KR102592927B1 - 세포막 투과성을 향상시키기 위한 교류 전기장 사용 - Google Patents

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Abstract

일정 기간 동안 세포에 교류 전기장을 적용하여 일반적으로 세포의 세포막을 통과할 수 없는 특정 물질(예 : 큰 분자)을 세포에 도입할 수 있다. 여기서 교류 전기장의 주파수는 교류 전기장이 세포막의 투과성을 증가시킨다. 세포막의 투과성이 증가하면 물질은 세포막을 통과할 수 있습니다. 이 접근법은 암 세포 (예 : 교모세포종)의 맥락에서 특히 유용하다.

Description

세포막 투과성을 향상시키기 위한 교류 전기장 사용
본 기술은 세포막 투과성을 향상시키기 위한 교류 전기장 사용과 관련된다.
교류 전기장을 사용한 교모세포종(GBM, glioblstoma) 치료는 항암 치료를 위한 추가 양식(수술 화학 방사선 요법 및 화학 요법 후)이 된 새롭고 검증된 치료법이다. 중간 주파수 교류 전기장(100-500 kHz)이 자세히 연구되었다. 가장 최근에, 종양치료장는 유지 테모졸로마이드 화학 요법(maintenance temozolomide chemotherapytemozolomide)에서 교모세포종 환자의 중앙 생존(5 개월까지)을 연장하는 것으로 나타났다. 종양 치료와 관련하여 이러한 주파수에서 교류하는 전기장을 종종 "종양치료장"또는 "TTFie1ds"라고 한다.
종양치료장의 메커니즘에 대한 많은 가설이 존재하지만 종양치료장에 의해 가장 널리 제안된 ("표준") 항암 작용 메커니즘은 튜불린 서브 유닛(tubulin subunits)이 고유 쌍극자 모멘트를 갖는다는 속성에 중심을 두고 있다. 200kHz 종양치료장의 외인성 부가를 통해 미세 소관 구조(microtubule structures)가 교대로 전기장 선(elecri field line)을 따라 정렬되도록 함으로써, 세포를 능동적으로 분할하는 기능은 유사 분열 스핀들(mitotic spindles)을 지원하는 세포 골격(cytoskeleton)과의 간섭을 통해 중단된다. 이러한 스트레스는 궁극적으로 손상된 세포 증식을 촉진한다. 개념 증명 실험 및 관련 기술 개발이 지난 10년 동안 이루어졌으며, 이는 식품의약국(FDA)의 재발 및 새로이 진단된 교모세포종의 치료를 위한 상업적, 임상적 종양 치료장 장치(Optuneo , Novocure Ltd.,) 승인으로 정점을 이루었다.
지난 몇 년 동안 행동 메커니즘에 대한 추가 세부 사항이 보고되었다. 예를 들어, 종양치료장은 septins(세포 분열 중에 유사 분열 방추를 고정시키는 세포 내 단백질)의 국소화를 방해하여 유사 분열을 교란시키는 것으로 나타났다. 일부 팀은 종양치료장과 함께 화학 요법 또는 방사선 요법으로 DNA 손상이 연장되었다고 보고한 반면에 다른 팀은 미토콘드리아 매트릭스의 부종을 통해 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 것을 보여주었다. 다른 팀은 GBM 환자에서 화학 요법 (예 : 테모졸로마이드)과 종양치료장의 조합을 조사하였다. 이러한 조합 개입에 대한 연구는 교모세포종에 대한 다른 유망한 효과를 발견하였다.
미국 특허출원공개공보 US2005/0209642호(2005.09.22.) 미국 특허출원공개공보 US2014/0330268호(2014.11.06.) 미국 특허출원공개공보 US2017/0281934호(2017.10.05.)
본 기술은 교류 전기장을 이용하여 세포막 투과성을 향상시켜 질병을 치료하기 위한 기술을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 한 측면은 세포의 세포막을 통해 물질을 전달하는 첫 번째 방법에 관한 것이다. 첫 번째 방법은 일정 기간 동안 세포에 교류 전기장을 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 교류 전기장의 적용은 세포막의 투과성을 증가시키고; 그리고 물질을 세포 부근에 도입하는 단계를 포함하며, 투과성이 증가된 세포막의 물질이 세포막을 통과할 수 있도록 한다.
첫 번째 방법의 일부 예에서 세포는 암세포이다. 첫 번째 방법의 일부 예에서 세포는 교모세포종 세포이다. 첫 번째 방법의 일부 예에서 교류 전기장은 약 200kHz의 주파수로 제공된다. 첫 번째 방법의 일부 예에서 교류 전기장은 50 내지 190kHz 사이의 주파수로 제공된다. 첫 번째 방법의 일부 예에서 교류 전기장은 210 ~ 400kHz 사이의 주파수로 제공된다. 첫 번째 방법의 일부 예에서, 교류 전기장은 적어도 IV/cm의 전기장 강도를 가진다.
첫 번째 방법의 일부 예에서, 세포는 살아있는 피험자의 신체에 위치하고, 교류 전기장은 피험자의 신체에 전기장을 제공하여 세포에 제공되며, 제공은 물질을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 세포는 암세포일 수 있다. 일부 예에서, 세포는 교모세포종 세포일 수 있다. 일부 예에서, 교류 전기장은 50 ~ 190kHz 사이의 주파수를 가질 수 있다. 일부 예에서, 교류 전기장은 210 ~ 400kHz 사이의 주파수를 가질 수 있다. 일부 예에서, 교류 전기장은 적어도 1 V/cm RMS의 전계 강도를 가질 수 있다. 일부 예에서, 교류 전기장은 1~ 4 V/cm RMS 사이의 전계 강도를 가질 수 있다. 일부 예에서, 물질 도입 단계는 주어진 시간에 시작될 수 있으며, 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간에서 적어도 12 시간 이후 종료된다. 일부 예에서, 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간보다 적어도 한 시간 전에 시작될 수 있다. 일부 예에서, 물질은 최소 1.2 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일부 예에서, 물질은 적어도 4 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일부 예에서, 물질은 적어도 20 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일부 예에서, 물질은 일반적으로 물질이 세포막을 가로지르는 것을 방해하는 하나 이상의 특성을 가질 수 있다. 일부 예에서, 세포는 물질을 사용한 치료에 선천적으로 내성이 있는 암세포 일 수 있다. 일부 예에서, 세포는 박테리아를 포함할 수 있고 물질은 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 암세포를 공격하는 제2 방법에 관한 것이다. 제2 방법은 제1 기간 동안 제1 주파수에서 제1 교류 전기장을 암세포에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 기간 동안 제1 주파수에서 제1 교류 전기장을 암세포에 적용하여 암세포의 세포막의 투과성을 증가시키고; 물질을 암세포에 도입하는 단계를 포함하며, 세포막의 증가된 투과성은 물질이 세포막을 통과할 수 있게 하고; 및 제2 기간 동안 제2 주파수의 제2 교류 전기장을 암세포에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 주파수는 제1 주파수와 상이하고, 제2 주파수의 제2 교류 전기장은 암세포의 생존력을 감소시킨다.
제2 방법의 일부 예에서, 암 세포는 교모세포종 세포를 포함하고, 제1 주파수는 250kHz 내지 350kHz이고, 제2 주파수는 150kHz 내지 250kHz이다. 두 번째 방법의 일부 예에서, 암 세포는 자궁 육종 세포를 포함하고, 첫 번째 주파수는 125kHz와 175kHz 사이이고, 두 번째 주파수는 75kHz와 125kHz 사이이다. 제2 방법의 일부 예에서, 암 세포는 유방 선암 세포를 포함하고, 제1 주파수는 75kHz 내지 175kHz이고, 제2 주파수는 100kHz 내지 300kHz이다. 두 번째 방법의 일부 예에서 물질을 도입하는 단계는 주어진 시간에 시작되고 첫 번째 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간이후 적어도 12 시간 이후 종료된다. 두 번째 방법의 일부 예에서, 첫 번째 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간보다 적어도 한 시간 전에 시작된다. 제2 방법의 일부 예에서, 제2 기간은 제2 주파수의 제2 교류 전기장이 암 세포에 인가되는 복수의 비연속적 시간 간격을 포함하고, 여기서 복수의 비연속적 간격은 시간을 합하면 최소 1 주 이다.
두 번째 방법의 일부 예에서, 암 세포는 살아있는 피험자의 신체에 위치하고, 제1 교류 전기장은 피험자의 신체에 제1 교류 전기장을 적용하여 암세포에 적용되며, 제2 교류 전기장은 피험자의 신체에 제2 교류 전기장을 적용하여 암세포에 적용되고, 적용하는 것은 피험자에 물질을 투여하는 것을 포함한다. 제2 방법의 일부 예에서, 제1 교류 전기장은 적어도 1 V/cm RMS의 전계 강도를 가진다. 두 번째 방법의 일부 사례에서 물질의 분자량은 최소 1.2 kDa이다. 두 번째 방법의 일부 예에서, 물질의 분자량은 4 kDa 이상이다. 두 번째 방법의 일부 예에서, 물질의 분자량은 20kDa 이상이다.
본 발명의 또 다른 측면은 피험자 신체의 종양을 치료하고 피험자 신체 내의 세포막을 통해 물질을 전달하는 제3 방법에 관한 것이다. 제3 방법은 제1 기간 동안 제1 주파수의 제1 교류 전기장을 피험자의 신체에 적용하는 단계를 포함하며, 제1 기간 동안 제1 주파수의 제1 교류 전기장을 피험자의 신체에 적용하면 피험자의 신체에 있는 세포막의 투과성을 증가시키고; 물질을 피험자에게 투여하고, 여기서 세포막의 증가된 투과성은 물질이 세포막을 통과할 수 있게 하며; 및 적어도 1 주일 길이의 제2 기간 동안 제2 주파수의 제2 교류 전기장을 피험자의 신체에 적용하는 단계를 포함하며, 여기서 제2 주파수는 제1 주파수와 다르며, 제2 교류 전기장은 제2 주파수에서 주파수는 종양의 성장을 억제한다.
세 번째 방법의 일부 예에서, 종양은 피험자의 뇌의 교모세포종을 포함하고, 제1 주파수는 250kHz와 350kHz 사이이고, 제2 주파수는 150kHz와 250kHz 사이이다. 제3 방법의 일부 예에서, 제2 기간은 제2 주파수의 제2 교류 전기장이 피험자의 신체에 인가되는 복수의 비연속적 시간 간격을 포함하고, 여기서 복수의 비 연속적 간격은 시간을 합하면 최소 1 주이다. 세 번째 방법의 일부 예에서, 물질을 투여하는 단계는 주어진 시간에 시작되고, 첫 번째 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간으로부터 적어도 12 시간 후에 종료ㄹ한다. 세 번째 방법의 일부 예에서, 첫 번째 교류 전기장을 적용하는 단계는 주어진 시간보다 적어도 한 시간 전에 시작된다.
세 번째 방법의 일부 예에서 물질의 분자량은 최소 1.2kDa 이다. 세 번째 방법의 일부 예에서 물질의 분자량은 4kDa 이상이다. 세 번째 방법의 일부 사례에서 물질의 분자량은 20kDa 이상이다.
본 발명의 또 다른 측면은 피험자의 신체에서 종양을 치료하고 피험자의 세포막을 통한 물질의 전달을 촉진하기 위한 제1 장치에 관한 것이다. 제1 장치는 50 내지 500 kHz 사이의 제1 주파수 및 50 내지 500 kHz 사이의 제2 주파수에서 작동할 수 있는 AC 전압 발생기를 포함한다. 여기서 제2 주파수는 제1 주파수와 다르다. AC 전압 생성기는 제어 입력을 갖고, AC 전압 생성기는 제어 입력이 제1 상태에 있을 때 제1 주파수를 출력하고 제어 입력이 제2 상태에 있을 때 제2 주파수를 출력하도록 구성된다. 제1 장치는 또한 (a) 제어 입력을 제2 상태에 두어 AC 전압 발생기가 제2 주파수를 출력하고, (b) 제1 주파수로의 전환 요청을 수락하고, (c) 요청 수신시 AC 전압 발생기가 일정 시간 동안 첫 번째 주파수를 출력하도록 제어 입력을 첫 번째 상태로 형성하고 (d) 시간 간격이 경과 한 후 제어 입력을 두 번째 상태에 형성하여 AC 전압 발생기는 두 번째 주파수를 출력하도록 프로그램된 제어기를 포함한다.
제1 장치의 일부 실시예는 피험자의 신체에 부착하도록 구성된 전극 세트; 및 AC 전압 발생기의 출력을 전극 세트에 연결하는 배선을 포함한다.
제1 장치의 일부 실시예에서, 제1 주파수는 250 kHz 내지 350 kHz이고, 제2 주파수는 150 kHz 내지 250 kHz이다. 제1 장치의 일부 실시 예에서, 제1 주파수는 125 kHz 내지 175 kHz이고, 제2 주파수는 75 kHz 내지 125 kHz이다. 제1 장치의 일부 실시 예에서, 제1 주파수는 75 kHz 내지 175 kHz이고, 제2 주파수는 100 kHz 내지 300 kHz이다. 제1 장치의 일부 실시예에서, 시간 간격은 적어도 12 시간이다. 제1 장치의 일부 실시 예에서, 시간 간격은 12 시간 내지 72 시간이다. 제1 장치의 일부 실시예에서, 제어기는 요청을 수신한 후에 제어 입력을 제1 상태와 제2 상태 사이에서 앞뒤로 전환하도록 추가로 프로그램된다.
제1 장치의 일부 실시예에서, AC 전압 생성기는 50 내지 500 kHz 사이의 적어도 하나의 추가 주파수에서 작동할 수 있고, AC 전압 생성기는 제어 입력이 적어도 하나의 추가 상태에 있을 때 적어도 하나의 추가 주파수를 출력하도록 구성되며, 제어기는 요청을 수신하기 전에 제2 상태 및 적어도 하나의 추가 상태를 통해 제어 입력을 순환하고, 시간 간격이 지난 후 제 2 상태 및 적어도 하나의 추가 상태를 통해 제어 입력을 순환하도록 프로그램된다.
제1 장치의 일부 실시예는 사용자 인터페이스를 더 포함하고, 요청은 사용자 인터페이스를 통해 수락된다. 제1 장치의 일부 실시예에서, 요청은 RF를 통해 수락된다.
본 발명에 의하면 교류 전기장을 사용하여 암세포의 원형질 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시켜 일반적으로 세포막에 의해 차단되는 물질이 세포막을 통과할 수 있도록 하거나, 일반적으로 세포막에 의해 저지되는 물질이 세포막을 통과하게 할 수 있다는 장점이 제공된다.
도 1은 세포막의 완전성 및 따라서 투과성을 조절하는 종양치료장의 대안적 효과를 도시하는 개요도이다.
도 2a는 종양치료장이 있는 경우(TTFields) 대비 종양치료장이 없는 조건(No TTFields)에서 시간의 함수로서 생물 발광 이미징 스캔으로부터 U87MG / eGFP-fLuc 세포의 생물 발광에 대한 종양치료장의 예시적인 효과를 도시한 도면이다.
도 2b는 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 대한 eGFP 형광에 대한 종양치료장의 예시적인 효과를 종양치료장이 있는 경우 대비 종양치료장이 없는 조건에서 시간의 함수로서 도시한 도면이다.
도 2c는 종양치료장 노출 길이의 함수로서 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 대한 eGFP 형광(eGFP-FL) 비율에 대한 fLuc 생물 발광 (fLuc-BLI)에 대한 종양치료장의 효과를 도시한 도면이다.
도 2d는 종양치료장 노출 시간의 함수로서 fLucBLI / eGFP-FL 비율에 대한 종양치료장 노출 대비 비노출의 영향를 도시한 도면이다.
도 3a는 종양치료장이 없는 경우와 종양치료장(200kHz) 사이의 U87-MCJ / eCJFP-fLuc 세포에서 시간 의존적 흡수 또는 Ethidium D에 대한 종양치료장의 예시적인 효과를 도시한 도면이다.
도 3b 내지 도 3d는 각각 4 kDa Dextran-FITC, 20 kDa Dextran-FITC 및 50 kDa Dextran-FITC에 대한 Dextran-FITC 흡수의 시간 경과에 대한 예시적인 영향 또는 종양치료장 대비 종양치료장 없음 조건을 도시한 도면이다.
도 4a는 6 시간 및 24 시간 동안 종양치료장에 노출된 대표적인 프로토 포르피린 IX (PpIX) 형광 대 종양치료장에 노출되지 않은 U87-MG 세포에 의해 나타낸 바와 같이 5 아미노레불린산(5-ALA) 흡수에 대한 종양치료장 (200kHz)의 예시적인 효과를 도시한 도면이다.
도 4b는 종양치료장에 노출된 공동 배양 플랫폼에서 교모세포종 대 섬유모세포에서 시간에 따라 PpIX 형광이 어떻게 변하는지 도시한 도면이다.
도 5는 3 일 동안 종양치료장에 노출 및 노출되지 않은 U87-MG / eGFP-lLuc 세포의 원형질막 구멍의 SEM 비교로부터 구멍의 수와 크기의 정량화를 제공한 도면이다.
도 6은 3 일 동안 종양치료장에 노출되거나 노출되지 않은 정상 인간 PCS-20 Icells의 원형질막 구멍의 SEM 비교에서 구멍의 수와 크기를 정량화를 제공한 도면이다.
도 7a 내지 7c는 각각 D-Luciferin, 5-ALA 및 Dextran-FITC (4kDa)의 U87-MG 세포에서 교대 전기장이 가역적으로 흡수를 증가시키는 것을 보여주는 실험 결과이다.
도 7d는 U87-MG 세포에 대한 종양치료장의 적용에 의해 유도되는 투과성의 타이밍 특성을 보여주는 실험의 결과를 도시한 도면이다.
도 8a는 교류 전기장이 MDA-MB-435 세포막의 7-AAD에 대한 투과성에 어떠한 영향을 미치는지 나타낸 실험 결과를 도시한다.
도 8b는 교류 전기장이 MDA-MB-435 및 MDA-MB-435 독소루비신(doxorubicin)에 대한 독시사이클린(Doxycycline) 내성 세포막의 투과성에 어떻게 영향을 미치는지 나타내는 실험 결과를 도시한다.
도 8c는 교대 전기장이 MCF-7 및 MCF-7 미톡산트론(Mitoxantrone) 저항성 세포막의 미톡산트론에 대한 투과성을 어떻게 대체하는지 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 9g는 물질 및 상응하는 세포 유형의 7 가지 확장 조합에 대한 민감도에 대한 종양치료장의 선택을 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 각각 교류 전기장의 적용과 암세포 부근에 물질의 도입 사이의 적절한 타이밍 관계를 도시한 도면이다.
도 11a는 U-87 MG 세포에 가장 높은 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다.
도 11b는 U-87 MG 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다.
도 12a는 MES-SA 세포에 가장 높은 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한 도면이다.
도 12b는 MES-SA 세포의 세포막 투과성의 최대 증가를 제공하는 주파수를 결정하기위한 실험의 결과를 도시한다.
도 12c는 150kHz 교류 전기장이 MES-SA 세포의 세포막의 독소루비신에 대한 투과성에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다.
도 13a는 MCF-7 세포에 최고 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기위한 실험 결과를 도시한다.
도 13b는 MCF-7 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다.
도 14는 GBM39 / Luc 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다.
도 15는 세포 투과성을 유도하기 위한 제1 주파수 및 세포 독성(cytotoxicity)을 유도하기 위한 제2 주파수를 생성하는 이중 주파수 장치의 블록 다이어그램이다.
본 출원은 미국 가출원 62/693,811(2018년 7월 3일 출원), 62/728,255(2018년 9월 7일 출원), 및 62/795,136(2019년 1월 22일 출원)의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 여기에 참조로 포함된다.
다양한 실시 예가 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 상세하게 설명되며, 동일한 참조 번호는 동일한 요소를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "생존율 감소(reducing viability)"는 세포의 성장, 증식 또는 생존을 감소시키거나 세포의 세포 독성을 증가시키는 것을 지칭한다.
본 출원은 교류 전기장을 사용하여 암세포의 원형질 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시켜 일반적으로 세포막에 의해 차단되는 물질이 세포막을 통과할 수 있도록 하거나, 일반적으로 세포막에 의해 저지되는 물질이 세포막을 통과할 수 있도록 하는 새로운 접근법을 설명한다. 본원에 기술된 일부 실시 예에서, 이 접근법은 교모세포종(glioblastoma) 세포막에 의해 일반적으로 방해받는 물질이 교모세포종 세포막을 더 쉽게 통과할 수 있도록 교류 전기장을 사용하여 교모세포종 원형질 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 데 사용된다.
본 발명자들은 새로운 항암 화합물 Withaferin A와 함께 종양치료장 치료가 인간 교모세포종 세포의 성장을 상승적으로 억제한다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 이러한 상승 효과가 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 일시적으로 종양 세포막 투과성을 증가시키는 종양치료장의 능력을 통해 교모세포종 세포에 대한 Withaferin A의 증가된 접근성 때문이라고 가정하였다. 이 그림에서 5-ALA = 5-아미노레불린산(5- aminolevulinic acid); 에티듐 D = 에티듐 브로마이드(ethidium bromide); 및 FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate) 이다.
그런 다음 가설을 검증하는 연구가 수행되었다. 특히, 종양치료장 노출이 루시퍼라제(레닐라 및 반딧불이, luciferase (renilla and firefly))를 발현하도록 변형된 인간 교모세포종 세포에서 더 큰 생물 발광을 유도하고, 이 유도는 원형질막을 통한 기질(D- 루시퍼린(D-luciferin) 및 코엘렌테라진(coelenterazine), 각각)의 증가된 투과에 기인한다는 증거가 발견되었다. 종양치료장 노출로 인한 막 투과성 증가는 Dextran-FITC 및 Ethidium D와 같은 다른 막 침투 시약으로도 입증되었다.
종양치료장을 사용하여 교모세포종 세포에서 막 투과성을 증가시키는 것도 5- 아미노레불린 산(5-ALA)을 사용하여 표시되었다. 5-ALA는 모든 포유류 세포에서 형광성 프로토 포르피린 IX (PpIX)로 전환되는 헤모글로빈 전구체이다. 그러나 고급 교종(high grade gliomas)을 포함한 많은 악성 세포는 헤모글로빈 생합성이 증가하여 형질 전환된 세포 및 조직 내에서 PpIX의 축적이 강화된 것으로 나타난다(비암 세포와 비교). 이러한 특성은 종양 세포에 대한 형광 바이오 마커로 5-ALA 흡수(결과적으로 PpIX 로의 효소적 전환)를 사용하는 많은 의학적 조사를 촉발하였다. 그러나 현재의 기술 수준에서는 수술 중 종양과 비 종양 조직 사이의 정확한 세포 마진을 구별하는 것이 어려울 수 있다. 여기에 설명된 실험은 종양치료장이 PpIX 형광 (5-ALA 노출 및 흡수에 의해 발생)에 대해 종양 대 정상 세포 비율을 상당히 향상시키고, 이러한 방식으로 수술 중 설정에서 종양 마진을 더 잘 나타내는데 사용될 수 있음을 보여준다.
주사 전자 현미경 (SEM) 데이터를 사용한 추가 실험은 종양치료장 노출로 인한 교모세포종 세포막의 구멍 수와 크기가 증가하고 종양치료장이 적용될 때 교 모세포종 세포막의 형태가 교란된다는 것을 나타낸다. 연구된 모든 양식(생체 발광, 형광 및 SEM)을 통해 GBM 세포막 투과성에 대한 종양치료장의 효과는 종양치료장 노출 중단 후 가역적인 것으로 밝혀졌다.
결과
종양치료장의 유도는 교모세포종을 발현하는 루시퍼라제에서 생물 발광( BLI )을 증가시킨다.
U87-MG / eGFP-fLuc 세포를 Thermanox 유리 커버 슬립에 시드하고 정착 및 성장시킨 다음 종양치료장 처리하거나 또는 적용하지 않았다. 이 실험에서 종양치료장(4 V/cm, 200kHz, 0.5 - 24 시간 기간)을 사용하면 노출되지 않은 조건에 비해 U87-MG / eGFP-fLuc 세포의 생물 발광 강도 (BLI)가 크게 증가하였다. 이러한 BLI의 증가는 종양치료장 시작 후 30 분에 발생했으며 종양치료장 노출 24 시간까지 계속되었다. ROI 정량화가 수행되었을 때, 종양치료장 노출 샘플에 대한 BLI 강도의 시간 경과는 종양치료장 비노출 샘플에 비해 상당히 증가하였다(p <0.0001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 종양치료장 없음). 이러한 실험의 시간적 정량화 또는 BLI 결과를 묘사하는 데이터는 도 2a에 요약되어 있다. 이 이론에 얽매이지 않고, 생물 발광의 상승은 반딧불이 루시퍼라제 활성에 대한 종양치료장의 직접적인 영향 때문이 아닌 것으로 받아들여진다. 정제된 반딧불이 루시퍼라제를 200kHz 종양치료장에 노출하면 종양치료장의 개시 60 분 후에 효소 활성이 손실된다.
도 2b는 종양치료장 노출 대 종양치료장 비노출 U87-MG / eGFP-fLuc에 대한 대표적인 이미지(미도시)의 시간 경과로부터 관찰된 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에서 eGFP 형광에 대한 종양치료장의 효과를 도시한다. 종양치료장의 존재는 실험 과정에서 eGFP 형광(eGFP-FL)을 유의하게 증가시키지 않았다. eGFP-FL에 대한 BLI의 비율을 종양치료장 샘플 대비 비종양치료장 샘플간에 비교했을 때, 그림 2c, 2d에 도시된 바와 같이 종양치료장 샘플에 대한 종양치료장 배양 시간과 관련하여 비율이 상당히 증가하였다(p <0.0001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 비종양치료장). 보다 구체적으로, 도 2c는 종양치료장 노출 길이의 함수로서 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 대한 eGFP 형광 (eGFP-FL) 비율에 대한 [Luc 생물 발광 (fLuc-BLI)에 대한 종양치료장의 효과를 도시한다. 도 2d는 종양치료장 노출 시간(시간)의 함수로서 fLuc-BLI / eGFP-FL 비율에 대한 종양치료장 노출 대 비노출의 효과를 도시한다. 종양치료장은 종양치료장이 없는 경우에 비해 정제된 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 크게 감소시켰다(p <0.01, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 비종양치료장).
다른 환자로부터 유래된 교모세포종 세포주인 GBM2 / GFP-fLuc에 대한 시간 경과에 따른 종양치료장의 적용은 종양치료장 비적용 대조군과 비교할 때 종양치료장에 노출된 GBM2 / GFP-fLuc 세포에서 생물 발광의 시간 의존적 증가를 유도하였다 (p <0.0001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 vs. 비종양치료장). 이 동일한 효과는 Renilla luciferase-red 형광 단백질 융합 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 쥐 성상 세포종 세포주(KR158B)에서 관찰되었다(p <0.0001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 vs. 비종양치료장). Renilla luciferase 활성은 ATP 및 마그네슘에 의존하지 않는다(반딧불이 luciferase와 반대). 따라서, 종양치료장에 의한 생물 발광의 유도는 ATP의 내인성 풀의 변경으로 인한 것이 아라고 파악된다.
막 결합 시약의 흡수에 대한 종양치료장의 효과
종양치료장의 부과가 세포막 특성에 영향을 미치고 따라서 막 투과성에 영향을 미치는지 테스트하기 위해 세포막에 결합하는 형광 태그가 지정된 시약의 거동에 대한 종양치료장의 효과를 결정하였다. 처음에는 Annexin-V-APC와 U87-MG / eGFP-fLuc 세포의 막에 대한 종양치료장의 영향을 측정하였다. Annexin-V-APC 결합은 막의 주름을 특징으로 하는 이른 세포 사멸(apoptosis)의 특징이다. 아폽토시스에 대한 양성 대조군 (U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 21 개의 uM 위다 페린 A 추가)을 사용하여 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 대한 Annexin-V-APC 결합의 가시성을 평가했으며, 이러한 결합이 종양치료장 비노출 샘플을 통해 형광 현미경을 통해 시각화 할 수 있다. 그러나 종양치료장이 U87-MG / eGFP-fLuc 세포에 적용되었을 때 Annexin-V-APC 결합은 종양치료장에 노출된 시점에서 관찰되지 않았다. 따라서 종양치료장은 U87-MG 세포에서 유의한 정도의 세포 사멸을 유도하지 않은 것으로 보인다.
특히, 에티듐 D(ethidium D) 흡수는 도 3a에 도시된 바와 같이 U87-MG / eGFP-fLuc 세포가 200 kHz TTFie1ds에 노출되었을 때 유의하게 증가하였다(p <0.0001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 비종양치료장). 에티듐 D는 원형질막과 핵막을 통해 침투하여 게놈 DNA에 삽입된다. 따라서, 이러한 발견은 종양치료장이 U87-MCJ / eCJFP-fLuc 세포에서 원형질막의 투과성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
종양치료장에 의한 향상된 막 투과성의 또 다른 결과는 세포막에 대한 Dextran-FITC 결합의 변경이다. Dextran-FITC는 원형질막에 결합하고 삽입하는 것으로 알려져 있다. U87-MG 세포가 200kHz 종양치료장에 1 시간 동안 처리되었을 때, 도 3b 및 3c에 도시된 바와 같이, 종양치료장에 노출이 없는 것과 비교하여 분자량 4kDa 및 20kDa의 Dextran-FITC의 상당한 흡수가 있었다. 그러나 그림 3d에 묘사된 바와 같이 50 kDa Dextran-FITC에 대한 흡수에는 유의한 차이가 없었다. 보다 구체적으로, Dextran-FITC 결합은 종양치료장의 존재하에 0.5 ~ 24 시간 노출 기간 동안 조사되었으며, 종양치료장 비노출된 샘플에 비해 4kDa Dextran-FITC의 흡수가 크게 증가한 것으로 나타났다(p <0.0001, 2 -way ANOVA, 종양치료장 vs. 비종양치료장), 종양치료장 노출에서 20kDa Dextran-FITC의 상당한 증가(p <0.01, 종양치료장 vs. 비종양치료장)가 있었고 및 종양치료장에서 50kDa Dextran-FITC의 흡수에는 큰 차이 없었다(p = 0.26, 중요하지 않음, 종양치료장 vs. 종양치료장 없음). 이러한 데이터는 이 실험에서 종양치료장 노출 하에 원형질막에 결합하고 원형질막에 들어간 Dextran-FITC의 최대 크기가 약 20 ~ 50kDa임을 시사한다. 이 단락에 설명된 모든 통계 비교에서 각 데이터 포인트는 n = 3 개의 실험을 나타낸다. 도 3a 내지 3d에서, APC = 알로피코시아닌(allophycocyanin); 에티듐 D =에티듐브로마이드(ethidium bromide); 및 FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate).
5- 아미노레불린 (5-ALA) 산 흡수에 대한 종양치료장의 효과 : 단일 U87MG 배양.
교모세포종 세포에서 5- ALA (PpIX 축적 및 그 결과 형광에 의해 측정 됨)의 흡수에 대한 종양치료장의 효과를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 현재의 5-ALA 바이오 어세이를 사용하여 종양과 정상 세포 사이의 경계를 구분하기가 어렵 기 때문에 PpIX 형광 측정을 사용하여 이 문제를 해결하였다. 종양치료장 노출로 세포막을 통한 교모세포종 세포로의 5-ALA 침투가 증가할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조사가 실행되었다. U87-MG 세포는 각각 종양치료장에 노출되거나 노출되지 않았으며, 각각 6-24 시간 동안 지속되었다. 도 4A로 요약된 결과는 다음과 같다: 종양치료장 노출은 종양치료장 노출 6 시간에 U87-MG / eGFP-fLuc 세포로 5-ALA의 흡수를 상당히 증가시켰다 (p = 0.047, Student 's t- 테스트, 종양치료장 vs. 비종양치료장) 그리고 이 증가는 24시간의 연장된 종양치료장 노출로 유지되었다 (p = 0.011).
도 4a에 도시된 데이터를 생성하기 위해, 노출 6 시간 및 24 시간 후 종양치료장 비노출 대 종양치료장 노출 U87-MG 세포에 대해 프로토 포르피린 IX (PpIX) 형광 패널을 얻었다. 이들 이미지를 정량화하면 6 시간 (p = 0.047) 및 24 시간 (p = 0.01) 시점에서 종양치료장에 노출되지 않은 세포에 비해 종양치료장 노출된 세포에서 PpIX 신호가 크게 증가하는 것으로 나타났다. 비종양치료장 대비 종양치료장 샘플들에 대한 모든 단변량(monovariant statistical comparisons)는 시점당 n = 3 실험에 대한 Student t-test에 의하여 수행되었다.
5- 아미노레불린 산 흡수에 대한 종양치료장의 효과 : PCS-201 섬유 아세포 공동 배양에 대한 U87-MG GBM .
환자의 교모세포종 절제술 동안 5-ALA는 신경외과 의사가 종양과 주변 정상 뇌 조직을 구분하는데 사용된다. 마찬가지로, 교모세포종과 정상 세포 사이의 5-ALA 흡수 차이를 구별하기 위해 U87-MG 세포가 PCS-201 섬유 아세포의 침대 중앙에 파종되고 종양치료장으로 처리되거나 또는 종양치료장으로 처리되지 않도록 공동 배양이 개발되었다. 형광 및 명시야 현미경 사진은 공동 배양 설정에서 개별 교모세포종 대 섬유 아세포 세포 영역의 존재를 확인하였다. 공동 배양을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신 (H & E)으로 염색했을 때, 현미경 사진은 종양치료장에 노출된 샘플에 대해 섬유 아세포 주변으로 침투하는 GBM 세포의 수가 감소한 것으로 나타났다.
특히, 종양치료장 노출없이, GBM 세포는 이전에 보고된 바와 같이 부착성 신경구의 많은 포켓을 형성하였다. 형광 이미지는 6 시간 동안 종양치료장에 노출된 공동 배양 플랫폼에서 교모세포종 대 섬유 모세포 세포에서 증가된 PpIX 형광을 보여주었다. 도 4b에 요약된 결과는 다음과 같다: 시간이 지남에 따라 PpIX 형광이 축적되었지만 형광 강도 증가율은 종양치료장 비노출 공동 배양에 비해 종양치료장 노출 공동 배양에 대해 상당히 증가하였다 (p < 0.001, 양방향 ANOVA, 종양치료장 vs. 비종양치료장). 도 4B로 도시된 데이터를 생성하기 위해, 종양치료장 및 종양치료장이 없는 경우 5-ALA 흡수(및 후속 Pp1X 형광, Ex = 558 nm, Em = 583 nm)의 형광 패널을 얻었다. 노출 기간은 2, 6 및 24 시간이다. 종양치료장에 노출 대비 노출되지 않은 조건(p < 0.001) 하에서 교모세포종-섬유 아세포 공동 배양 플랫폼에서 PpIX 축적(따라서 광자 / s로 표현되는 형광 플럭스의 축적)의 시간 경과에 대한 정량화. 통계 분석은 종양치료장 대 종양치료장 조건이 없는 경우의 양방향 ANOVA와 시점 당 n = 3 회의 실험으로 구성되었다.
별도의 실험 세트에서, 종양치료장 적용 24 시간에 의해 주변 PCS-201 섬유 아세포 세포에 대한 U87-MG 교모세포종 세포의 PpIX 형광 강도의 비율은 종양치료장이 적용되지 않은 환경 (p = 0.043, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 비종양치료장)에서 공동 배양된 세포들에 대한 형광 강도의 비율에 비하여 크게 증가하였다.
주사 전자 현미경 사진 (SEM)은 종양치료장가 U87-MG / eGFP-fLuc 세포의 막 형태를 변경한다는 것을 도시한다.
종양치료장에 노출되지 않았거나 종양치료장에 3 일 동안 노출되지 않은 저밀도 (5,000 개 세포 / 커버 슬립) U87-MG / eGFP-fLuc 세포의 SEM 이미지는 2000x, 20,000x 및 60,000x 배율에서 획득되었다. 이러한 SEM 이미지를 검토하여 얻은 데이터는 그림 5에 요약되어 있다. 종양치료장에 노출되지 않은 셀 (23.9 ± 11.0)에 비해 종양치료장에 노출된 셀(53.5 ± 19.1)의 ROI 내에서 크기가 51.8 nm2 (60,000x 배율에서 9 픽셀2에 해당)보다 큰 구멍 수가 상당히 증가하였다. (p = 0.0002, 일 변량 Mann-Whitney 테스트). ROI 내의 구멍의 평균 크기는 종양치료장 비노출 셀 (129.8 ± 31.9 nm2)에 비해 종양치료장 노출 셀 (240.6 ± 91.7 nm2)에서 훨씬 더 컸다 (p = 0.0005 (단 변량 Mann-Whitney 테스트)). 도 5에 묘사된 데이터를 얻기 위해, 500 nm 반경의 원형 관심 영역 내에서 노출되지 않은 TTField 및 노출된 세포 사이의 구멍 수 및 크기의 정량화 및 비교가 수행되었다. 최소 홀 크기 컷오프는 각각 20kDa 및 50kDa Dextran-FITC의 3.3 및 5.0nm 스톡스 반경을 기반으로한다. 조건 당 세 번의 실험에서 얻은 커버 슬립이 사용되었으며, 커버 슬립 당 최소 5 개의 세포가 이중 블라인드 방식으로 구멍 수와 크기에 대해 분석되었다.
고밀도로 시드된 U87MG 세포의 원형질막에 대한 종양치료장에 대한 24 시간 노출의 효과도 시각적으로 관찰되었다. 종양치료장에 노출되지 않은 샘플의 경우, 세포 표면은 막 주름과 유사하고 세포막과 인접한 조밀하게 매트하고 길고 평평한 막 확장으로 덮여있는 것처럼 보였다. 대조적으로, 종양치료장에 24 시간 노출된 후 조밀하게 매트하고 길쭉한 구조는 짧고 구근 모양의 수포 모양의 구조로 대체되었다.
비교를 위해 정상 인간 PCS-201 세포의 SEM 이미지도 획득하고 분석하였다. PCS-201 세포를 저밀도 (13mm 유리 커버 슬립 당 5,000 개 세포)로 시드하였다. 표준 조직 배양 조건 (3T C, 95 % 02, 5 % CO2)에서 세포를 성장시켰다. 비 종양치료장 노출 세포는 연구 기간 동안 이러한 조건하에 두었다. 다른 세포는 72 시간 동안 종양치료장에 노출되었다. 72 시간 후 2000x, 20,000x 및 60,000x 배율에서 SEM 이미지를 얻었다. 500nm 반경 원형 관심 영역 내에서 51.8nm2 (반경 4nm 원 또는 60,000 배 확대 이미지에서 9 픽셀2) 영역을 가진 구멍 수와 크기의 노출되지 않은 TTField 및 노출된 셀 간의 정량화 및 비교. 최소 홀 크기 컷오프는 각각 20kDa 및 50kDa DextranFITC의 3.3nm 및 5.0nm 스톡스 반경을 기반으로 한다. 도 6에 도시 된 결과는 다음과 같다 : 종양치료장에 노출되지 않거나 노출된 정상 인간 PCS-201 세포 사이에 구멍의 수 또는 크기에는 유의한 차이가 없었다(Wilcoxon rank-sum 분석). 조건당 세 번의 실험에서 얻은 커버 슬립이 사용되었으며, 커버 슬립 당 최소 5 개의 셀이 이중 블라인드 방식으로 구멍 수와 크기에 대해 분석되었다.
가역적인 막 투과성에 대한 종양치료장의 효과
종양치료장이 암세포에 미치는 영향의 가역성을 평가하기 위해 U87-MG / eGFP-fLuc 세포는 세 가지 조건에 적용되었다. (1) 종양치료장 노출 없음, 표준 세포 배양 조건 (37℃ , 95 % 02, 5 % CO2) ), (2) 24 시간 동안 종양치료장 노출 및 (3) 24 시간 동안 종양치료장 노출 후 24 시간 동안 종양치료장 노출 없음. BLI, PpIX 형광 (5-ALA 제품) 및 Dextran-FITC (4 kDa) 형광의 판독 값을 획득하였다. 모든 실험 조건은 세 번 수행되었다. 도 7a는 BLI에 대한 데이터를 요약한다. 24 시간 동안 종양치료장(중간 막대)의 존재는 종양치료장 노출이 없는 경우 (왼쪽 막대)에 비해 BLI 플럭스가 크게 증가했지만 (p <0.0005, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 비종양치료장) 이 증가는 세포가 24 시간 동안 TTFie1ds 없음 조건(오른쪽 막대)으로 재도입되었을 때 크게 감소되었다 (양방향 ANOVA, p <0.005, 24 시간 동안 종양치료장 대 24 시간 동안 종양치료장 이후 24 시간 동안 종양치료장 없음). 도 7B는 유사한 패턴의 가역적 판독이 PpIX 형광에서 발생했음을 보여준다(p <0.0005, 양방향 ANOVA, 종양치료장(가운데 막대) 대 비종양치료장(왼쪽 막대) 및 p <0.0004, 종양치료장 대 종양치료장 이후 종양치료장 없음 (오른쪽 막대)). 그리고 도 7c는 4kDa Dextran-FITC 형광에 대해 유사한 가역 판독 패턴이 발생했음을 도시한다(p < 0.05, 양방향 ANOVA, 종양치료장(중앙 막대) 대 종양치료장 없음(좌측 막대); 그리고 p < 0.05, 종양치료장 대 종양치료장 이후 종양치료장 없음(우측 막대)). 각 실험 세트에 대해 eGFP 형광은 크게 변하지 않았다. SEM 조사는 또한 구멍 수 (p = 0.007, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 종양치료장 없음)와 구멍 크기 (p = 0.0007, 양방향 ANOVA, 종양치료장 대 종양치료장 없음) 모두에서 유의한 증가가 있음을 보여주었다.) TTFie1ds는 24 시간 동안 노출되지 않은 후에도 가역적이었다. 여기서 NS = 중요하지 않음; BLI = 생물 발광 이미징; eGFP = 강화 된 녹색 형광 단백질; fLuc = 반딧불이 루시퍼라제; 5-ALA = 5 아미노 레불린 산; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PpIX = 프로토 포르피린 IX; 및 FL = 형광.
요약하면, 교류 전기장을 적용했을 때(교류 전기장이 적용되지 않은 경우에 비해) 관련 화합물의 흡수가 증가하였다. 이들 각각의 수치는 또한 24 시간 동안 교류 전기장이 중단된 후 흡수가 실질적으로 감소했음을 보여준다. 이로부터 교류 전기장에 의해 유도된 세포막의 투과성 증가는 영구적인 효과가 아며 교류 전기장이 중단된 후 투과율이 다시 떨어짐을 추론할 수 있다.
도 7d는 교류 전기장의 중단을 변경하면서 투과성이 얼마나 빨리 다시 떨어지는지를 테스트하기 위한 실험의 결과를 도시한다. 보다 구체적으로, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)는 DNA에 강한 친화성을 가진 형광 화합물이다. 7-AAD는 일반적으로 손상되지 않은 세포막을 쉽게 통과하지 않는 비교적 큰 분자 (1270.43 g / mol, 즉 1.27 kDa)이다. 도 7D는 U87-MG 세포에 대한 종양치료장의 적용에 의해 유도되는 7-AAD에 대한 투과성의 타이밍 특성을 보여준다. 이 실험에서 세포는 주변 온도 18 ℃에서 24 시간 동안 전기장 강도 1.62 V/cm RMS로 300kHz에서 교류 전기장으로 처리되었다. 7-AAD는 실시간 확장 시간에 샘플에 도입되었다 : 교류 전기장이 중단되기 15 분 전; 교류 전기장이 중단된 직후; 및 교류 전기장 중단 후 15, 30 및 60 분. 각각의 경우에, 7-AAD 도입 후 30 분 동안 7-AAD와 함께 세포를 배양한 다음, 각기 다른 타이밍에 대해 형광 7-AAD의 축적이 증가 된 세포 백분율의 유세포 분석을 수행하였다. 도 7D에서 볼 수있는 바와 같이, 7-AAD의 축적의 현저한 증가는 교류 전기장을 받는 동안 7-AAD와 함께 배양된 샘플에서만 관찰되었다.
다른 약물과 다른 유형의 암세포에 대한 추가 결과 .
여기에 기재된 방법은 교모세포종의 맥락에 제한되지 않는다. 반대로 다른 유형의 암세포에도 적용할 수 있다.보 다 구체적으로, 물질은 (a) 일정 기간 동안 세포에 교류 전기장을 적용하고 여기서 교류 전기장의 적용은 세포막의 투과성을 증가시키고; 및 (b) 물질을 세포 주변에 도입하는 단계에 의하여 세포의 세포막을 통해 전달될 수 있다. 세포막의 투과성이 증가하면 물질이 세포막을 통과할 수 있다. 특히, 여기에 기술된 방법은 다른 유형의 암 세포(예를 들어, MDA-MB-435 및 MCF-7 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 유형의 세포(교 모세포종 이외의 세포)의 세포막을 통해 큰 분자(일반적으로 관련 세포막을 통과하지 않음)를 전달하는 데 사용될 수 있다.
도 8a는 교류 전기장이 MDA-MB-435 인간 흑색종 세포주 세포(human melanoma cell line cells)의 세포막 투과성에 미치는 영향을 결정하기 위해 수행 된 실험의 결과를 도시한다. 이 실험에서 MDA-MB-435 세포는 주변 온도 18 ℃ 및 접시 온도 37 °C에서 24 시간 동안 전기장 강도 1.62 V/cm의 150kHz에서 교류 전기장으로 처리되었다. (이 예와 다른 예의 접시 온도는 교류 전기장으로 인한 가열로 인해 주변 온도보다 높다.) 처음 23.75 시간 이후에 7-AAD를 배양물에 첨가하고 15 분 동안 인큐베이션했으며, 그 동안 교류 전기장이 계속되었다(24 시간 기간을 완료하기 위해). 이 15 분의 기간 이후에 교류 전기장 적용을 종료하고 세포를 실온에서 추가로 15분간 배양하였다. 형광 7-AAD의 축적이 증가된 세포의 백분율은 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 사용하여 결정되었다. 세포의 ~ 66 %는 교류 전기장이 적용되지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에 노출된 대조군(막대 1) 세포의 5 % 미만과 비교하여 7-AAD(도 8a의 막대2)의 증가된 축적을 나타냈다. 이러한 결과는 교류 전기장이 세포막의 투과성을 매우 크게 증가시킨다는 것을 나타낸다.
이 실험의 변형에서, MDA-MB-435 인간 흑색 종 세포주 세포는 주변 온도 18℃ 및 접시 온도는 37 ℃이다. 이 24 시간 후, 교류 전기장은 15 분 동안 꺼지고 7-AAD가 추가되었다. 추가로 15 분을 기다린 후, 형광 7-AAD의 축적이 증가한 세포의 백분율을 유세포 분석을 사용하여 결정하였다. 이번에는 세포 중 7-AAD의 증가된 축적을 나타냈다(도 8a의 막대 3). 이러한 결과는 교류 전기장에 의해 유도되는 세포막의 투과성 증가가 상대적으로 수명이 짧고 교류 전기장이 중단된 후 투과성이 급격히 감소함을 나타낸다.
도 8b는 교류 전기장이 MDA-MB-435 인간 흑색 종 세포주 세포의 세포막의 독소루비신(doxorubicin, 543.52 g / mol)에 대한 투과성에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해 수행된 다른 실험의 결과를 묘사한다. 이 실험에서 MDA-MB-435 세포의 야생형 및 독소루비신 내성 변이체 모두를 23 시간 동안 1.62 V/cm의 전계 강도로 150 kHz의 교류 전기장으로 처리하였다. 이 23 시간 후, 10 μM 농도의 독소루비신을 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였으며, 그 동안 교류 전기장이 지속되었다. 그 다음 독소루비신의 세포 내 축적을 측정하였다. 독소루비신의 세포 내 축적은 야생형 세포(bar 1에서 bar 3 비교)와 독소루비신 내성 세포 (bar 2에서 bar 4 비교) 모두에서 증가하였다.
도 8c는 MCF-7 인간 유방 선암 세포주 세포(human breast adenocarcinoma cell line cell) 및 미톡산트론 (mitoxantrone, 444.481 g/mol)을 사용한 유사한 실험의 결과를 도시한다. 이 실험에서 MCF-7 세포의 야생형 및 미톡산트론 내성 변이체 모두를 23 시간 동안 전계 강도 1.62 V/cm로 150kHz에서 교류 전기장으로 처리하였다. 이 23 시간 후, 2 μM 농도의 미톡산트론을 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하였으며, 그 동안 교류 전기장이 계속되었다. 이어서 미톡산트론의 세포 내 축적을 측정하였다. 미톡산트론의 세포 내 축적은 야생형 세포 (bar I과 bar 3 비교)와 미톡산트론 내성 세포 (bar 2와 bar 4 비교) 모두에서 증가하였다.
도 8b 및 8c와 관련하여 위에서 설명된 결과는 교번 전기장이 야생형 및 약물 내성 세포 모두에서 화학 요법 분자의 세포 내 축적을 개선하고, 교류 전기장은 암세포에서 화학 요법 화학 물질의 세포 내 축적을 유리하게 복원할 수 있다는 것을 나타낸다.
종양치료장과 다양한 암 세포주에 대한 다양한 약물 사이에 상승효과(synergy)가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 추가 실험이 수행되었으며, 도 9a - 9g는 이러한 실험 중 일부의 결과를 도시한다. 보다 구체적으로, 도 9a는 3 일 동안 종양치료장을 적용하면 다양한 농도의 Lomustine에 대한 U87-MG / GFP-Luc 세포의 감도가 어떻게 향상되는지를 도시한다.(종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교). 도 9c는 3 일 동안 종양치료장을 적용하면 다양한 농도의 Lomustine에 대한 GBM39 세포의 감도가 어떻게 향상되는지 도시한다 (종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교하여). 도 9d는 3 일 동안 종양치료장을 적용하는 것이 Temozolomide의 다양한 농도에 대한 GBM39 세포의 감도를 어떻게 향상시키는지 도시한다 (종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교). 도 9e는 3 일 동안 종양치료장을 적용하는 것이 Irinotecan의 다양한 농도에 대한 GBM39 / Luc 세포의 감도를 어떻게 향상시키는지 도시한다 (종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교). 도 9f는 3 일 동안 종양치료장을 적용하면 다양한 농도의 독소루비신에 대한 MDA-MB-235 세포의 민감도가 어떻게 향상되는지 도시한다(종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교). 그리고 도 9G는 4 일 동안 종양치료장을 적용하면 U87-MG / eGFP-Luc 세포의 다양한 농도의 Mannose에 대한 민감도가 어떻게 향상되는지 도시한다(종양치료장가 적용되지 않은 대조군과 비교).
현재까지 CJBM39 / Luc, U87-MG / GFP-Luc 및 pcCJBM2 / GFP-Luc에 대해 종양치료장s와 Withaferin A의 조합에서 상승 효과가 발견되었다. 상승 효과는 CJBM39 / Luc, U87-MG / GFP-Luc 및 pcGBM2 / GFP-Luc에 대해 종양치료장 + Lomustine 조합에 대해 발견되었다. GBM39 / Luc에 대한 종양치료장과 Irinotecan의 조합에서 시너지가 발견되었다. U87MG / GFP-Luc에 대한 종양치료장과 Mannose의 조합에서 시너지가 발견되었다. VIDA-MB -235에 대한 종양치료장과 Doxorubicin의 조합에 대한 상승 효과의 증거도 발견되었다.
토의
이전 연구는 종양치료장이 핵(예 : 미세 소관), 셉틴, 미토콘드리아 및 자가 포식(autophagy)에 미치는 영향에 초점을 맞추었다. 그러나 여기에 설명된 실험은 암 세포막 완전성에 대한 종양치료장의 효과를 보고하고 다양한 평가 기술을 사용하여 종양치료장의 존재 하에 암세포(예 : 다중 인간 GBM 세포주)에 대한 증가된 세포막 투과성을 입증한 최초의 것으로 여겨진다(예 : 생물 발광 이미징, 형광 이미징 및 주사 전자 현미경).
관찰 결과 여러 인간 GBM 세포주에 걸쳐 종양치료장의 존재하에 교모세포종에 대한 증가된 세포막 투과성이 밝혀졌다. 가설을 검증하기 위해 사용된 접근 방식에는 생물 발광 이미징, 형광 이미징 및 주사 전자 현미경이 포함되었다. 관찰은 또한 종양치료장의 존재하에 다른 유형의 암 세포에 대한 증가된 세포막 투과성을 나타냈다. 화학 요법과 함께 종양치료장에 대한 연구는 치료적 부가성(therepeutic additivity)과 상승 효과를 모두 보여주었다. 이 연구를 위해 우리는 종양치료장이 암세포에 대한 접근성 향상을 매개한다고 가정하였다. 여러 실험에서 막에 대한 종양치료장 효과의 가역성을 보여주어 종양치료장과 막 투과성 증가 사이의 인과 관계를 보여주었다. 이러한 관찰은 또한 종양치료장이 암세포에 대한 약물 접근성을 조정하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
종양치료장 작용의 세포 투과성 가설에 대한 조사는 부분적으로 종양치료장에 의한 루시퍼라제 발현 GBM 세포에서 증가된 생물 발광 관찰 때문에 시작되었다. 이 이론에 구속되지는 않지만, 종양치료장은 GBM 세포의 세포막에서 증가된 투과성을 유도했다고 믿어진다. BLI에 의해 측정된 D- 루시퍼린에 대한 GBM 세포 투과성의 증가는 루시퍼라제 자체에 대한 종양치료장의 영향 때문이 아라 오히려 반딧불이 루시퍼라제를 발현하도록 조작된 세포로의 기질 D-루시퍼린의 증가된 유입 때문이라고 믿어진다. 또한, 이 발견은 ATP 의존성 (FLuc) 및 ATP 의존성 루시퍼 라제 (RLuc) 모두에 적용되었다. 따라서 종양치료장에 노출된 CT26 대장암 세포에서 세포 내 ATP가 증가했음을 시사하는 예비 보고에도 불구하고, 종양치료장 노출 설정에서 증가된 교모세포종 세포막 투과성 관찰은 독립적인 현상을 시사한다. 종양치료장 노출로 인한 루시퍼라제의 증가된 발현 또는 활성화는 이러한 세포에서 루시퍼라제 효소가 eGFP와 동일한 프로모터에 의해 제어되고 동일한 세포에서 형광 신호의 증가가 관찰되지 않았기 때문에 증 된 BLI 신호를 설명할 수 없었다. 그러나 종양치료장에 노출되면 ATP 수준의 변화, 막 형태의 변화 및 산소 소비의 변화에 의해 나타나는 세포 대사에 영향을 미칠 수 있다.
투과성 가설을 뒷받침하는 몇 가지 주요 결과는 도 3b 내지 도3d와 관련하여 위에서 설명한 Dextran-FITC 검증 실험에서 나왔다. 종양치료장 설정에서 작은 프로브에 대한 세포막의 접근성은 FITC 표지 dextrans로 테스트되었으며, 그 결과 50kDa(Stokes 반경 ~5nm) 덱스트란이 아닌 4kDa(Stokes 반경 ~1.4nm) 및 20kDa(Stokes 반경 ~3.3nm)의 유입이 증가하였다. 이것은 종양치료장이 GBM 세포가 50kDa 이하 20kDa 정도 이상의 물질을 더 침투하도록 만드는 것을 시사한다. 참고로, 루시퍼린 및 코엘렌테라진 기질은 종양치료장 노출로 멤브레인을 통해 접근할 수 있을만큼 분자량이 작다. D-루시퍼린(반딧불 루시퍼라제의 기질)의 분자량은 280.3 g/mol(~280 Da)이고, 코엘렌테라진 H(Renilla luciferase의 기질)는 분자량이 407.5 g/mol(~408 Da)이며 5-ALA의 분자량은 167.6 g/mol(169 Da)이고, Dextran-FITC 결과와 일치한다.
여기에 설명된 SEM 결과는 낮은 시딩 밀도에서 3 일의 종양치료장 노출이 도 5와 관련하여 위에서 설명한 바와 같이 종양치료장 없음 조건에 비해 면적이 51.8nm2보다 큰 구멍의 수와 크기를 크게 증가 시켰음을 보여준다. 이 구멍 크기 컷오프는 반경 4.1 nm의 원을 나타내며, 이는 크기가 20-40 kDa 인 FITC-dextran 분자의 Stokes 반경이다. 따라서, SEM에 의해 시각화된 세포막 파괴의 차이는 여기에 설명된 FITC-덱스트란 연구로부터의 간접적 관찰을 확인한다.
흥미롭게도, 정상적인 인간 섬유 아세포 (PCS-201)가 종양치료장에 노출되면 세포막 구멍의 수나 크기가 크게 증가하지 않았으므로 투과성 효과가 암세포에 어느 정도 특이성을 가질 수 있음을 시사한다. 질적으로, U87-MG 세포의 경우 높은 시딩 밀도 하에서 종양치료장에 24 시간 노출 되었기 때문에 구근, 수포와 같은 구조(bulbous, bleb-like structures)가 분명하게 시작되었다. 이러한 구조의 출현은 외막의 증가된 투과성 및 세포 사멸 유도와 일치하며 24 시간 종양치료장 노출에서 세포 사멸 표현형에 대한 증거가 거의없는 것으로 보인다. 더욱이, 고밀도 PCS-201 세포는 종양치료장 노출(데이터 미도시)에 이러한 변화를 나타내지 않았으므로 암세포에 대한 종양치료장 효과의 특이성을 다시 시사한다.
세포주기가 실험을 위해 동기화되지 않았지만 U87-MG 세포의 배가 시간(doubling time)은 48 시간이고 종양치료장이 세포 분열에 최대 항증식 효과를 발휘한다는 점을 감안할 때 종양치료장 노출 24 시간 후 관찰된 풍부한 아폽토시스(apoptosys)의 부족을 설명할 수 있다. 다른 해석은 세포 수포(celluar blebbing)가 세포 용해에 대한 저항성을 부여할 수 있다는 보고에 있을 수 있다. 동기화되지 않은 교모세포종 세포에 대한 종래의 보고는 72 시간의 종양치료장 노출이 Annexin V- 양성 세포를 현저한 비율로 세포 사멸하도록 유도했음을 입증하였다. 이 보고서는 투과 전자 현미경을 사용하여 자식포(autophagosomes), 부어오른 미토콘드리아 및 확장된 소포체를 포함한 자식 작용(autophagy)의 징후를 설명하였다. 대조적으로, 본원의 결과는 SEM을 사용하여 특히 원형질 세포막에 대한 종양치료장의 효과를 더 잘 시각화한다.
종양치료장에 의한 막 투과성의 증가는 중요한 임상적 영향을 미친다. 정상적인 인간 섬유 아세포(fibroblast cell)위에 층을 이룬 인간 GBM 세포의 공동 배양 플랫폼을 사용하여, GBM 세포로의 5- 아미노레불린 산(5-ALA) 흡수에 대한 종양치료장의 영향을 연구하였다. 종양치료장 노출은 섬유 아세포에 비해 GBM 세포에서 5ALA 흡수를 상당히 증가시켰다. 종양치료장 노출은 섬유 아세포에 비해 GBM 세포에서 5=2ALA 흡수를 상당히 증가시켰다. 2017년 6월, 5-ALA는 신경외과 의사가 신경 교종 절제 중에 종양-정상적인 뇌 경계를 묘사하는 데 도움을 주도록 미국 식품의약국(FDA)의 임상 사용 승인을 받았다. 따라서 5-ALA 투여 전에 종양치료장으로 신경 교종 환자를 전처리하는 것은 종양 절제 동안 침윤성 종양 가장자리의 윤곽을 향상시키는 데 유용할 것이다.
암세포에 대한 종양치료장의 효과를 감지하고 측정하는 것과 관련하여 현재까지 세포 배양 기반 연구의 대부분은 1 차 판독 값으로 세포 수/생존율에 초점을 맞추었다. 이것은 종양치료장이 빠르게 분열하는 종양 세포의 유사 분열을 방해하여 암세포 사멸을 초래한다는 일반적인 이해를 기반으로한다. 또한, 세포 배양에서 종양치료장의 계산 모델링 연구는 현재 모델의 주요 결과인 세포 수에 의해 주도된다.
GBM의 재발은 불가피하며 표준 치료에도 불구하고 첫 재발까지의 중앙값은 약 7 개월 이다. GBM 환자에 대한 종양치료장의 임상 적용에서, 데이터는 종양치료장 사용의 증가된 순응도와 기간이 향상된 생존과 관련이 있음을 시사한다. TFields 준수 (≥75 % 대 <75 %)는 전체 EF-14 시험 데이터 세트의 후향적 분석에서 전체 생존의 독립적인 예측 변수였으며 종양치료장 사용 기간도 전체 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 이러한 데이터는 세포 배양 기반 종양치료장 실험 설정에서 관찰된 효과의 임상 상관 관계가 될 수 있다. 즉, 종양치료장 노출 길이와 종양치료장 중단 후 세포막 투과성에 미치는 영향 기간 사이의 상관 관계가 관찰되었다. 0.5 ~ 3 시간의 종양치료장 노출 길이에서 BLI 확대 기간 (종양치료장 조건이 없는 것과 비교)은 약 5 분 동안 지속되었다. 그러나 12 ~ 25 시간의 종양치료장 노출에서 종양치료장와 종양치료장이 없는 조건 사이의 BLI 차이는 20 분 이상 지속되었다. 마찬가지로 Ram et. al이 보고한 데이터를 재분석한 결과 전체 생존율 (종양치료장과 테모졸로미드로 치료한 환자 대 테모졸로미드 단독으로 치료한 환자)이 종양치료장에 노출된 지 1 년 후 32 %에서 종양치료장 노출 5 년 후 551 %로 증가하였다.
여기에 설명된 결과, 즉 교류 전기장이 세포막 투과성을 증가시킨다는 결과는 이전에 보고된 종양치료장의 효과와 구별된다. 이것은 교모세포종뿐만 아라 다른 유형의 암 치료에 있어 현재의 외과적 및 임상적 관행에 상당한 영향을 미칠 것이다.
위에서 설명한 체외 실험에서 교류 전기장의 주파수는 200kHz이었다. 그러나 대안적인 실시예에서, 교류 전기장의 주파수는 다른 주파수일 수 있다. 예를 들어 약 200kHz, 50 ~ 500kHz, 25kHz ~ 1MHz, 50 ~ 190kHz, 25 ~ 190kHz, 또는 210 및 400kHz일 수 있다.
위에서 설명한 체외 실험에서 교류 전기장의 전계 강도는 1 ~ 4 V/cm RMS 사이 이었다. 그러나 대안적인 실시 예에서, 상이한 전계 강도가 사용될 수 있다 (예를 들어, 0.1 내지 10 V/cm).
위에서 설명한 체외 실험에서 교류 전기장은 0.5 시간에서 72 시간 사이의 다양한 확장 간격으로 적용되었다. 그러나 다른 실시예에서, 다른 기간이 사용될 수 있다(예를 들어, 0.5 시간 내지 14 일 사이). 일부 실시예에서, 교류 전기장의인가는 주기적으로 반복될 수 있다. 예를 들어, 교류 전기장은 매일 2 시간 동안 적용될 수 있다.
여기에 설명된 InovitroTM 시스템을 사용한 체외 실험에서 교류 전기장의 방향은 두 수직 방향 사이에서 1 초 간격으로 전환되었다. 그러나 다른 실시예에서, 교류 전기장의 방향은 더 빠른 속도(예를 들어, 1과 1000ms 사이의 간격) 또는 더 느린 속도 (예를 들어, 1과 100 초 사이의 간격)로 스위칭 될 수 있다.
여기에 설명된 InovitroTM 시스템을 사용한 시험관 내 실험에서, 교류 전기장의 방향은 교류 전압을 2D 공간에서 서로 90도 떨어져 배치 된 두 쌍의 전극에 교대로 교류 전압을 가함으로써 서로 다른 두 수직 방향으로 전환되었다. 그러나 대안적인 실시예에서, 교류 전기장의 방향은 전극 쌍을 재배치함으로써 수직이 아닌 두 방향 사이에서 또는 3 개 이상의 방향 사이에서 전환될 수 있다(추가적인 전극 쌍이 제공된다고 가정). 예를 들어, 교류 전기장의 방향은 3 개의 방향 사이에서 전환 될 수 있으며, 각 방향은 자신의 전극 쌍의 배치에 의해 결정된다. 선택적으로, 이러한 세 쌍의 전극은 결과적인 필드가 3D 공간에서 서로 90° 떨어져 배치되도록 위치할 수 있다. 다른 대안적인 실시 예에서, 전극은 쌍으로 배열될 필요가 없다. 예를 들어, 본원에 참고로 포된 미국 특허 7,565,205에 설명된 전극 위치를 참조한다. 다른 대안적인 실시 예에서, 필드의 방향은 일정하게 유지된다.
여기에 설명된 InovitroTM 시스템을 사용한 체외 실험에서 InovitroTM 시스템은 접시 측벽의 외부 표면에 배치된 전도성 전극을 사용하고 측벽의 세라믹 재료가 유전체로 작용하기 때문에 전기장이 배양물에 용량적으로 결합되었다. 그러나 대안적인 실시예에서 전기장은 (예를 들어, 전도성 전극이 측벽의 외부 표면 대신에 측벽의 내부 표면에 배치되도록 InovitroTM 시스템 구성을 수정함으로써) 용량성 결합 없이 셀에 직접 적용될 수 있다.
여기에 기재된 방법은 교모세포종 세포 및 다른 유형의 암세포 둘 다에 대해 살아있는 피험자의 신체의 표적 영역에 교번 전기장을 적용함으로써 생체 내 맥락에서 적용될 수 있다. 표적 영역에 전기장을 부과하면 표적 영역의 세포막 투과성이 증가하여 일반적으로 세포막에 의해 차단되거나 방해되는 분자가 세포막을 통과할 수 있다. 이것은 예를 들어, 전극을 피험자의 피부 위 또는 아래에 위치시킴으로써 달성될 수 있으며, 이러한 전극의 선택된 서브 세트 사이에 AC 전압을 인가하면 피험자의 신체의 표적 영역에 교류 전기장이 인가된다.
예를 들어, 관련 세포가 피험자의 폐에 있는 상황에서 한 쌍의 전극은 피험자의 흉부 앞뒤에 위치 할 수 있고 두 번째 전극 쌍은 피험자 흉부의 오른쪽과 왼쪽에 위치할 수 있다. 일부 실시 예에서, 전극은 피험자의 신체에 (예를 들어, 전도성 플레이트를 포함하고 또한 전도성 플레이트와 대상체의 신체 사이에 배치된 유전체 층을 갖는 전극을 사용함으로써) 용량적으로 결합된다. 그러나 대안적인 실시 예에서, 유전체 층은 생략될 수 있으며,이 경우 전도성 플레이트는 피험자의 신체와 직접 접촉한다. 다른 실시 예에서, 전극은 환자의 피부 아래에 피하로 삽입 될 수 있다. AC 전압 발생기는 첫 번째 기간(1초) 동안 오른쪽과 왼쪽 전극 사이에 선택된 주파수(100 ~ 200 kHz)의 AC 전압을 적용하여 필드 라인의 가장 중요한 요소가 피험자 신체의 가로축(transverse axis)과 평행하도록 교류 전기장을 유도한다. 이어서 AC 전압 발생기는 두 번째 시간(예: 1초) 동안 전면 및 후면 전극 사이에 동일한 주파수(또는 다른 주파수)로 AC 전압을 적용하여 필드 라인의 가장 중요한 구성 요소가 피험자의 시상 축(sagittal axis)과 평행한 교류 전기장을 유도한다. 이 두 단계 순서는 치료 기간 동안 반복된다. 선택적으로, 열 센서가 전극에 포함될 수 있으며, AC 전압 발생기는 전극에서 감지된 온도가 너무 높으면 전극에 적용되는 AC 전압의 진폭을 감소 시키도록 구성될 수 있다. 일부 실시 예에서, 하나 이상의 추가 전극 쌍이 추가되고 시퀀스에 포함될 수 있다. 대안적인 실시예에서, 한 쌍의 전극 만이 사용되며, 이 경우 필드 라인의 방향은 전환되지 않는다. 이 생체 내 실시예에 대한 임의의 매개 변수(예를 들어, 주파수, 전계 강도, 지속 시간, 방향 전환 속도 및 전극의 배치)는 생체 외 실시예와 관련하여 전술한 바와 같이 변할 수 있음을 주목한다. 그러나 전기장이 항상 피험자에게 안전하게 유지되도록 생체 내 맥락에서 주의를 기울여야한다.
세포막의 투과성을 높이기 위한 다양한 응용이 생체 내 맥락에서 쉽게 구상 될 수 있다. 일 예로, 종양 세포에 의한 약물 흡수의 국부적인 향상은 화학 요법 또는 다른 항종양제의 투여 전과 투여 중에 일정 기간(예를 들어, 12 또는 24 시간) 동안 관련 신체 부위에 교번 전기장을 적용함으로써 유도될 수 있다. 또 다른 예에서, 다중 약물 내성 종양 세포에 의한 약물 흡수는 화학 요법 또는 다른 항종양제의 투여 전과 투여 중에 일정 기간(예를 들어, 12 또는 24 시간) 동안 관련 신체 부위에 교류 전기장을 적용함으로써 회복될 수 있다. 또 다른 예에서, 적절한 약물의 투여 전 및 투여 중에 일정 기간(예를 들어, 12 또는 24 시간) 동안 (피험자가 교대 전기장으로 치료되는 원발성 종양이 있는지 여부에 관계없이) 전이되기 쉬운 영역에 교류 전기장을 적용함으로써 다중 약물 내성 전이의 발생을 예방할 수 있다.
도 10a는 시험 관내 맥락에서 교번 전기장의 적용과 물질을 암세포 근처로 도입하는 시기 또는 교류 전기장의 적용과 살아있는 환자에게 물질의 투여 사이의 적절한 첫 번째 관계를 도시한다. 도 7a - 7d 및 도 8a와 관련하여 위에 설명된 데이터를 기반으로, 물질이 주어진 시간 t = 0에 도입 또는 투여된다고 가정하면, 교류 전기장은 주어진 시간 후에 시작하여 물질이 세포 근처에서 여전히 이용 가능한 일정 시간(예 : 12 시간) 동안 계속될 수 있다. 이 상황에서, 교류 전기장이 시작된 후 투과성이 증가하기 시작하, 이 투과성의 증가는 물질이 관련 세포에 들어갈 수 있게 할 것이다. 화학 요법의 맥락에서, 이것은 환자에게 화학 요법제를 투여 한 다음 시간 간격 (예 : 12 시간 동안) 동안 교류 전기장을 적용하는 것에 해당한다.
대안적으로, 도 10b에 도시된 바와 같이, 교류 전기장은 주어진 시간 이전에(예를 들어, t = 0 이전에 1 시간) 시간 간격(예를 들어, t = 0 이후 12 시간까지) 동안 계속될 수 있으며 셀 주변에서 여전히 사용할 수 있다. 이 상황에서, 물질이 세포 근처에 도착하기 전((또는 물질이 살아있는 환자에게 투여되기 전))에 관련 세포의 투과성이 증가하기 시작한다. 이것은 물질이 세포 근처에 도착하자마자 즉시 세포막을 통과할 수 있게 한다. 화학 요법의 맥락에서, 이것은 교류 전기장의 적용을 시작한 다음, 교류 전기장이 여전히 적용되는 동안 화학 요법제를 투여 한 다음, 이어서 추가 시간 간격(예 : 화학 요법제 투여 후 12 시간까지) 동안 교류 전기장을 계속 적용하는 것에 상응한다.
도 10a 및 도 10b와 관련하여 위에서 논의된 시간 간격은 중단되지 않거나 바람직하게는 짧은 휴식 시간을 포함할 수 있다는 점에 유의한다. 예를 들어 시간 간격이 12 시간이라고 가정하면 중단되지 않는 12 시간 블록으로 충족될 수 있다. 또는 6 시간 동안 교류 전기장을 적용한 후 1 시간 휴식을 취한 다음 추가 6 시간 동안 교류 전기장을 적용하여 12 시간 간격을 충족할 수 있다 (물질이 여전히세포 근처에서 사용할 수 있는 동안). 또한, 도 10a 및 10b의 맥락에서, 물질이 살아있는 환자에게 투여될 때, 물질의 투여는 정맥 내, 경구, 피하, 척수강 내, 심실 내 및 복강 내를 포함 하나 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 접근법을 사용하여 수행될 수 있음에 유의한다.
최적의 주파수, 전계 강도 및 스위칭 특성은 주어진 유형의 숙주 세포와 세포막을 통해 전달되는 주어진 유형의 물질의 각 조합에 대해 실험적으로 결정될 수 있다. 일부 바람직한 실시 예에서, 주파수는 190 kHz 미만 (예를 들어, 50 내지 190 kHz 또는 25 내지 190 kHz)이다. 다른 바람직한 실시 예에서, 주파수는 210 내지 400kHz이다.
종양(예를 들어, 교모세포종)을 치료하는 한 가지 기존 접근법은 50 ~ 500kHz, 바람직하게는 100 ~ 300kHz 사이의 주파수에서 교번 전기장을 종양에 적용하는 것이다. 교모세포종의 경우 200kHz가 가장 선호되는 주파수이다. 이들 주파수에서 교번하는 전기장은 종양치료장(종양치료장)이라고 하며, 미국 특허 6,868,289 및 7,565,205에 설명되어 있고, 각각은 그 전체가 여기에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, 이 두 특허는 유사 분열 동안 분열하는 세포를 파괴하는 것을 설명한다. 종양치료장의 효과는 전기장의 방향이 주기적으로 전환될 때, 종양의 적어도 일부에서 장의 강도가 최소 1 V/cm 일 때 및 가능한 한 휴지가 적도록 장(field)이 장기간(예 : 몇 주 또는 몇 달) 적용될 때 향상된다.
종양치료장으로 종양을 치료하고 종양 세포의 세포막을 통해 물질을 전달하는 것이 바람직한 상황이 발생할 수 있다(예 : 종양에 대한 추가 공격 라인을 제공하기 위해 세포막을 지나 치료적으로 유효한 양의 화학 요법 약물을 얻는 데 도움이 됨). 어떤 상황에서는 종양을 치료하고 세포막의 투과성을 높이기 위해 단일 주파수의 교류 전기장을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 다른 상황에서는 세포막의 투과성을 증가시키기 위한 개선된 결과를 제공하기 위해 선택되는 제1 주파수 및 종양치료장의 항종양 작용에 대한 개선된 결과를 제공하기 위해 선택되는 제2 주파수와 같이 주파수가 다른 교류 전기장을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
도 11a 및 11b는 U-87 MG 교모세포종 세포에 대한 2 개의 체외 실험 결과를 도시한다. 보다 구체적으로, 도 11a는 U-87 MG 세포에 최고 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기 위한 첫 번째 실험의 결과를 도시한다. 그리고 도 11b는 U-87 MG 세포의 세포막의 가장 큰 투과성 증가를 제공하는 주파수를 결정하기 위한 두 번째 실험의 결과를 도시한다.
첫 번째 실험에서 U-87 MG 셀은 18 ℃의 주변 온도에서 72 시간 동안 서로 다른 주파수에서 1.62 V/cm RMS의 전계 강도로 교류 전기장에 노출되었다. 이 72 시간 후, 각기 다른 주파수에 대해 샘플에 존재하는 세포의 수를 유세포 분석을 사용하여 측정하였다. 도 11a에 도시된 바와 같이, 200kHz에서 교번 전기장이 제공된 샘플에서 가장 낮은 수의 세포(가장 높은 수준의 세포 독성을 나타냄)가 관찰되었다.
두 번째 실험에서는 7-AAD (일반적으로 손상되지 않은 세포막을 쉽게 통과하지 않는 분자량이 1270.43 g/mol인 형광 화학 물질)에 대한 투과성을 측정하였 다. 이 실험에서 세포는 주변 온도 18 ℃ 및 접시 온도 37 ℃에서 총 24 시간 동안 1.62 V/cm RMS의 전계 강도를 가진 서로 다른 주파수의 교류 전기장으로 처리되었다. 처음 23.75 시간 후, 7-AAD를 배양 물에 첨가하고 15 분 동안 인큐베이션했으며, 그 동안 교류 전기장이 계속되었다(24 시간을 완료하기 위해). 이 15 분 후, 교류 전기장 적용을 종료하고 세포를 추가로 15 분 동안 실온에서 인큐베이션 한 다음, 서로 다른 각각의 주파수에 대해 형광 7-AAD의 축적이 증가된 세포의 백분율에 대한 유세포 분석 분석이 이어졌다. 도 11b에서 볼 수 있듯이, 300kHz 교류 전기장을 받은 샘플에 대해 7-AAD (이는 최고 수준의 투과성을 나타냄) 축적이 증가된 세포의 가장 높은 비율이 관찰되었다.
도 12a 및 12b는 MES-SA 자궁 육종 세포가 사용된 것을 제외하고 도 11a, 11b와 관련하여 위에 기재된 것과 유사한 2 개의 체외 실험의 결과를 도시한다. 보다 구체적으로, 도 12a는 MES-SA 세포에 가장 높은 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다. 가장 낮은 수의 MES-SA 세포 (가장 높은 수준의 세포 독성을 나타냄)는 100kHz의 교류 전기장이 제공된 샘플에서 관찰되었다. 도 12b는 MES-SA 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기위한 실험의 결과를 도시한다. 7-AAD의 축적이 증가한 MES-SA 세포의 가장 높은 비율(가장 높은 수준의 투과성을 나타냄)은 150kHz에서 교류 전기장이 제공된 샘플에서 관찰되었다.
도 12c는 150kHz 교류 전기장이 MES-SA 세포의 세포막에서 독소루비신 (543.52g / mol)에 대한 투과성에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해 수행된 또 다른 실험의 결과를 도시한다. 이 실험에서, MES-SA 세포는 24 시간 동안 1.62 V/cm RMS의 전계 강도로 150 kHz에서 교류 전기장으로 처리되었다. 처음 23 시간 후, 10 μM 농도의 독소루비신을 첨가하고 1 시간 동안 인큐베이션하고, 그 동안 교류 전기장이 계속되었다 (24 시간을 완료하기 위해). 이어서 독소루비신의 세포 내 축적을 측정하였다. 독소루비신의 세포 내 축적은 150kHz 교류 전기장으로 처리 된 샘플의 경우 2 배 이상 증가하였다.
도 13a 및 13b는 MCF-7 유방 선암 세포가 사용된 것을 제외하고 도 11a, 11b와 관련하여 상기 기재된 것과 유사한 2 개의 체외 실험의 결과를 도시한다. 보다 구체적으로, 도 13a는 MCF7 세포에 최고 수준의 세포 독성을 제공하는 주파수를 결정하기 위한 실험의 결과를 도시한다. 200kHz의 교류 전기장이 제공된 샘플에서 가장 낮은 수의 MCF-7 세포(가장 높은 수준의 세포 독성을 나타냄)가 관찰되었다. 도 13b는 MCF-7 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기위한 실험의 결과를 도시한다. 7-AAD의 축적이 증가한 MCF-7 세포의 가장 높은 비율(가장 높은 수준의 투과성을 나타냄)은 150kHz의 교류 전기장이 제공된 샘플에서 관찰되었다.
도 11 내지 도 13과 관련하여 위에서 설명된 실험은 세포 투과성을 유도하기 위한 최적 주파수가 세포 독성 유도를 위한 최적 주파수와 다르다는 것을 보여준다. 보다 구체적으로, 교모세포종의 경우 세포 투과성을 유도하기 위한 최적의 제1 주파수는 250kHz에서 350kHz 사이이다. 세포 독성 유도를 위한 최적의 제2 주파수는 150kHz에서 250kHz 사이이다. 자궁 육종의 경우 세포 투과성을 유도하기 위한 최적의 제1 주파수는 125kHz에서 175kHz 사이이다. 세포 독성 유도를 위한 최적의 제2 주파수는 75kHz에서 125kHz 사이이다. 유방선암의 경우 최적의 세포 투과성을 유도하기 위한 제1 주파수는 75kHz에서 175kHz 사이이다. 세포 독성 유도를 위한 최적의 제2 주파수는 100kHz에서 300kHz 사이이다. 다른 유형의 암에 대한 주파수 범위쌍은 실험적으로 결정할 수 있다.
세포 투과성을 유도하고 세포 독성을 유도하기 위해 다른 주파수를 사용하는 경우, 세포 독성 주파수는 환자가 편안하게 견딜 수 있는 최대 시간 동안 적용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 세포 독성 주파수는 적어도 1 주일 동안 적용된다. 보다 바람직하게는 세포 독성 주파수는 수개월 동안 적용된다. 선택적으로, 세포 독성 주파수가 적용되는 시간 간격은 휴식 시간에 의해 분리되는 복수의 비연속적인 시간 간격으로 분할될 수 있으며, 여기서 복수의 비연속적인 시간 간격은 집합적으로 적어도 한 주(week)로 합산될 수 있다. 대조적으로, 투과성을 유도하기 위한 주파수는 바람직하게는 관련 물질이 표적 세포 근처에 위치할 때 투과성이 높도록 적용된다(예를 들어, 도 10a 내지 도 10b와 관련하여 전술한 바와 같음). 이 두 가지 다른 주파수의 적용은 특정 시간에 세포 투과성을 유도하는 제1 주파수와 다른 시간에 세포 독성을 유도하는 제2 주파수를 출력하도록 제어 할 수 있는 단일 AC 전압 발생기를 사용하여 수행할 수 있다. 동일한 트랜스듀서 어레이의 세트 (즉, 전극)를 사용하여 이 두 주파수(AC 전압 발생기에 의해 적용되는 주파수에 따라 다름)에서 교류 전기장을 적용할 수 있다.
도 15는 세포 투과성을 유도하기 위한 제1 주파수 및 세포 독성을 유도하기위한 제2 주파수를 생성하는 장치의 블록 다이어그램이다. 장치는 종래의 Optune® 필드 발생기 유닛과 유사하지만 2 개의 다른 주파수에서 작동할 수 있는 능력을 갖는 AC 전압 발생기(44)를 포함한다. 각 주파수는 50 ~ 500kHz이다. 이 기능은 예를 들어 릴레이를 사용하여 첫 번째 구성 요소 세트 또는 두 번째 구성 요소 세트를 AC 전압을 생성하는 기존 회로로 전환하고 발진기의 작동 주파수를 조정하여 구현 될 수 있다. AC 전압 발생기(44)는 제어 입력의 상태에 따라 제1 주파수 또는 제2 주파수를 출력하도록 구성된다. 제어 입력이 제1 상태에 있을 때 AC 전압 생성기 (44)는 제1 주파수를 출력하고, 제어 입력이 제2 상태에 있을 때 AC 전압 생성기 (44)는 제2 주파수를 출력한다. 제어기(42)는 AC 전압 발생기(44)가 제2 주파수를 출력하도록 제2 상태의 제어 입력을 제공하도록 프로그래밍된다. 제어기(42)는 또한 제1 주파수로의 전환 요청을 수락하도록 프로그래밍된다. 도 15에 도시된 실시 예에서, 요청은 푸시 버튼, 터치 스크린 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 종래의 접근법 중 임의의 것을 사용하여 구현될 수 있는 사용자 인터페이스(40)를 통해 제공된다. 대안적인 실시예에서, 요청은 태블릿, 스마트 폰 등으로부터 RF (예를 들어 블루투스, WiFi 등)을 통해 제공될 수 있다.
요청을 수신하면, 제어기(42)는 AC 전압 발생기(44)가 시간 간격(예를 들어, 적어도 1 시간, 적어도 12 시간, 또는 적어도 24 시간) 동안 제1 주파수를 출력하도록 제1 상태의 제어 입력을 제공한다. 시간 간격이 경과한 후, 제어기(42)는 제어 입력을 제2 상태로 하여 AC 전압 발생기(44)가 제2 주파수를 출력하도록 복귀한다.
선택적으로, AC 전압 발생기(44)는 제어 입력의 상태에 따라 하나 이상의 추가 주파수(예를 들어, 제3 주파수, 제4 주파수 등)를 출력하도록 구성될 수 있다. 바람직하게는 이들 추가 주파수 각각은 세포 독성을 유도하기 위해 선택된다. 이러한 실시 예에서, 제어기(42)는 요청이 도달하기 전에 AC 전압 발생기(44)가 제2 주파수 및 하나 이상의 추가 주파수를 출력하게 하는 상태를 통해 제어 입력을 순환하도록 프로그래밍된다. 제어기(42)는 또한 제1 주파수로의 전환 요청을 수락하도록 프로그래밍 된다. 요청을 수신하면, 제어기(42)는 AC 전압 발생기(44)가 시간 간격(예를 들어, 적어도 1 시간, 적어도 12 시간, 또는 적어도 24 시간) 동안 제1 주파수를 출력하도록 제어 입력을 제1 상태로 한다. 시간 간격이 경과한 후, 제어기(42)는 AC 전압 발생기(44)가 제2 주파수 및 하나 이상의 추가 주파수를 출력하게 하는 상태를 통해 제어 입력을 순환시키는 것으로 복귀한다.
도 15로 예시된 시스템은 종양치료장 및 화학 요법을 포함하는 병용 요법에 의해 치료되는 종양이 있는 사람에게 특히 유용하다. 이 상황에서 시스템은 최대 세포 독성 효과를 제공하기 위해 두 번째 주파수에서 대부분의 시간을 작동한다. 그러나 사람이 화학 요법을 위해 화학 요법 클리닉을 방문할 때, 의료진(또는 사용자)은 사용자 인터페이스(40)를 작동시켜 시스템을 투과성을 촉진하는 제1 주파수로 전환한다. 이러한 상황에서 사용자 인터페이스의 작동은 예를 들어 화학 요법의 예상 시작 1 시간 전 또는 실제 화학 요법 시작 후 짧은 시간에 수행될 수 있다.
대안적으로, (예를 들어, 사용자 인터페이스(40)로 부터) 요청을 수신하면, 제어기(42)는 제어 입력을 제어하여 AC 전압 발생기(44)가 시간 간격 (예를 들어, 1 시간) 동안 제1 주파수를 출력한 다음 두 번째 주파수와 첫 번째 주파수 사이를 앞뒤로 전환한다(예 : 매시간 전환). 결국(예를 들어, 관련 물질이 환자의 혈류에서 고갈되었을 때), 제어기(42)는 제어 입력을 제어하여 AC 전압 발생기(44)가 제 2 주파수를 출력하도록 복귀한다.
Optune®과 함께 사용되는 종래의 전극과 유사한 전극 세트(미도시)가 AC 전압 발생기(44)의 출력에 연결된다.
도 14는 GBM39 / Luc 세포의 세포막 투과성의 가장 큰 증가를 제공하는 주파수를 결정하기 위한 또 다른 실험의 결과를 묘사한다. 이 실험에서, 세포는 4kDa Dextran FITC (일반적으로 손상되지 않은 세포막을 쉽게 통과하지 않음)의 존재 하에서 2 일 동안 서로 다른 주파수에서 교번 전기장으로 처리되었다. 도 14로 도시된 바와 같이, 100kHz에서 교류 전기장을 은 샘플에서 가장 높은 수준의 Dextran-FITC 형광(최고 수준의 투과성을 나타냄)이 관찰되었다.
도 11 내지 도 14와 관련하여 논의된 실험 데이터는 2 차 효과로 발생할 수 있는 세포 독성과 관계없이 가능한 최대 범위까지 세포 투과성을 유도(관련 물질이 더 많은 세포막을 통과 할 수 있도록 함)하는 데 유용한 정보를 포함한다. 이러한 상황에서, 교류 전기장은 바람직하게는 최고 수준의 세포 투과성을 유도하도록 선택된 단일 주파수에서만 적용된다. 일부 상황 (예 : GBM39 / Luc, 자궁 육종 및 유방 선암)에서 이 주파수는 50 ~ 190kHz이다. 다른 상황 (예 : U-87 MG 교모세포종)에서 이 주파수는 210 ~ 400kHz 사이이다.
일반적으로 상당한 정도로 세포막을 횡단할 수 있는 물질의 경우, 세포막 투과성을 증가시키기 위한 본원에 설명된 기술을 사용하여 세포에 들어갈 물질의 양을 증가시킬 수 있다. 이것은 이러한 물질이 제공하는 치료 결과를 향상시킬 수 있다. 위에서 논의한 이러한 종류의 물질의 예로는 ethidium bromide (크기 = 394 Da), doxorubicin (크기 = 544 Da), Mitoxantrone (크기 = 445 Da) 등이 있다.
특히, 여기에 설명된 기술은 일반적으로 세포막을 통과할 수 없는 물질이 세포에 들어갈 수 있도록 하는 데에도 사용될 수 있다. 위에서 논의된 이러한 종류의 물질의 예는 (a) 최소 1.2kDa 인 화합물(예 : 크기가 1.27kDa인 7-AAD), (b) 최소 4kDa 인 화합물 (예 : 4kDa Dextran-FITC), (c) 적어도 20kDa 인 화합물 (예 : 20kDa DextranFITC), (d) 슈퍼 코일 플라스미드 DNA, siRNA 및 shRNA 구축물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전 물질, (e) 게놈 편집 시스템 메가뉴클레아제(meganucleases), 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성제-유사 이펙터 기반 뉴클레아제 (TALEN) 및 클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 (CRISPR / Cas9)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, (f) IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, sdAb를 포함 하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의 항체, 이러한 항체는 비접합(unconugated)되거나 세포 독성 제(cytotoxic agent), 독소(toxin), 형광 단(fluorophore), 양자점(quantum dots) 및 효소와 접합될 수 있고, (g) 하전된 분자 및 (h) 소분자, 치료 개체, 펩티드 및 일반적으로 세포막을 투과하지 않거나 세포 내 이입(endocytosis) 중에 파괴되는 단백질을 포함한다. 세포막을 통해 이러한 물질을 얻을 수 있는 능력을 제공한다는 것은 이전에 화합물 스크리닝 과정에서 효과가 없다고 거부되었을 수 있는 화합물이 세포 투과성을 향상시키는 교류 전기장과 함께 사용될 때 비로소 치료 목적으로 사용될 수 있음을 의미한다.
본원에 기재된 방법은 또한 암 세포의 맥락을 넘어 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 방법은 특정 다른 비암성 세포(예를 들어, 신장 세포, 폐 세포, 간 세포, 심장 세포, 뇌 세포, 근육 세포, 골수 세포, 기타)의 세포막을 통해 큰 분자(일반적으로 관련 세포막을 통과하지 않음)를 전달하는 데 유용할 수 있다. 이러한 약물의 전달은 약물 투여 전과 투여 중에 일정 시간 (예: 24 시간) 동안 관련 신체 부위에 교류 전기장을 적용함으로써 향상될 수 있다. 이러한 약물의 후보에는 항간질제 및 향정신성 약물(예 : 올란자핀(olanzapine), 9-OH 리스페리돈(9-OH risperidone) 및 기타 다양한 종류의 리스페리돈(risperidone)이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
또 다른 예에서, 적절한 항생제를 투여하기 전 및 투여하는 동안 일정 기간 (예를 들어, 24 시간) 동안 관련 신체 부위에 교류 전기장을 적용함으로써 박테리아에서 약물 흡수의 국부적인 향상을 달성할 수 있다. 특정 박테리아가 약물 내성 또는 다제 내성(예 : 세포막을 포함하는 작용 메커즘을 기반으로 함)으로 진화 한 상황에서 교류 전기장을 적용하면 내성을 극복 할 수있는 지점까지 박테리아 세포막의 투과성을 높일 수 있다. 유사한 접근법을 사용하여 수막염, 폐렴, 감염성 심내막염 등을 퇴치하기 위해 약물 섭취를 향상시킬 수 있다. 생체 내 맥락에서 교류 전기장은 종양이 없는 표적 영역(예: 폐)에 적용될 수 있다. 대안적으로, 교류 전기장이 종양을 포함하는 표적 영역(예를 들어, 교모세포종을 포함하는 뇌)에 적용될 수 있다.
본 발명이 특정 실시예를 참조하여 개시되었지만, 첨부된 청구 범위에 정의 된 바와 같이 본 발명의 범위 및 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시 예에 대한 다양한 수정, 변경 및 변경이 가능하다. 따라서, 본 발명은 설명 된 실시 예에 제한되지 않고, 아래 나열된 청구 범위의 언어 및 그 균등 물에 의해 정의 된 전체 범위를 갖는 것으로 의도된다.
물질 및 방법
세포 배양 연구: 2 개의 환자 유래 CJBM 세포주들(GBM2, GBM39), 즉 상업적으로 이용 가능한 인간 GBM 세포주(미국 버지니아주 맨사스 ATCC의 U87-MG)와 쥐 성상 세포종 세포주(murine astrocytoma cell line, KR158B; 플로리다 대학교 의과 대학교 신경외과의 Duane Mitchell 박사의 길트(gilt))를 사용했다. 인간 U87-MG, 인간 PCS-201 및 쥐과(murine) KR158B 교모세포종 세포주를 DMEM(인비트로젠/ 라이프 테크놀로지, 미국 캘리포니아 칼스배드)/ 10% FBS/ 및 1X 항진균제M(인비트로젠/ 라이프 테크놀로지, 미국 캘리포니아 칼스배드)에서 성장시켰다. GBM2 및 GBM39는 위에서 설명된 정 된 무 혈청 배지에서 성장되었다.
종양치료장 실험을 위해 유리 커버 슬립에 세포 시딩: 간단히 말해서, 배양중인 세포를 표준 프로토콜을 통해 트립신 처리하고 10,000-50,000 개의 단일 세포를 200 또는 75 μL의 DMEM / 10 % FBS / 1x 항생제 항진균제에 현탁한 다음 직경 22mm 또는 12mm 유리의 중앙에 각각 ThermanoxTM 커버 슬립에 시드하였다. (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). 세포를 37℃ 로 설정된 가습 95 % 공기 / 5 % CO2 배양기에서 밤새 배양하였다. 세포가 커버 슬립에 부착되면, 6 웰 또는 12 웰 플레이트의 웰당 각각 2mL 또는 1mL의 DMEM / 10 % FBS / 1X 항생제-항진균제를 첨가하였다. 결과 섹션에 달리 명시되지 않는 한, 세포는 inovitroTM 체외 종양치료장 장치(이스라엘, 하이파, 노보큐어 사)의 세라믹 접시로 옮기기 전에 2 ~ 3 일 동안(세포가 성장 단계에 있는지 확인하기 위해) 커버 슬립에서 성장하도록 두었다. 성장 조건(즉, 종양치료장 노출 조건과 노출되지 않은 조건에서 성장할 수 있는 시간 영역)은 결과 섹션 또는 해당 도면의 범례에 명시되었다.
체외 종양치료장 장치: 커버 슬립을 inovitroTM 시스템의 세라믹 접시로 옮긴 다음 inovitroTM베이스 플레이트(이스라엘, 하이파, 노보큐어 사)에 장착하였다. 200kHz (1 - 4 V/cm)의 종양치료장이 inovitroTM 발전기를 통해 제공되었다. 인큐베이터 주변 온도는 20 - 27℃에 걸쳐있었으며, 종양치료장을 적용할 때 세라믹 접시에서 목표 온도가 37℃ 이었다. 종양치료장 노출 기간은 0.5 ~ 72 시간 동안 지속되었으며, 그 후 커버 슬립을 제거하고 적절한 생물학적 분석을 위해 커버 슬립을 처리하였다(아래 참조). 가역성 실험의 경우, 종양치료장에 노출된 커버 슬립은 적절한 생물학적 분석을 위해 처리하기 전에 24 시간 동안 종양치료장 노출없이 일반 인큐베이터로 옮겨졌다(세포막 투과성에 대한 종양치료장 효과의 가역성을 평가하기 위해 종양치료장 기간을 벗어남). 배양 배지는 증발을 보상하기 위해 실험 내내 24 시간마다 수동으로 교환되었다. 6- 웰 또는 12- 웰 플레이트 내에 동등한 커버 슬립을 기존의 가습 조직 배양 인큐베이터 및 종양치료장에 노출된 커버 슬립과 병렬로 성장한 세포에 배치하여 해당 대조군 실험을 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 실험은 조건 및 시점당 최소 3 개의 샘플에서 수행되었다.
혈구계(hemocytometer)를 통한 세포 계수 분석 : 계수를 위한 세포 준비는 확립된 프로토콜을 통해 이루어졌으며 Zeiss PrimoVert 벤치 탑 현미경(Dublin, CA, USA)에서 시각화되었다. 달리 명시되지 않는 한, 세포 계수는 혈구계(hemocytometer)를 사용하여 트립신 처리된 단일 세포 현탁액에서 수행되었으며 4 개의 세포 계수 측정의 평균을 계산하고 가장 가까운 정수로 반올림하였다.
생물 발광 이미징 : 모든 생물 발광 작업을 위해 유전자 변형된 GBM2, GBM39 및 U87-MG를 사용하여 교모세포종 세포를 반딧불이 루시퍼라제(GBM39의 경우 fLuc 및 U87-MG의 경우 eGFP-fLuc) 또는 GFP와 반딧불이 루시퍼라제의 융합 단백질(GBM2의 경우 GFP/fLuc) 또는 레닐라 루시퍼라제-적색 형광 단백질 융합(KR158B의 경우 RLuc-RL8)을 발현하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 감염시켰다. 바이러스 상청액을 사용하여 세포를 형질 도입하고, ILuc의 경우 D-LuciferinLuciferin (0.3 mg/mL 최종 농도) 및 rLuc의 경우 coelenterazine(1 μg/mL)의 존재 하에서 세포 루시퍼라제 활성을 측정(IVIS Spectrum; Perkin Elmer, Waltman, MA) 하여 루시퍼라제의 발현을 확인하였다.
주사 현미경( SEM ): 5,000(낮은 시딩 조건) 내지 50,000(높은 시딩 조건) 개의 U87-MG / eGFP-fLuc 세포 또는 PCS-201 섬유 아세포 세포를 13mm 유리 커버 슬립에 위치하여 종양치료장 실험을 위해 준비하였다. 세포를 표준 조직 배양 인큐베이터 조건 (37 ℃, 95 % 02, 5 % CO2)에서 성장시켰다. 종양치료장 노출 및 종양치료장 비노출 실험의 마지막에서(높은 시딩 조건의 경우 1 일, 낮은 시딩 조건의 경우 3 일) 커버 슬립은 SEM을 위해 처리되었다. 모든 ROI 분석은 SEM 이미지 수집을 담당하는 개인이나 데이터 분석을 수행하는 사람이 샘플의 실험 조건을 알지 못하는 블라인드 방식으로 수행되었다. 세 번째 개인은 샘플 정체를 소유했다.
화학 시약: 달리 명시되지 않는 한 모든 화학 물질을 Selleckchem Inc.(Houston, TX, USA), Thermo-Fisher Scientific(Waltham, MA, USA) 또는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 정제된 반딧불이 루시퍼린 또는 반딧불이 루시퍼라제(SRE0045-2MG) 및 Ethidium D 아폽토시스 키트 (11835246001)는 Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO). )에서 구입하였다. 분자량 4, 20 및 50 kDa (FD4, FD20 및 FD50)의 Dextran-FITC도 Sigma Aldrich Inc.에서 구입하였다. 5- 아미노 레불린산 (5-ALA, AAA16942ME) 및 AnnexinV-APC 키트 (50712549)는 Thermo-Fisher Scientific Inc.(Waltham, MA)에서 구입하였다.
통계적 분석: PRISM 7.0 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 데이터가 정상적으로 분포되었는지 확인하였다. 정규 분포 데이터는 양방향 스튜던트 t- 검정 또는 분산 비교 분석(ANOVA)으로 분석되었으며 비정규 분포 데이터는 비모수 분석(예 : 중앙값의 Mann-Whitney U 테스트 비교)으로 분석되었다. 통계적 유의 수준은 알파 = 0.05로 설정되었다. Bonferroni 또는 Dunnet 사후 보정을 사용하여 다중 비교를 위해 알파를 조정하였다. 모든 데이터는 범위, 평균 ± 표준 편차, 중앙값 (사 분위 범위) 또는 백분율로 표시되었다. 모든 그림에서 통계적으로 유의한 차이 수준은 *p <0.05, **p <0.01 및 ***p <0.001로 표시되었다.
40: 유저 인터페이스 42: 제어기
44: 교류 전압 형성기

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  43. 피험자의 신체내 종양을 치료하고, 상기 피험자의 신체 내 세포막을 통하여 물질의 전달을 촉진하는 장치로, 상기 장치는:
    50 및 500kHz 사이의 제1 주파수와 상기 제1 주파수와 상이한 50 및 500kHz 사이의 제2 주파수를 구동하는 것이 가능한 교류 전압 형성기로, 상기 교류 전압 형성기는 제어 입력을 포함하고, 상기 교류 전압 형성기는 상기 제어 입력이 제1 상태일 때 상기 제1 주파수를 출력하고, 상기 제어 입력이 제2 상태일 때 상기 제2 주파수를 출력하며;
    (a) 상기 교류 전압 형성기가 제2 주파수를 출력하도록 상기 제어 입력을 제2 상태로 형성하고, (b) 제1 주파수로 전환하도록 하는 요청을 수락하며, (c) 상기 요청을 수락하면 교류 전압 형성기가 시간 간격동안 상기 제1 주파수를 출력하도록 상기 제어 입력을 상기 제1 상태로 형성하고, (d) 상기 시간 간격이 도과한 후, 상기 제어 입력을 상기 제2 상태로 형성하여 상기 교류 전압 형성기가 제2 주파수를 출력하도록 프로그램된 제어기를 포함하고,
    상기 제1 주파수는 피험자의 신체 내 세포막을 가로지르는 물질 전달을 촉진하도록 세포의 투과성을 향상시키는 주파수이며,
    상기 제2 주파수는 종양 세포에 세포 독성을 증가시키는 주파수인 장치.
  44. 제43항에 있어서, 상기 장치는
    상기 피험자의 신체에 고정되도록 구성된 전극들의 세트; 및
    상기 전극들의 세트와 상기 교류 전압 형성기의 출력을 연결하는 배선을 더 포함하는 장치.
  45. 제43항에 있어서,
    상기 제1 주파수는 250 kHz 및 350 kHz 사이이고, 상기 제2 주파수는 150 kHz 및 250 kHz 사이인 장치.
  46. 제43항에 있어서,
    상기 제1 주파수는 125 kHz 및 175 kHz 사이이고, 상기 제2 주파수는 75 kHz 및 125 kHz 사이인 장치.
  47. 제43항에 있어서,
    상기 제1 주파수는 75 kHz 및 175 kHz 사이이고, 상기 제2 주파수는 100 kHz 및 300 kHz 사이인 장치.
  48. 제43항에 있어서,
    상기 시간 간격은 적어도 12 시간인 장치.
  49. 제43항에 있어서,
    상기 시간 간격은 12 시간 및 72 시간 사이인 장치.
  50. 제43항에 있어서,
    상기 제어기는,
    상기 요청을 수신한 후, 상기 제어 입력을 상기 제1 상태와 제2 상태 사이에서 앞뒤로 전환하도록 추가로 프로그램되는 장치.
  51. 제43항에 있어서,
    상기 교류 전압 형성기는 50 및 500kHz 사이의 적어도 하나의 주파수를 더 구동할 수 있으며,
    상기 교류 전압 형성기는 상기 제어 입력이 적어도 하나의 추가 상태에 있을 때 상기 적어도 하나의 추가 주파수를 출력하고,
    상기 제어기는 상기 요청을 수신하기 전에 상기 제2 상태 및 적어도 하나의 추가 상태를 통해 제어 입력을 순환하고, 상기 시간 간격이 지난 후 상기 제2 상태 및 상기 적어도 하나의 추가 상태를 통해 제어 입력을 순환하도록 프로그램되는 장치.
  52. 제43항에 있어서,
    상기 장치는 유저 인터페이스를 더 포함하며,
    상기 요청은 상기 유저 인터페이스를 통하여 수락되는 장치.
  53. 제43항에 있어서, 상기 요청은 RF를 통하여 수락되는 장치.





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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10779875B2 (en) 2013-05-06 2020-09-22 Novocure Gmbh Optimizing treatment using TTfields by changing the frequency during the course of long term tumor treatment
US10188851B2 (en) 2015-10-28 2019-01-29 Novocure Limited TTField treatment with optimization of electrode positions on the head based on MRI-based conductivity measurements
US10821283B2 (en) 2016-04-04 2020-11-03 Novocure Gmbh Reducing motility of cancer cells using tumor treating fields (TTFields)
US20180001075A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Novocure Limited Arrays for Longitudinal Delivery of TTFields to a Body
CA3049949C (en) 2017-01-19 2024-04-23 Novocure Limited System for viewing cell cultures under a microscope whilst applying tumor treating fields
WO2019133608A1 (en) 2017-12-26 2019-07-04 Gala Therapeutics, Inc. Optimization of energy delivery for various applications
JP7055906B2 (ja) 2018-07-03 2022-04-18 エドウィン・チャン 細胞膜透過性を増加させるための交流電界の使用
KR20210030971A (ko) 2018-07-10 2021-03-18 노보큐어 게엠베하 교류 전기장을 사용한 바이러스 감염 억제
KR20230161546A (ko) 2018-07-18 2023-11-27 노보큐어 게엠베하 종양 치료장의 용량을 정량화하기 위한 전력 손실 밀도 및 관련 측정값의 사용
HUE056950T2 (hu) 2018-08-23 2022-03-28 Novocure Gmbh Váltakozó elektromos mezõk alkalmazása a vér-agy gát permeabilitásának növelésére
US11986647B2 (en) 2018-09-07 2024-05-21 Novocure Gmbh Treating autoinflammatory and mitochondrial diseases using an alternating electric field
JP2022501098A (ja) 2018-09-07 2022-01-06 ノボキュア ゲーエムベーハー Ｔ細胞の増殖を低減する交流電場を使用する自己免疫性疾患の治療
EP3984590B1 (en) 2018-10-15 2022-12-07 Novocure GmbH Generating tumor treating fields (ttfields) with high uniformity throughout the brain
EP3870271A1 (en) 2018-10-25 2021-09-01 Zeev Bomzon Delivering alternating electric fields (e.g., ttfields) to a subject's spinal anatomy
EP3922300B1 (en) 2018-11-19 2024-03-06 Novocure GmbH Arrays for delivering tumor treating fields (ttfields) with selectively addressable sub-elements
KR20230164208A (ko) 2018-11-29 2023-12-01 노보큐어 게엠베하 종양처리장을 전달하는 향상된 유연성 트랜스듀서 어레이
WO2020144582A1 (en) 2019-01-08 2020-07-16 Novocure Gmbh Evaluating quality of segmentation of an image into different types of tissue for planning treatment using tumor treating fields (ttfields)
KR20210126083A (ko) 2019-02-26 2021-10-19 노보큐어 게엠베하 표적 암세포들의 전기적 특징에 기초한 종양처리장 요법의 주파수 결정
CN113453638A (zh) 2019-02-27 2021-09-28 诺沃库勒有限责任公司 使用可植入换能器阵列递送肿瘤治疗场（TTFields）
EP3988099B1 (en) 2019-03-29 2023-06-07 Novocure GmbH Methods for restoring sensitivity to ttfields in ttfields-resistant cancer cells with ptger3 inhibitors
HUE061231T2 (hu) 2019-04-17 2023-05-28 Novocure Gmbh Adatok feltöltése egy szigetelt rendszerbõl a szigetelés veszélyeztetése nélkül
US20200330758A1 (en) * 2019-04-22 2020-10-22 Boston Scientific Scimed, Inc. Combination electrical and chemotherapeutic treatment of cancer
EP4378519A1 (en) 2019-04-22 2024-06-05 Boston Scientific Scimed, Inc. Electrical stimulation devices for cancer treatment
US11607542B2 (en) 2019-04-23 2023-03-21 Boston Scientific Scimed, Inc. Electrical stimulation for cancer treatment with internal and external electrodes
WO2020219519A1 (en) 2019-04-23 2020-10-29 Boston Scientific Scimed, Inc. Electrodes for electrical stimulation to treat cancer
CN113766950A (zh) 2019-04-23 2021-12-07 波士顿科学国际有限公司 带有热治疗或热监测的电刺激
JP7472264B2 (ja) 2019-07-31 2024-04-22 ノボキュア ゲーエムベーハー 頭蓋骨インプラントに埋め込まれた電極による腫瘍治療電場（ｔｔフィールド）の印加
US20210038584A1 (en) * 2019-08-05 2021-02-11 Novocure Gmbh Increasing Cancer Cells' Sensitivity to Tumor Treating Fields (TTFields) by Inhibiting IL11 Activity
CN114364433A (zh) 2019-08-30 2022-04-15 诺沃库勒有限责任公司 向颈部输送肿瘤治疗场（TTFields）
WO2021102356A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 Berg Llc Combination therapy of a coenzyme q10 compound and radiation therapy for treatment of glioma
CA3163315A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Novocure Gmbh High voltage, high efficiency sine wave generator that prevents spikes during amplitude adjustments and switching of channels
AU2020416669A1 (en) 2019-12-31 2022-06-16 Novocure Gmbh Arrays for delivering tumor treating fields (TTFields) with individually accessible electrode elements and temperature sensors
CN115515674A (zh) 2020-02-24 2022-12-23 波士顿科学国际有限公司 用于治疗胰腺癌的系统和方法
US20210299440A1 (en) * 2020-03-30 2021-09-30 Novocure Gmbh Intravenous / Intra-Spinal / Intra-Cavity / Intraventricular Delivery of TTFields (Tumor Treating Fields) for Treating Cancer and Metastases
US11818943B2 (en) 2020-06-25 2023-11-14 Novocure Gmbh Fabricating organic light emitting diodes (OLEDs) using tubulin
CN116867544A (zh) 2020-11-25 2023-10-10 诺沃库勒有限责任公司 通过在少于一半的时间在峰值强度处施加肿瘤治疗场（TTField）来增加TTField的功效
WO2022130183A2 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Novocure Gmbh Pyroelectric-based temperature sensing of transducer arrays for applying tumor treating fields (ttfields)
IT202100000119A1 (it) * 2021-01-05 2022-07-05 Telea Electronic Eng Srl Dispositivo e farmaco antitumorale per il trattamento di cellule neoplastiche
US20230009366A1 (en) 2021-06-30 2023-01-12 Novocure Gmbh Using Alternating Electric Fields at Different Frequencies to Increase Permeability of the Blood Brain Barrier and also to Provide Other Benefits
US11877838B2 (en) * 2021-08-14 2024-01-23 Nano Hesgarsazan Salamat Arya Preventing cytokine storm in COVID-19 patients by suppressing clonal expansion in activated lymphocytes using alternating electric fields
TW202333820A (zh) 2021-12-29 2023-09-01 瑞士商諾沃庫勒有限責任公司 在使用交流電場治療受試者時藉由使用較大陰極和較小陽極來降低電知覺
US20230218912A1 (en) 2021-12-30 2023-07-13 Novocure Gmbh Selecting Values of Parameters for Treatment Using Tumor Treating Fields (TTFields)
WO2023187689A1 (en) 2022-03-30 2023-10-05 Novocure Gmbh Using interleaved cooling periods to increase the peak intensity of tumor treating fields
US20230310877A1 (en) 2022-03-30 2023-10-05 Novocure Gmbh Reducing Electrosensation Whilst Treating a Subject Using Alternating Electric Fields by Pairing Transducer Arrays Together
CN114891777B (zh) * 2022-05-19 2024-05-14 江苏大学 利用高压电场放电刺激提高微藻胞外多糖分泌的装置及方法
WO2023248139A1 (en) 2022-06-20 2023-12-28 Novocure Gmbh Compositions, systems, and methods for treating cancer using tumor treating fields and vegf inhibitors
US20230407282A1 (en) * 2022-06-21 2023-12-21 Novocure Gmbh Systems and methods for treating conditions and diseases using alternating electric fields and crispr-cas system
WO2024003791A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Novocure Gmbh Electrode assembly for applying tumor treating fields (ttfields) that includes a plurality of thermally linked but electrically isolated graphite sheets
WO2024069321A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Novocure Gmbh Compositions, systems, and methods for reducing electrosensation and/or skin irritation
WO2024079719A1 (en) * 2022-10-14 2024-04-18 Novocure Gmbh Method and apparatus for delivering alternating electric fields to a target tissue
CN116284483A (zh) * 2023-03-24 2023-06-23 中国药科大学 一种低频极化电场辅助提取杜仲叶多糖的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020182591A1 (en) 2001-06-05 2002-12-05 Applied Biophysics, Inc. Electrical wounding assay for cells in vitro
US20050209642A1 (en) * 2000-02-17 2005-09-22 Yoram Palti Treating a tumor or the like with electric fields at different orientations
US20140330268A1 (en) * 2013-05-06 2014-11-06 Novocure Ltd Optimizing treatment using ttfields by changing the frequency during the course of long term tumor treatment
US20170281934A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-05 Novocure Limited Reducing Motility of Cancer Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3323415C2 (de) * 1983-06-29 1985-04-25 Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich Verwendung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Bestimmung von Zellinhaltstoffe sezernierenden Zellen
AU9472998A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Science Research Laboratory, Inc. Cell separation using electric fields
US6537272B2 (en) 1998-07-07 2003-03-25 Medtronic, Inc. Apparatus and method for creating, maintaining, and controlling a virtual electrode used for the ablation of tissue
US7070595B2 (en) 1998-12-14 2006-07-04 Medwaves, Inc. Radio-frequency based catheter system and method for ablating biological tissues
US7146210B2 (en) 2000-02-17 2006-12-05 Standen Ltd. Apparatus and method for optimizing tumor treatment efficiency by electric fields
US8447395B2 (en) 2000-02-17 2013-05-21 Novocure Ltd Treating bacteria with electric fields
US8175698B2 (en) 2000-02-17 2012-05-08 Novocure Ltd. Treating bacteria with electric fields
US7016725B2 (en) 2001-11-06 2006-03-21 Standen Ltd. Method and apparatus for destroying dividing cells
US7890183B2 (en) 2000-02-17 2011-02-15 Novocure Ltd. Treating parasites with electric fields
US7599746B2 (en) 2000-02-17 2009-10-06 Standen Ltd Apparatus and method for preventing the spread of cancerous metastases and for elimination of metastases
US7136699B2 (en) 2002-10-02 2006-11-14 Standen, Ltd. Apparatus for destroying dividing cells
CN1416466A (zh) 2000-02-17 2003-05-07 约朗姆·帕尔蒂 破坏正在分裂的细胞的方法和装置
US6868289B2 (en) 2002-10-02 2005-03-15 Standen Ltd. Apparatus for treating a tumor or the like and articles incorporating the apparatus for treatment of the tumor
US7089054B2 (en) 2002-10-02 2006-08-08 Standen Ltd. Apparatus and method for treating a tumor or the like
US8313908B2 (en) * 2000-02-23 2012-11-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of stem cell gene production with specific and selective electric and electromagnetic fields
US7465566B2 (en) * 2000-02-23 2008-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulation of genes via application of specific and selective electrical and electromagnetic signals
IT1321296B1 (it) * 2000-06-16 2004-01-08 Group Talamonti Di Talamonti A Apparecchiatura di elettrostimolazione del corpo umano.
US20040147984A1 (en) 2001-11-29 2004-07-29 Palomar Medical Technologies, Inc. Methods and apparatus for delivering low power optical treatments
WO2004082759A2 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Trustees Of Boston University Magnetic stimulator
ES2663779T3 (es) 2004-12-07 2018-04-17 Novocure Limited Electrodos para aplicar un campo eléctrico in vivo durante un período de tiempo
EP3666328B1 (en) 2004-12-27 2022-04-06 Novocure GmbH Treating a tumor or the like with electric fields at different orientations
ES2534488T3 (es) 2005-10-03 2015-04-23 Novocure Ltd. Características de optimización de un campo eléctrico para aumentar el efecto del campo sobre las células que proliferan
US20070141106A1 (en) * 2005-10-19 2007-06-21 Bonutti Peter M Drug eluting implant
US8019414B2 (en) 2006-04-05 2011-09-13 Novocure Ltd. Treating cancer using electromagnetic fields in combination with other treatment regimens
EP2167194B1 (en) 2007-03-06 2017-04-19 Novocure Ltd. Treating cancer using electromagnetic fields in combination with photodynamic therapy
US8715203B2 (en) 2007-09-17 2014-05-06 Novocure Limited Composite electrode
US20100259251A1 (en) 2007-12-13 2010-10-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Arangement and method for influencing and/or detecting magnetic particles in a region of action
WO2010106544A1 (en) 2009-03-16 2010-09-23 Rajah Vijay Kumar A method and apparatus for - focused resonance nanopermeabilization (forn)
EP2911736A4 (en) * 2012-10-25 2016-06-15 Oncosec Medical Inc electroporation
US10779875B2 (en) 2013-05-06 2020-09-22 Novocure Gmbh Optimizing treatment using TTfields by changing the frequency during the course of long term tumor treatment
US10639098B2 (en) 2014-05-06 2020-05-05 Cosman Instruments, Llc Electrosurgical generator
GB201408119D0 (en) * 2014-05-08 2014-06-25 Univ Cork Method
CN112807074A (zh) 2014-05-12 2021-05-18 弗吉尼亚暨州立大学知识产权公司 电穿孔系统
CN107872982B (zh) * 2015-03-31 2022-10-28 昂科赛克医疗公司 用于改进的基于组织感测的电穿孔的系统和方法
WO2016180934A1 (en) * 2015-05-12 2016-11-17 Umc Utrecht Holding B.V. Asymmetric balanced waveform for ac cardiac irreversible electroporation
WO2016179712A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 London Health Sciences Centre Research Inc. Intratumoral modulation therapy
US9910453B2 (en) 2015-09-25 2018-03-06 Novocure Limited High voltage, high efficiency sine wave generator with pre-set frequency and adjustable amplitude
US10188851B2 (en) 2015-10-28 2019-01-29 Novocure Limited TTField treatment with optimization of electrode positions on the head based on MRI-based conductivity measurements
US20180001075A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Novocure Limited Arrays for Longitudinal Delivery of TTFields to a Body
US20180008708A1 (en) 2016-07-10 2018-01-11 Novocure Limited Synchronizing Tumor Cells to the G2/M Phase Using TTFields Combined with Taxane or Other Anti-Microtubule Agents
BR112019003199A2 (pt) 2016-08-18 2019-06-18 Novocure Ltd medição de temperatura em array para entrega do tt fields
EP3528732B1 (en) * 2016-10-20 2023-06-21 Retrovascular, Inc. Device for enhanced composition delivery
KR102548188B1 (ko) 2016-12-13 2023-06-27 지브 봄존 전극위치가 변형 가능한 템플릿들로 최적화된 종양 치료장을 이용하여 환자들을 치료
CA3049949C (en) 2017-01-19 2024-04-23 Novocure Limited System for viewing cell cultures under a microscope whilst applying tumor treating fields
US20190117969A1 (en) * 2017-10-23 2019-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Medical devices for treatment of cancer with electric fields
US10953209B2 (en) 2018-03-28 2021-03-23 Board Of Regents Of The University Of Texas System Treating tumors using TTFields combined with a PARP inhibitor
JP7139448B2 (ja) * 2018-04-09 2022-09-20 ノボキュア ゲーエムベーハー ＴＴＦｉｅｌｄｓ及びオーロラキナーゼ阻害剤による腫瘍の治療
EP3832335A1 (en) 2018-04-10 2021-06-09 Zeev Bomzon Low frequency (< 1 mhz) ac conductivity estimates derived from two mri images having different repetition times
JP7055906B2 (ja) * 2018-07-03 2022-04-18 エドウィン・チャン 細胞膜透過性を増加させるための交流電界の使用
HUE056950T2 (hu) * 2018-08-23 2022-03-28 Novocure Gmbh Váltakozó elektromos mezõk alkalmazása a vér-agy gát permeabilitásának növelésére

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050209642A1 (en) * 2000-02-17 2005-09-22 Yoram Palti Treating a tumor or the like with electric fields at different orientations
US20020182591A1 (en) 2001-06-05 2002-12-05 Applied Biophysics, Inc. Electrical wounding assay for cells in vitro
US20140330268A1 (en) * 2013-05-06 2014-11-06 Novocure Ltd Optimizing treatment using ttfields by changing the frequency during the course of long term tumor treatment
US20170281934A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-05 Novocure Limited Reducing Motility of Cancer Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

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Zhitomirsky et al. The role of cytoplasmic-to-lysosomal pH gradient in hydrophobic weak base drug sequestration in lysosomes
Gao et al. Radiosensitization of HT‐29 cells and xenografts by the nitric oxide donor DETANONOate
US20230009366A1 (en) Using Alternating Electric Fields at Different Frequencies to Increase Permeability of the Blood Brain Barrier and also to Provide Other Benefits
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He et al. Reconstructing Tumor Microenvironment Using Photoresponsive Cyanobacteria to Reversal Chemoresistance for Robust Chemotherapy
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