WO2021157613A1 - ピラゾール誘導体及び医薬組成物 - Google Patents

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WO2021157613A1
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PCT/JP2021/003938
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専二 白澤
俊之 角田
孝志 大嶋
亮 矢崎
正彦 末永
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学校法人福岡大学
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    • C07D471/14—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to pyrazole derivatives and pharmaceutical compositions.
  • VDACs Voltage-dependent anion channels
  • ATP ATP, phosphate, calcium, and respiratory substrates between mitochondria and the cytoplasm.
  • VDAC forms an oligomer (polymer) via the N-terminal domain and is involved in the induction of apoptosis by releasing calcium, cytochrome c and the like.
  • VDAC1, VDAC2 and VDAC3 There are at least three isoforms of VDAC (VDAC1, VDAC2 and VDAC3).
  • VDAC1 is believed to be particularly involved in calcium-induced apoptosis.
  • the Warburg effect is a phenomenon in which the ATP pathway produced by the conversion of glucose to pyruvic acid in cancer cells is mainly used.
  • ATP ATP
  • pyruvate ATP
  • additional ATP is produced by oxidative phosphorylation in mitochondria, but in cancer cells, mitochondrial function is suppressed even under aerobic conditions.
  • the C-terminal part of cancer-specific tubulin, the N-terminal part of hexokinase, and the N-terminal part of BCL2 / BCL-xL block the channel by binding to the N-terminal part of VDAC.
  • Such binding between VDAC-binding protein and VDAC is considered to be the cause of suppression of mitochondrial function, and VDAC binding inhibitors are attracting attention as a new target in cancer cells.
  • VDAC function adjusting agents have been proposed in JP-A-2011-178713, JP-A-2003-335676 and JP-A-2002-338469.
  • An object of the present invention is to provide a compound having a VDAC binding ability.
  • the first aspect is a pyrazole derivative represented by the following formula (I).
  • R 1 and R 3 each independently represent a optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom or a optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 4 represents a substituent.
  • R 5 and R 6 are independently hydrogen atoms, optionally substituted hydrocarbon groups having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 6 carbon atoms. Represents an alkylcarbonyl group that may be substituted.
  • X 1 to X 4 independently represent a nitrogen atom or CR 11.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a substituent.
  • n represents an integer from 0 to 4.
  • L represents a linking group.
  • the substituents are a halogen atom, a hydroxy group, a nitro group, a cyano group, a formyl group, an alkylcarbonyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbamoyl group, a mono or dialkylcarbamoyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms.
  • the linking group may be at least one selected from the group consisting of an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms, an oxygen atom, an imino group, a sulfur atom and a carbonyl group. good.
  • the second aspect is a voltage-dependent anion channel function regulator containing the pyrazole derivative.
  • a third aspect is a KDEL receptor 1 function regulator containing the pyrazole derivative.
  • a fourth aspect comprises the pyrazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and is used for treating at least one disease selected from the group consisting of voltage-dependent anion channel-related diseases and KDEL receptor 1-related diseases. It is a pharmaceutical composition used.
  • the disease may be at least one selected from the group consisting of neurodegenerative diseases, ischemic diseases, nephritis, metabolic diseases, viral diseases, spinal cord dysplasia diseases, liver diseases, joint diseases, ear diseases and tumors. ..
  • the disease may be at least one type of tumor derived from mutant KRAS or mutant KRAS-related signals.
  • a fifth aspect is a method for treating a disease, which comprises administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the disease may be at least one selected from the group consisting of neurodegenerative diseases, ischemic diseases, nephritis, metabolic diseases, viral diseases, spinal cord dysplasia diseases, liver diseases, joint diseases, ear diseases and tumors. , Variant KRAS or at least one of the tumors derived from variant KRAS-related signals.
  • the term "process” is included in this term not only as an independent process but also as long as the intended purpose of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes. ..
  • the content of each component in the composition means the total amount of the plurality of substances present in the composition when a plurality of substances corresponding to each component are present in the composition, unless otherwise specified.
  • embodiments of the present invention will be described in detail. However, the embodiments shown below exemplify a pyrazole derivative, a pharmaceutical composition, etc. for embodying the technical idea of the present invention, and the present invention describes the pyrazole derivative, the pharmaceutical composition, etc. shown below. Not limited to.
  • Pyrazole derivative The pyrazole derivative has a structure represented by the following formula (I).
  • R 1 and R 3 each independently represent a optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a halogen atom or a optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 4 represents a substituent.
  • R 5 and R 6 are independently hydrogen atoms, optionally substituted hydrocarbon groups having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 6 carbon atoms. Represents an alkylcarbonyl group that may be substituted.
  • X 1 to X 4 independently represent a nitrogen atom or CR 11.
  • R 11 represents a hydrogen atom or a substituent.
  • n represents an integer from 0 to 4.
  • L represents a linking group.
  • Pyrazole derivatives are thought to induce apoptosis of cancer cells by binding to VDAC, for example.
  • the pyrazole derivative is, for example, a type that inhibits the channel function of VDAC and induces apoptosis by enhancing membrane permeability, a type that inhibits the binding of VDAC-Tubulin, VDAC-HK and VDAC-BCL2 that induces closure of VDAC channel, and the like. It is considered to correspond to at least one of the type that inhibits the binding of Adenine voltage transformer (ANT) -VDAC or the type that induces the expression of VDAC and induces apoptosis following the polymerization of VDAC.
  • ANT Adenine voltage transformer
  • the pyrazole derivative may have a binding ability to KDEL receptor 1 (hereinafter, also referred to as KDELR1).
  • KDELR1 is expressed in the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum (ER), is involved in the retrograde transport of proteins from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum, and is involved in stress caused by proteins with abnormal folding accumulated in the endoplasmic reticulum, that is, endoplasmic reticulum stress. It is said to be involved.
  • Endoplasmic reticulum (ER) stress is observed in many diseases such as cancer, diabetes, autoimmune symptoms, liver disease, obesity, and neurodegenerative diseases.
  • UPR endoplasmic reticulum stress response
  • HIF-1 Hypoxia Induced Factor-1
  • HIF-1 hexokinase
  • pyrazole derivative can induce apoptosis by binding to KDELR1 and inhibit the activation of HIF-1 to suppress the Warburg effect.
  • the pyrazole derivative can exhibit a low-toxic growth inhibitory effect on tumor cells derived from mutant KRAS or mutant KRAS-related signal.
  • Pyrazole derivatives can target downstream hub proteins without directly targeting mutant KRAS.
  • Pyrazole derivatives are thought to exhibit a growth inhibitory effect on tumor cells derived from mutant atypical KRAS or mutant KRAS-related signals, for example, by targeting VDAC and KDELR1.
  • the mutant KRAS signal is thought to regulate VDAC function, for example, by altering the expression of tubulin B3 that binds to VDAC.
  • Pyrazole derivatives are thought to inhibit mutant KRAS signaling by binding to VDAC.
  • Mutant KRAS signals are also thought to increase KDELR1 expression, enhance retrograde transport from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum, induce endoplasmic reticulum stress, and activate HIF-1. It is considered that the pyrazole derivative relieves endoplasmic reticulum stress and suppresses the activation of HIF-1 by binding to KDELR1.
  • BIP a chaperone molecule that binds to KDELR1 activates the IP3R endoplasmic reticulum, which is important for the release of stored calcium in the endoplasmic reticulum, by localizing from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum.
  • IP3R1 binds to VDAC via GRP75 and forms a structure called Mitochondria assisted membrane (MAM) that activates calcium transport from the endoplasmic reticulum to mitochondria. Since the influx of calcium into mitochondria further induces reactive oxygen species (ROS), promotes proliferation in ROS-adapted cancer cells, and is involved in avoiding apoptosis, KDELR1 and VDAC are MAM. It can be considered that the growth of cancer cells is suppressed by interacting with each other.
  • ROS reactive oxygen species
  • Examples of the substituent in the formula (I) include halogen atoms such as fluorine, chlorine, bromine and iodine, hydroxy groups, nitro groups, cyano groups, formyl groups, alkylcarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carbamoyl groups and 1 carbon atoms.
  • Mono or dialkylcarbamoyl groups from 1 to 6, acylamino groups with 1 to 6 carbon atoms, alkyl groups with 1 to 6 carbon atoms, alkyloxy groups with 1 to 6 carbon atoms, amino groups, mono or dialkylamino groups with 1 to 6 carbon atoms At least one selected from the group consisting of groups, carboxy groups, and sulfo groups can be mentioned.
  • the alkyl group portion constituting the substituent may be linear or branched.
  • the linking group represented by L in the formula (I) is a link formed from at least one selected from the group consisting of an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms, an oxygen atom, an imino group, a sulfur atom and a carbonyl group.
  • the group can be mentioned.
  • Examples of the hydrocarbon group represented by R 1 and R 3 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, an arylalkyl group and the like, and the number of carbon atoms may be, for example, 1 to 8, preferably 1. May be 6 or 1 to 3.
  • Examples of the halogen atom in R 2 include fluorine, chlorine, bromine, iodine and the like.
  • Examples of the hydrocarbon group represented by R 2 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group and the like, and the number of carbon atoms may be, for example, 1 to 3.
  • the alkyl group, alkenyl group and alkynyl group in R 1 to R 3 may be linear or branched chain.
  • Examples of the hydrocarbon group in R 5 and R 6 include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group and the like, and the number of carbon atoms may be, for example, 1 to 3. In R 5 and R 6.
  • the number of carbon atoms of the alkoxycarbonyl group and the alkyl group constituting the alkylcarbonyl group may be, for example, 1 to 4.
  • the alkyl group, alkenyl group and alkynyl group in R 5 to R 6 may be linear or branched chain.
  • substitution number n of the substituents R 4 on the phenyl group can be, for example, a 0-2, may be preferably 0 or 1.
  • the pyrazole derivative represented by the formula (I) may contain one or more asymmetric carbon atoms or asymmetric centers in its structural formula, and may contain two or more kinds of optical isomers. However, the present invention also includes all optical isomers and mixtures containing them in arbitrary proportions. Further, the pyrazole derivative represented by the formula (I) may have two or more kinds of geometric isomers and tautomers derived from the double bond in its structural formula, but each geometric isomer is present. It also includes all mixtures containing bodies and tautomers in arbitrary proportions. Further, various crystal polymorphs, hydrates, solvates and the like of the pyrazole derivative represented by the formula (I) are also included.
  • the pyrazole derivative represented by the formula (I) is synthesized, for example, by condensing and ring-closing the aldehyde compound represented by the formula A and the indole derivative represented by the formula B according to the following synthesis scheme. It can be synthesized via a pyrazole derivative represented by the formula (Ia).
  • the aldehyde derivative represented by the formula A can be synthesized, for example, according to the following synthesis scheme.
  • the pyrazole derivative represented by the formula (I) has a binding ability to VDAC and KDELR1 as described above. Therefore, in the present invention, in addition to the pyrazole derivative represented by the formula (I), a VDAC binder, a VDAC function regulator, a VDAC-related disease therapeutic agent, a KDELR1 binder, and a KDELR1 function containing the pyrazole derivative as an active ingredient are used. Includes regulators and therapeutic agents for KDELR1-related diseases. Furthermore, the present invention is a therapeutic agent for Warburg effect-related diseases containing a pyrazole derivative represented by the formula (I) as an active ingredient, an energy production regulator in mitochondria, a glycolipid metabolism regulator, a cell death inducer, and a research agent. Includes reagents.
  • Warburg effect-related diseases include cancer (tumor), neurodegenerative disease, ischemic disease, nephritis, metabolic disease, viral disease, spinal cord dysplasia disease, liver disease, joint disease, ear disease and the like.
  • cancers include leukemia, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, colon cancer, retinoblastoma, brain tumor, glioma, oral cancer, nasopharyngeal cancer, mesopharyngeal cancer, hypopharyngeal cancer. Cancer, laryngeal cancer, kidney cancer and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition contains a pyrazole derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and is selected from the group consisting of voltage-dependent anion channel-related diseases and KDEL receptor 1-related diseases. It is used in the treatment of at least one disease.
  • the treatment of the disease may be any treatment given to the disease, and examples thereof include treatment of the disease, improvement, suppression of progression (prevention of exacerbation), prevention, alleviation of symptoms caused by the disease, and the like. Be done.
  • Warburg effect-related diseases include neurodegenerative diseases, ischemic diseases, nephritis, metabolic diseases, viral diseases, spinal dysplasia diseases, liver diseases, joint diseases, ear diseases, tumors and the like.
  • Further tumors include leukemia, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, colon cancer, retinoblastoma, brain tumor, glioma, oral cancer, nasopharyngeal cancer, mesopharyngeal cancer, hypopharyngeal cancer. , Laryngeal cancer, kidney cancer, etc.
  • the pharmaceutical composition may be used in the treatment of tumors derived from mutant KRAS or mutant KRAS-related signals.
  • tumors derived from mutant KRAS or mutant KRAS-related signals include pancreatic cancer, lung cancer, colorectal cancer, and melanoma and breast cancer associated with mutant KRAS-related signals.
  • Drug-resistant cancer and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition can be prepared according to a conventional method using at least one of the pyrazole derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. ..
  • the pharmaceutical composition can be administered parenterally or orally depending on its dosage form.
  • Dosage forms that are administered parenterally include, for example, injections, infusions, eye drops, nasal agents, and lung agents.
  • Examples of the dosage form to be orally administered include solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders, troches, syrups, emulsions and suspensions, liquid preparations or semi-liquid preparations. ..
  • the pharmaceutical composition may contain the pyrazole derivative represented by the formula (I) itself as an active ingredient, or may contain a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Specific examples of the pharmaceutically acceptable salt include acid addition salts, metal salts, ammonium salts, organic amine addition salts and the like.
  • Acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochlorides, sulfates, nitrates and phosphates; acetates, maleates, fumarates, citrates, malates, lactates and ⁇ -ketoglutarates. , Gluconate, organic acid salts such as caprylate, and the like.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt; aluminum salt and zinc salt.
  • Examples of the ammonium salt include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
  • Examples of the organic amine addition salt include salts such as morpholine and piperidine.
  • any carrier commonly used in pharmaceutical preparations can be used.
  • the carrier include excipients, disintegrants, binders, fluidizers, lubricants, etc. in solid formulations, and solvents, solubilizers, suspending agents, isotonic agents, buffers, etc. in liquid formulations.
  • a pH adjuster, a pain-relieving agent, etc. may be mentioned.
  • additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, refreshing agents or flavoring agents, defoaming agents, and thickeners may be included.
  • Excipients include, for example, lactose, sucrose, D-mannitol, D-sorbitol, corn starch, dextrin, microcrystalline cellulose, crystalline cellulose, carmellose, carmellose calcium, carboxymethyl starch sodium, low-substituted hydroxypropyl cellulose, etc. Arabic rubber and the like can be mentioned.
  • examples of the disintegrant include carmellose, carmellose calcium, carmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, croscarmellose sodium, crospovidone, low degree of substitution hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, crystalline cellulose and the like.
  • binder examples include hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, povidone, crystalline cellulose, sucrose, dextrin, starch, gelatin, carmellose sodium, gum arabic and the like.
  • fluidizing agent examples include light anhydrous silicic acid and magnesium stearate.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, talc and the like.
  • Examples of the solvent in the liquid preparation include purified water, ethanol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, olive oil and the like.
  • Examples of the solubilizing agent include propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Examples of the suspending agent include benzalkonium chloride, carmellose, hydroxypropyl cellulose, propylene glycol, povidone, methyl cellulose, glycerin monostearate and the like.
  • Examples of the tonicity agent include glucose, D-sorbitol, sodium chloride, D-mannitol and the like.
  • Examples of the buffer or pH adjuster include sodium hydrogen phosphate, sodium acetate, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • Examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, chlorobutanol, benzyl alcohol, sodium dehydroacetate, sorbic acid and the like.
  • Examples of the antioxidant include sodium sulfite, ascorbic acid and the like.
  • Examples of the colorant include edible pigments (eg, edible red No. 2 or 3, edible yellow No. 4 or 5, etc.), ⁇ -carotene and the like.
  • Examples of the sweetener include sodium saccharin, dipotassium glycyrrhizinate, aspartame and the like.
  • Examples of the refreshing agent or flavoring agent include l-menthol or mint water.
  • Examples of the defoaming agent include dimethylpolysiloxane and silicone defoaming agents.
  • Examples of the thickener include xanthan gum, tragant, methyl cellulose, dextrin and the like.
  • the pharmaceutical composition may contain other anticancer agents or may be used in combination with other anticancer agents, if necessary.
  • Other anticancer agents include, for example, antimetabolites, molecular targeted agents, alkylating agents, plant alkaloids, anticancer antibiotics, platinum preparations, hormonal agents, biological response regulators, immune checkpoint inhibitors, etc. Can be mentioned.
  • anticancer agents for example, antimetabolites include gemcitabine, cytarabine, enocitabine, tegafur, carmofur and the like.
  • Molecular-targeted drugs include imatinib, gefitinib, sunitinib, cetuximab and the like.
  • the alkylating agent include ifosfamide, cyclophosphamide, dacarbacin and the like.
  • the plant alkaloid agent include docetaxel, vincristine, vindesine, vinblastine and the like.
  • anticancer antibiotics include pirarubibicin, bleomycin, mitomycin, peplomycin and the like.
  • platinum preparation examples include cisplatin, carboplatin, oxaliplatin and the like.
  • hormonal agents include exemestane, tamoxifen, prednisolone and the like.
  • biological response regulator examples include interferon and interleukin.
  • Immune checkpoint inhibitors include nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab and the like.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, dosage and the like, and is, for example, 0.1% by weight or more and 20% by weight or less, or 0.1% by weight or more and 10% by weight or less of the entire composition. ..
  • the administration dose of the pharmaceutical composition is appropriately selected depending on the administration subject, disease, symptom, dosage form, administration route and the like.
  • the administration dose is, for example, when orally administered to an adult cancer patient, the active ingredient is usually about 0.1 mg or more and 500 mg or less, or about 0.5 mg or more and 100 mg or less per day, and is administered once or several times. It can be administered separately.
  • Disease Treatment methods include administering to a subject an effective amount of the pharmaceutical composition and are selected from the group consisting of voltage-dependent anion channel-related (VDAC) diseases and KDEL receptor 1-related diseases. It is a method of treating at least one kind of disease.
  • VDAC voltage-dependent anion channel-related
  • KDEL receptor 1-related diseases KDEL receptor 1-related diseases.
  • the details of the pharmaceutical composition and the administration method are as described above.
  • the subject of treatment is, for example, a mammal, which includes a human.
  • the target of treatment may be a non-human animal.
  • the present invention in another aspect, is represented by formula (I) in the manufacture of a pharmaceutical composition used in the treatment of at least one disease selected from the group consisting of VDAC-related diseases and KDEL receptor 1 related diseases.
  • Use of pyrazole derivatives use of pyrazole derivatives represented by formula (I) in the treatment of at least one disease selected from the group consisting of VDAC-related diseases and KDEL receptor 1 related diseases, VDAC-related diseases and KDEL receptors 1
  • VDAC-related diseases and KDEL receptors 1 Includes a pyrazole derivative represented by formula (I) used in the treatment of at least one disease selected from the group consisting of related diseases.
  • Example 1 To evaluate the activity of the test compound, the genome of only one allele was edited for the human colon cancer cell line HCT116, and the wild-type KRAS was applied to HKe3 cells, which are colon cancer cell lines established by deleting only the mutant KRAS. HKe3-wtKRAS re-expressing (wtKRAS) and HKe3-mtKRAS re-expressing mutant KRAS (G13D; mtKRAS) were used (eg, S. Shirasawa et al. Science, 260, 1993, T. Tsunoda). et al. Anticancer Res. 35 (8), 2015).
  • HKe3 cells and HKe3-wtKRAS cells show a normal morphology like colon crypt, and by three-dimensional suspension culture as a cell mass (spheroid), the cell proliferation inhibitory activity of the test compound is reproduced in a state where the cancer microenvironment is reproduced. It is considered that it can be evaluated.
  • the cell polarity and luminal apoptosis of HKe3-mtKRAS cells are inhibited, and the cell proliferation inhibitory activity of the test compound can be evaluated by culturing the cells three-dimensionally as a cell mass.
  • STAR2 is a compound listed in the RIKEN library and obtained from Namki Shoji Co., Ltd.) and anthracycline.
  • DMSO solvent
  • HKe3-wtKRAS was sown at 2000 cells / well and HKe3-mtKRAS at 500 cells / well on a round bottom non-adhesive 96-weldish.
  • DMEM high glucose
  • 10% FBS was used as the medium, and the cells were cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
  • test compound was administered as a single dose at 16.6 ⁇ M or 50.0 ⁇ M at the start of culture (Day 0). Images of cell clusters formed in one well on the 3rd and 6th days of culture were obtained by Inner cell analyzer (manufactured by GE Healthcare), and the cell proliferation inhibitory activity was evaluated by increasing or decreasing the cross-sectional area. The state of the cell mass on the 6th day of culture is shown in FIG.
  • test compound STAR2 did not affect the cell proliferation of wild-type KRAS-expressing cells, but strongly suppressed the cell proliferation of mutant KRAS-expressing cells in a concentration-dependent manner.
  • doxorubicin did not suppress cell proliferation against mutant KRAS-expressing cells.
  • Example 2 As cell lines, human colon cancer cell lines HCT116, Calu-6, SW620 which are mutant KRAS expressing cells; human melanoma cell line SK-MEL28 having a mutation in the BRAF gene involved in mutant KRAS-related signals, human breast cancer cell line MDA-231; Human prostate cancer cell line LNCAP with mutation in PTEN gene involved in mutant KRAS-related signal; Human cervical cancer cell line HeLa with mutation in CTNNNB1 gene involved in mutant KRAS-related signal, human liver cancer cell
  • the activity of the test compound STAR2 was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the strain HepG2 was used and only STAR2 was used as the test compound and the administration concentration was 5 ⁇ M, 15 ⁇ M or 45 ⁇ M.
  • the state of the cell mass on the 6th day of culture is shown in FIG.
  • test compound STAR2 showed concentration-dependent cell proliferation suppression in mutant KRAS-expressing cells and cells having mutations in genes involved in mutant KRAS-related signals.
  • Example 3 A vemurafenib-resistant strain, which is a BRAFV600E inhibitor, was established using patient-derived melanoma cells (BRAFV600E mutation) as a parent strain. The activity of the test compound STAR2 was evaluated in the same manner as in Example 2 except that the parent strain and the vemurafenib resistant strain were used. The state of the cell mass on the 6th day of culture is shown in FIG.
  • test compound STAR2 showed concentration-dependent cell proliferation inhibition against melanoma and vemurafenib-resistant strains derived from clinical specimens.
  • Example 4 Subcutaneous 4-week-old female nude mice were inoculated with 1.5 ⁇ 110 6 human colorectal cancer HCT116 cells suspended in Matrigel (BD matrigel matrix, manufactured by BD bioscience). The tumor was bred under normal breeding conditions, and the time when the major axis of the tumor exceeded 5 mm was set as the first day (D0), and the test compound STAR2 was administered intraperitoneally at doses of 10 mg / kg, 40 mg / kg or 80 mg / kg once a day. Breeding was continued with multiple doses. DMSO, which is a solvent, was administered to the control. The change in tumor volume is shown in FIG.
  • STAR2 suppressed tumor growth in nude mice in a dose-dependent manner.
  • the GI50 was 7.7 mg / kg.
  • no toxicity was observed even when the dose was 80 mg / kg.
  • no toxicity was observed even after continuous administration for 4 weeks, and no toxicity was observed even when the test compound STAR2 was administered by drinking water.
  • Example 5 Nude mice having a dose of 40 mg / kg in Example 4 were collected on the 8th day of continuous breeding, and various hematological tests were performed.
  • 5A shows the white blood cell count (WBC)
  • FIG. 5B shows the red blood cell count
  • FIG. 5C shows the hemoglobin value (HGB)
  • FIG. 5D shows the hematocrit value (HCT)
  • FIG. 5E shows the platelet count (PLT).
  • Centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 5 min) was performed, and the bead washing in which the supernatant was discarded was repeated 3 times, and then 50 ⁇ L of protein-immobilized buffer was added to disperse the beads by ultrasonic waves. Then, after adding 50 ⁇ L of STAR2 solution, the reaction was carried out at 37 ° C. overnight (16 to 20 hours) with a microtube mixer. Centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 5 min) was performed and the supernatant was discarded.
  • Pull-down assay using STAR2 immobilized beads 2.5M KCl 60mL, Glycerol 126g, 1M HEPES-NaOH (pH 7.9) 20mL, 1M MgCl 2 1mL, 1M CaCl 2 200 ⁇ L, 0.5M EDTA (pH 8.0) 400 ⁇ L, 10 mL of 10% (w / v) NP-40 was mixed and measured up to 500 mL with ultrapure water to prepare 2 ⁇ 150 mM KCl buffer (500 mL). 25 mL of 2 ⁇ 150 mM KCl buffer and 25 mL of deionized water were mixed to prepare 150 mM KCl buffer on ice.
  • the protein solution was prepared on ice with 150 mM KCl buffer to 4 mg / mL.
  • the prepared protein solution was dispensed into a 1.5 mL microtube and centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C., 30 minutes or more) to remove insoluble matter.
  • STAR2 immobilized beads were weighed 0.1 mg into a 1.5 mL microtube.
  • 200 ⁇ L of 150 mM KCl buffer was added to disperse the beads. After the spin-down, magnetic separation was performed for 5 minutes, and bead washing in which the supernatant was discarded was repeated 3 times.
  • STAR2 dissolved in DMSO was added to 200 ⁇ L of the protein solution, and a competitive inhibition reaction was carried out at 4 ° C.
  • the competitive inhibition concentrations were STAR20 mM (DMSO control) and STAR2 1 mM.
  • 200 ⁇ L of the protein solution after competitive inhibition was added to a 1.5 mL microtube containing the beads from which the supernatant was discarded, and dispersed.
  • the binding reaction was carried out at 4 ° C. for 2 hours with stirring with a rotator. After 2 hours, spin down was performed, magnetic separation was performed, and the supernatant was discarded. 200 ⁇ L of 150 mM KCl buffer was added to disperse the beads, and after spin-down, magnetic separation was performed for 5 minutes, and a washing treatment of discarding the supernatant was repeated 3 times.
  • Fixative 1 Prepared by mixing 100 mL of methanol, 10 mL of acetic acid, and 90 mL of deionized water.
  • Fixative 2 Prepared by mixing 100 mL of methanol and 100 mL of deionized water.
  • Sensitizing solution Prepared by diluting 20 mL of the sensitizing stock solution with 180 mL of deionized water.
  • Staining solution Prepared by diluting 20 mL of the staining stock solution with 180 mL of deionized water.
  • Developer 1 g of developing powder was dissolved in 190 mL of deionized water, and 10 mL of undiluted developer was added to prepare.
  • the gel was immersed in 200 mL of fixation solution 1 and shaken for 20 minutes.
  • the fixative 1 was discarded, the gel was immersed in 200 mL of fixative 2 and shaken for 10 minutes.
  • the fixative 2 was discarded, the gel was immersed in 200 mL of deionized water, and washed with shaking for 10 minutes.
  • the deionized water was discarded, the gel was immersed in 200 mL of sensitizer and shaken for 1 minute.
  • the sensitizer was discarded, the gel was immersed in 200 mL of deionized water, and the washing treatment of shaking for 1 minute was repeated twice.
  • the deionized water was discarded, the gel was immersed in 200 mL of stain and shaken for 20 minutes.
  • the stain was discarded, the gel was immersed in 200 mL of deionized water, and the washing treatment of shaking for 1 minute was repeated twice.
  • the deionized water was discarded, the gel was immersed in 200 mL of developer and shaken for 3 to 10 minutes until a suitable stained image was obtained.
  • 20 mL of a stop solution was added and the mixture was shaken for 1 minute.
  • the developer was discarded, the gel was immersed in 200 mL of deionized water, and the washing treatment of shaking for 1 minute was repeated 3 times.
  • the obtained silver-stained gel was immersed in deionized water and stored at 4 ° C.
  • the silver-stained gel is shown in FIG. 6A.
  • FIG. 6B The results of Western blotting (immunoblot) using an anti-panVDAC antibody (Abcam, 15895) are shown in FIG. 6B, using an anti-VDAC1 antibody (Abcam, 14734) and an anti-VDAC2 antibody (Abcam, 37985).
  • FIG. 6C Western blots were performed by conventional methods under competitive inhibition conditions with the addition of 0.2 mM or 1 mM STAR2. From FIG. 6B, it was shown that STAR2 binds directly to VDAC. Further, from FIG. 6C, it was shown that STAR2 has a higher affinity for VDAC1 than VDAC2.
  • FIG. 6E The results of Western blotting using an anti-KDELR1 antibody (Novus Biologicals, 12873) are shown in FIG. 6E. From FIG. 6E, it was shown that STAR2 binds directly to KDELR1.
  • Example 7 3D suspension culture DMEM (high glucose, GIBCO) with 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% pen / strip / glutate (PSG100x; GIBCO), G418 (070-05183, wako) (600 ug / ml; stock 80) HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were cultured using (10F + G418 + puro) in which ml) and puro (2 ⁇ g / ml; stock 10 ⁇ g / ⁇ l) were added as a culture medium.
  • HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were seeded on a low-adhesion round bottom 96-well plate at 4000 cells / well and 1000 cells / well, respectively.
  • STAR2 was administered as a test compound.
  • DMSO of the same concentration was used as a control.
  • the cell mass was inverted from a 96-well plate to a plastic dish, collected in a 50 ml tube by centrifugation (200 G), washed with PBS, and centrifuged again.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • ROS was high in the mutant KRAS-positive cancer control (mt DMSO), and administration of STAR2 (mt STAR) suppressed the production of ROS.
  • sugar uptake was high in the mutant KRAS-positive cancer control (mt DMSO), and administration of STAR2 (mt STAR) suppressed sugar uptake.
  • Example 8 Other than using anti-PDK1 antibody (see Cell Signaling Technology, 3062.), Anti-GLUT1 antibody (see Cell Signaling Technology, 12939.), or anti-Hexokinase2 (HK2) antibody (see Cell Signaling Technology, 2106.) As the primary antibody. Evaluated the expression of PDK1, GLUT1 and HK2 in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG.
  • RNA Sequence and Data Analysis NEBNext from 750 ng total RNA extracted from 750 ng total RNA of HKe3-wtKRAS and HKe3-mtKRAS cells treated or untreated with STAR2 (30 ⁇ M) a library for RNA sequence (RNA-seq). Prepared using rRNA Depletion Kit (NEB, Tokyo, Japan: # E6318) and NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit (NEB, # E7420S).
  • the adapter sequence of the end pair (Paired end reads (151 bpx2)) obtained by the HiSeqX platform (Illumina, CA, USA) was removed by the cutapt-1.7.1 and the Topat 2.1.1 (http: // ccb). .jhu.edu / software / tophat / index.shtml) was used to map on the human reference genome (hg19). Then, picard-tools-1.109 was used to remove the overlap by PCR.
  • the generated Bam file is a gene annotation file obtained from Illumina iGenomes website (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html) (archive-2012-03-09-03-24-41).
  • the transcription amount of each gene was quantified by Cufflinks 2.2.1 (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/) using (.gtf file).
  • the Gene expression values were calculated as fragments per kilobase of exon per million mapped fragments (FPKM). The results are shown in FIG. 11 using IGV (Integrative Genomics Viewer).
  • the vertical axis indicates the expression level of mRNA, and each peak indicates an exon. From FIG. 11, it can be seen that treatment of HKe3-mtKRAS cells with STAR2 reduces the expression levels of LDHA, HK2, Glut1, and PDK1 mRNAs.
  • Example 10 The cell proliferation inhibitory activity of the test compound was evaluated in the same manner as in Example 1 except that the following compound was used as the test compound at 7.5 ⁇ M.
  • FIG. 12A shows the measurement results of the cross-sectional area of the cell mass in Day 3 and Day 7.
  • FIG. 12B shows the cell proliferation inhibitory activity calculated from the ratio of the cross-sectional area to the control as a relative value (%) with the case of KMA53 as 100%.
  • FIG. 12C shows the ratio (wt / mt) of the cell proliferation inhibitory activity in the wild-type KRAS cell line (HKe3-wtKRAS) to the cell proliferation inhibitory activity in the mutant KRAS cell line (HKe3-mtKRAS).
  • test compound exhibits cell proliferation inhibitory activity in the mutant KRAS cell line.
  • KMA052 and KMA054 are less toxic to the wild-type KRAS cell line than STAR2 and exhibit excellent cell proliferation inhibitory activity to the mutant KRAS cell line.
  • JC-1 a small molecule fluorescent dye, accumulates in mitochondria in a mitochondrial membrane potential-dependent manner. Further, when JC-1 accumulates in mitochondria to form a dimer, the fluorescence characteristic of JC-1 changes from green (about 530 nm) to red (about 590 nm). Therefore, when the membrane potential of mitochondria is high, the concentration of JC-1 in the mitochondria increases, and the pigment aggregates to emit red fluorescence. On the other hand, when the membrane potential of mitochondria is low, the concentration of JC-1 is low and it is present as a monomer, so that it emits green fluorescence.
  • mitochondrial activation can be evaluated (see the Dojindo JC-1 Mito MP Detection Kit manual). Specifically, mitochondrial activation was evaluated as follows.
  • HKe3-wtKRAS cells (4000cell / well) or HKe3-mtKRAS cells (1000cell / well) were seeded on an 8-chamber slide (Thermo) with DMEM (high glucose) + 10% FBS (200 ⁇ L) and in a 5% CO 2 incubator.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 3 days. 100 ⁇ L of medium was removed, 100 ⁇ L of 60 ⁇ M STAR2 solution diluted with DMEM medium was added to reach the final concentration (30 ⁇ M), and the mixture was incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 30 minutes.
  • STAR2 (30 ⁇ M) induced mitochondrial hyperpolarization in HKe3-mtKRAS 30 minutes after administration.
  • Example 12 Western blots were performed on the test compounds used in Example 10 using an anti-panVDAC antibody (15895, manufactured by abcam) and an anti-KDELR1 antibody. Western blots were performed under competitive inhibition conditions with the addition of 0.9 mM test compound. The results are shown in FIG.
  • KMA052 had a high affinity for VDAC and was low for KDELR1.
  • KMA053 had a high affinity for both VDAC and KDELR1.
  • KMA003 had no affinity for VDAC and had a high affinity for KDELR1.
  • Example 13 The following compounds were used as the test compounds.
  • DMEM high glucose, GIBCO
  • FBS pen / strip / glutamate
  • G418 (070-05183, wako) (600 ⁇ g / ml; stock 80 mg / ml) and puro (2 ⁇ g / ml; HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were three-dimensionally suspended and double-cultured using the mixture (10F + G418 + puro) to which stock (10 ⁇ g / ⁇ l) was added as a culture medium.
  • HKe3-wtKRAS cells were seeded at 4000 cells / well and HKe3-mtKRAS cells were seeded at 1000 cells / well on a low-adhesion round bottom 96-well plate.
  • the test compound was administered, and DMSO at the same concentration was added as a control.
  • the cross-sectional area of the cell mass was measured on the 3rd and 7th days of culturing.
  • the cross-sectional area data was calculated as the average value of the values of the four wells.
  • FIG. 15 shows the measurement results of the cross-sectional area of the cell mass on Day 3 and Day 7.
  • the table below shows TD50 (50% ToxicDose) and ED50 (50% EffectiveDose).
  • the concentration of TD50 was such that the cross-sectional area of the HKe3-wtKRAS cell mass (wild-type KRAS; normal model) on the 7th day was reduced by 50% as compared with the control.
  • the ED50 was set to a concentration that reduced the cross-sectional area of the HKe3-mt KRAS cell mass (mutant KRAS; cancer model) on the 7th day by 50% as compared with the control. The larger the value of TD50 / ED50, the less cytotoxic the compound.
  • KMA092 and KMA096 show excellent cell proliferation inhibitory activity against the mutant KRAS cell line. From Table 2, it can be seen that KMA092 has lower cytotoxicity than STAR2.
  • KMA092 was synthesized as follows. Further, KMA096 was also synthesized in the same manner.
  • a 37% aqueous formaldehyde solution (103.0 mg) was added to a solution of 7-azaindole (150.0 mg), dimethylamine hydrochloride (114.0 mg), and 1-butanol (1.30 ml) at room temperature.
  • the reaction solution was stirred at 120 ° C. for 2.5 hours, the reaction solution was cooled to room temperature, and then water, concentrated hydrochloric acid and ether were added.
  • a liquid separation operation was performed, and the aqueous phase was further washed with ether.
  • a 48% aqueous sodium hydroxide solution was added to the aqueous phase, and this was extracted with chloroform.
  • the obtained extract was dried over sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give the desired alkylated compound in a yield of 60%.
  • the alkylated compound (70.8 mg) was dissolved in a mixture of methanol (0.6 ml) and nitromethane (0.6 ml), cooled to 0 ° C., dimethyl sulfate (43 ⁇ l) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After cooling the reaction solution to 0 ° C. again, a methanol solution (90 ⁇ l) of 28% sodium methoxide was slowly added. After stirring at room temperature for 1.5 hours, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and extraction was performed with ethyl acetate. The obtained extract was dried over sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give the desired nitro compound in a yield of 39%.
  • Example 14 Western blots using anti-panVDAC antibody and anti-KDELR1 antibody were performed on the test compounds used in Example 13. Western blots were performed under competitive inhibition conditions with the addition of 0.9 mM test compound. The results are shown in FIG.
  • KMA092 and KMA096 bound to VDAC and KDELR1.
  • Example 15 Among the test compounds used in Example 13, the effect of the test compound on the expression level of HIF-1 ⁇ in the three-dimensional suspension culture in the same manner as in Example 7 except that KMA092 was used at 11 ⁇ M (25% inhibitory concentration). was evaluated. The results are shown in FIG.
  • KMA092 suppressed the expression of HIF-1 ⁇ specifically in HKe3-mtKRAS cells.
  • Two-dimensional culture DMEM high glucose, GIBCO
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • PSG100x pen / strip / glutamate
  • G418 (070-05183, wako) (600 ug / ml; stock 80 mg / ml)
  • puro (2 ⁇ g / ml; stock 10 ⁇ g / ⁇ l) were added (10F + G418 + puro) as a culture medium, and HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were seeded and cultured in 10 cm. The cells were collected when they had grown to about 80% confluent.
  • HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were seeded on a low-adhesion round bottom 96-well plate at 4000 cells / well and 1000 cells / well, respectively.
  • the cell mass was inverted with a 96-well plate on a plastic dish, collected in a 50 ml tube by centrifugation (200 G), washed with PBS, and then centrifuged again to collect the cells as a cell mass.
  • Example 15 3D suspension culture DMEM (high glucose, GIBCO) with 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% pen / strip / glutate (PSG100x; GIBCO), G418 (070-05183, wako) (600 ug / ml; stock 80) HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were cultured using (10F + G418 + puro) in which ml) and puro (2 ⁇ g / ml; stock 10 ⁇ g / ⁇ l) were added as a culture medium.
  • DMEM high glucose, GIBCO
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • PSG100x pen / strip / glutate
  • G418 (070-05183, wako)
  • HKe3-wtKRAS cells and HKe3-mtKRAS cells were cultured using (10F + G418 + puro) in which ml) and puro (2
  • HKe3-wtKRAS cells were seeded at 4000 cells / well and HKe3-mtKRAS cells were seeded at 1000 cells / well on a low-adhesion round bottom 96-well plate.
  • STAR2 7.5 ⁇ m
  • DMSO DMSO of the same concentration was added as a control, and cell culture was performed to obtain a cell mass.
  • the expression level of BIP binding to KDELR1 decreased in both HKe3-wtKRAS and HKe3-mtKRAS.
  • the expression levels of TUBB3 and TUBB4 that bind to VDAC were not changed in HKe3-wtKRAS, but decreased in HKe3-mtKRAS.
  • the original PDB data is converted into a pdbqt file by AutoDockToo (http://autodock.scripps.edu/resources/adt), and AutoDock Vina (http://vina.scripps) By .edu /), 9 orientations (poses) were output in descending order of binding affinity.
  • the location of the ligand (search range) was the entire protein.
  • the binding affinity was evaluated again with AutoDock Vina for the structure optimized by the FMO method.
  • the number of poses to be searched was set to 20 (default is 9), including the enantiomer (S-form) of the ligand used in the calculation so far.
  • STAR2 the ligand (STAR2) binds to two N-terminal sites of VDAC1. From this, it is considered that the binding of STAR2 to VDAC1 inhibits the binding of tubulin (TUBB) or hexokinase (HK) to VDAC1.
  • TUBB tubulin
  • HK hexokinase
  • S-STAR2 and S-STAR2-N1 in Table 3 suggests that N1 substitution of STAR2 slightly lowers the overall affinity for VDAC1 but improves the affinity for the functional domain. rice field.
  • the ligand binds to the KDEL sequence recognition site of KDELR1. From this, it is considered that the binding of STAR2 to KDELR1 inhibits the binding of the chaperone molecule having the KDEL sequence at the C-terminal to KDELR1. This suggests that the increase in ER stress-induced HIF-1 expression level associated with the increase in KDELR expression level in cancer cells may be suppressed.
  • the contrast between S-STAR2 and S-STAR2-N1 in Table 5 suggests that N1 substitution of STAR2 does not significantly change the overall affinity for KDELR1, but improves the affinity for the functional domain. rice field.
  • Example 17 For the interaction between the ligand and each amino acid residue constituting VDAC1, the interaction energy was calculated using PEEDA (Pair Interaction Analysis Analysis) of the FMO method. In PIEDA, the interaction energy between amino acid residues is also calculated, but since the numerical data is enormous, here, the interaction energy (kcal / mol) between the ligand and each amino acid residue (285 in total) is used. , The components of electrostatic interaction ( ⁇ Ees), exchange repulsion ( ⁇ E0), charge transfer interaction ( ⁇ ct * es), dispersion force ( ⁇ disp) and interaction with solvent ( ⁇ Gsol) total ( ⁇ total). rice field.
  • PEEDA Peak Interaction Analysis Analysis Analysis
  • the energy of interaction between the ligand and the amino acid adjacent to the ligand at each binding site of VDAC1 was calculated using PEEDA of the FMO method.
  • Amino acids existing at a distance of 2.5 ⁇ to 8 ⁇ from the ligand were designated as bound amino acids.
  • Met1, Ala2, Pro4, Thr6, Asp9, Leu10 and Gly11 were selected as the binding amino acids in pocket2, and Ala2, Val3, Pro4, Pro5, Thr6 and Tyr7 were selected as the binding amino acids in pocket3.
  • the sum of the interactions between the ligand and each amino acid residue is the components of the electrostatic interaction ( ⁇ Ees), exchange repulsion ( ⁇ E0), charge transfer interaction ( ⁇ ct * es), dispersion force ( ⁇ disp), and solvent. It is shown by the total ( ⁇ total) of the interaction ( ⁇ Gsol) of.
  • Example 18 For the interaction between the ligand and each amino acid residue constituting KDELR1, the interaction energy was calculated using PEEDA of the FMO method.
  • the interaction energy (kcal / mol) between the ligand and each amino acid residue (203 in total) is the component electrostatic interaction ( ⁇ Ees), exchange repulsion ( ⁇ E0), and charge transfer interaction ( ⁇ ct * es). ), Dispersive force ( ⁇ disp) and interaction with solvent ( ⁇ Gsol) ( ⁇ total).
  • the energy of interaction between the ligand and the amino acid adjacent to the ligand at the binding site of KDELR1 was calculated using PEEDA of the FMO method.
  • Amino acids existing at a distance of 2.5 ⁇ to 8 ⁇ from the ligand were designated as bound amino acids.
  • Arg47, Tyr48, Glu117, Asn165 and Trp166 were selected as the binding amino acids in pocket1.
  • the sum of the interactions between the ligand and each amino acid residue is the components of the electrostatic interaction ( ⁇ Ees), exchange repulsion ( ⁇ E0), charge transfer interaction ( ⁇ ct * es), dispersion force ( ⁇ disp), and solvent. It is shown by the total ( ⁇ total) of the interaction ( ⁇ Gsol) of.

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Abstract

電位依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）結合能を有する化合物が提供される。ＶＤＡＣ結合能を有するピラゾール誘導体は、下記式（Ｉ）で表される。式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１から１２の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ４は置換基を表す。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基、炭素数１から６の置換されてもよいアルコキシカルボニル基、又は炭素数１から６の置換されてもよいアルキルカルボニル基を表す。Ｘ１からＸ４はそれぞれ独立して窒素原子又はＣ－Ｒ１１を表す。Ｒ１１は水素原子又は置換基を表す。ｎは０から４の整数を表す。Ｌは連結基を表す。

Description

ピラゾール誘導体及び医薬組成物
　本発明は、ピラゾール誘導体及び医薬組成物に関する。
　電位依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）は、ミトコンドリア外膜に存在するマスターチャネルタンパク質であり、ミトコンドリアと細胞質間のＡＴＰ、リン酸、カルシウム、呼吸基質などの物質輸送を行っていることが知られている。またＶＤＡＣは、Ｎ末端のドメインを介してオリゴマー（重合体）形成し、カルシウム、チトクロームｃ等の放出によるアポトーシスの誘導にも関与していると考えられている。ＶＤＡＣには、少なくとも３つのアイソフォーム（ＶＤＡＣ１、ＶＤＡＣ２及びＶＤＡＣ３）が存在する。ＶＤＡＣ１は特にカルシウムによって誘導されるアポトーシスに関与していると考えられている。
　癌細胞ではワールブルグ効果という現象が特異的に認められている。ワールブルグ効果とは、癌細胞においてグルコースからピルビン酸に変換されて生じたＡＴＰの経路が主に使用されている現象である。正常細胞では主にグルコースからピルビン酸に変換されて生じたＡＴＰに加えて、ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化によりさらなるＡＴＰを産生するが、癌細胞では好気的条件下でもミトコンドリアの機能が抑制されている。近年、癌特異的なチュブリンのＣ末端部、ヘキソキナーゼのＮ末端部、ＢＣＬ２／ＢＣＬ－ｘＬのＮ末端部がＶＤＡＣのＮ末端部に結合することによってチャンネルをふさいでいることが明らかになった。このようなＶＤＡＣ結合タンパクとＶＤＡＣの結合がミトコンドリア機能の抑制の原因であると考えられ、癌細胞における新たな標的としてＶＤＡＣ結合阻害剤が注目されている。
　上記に関連して、例えば、特開２０１１－１７８７１３号公報、特開２００３－３３５６７６号公報及び特開２００２－３３８４６９号公報には種々のＶＤＡＣ機能調整剤が提案されている。
　本発明は、ＶＤＡＣ結合能を有する化合物を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第一態様は、下記式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１から１２の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ４は置換基を表す。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基、炭素数１から６の置換されてもよいアルコキシカルボニル基、又は炭素数１から６の置換されてもよいアルキルカルボニル基を表す。Ｘ１からＸ４はそれぞれ独立して窒素原子又はＣ－Ｒ１１を表す。Ｒ１１は水素原子又は置換基を表す。ｎは０から４の整数を表す。Ｌは連結基を表す。
　前記置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、炭素数１から６のアルキルカルボニル基、カルバモイル基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルカルバモイル基、炭素数１から６のアシルアミノ基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルキルオキシ基、アミノ基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルアミノ基、カルボキシ基、及びスルホ基からなる群から選択される少なくとも１種であってよい、また、前記連結基は、炭素数１から３のアルキレン基、酸素原子、イミノ基、硫黄原子及びカルボニル基からなる群から選択される少なくとも１つから形成されてよい。
　第二態様は、前記ピラゾール誘導体を含む電位依存性陰イオンチャネル機能調整剤である。第三態様は、前記ピラゾール誘導体を含むＫＤＥＬ受容体１機能調整剤である。
　第四態様は、前記ピラゾール誘導体又はその薬学的に許容される塩を含み、電位依存性陰イオンチャネル関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置に用いられる医薬組成物である。前記疾患は、神経変性疾患、虚血性疾患、腎炎、代謝性疾患、ウイルス疾患、脊髄異形成疾患、肝疾患、関節疾患、耳疾患及び腫瘍からなる群から選択される少なくとも１種であってよい。前記疾患は、変異型ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍の少なくとも１種であってよい。
　第五態様は、前記医薬組成物を、対象に投与することを含む疾患の処置方法である。前記疾患は、神経変性疾患、虚血性疾患、腎炎、代謝性疾患、ウイルス疾患、脊髄異形成疾患、肝疾患、関節疾患、耳疾患及び腫瘍からなる群から選択される少なくとも１種であってよく、変異型ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍の少なくとも１種であってよい。
　本発明によれば、ＶＤＡＣ結合能を有する化合物を提供することができる。
ピラゾール誘導体のヒト大腸癌細胞株に対する増殖抑制効果を示す図である。 ピラゾール誘導体の各種細胞株に対する増殖抑制効果を示す図である。 ピラゾール誘導体のベムラフェニブ耐性株に対する増殖抑制効果を示す図である。 ピラゾール誘導体のヌードマウスの腫瘍に対する作用を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与した腫瘍移植ヌードマウスにおける血液中の白血球数を示す図である。 ピラゾールル誘導体を投与した腫瘍移植ヌードマウスにおける血液中の赤血球数を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与した腫瘍移植ヌードマウスにおける血液のヘモグロビン値を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与した腫瘍移植ヌードマウスにおける血液のヘマトクリット値を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与した腫瘍移植ヌードマウスにおける血液中の血小板数を示す図である。 ピラゾール誘導体を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。 ピラゾール誘導体とＶＤＡＣとの親和性を示す図である。 ピラゾール誘導体とＶＤＡＣ１及びＶＤＡＣ２との親和性を示す図である。 ピラゾール誘導体を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。 ピラゾール誘導体とＫＤＥＬＲ１との親和性を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株におけるＲＯＳの生成状態を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株における糖の取り込み状態を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株におけるＨＩＦ－１の発現状態を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株における各種タンパク質の発現状態を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株におけるｍＲＮＡの発現状態を示す図である。 ピラゾール誘導体関連化合物のヒト大腸癌細胞株に対する増殖抑制効果を示す図である。 ピラゾール誘導体関連化合物のヒト大腸癌細胞株に対する増殖抑制活性を示す図である。 ピラゾール誘導体関連化合物による変異型ＫＲＡＳ細胞株に対する野生型ＫＲＡＳ細胞株の増殖抑制活性の比を示す図である。 ヒト大腸癌細胞株におけるピラゾール誘導体によるミトコンドリアの過分極の誘導を示す図である。 ピラゾール誘導体関連化合物のＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１に対する親和性を示す図である。 ピラゾール誘導体関連化合物のヒト大腸癌細胞株に対する増殖抑制効果を示す図である。 ピラゾール誘導体のＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１に対する親和性を示す図である。 ピラゾール誘導体を投与したヒト大腸癌細胞株におけるＨＩＦ－１βの発現状態を示す図である。 ヒト大腸癌細胞株におけるＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１の発現状態を示す図である。 ヒト大腸癌細胞株におけるＶＤＡＣ結合タンパク質及びＫＤＥＬＲ１結合タンパク質の発現状態を示す図である。 ピラゾール誘導体とＶＤＡＣ１との結合状態を示す分子モデルの一例である。 ピラゾール誘導体とＶＤＡＣ１との結合状態を示す分子モデルの一例である。 ピラゾール誘導体とＫＤＥＬＲ１との結合状態を示す分子モデルの一例である。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、ピラゾール誘導体及び医薬組成物等を例示するものであって、本発明は、以下に示すピラゾール誘導体及び医薬組成物等に限定されない。
ピラゾール誘導体
　ピラゾール誘導体は、下記式（Ｉ）で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１から１２の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基を表す。Ｒ４は置換基を表す。Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基、炭素数１から６の置換されてもよいアルコキシカルボニル基、又は炭素数１から６の置換されてもよいアルキルカルボニル基を表す。Ｘ１からＸ４はそれぞれ独立して窒素原子又はＣ－Ｒ１１を表す。Ｒ１１は水素原子又は置換基を表す。ｎは０から４の整数を表す。Ｌは連結基を表す。
　ピラゾール誘導体は、例えば、ＶＤＡＣに結合することで癌細胞のアポトーシスを誘導すると考えられる。ピラゾール誘導体は、例えば、ＶＤＡＣのチャンネル機能を阻害し膜透過性亢進によってアポトーシスを誘導するタイプ、ＶＤＡＣチャンネルの閉鎖を誘導するＶＤＡＣ－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ＶＤＡＣ－ＨＫ及びＶＤＡＣ－ＢＣＬ２の結合等を阻害するタイプ、Ａｄｅｎｉｎｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＡＮＴ）－ＶＤＡＣの結合を阻害するタイプ、またはＶＤＡＣの発現を誘導しＶＤＡＣの重合化に引き続くアポトーシスを誘導するタイプの少なくとも１つに該当すると考えられる。
　また、ピラゾール誘導体は、ＫＤＥＬ受容体１（以下、ＫＤＥＬＲ１ともいう）に対する結合能を有していてよい。ＫＤＥＬＲ１は、ゴルジ体及び小胞体（ＥＲ）に発現し、ゴルジ体から小胞体へのタンパク質の逆行性輸送に関与し、小胞体に蓄積した折りたたみに異常を有するタンパク質が引き起こすストレスすなわち小胞体ストレスに関与するとされている。小胞体（ＥＲ）ストレスは、がん、糖尿病、自己免疫症状、肝疾患、肥満、神経変性疾患などといった多くの疾患で観察される。ＥＲストレスに対する細胞適応は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の活性化によって獲得されるとされている。ＵＰＲは、ＥＲのさまざまな生理機能を調節する統合されたシグナル伝達経路である。折りたたみに異常を有するタンパク質の蓄積に対し、このような適応メカニズムによって十分な制御ができない場合、細胞はアポトーシスを起こす。また、小胞体ストレスはＨｙｐｏｘｉａ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｆａｃｔｏｒ－１（ＨＩＦ－１）を活性化させるとされ、ＨＩＦ－１は、ヘキソキナーゼ（ＨＫ、Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）等の解糖系酵素の発現を誘導することによってワールブルグ効果を誘導する。したがってピラゾール誘導体は、ＫＤＥＬＲ１への結合によってアポトーシスを誘導するとともに、ＨＩＦ－１の活性化を阻害し、ワールブルク効果を抑制できると考えられる。
　ピラゾール誘導体は、変異型ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍細胞に対して、低毒性な増殖抑制効果を示すことができる。ピラゾール誘導体は変異型ＫＲＡＳを直接標的とせずに、下流のハブタンパク質を標的とすることができる。ピラゾール誘導体は、例えば、ＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１を標的とすることで、変型異ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍細胞に対して増殖抑制作用を示すと考えられる。
　変異型ＫＲＡＳのシグナルは、例えば、ＶＤＡＣに結合するチュブリンＢ３の発現を変化させて、ＶＤＡＣ機能を制御すると考えられる。ピラゾール誘導体は、ＶＤＡＣに結合することで変異型ＫＲＡＳシグナルを阻害すると考えられる。また、変異型ＫＲＡＳシグナルは、ＫＤＥＬＲ１の発現を上昇させて、ゴルジ体から小胞体への逆行性輸送を増強し、小胞体ストレスを誘発して、ＨＩＦ－１を活性化すると考えられる。ピラゾール誘導体は、ＫＤＥＬＲ１に結合することで小胞体ストレスを緩和し、ＨＩＦ－１の活性化を抑制すると考えられる。更に、ＫＤＥＬＲ１と結合するシャペロン分子であるＢＩＰは、ゴルジ体から小胞体に局在することで、小胞体の貯蔵カルシウムの放出に重要なＩＰ３Ｒ小胞体を活性化する。ＩＰ３Ｒ１はＧＲＰ７５を介してＶＤＡＣと結合し、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＡＭ）という小胞体からミトコンドリアへのカルシウム輸送等を活性化する構造を形成する。ミトコンドリアへのカルシウムの流入はさらに活性酸素種（ＲＯＳ）を誘導し、ＲＯＳに適応した癌細胞においては増殖が促進され、アポトーシスの回避に関与するとされていることから、ＫＤＥＬＲ１とＶＤＡＣとは、ＭＡＭを介して相互作用することで癌細胞の増殖を抑制すると考えることができる。
　式（Ｉ）における置換基としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、炭素数１から６のアルキルカルボニル基、カルバモイル基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルカルバモイル基、炭素数１から６のアシルアミノ基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルキルオキシ基、アミノ基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルアミノ基、カルボキシ基、及びスルホ基からなる群から選択される少なくとも１種を挙げることができる。置換基を構成するアルキル基部分は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
　式（Ｉ）におけるＬで表される連結基としては、炭素数１から３のアルキレン基、酸素原子、イミノ基、硫黄原子及びカルボニル基からなる群から選択される少なくとも１つから形成される連結基を挙げることができる。
　Ｒ１及びＲ３で表される炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アリールアルキル基等が挙げられ、炭素数は例えば１から８であってよく、好ましくは１から６又は１から３であってよい。Ｒ２におけるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。またＲ２で表される炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられ、炭素数は例えば１から３であってよい。Ｒ１からＲ３におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
　Ｒ５及びＲ６における炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられ、炭素数は例えば１から３であってよい。Ｒ５及びＲ６における。アルコキシカルボニル基及びアルキルカルボニル基を構成するアルキル基の炭素数は、例えば１から４であってよい。Ｒ５からＲ６におけるアルキル基、アルケニル基及びアルキニル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。
　フェニル基における置換基Ｒ４の置換数ｎは、例えば０から２であってよく、好ましくは０又は１であってよい。
　式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体は、その構造式中に１個または複数個の不斉炭素原子または不斉中心を含む場合があり、２種以上の光学異性体が存在する場合もあるが、本発明は各々の光学異性体、及びそれらが任意の割合で含まれる混合物をも全て包含するものである。また、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体は、その構造式中に、二重結合に由来する２種以上の幾何異性体、互変異性体が存在する場合もあるが、各々の幾何異性体、互変異性体が任意の割合で含まれる混合物をも全て包含する。さらに、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体の各種の結晶多型、水和物、溶媒和物等をも包含する。
　式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体は、例えば、以下のような合成スキームに従って、式Ａで表されるアルデヒド化合物と、式Ｂで表されるインドール誘導体とを縮合、閉環することで合成される式（Ｉａ）で表されるピラゾール誘導体を経由して合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　なお、式Ａで表されるアルデヒド誘導体は、例えば、以下のような合成スキームに準じて合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体は、上述したようにＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１に対する結合能を有している。従って、本発明は、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体に加えて、当該ピラゾール誘導体を有効成分として含有するＶＤＡＣ結合剤、ＶＤＡＣ機能調節剤、ＶＤＡＣ関連疾患治療剤、ＫＤＥＬＲ１結合剤、ＫＤＥＬＲ１機能調節剤、及びＫＤＥＬＲ１関連疾患治療剤を包含する。更に本発明は、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体を有効成分として含有するワールブルグ効果関連疾患治療剤、ミトコンドリア内でのエネルギー産生調節剤、糖脂質代謝調節剤、細胞死誘導剤及び研究用試薬を包含する。
　ここで、ワールブルグ効果関連疾患としては、癌（腫瘍）、神経変性疾患、虚血性疾患、腎炎、代謝性疾患、ウイルス疾患、脊髄異形成疾患、肝疾患、関節疾患、耳疾患等が挙げられる。さらに、癌（腫瘍）としては、白血病、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、大腸癌、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、神経膠腫、口腔癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、腎臓癌等が挙げられる。
医薬組成物
　医薬組成物は、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体又はその薬学的に許容される塩を含み、電位依存性陰イオンチャネル関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置に用いられる。ここで、疾患の処置とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、疾患に起因する症状の緩和等が挙げられる。
　電位依存性陰イオンチャネル関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される疾患には、ワールブルグ効果関連疾患が含まれる。ワールブルグ効果関連疾患として具体的には、神経変性疾患、虚血性疾患、腎炎、代謝性疾患、ウイルス疾患、脊髄異形成疾患、肝疾患、関節疾患、耳疾患、腫瘍等が挙げられる。更に腫瘍（癌）としては、白血病、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌、食道癌、大腸癌、網膜芽細胞腫、脳腫瘍、神経膠腫、口腔癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、喉頭癌、腎臓癌等が挙げられる
　医薬組成物は、変異型ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍の処置に用いられてもよい。変異型ＫＲＡＳ又は変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍として具体的には、直接変異型ＫＲＡＳの変異が関連する膵癌、肺癌、結腸直腸癌、及び変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに関連するメラノーマ、乳癌、各種薬剤耐性癌等を挙げることができる。
　医薬組成物は、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体又はその薬学的に許容される塩の少なくとも１種と、薬学的に許容される担体とを用いて、従来法に従って調製することができる。
　医薬組成物は、その剤形により非経口または経口投与することができる。非経口投与される剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤などが挙げられる。また、経口投与される剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの固体製剤、液体状製剤もしくは半液体状製剤が挙げられる。
　医薬組成物は、式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体自体を有効成分として含んでいてもよく、その薬学的に許容される塩を有効成分として含んでいてもよい。薬学的に許容される塩として具体的には例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α－ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられる。アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられる。有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、医薬品の製剤に慣用されている担体であれば、いずれも使用することができる。担体としては、例えば、固形製剤における賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤等、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤またはｐＨ調整剤、無痛化剤などが挙げられる。更に必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、清涼化剤または矯味矯臭剤、消泡剤、粘稠剤等の添加物を含んでいてもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴムなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロースなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、結晶セルロース、白糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、アラビアゴムなどが挙げられる。流動化剤としては、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルクなどが挙げられる。
　液状製剤における溶剤としては、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリンなどが挙げられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ－マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤またはｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
　保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などが挙げられる。着色剤としては、例えば、食用色素（例：食用赤色２号若しくは３号、食用黄色４号若しくは５号等）、β－カロテンなどが挙げられる。甘味剤としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテームなどが挙げられる。清涼化剤または矯味矯臭剤としては、例えばｌ－メントールまたはハッカ水などが挙げられる。消泡剤としては、例えばジメチルポリシロキサンまたはシリコン消泡剤などが挙げられる。粘稠剤としては、例えばキサンタンガム、トラガント、メチルセルロースまたはデキストリンなどが挙げられる。
　医薬組成物は、必要に応じて、他の抗癌剤を含有していてもよく、他の抗癌剤と併用してもよい。他の抗癌剤としては、例えば、代謝拮抗剤、分子標的薬、アルキル化剤、植物アルカロイド剤、抗癌性抗生物質、プラチナ製剤、ホルモン剤、生物学的応答調節剤、免疫チェックポイント阻害剤などが挙げられる。
　抗癌剤のうち、例えば、代謝拮抗剤としてはゲムシタビン、シタラビン、エノシタビン、テガフール、カルモフールなどが挙げられる。分子標的薬としてはイマチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブなどが挙げられる。アルキル化剤としてはイホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバシンなどが挙げられる。植物アルカロイド剤としてはドセタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなどが挙げられる。抗癌性抗生物質としてはピラルビビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ペプロマイシンなどが挙げられる。プラチナ製剤としてはシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどが挙げられる。ホルモン剤としてはエキセメスタン、タモキシフェン、プレドニゾロンなどが挙げられる。生物学的応答調節剤としてはインターフェロン、インターロイキンなどが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブなどがあげられる。
　医薬組成物における有効成分の含量は、剤形、投与量等により異なるが、例えば、組成物全体の０．１重量％以上２０重量％以下、又は０．１重量％以上１０重量％以下である。また、医薬組成物の投与用量は、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート等により適宜選択される。投与用量は、例えば、成人の癌患者に経口投与する場合、有効成分として、１日あたり、通常約０．１ｍｇ以上５００ｍｇ以下、又は約０．５ｍｇ以上１００ｍｇ以下であり、１回又は数回に分けて投与することができる。
疾患の処置方法
　疾患の処置方法は、有効量の前記医薬組成物を、対象に投与することを含み、電位依存性陰イオンチャネル関連（ＶＤＡＣ）疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患を処置する方法である。医薬組成物の詳細及び投与方法は既述の通りである。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、処置の対象は、非ヒト動物であってもよい。
　本発明は、別の態様として、ＶＤＡＣ関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置に用いられる医薬組成物の製造における式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体の使用、ＶＤＡＣ関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置における式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体の使用、ＶＤＡＣ関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置に使用される式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体を包含する。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　試験化合物の活性評価には、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６に対して片アレルのみのゲノム編集を行い、変異型ＫＲＡＳのみを欠失させて樹立した大腸癌細胞株であるＨＫｅ３細胞に、野生型ＫＲＡＳ（ｗｔＫＲＡＳ）を再発現させたＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ、及び変異型ＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ；ｍｔＫＲＡＳ）を再発現させたＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳを用いた（例えば、S. Shirasawa et al. Science, 260, 1993、T. Tsunoda et al. Anticancer Res.35(8), 2015参照）。ＨＫｅ３細胞、及びＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞は、大腸クリプト様の正常形態を示し、細胞塊（スフェロイド）として３次元浮遊培養することで、癌微小環境が再現される状態で試験化合物の細胞増殖抑制活性を評価することができると考えられる。ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞は、細胞極性と内腔のアポトーシスが阻害されており、細胞塊として３次元培養することで、試験化合物の細胞増殖抑制活性を評価することができる。
　試験化合物として、下式で表される化合物（以下では、ＳＴＡＲ２ともいう。なお、ＳＴＡＲ２は、国立研究開発法人理化学研究所ライブラリに収載の化合物であり、ナミキ商事より入手した。）と、アントラサイクリン系の抗腫瘍性抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｅ）を用いた。なお、コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）には溶媒（ＤＭＳＯ）のみを用いた。ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳを２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳを５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ、丸底非接着性９６ウェルディッシュに播種した。培地にはＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ）＋１０％ＦＢＳを用い、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内で培養を行った。試験化合物は、培養開始時（Ｄａｙ０）に１６．６μＭ又は５０．０μＭで単回投与した。培養３日目及び６日目に１ウェルにひとつ形成された細胞塊の画像をＩｎ　ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）で取得し、断面積の増減にて細胞増殖抑制活性を評価した。培養６日目の細胞塊の状態を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　図１に示すように、試験化合物ＳＴＡＲ２は、野生型ＫＲＡＳ発現細胞の細胞増殖には影響を与えなかったが、濃度依存的に変異型ＫＲＡＳ発現細胞の細胞増殖を強く抑制した。一方、ドキソルビシンには、変異型ＫＲＡＳ発現細胞に対する細胞増殖抑制は認められなかった。
（実施例２）
　細胞株として、変異型ＫＲＡＳ発現細胞であるヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、Ｃａｌｕ－６、ＳＷ６２０；変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに関与するＢＲＡＦ遺伝子に変異を有するヒトメラノーマ細胞株ＳＫ－ＭＥＬ２８、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－２３１；変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに関与するＰＴＥＮ遺伝子に変異を有するヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａＰ；変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに関与するＣＴＮＮＢ１遺伝子に変異を有するヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を用いたことと、試験化合物としてＳＴＡＲ２のみを用い、投与濃度を５μＭ、１５μＭ又は４５μＭとしたこと以外は実施例１と同様にして、試験化合物ＳＴＡＲ２の活性を評価した。培養６日目の細胞塊の状態を図２に示す。
　図２に示すように、試験化合物ＳＴＡＲ２は、変異型ＫＲＡＳ発現細胞、及び変異型ＫＲＡＳ関連シグナルに関与する遺伝子に変異を有する細胞に対して、濃度依存的に細胞増殖抑制を示した。
（実施例３）
　患者由来のメラノーマ細胞（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異）を親株として、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤であるベムラフェニブ耐性株を樹立した。親株とベムラフェニブ耐性株とを用いたこと以外は実施例２と同様にして、試験化合物ＳＴＡＲ２の活性を評価した。培養６日目の細胞塊の状態を図３に示す。
　図３に示すように、試験化合物ＳＴＡＲ２は、臨床検体由来のメラノーマ及びベムラフェニブ耐性株に対して、濃度依存的に細胞増殖抑制を示した。
（実施例４）
　４週齢メスのヌードマウスの皮下に、マトリゲル（ＢＤ　ｂａｉｏｓｉｅｎｃｅ社製、ＢＤ　ｍａｔｒｉｇｅｌ　ｍａｔｒｉｘ）に懸濁した１．５×１１０６個のヒト大腸癌ＨＣＴ１１６細胞を接種した。通常飼育条件で飼育し、腫瘍の長径が５ｍｍを越えた時点を初日（Ｄ０）として、試験化合物ＳＴＡＲ２を、１０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ又８０ｍｇ／ｋｇの投与量で、腹腔内に１日１回投与しながら飼育を継続した。なおコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、溶媒であるＤＭＳＯを投与した。腫瘍体積の変化を図４に示す。
　図４に示すように、ＳＴＡＲ２はヌードマウスにおける腫瘍の増殖を、投与量依存的に抑制した。ＧＩ５０は７．７ｍｇ/ｋｇであった。また、投与量が８０ｍｇ／ｋｇの場合でも毒性の発現は認められなかった。さらに、４週間継続投与した場合でも毒性の発現は認められず、また、試験化合物ＳＴＡＲ２を飲水投与した場合でも毒性の発現は認められなかった。
（実施例５）
　実施例４における投与量が４０ｍｇ／ｋｇのヌードマウスについて、継続飼育８日目に採血し、各種の血液学的検査を実施した。図５Ａに白血球数（ＷＢＣ）、図５Ｂに赤血球数、図５Ｃにヘモグロビン値（ＨＧＢ）、図５Ｄにヘマトクリット値（ＨＣＴ）、図５Ｅに血小板数（ＰＬＴ）の結果をそれぞれ示す。
　図５Ａから図５Ｅに示すように、各種の血液学的検査には、コントロール（ｃｏｎｔ）と比較して、ＳＴＡＲ２の投与による異常は認められなかった。
（実施例６）
エポキシビーズへのＳＴＡＲ２の固定化
　ＳＴＡＲ２をタンパク質固定化バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９）で希釈し、１μｇ／μＬのＳＴＡＲ２溶液を５０μＬ作製した。１．５ｍＬマイクロチューブへエポキシビーズ（ＴＡＳ８８４８Ｎ１１１０，Ｔａｍａｇａｗａ　Ｓｅｉｋｉ）を１ｍｇ量り取った。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）を行い、上清を廃棄した。次いでタンパク質固定化バッファー５０μＬを添加し、エポキシビーズを超音波にて分散させた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）を行い、上清を廃棄するビーズ洗浄を３回繰り返した後、タンパク質固定化バッファー５０μＬを添加しビーズを超音波にて分散させた。次いでＳＴＡＲ２溶液５０μＬを添加した後、３７℃で、一晩（１６から２０時間）マイクロチューブミキサーにて反応させた。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）を行い、上清を廃棄した。タンパク質固定化ビーズ洗浄・保存バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ　ｐＨ７．９，５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）５００μＬを添加し、ビーズを分散させた後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃，５ｍｉｎ）を行い、上清を廃棄するビーズ洗浄を３回繰り返した。ＳＴＡＲ２が固定化されたビーズをタンパク質固定化ビーズ洗浄・保存バッファー２００μＬに分散させ、４℃にて保存した。ＳＴＡＲ２固定化ビーズ濃度は０．１ｍｇ／２０μＬであった。
ＳＴＡＲ２固定化ビーズを使用したプルダウンアッセイ
　２．５Ｍ　ＫＣｌ　６０ｍＬ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　１２６ｇ、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）　２０ｍＬ、１Ｍ　ＭｇＣｌ２　１ｍＬ、１Ｍ　ＣａＣｌ２　２００μＬ、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）　４００μＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＮＰ－４０　１０ｍＬを混合し、超純水にて５００ｍＬまでメスアップし、２×１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＬ）を調製した。２×１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ　２５ｍＬと脱イオン水２５ｍＬを混合し、１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒを氷上に準備した。氷上にてタンパク質溶液を１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒにて４　ｍｇ／ｍＬに調製した。調製したタンパク質溶液を１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、３０分以上）を行い、不溶物を除いた。別途、ＳＴＡＲ２固定化ビーズを１．５ｍＬマイクロチューブへ０．１ｍｇ量りとった。１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加え、ビーズを分散させた。スピンダウン後、磁気分離を５分間行い、上清を廃棄するビーズ洗浄を３回繰り返した。タンパク質溶液２００μＬにＤＭＳＯに溶解したＳＴＡＲ２を加え、４℃で、ローテーターにて攪拌しながら２時間競合阻害反応を行った。競合阻害濃度はＳＴＡＲ２　０ｍＭ（ＤＭＳＯ　ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＳＴＡＲ２　１ｍＭとした。上清を廃棄したビーズの入っている１．５ｍＬマイクロチューブへ競合阻害後のタンパク質溶液を２００μＬ添加し、分散させた。４℃で、ローテーターにて攪拌しながら２時間結合反応を行った。２時間後、スピンダウンし、磁気分離を行い、上清を廃棄した。１５０ｍＭ　ＫＣｌ　ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加え、ビーズを分散させ、スピンダウン後、磁気分離を５分間行い、上清を廃棄する洗浄処理を３回繰り返した。上清を廃棄したビーズへ１×ｄｙｅ溶液を４０μＬ加え、分散させた後。９８℃にて５分間加熱を行った。ビーズ分散液をスピンダウンし、室温で磁気分離を行い、上清（加熱溶出サンプル）を別の１．５ｍＬマイクロチューブへ回収した。溶出サンプルを、通常サイズのゲルでそれぞれ電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）し、泳動後のゲルを以下のようにして銀染色して、結果を解析した。
銀染色
＜試薬調製＞
固定液１：メタノール１００ｍＬ、酢酸１０ｍＬ、脱イオン水９０ｍＬを混和して調製した。
固定液２：メタノール１００ｍＬ、脱イオン水１００ｍＬを混和して調製した。
増感液：増感原液２０ｍＬを脱イオン水１８０ｍＬで希釈して調製した。
染色液：染色原液２０ｍＬを脱イオン水１８０ｍＬで希釈して調製した。
現像液：現像粉末１ｇを脱イオン水１９０ｍＬに溶解し、現像原液１０ｍＬを加えて調製した。
＜染色＞
　ゲルを２００ｍＬの固定液１に浸し、２０分間振とうした。固定液１を捨て、ゲルを２００ｍＬの固定液２に浸し、１０分間振とうした。固定液２を捨て、ゲルを２００ｍＬの脱イオン水に浸し、１０分間振とう洗浄した。脱イオン水を捨て、ゲルを２００ｍＬの増感液に浸し、１分間振とうした。増感液を捨て、ゲルを２００ｍＬの脱イオン水に浸し、１分間振とうする洗浄処理を２回繰り返した。脱イオン水を捨て、ゲルを２００ｍＬの染色液に浸し、２０分間振とうした。染色液を捨て、ゲルを２００ｍＬの脱イオン水に浸し、１分間振とうする洗浄処理を２回繰り返した。脱イオン水を捨て、ゲルを２００ｍＬの現像液に浸し、適当な染色像が得られるまで、３から１０分間振とうした。適当な染色像が得られたら、２０ｍＬの停止液を加え、１分間振とうした。現像液を捨て、ゲルを２００ｍＬの脱イオン水に浸し、１分間振とうする洗浄処理を３回繰り返した。得られた銀染色ゲルを脱イオン水に浸して４℃で保存した。銀染色ゲルを図６Ａに示す。
　図６Ａに示すように、３０ｋＤ付近にＳＴＡＲ２に結合するタンパク質のバンドが見られた。後述する質量分析（ＭＳ）解析により、ＳＴＡＲ２に結合したタンパク質はＶＤＡＣであることが明らかとなった。
　抗ｐａｎＶＤＡＣ抗体（ａｂｃａｍ社製、１５８９５）を用いたウェスタンブロット（イムノブロット）の結果を図６Ｂに、抗ＶＤＡＣ１抗体（ａｂｃａｍ社製、１４７３４）及び抗ＶＤＡＣ２抗体（ａｂｃａｍ社製、３７９８５）を用いたウェスタンブロットの結果を図６Ｃに示す。ウェスタンブロットは、０．２ｍＭ又は１ｍＭのＳＴＡＲ２を添加した競合阻害条件下で、常法により実施した。図６Ｂから、ＳＴＡＲ２はＶＤＡＣに直接結合することが示された。また図６Ｃから、ＳＴＡＲ２は、ＶＤＡＣ２よりもＶＤＡＣ１に対する親和性が高いことが示された。
　電気泳動に用いたゲルを濃度１５％に変更したこと、ＳＴＡＲ２の競合阻害の濃度を０．２ｍＭ及び１ｍＭとしたこと以外は上記と同様にして、３０ｋＤ以下のタンパク質について、ＳＴＡＲ２と結合するタンパク質を探索した。結果を図６Ｄに示す。
　図６Ｄに示すように、２０ｋＤ付近にＳＴＡＲ２に結合するタンパク質のバンドが見られた。後述する質量分析（ＭＳ）解析により、ＳＴＡＲ２に結合したタンパク質はＫＤＥＬＲ１であることが明らかとなった。
　抗ＫＤＥＬＲ１抗体（Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，　１２８７３）を用いたウェスタンブロットの結果を図６Ｅに示す。図６Ｅから、ＳＴＡＲ２はＫＤＥＬＲ１に直接結合することが示された。
ＭＳ解析
　銀染色にて得られた２つのバンド（約２０ｋＤ及び３０ｋＤ）をＪＢｉｏＳ　（株式会社日本バイオサービス）にてマスコットサーチ（ＭＳ／ＭＳ　Ｉｏｎ　Ｓｅａｒｃｈ）解析して、タンパク質を同定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　質量分析の結果から、ＳＴＡＲ２と結合する約２０ｋＤのタンパク質はＫＤＥＬＲ１であることが示唆された。また約３０ｋＤのタンパク質はＶＤＡＣであることが示唆された。
（実施例７）
３次元浮遊培養
　ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＰＳＧ１００ｘ；ＧＩＢＣＯ），Ｇ４１８（０７０－０５１８３，ｗａｋｏ）（６００ｕｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　８０ｍｇ／ｍｌ）及びｐｕｒｏ（２μｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　１０μｇ／μｌ）を加えたもの（１０Ｆ＋Ｇ４１８＋ｐｕｒｏ）を培養液として用いて、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を培養した。ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を低接着丸底９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ４０００個／ｗｅｌｌ及び１０００個／ｗｅｌｌ播種した。同時に試験化合物としてＳＴＡＲ２を投与した。コントロールとしては同濃度のＤＭＳＯを使用した。６日目に細胞塊を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅからプラスチックディッシュに反転し、遠心（２００Ｇ）にて５０ｍｌチューブに回収し、ＰＢＳで洗浄後再度遠心した。
活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
　得られた細胞塊２４個をＰＢＳで洗浄し、ＲＯＳ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　－Ｈｉｇｈｌｙ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＤＣＦＨ－ＤＡ－（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いて３７℃で３０分インキュベーション後、再度ＰＢＳにて洗浄した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて３７℃で１０分間インキュベーションした後、フローサイトメトリ（ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＴＭ））にて計測した。結果を図７に示す。
　図７に示すように、ＲＯＳは変異ＫＲＡＳ陽性癌コントロール（ｍｔ　ＤＭＳＯ）において高く、ＳＴＡＲ２の投与により（ｍｔ　ＳＴＡＲ）、ＲＯＳの生成が抑制された。
糖取り込みアッセイ
　得られた細胞塊２４個をグルコース非含有ＤＭＥＭ培地で洗浄し、３７℃で１５分インキュベーション後、Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｕｐｔａｋｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ－Ｇｒｅｅｎ－（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）を用いて３７℃で１５分インキュベーションした。その後、Ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎにて３回洗浄した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）にて３７℃で１０分間インキュベーションした後、フローサイトメトリ（ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＴＭ））にて計測した。結果を図８に示す。
　図８に示すように、糖の取り込みは変異ＫＲＡＳ陽性癌コントロール（ｍｔ　ＤＭＳＯ）において高く、ＳＴＡＲ２の投与により（ｍｔ　ＳＴＡＲ）、糖の取り込みが抑制された。
ウェスタンブロット
　得られた細胞塊に対して、ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％ＮＰ－４０，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％　ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を適量加え、３０秒撹拌後、氷上にて１０ｍｉｎｘ３、その後１５０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心してタンパク質を回収した。蛋白濃度測定し、５ｘｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ６．８，５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０％ＳＤＳ，１２．５％　２－ＭＥ，０．０２５％　ＢＰＢ）を加えて撹拌し、９５℃、５ｍｉｎ煮沸した。アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動後、メンブレンにトランスファーし、５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒでブロッキングした。次に一次抗体として抗ＨＩＦ－１α抗体（Cell Signaling Technology, 36169.参照）又は抗ＨＩＦ－１β抗体（Cell Signaling Technology, 5537.参照）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。ＴＢＳＴに１：５０００で希釈し二次抗体を入れた。１時間後に洗浄し、ＥＣＬにて現像した。結果を図９に示す。
　図９から、ＳＴＡＲ２の投与により、ＨＩＦ－１α及びＨＩＦ－１βの発現が抑制されることが示された。
（実施例８）
　一次抗体として、抗ＰＤＫ１抗体（Cell Signaling Technology, 3062.参照）、抗ＧＬＵＴ１抗体（Cell Signaling Technology, 12939.参照）、又は抗Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ２（ＨＫ２）抗体（Cell Signaling Technology, 2106.）を用いたこと以外は実施例７と同様にして、ＰＤＫ１、ＧＬＵＴ１及びＨＫ２の発現を評価した。結果を図１０に示す。
　図１０から、ＳＴＡＲ２の投与により、ＰＤＫ１、ＧＬＵＴ１及びＨＫ２のタンパク質発現量は、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞（癌モデル）において、ＣｏｎｔｒｏｌよりもＳＴＡＲ２投与群の発現が低下した。また、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞（正常モデル）においては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群とＳＴＡＲ２投与群の発現が同等レベルになっていた。このことより、ＳＴＡＲ２の投与により、ＰＤＫ１、ＧＬＵＴ１及びＨＫ２のタンパク質発現量が癌特異的に低下することが示された。
（実施例９）
ＲＮＡシークエンス及びデータ解析
　ＲＮＡシークエンス（ＲＮＡ－ｓｅｑ）用のライブラリを、ＳＴＡＲ２（３０μＭ）で処理した又は処理していないＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞から、それぞれ抽出した７５０ｎｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡより、ＮＥＢＮｅｘｔ　ｒＲＮＡ　Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＮＥＢ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ：＃Ｅ６３１８）及びＮＥＢＮｅｘｔ　Ｕｌｔｒａ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＮＥＢ，＃Ｅ７４２０Ｓ）を用いて準備した。ＨｉＳｅｑＸ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって得られた端部対（Ｐａｉｒｅｄ　ｅｎｄ　ｒｅａｄｓ（１５１ｂｐｘ２））のアダプターシークエンスはｃｕｔａｄａｐｔ－１．７．１によって除去し、Ｔｏｐｈａｔ２．１．１（http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml）を用いて、ｈｕｍａｎ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ（ｈｇ１９）上にマッピングした。次いで、ｐｉｃａｒｄ－ｔｏｏｌｓ－１．１０９を用いてＰＣＲによる重複部分を除去した。生成されたＢａｍファイルはＩｌｌｕｍｉｎａ　ｉＧｅｎｏｍｅｓ　ｗｅｂｓｉｔｅ（https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html）(archive-2012-03-09-03-24-41)から得られたｇｅｎｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｆｉｌｅ（.gtf file）を用いてＣｕｆｆｌｉｎｋｓ　２．２．１（http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/）にて各遺伝子の転写量を定量化した。なお、Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖａｌｕｅｓはｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＦＰＫＭ）として計算した。結果をＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｖｉｅｗｅｒ）を用いて、図１１に示す。
　図１１において、縦軸はｍＲＮＡの発現量を示し、それぞれのピークはエクソンを示す。図１１から、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞をＳＴＡＲ２で処理することで、ＬＤＨＡ、ＨＫ２、Ｇｌｕｔ１、及びＰＤＫ１のｍＲＮＡの発現量が低下することが分かる。
（実施例１０）
　試験化合物として、以下に示す化合物を、７．５μＭで用いたこと以外は、実施例１と同様にして試験化合物の細胞増殖抑制活性を評価した。図１２Ａには、Ｄａｙ３及びＤａｙ７における細胞塊の断面積の計測結果を示す。また、図１２Ｂには、コントロールに対する断面積の比から算出される細胞増殖抑制活性を、ＫＭＡ５３の場合を１００％とした相対値（％）として示す。更に図１２Ｃには、変異型ＫＲＡＳ細胞株（ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ）における細胞増殖抑制活性に対する野生型ＫＲＡＳ細胞株（ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ）における細胞増殖抑制活性の比（ｗｔ／ｍｔ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　図１２Ａ及び１２Ｂから、試験化合物は変異型ＫＲＡＳ細胞株において細胞増殖抑制活性を示すことが分かる。また、図１２Ｃから、ＫＭＡ０５２とＫＭＡ０５４は、ＳＴＡＲ２よりも、野生型ＫＲＡＳ細胞株に対する毒性が低く、変異型ＫＲＡＳ細胞株に対して優れた細胞増殖抑制活性を示すことが分かる。
（実施例１１）
ミトコンドリア活性化の評価
　低分子蛍光色素であるＪＣ－１は、ミトコンドリアの膜電位依存的にミトコンドリアへ蓄積する。また、ＪＣ－１がミトコンドリアに蓄積してダイマーを形成することで、ＪＣ－１の蛍光特性が、緑色（約５３０ｎｍ）から赤色（約５９０ｎｍ）へと変化する。したがって、ミトコンドリアの膜電位が高い場合、ミトコンドリア内でのＪＣ－１の濃度が上昇し、色素が凝集を起こすことで赤色の蛍光を発する。一方、ミトコンドリアの膜電位が低い場合、ＪＣ－１の濃度が低く、モノマーで存在するため、緑色の蛍光を発する。このようなＪＣ－１の特性を利用することで、ミトコンドリアの活性化を評価することができる（Ｄｏｊｉｎｄｏ　ＪＣ－１　Ｍｉｔｏ　ＭＰ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　マニュアル参照）。具体的には、以下のようにしてミトコンドリアの活性化を評価した。
　ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞（４０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）又はＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞（１０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を８チャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ）に、ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ）＋１０％ＦＢＳ（２００μＬ）で播種し、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃、３日間培養した。培地を１００μＬ取り除き、ＤＭＥＭ培地で希釈した６０μＭのＳＴＡＲ２溶液を１００μＬ添加し、最終濃度（３０μＭ）とし、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間インキュベートした。培地を１００μＬ取り除き、４μＭのＪＣ－１を１００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分間インキュベートした。上澄みを除去し、２００μＬの培地で細胞を２回洗浄した。２００μＬのＩｍａｇｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００）で観察した。赤色蛍光発現細胞数と緑色細胞発現細胞数をハイブリッドセルカウント（ＢＺ－Ｈ３Ｃ）にてダイマー数／全細胞面積を計測した。結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、ＳＴＡＲ２（３０μＭ）は投与後３０分でＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳにおいてミトコンドリアの過分極を誘導した。
（実施例１２）
　実施例１０で用いた試験化合物について、抗ｐａｎＶＤＡＣ抗体（ａｂｃａｍ社製、１５８９５）及び抗ＫＤＥＬＲ１抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。ウェスタンブロットは、０．９ｍＭの試験化合物を添加した競合阻害条件下で実施した。結果を図１４に示す。
　図１４に示すように、ＫＭＡ０５２は、ＶＤＡＣに親和性が高く、ＫＤＥＬＲ１に低かった。一方、ＫＭＡ０５３は、ＶＤＡＣとＫＤＥＬＲ１の両者に親和性が高かった。また、ＫＭＡ００３はＶＤＡＣに親和性がなく、ＫＤＥＬＲ１に親和性が高かった。
（実施例１３）
　試験化合物として、以下に示す化合物を用いた。ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ）に１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＰＳＧ１００ｘ；ＧＩＢＣＯ）、Ｇ４１８（０７０－０５１８３，ｗａｋｏ）（６００μｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　８０ｍｇ／ｍｌ）及びｐｕｒｏ（２μｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　１０μｇ／μｌ）を加えたもの（１０Ｆ＋Ｇ４１８＋ｐｕｒｏ）を培養液として用いて、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を３次元浮遊倍養した。低接着丸底９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞を４０００個／ｗｅｌｌで播種し、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を１０００個／ｗｅｌｌで播種した。同時に試験化合物投与し、コントロールとしては同濃度のＤＭＳＯを添加した。培養３日目及び７日目に細胞塊の断面積を計測した。断面積データは４つのｗｅｌｌの値の平均値として算出した。図１５には、Ｄａｙ３及びＤａｙ７における細胞塊の断面積の計測結果を示す。また、下表にＴＤ５０（５０％ＴｏｘｉｃＤｏｓｅ）及びＥＤ５０（５０％ＥｆｆｅｃｔｉｖｅＤｏｓｅ）を示す。なお、ＴＤ５０はＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞塊（野生型ＫＲＡＳ；正常モデル）の７日目の断面積をコントロールと比べて５０％縮小させる濃度とした。ＥＤ５０はＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞塊（変異型ＫＲＡＳ；癌モデル）の７日目の断面積をコントロールと比べて５０％縮小させる濃度とした。ＴＤ５０／ＥＤ５０の値が大きいほど細胞毒性の少ない化合物であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　図１５に示すように、ＫＭＡ０９２及びＫＭＡ０９６は、変異型ＫＲＡＳ細胞株に対して優れた細胞増殖抑制活性を示すことが分かる。表２から、ＫＭＡ０９２はＳＴＡＲ２に比べて、より細胞毒性が低いことが分かる。
　なお、ＫＭＡ０９２は以下のようにして合成した。また、ＫＭＡ０９６についても同様にして合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　７－アザインドール（１５０．０ｍｇ）、ジメチルアミン塩酸塩（１１４．０ｍｇ）、１－ブタノール（１．３０ｍｌ）の溶液に３７％ホルムアルデヒド水溶液（１０３．０ｍｇ）を室温で加えた。反応溶液を１２０℃で２．５時間攪拌し、反応溶液を室温に冷却後、水、濃塩酸、エーテルを加えた。分液操作を行い、水相をさらにエーテルで洗浄した。その後水相に４８％水酸化ナトリウム水溶液を加え、これをクロロホルムで抽出した。得られた抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、減圧濃縮を行い、所望のアルキル化化合物を６０％の収率で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　アルキル化化合物（７０．８ｍｇ）をメタノール（０．６ｍｌ）とニトロメタン（０．６ｍｌ）の混合物に溶解し、０℃に冷却した後に、硫酸ジメチル（４３μｌ）を加え、室温下３０分攪拌した。反応溶液を再び０℃に冷却した後に２８％ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（９０μｌ）をゆっくり加えた。室温下１．５時間攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出を行なった。得られた抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、減圧濃縮を行い、所望のニトロ化合物を３９％の収率で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　ニトロ化合物（１３３．７ｍｇ）のエタノール溶液（１４．０ｍｌ）に１０％水酸化パラジウム／炭素（２０ｍｏｌ％パラジウム）を室温で加えた。水素雰囲気下（１気圧）、７０℃で２日間攪拌後、濾過、減圧濃縮を行い、所望のアミン化合物を９７％の収率で得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　アミン化合物（３２．２ｍｇ）、アルデヒド化合物（４８．９ｍｇ）のクロロホルム溶液（０．２ｍｌ）を６０℃で１日攪拌した。得られた反応液に酢酸（０．５ｍｌ）を加え、２．５時間加熱還流を行なった。室温まで冷却後、炭酸カリウム水溶液を加えアルカリ性にした後に、塩化メチレンで抽出を行なった。得られた抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥後、濾過、減圧濃縮を行い、カラムクロマトグラフィーで精製を行って、目的化合物を得た（収率３から１０％）。
（実施例１４）
　実施例１３で用いた試験化合物について、抗ｐａｎＶＤＡＣ抗体及び抗ＫＤＥＬＲ１抗体を用いたウェスタンブロットを実施した。ウェスタンブロットは、０．９ｍＭの試験化合物を添加した競合阻害条件下で実施した。結果を図１６に示す。
　図１６に示すように、ＫＭＡ０９２及びＫＭＡ０９６はＶＤＡＣ及びＫＤＥＬＲ１に結合した。
（実施例１５）
　実施例１３で用いた試験化合物のうち、ＫＭＡ０９２を１１μＭ（２５％阻害濃度）で用いたこと以外は実施例７と同様にして、試験化合物の３次元浮遊培養におけるＨＩＦ－１βの発現量に対する影響を評価した。結果を図１７に示す。
　図１７に示すように、ＫＭＡ０９２は、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞に特異的にＨＩＦ－１βの発現を抑制した。
（参考例）
２次元培養
　ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＰＳＧ１００ｘ；ＧＩＢＣＯ），Ｇ４１８（０７０－０５１８３，ｗａｋｏ）（６００ｕｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　８０ｍｇ／ｍｌ）及びｐｕｒｏ（２μｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　１０μｇ／μｌ）を加えたもの（１０Ｆ＋Ｇ４１８＋ｐｕｒｏ）を培養液として用いて、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を１０ｃｍに播種して培養した。８０％コンフルーエント程度に生育したところで、細胞を回収した。
３次元浮遊培養
　ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を低接着丸底９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにそれぞれ４０００個／ｗｅｌｌ及び１０００個／ｗｅｌｌ播種した。６日目に細胞塊を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅをプラスチックディッシュに反転し、遠心（２００Ｇ）にて５０ｍｌチューブに回収し、ＰＢＳで洗浄後、再度遠心して細胞塊として細胞を回収した。
ウェスタンブロット
　得られた細胞に対して、ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％ＮＰ－４０，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％　ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を適量加え、３０秒撹拌後、氷上にて１０ｍｉｎｘ３、その後１５０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎで遠心してタンパク質を回収した。蛋白濃度測定し、５ｘｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ６．８，５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０％ＳＤＳ，１２．５％　２－ＭＥ，０．０２５％　ＢＰＢ）を加えて撹拌し、９５℃で５ｍｉｎ煮沸した。アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動後、メンブレンにトランスファーし、５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒでブロッキングした。次に一次抗体として抗ｐａｎ－ＶＤＡＣ抗体又は抗ＫＤＥＬＲ１抗体を添加し、４℃で一昼夜反応させた。ＴＢＳＴに１：５０００で希釈し、二次抗体を添加した。１時間後に洗浄し、ＥＣＬにて現像した。結果を図１８に示す。
　ＶＤＡＣの発現量については、２次元培養及び３次元培養において、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳとＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳの間で発現量の変化は認められなかった、一方、ＫＤＥＬＲ１の発現量については、２次元培養及び３次元培養のいずれにおいてもＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳのほうが、ＫＤＥＬＲ１の発現量が高かった。
（実施例１５）
３次元浮遊培養
　ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ、ＧＩＢＣＯ）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔａｍａｔｅ（ＰＳＧ１００ｘ；ＧＩＢＣＯ），Ｇ４１８（０７０－０５１８３，ｗａｋｏ）（６００ｕｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　８０ｍｇ／ｍｌ）及びｐｕｒｏ（２μｇ／ｍｌ；ｓｔｏｃｋ　１０μｇ／μｌ）を加えたもの（１０Ｆ＋Ｇ４１８＋ｐｕｒｏ）を培養液として用いて、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞及びＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を培養した。低接着丸底９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳ細胞を４０００個／ｗｅｌｌで播種し、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳ細胞を１０００個／ｗｅｌｌで播種した。同時にＳＴＡＲ２（７．５μｍ）投与し、コントロールとしては同濃度のＤＭＳＯを添加して、細胞培養を行い、細胞塊を得た。
ウェスタンブロット
　得られた細胞塊に対して、ＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％ＮＰ－４０，０．５％　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％　ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ））を適量加え、３０秒撹拌後、氷上にて１０ｍｉｎｘ３、その後１５０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ遠心してタンパク質を回収した。蛋白濃度測定し、５ｘｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ６．８，５０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０％ＳＤＳ，１２．５％　２－ＭＥ，０．０２５％　ＢＰＢ）を加えて撹拌し、９５℃で５ｍｉｎ煮沸した。アクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動後、メンブレンにトランスファーし、５％ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒでブロッキングした。次に一次抗体として抗ＢＩＰ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　３１７７）、抗ＴＵＢＢ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ，　８０１２１３）、又は抗ＴＵＢＢ４抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，　１０７３０７－Ｔ３４）を添加し、４℃で一昼夜反応させた。ＴＢＳＴに１：５０００で希釈して二次抗体を添加した。１時間後に洗浄し、ＥＣＬにて現像した。結果を図１９に示す。
　ＳＴＡＲ２を添加することで、ＫＤＥＬＲ１に結合するＢＩＰの発現量は、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳとＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳのいずれにおいても低下した。また、ＶＤＡＣに結合するＴＵＢＢ３及びＴＵＢＢ４の発現量は、ＨＫｅ３－ｗｔＫＲＡＳにおいては変化が認められなかったが、ＨＫｅ３－ｍｔＫＲＡＳにおいて低下した。
（実施例１６）
　ＳＴＡＲ２及びその誘導体をリガンド分子として、ＶＤＡＣ１及びＫＤＥＬＲ１に対するそれぞれのリガンド分子との結合エネルギーを以下のようにして算出した。計算に用いたリガンド分子の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ（https://www.rcsb.org/）よりＫＤＥＬＲ１（６ｉ６ｂ．ｐｄｂ）及びＶＤＡＣ－１（２ｋ４ｔ．ｐｄｂ）の座標データを取得した。重複原子や欠落分子の補完はＦａｃｉｏ（分子モデリング及び計算化学統合環境，http://zzzfelis.sakura.ne.jp/）を使用して行った。また、リガンド分子のモデリングにはＦａｃｉｏを用いた。
　タンパク質とリガンド分子との結合位置について、もととなるＰＤＢデータをＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏ（http://autodock.scripps.edu/resources/adt）によりｐｄｂｑｔファイルに変換し、ＡｕｔｏＤｏｃｋ　Ｖｉｎａ（http://vina.scripps.edu/）により、結合親和力が大きい順に９個の配向（ｐｏｓｅ）を出力した。なお、リガンドを置く場所（探索の範囲）は，タンパク質全体とした。
　タンパク質－リガンド複合体の構造最適化を以下のようにして実施した。ＮＡＭＤ（https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/）を使い、分子力学計算を行った。リガンドのパラメータはＭＡＴＣＨ　Ｓｅｒｖｅｒ（https://brooks.chem.lsa.umich.edu/index.php?matchserver=submit）を使って作成した。分子軌道計算は、ＧＡＭＥＳＳ（ＶＥＲＳＩＯＮ＝３０ＳＥＰ２０１８（Ｒ３））（https://www.msg.chem.iastate.edu/gamess/）、ＦＭＯ（https://staff.aist.go.jp/d.g.fedorov/）、ＤＦＴＢ（３ｏｂ－３－１）　ＤＦＴＢ（https://www.dftb.org/）を用い、溶媒モデルはＰＣＭ＜１＞／Ｗａｔｅｒ、分散力はＵＦＦの各条件にて行い、最適化した（例えば、FMO method in GAMESS D. G. Fedorov, K. Kitaura, J. Chem. Phys. 120, 6832 (2004)参照）。
　タンパク質＋リガンドの周り５Åに水分子（ＴＩＰ３Ｗ）を３２１８個置いた４８．４×５９．６×５１．０（Å３）のｗａｔｅｒ　ｂｏｘを初期構造として、周期境界条件下、１０００ｓｔｅｐｓのｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎの後、１００００ｓｔｅｐｓの分子力学を行い平衡構造を求めた。
　ＦＭＯＳＡのマニュアル（https://staff.aist.go.jp/d.g.fedorov/fmo/FMOSA_manual.pdf）に従い、ＦＭＯ法で最適化された構造を用いてＳｕｂｓｙｓｔｅｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓを行い、それぞれのリガンドの結合エネルギーを求めた（例えば、Dmitri G. Fedorov, and Kazuo Kitaura J. Phys. Chem. A 2016, 120, 2218-2231．参照）。結合エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は下式で求められる。ここで、Ａはタンパク質であり、Ｂはリガンドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000021
　ＦＭＯ法により最適化を行った構造に対して改めてＡｕｔｏＤｏｃｋ　Ｖｉｎａで結合親和力の評価を行った。なお、この評価にはこれまで計算に使ってきたリガンドの鏡像体（Ｓ体）も含め、探索するｐｏｓｅの数を２０に設定（デフォルトは９）して行った。
　ＶＤＡＣ１についての結果を以下に示す。ＶＤＡＣ１におけるリガンドの結合位置について、図２０Ａ及び図２０Ｂに示すＶＤＡＣ１－リガンド複合体モデルにおける２つの結合位置のうち、ＳＴＡＲ２－１＿２に対応する位置をｐｏｃｋｅｔ２、ＳＴＡＲ２－１＿３に対応する位置をｐｏｃｋｅｔ３とした。結果を表３及び表４に示す。表３はｐｏｃｋｅｔ２またはｐｏｃｋｅｔ３に対する結合親和力の総和を示す。表４中のリガンド名の末尾の＿２及び＿３はそれぞれｐｏｃｋｅｔ２及びＰｏｃｋｅｔ３に対応し、タンパク質Ａ：リガンドＢ＝１：１の条件で結合エネルギー（ｋｃaｌ／ｍｏｌ）を計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、リガンド（ＳＴＡＲ２）はＶＤＡＣ１のＮ末端の２カ所に結合することが示唆された。このことから、ＳＴＡＲ２がＶＤＡＣ１に結合することで、チュブリン（ＴＵＢＢ）又はヘキソキナーゼ（ＨＫ）のＶＤＡＣ１への結合が阻害されると考えられる。表３におけるＳ－ＳＴＡＲ２とＳ－ＳＴＡＲ２－Ｎ１の対比から、ＳＴＡＲ２のＮ１置換によって、ＶＤＡＣ１に対する全体的な親和性（Ｔｏｔａｌ）はやや低下するものの、機能ドメインに対する親和性は向上することが示唆された。
　次に、ＫＤＥＬＲ１についての結果を以下に示す。ＫＤＥＬＲ１におけるリガンドの結合位置について、図２０Ｃに示すＫＤＥＬＲ１－リガンド複合体モデルにおける結合位置をｐｏｃｋｅｔ１とした。結合エネルギー（ｋｃaｌ／ｍｏｌ）の計算結果を表５及び表６に示す。表５はｐｏｃｋｅｔ１に対する結合親和力の総和を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　図２０Ｃに示すように、リガンド（ＳＴＡＲ２）はＫＤＥＬＲ１のＫＤＥＬ配列認識部位に結合することが示唆された。このことから、ＳＴＡＲ２がＫＤＥＬＲ１に結合することで、Ｃ末端にＫＤＥＬ配列を有するシャペロン分子のＫＤＥＬＲ１への結合が阻害されると考えられる。これにより、癌細胞におけるＫＤＥＬＲ発現量の増大に伴うＥＲストレス誘導性のＨＩＦ－１発現量の増加が抑制される可能性が示唆された。表５におけるＳ－ＳＴＡＲ２とＳ－ＳＴＡＲ２－Ｎ１の対比から、ＳＴＡＲ２のＮ１置換によって、ＫＤＥＬＲ１に対する全体的な親和性（Ｔｏｔａｌ）は大きく変化しないものの、機能ドメインに対する親和性は向上することが示唆された。
（実施例１７）
　リガンドと、ＶＤＡＣ１を構成する各アミノ酸残基との相互作用について、ＦＭＯ法のＰＩＥＤＡ　（Ｐａｉｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて相互作用エネルギーを計算した。ＰＩＥＤＡでは，アミノ酸残基間の相互作用エネルギーも計算されるが、数値データが膨大になるため、ここではリガンドと各アミノ酸残基（全部で２８５個）との相互作用エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、その成分である静電相互作用（ΣＥｅｓ）、交換反発（ΣＥ０）、電荷移動相互作用（Σｃｔ＊ｅｓ）、分散力（Σｄｉｓｐ）及び溶媒との相互作用（ΣＧｓｏｌ）の合計（Σｔｏｔａｌ）で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表７から、ＶＤＡＣ１のｐｏｃｋｅｔ２において、ＳＴＡＲ２－Ｎ１との相互作用が、ＳＴＡＲ２との相互作用よりも大きいことが分かる。
　さらに、ＶＤＡＣ１の各結合部位においてリガンドと近接するアミノ酸と、リガンドとの相互作用エネルギーを、ＦＭＯ法のＰＩＥＤＡを用いて計算した。リガンドから２．５Åから８Åの距離に近接して存在するアミノ酸を結合アミノ酸とした。具体的にｐｏｃｋｅｔ２における結合アミノ酸としてＭｅｔ１、Ａｌａ２、Ｐｒｏ４、Ｔｈｒ６、Ａｓｐ９、Ｌｅｕ１０及びＧｌｙ１１を選択し、ｐｏｃｋｅｔ３における結合アミノ酸としてＡｌａ２、Ｖａｌ３、Ｐｒｏ４、Ｐｒｏ５、Ｔｈｒ６及びＴｙｒ７を選択した。リガンドと各アミノ酸残基との相互作用の和を、その成分である静電相互作用（ΣＥｅｓ）、交換反発（ΣＥ０）、電荷移動相互作用（Σｃｔ＊ｅｓ）、分散力（Σｄｉｓｐ）、溶媒との相互作用（ΣＧｓｏｌ）の合計（Σtｏｔａｌ）で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　表８から、ＶＤＡＣ１のｐｏｃｋｅｔ２において、ＳＴＡＲ２－Ｎ１との相互作用が、ＳＴＡＲ２との相互作用よりも２倍以上大きいことが分かる。
（実施例１８）
　リガンドと、ＫＤＥＬＲ１を構成する各アミノ酸残基との相互作用について、ＦＭＯ法のＰＩＥＤＡを用いて相互作用エネルギーを計算した。リガンドと各アミノ酸残基（全部で２０３個）との相互作用エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、その成分である静電相互作用（ΣＥｅｓ）、交換反発（ΣＥ０）、電荷移動相互作用（Σｃｔ＊ｅｓ）、分散力（Σｄｉｓｐ）及び溶媒との相互作用（ΣＧｓｏｌ）の合計（Σｔｏｔａｌ）で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　表９から、ＫＤＥＬＲ１との相互作用について、ＳＴＡＲ２Ｎ１とＳＴＡＲ２とでは大きくは変わらないことが示唆された。
　次に、ＫＤＥＬＲ１の結合部位においてリガンドと近接するアミノ酸と、リガンドとの相互作用エネルギーを、ＦＭＯ法のＰＩＥＤＡを用いて計算した。リガンドから２．５Åから８Åの距離に近接して存在するアミノ酸を結合アミノ酸とした。具体的にｐｏｃｋｅｔ１における結合アミノ酸としてＡｒｇ４７、Ｔｙｒ４８、Ｇｌｕ１１７、Ａｓｎ１６５及びＴｒｐ１６６を選択した。リガンドと各アミノ酸残基との相互作用の和を、その成分である静電相互作用（ΣＥｅｓ）、交換反発（ΣＥ０）、電荷移動相互作用（Σｃｔ＊ｅｓ）、分散力（Σｄｉｓｐ）、溶媒との相互作用（ΣＧｓｏｌ）の合計（Σｔｏｔａｌ）で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　表１０から、ＫＤＥＬＲ１のＰｏｃｋｅｔ１との相互作用について、ＳＴＡＲ２－Ｎ１とＳＴＡＲ２の間に大きな差は認められなかった。
　日本国特許出願２０２０－０１７３０７号（出願日：２０２０年２月４日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (9)

  1. 　下記式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１及びＲ３はそれぞれ独立して炭素数１から１２の置換されてもよい炭化水素基を表す。
    　Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子又は炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基を表す。
    　Ｒ４は置換基を表す。
    　Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１から６の置換されてもよい炭化水素基、炭素数１から６の置換されてもよいアルコキシカルボニル基、又は炭素数１から６の置換されてもよいアルキルカルボニル基を表す。
    　Ｘ１からＸ４はそれぞれ独立して窒素原子又はＣ－Ｒ１１を表す。
    　Ｒ１１は水素原子又は置換基を表す。
    　ｎは０から４の整数を表す。
    　Ｌは連結基を表す。）
  2. 　前記置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、炭素数１から６のアルキルカルボニル基、カルバモイル基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルカルバモイル基、炭素数１から６のアシルアミノ基、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルキルオキシ基、アミノ基、炭素数１から６のモノ又はジアルキルアミノ基、カルボキシ基、及びスルホ基からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１に記載のピラゾール誘導体。
  3. 　前記連結基は、炭素数１から３のアルキレン基、酸素原子、イミノ基、硫黄原子及びカルボニル基からなる群から選択される少なくとも１つから形成される請求項１又は請求項２に記載のピラゾール誘導体。
  4. 　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のピラゾール誘導体を含む電位依存性陰イオンチャネル機能調整剤。
  5. 　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のピラゾール誘導体を含むＫＤＥＬ受容体１機能調整剤。
  6. 　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のピラゾール誘導体又はその薬学的に許容される塩を含み、電位依存性陰イオンチャネル関連疾患及びＫＤＥＬ受容体１関連疾患からなる群から選択される少なくとも１種の疾患の処置に用いられる医薬組成物。
  7. 　前記疾患が、神経変性疾患、虚血性疾患、腎炎、代謝性疾患、ウイルス疾患、脊髄異形成疾患、肝疾患、関節疾患、耳疾患及び腫瘍からなる群から選択される少なくとも１種である請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　前記疾患が、変異型ＫＲＡＳ又は変異ＫＲＡＳ関連シグナルに由来する腫瘍の少なくとも１種である請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、疾患の処置方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2019019094A (ja) * 2017-07-19 2019-02-07 学校法人福岡大学 変異ｋｒａｓ関連シグナル阻害用組成物
JP2020023447A (ja) * 2018-08-06 2020-02-13 学校法人福岡大学 フェニルテトラヒドロピリドインドール誘導体及び医薬組成物

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