리스-염기 100㎕/웰을 첨가하여 염료를 용해시킨다. 5-10분 후에 플레이트는 570nm와 630nm 이중 파장에서 Dynatech ELISA Plate Reader에서 읽는다.
검사 2: PDGF-R/SRB 흡착 세포 성정 검사
Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-1112에서 상술한 발색 측정 검사를 이용하여 고정-의존성 종양 성장을 저해하는 능력에 대해 화합물을 테스트하였다. 검사는 카운터 이온 결합 염려 설프로다민 B(SBR, Sigma)을 이용하여 산-고정된 세포의 단백질 함량을 측정하였다. 화합물은 DMSO(Sigma 세포배양등급)에 용해시켜 원하는 최종 검사 농도의 2배에서 적절한 성장 배지로 희석한다. Cb 세포(CCL 107)을 이용하는 검사에서, 화합물(100㎕)을 부착된 세포 단층(2000 세포/웰 100㎕)을 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가한다. C6(CATCC# CCL 107) 세포는 5% 태아 소혈청 (FBS)와 2mM 글루타민 (GLN)이 보충된 Han's F10에서 유지시킨다. 4일 후에 (37℃, 5% CO2) 단층은 PBS로 3회 세척하고, 200㎕ 냉각 10% TCA(Fisher Scientific)로 고정시키고, 60분간 4℃에 유지시킨다. TCA를 제거하고, 고정된 단층은 수돗물로 5회 세척하고, 실온에서 흡수지상에서 완전히 건조시킨다. 세포 단백질은 1% 아세트산에 용해된 100㎕ 0.4% SBR로 10분간 착색시킨다. 수돗물로 5회 세척한 후에, 염료는 10mM 트리스 염기(웰당 100㎕)에 용해시키고 흡수 도는 Dynatech plate reader model MR5000을 이용하여 570nm에서 읽는다. 성장 저해 데이터는 0.4% DMSO 단독으로 처리된 컨트롤 웰에서 감지된 흡수도 %로 나타낸다. DMSO 컨트롤은 정상 성장 배지에서 생장된 세포와 상이하지 않는다. 4개 변수 곡선 고정 함수를 이용하여 IC50값을 측정한다.
고정-독립성 종양 세포 성장 검사를 위해 화합물 없이 또는 화합물과 함께 검사 배지(100% FCS를 포함하는 DMEM)에서 0.4% 아가로즈에서 현탁된 세포(접시당 3000 내지 5000)를 고형화한 아가로즈 염기층(0.8% 아가로즈)으로 피복된 35mm 배양접시에서 플레이트 하였다. 37℃에서 2-3주 배양 후에, 50㎛이상의 콜로니는 Omnicon 3800 Tumor Colony counter를 이용하여 정량화 하였다.
검사 3: MCF-7/HER-2B 성장인자
여기에서 이용된 프로토콜은 전술한 (MCF-7 성장검사)의 것과 근본적으로 유사하나 단 화합물 1은 첨가하기 전에 정상 성장 배지를 제거하고 2mM 글루타민이 보충된 0.5% FBS/RPMI를 세포에 첨가한다. 화합물은 0.5% 혈청 배지에서 준비한다. 세포 플레이트는 4일간 배양시키고, 표준 기술을 이용하여 발생시킨다.
검사 4: A431/SRB 성장검사
A431 (ATCC# CRL 1555) 세포는 MCF-7/HER-2B 성장 검사를 위해 전술한 프로토콜에 따라 근본적으로 테스트한다.
7.2. 결과
7.1에서 상술하는 SRB 프로토콜을 이용하여 세포 증식에 화합물 1의 효과를 테스트 하기 위해 화합물 1과 다수의 세포주를 접촉시킨다.
하기에서 나타낸 것과 같이, 화합물 1은 테스트된 4개 세포주 각각의 세포 증식을 저해하는 것으로 나타났다.
세포주 화합물 IC50(MM)
C6 8
A431 7.5
MCF7 10
MCF7-HER 2 6
여기에서 이용된 것과 같이, IC50은 테스트 화합물(이 경우, 화합물 1)에 접촉하지 않은 동일 세포주에서 볼 수 있는 수준의 50%으로 세포 증식을 방해하는데 요구되는 테스트 화합물의 농도를 말한다.
따라서, 이 단락에서 상술하는 결과에서는 화합물 1이 세포증식을 저해하는 것으로 작용한다는 것을 설명한다. 5에서 제시한 것과 같이 이 결과에서는 화합물 1은 단백질 티로신 카이나제 수용체 EGFR의 SH2 도메인에 어뎁터 단백질 결합을 방해하여 이는 화합물 1은 이의 결합짝(예로써 단백질 티로신 카이나제 분자)과 어뎁터 단백질 상호 작용을 방해하는 세포 성장 저해 물질로써 작용한다. 화합물 1이 활성을 가지는 경우에 화합물은 항-세포 증식제를 나타낸다.
8. 실시예: 3T3 세포 증식 저해 검사
다음의 과정은 EGFr, IGF1r 또는 PDGF를 과발현하는 3T3 조작원 세포주에서 세포 증식을 저해하는 화합물의 능력을 결정하는데 이용된다.
8.1 재료와 방법
(1) EGF 리간드: 보존 농도 = 16.5 μM; EGF 201, TOYOBO, CO., Ltd. Japan
(2) IGF1 리간드: 사람 재조합; G511, Promega Corp, USA.
(3) PDGF 리간드 : 사람 PDGF B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim, Germany
(4) SRB: 설포로다민 B; S-9012, Sigma Chemical Co., USA.
SRB 염료 용액: 0.4% SRB 1%빙초산, Glacial.
(5) 빙초산: A38-212, Fisher Scientific, USA.
(6) 소알부민: 분절 v 분말; A-8551, Sigma Chemical Co., USA
(7) TCA 완충액: 10% 트리콜로로아세트산 (A32-500, Fisher Scientific, USA)
(8) 트리스 염기 완충액: 10 mM 트리스 베이스 (BP152-5, Fisher Scientific, USA)
8.2. 과정
(1) N-1H 3T3 (ATCC# 1658) 조작된 세포주: 3T3-EGFr, 3T3-IGFIr,3T3-PDGFr.
(2) 세포는 96웰 플레이트에서 10% FBS + 2mM GLN DMEM에서 8000 세포/웰 농도로 접종한다. 세포는 세포가 플레이트에 접착할 수 있도록 하룻밤동안 37℃, 5% CO2에서 배양한다.
(3) 2일째에 세포는 24시간동안 무혈청 배지(0% FBS DMEM)에서 고정시킨다.
(4) 3일째에 세포는 리간드(EGF=5mM, IGF1=20mM 또는 PDGF=100mg/ml)로 처리하고, 동시에 약물로 처리한다. 리간드는 0.1% 소 알부민과 함께 무혈청 DMEM에서 준비한다. 네가티브 콘트롤 세포는 0.1% 소 알부민이 보충된 무혈청 DMEM을 수용하고; 포지티브 콘트롤 세포는 약물은 없이, 리간드(EGF, IGF1 또는 PDGF)를 수용한다. 약물은 97웰 플레이트에서 무혈청 DMEM에서 준비하고 연속 희석한다. 희석된 약물 총 10㎕/웰을 세포에 추가한다. 각 웰의 총 용적은 200㎕이다. 테스트된 각 약물에 11개 농도를 적용한다.
(5) 4일째에, 세포에 다시 리간드(EGF, IGF1 또는 PDGF)를 첨가하고 세포에서 최종 리간드 농도를 유지시킨다.
(6) 5일째에 세포는 PBS로 세척하고, 0-5℃에서 1시간 동안 200㎕/웰 냉각 10% TCA로 고정시킨다.
(7) TCA를 제거하고 이온 제거수로 5회 웰을 씻어낸다. 종이 타올에 플레이트를 뒤집어 건조시킨다. 10분간 100㎕/웰에서 0.4% SRB로 세포를 착색시킨다.
(8) SRB를 제거하고 1% 아세트산으로 플레이트를 5회 씻어낸다. 플레이트는 완전히 건조시킨다.
(9) 교반기에서 10분간 100㎕/웰에서 염료를 10mM 트리스-베이스로 용해시킨다.
(10) 570nm와 630nm에서 Dynatech Elsia plate reader를 이용하여 플레이트를 읽는다.
8.3. 검사 과정
(1) 제 1웰에서 RPMI배지로 약물 보존액 (10mM/DMSO)을 1:50으로 희석하고 조직 배양 플레이트에서 8개점에 대해 1:2 희석한다. 이용액 50㎕/웰을 세포에 옮긴다. 컨트롤 웰은 배지만을 넣는다. 세포는 15시간동안 37℃, 5% CO2에서 약물로 배양시킨다.
(2) 각 웰에 15㎕ MTT를 첨가한다. 플레이트는 37℃에서 4시간동안 배양시킨다.
(3) 4시간 후에 각 웰에 100㎕ 가용화 용액을 첨가한다.
(4) 플레이트는 알루미늄 호일로 덮고, 플레이트는 ELISA 플레이트 교반기에 두고 24시간 교반시켜 포르마잔 결정을 완전히 용해시킨다.
(5) Dynatech ELISA plate reader, Model MR 500을 이용하여 630㎚ 참고 파장으로 하여 570㎚ 파장에서 흡수도를 읽는다.
본 발명에 벗어나지 않고 본 발명의 다양한 수정 및 변화를 만들 수 있다. 여기에서 상술한 특정 구체 예는 본 발명을 설명하기 위함이고 본 발명은 청구범위에 한정한다.

Claims (21)

  1. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 염과 제약학적 수용 가능한 염으로 구성된 사람에 투여하기에 적합한 제약학적 조성물:
  2. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 염과 제약학적 수용 가능한 염으로 구성된 사람에 투여하기에 적합한 제약학적 조성물
  3. 세포 증식성 질환의 증상을 완화하는 방법에 있어서, 세포 증식성 질환은 세포의 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체를 파괴할 수 있는 충분한 양의 화합물과 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체와 접촉시켜 세포 증식성 질환의 증상이 개선되고; 이때 화합물은 다음의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 세포 증식성 질환은 포유류에서 일어나고 화합물은 포유류 내에 세포와 접촉하여 포유류에서 세포 증식성 질환 증상이 개선되는 것을 특징으로 하는 방법
  5. 제 3항에 있어서 세포 증식성 질환은 BCR-ABL-연관된 암, 신경 교종, 신경교아종, 흑색종, 난소암, 유방암 또는 전립선암인 것을 특징으로 하는 방법
  6. 세포 증식성 질환은 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펩티드 복합체와 연관된 세포 증식성 질환의 증상을 감소시키는 방법에 있어서 세포의 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체를 파괴할 수 있는 충분한 양의 제 1항 또는 제 2항의 화합물과 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체를 만들 수 있는 세포와 접촉시켜 세포 증식성 질환의 증상이 개선되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 염.
    이때, R1과 R2는 각 수소, 저가알킬, 아세틸, 아릴, 알킬아릴 또는 고차 알킬산 에스테르이고 이때 R1과 R2중 적어도 하나는 H가 아니고;
    R3 내지 R12는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아닐, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 얼캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R11과 R12중 적어도 하나는 2-메틸부트-2-en-4-yl이다.
  8. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 수용 가능한 염.
    이때 R1과 R2는 모두 수소이고;
    R3내지 R10는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복스아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고; 이때 R11과 R12는 각 H 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R11와 R12는 각 H 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고; 이때 R3 내지 R10중 적어도 하나는 H가 아니다.
  9. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 수용 가능한 화합물.
    이때 R1과 R2는 각 아릴, 알킬아릴 또는 고차 알킬산 에스테르이고;
    R3 내지 R12는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아닐, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토이다.
  10. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 수용 가능한 염
    이때, R1과 R11과 R12는 수소이고;
    R3 내지 R10는 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아닐, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미도, 카르복시아미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 이때 R3 내지 R10중 적어도 하나는 H가 아니고;
    a) R4-R10이 H일 때, R3은 2-메틸부트-2-en-4-yl 또는 2-하이드록시-2-메틸부트-4-yl이 아니고;
    b) R4-R6과 R8-R10이 각 H일 때, R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
    c) R3-R4, R6-R8과 R10은 H일 때, R5와 R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl 또는 3-메틸-n-부틸이 아니고;
    d) R3, R5, R7, R9-R10이 H일 때, R4와 R8은 모두 2-메틸부트-2-en-4-yl 또는 2-메틸부트-1,4-디엔-4-yl이 아니고 그리고 R4와 R8은 2-메틸부트-2-en-4-yl과 2-메틸부트-1,4-디엔-4-yl이 아니다.
  11. 제 10항에 있어서, 다음과 같은 것을 특징으로 하는 화합물
    이때, R3-R5와 R7-R9는 H이고 R6과 R10중 하나 또는 둘다 2-메틸부트-2- en-4-yl이다.
  12. 다음의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염
    이때, R1과 R2중 적어도 하나는 아세틸이고;
    R11과 R12중 H이고; 그리고
    R3과 R10은 각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬알릴, OH, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설포아미드, 아미노와 멀캅토이고 이때
    a) R1과 R2가 모두 아세틸인 경우 모든 R1과 R2중 하나가 아세틸이고, R3-R4, R6-R8과 R10-R12가 H인 경우, R5와 R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl 아니고;
    b) R1과 R2가 아세틸이고, R4-R6과 R8-R10은 H인 경우 R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
    c) R1과 R2가 모두 아세틸이고, R3, R5-R7, R9-R10이 H인 경우, R4와 R8은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니다.
  13. 다음의 화합물과 이의 제약학적 염
    이때, R1과 R2중 적어도 하나는 저가 알킬이고;
    R11과 R12는 H이고; 그리고
    R3 내지 R10은 각각 H, 알킬, 알킬카르복시, 알케닐, 알케닐카르복시, 아릴, 알킬아릴, OH, 알콜시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설포아미드, 아미노와 멀캅토이고 이때,
    a) R1과 R2 모두 메틸인 경우 R3 내지 R10의 적어도 하나는 H이외의 기가 되고;
    b) R1과 R2는 메틸이고 R4-R10이 H인 경우, R3는 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
    c) R1과 R2가 메틸이고 R4-R6과 R8-R10이 H인 경우, R3과 R7은 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니고;
    d) R1과 R2가 메틸이고, R3-R4, R6-R8과 R10이 H인 경우, R9는 동시에 2-메틸부트-2-en-4-yl이 아니다.
  14. 제 10항에 있어서 이때, R4는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3와 R5-R10은 H이고; 또는
    R5는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3-R4와 R6-R10은 H이고; 또는
    R6은 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3-R5와 R7-R10은 H인 것을 특징으로 하는 화합물
  15. a) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    b) 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-en-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    c) 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(2-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논
    d) 3,6-디-[5-(브로모)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    e) 3,6-디-[2-(알릴)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    f) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(n-프로필)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    g) 3,6-디-[2-(아미노카르보닐)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    h) 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    i 3,6-디-[2-(알릴인돌-3-yl]-2,5-디벤조일옥시-1,4-퀴논;
    j) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(시아노)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    k) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[4-(메톡시카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    l) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[5,7-(디매톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    m) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[4,7-(디메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    n) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[5-(니트로)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    o) 3,6-디-[4(4-클로로벤조일아미노)인돌-3-yl]-2,5-이다히드록시-1,4-퀴논;
    p) 3,6-디-[2-(4-클로로페닐)인돌-3-yl]-2,5-이다히드록시-1,4-퀴논;
    q) 2,5-디하이드록시-3,6-디-(2-클로로페닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    r) 2,5-디하이드록시-3,6-디-(4,6-[디메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    s) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(5-하이드록시-6-메톡시)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    t) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[4-(시아노)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    u) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[5-(4-트리플로로메틸페닐아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    v) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(4-트리플로로메틸페닐아미노카르보닐)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    w) 3,6-디-[2-(5-브로모-6-니트로)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    x) 2,5-디메톡시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-2-n-4-yl)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    z) 2,5-디메톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논으로 구성된 화합물
  16. a) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(메틸)인돌-3-yl]1,4-퀴논;
    b) 3,6-디-(2-메틸부트-3-yl)-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    c) 3,6-디-(2-부틸인돌-3-yl)-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    d) 3,6-디-[2-(부트-1-en-4-yl)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    e)2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-메틸부트-1-en-4-yl)인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    f) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(4-메틸-n-펜틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    g) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-페닐에틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    h) 3,6-디-[(5-카르복시-2-에틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    I) 3,6-디-[[5-카르복시-2-(n-프로필)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    j) 3,6-디-[[5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    k) 3,6-디-[2-(4-카르복시-n-부틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    l) 3-[[5-카르복시-2-(3-메틸-n-부틸)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-6-(인돌-3-yl)-1,4-퀴논;
    m) 3,6-디-[(5-아미노-2-에틸)인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    n) 3,6-디-[[5-아미노-2-(n-프로필)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    o) 3,6-디-[5-아미노-2-(3-메틸-n-부틸)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    p) 2,5-디아세톡시-3,6-디-[2-(3-메틸-n-부틸)인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    q) 3,6-디-[[2-에틸-5-(4-메틸테닐설포닐아미노)]인돌-3-yl]-2,5-디하이드록시-1,4-퀴논;
    r) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[[5-(4-메틸페닐설포닐아미노)-2-(n-프로필)]인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    s) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[[2-(3-메틸-n-부틸)-5-(4-메틸페닐설포닐아미노)인돌-3-yl]-1,4-퀴논;
    t) 2,5-디하이드록시-3,6-디-[2-(2-메틸펜트-2-en-5-yl)인돌-3-yl]-1,4-퀴논으로 구성된 화합물
  17. 다음의 화합물 또는 이의 제약학적 수용 가능한 염
    이때 R1와 R2는 각각 수소, 저가 알킬 아세릴, 아릴, 알킬일과 고차 알킬 산 에스테르이고; R3 내지 R10는 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토, 4-메틸페틸설포닐아미노 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고
    R11과 R12는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 알릴, 알킬아릴, 알킬카르복시, 알케닐카르복시, 부트-1-en-4-yl, 2-메틸부트-1-en-4-yl, 4-메틸-n-펜틸, 2-페닐에틸, 2-메틸펜트-2-en-4-yl와 4-카르복시-n -부틸이고 이때 R11과 R12중 적어도 하나는 H가 아니다.
  18. 다음의 화합물과 이의 제약학적 수용가능한 염
    이때, R1과 R2는 각 수소, 저가 알킬, 아세틸, 아릴, 알킬일과 고차 알킬 산 에스테르이고; R3내지 R10는 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사미드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멀캅토, 4-메틸페틸설포닐아미노 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 ; R11과 R12는 모두 3-메틸-n-부틸 이다.
  19. 다음의 화합물과 이의 제약학적 수용 가능한 염
    이때, R1과 R2는 각 수소, 저가알킬, 아세틸, 아릴, 알킬일과 고차 알킬산 에스테르이고; R3내지 R10 은 각각 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, OH, 하이드록시알킬, 알콕시, 니트로, 할로, 트리할로메틸, 아미드, 카르복사이드, 카르복시, 설포닐, 설폰아미드, 아미노, 멜캅토, 4-메틸페닐설포닐아미노 또는 2-메틸부트-2-en-4-yl이고 R3내지 R10 중 적어도 하나는 수소가 아니고; R11과 R12는 각 수소 또는 3-메틸-n-부틸이다.
  20. 제 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19항에 따른 화합물과 제약학적 수용 가능한 담체로 구성된 사람에 투여하기에 적합한 제약학적 조성물.
  21. 세포증식성 질환은 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리텝티드 복합체와 연관된 세포 증식성 질환의 증상을 감소시키는 방법에 있어서, 세포의 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체를 파괴할 수 있는 충분한 양의 제 20항에 따른 제약학적 조성물을 단백질 티로신 카이나제 폴리펩티드/어뎁터 폴리펨티드 복합체와 접촉시켜 세포 증식성 질환의 증상이 개선되는 것을 특징으로 하는 방법.
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