BR112020025760A2

BR112020025760A2 - Uso de campos elétricos alternados para aumentar a permeabilidade da membrana celular

Info

Publication number: BR112020025760A2
Application number: BR112020025760-5A
Authority: BR
Inventors: Edwin Chang; Chirag B. Patel; Sanjiv S. Gambhir; Tali VOLOSHIN-SELA; Yaara PORAT; Moshe Giladi
Original assignee: Edwin chang; Chirag B. Patel; Sanjiv S. Gambhir; Tali Voloshin-Sela; Yaara Porat; Moshe Giladi
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2021-03-16
Also published as: US20200254242A1; AU2019299533B2; CN114025832A; DK3838333T3; US11103698B2; CN116236688A; JP7055906B2; EP3900776A1; US11529511B2; CN116603165A; EP3773877B1; CN114025832B; US20200009377A1; JP2021090424A; CN116139400A; CN114082099A; NZ770871A; US20200009376A1; AU2019299533A1; EP3900775A1

Abstract

certas substâncias (por exemplo, moléculas grandes) que, em circunstâncias normais, não atravessam a membrana celular podem ser introduzidas nas células aplicando-se às células um campo elétrico alternado por um período de tempo, sendo que a frequência do campo elétrico alternado é selecionada para que a aplicação do mesmo aumente a permeabilidade da membrana celular. uma vez que a permeabilidade da membrana celular aumenta, a substância é capaz de atravessá-la. essa abordagem é particularmente útil no contexto das células cancerosas (por exemplo, de glioblastoma).

Description

“USO DE CAMPOS ELÉTRICOS ALTERNADOS PARA AUMENTAR A PERMEABILIDADE DA MEMBRANA CELULAR” REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios dos EUA nº 62/693.811 (depositado no dia 3 de julho de 2018), 62/728.255 (depositado no dia 7 de setembro de 2018) e 62/795.136 (depositado no dia 22 de janeiro de 2019), cada um dos quais incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002]O tratamento contra o glioblastoma (GBM) usando campos elétricos alternados é uma nova terapia atestada que se tornou uma modalidade adicional (depois da quimiorradiação e quimioterapia) nos tratamentos anticâncer. Os campos elétricos alternados de frequência intermediária (100 a 500 kHz) vêm sendo estudados em detalhes. Mais recentemente, ficou demonstrado que os TTFields prolongam a sobrevivência mediana (em 5 meses) de pacientes com glioblastoma em quimioterapia de manutenção com a temozolomida. No contexto do tratamento contra tumores, os campos elétricos alternados nessas frequências são chamados em geral de "campos de tratamento de tumor" ou "TTFields."

[003]Há muitas hipóteses quanto ao mecanismo dos TTFields, mas o mecanismo de ação anticâncer dos mesmos mais difundidamente proposto ("padrão") centra-se na propriedade de que as subunidades de tubulina têm momentos dipolares intrínsecos. Ao forçar as estruturas de microtúbulos a alinhar-se ao longo das linhas dos campos elétricos alternados pela imposição exógena de TTFields de 200 kHz, a funcionalidade de dividir-se ativamente das células é abalada pela interferência nos fusos mitóticos que sustentam o citoesqueleto. Esse estresse, em última instância, debilita a proliferação celular. Experimentos de prova de conceito e desenvolvimentos tecnológicos relevantes ocorreram nos últimos dez anos, culminando na aprovação pela Food and Drug Administration (FDA) de um dispositivo de TTFields clínico comercial (Optune®, Novocure Ltd.) para o tratamento contra glioblastomas recorrentes e recém-diagnosticados.

[004]Nos últimos anos, relataram-se detalhes adicionais acerca dos mecanismos de ação. Por exemplo, foi demonstrado que os TTFields abalam a localização das septinas (proteínas intracelulares responsáveis por ancorar os fusos mitóticos durante a divisão celular) e, por conseguinte, prejudicam a mitose. Algumas equipes relataram o prolongamento dos danos ao DNA por quimioterapia ou radioterapia junto com os TTFields, ao passo que outras demonstraram efeitos sobre a função mitocondrial através da dilatação das matrizes mitocondriais. Outras equipes exploraram a combinação de quimioterapia (por exemplo, com temozolomida) com TTFields em pacientes com GBM. Essa pesquisa acerca de intervenções combinadas desvendou outros efeitos promissores contra o glioblastoma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005]Um aspecto da invenção refere-se a um primeiro método para distribuir uma substância através da membrana celular de uma célula. O primeiro método compreende aplicar um campo elétrico alternado à célula por um período de tempo, sendo que a aplicação do campo elétrico alternado aumenta a permeabilidade da membrana celular; e introduzir a substância nos arredores da célula, sendo que o aumento na permeabilidade da membrana celular permite que a substância cruze-a.

[006]Em alguns exemplos do primeiro método, a célula é uma célula cancerosa. Em alguns exemplos do primeiro método, a célula é uma célula de glioblastoma. Em alguns exemplos do primeiro método, o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência de cerca de 200 kHz. Em alguns exemplos do primeiro método, o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência entre 50 e 190 kHz. Em alguns exemplos do primeiro método, o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência entre 210 e 400 kHz. Em alguns exemplos do primeiro método, o campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm.

[007]Em alguns exemplos do primeiro método, a célula encontra-se no corpo de um paciente vivo, o campo elétrico alternado é aplicado à célula aplicando-se um campo elétrico ao corpo do paciente, e introduzir compreende administrar a substância ao paciente. Nesses exemplos, a célula pode ser uma célula cancerosa. Nesses exemplos, a célula pode ser uma célula de glioblastoma. Nesses exemplos, o campo elétrico alternado pode ter uma frequência entre 50 e 190 kHz. Nesses exemplos, o campo elétrico alternado pode ter uma frequência entre 210 e 400 kHz. Nesses exemplos, o campo elétrico alternado pode ter uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm RMS. Nesses exemplos, o campo elétrico alternado pode ter uma intensidade de campo de entre 1 e 4 V/cm RMS. Nesses exemplos, a etapa de introduzir a substância pode começar em dado momento, e a etapa de aplicar o campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento. Nesses exemplos, a etapa de aplicar o campo elétrico alternado pode começar ao menos uma hora antes do dado momento. Nesses exemplos, a substância pode ter um peso molecular de ao menos 1,2 kDa. Nesses exemplos, a substância pode ter um peso molecular de ao menos 4 kDa. Nesses exemplos, a substância pode ter um peso molecular de ao menos 20 kDa. Nesses exemplos, a substância pode ter ao menos uma característica que, em circunstâncias normais, dificulta-lhe cruzar a membrana celular. Nesses exemplos, a célula pode ser uma célula cancerosa que é inatamente resistente a tratamentos que usam a substância. Nesses exemplos, a célula pode compreender uma bactéria, e a substância compreende um antibiótico.

[008]Outro aspecto da invenção refere-se a um segundo método para atacar células cancerosas. O segundo método compreende aplicar um primeiro campo elétrico alternado a uma primeira frequência às células cancerosas durante um primeiro período de tempo, sendo que a aplicação do primeiro campo elétrico alternado à primeira frequência às células cancerosas durante o primeiro período de tempo aumenta a permeabilidade das membranas celulares das células cancerosas; introduzir uma substância nas células cancerosas, sendo que o aumento da permeabilidade das membranas celulares permite que a substância cruze-as; e aplicar um segundo campo elétrico alternado a uma segunda frequência às células cancerosas durante um segundo período de tempo, sendo que a segunda frequência difere da primeira e sendo que o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência reduz a viabilidade das células cancerosas.

[009]Em alguns exemplos do segundo método, as células cancerosas compreendem células de glioblastoma, a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz. Em alguns exemplos do segundo método, as células cancerosas compreendem células de sarcoma uterino, a primeira frequência é de entre 125 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 75 kHz e 125 kHz. Em alguns exemplos do segundo método, as células cancerosas compreendem células de adenocarcinoma de mama, a primeira frequência é de entre 75 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 100 kHz e 300 kHz. Em alguns exemplos do segundo método, a etapa de introduzir a substância começa em dado momento, e a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento. Em alguns exemplos do segundo método, a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado começa ao menos uma hora antes do dado momento. Em alguns exemplos do segundo método, o segundo período de tempo compreende vários intervalos de tempo não contíguos durante os quais o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência é aplicado às células cancerosas, sendo que os vários intervalos de tempo não contíguos somam coletivamente ao menos uma semana.

[010]Em alguns exemplos do segundo método, as células cancerosas encontram-se no corpo de um paciente vivo, o primeiro campo elétrico alternado é aplicado às células cancerosas aplicando-se um primeiro campo elétrico alternado ao corpo do paciente, o segundo campo elétrico alternado é aplicado às células cancerosas aplicando-se um segundo campo elétrico alternado ao corpo do paciente, e introduzir compreende administrar a substância ao paciente. Em alguns exemplos do segundo método, o primeiro campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm RMS. Em alguns exemplos do segundo método, a substância possui um peso molecular de ao menos 1,2 kDa. Em alguns exemplos do segundo método, a substância possui um peso molecular de ao menos 4 kDa. Em alguns exemplos do segundo método, a substância possui um peso molecular de ao menos 20 kDa.

[011]Outro aspecto da invenção refere-se a um terceiro método para tratar um tumor no corpo de um paciente e distribuir uma substância através das membranas celulares no corpo do paciente. O terceiro método compreende aplicar um primeiro campo elétrico alternado a uma primeira frequência ao corpo do paciente durante um primeiro período de tempo, sendo que a aplicação do primeiro campo elétrico alternado à primeira frequência ao corpo do paciente durante o primeiro período de tempo aumenta a permeabilidade das membranas celulares no corpo do paciente; administrar a substância ao paciente, sendo que o aumento da permeabilidade das membranas celulares permite que a substância cruze-as; e aplicar um segundo campo elétrico alternado a uma segunda frequência ao corpo do paciente durante um segundo período de tempo de ao menos uma semana, sendo que a segunda frequência difere da primeira e sendo que o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência inibe o crescimento do tumor.

[012]Em alguns exemplos do terceiro método, o tumor compreende um glioblastoma no cérebro do paciente, a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz. Em alguns exemplos do terceiro método, o segundo período de tempo compreende vários intervalos de tempo não contíguos durante os quais o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência é aplicado ao corpo do paciente, sendo que os vários intervalos de tempo não contíguos somam coletivamente ao menos uma semana. Em alguns exemplos do terceiro método, a etapa de administrar a substância pode começar em dado momento, e a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento. Em alguns exemplos do terceiro método, a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado começa ao menos uma hora antes do dado momento.

[013]Em alguns exemplos do terceiro método, a substância possui um peso molecular de ao menos 1,2 kDa. Em alguns exemplos do terceiro método, a substância possui um peso molecular de ao menos 4 kDa. Em alguns exemplos do terceiro método, a substância possui um peso molecular de ao menos 20 kDa.

[014]Outro aspecto da invenção refere-se a um primeiro aparelho para tratar um tumor no corpo de um paciente e facilitar a distribuição de uma substância através das membranas celulares no corpo do paciente. O primeiro aparelho compreende um gerador de tensão elétrica de CA capaz de operar a uma primeira frequência entre 50 e 500 kHz e a uma segunda frequência entre 50 e 500 kHz, sendo que a segunda frequência difere da primeira. O gerador de tensão elétrica de CA possui uma entrada de controle, e o gerador de tensão elétrica de CA é configurado para emitir a primeira frequência quando a entrada de controle estiver em um primeiro estado e para emitir a segunda frequência quando a entrada de controle estiver em um segundo estado. O primeiro aparelho também compreende um controlador programado para (a) posicionar a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA emita a segunda frequência, (b) aceitar um pedido para cambiar para a primeira frequência, (c) quando do recebimento do pedido, posicionar a entrada de controle no primeiro estado para que o gerador de tensão elétrico de CA emita a primeira frequência durante um intervalo de tempo, e, (d) após o fim do intervalo de tempo, posicionar a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA emita a segunda frequência.

[015]Algumas modalidades do primeiro aparelho compreendem ainda um conjunto de elétrodos configurado para afixação junto ao corpo do paciente; e a fiação que conecta uma saída do gerador de tensão elétrica de CA ao conjunto de elétrodos.

[016]Em algumas modalidades do primeiro aparelho, a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, a primeira frequência é de entre 125 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 75 kHz e 125 kHz. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, a primeira frequência é de entre 75 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 100 kHz e 300 kHz. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, o intervalo de tempo é de ao menos 12 horas. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, o intervalo de tempo é de entre 12 e 72 horas. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, o controlador é programado ainda para, subsequentemente ao recebimento do pedido, cambiar a entrada de controle para trás e para frente entre o primeiro estado e o segundo estado.

[017]Em algumas modalidades do primeiro aparelho, o gerador de tensão elétrica de CA é capaz de operar a ao menos uma frequência adicional entre 50 e 500 kHz, e o gerador de tensão elétrica de CA é configurado para emitir a ao menos uma frequência adicional quando a entrada de controle estiver em ao menos um estado adicional, e o controlador é programado para alternar a entrada de controle entre o segundo estado e o ao menos um estado adicional antes de receber o pedido, e para alternar a entrada de controle entre o segundo estado e o ao menos um estado adicional após o fim do intervalo de tempo.

[018]Algumas modalidades do primeiro aparelho compreendem ainda uma interface do usuário, e o pedido é aceito através dela. Em algumas modalidades do primeiro aparelho, o pedido é aceito via RF.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[019]A FIG. 1 é uma ilustração esquemática que representa o efeito alternado dos TTFields ao modular a integridade e, portanto, a permeabilidade das membranas celulares.

[020]A FIG. 2A ilustra efeitos exemplificativos dos TTFields sobre a bioluminescência de células U87-MG/eGFP-fLuc com base em varreduras de imagiologia bioluminescente em função do tempo em condições com TTFields vs. sem TTFields.

[021]A FIG. 2B ilustra efeitos exemplificativos dos TTFields sobre a fluorescência da eGFP para células U87-MG/eGFP-fLuc em função do tempo com base em condições com TTFields vs. sem TTFields.

[022]A FIG. 2C ilustra o efeito dos TTFields sobre a razão bioluminescência de células fLuc (fLuc-BLI) para fluorescência da eGFP (eGFP-FL) para células U87- MG/eGFP-fLuc em função do tempo de exposição aos TTFields.

[023]A FIG. 2D ilustra o efeito da exposição vs. não exposição aos TTFields sobre a razão fLuc-BLI/eGFP-FL em função do tempo de exposição aos TTFields.

[024]A FIG. ЗА ilustra efeitos exemplificativos dos TTFields sobre a absorção dependente do tempo de Etídio D em células U87-MG/eGFP-fLuc com base em condições sem TTFields e com TTFields (200 kHz).

[025]As FIGs. 3B a 3D ilustram o impacto exemplificativo de condições com TTFields vs. sem TTFields sobre o curso de tempo da absorção de Dextrano-FITC para 4 kDa de Dextrano-FITC, 20 kDa de Dextrano-FITC e 50 kDa de Dextrano- FITC, respectivamente.

[026]A FIG. 4A ilustra o efeito exemplificativo dos TTFields (200 kHz) sobre a absorção do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), conforme demonstrado pela fluorescência representativa da protoporfirina IX (PpIX) para células U87-MG expostas e não expostas a TTFields em 6 e 24 horas.

[027]A FIG. 4B ilustra como a fluorescência da PpIX mudou com o tempo em células de glioblastoma vs. células de fibroblastos nas plataformas cocultura que foram submetidas a TTFields.

[028]A FIG. 5 traz a quantificação do número e dimensão dos orifícios com base em uma comparação por SEM dos orifícios na membrana plasmática em células U87-MG/eGFP-fLuc expostas e não expostas a TTFields durante 3 dias.

[029]A FIG. 6 traz a quantificação do número e dimensão dos orifícios com base em uma comparação por SEM dos orifícios na membrana plasmática em células PCS-201 humanas normais expostas e não expostas a TTFields durante 3 dias.

[030]As FIGs. 7A a 7C ilustram os resultados de experimentos que demonstram como os campos elétricos alternados aumentam reversivelmente a absorção em células U87-MG da D-Luciferina, do 5-ALA e do Dextrano-FITC (4 kDa), respectivamente.

[031]A FIG. 7D ilustra os resultados de um experimento que demonstra as características temporais da permeabilidade que é induzida pela aplicação de TTFields a células U87-MG.

[032]A FIG. 8A ilustra os resultados de um experimento que demonstra como os campos elétricos alternados afetam a permeabilidade das membranas de células MDA-MB-435 à 7-AAD.

[033]A FIG. 8B ilustra os resultados de um experimento que demonstra como os campos elétricos alternados afetam a permeabilidade das membranas de células MDA-MB-435 e células MDA-MB-435 resistentes à doxiciclina à doxorrubicina.

[034]A FIG. 8C ilustra os resultados de um experimento que demonstra como os campos elétricos alternados afetam a permeabilidade das membranas de células MCF7 e células MCF7 resistentes à mitoxantrona à mitoxantrona.

[035]As FIGs. 9A a 9G ilustram o efeito dos TTFields sobre a sensibilidade com sete combinações diferentes de substâncias e tipos de célula correspondentes.

[036]Cada uma das FIGs. 10A e 10B ilustra uma relação temporal adequada entre a aplicação do campo elétrico alternado e a introdução da substância nos arredores da célula cancerosa.

[037]A FIG. 11A ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o mais alto nível de citotoxicidade a células U-87 MG.

[038]A FIG. 11B ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células U-87 MG.

[039]A FIG. 12A ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o mais alto nível de citotoxicidade a células MES-SA.

[040]A FIG. 12B ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células MES-SA.

[041]A FIG. 12C ilustra os resultados de um experimento para determinar como campos elétricos alternados de 150 kHz afetam a permeabilidade das membranas celulares de células MES-SA à doxorrubicina.

[042]A FIG. 13A ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o mais alto nível de citotoxicidade a células MCF-7.

[043]A FIG. 13B ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células MCF-7.

[044]A FIG. 14 ilustra os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células GBM39/Luc.

[045]A FIG. 15 é um diagrama em blocos de um aparelho de dupla frequência que gera uma primeira frequência para induzir à permeabilidade celular e uma segunda frequência para induzir à citotoxicidade.

[046]Várias modalidades são descritas em detalhes abaixo com referência aos desenhos concomitantes, nos quais números de referência iguais representam os mesmos elementos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[047]Conforme usado neste documento, o termo "reduzir a viabilidade" de uma célula refere-se a reduzir o crescimento, a proliferação ou a sobrevivência da célula ou a aumentar a citotoxicidade da mesma.

[048]O presente pedido descreve uma nova abordagem para aumentar temporariamente a permeabilidade das membranas celulares plasmáticas de células cancerosas usando campos elétricos alternados para que substâncias que são, em circunstâncias normais, bloqueadas pela membrana celular possam cruzá-la, ou para que substâncias que têm seu acesso, em circunstâncias normais, dificultado pela membrana celular possam cruzá-la com mais facilidade. Em alguns dos exemplos descritos neste documento, essa abordagem é usada para aumentar temporariamente a permeabilidade das membranas celulares plasmáticas de células de glioblastoma usando campos elétricos alternados para que substâncias que têm seu acesso, em circunstâncias normais, dificultado pela membrana da célula de glioblastoma possam cruzá-la com mais facilidade.

[049]Os inventores demonstraram que o tratamento com TTFields, junto com o novo composto anticâncer Witaferina A, inibiu sinergicamente o crescimento de células de glioblastoma humanas. Os inventores acreditam que esse efeito sinérgico deveu-se à maior acessibilidade da Witaferina A às células de glioblastoma graças à capacidade dos TTFields de aumentar transitoriamente a permeabilidade da membrana de células tumorais, como representa esquematicamente a FIG. 1. Nessa figura, 5-ALA = ácido 5-aminolevulínico; Etídio D = brometo de etídio; e FITC = isotiocianato de fluoresceína.

[050]Em seguida, foram realizados estudos para confirmar essa hipótese. Em particular, encontraram-se evidências que demonstram que a exposição a TTFields induziu a maior bioluminescência em células de glioblastoma humanas modificadas para expressar a luciferase (de Renilla e de vagalume) e que essa indução deveu-se à maior permeação das substâncias (D-luciferina e coelenterazina, respectivamente) através da membrana plasmática. A maior permeabilidade da membrana causada pela exposição a TTFields também foi demonstrada com outros reagentes penetrando na membrana, tais como Dextrano-FITC e Etídio D.

[051]O uso de TTFields para aumentar a permeabilidade da membrana em células de glioblastoma também foi demonstrado usando o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). O 5-ALA é um precursor da hemoglobina que converte-se na protoporfirina fluorescente IX (PpIX) em todas as células mamíferas. No entanto, muitas células malignas, inclusive gliomas de alto grau, exibem elevada biossíntese de hemoglobinas, que repercute no maior acúmulo de PpIX nas células e tecidos transformados (em comparação a células não cancerosas). Essa propriedade encorajou muitas investigações médicas a usar a absorção do 5-ALA (e, como consequência, sua conversão enzimática na PpIX) como um biomarcador fluorescente para células tumorais. No entanto, no atual nível da tecnologia, é difícil distinguir a margem celular precisa entre o tecido tumoral e o tecido não tumoral intraoperatoriamente. Os experimentos descritos neste documento demonstram que os TTFields realçam significativamente a razão de células tumorais para células normais por fluorescência da PpIX (causada pela exposição e absorção do 5-ALA) e, portanto, podem ser usados para melhor delinear as margens dos tumores em cenários intraoperatórios.

[052]Experimentos adicionais usando dados de microscopia eletrônica de varredura (SEM) exibem um aumento no número e dimensão dos orifícios nas membranas das células de glioblastoma causado pela exposição a TTFields e que a morfologia da membrana das células de glioblastoma é abalada quando aplicam-se os TTFields. Em todas as modalidades estudadas (bioluminescência, fluorescência e SEM), os efeitos dos TTFields sobre a membrana de células GBM mostraram-se reversíveis após a interrupção da exposição aos TTFields.

RESULTADOS A indução de TTFields aumenta a bioluminescência (BLI) em glioblastomas que expressam a luciferase.

[053]Células U87-MG/eGFP-fLuc foram semeadas em lamínulas de vidro Thermanox, permitidas acomodar-se e crescer, e então submetidas ou não a TTFields. Nesse experimento, o uso de TTFields (4 V/cm, 200 kHz, 0,5 a 24 h de duração) aumentou significativamente a intensidade de bioluminescência (BLI) das células U87-MG/eGFP-fLuc em comparação às condições não expostas. Esse aumento na BLI ocorreu em apenas 30 minutos após o início dos TTFields e persistiu por 24 h de exposição aos TTFields. Quando a quantificação do ROI foi realizada, o curso de tempo da intensidade de BLI para as amostras expostas a TTFields foi significativamente elevado em comparação às amostras não expostas a TTFields (p < 0,0001, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields). Os dados que representam a quantificação temporal dos resultados de BLI desses experimentos são relacionados na FIG. 2A. Sem limitação a esta teoria, acredita-se que a elevação na bioluminescência não se deve a um efeito direto dos TTFields sobre a atividade da luciferase de vagalume porque a exposição da luciferase de vagalume purificada a TTFields de 200 kHz levou a uma perda de 1.000 vezes na atividade enzimática 60 minutos após o início dos TTFields.

[054]A FIG. 2B ilustra o efeito dos TTFields sobre a fluorescência da eGFP em células U87-MG/eGFP-fLuc observado no curso de tempo de imagens representativas (não ilustradas) para células U87-MG/eGFP-fLuc expostas a TTFields vs. não expostas a TTFields. A presença de TTFields não aumentou significativamente a fluorescência da eGFP (eGFP-FL) ao longo do curso dos experimentos. Quando as razões de BLI para eGFP-FL foram comparadas entre amostras com TTFields vs. sem TTFields, observou-se uma razão significativamente aumentada em relação ao tempo de incubação em TTFields para as amostras com TTFields, conforme ilustram as FIGs. 2C e 2D (p < 0,0001, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields). Mais especificamente, a FIG. 2C representa o efeito dos TTFields sobre a razão bioluminescência de células fLuc (fLuc-BLI) para fluorescência da eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc em função do tempo de exposição aos TTFields; e a FIG. 2D ilustra o efeito da exposição aos TTFields vs. não exposição sobre a razão fLuc-BLI/eGFP-FL em função do tempo de exposição aos TTFields (horas). As TTFields diminuíram significativamente a atividade da luciferase de vagalume purificada em comparação à ausência de TTFields (p < 0,01, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields).

[055]A aplicação de TTFields ao longo do tempo sobre uma linha de células de glioblastoma derivada de outro paciente, GBM2/GFP-fLuc, também induziu a um aumento dependente do tempo na bioluminescência em células GBM2/GFP-fLuc expostas a TTFields em comparação a controles sem TTFields (p < 0,0001, ANOVA direcional, com TTFields vs. sem TTFields). Esse mesmo efeito foi observado em uma linha de células de astrocitoma murídea (KR158B), que foi geneticamente modificada para expressar a proteína de fusão a luciferase de Renilla-proteína fluorescente vermelha (p < 0,0001, ANOVA, com TTFields vs. sem TTFields). A atividade da luciferase de Renilla não depende do ATP nem do magnésio (à diferença da luciferase de vagalume). Sendo assim, acredita-se que a indução da bioluminescência por TTFields não deveu-se a alterações nos acervos endógenos de ATP. Efeito dos TTFields sobre a absorção de reagentes associáveis à membrana.

[056]Para testar se a imposição de TTFields afeta as propriedades da membrana celular, e portanto a permeabilidade da mesma, determinou-se o efeito dos TTFields sobre o comportamento de reagentes fluorescentemente marcados que ligam-se à membrana celular. Inicialmente, mediu-se o impacto dos TTFields sobre a ligação da Anexina-V-APC à membrana de células U87-MG/eGFP-fLuc. A ligação com a Anexina-V-APC é uma marca registrada da apoptose precoce, que é caracterizada pela ondulação da membrana. Um controle positivo para a apoptose (adição de 21 μM de Witaferina A a células U87-MG/eGFP-fLuc) foi usado para avaliar a visibilidade da ligação da Anexina-V-APC com células U87-MG/eGFP-fLuc e demonstrou que essa ligação poderia ser visualizada por microscopia de fluorescência em amostras não expostas a TTFields. No entanto, quando aplicaram- se TTFields a células U87-MG/eGFP-fLuc, não observou-se ligação com a Anexina- V-APC em nenhum momento da exposição a TTFields. Ao que tudo indica, portanto, os TTFields não induziram a nenhum grau significativo de apoptose nas células U87- MG.

[057]Notadamente, a absorção de etídio D aumentou significativamente quando as células U87-MG/eGFP-fLuc foram submetidas a TTFields de 200 kHz, conforme ilustra a FIG. ЗА (p < 0,0001, ANOVA direcional, com TTFields vs. sem TTFields). O etídio D atravessa tanto a membrana plasmática quanto a membrana nuclear e intercala-se no DNA genômico. Sendo assim, essas descobertas sugerem que os TTFields exercem efeito sobre a permeabilidade da membranas plasmática em células U87-MG/eGFP-fLuc.

[058]Outra consequência do aumento na permeabilidade da membrana pelos TTFields são as alterações na ligação com Dextrano-FITC na membrana celular. O Dextrano-FITC é conhecido por ligar-se e intercalar-se na membrana plasmática. Quando células U87-MG foram submetidas a 1 h de TTFields de 200 kHz, observou-se a significativa absorção de Dextrano-FITC com pesos moleculares de 4 kDa e 20 kDa, em comparação à ausência de exposição a TTFields, conforme ilustram as FIGs. 3B e 3C. Mas não observou-se diferença significativa na absorção para 50 kDa de Dextrano-FITC, conforme ilustra a FIG. 3D. Mais especificamente, a ligação com Dextrano-FITC foi examinada na presença de TTFields ao longo de um período de tempo de 0,5 a 24 h de exposição, observaram-se um aumento significativo na absorção de 4 kDa de Dextrano-FITC em comparação a amostras não expostas a TTFields (p < 0,0001, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields), um aumento significativo na absorção de 20 kDa de Dextrano-FITC sob exposição a TTFields (p < 0,01, com TTFields vs. sem TTFields) e nenhuma diferença significativa na absorção de 50 kDa de Dextrano-FITC sob exposição a TTFields (p= 0,26, não significativo, com TTFields vs. sem TTFields). Esses dados sugerem que o tamanho máximo do Dextrano-FITC que ligou-se à membrana plasmática e penetrou-a sob exposição a TTFields nesse experimento foi entre cerca de 20 e 50 kDa. Em todas as comparações estatísticas descritas nesse parágrafo, cada ponto de dados representa n = 3 experimentos. Nas FIGs 3A a 3D, APC = aloficocianina; Etídio D = brometo de etídio; e FITC = isotiocianato de fluoresceína. Efeito dos TTFields sobre a absorção do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA): cultura de U87-MG simples.

[059]Realizaram-se experimentos para determinar os efeitos dos TTFields sobre a absorção de 5-ALA (conforme medida pelo acúmulo de PpIX e sua fluorescência resultante) em células de glioblastoma. Como é difícil distinguir o limite entre células tumorais e células normais usando o bioensaio de 5-ALA atual, a medição da fluorescência da PpIX foi usada para tratar essa questão. Fizeram-se investigações para determinar se a permeação do 5-ALA através da membrana celular e às células de glioblastoma poderia ser aumentada com a exposição a TTFields. As células U87-MG foram expostas ou não a TTFields, cada uma por uma duração de 6 a 24 h. Os resultados, que são relacionados na FIG. 4A, foram os seguintes: A exposição a TTFields resultou em um aumento significativo na absorção do 5-ALA em células U87-MG/eGFP-fLuc com apenas 6 h de exposição a TTFields (p = 0,047, teste de Student, com TTFields vs. sem TTFields) e esse aumento se manteve com a exposição a TTFields prolongada de 24 h (p = 0,011).

[060]Para gerar os dados exibidos na FIG. 4A, painéis de fluorescência da protoporfirina IX (PpIX) foram obtidos para células U87-MG não expostas a TTFields vs. expostas a TTFields após 6 e 24 h de exposição. A quantificação dessas imagens exibiu um aumento significativo nos sinais de PpIX das células expostas a TTFields em comparação à ausência de TTFields, em ambos os pontos no tempo de 6 h (p = 0,047) e 24 h (p = 0,01). Todas as comparações estatísticas monovariantes entre amostras sem TTFields vs. com TTFields foram feitas pelo teste de Student para n = 3 experimentos por ponto no tempo. Efeito dos TTFields sobre a absorção do ácido 5-aminolevulínico: coculturas de GBM U87-MG em fibroblastos PCS-201.

[061]Durante a resseção de um glioblastoma nos pacientes, o 5-ALA é usado para ajudar os neurocirurgiões a delinear os tumores e o tecido cerebral normal circundante. Outrossim, para distinguir diferenças na absorção do 5-ALA entre as células de glioblastoma e as células normais, desenvolveu-se uma cocultura na qual células U87-MG foram semeadas no centro de um leito de fibroblastos PCS- 201 e submetidas ou não a TTFields. Fotomicrografias fluorescentes e brightfield confirmaram a presença das diferentes regiões de células de glioblastoma vs. células de fibroblastos no ambiente de cocultura. Quando as coculturas foram tingidas com hematoxilina e eosina (H&E), as fotomicrografias revelaram números reduzidos de células GBM infiltrando a periferia dos fibroblastos nas amostras expostas a TTFields.

[062]Em particular, sem a exposição a TTFields, as células GBM formaram muitos bolsos de neuroesferas aderentes, como previamente divulgado. As imagens de fluorescência exibiram aumento na fluorescência da PpIX em células de glioblastoma vs. células de fibroblastos nas plataformas cocultura que foram submetidas a TTFields durante 6 h. Os resultados, que são relacionados na FIG. 4B, foram os seguintes: A fluorescência da PpIX acumulou com o tempo mas a taxa de aumento da intensidade de fluorescência subiu significativamente (p < 0,001, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields) para coculturas expostas a TTFields em comparação a coculturas não expostas a TTFields. Para gerar os dados exibidos na FIG. 4B, obtiveram-se painéis fluorescentes da absorção de 5- ALA (e subsequentemente a fluorescência da PpIX, Ex = 558 nm, Em = 583 nm) para as amostras sem TTFields e com TTFields. A duração das exposições foi de 2, 6 e 24 h. Quantificação do curso de tempo de acúmulo da PpIX (e, portanto, acúmulo do fluxo fluorescente conforme expresso por fótons/s) na plataforma cocultura glioblastoma-fibroblasto em condições com exposição a TTFields vs. sem exposição a TTFields (p < 0,001). As análises estatísticas consistiram em ANOVA direcional para condições sem TTFields vs. com TTFields, e n = 3 experimentos por ponto no tempo.

[063]Em um conjunto distinto de experimentos, para 24 h de aplicação de TTFields, a razão de intensidade de fluorescência da PpIX nas células de glioblastoma U87-MG para as células de fibroblasto PCS-201 circundantes aumentou significativamente em comparação à razão de intensidade de fluorescência para células cocultivadas em condições sem TTFields (p = 0,043, ANOVA direcional, com TTFields vs. sem TTFields). A micrografia eletrônica de varredura (SEM) demonstra que os TTFields alteram a morfologia da membrana de células U87-MG/eGFP-fLuc.

[064]Imagens SEM de células U87-MG/eGFP-fLuc a baixa densidade (5.000 células/lamínula) que foram expostas ou não a TTFields durante 3 dias foram obtidas a amplificações de 2.000x, 20.000x e 60.000x. Os dados obtidos analisando essas imagens SEM são relacionados na FIG. 5. Houve um número significativamente maior de orifícios com dimensão superior a 51,8 nm2 (equivalentes a 9 pixels2 em uma amplificação de 60.000x) dentro do ROI de células expostas a TTFields (53,5 ± 19,1) em comparação às células não expostas a TTFields (23,9 ± 11,0), (p = 0,0002, testes de Mann-Whitney univariado). O tamanho médio dos orifícios dentro do ROI também foi significativamente maior nas células expostas a TTFields (240,6 ± 91,7 nm2) em comparação às células não expostas a TTFields (129,8 ± 31,9 nm2), (p = 0,0005 (teste de Mann-Whitney univariado)). Para obter os dados representados na FIG. 5, a quantificação e comparação, entre células não expostas e expostas a TTFields, do número e dimensão dos orifícios foram feitas dentro de uma região de interesse circular com raio de 500 nm. O corte de dimensão de orifício mínima baseou-se nos raios de Stokes de 3,3 e 5,0 nm de 20 kDa e 50 de kDa Dextrano-FITCs, respectivamente. Utilizaram-se lamínulas desses três experimentos para cada condição, e analisaram-se ao menos 5 células para cada lamínula quanto à contagem e dimensão dos orifícios, de maneira duplo- cego.

[065]Os efeitos de uma exposição de 24 h a TTFields sobre as membranas plasmáticas de células U87-MG semeadas a alta densidade também foram observados visualmente. No caso das amostras sem TTFields, a superfície celular pareceu coberta em extensões de membrana densamente emaranhadas, alongadas e achatadas, semelhantes a ondulações de membrana e contíguas à membrana celular. Em contrapartida, após 24 h de exposição a TTFields, as estruturas densamente emaranhadas e alongadas foram substituídas por estruturas tipo bolha curtas e bulbosas.

[066]Para fins de comparação, imagens SEM de células PCS-201 humanas normais também foram obtidas e analisadas. As células PCS-201 foram semeadas a baixa densidade (5.000 células por lamínula de vidro de 13 mm). As células foram cultivadas em condições de cultura de tecido padrão (37° C, 95% de O2, 5% de CO2). As células não expostas a TTFields foram mantidas nessas condições pela duração do estudo. As demais células foram expostas a TTFields por 72 h. Após 72 horas, as imagens SEM foram obtidas a amplificações de 2.000x, 20.000x e

60.000x. Quantificação e comparação, entre células expostas e não expostas a TTFields, do número e dimensão dos orifícios com área superior a 51,8 nm2 (equivalentes a um círculo com raio de 4 nm, ou 9 pixels2 nas imagens com 60.000x de amplificação) dentro de uma região de interesse circular com raio de 500 nm. O corte de dimensão de orifício mínima baseou-se nos raios de Stokes de 3,3 nm e 5,0 nm de 20 kDa e 50 de kDa Dextrano-FITCs, respectivamente. Os resultados, que são representados na FIG. 6, foram os seguintes: Não houve diferença significativa no número ou dimensão dos orifícios entre as células PCS-201 humanas normais expostas e não expostas a TTFields (análise rank-sum de Wilcoxon). Utilizaram-se lamínulas desses três experimentos para cada condição, e analisaram-se ao menos 5 células para cada lamínula quanto à contagem e dimensão dos orifícios, de maneira duplo-cego.

[067]Os efeitos de uma exposição de 24 h a TTFields sobre as membranas plasmáticas de células PCS-201 também foram observados visualmente. À diferença da situação descrita acima para as células U87-MG, os TTFields não pareceram alterar a morfologia de membrana das células PCS-201. Efeito dos TTFields sobre a permeabilidade das membranas é reservível.

[068]Para avaliar a reversibilidade do efeito dos TTFields sobre células cancerosas, células U87-MG/eGFP-fLuc foram submetidas a três condições: (1) Sem exposição a TTFields, condições de cultura celular padrão (37° C, 95% de O2, 5% de CO2), (2) Exposição a TTFields por 24 h e (3) Exposição a TTFields por 24 h, seguida por ausência de exposição a TTFields por 24 h. As leituras de BLI, fluorescência da PpIX (produto do 5-ALA) e fluorescência do Dextrano-FITC (4 kDa) foram obtidas. Todas as condições experimentais foram realizadas em triplicata. A FIG. 7A traz os dados para BLI: A presença de TTFields por 24 h (barra central) aumentou significativamente o fluxo de BLI em comparação à ausência de exposição a TTFields (barra esquerda) (p < 0,0005, ANOVA bidirecional, com TTFields vs. sem TTFields), mas esse aumento foi significativamente atenuado quando as células foram reintroduzidas à condição sem TTFields por 24 h (barra direita) (ANOVA bidirecional, p < 0,005, TTFields por 24 h vs. TTFields por 24 h seguidos por ausência de TTFields por 24 h). A FIG. 7B ilustra que um padrão similar de leituras reversíveis ocorreu com a fluorescência da PpIX (p < 0,0005, ANOVA bidirecional, TTFields (barra central) vs. sem TTFields (barra esquerda) e p < 0,0004, TTFields vs. TTFields seguidos por ausência de TTFields (barra direita)). E a FIG. 1С ilustra que um padrão similar de leituras reversíveis ocorreu para a fluorescência de 4 kDa de Dextrano-FITC (p < 0,05, ANOVA direcional, TTFields (barra central) vs. sem TTFields (barra esquerda); e p < 0,05, TTFields vs. TTFields seguidos por ausência de TTFields (barra direita)). Para cada conjunto experimental, a fluorescência da eGFP não mudou significativamente. As investigações por SEM também revelaram que o aumento significativo tanto no número de orifícios (p = 0,007, ANOVA bidirecional, TTFields vs. sem TTFields) quanto na dimensão dos orifícios (p = 0,0007, ANOVA bidirecional, TTFields vs. Sem TTFields) pelos TTFields também foi reversível, após 24 h sem exposição. Aqui, NS = não significativo; BLI = imagiologia bioluminescente; eGFP = proteína fluorescente verde intensificada; fLuc = luciferase de vagalume; 5-ALA = ácido 5-aminolevulínico; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PpIX = protoporfirina IX; e FL = fluorescência.

[069]Em suma, a absorção dos compostos relevantes aumentou quando aplicaram-se campos elétricos alternados (em comparação a quando não aplicaram- se campos elétricos alternados). Cada uma dessas figuras também demonstra que a absorção diminuiu substancialmente depois de interromper os campos elétricos alternados por 24 horas. Com base nisso, pode-se deduzir que o aumento na permeabilidade das membranas celulares que foi induzido pelos campos elétricos alternados não é um efeito permanente e que a permeabilidade volta a cair após a interrupção dos campos elétricos alternados.

[070]A FIG. 7D traz os resultados de um experimento para testar a rapidez com que a permeabilidade volta a cair após a interrupção dos campos elétricos alternados. Especificamente, a 7-aminoactinomicina D (7-AAD) é um composto químico fluorescente com forte afinidade pelo DNA. A 7-AAD é uma molécula relativamente grande (1270,43 g/mol, isto é, 1,27 kDa) que, em circunstâncias normais, não atravessa prontamente membranas celulares intactas. A FIG. 7D ilustra as características temporais da permeabilidade à 7-AAD que é induzida pela aplicação de TTFields para células U87-MG. Nesse experimento, as células foram tratadas com um campo elétrico alternado a 300 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas, a uma temperatura ambiente de 18° C. A 7-AAD foi introduzida nas amostras em quatro momentos diferentes: 15 minutos antes da interrupção do campo elétrico alternado; imediatamente após a interrupção do campo elétrico alternado; e 15, 30 e 60 minutos após a interrupção do campo elétrico alternado. Em cada caso, as células foram incubadas com 7-AAD durante 30 minutos após a introdução da 7- AAD, seguidos por análise por citometria de fluxo da porcentagem de células com aumento no acúmulo de 7-AAD fluorescente para cada um dos diferentes momentos. Como se vê na FIG. 7D, observou-se um aumento significativo no acúmulo de 7-AAD somente na amostra que foi incubada com 7-AAD enquanto submetida a um campo elétrico alternado. Resultados adicionais para diferentes fármacos e diferentes tipos de células cancerosas.

[071]Os métodos descritos neste documento não se limitam ao contexto do glioblastoma. Muito pelo contrário, eles aplicam-se a outros tipos de células cancerosas. Mais especificamente, uma substância pode ser distribuída através da membrana celular de uma célula ao (a) aplicar um campo elétrico alternado à célula durante um período de tempo, sendo que a aplicação do campo elétrico alternado aumenta a permeabilidade da membrana celular; e (b) introduzir a substância nos arredores da célula. A maior permeabilidade da membrana celular permite que a substância atravesse a membrana celular. Notadamente, os métodos descritos neste documento podem ser usados para distribuir moléculas grandes (que, em circunstâncias normais, não atravessariam a membrana celular relevante) através da membrana celular de diferentes tipos de células (isto é, células que não de glioblastoma), incluindo, entre outros, outros tipos de células cancerosas (por exemplo, células MDA-MB-435 e MCF-7).

[072]A FIG. 8A traz os resultados de um experimento realizado para determinar como os campos elétricos alternados afetam a permeabilidade das membranas celulares de células da linha celular do melanoma humano MDA-MB-

435. Nesse experimento, células MDA-MB-435 foram tratadas com um campo elétrico alternado a 150 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a uma temperatura ambiente de 18° C e uma temperatura do prato de 37° C. (A temperatura do prato neste e em outros experimentos é superior à temperatura ambiente em razão do aquecimento causado pelos campos elétricos alternados.) Depois das primeiras 23,75 horas, adicionou-se 7-AAD à cultura e incubou-se durante 15 minutos, durante os quais mantiveram-se os campos elétricos alternados (para concluir o período de 24 horas). Depois desse período de tempo de 15 minutos, encerrou-se a aplicação do campo elétrico alternado, e as células foram incubadas em temperatura ambiente por mais 15 minutos. A porcentagem de células com aumento no acúmulo de 7-AAD fluorescente foi determinada por análise por citometria de fluxo. Cerca de 66% das células exibiram aumento no acúmulo de 7- AAD (barra 2 na FIG. 8A) em comparação a menos de 5% das células no controle (barra 1), que foi submetido às mesmas condições, salvo que não aplicaram-se os campos elétricos alternados. Esses resultados indicam que os campos elétricos alternados provocam um aumento muito significativo na permeabilidade das membranas celulares.

[073]Em uma variação desse experimento, células da linha celular do melanoma humano MDA-MB-435 foram tratadas com um campo elétrico alternado a 150 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a uma temperatura ambiente de 18° C e uma temperatura do prato de 37° C. Depois desse período de 24 horas, os campos elétricos alternados foram desligados por 15 minutos, após os quais adicionou-se 7-AAD. Depois de aguardar por mais 15 minutos, a porcentagem de células com aumento no acúmulo de 7-AAD fluorescente foi determinada por análise por citometria de fluxo. Dessa vez, só cerca de 20% das células exibiram aumento no acúmulo de 7-AAD (barra 3 na FIG. 8A). Esses resultados indicam que o aumento na permeabilidade das membranas celulares que é induzido pelos campos elétricos alternados é relativamente efêmero e que a permeabilidade cai rápida e drasticamente após a interrupção dos campos elétricos alternados.

[074]A FIG. 8B traz os resultados de outro experimento realizado para determinar como os campos elétricos alternados afetam a permeabilidade das membranas celulares de células da linha celular do melanoma humano MDA-MB- 435 à doxorrubicina (543,52 g/mol). Nesse experimento, tanto variantes do tipo selvagem quanto variantes resistente à doxorrubicina de células MDA-MB-435 foram tratadas com um campo elétrico alternado a 150 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Depois desse período de 23 horas, adicionou-se doxorrubicina a uma concentração de 10 μM e incubou-se por uma hora, durante a qual mantiveram-se os campos elétricos alternados. Em seguida, mediu-se o acúmulo intracelular de doxorrubicina. O acúmulo intracelular de doxorrubicina aumentou tanto para as células do tipo selvagem (comparar a barra 1 à barra 3) quanto para as células resistentes à doxorrubicina (comparar a barra 2 à barra 4).

[075]A FIG. 8C traz os resultados de um experimento similar usando células da linha celular do adenocarcinoma de mama humano MCF-7 e mitoxantrona (444,481 g/mol). Nesse experimento, tanto variantes do tipo selvagem quanto variantes resistente à mitoxantrona de células MCF-7 foram tratadas com um campo elétrico alternado a 150 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Depois desse período de 23 horas, adicionou-se mitoxantrona a uma concentração de 2 μM e incubou-se por uma hora, durante a qual mantiveram-se os campos elétricos alternados. Em seguida, mediu-se o acúmulo intracelular de mitoxantrona. O acúmulo intracelular de mitoxantrona aumentou tanto para as células do tipo selvagem (comparar a barra 1 à barra 3) quanto para as células resistentes à mitoxantrona (comparar a barra 2 à barra 4).

[076]Os resultados descritos acima com referência às FIGs. 8B e 8C indicam que os campos elétricos alternados melhoram o acúmulo intracelular das moléculas de quimioterapia tanto em células do tipo selvagem quanto em células resistentes a fármaco, e que os campos elétricos alternados podem restaurar vantajosamente o acúmulo intracelular de agentes químicos quimioterápicos em células cancerosas após essas células terem desenvolvido resistência multifármaco a esses agentes químicos.

[077]Realizaram-se experimentos adicionais para determinar se há sinergia entre os TTFields e vários fármacos para várias linhas celulares cancerosas, e as FIGs. 9A a 9G trazem o resultado de alguns desses experimentos. Mais especificamente, a FIG. 9A ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células U87-MG/GFP-Luc a várias concentrações de Lomustina (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). A FIG. 9B ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células pcGBM2/GFP- Luc a várias concentrações de Lomustina (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). A FIG. 9C ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células GBM39 a várias concentrações de Lomustina (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). A FIG. 9D ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células GBM39 a várias concentrações de Temozolomida (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). A FIG. 9E ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células GBM39/Luc a várias concentrações de Irinotecano (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). A FIG. 9F ilustra como aplicar TTFields por 3 dias melhora a sensibilidade de células MDA-MB-235 a várias concentrações de Doxorrubicina (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields). E a FIG. 9A ilustra como aplicar TTFields por 4 dias melhora a sensibilidade de células U87-MG/eGFP-Luc a várias concentrações de Manose (em comparação a um controle ao qual não aplicaram-se TTFields).

[078]Até agora, foram demonstradas a sinergia da combinação de TTFields mais Witaferina A para a GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc e pcGBM2/GFP-Luc; a sinergia da combinação de TTFields mais Lomustina para a GBM39/Luc, U87- MG/GFP-Luc e pcGBM2/GFP-Luc; a sinergia da combinação de TTFields mais Irinotecano para a GBM39/Luc; e a sinergia da combinação de TTFields mais Manose para a U87-MG/GFP-Luc. Também encontrou-se evidências de sinergia para a combinação de TTFields mais Doxorrubicina para a MDA-MB-235.

DISCUSSÃO

[079]Os estudos anteriores concentraram-se nos efeitos dos TTFields sobre o núcleo (por exemplo, microtúbulos), a septina, as mitocôndrias e a autofagia. Porém, acredita-se que os experimentos descritos neste documento sejam os primeiros a divulgar os efeitos dos TTFields sobre a integridade da membrana de células cancerosas e a demonstrar o aumento na permeabilidade da membrana celular de células cancerosas (por exemplo, de várias linhas de células GBM humanas) na presença de TTFields usando várias técnicas de avaliação (por exemplo, imagiologia de bioluminescência, imagiologia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura).

[080]Observações revelaram aumento na permeabilidade da membrana celular para glioblastomas na presença de TTFields em várias linhas de células GBM humanas. As abordagens empregadas para confirmar a hipótese incluíram imagiologia de bioluminescência, imagiologia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura. Observações também revelaram aumento na permeabilidade da membrana celular para outros tipos de células cancerosas na presença de TTFields. Os estudos de TTFields em combinação a quimioterapias demonstraram tanto a aditividade quanto a sinergia terapêuticas. Para esses estudos, postula-se que os TTFields medeiam a acessibilidade aprimorada a células cancerosas. Vários experimentos exibiram a reversibilidade do efeito dos TTFields sobre as membranas, demonstrando assim uma relação causal entre os TTFields e o aumento na permeabilidade das membranas. Essas observações também sugerem que os TTFields poderiam ser usados para refinar a acessibilidade do fármaco às células cancerosas.

[081]A investigação da hipótese da permeabilidade celular por ação dos TTFields foi iniciada em parte devido às observações de aumento na bioluminescência em células GBM expressando a luciferase por TTFields. Embora sem limitação a esta teoria, acredita-se que os TTFields induziram à maior permeabilidade nas membranas celulares de células GBM. Acredita-se que o aumento na permeabilidade das células GBM à D-luciferina, conforme medido pela BLI, não deveu-se aos efeitos dos TTFields sobre a própria luciferase mas, em vez disso, ao aumento no influxo de seu substrato D-luciferina nas células trabalhadas para expressar a luciferase de vagalume. Além disso, essa descoberta confirmou-se tanto para a luciferase dependente do ATP (FLuc) quanto para a luciferase independente do ATP (RLuc). Logo, apesar de um relatório preliminar sugerir que o ATP intracelular aumentou em células de carcinoma colorretal CT26 expostas a TTFields, a observação do aumento na permeabilidade da membrana de células de glioblastoma no cenário de exposição a TTFields sugere um fenômeno independente. O aumento na expressão ou ativação da luciferase devido à exposição a TTFields não poderia explicar o aumento no sinal de BLI porque, nessa células, a enzima luciferase foi controlada pelo mesmo promotor que a eGFP, e um aumento no sinal de fluorescência não foi observado nessas células. No entanto, a exposição a TTFields pode afetar o metabolismo celular, que seria manifesto por mudanças nos níveis de ATP, alterações na morfologia da membrana e alterações no consumo de oxigênio.

[082]Algumas descobertas chave que sustentam a hipótese da permeabilidade vieram dos experimentos de validação com Dextrano-FITC descritos acima com referência às FIGs. 3B a 3D. A acessibilidade da membrana celular a pequenas sondas no cenário dos TTFields foi testada com dextranos marcados com

FITC, o que resultou em aumento no influxo de 4 kDa (raio de Stokes de ~1,4 nm) e 20 kDa (raio de Stokes de ~3,3 nm) mas não de 50 kDa de dextranos (raio de Stokes de ~5 nm). Isso sugere que os TTFields fazem com que as células GBM tornem-se mais permeáveis a substâncias com até mesmo 20 kDa, mas não mais que 50 kDa. Para fins de referência, os substratos de luciferina e coelenterazina são de peso molecular baixo o bastante para que sejam acessíveis através da membrana com a exposição a TTFields. A D-luciferina (substrato para a luciferase de vagalume) possui um peso molecular de 280,3 g/mol (~280 Da), a coelenterazina H (substrato para a luciferase de Renilla) possui um peso molecular de 407,5 g/mol (~408 Da) e o 5-ALA possui um peso molecular de 167,6 g/mol (169 Da), em consonância com as descobertas com o Dextrano-FITC.

[083]As descobertas por SEM descritas neste documento revelam que, a baixa densidade de semeadura, 3 dias de exposição a TTFields provocaram um aumento significativo no número e dimensão dos orifícios acima de 51,8 nm2 em área, em comparação à condição sem TTFields, conforme descrito acima com referência à FIG. 5. Esse corte de dimensão dos orifícios representa um círculo com raio de 4,1 nm, que é o raio de Stokes de uma molécula de FITC-dextrano com tamanho de 20 a 40 kDa. Sendo assim, a diferença no rompimento da membrana celular visualizado por SEM confirma as observações indiretas dos estudos com FITC-dextrano descritos neste documento.

[084]Interessantemente, a exposição de fibroblastos humanos normais (PCS-201) a TTFields não provocou nenhum aumento significativo no número ou dimensão dos orifícios da membrana celular, sugerindo assim que o efeito de permeabilidade pode ter alguma especificidade às células cancerosas. Quantitativamente, no que diz respeito às células U87-MG, houve um claro princípio de estruturas tipo bolha bulbosas devido à exposição por 24 h a TTFields sob alta densidade de semeadura. A aparência dessas estruturas é consistente com o aumento de permeabilidade na membrana externa e com a indução da apoptose, e parece haver pouca evidência de um fenótipo apoptótico com uma exposição a TTFields por 24 h. Além disso, as células PCS-201 de alta densidade não exibiram tais mudanças com a exposição a TTFields (dados não ilustrados), sugerindo assim novamente a especificidade do efeito dos TTFields às células cancerosas.

[085]Embora o ciclo celular não tenha sido sincronizado para os experimentos, o tempo de dobradura das células U87-MG é de ~48 h, e, dado que os TTFields exercem seu efeito antiproliferativo maximal sobre células dividindo-se, isso poderia explicar a falta de apoptose em abundância observada após uma exposição a TTFields por 24 h. Uma interpretação alternativa pode estar nos relatos de que a formação de bolhas celulares pode conferir resistência à lise celular. Um relato prévio sobre as células de glioblastoma não sincronizadas demonstrou que 72 h de exposição a TTFields induziram à morte celular com uma proporção marcante de células Anexina V-positivas. Fazendo uso de microscopia eletrônica de transmissão, esses relatos descreveram sinais de autofagia, incluindo autofagossomas, mitocôndrias inchadas e um retículo endoplasmático dilatado. Em contrapartida, os resultados neste documento usam a SEM para melhor visualizar os efeitos dos TTFields especificamente sobre a membrana celular plasmática.

[086]O aumento na permeabilidade da membrana pelos TTFields tem implicações clínicas significativas. Usando a plataforma cocultura de células GBM humanas dispostas em camada no topo de células de fibroblasto humanas normais, estudou-se o impacto dos TTFields sobre a absorção do ácido 5-aminolevulínico (5- ALA) nas células GBM. A exposição a TTFields resultou em um aumento significativo na absorção do 5-ALA nas células GBM em comparação às células de fibroblasto. Em junho de 2017, o 5-ALA foi aprovado pela Food and Drug Administration para uso clínico nos Estados Unidos para ajudar os neurocirurgiões a delinear o limite tumor-cérebro normal durante a resseção do glioma. Pré-tratar os pacientes com glioma com TTFields antes da administração do 5-ALA, portanto, será útil para intensificar a delineação do limite tumoral infiltrante durante a resseção do tumor.

[087]No que diz respeito a detectar e medir os efeitos dos TTFields sobre células cancerosas, a maioria dos estudos baseados em cultura celular até hoje concentrou-se na contagem/viabilidade como a leitura primária. Isso baseia-se no entendimento predominante de que os TTFields interfeririam na mitose de células tumorais dividindo-se rapidamente, o que resultaria na morte das células cancerosas. Além disso, estudos de modelagem computacional dos TTFields em culturas celulares são atualmente orientados pela contagem celular como o resultado primário do modelo.

[088]A recorrência do GBM é inevitável e o tempo mediano até a primeira recorrência, apesar da terapia padrão, é de aproximadamente 7 meses. Nas aplicações clínicas de TTFields a pacientes com GBM, os dados sugerem que a maior complacência e duração do uso de TTFields está correlacionada a uma maior sobrevivência. A complacência dos TTFields (≥75% vs. <75%) foi um preditor independente da sobrevivência geral na análise retrospectiva do conjunto de dados de ensaio EF-14 completo e a duração do uso dos TTFields também provou afetar a sobrevivência geral. Juntos, esses dados podem servir como correlatos clínicos dos efeitos observados no cenário experimental de TTFields com base em culturas celulares. A saber, observou-se uma correlação entre o tempo de exposição a TTFields e a duração de seu efeito sobre a permeabilidade da membrana celular após a interrupção dos TTFields. A tempos de exposição a TTFields de 0,5 a 3 h, a duração no aumento da BLI (em comparação a condições sem TTFields) durou cerca de 5 min. No entanto, a exposições a TTFields de 12 a 25 h, essa diferença na BLI entre as condições com TTFields e sem TTFields durou mais de 20 min. Outrossim, uma nova análise dos dados divulgados por Ram et al. demonstra que a porcentagem de aumento na sobrevivência geral (em pacientes tratados com TTFields mais temozolomida vs. só temozolomida) saltou de 32% após 1 ano de exposição a TTFields para 551% após 5 anos de exposição a TTFields, respectivamente.

[089]Os resultados descritos neste documento, isto é, de que os campos elétricos alternados aumentam a permeabilidade da membrana celular, são distintos dos efeitos previamente divulgados dos TTFields. Isso terá impacto significativo sobre as práticas cirúrgicas e clínicas atuais no tratamento contra glioblastomas, bem como contra outros tipos de câncer.

[090]Nos experimentos in vitro descritos acima, a frequência dos campos elétricos alternados foi de 200 kHz. No entanto, em modalidades alternativas, a frequência dos campos elétricos alternados poderia ser outra, por exemplo, de cerca de 200 kHz, entre 50 e 500 kHz, entre 25 kHz e 1 MHz, entre 50 e 190 kHz, entre 25 e 190 kHz, ou entre 210 e 400 kHz.

[091]Nos experimentos in vitro descritos acima, a intensidade de campo dos campos elétricos alternados foi de entre 1 e 4 V/cm RMS. No entanto, em modalidades alternativas, intensidades de campo diferentes podem ser usadas (por exemplo, entre 0,1 e 10 V/cm).

[092]Nos experimentos in vitro descritos acima, os campos elétricos alternados foram aplicados durante uma variedade de intervalos diferentes que variaram de 0,5 hora a 72 horas. No entanto, em modalidades alternativas, uma duração diferente pode ser usada (por exemplo, entre 0,5 hora e 14 dias). Em algumas modalidades, a aplicação dos campos elétricos alternados pode ser repetida periodicamente. Por exemplo, os campos elétricos alternados podem ser aplicados todos os dias por uma duração de duas horas.

[093]Nos experimentos in vitro usando o sistema Inovitro™ descrito neste documento, a direção dos campos elétricos alternados foi cambiada em intervalos de um segundo entre duas direções perpendiculares. Todavia, em modalidades alternativas, a direção dos campos elétricos alternados pode ser cambiada a uma velocidade mais rápida (por exemplo, em intervalos entre 1 e 1.000 ms) ou a uma velocidade mais lenta (por exemplo, em intervalos entre 1 e 100 segundos).

[094]Nos experimentos in vitro usando o sistema Inovitro™ descrito neste documento, a direção dos campos elétricos alternados foi cambiada entre duas direções perpendiculares aplicando-se uma tensão elétrica de CA a dois pares de elétrodos dispostos a 90° um do outro no espaço 2D em uma sequência alternada. No entanto, em modalidades alternativas, a direção dos campos elétricos alternados pode ser cambiada entre duas direções que não são perpendiculares reposicionando os pares de elétrodos, ou entre três ou mais direções (pressupondo- se que pares adicionais de elétrodos sejam incluídos). Por exemplo, a direção dos campos elétricos alternados pode ser cambiada entre três direções, cada uma das quais é determinada pelo posicionamento de seu próprio par de elétrodos. Como opção, esses três pares de elétrodos podem ser posicionados de tal modo que os campos resultantes sejam dispostos a 90° uns dos outros no espaço 3D. Em outras modalidades alternativas, os elétrodos não precisam ser dispostos em pares. Vide, por exemplo, o posicionamento de elétrodos descrito na patente dos EUA 7.565.205, que incorpora-se ao presente documento por referência. Em outras modalidades alternativas, a direção do campo permanece constante.

[095]Nos experimentos in vitro usando o sistema Inovitro™ descrito neste documento, o campo elétrico foi capacitivamente acoplado à cultura porque o sistema Inovitro™ utiliza elétrodos condutores dispostos na superfície externa das paredes laterais do prato, e o material cerâmico das paredes laterais atua como um dielétrico. No entanto, em modalidades alternativas, o campo elétrico poderia ser aplicado diretamente às células sem acoplamento capacitivo (por exemplo, modificando-se a configuração do sistema Inovitro™ para que os elétrodos condutores sejam dispostos na superfície interna da parede lateral em vez de na superfície externa da parede lateral).

[096]Os métodos descritos neste documento também podem aplicar-se ao contexto in vivo aplicando-se os campos elétricos alternados a uma região alvo do corpo de um paciente vivo, tanto para células de glioblastoma quanto para outros tipos de células cancerosas. Impor o campo elétrico à região alvo aumentará a permeabilidade das membranas celulares à região alvo, o que permitirá que as moléculas que, em circunstâncias normais, têm sua passagem através da membrana celular bloqueada ou dificultada possam atravessá-la. Isso pode ser consumado, por exemplo, posicionando elétrodos sobre ou sob a pele do paciente para que a aplicação de uma tensão elétrica de CA entre subconjuntos selecionados desses elétrodos imponha campos elétricos alternados à região alvo do corpo do paciente.

[097]Por exemplo, em situações nas quais as células relevantes localizam- se nos pulmões do paciente, um par de elétrodos poderia ser posicionado na frente e atrás do tórax do paciente, e um segundo par de elétrodos poderia ser posicionado nos lados direito e esquerdo do tórax do paciente. Em algumas modalidades, os elétrodos são acoplados capacitivamente ao corpo do paciente (por exemplo, usando elétrodos que incluem uma placa condutora e também uma camada dielétrica disposta entre a placa condutora e o corpo do paciente). No entanto, em modalidades alternativas, a camada dielétrica pode ser omitida, caso esse em que as placas condutoras fariam contato direto com o corpo do paciente. Em outra modalidade, os elétrodos poderiam ser inseridos subcutaneamente abaixo da pele do paciente. Um gerador de tensão elétrica de CA aplica tensão elétrica de CA a uma frequência selecionada (por exemplo, entre 100 e 200 kHz) entre os elétrodos direito e esquerdo por um primeiro período de tempo (por exemplo, de 1 segundo), o que induz campos elétricos alternados onde os componentes mais significativos das linhas de campo são paralelos ao eixo transversal do corpo do paciente. Em seguida, o gerador de tensão elétrica de CA aplica tensão elétrica de CA à mesma frequência (ou a uma frequência diferente) entre os elétrodos na frente e atrás por um segundo período de tempo (por exemplo, de 1 segundo), o que induz campos elétricos alternados onde os componentes mais significativos das linhas de campo são paralelos ao eixo sagital do corpo do paciente. Essa sequência de duas etapas é então repetida pela duração do tratamento. Como opção, sensores térmicos podem ser incluídos nos elétrodos, e o gerador de tensão elétrica de CA pode ser configurado para diminuir a amplitude das tensões elétricas de CA que são aplicadas aos elétrodos se a temperatura detectada nos mesmos ficar muito alta. Em algumas modalidades, um ou mais pares extra de elétrodos podem ser adicionados e incluídos na sequência. Em modalidades alternativas, utiliza-se só um par de elétrodos, caso esse em que a direção das linhas de campo não é cambiada. Note- se que qualquer um dos parâmetros dessa modalidade in vivo (por exemplo, frequência, intensidade de campo, duração, taxa de câmbio de direção, e posicionamento dos elétrodos) pode ser variado conforme descrito com referência às modalidades in vitro. No entanto, deve-se tomar cuidado no contexto in vivo para garantir que o campo elétrico permaneça seguro para o paciente o tempo todo.

[098]Uma ampla variedade de aplicações para aumentar a permeabilidade de membranas celulares pode ser prontamente contemplada no contexto in vivo. Em um exemplo, o aprimoramento localizado da absorção do fármaco por células tumorais pode ser induzido aplicando-se campos elétricos alternados à parte do corpo relevante por um período de tempo (por exemplo, de 12 ou 24 horas) antes e durante a transmissão de quimioterapias ou de outros agentes antineoplásicos. Em outro exemplo, a absorção por células tumorais multirresistentes a fármacos pode ser restaurada aplicando-se campos elétricos alternados à parte do corpo relevante por um período de tempo (por exemplo, de 12 a 24 horas) antes e durante a administração de quimioterapias ou de outros agentes antineoplásicos. Em outro exemplo, o desenvolvimento de metastases multirresistentes a fármacos pode ser prevenido aplicando-se campos elétricos alternados a regiões propensas a metastases por um período de tempo (por exemplo, de 12 ou 24 horas) antes e durante a administração de um fármaco apropriado (independentemente de se o paciente tem um tumor primário que está em tratamento com campos elétricos alternados).

[099]A FIG. 10A representa uma primeira relação adequada na temporização entre a aplicação do campo elétrico alternado e a introdução da substância nos arredores da célula cancerosa no contexto in vitro; ou entre a aplicação do campo elétrico alternado e a administração da substância a um paciente vivo. Com base nos dados descritos acima com referência às FIGs. 7A a 7D e 8A, e supondo que a substância seja introduzida ou administrada em dado momento t = 0, o campo elétrico alternado pode ter início após o dado momento e continuar por um intervalo de tempo (por exemplo, de 12 horas) enquanto a substância permanecer disponível nos arredores da célula. Nessa situação, a permeabilidade começará a aumentar após o campo elétrico alternado ter início, e esse aumento na permeabilidade permitirá que a substância penetre as células relevantes. No contexto da quimioterapia, isso corresponderia a administrar um agente quimioterápico a um paciente, seguido pela aplicação dos campos elétricos alternados por um intervalo de tempo (por exemplo, de 12 horas).

[0100]Como alternativa, conforme ilustra a FIG. 10B, o campo elétrico alternado pode ter início antes do dado momento (por exemplo, 1 hora antes de t = 0) e continuar por um intervalo de tempo (por exemplo, até 12 horas após t = 0) enquanto a substância permanecer disponível nos arredores da célula. Nessa situação, a permeabilidade das células relevantes começará a aumentar antes de a substância chegar aos arredores da célula (ou antes de a substância ser administrada a um paciente vivo). Isso permitirá que a substância cruze a membrana celular imediatamente quando de sua chegada aos arredores da célula. No contexto da quimioterapia, isso corresponderia a dar início à aplicação dos campos elétricos alternados, seguida pela administração do agente quimioterápico enquanto os campos elétricos alternados continuam sendo aplicados, seguida pela aplicação contínua dos campos elétricos alternados por um intervalo de tempo extra (por exemplo, até 12 horas após o momento quando o agente quimioterápico foi administrado).

[0101]Note-se que os intervalos de tempo discutidos acima com referência às FIGs. 10A e 10B pode ser ou ininterrupto ou incluir pausas, de preferência curtas. Por exemplo, supondo que o intervalo de tempo seja de 12 horas, este poderia ser satisfeito por um único bloco ininterrupto de 12 horas. Como alternativa, o intervalo de 12 horas poderia ser satisfeito aplicando-se os campos elétricos alternados durante 6 horas, seguidas por uma pausa de 1 hora, seguida pela aplicação dos campos elétricos alternados por mais 6 horas (enquanto a substância permanecer disponível nos arredores da célula). Note-se também que, no contexto das FIGs. 10A e 10B, quando a substância é administrada a um paciente vivo, sua administração pode ser realizada usando qualquer uma de uma variedade de abordagens, inclusive, entre outras, por via subcutânea, por via intratecal, por via intraventricular e por via intraperitoneal.

[0102]As características de frequência, intensidade de campo e câmbio ideais podem ser determinadas experimentalmente para cada combinação de dado tipo de célula hospedeira e dado tipo de substância que será distribuída através da membrana celular. Em algumas modalidades preferidas, a frequência é inferior a 190 kHz (por exemplo, entre 50 e 190 kHz ou entre 25 e 190 kHz). Em outras modalidades preferidas, a frequência é de entre 210 e 400 kHz.

[0103]Uma abordagem existente para tratar tumores (por exemplo, um glioblastoma) se dá aplicando campos elétricos alternados a frequências entre 50 e 500 kHz, de preferência entre 100 e 300 kHz, ao tumor. No caso de um glioblastoma, 200 kHz é a frequência mais preferida. Os campos elétricos alternados nessas frequências são chamados de TTFields e são descritos nas patentes dos EUA 6.868.289 e 7.565.205, cada uma das quais incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra. Em suma, esses dois pedidos descrevem o transtorno à divisão celular durante a mitose. A eficácia dos TTFields é intensificada quando a direção do campo elétrico é periodicamente cambiada, quando a intensidade do campo em ao menos uma porção do tumor é de ao menos 1 V/cm e quando os campos são aplicados por períodos de tempo prolongados (por exemplo, de semanas ou meses) com o mínimo de pausas possível.

[0104]Podem ocorrer situações em que é desejável tratar o tumor com TTFields e também distribuir uma substância através das membranas celulares das células tumorais (por exemplo, para ajudar a fazer com que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco quimioterápico atravesse as membranas celulares para prover uma linha de ataque extra contra o tumor). Em algumas situações, é possível usar uma única frequência de um campo elétrico alternado tanto para tratar o tumor quanto para aumentar a permeabilidade das membranas celulares. Em outras situações, é desejável usar campos elétricos alternados com frequências diferentes: uma primeira frequência que é selecionada para prover resultados aprimorados para aumentar a permeabilidade das membranas celulares, e uma segunda frequência que é selecionada para prover resultados aprimorados para a ação antitumor dos TTFields.

[0105]As FIGs. 11A e 11B trazem os resultados de dois experimentos in vitro em células de glioblastoma U-87 MG. Mais especificamente, a FIG. 11A traz os resultados de um primeiro experimento para determinar a frequência que provém o nível mais alto de citotoxicidade a células U-87 MG; e a FIG. 11B traz os resultados de um segundo experimento para determinar a frequência que provém o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares das células U-87 MG.

[0106]No primeiro experimento, as células U-87 MG foram submetidas a campos elétricos alternados com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm RMS a diferentes frequências por um período de 72 horas e a uma temperatura ambiente de 18° C. Depois desse período de 72 horas, o número de células que fizeram-se presentes na amostra para cada uma das diferentes frequências foi medido por citometria de fluxo. Como se vê na FIG. 11A, o número mais baixo de células (que indica o nível mais alto de citotoxicidade) foi observado para a amostra que foi submetida a campos elétricos alternados a 200 kHz.

[0107]No segundo experimento, mediu-se a permeabilidade à 7-AAD (um agente químico fluorescente com peso molecular de 1.270,43 g/mol que, em circunstâncias normais, não atravessa prontamente membranas celulares intactas). Nesse experimento, as células foram tratadas com um campo elétrico alternado a diferentes frequências com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm RMS por um total de 24 horas, a uma temperatura ambiente de 18° C e uma temperatura do prato de 37° C. Depois das primeiras 23,75 horas, adicionou-se 7-AAD à cultura e incubou-se durante 15 minutos, durante os quais mantiveram-se os campos elétricos alternados (para concluir o período de 24 horas). Depois desse período de 15 minutos, encerrou-se a aplicação do campo elétrico alternado, e as células foram incubadas a temperatura ambiente por mais 15 minutos, seguidos por análise por citometria de fluxo da porcentagem de células com aumento no acúmulo de 7-AAD fluorescente para cada uma das diferentes frequências. Como se vê na FIG. 11B, a porcentagem mais alta de células com aumento no acúmulo de 7-AAD (que indica o nível mais alto de permeabilidade) foi observada para a amostra que foi submetida a um campo elétrico alternado a 300 kHz.

[0108]As FIGs. 12A e 12B trazem os resultados de dois experimentos in vitro semelhantes aos descritos acima com referência às FIGs. 11A/B, salvo que utilizaram-se células de sarcoma uterino MES-SA. Mais especificamente, a FIG. 12A traz os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o mais alto nível de citotoxicidade a células MES-SA. O número mais baixo de células MES-SA (que indica o nível mais alto de citotoxicidade) foi observado para a amostra que foi submetida a campos elétricos alternados a 100 kHz. A FIG. 12B traz os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células MES-SA. A porcentagem mais alta de células MES-SA com aumento no acúmulo de 7-AAD (que indica o nível mais alto de permeabilidade) foi observada para a amostra que foi submetida a um campo elétrico alternado a 150 kHz.

[0109]A FIG. 12C traz os resultados de outro experimento realizado para determinar como campos elétricos alternados de 150 kHz afetam a permeabilidade das membranas celulares de células MES-SA à doxorrubicina (543,52 g/mol). Nesse experimento, as células MES-SA foram tratadas com um campo elétrico alternado a 150 kHz com uma intensidade de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas. Depois dessas primeiras 23 horas, adicionou--se doxorrubicina a uma concentração de 10 μM e incubou-se por uma hora, durante a qual mantiveram-se os campos elétricos alternados (para completar o período de 24 horas). Em seguida, mediu-se o acúmulo intracelular de doxorrubicina. O acúmulo intracelular de doxorrubicina aumentou em mais de 2X para a amostra que foi tratada com o campo elétrico alternado de 150 kHz.

[0110]As FIGs. 13A e 13B trazem os resultados de dois experimentos in vitro semelhantes aos descritos acima com referência às FIGs. 11A/B, salvo que utilizaram-se células de adenocarcinoma de mama MCF-7. Mais especificamente, a FIG. 13A representa os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o mais alto nível de citotoxicidade a células MCF-7. O número mais baixo de células MCF-7 (que indica o nível mais alto de citotoxicidade) foi observado para a amostra que foi submetida a campos elétricos alternados a 200 kHz. A FIG. 13B traz os resultados de um experimento para determinar a frequência que causa o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células MCF-7. A porcentagem mais alta de células MCF-7 com aumento no acúmulo de 7-AAD (que indica o nível mais alto de permeabilidade) foi observada para a amostra que foi submetida a um campo elétrico alternado a 150 kHz.

[0111]Os experimentos descritos acima com referência às FIGs. de 11 a 13 revelam que a frequência ideal para induzir à permeabilidade celular difere da frequência ideal para induzir à citotoxicidade. Mais especificamente, no caso de um glioblastoma, a primeira frequência ideal (para induzir à permeabilidade celular) é de entre 250 kHz e 350 kHz; e a segunda frequência ideal (para induzir à citotoxicidade) é de entre 150 kHz e 250 kHz. No caso do sarcoma uterino, a primeira frequência ideal (para induzir à permeabilidade celular) é de entre 125 kHz e 175 kHz; e a segunda frequência ideal (para induzir à citotoxicidade) é de entre 75 kHz e 125 kHz. E, no caso do adenocarcinoma de mama, a primeira frequência ideal (para induzir à permeabilidade celular) é de entre 75 kHz e 175 kHz; e a segunda frequência ideal (para induzir à citotoxicidade) é de entre 100 kHz e 300 kHz. Pares de faixas de frequência para outros tipos de câncer podem ser determinados experimentalmente.

[0112]Quando diferentes frequências são usadas para induzir à permeabilidade celular e induzir à citotoxicidade, a frequência de citotoxicidade é preferivelmente aplicada pelo maior tempo possível que possa ser confortavelmente tolerado pelo paciente. De preferência, a frequência de citotoxicidade é aplicada por ao menos uma semana. Mais preferivelmente, a frequência de citotoxicidade é aplicada por muitos meses. Como opção, o intervalo de tempo durante o qual a frequência de citotoxicidade é aplicada pode ser dividido entre vários intervalos de tempo não contíguos que são separados por pausas, sendo que os vários intervalos de tempo não contíguos somam coletivamente ao menos uma semana. Em contrapartida, a frequência para induzir à permeabilidade é aplicada de preferência para que a permeabilidade seja alta quando a substância relevante localizar-se nos arredores das células alvo (por exemplo, conforme descrito acima com referência às FIGs. 10A a 10B). A aplicação dessas duas frequências diferentes pode ser consumada usando um único gerador de tensão elétrica de CA que seja controlável para emitir uma primeira frequência para induzir à permeabilidade celular em determinados momentos e uma segunda frequência para induzir à citotoxicidade em outros momentos. O mesmo conjunto de arranjos de transdutores (isto é, elétrodos) pode ser usado para aplicar os campos elétricos alternados a essas duas frequências (dependendo de a qual frequência é aplicada pelo gerador de tensão elétrica de CA).

[0113]A FIG. 15 é um diagrama em blocos de um aparelho que gera uma primeira frequência para induzir à permeabilidade celular e uma segunda frequência para induzir à citotoxicidade. O aparelho inclui um gerador de tensão elétrica de CA 44 que é semelhante à unidade geradora de campo Optune® convencional, mas com capacidade para operar a duas frequências diferentes. Cada uma dessas frequências é de entre 50 e 500 kHz. Essa capacidade pode ser implementada, por exemplo, usando relés para cambiar entre um primeiro conjunto de componentes ou um segundo conjunto de componentes no circuito convencional que gera a tensão elétrica de CA e ajustando a frequência operacional de um oscilador. O gerador de tensão elétrica de CA 44 é configurado para emitir ou a primeira frequência ou a segunda frequência dependendo do estado de uma entrada de controle. Quando a entrada de controle está em um primeiro estado, o gerador de tensão elétrica de CA 44 emite a primeira frequência e, quando a entrada de controle está em um segundo estado, o gerador de tensão elétrica de CA 44 emite a segunda frequência. Um controlador 42 é programado para posicionar a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a segunda frequência. O controlador 42 também é programado para aceitar um pedido para cambiar para a primeira frequência. Na modalidade representada na FIG. 15, o pedido chega através de uma interface do usuário 40, que pode ser implementada usando qualquer uma de uma variedade de abordagens, inclusive, entre outras, um botão de apertar, uma tela de toque etc. Em modalidades alternativas, o pedido pode chegar via RF (por exemplo, Bluetooth, WiFi etc.) a partir de um tablet, smartphone etc.

[0114]Quando do recebimento do pedido, o controlador 42 posicionará a entrada de controle no primeiro estado para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a primeira frequência por um intervalo de tempo (por exemplo, de ao menos 1 hora, ao menos 12 horas ou ao menos 24 horas). Após o fim do intervalo de tempo, o controlador 42 posicionará a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 volte a emitir a segunda frequência.

[0115]Como opção, o gerador de tensão elétrica de CA 44 pode ser configurado para emitir uma ou mais frequência adicionais (por exemplo, uma terceira frequência, uma quarta frequência etc.) dependendo do estado da entrada de controle. De preferência, cada uma dessas frequências adicionais é selecionada para induzir à citotoxicidade. Nessas modalidades, o controlador 42 é programado para alternar a entrada de controle entre os estados que fazem com que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a segunda frequência e as uma ou mais frequências adicionais antes que o pedido chegue. O controlador 42 também é programado para aceitar um pedido para cambiar para a primeira frequência. Quando do recebimento do pedido, o controlador 42 posicionará a entrada de controle no primeiro estado para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a primeira frequência por um intervalo de tempo (por exemplo, de ao menos 1 hora, ao menos 12 horas ou ao menos 24 horas). Após o fim do intervalo de tempo, o controlador 42 voltará a alternar a entrada de controle entre os estados que fazem com que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a segunda frequência e as uma ou mais frequências adicionais.

[0116]O sistema representado na FIG. 15 é particularmente útil quando uma pessoa com tumor é tratada com terapia combinada incluindo TTFields e quimioterapia. Nessa situação, o sistema opera a maior parte do tempo à segunda frequência para prover o máximo efeito de citotoxicidade. No entanto, quando a pessoa visita uma clínica de quimioterapia para uma dose de quimioterapia, a equipe de saúde (ou o usuário) aciona a interface do usuário 40 para passar o sistema à primeira frequência, que promove a permeabilidade. Nessa situação, o acionamento da interface do usuário pode se dar, por exemplo, uma hora antes do início esperado da quimioterapia, ou pouco depois do início de fato da quimioterapia.

[0117]Como alternativa, quando do recebimento do pedido (por exemplo, pela interface do usuário 40), o controlador 42 controla a entrada de controle para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 emita a primeira frequência por um intervalo de tempo (por exemplo, de 1 hora) e então alterne entre a segunda frequência e a primeira frequência (por exemplo, de hora em hora). Em última análise, (por exemplo, quando a substância relevante deixar por completo a corrente sanguínea do paciente), o controlador 42 controla a entrada de controle para que o gerador de tensão elétrica de CA 44 volte a emitir a segunda frequência.

[0118]Um conjunto de elétrodos (não ilustrado), que são similares aos elétrodos convencionais usados na Optune®, conecta-se à saída do gerador de tensão elétrica de CA 44.

[0119]A FIG. 14 representa os resultados de ainda outro experimento para determinar a frequência que provoca o maior aumento na permeabilidade das membranas celulares de células GBM39/Luc. Nesse experimento, as células foram tratadas com um campo elétrico alternado a diferentes frequências na presença de 4 kDa de Dextrano-FITC (que, em circunstâncias normais, não atravessa prontamente membranas celulares intactas) durante 2 dias. Como se vê na FIG. 14, o nível mais alto de fluorescência do Dextrano-FITC (que indica o nível mais alto de permeabilidade) foi observado para a amostra que foi submetida a um campo elétrico alternado a 100 kHz.

[0120]Os dados experimentais discutidos com referência às FIGs. 11 a 14 contêm informações que são úteis para induzir à máxima permeabilidade celular possível (para permitir que mais da substância relevante atravesse a membrana celular) sem levar em conta nenhuma citotoxicidade que possa ocorrer como efeito secundário. Nessas situações, o campo elétrico alternado é preferivelmente aplicado a uma única frequência, selecionada para induzir ao mais alto nível de permeabilidade celular. Em algumas situações (por exemplo, GBM39/Luc, sarcoma uterino e adenocarcinoma de mama), essa frequência será de entre 50 e 190 kHz; e, em outras situações (por exemplo, glioblastoma U-87 MG), essa frequência será de entre 210 e 400 kHz.

[0121]No caso das substâncias que, em circunstâncias normais, não atravessam a membrana celular em uma medida significativa, as técnicas descritas neste documento para aumentar a permeabilidade da membrana celular podem ser usadas para aumentar a quantidade da substância que penetrará na célula. Isso pode aprimorar o resultado terapêutico proporcionado por essas substâncias. Exemplos dessa classe de substâncias discutida acima incluem o brometo de etídio (dimensão = 394 Da), a doxorrubicina (dimensão = 544 Da), a Mitoxantrona (dimensão = 445 Da) etc.

[0122]E, notadamente, as técnicas descritas neste documento também podem ser usadas para permitir que substâncias que, em circunstâncias normais, não atravessariam a membrana celular penetrem a célula em quantidade significativa. Exemplos dessa classe de substâncias discutida acima incluem (a)

compostos que têm ao menos 1,2 kDa (por exemplo, 7-AAD, cujas dimensões são de 1,27 kDa), (b) compostos que têm ao menos 4 kDa (por exemplo, 4 kDa de Dextrano-FITC, e (c) compostos que têm ao menos 20 kDa (por exemplo, 20 kDa de Dextrano-FITC), (d) material genético, incluindo, entre outros, DNA plasmídeo superenrolado, siRNA e construtos de shRNA, (e) um sistema editor de genomas, incluindo, entre outros, meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases à base de efetores do tipo ativador de transcrição (TALEN) e repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR/Cas9), (f) qualquer forma de um anticorpo, incluindo, entre outros, IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, sdAb. Um anticorpo desse tipo pode ser conjugado ou não a um agente citotóxico, toxina, fluoróforo, pontos quânticos e enzimas, (g) moléculas carregadas, e (h) moléculas pequenas, entidades terapêuticas, peptídeos e proteínas que tipicamente não permeiam a membrana celular ou que estejam sendo destruídas durante a endocitose. Prover capacidade para fazer com que essas substâncias atravessem a membrana celular significa que compostos que tenham sido previamente rejeitados como ineficazes em um processo de triagem de compostos (devido a sua incapacidade de atravessar a membrana celular) podem, quem sabe, tornar-se úteis para fins terapêuticos quando usados em combinação a um campo elétrico alternado que intensifique a permeabilidade celular.

[0123]Os métodos descritos neste documento também podem ser úteis além do contexto das células cancerosas. Mais especificamente, os métodos descritos neste documento podem ser úteis para distribuir moléculas grandes (que, em circunstâncias normais, não atravessariam a membrana celular relevante) através da membrana celular de certas células não cancerosas (por exemplo, células renais, células pulmonares, células hepáticas, células cardíacas, células cerebrais, células musculares, células da medula óssea etc.). A distribuição desses fármacos pode ser intensificada aplicando-se campos elétricos alternados à parte do corpo relevante por um período de tempo (por exemplo, de 24 horas) antes e durante a administração desses fármacos. Candidatos a esses fármacos incluem, entre outros, fármacos antiepilépticos e fármacos psicotrópicos (por exemplo, olanzapina, 9-OH- risperidona e outras variedades de risperidona etc.).

[0124]Em ainda outro exemplo, é possível obter a intensificação localizada da absorção do fármaco em bactérias aplicando-se campos elétricos alternados à parte do corpo relevante por um período de tempo (por exemplo, de 24 horas) antes e durante a administração de um antibiótico relevante. Em situações nas quais uma bactérias específica evoluiu de modo a tornar-se resistente ao fármaco ou multirresistente a fármacos (por exemplo, com base em um mecanismo de ação que envolve a membrana celular), a aplicação de campos elétricos alternados pode aumentar a permeabilidade da membrana celular da bactéria ao ponto em que essa resistência seja superada. Abordagens semelhantes podem ser usadas para intensificar a absorção de fármacos para combater a meningite, pneumonia, endocardite infecciosa, etc. Note-se que, no contexto in vivo, os campos elétricos alternados podem ser aplicados a uma região alvo (por exemplo, aos pulmões) que não tenha um tumor. Como alternativa, os campos elétricos alternados podem ser aplicados a uma região alvo que contém um tumor (por exemplo, um cérebro que inclui um glioblastoma).

[0125]Embora tenha-se revelado a presente invenção com referência a certas modalidades, um sem-número de modificações, alterações e mudanças às modalidades descritas é possível sem divergir do âmbito nem da essência da presente invenção, conforme definidos nas reivindicações apensas. Logo, tenciona- se que a presente invenção não se limite às modalidades descritas, mas que tenha seu âmbito completo definido pela letra das reivindicações listadas abaixo, e equivalentes das mesmas.

MATERIAL E MÉTODOS

[0126]Estudos com culturas celulares: Utilizaram-se duas linhas GBM derivadas de pacientes (GBM2, GBM39), uma linha de células GBM humanas disponível na praça (U87-MG da ATCC, Manassas, VA, EUA), além de uma linha de células de astrocitoma murídeas (KR158B; um presente do Dr. Duane Mitchell do Departamento de Neurocirurgia da Escola de Medicina da Universidade da Flórida). Linhas de células de glioblastoma U87-MG humanas, PCS-201 humanas e KR158B murídeas foram cultivadas em DMEM (Invitrogen/ Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA)/FBS a 10%/1x antibiótico-antimicótico (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA). A GBM2 e a GBM39 foram cultivadas em um meio sem soro definido cuja composição já foi descrita antes.

[0127]Semeadura de células em lamínulas de vidro para experimentos com TTFields: Em suma, as células na cultura foram tripsinizadas via protocolos padrão e de 10.000 a 50.000 células simples foram suspensas em 200 ou 75 μL de DMEM/FBS a 10%/1x antibiótico-antimicótico e, então, semeadas no centro de lamínulas de vidro Thermanox™ de 22 mm ou 12 mm diâmetros, respectivamente (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). As células foram incubadas de um dia para o outro em uma incubadora de ar a 95%/CO2 a 5% umidificada regulada em 37° C. Uma vez que as células vincularam-se à lamínula, adicionaram-se 2 mL ou 1 mL de DMEM/FBS a 10%/1x antibiótico-antimicótico por poço em placas de 6 poços ou 12 poços, respectivamente. Salvo menção em contrário na seção Resultados, permitiu-se que as células crescessem na lamínula por dois a três dias (a fim de garantir que as células estivesse na fase de crescimento) antes de transferi-las a pratos de cerâmica de um aparelho de TTFields in vitro inovitro™ (Novocure Inc., Haifa, Israel). As condições de crescimento (isto é, tempos por que permitiu-se que as células crescessem em condições expostas vs. não expostas a TTFields) são especificadas ou na seção Resultados ou nas legendas correspondentes nas figuras.

[0128]Aparelho de campos para tratamento de tumor in vitro: As lamínulas foram transferidas a um prato de cerâmica do sistema inovitro™, que, por sua vez, foi montado em placas de base inovitro™ (Novocure Ltd., Haifa, Israel). Campos para tratamento de tumor a 200 kHz (1 a 4 V/cm) foram aplicados através de um gerador de força inovitro™. As temperaturas ambientes na incubadora variaram entre 20° e 27° С com uma temperatura alvo de 37° С nos pratos de cerâmica quando da aplicação dos TTFields. A duração da exposição a TTFields durou em todos os casos de 0,5 a 72 h, após o quê as lamínulas foram removidas e processadas para os bioensaios apropriados (vide abaixo). Nos experimentos de reversibilidade, as lamínulas expostas a TTFields foram transferidas a uma incubadora regular sem exposição a TTFields por 24 h (período sem TTFields para avaliar a reversibilidade do efeito dos TTFields sobre a permeabilidade da membrana) antes do processamento para os bioensaios apropriados. Os meios de cultura foram trocados manualmente a cada 24 h em todos os experimentos para compensar a evaporação. Experimentos controle correspondentes (sem TTFields) foram realizados introduzindo lamínulas equivalentes dentro de placas de 6 ou 12 poços em uma incubadora de culturas de tecido umedecida convencional (37° C, ar a 95%/CO2 a 5%) e células cultivadas em paralelo às lamínulas expostas a TTFields. Salvo menção em contrário, todos os experimentos foram realizados em amostras ao menos em triplicada para cada condição e para cada ponto no tempo.

[0129]Ensaio de contagem de células via hemocitômetro: O preparo das células para a contagem foi obtido via protocolos consagrados e visualizado em um microscópio de bancada Zeiss PrimoVert (Dublin, CA, USA). Salvo menção em contrário, as contagens das células foram realizadas em suspensões de célula simples tripsinizadas usando um hemocitômetro, e a média das quatro medições de contagem de células foi calculada e arredondada para o número inteiro mais próximo.

[0130]Imagiologia de bioluminescência: Em todo o trabalho de bioluminescência, utilizaram-se GBM2, GBM39 e U87-MG geneticamente modificadas, com o que as células de glioblastoma foram transfectadas com vetores lentivirais que expressaram ou a luciferase de vagalume (fLuc para a GBM39) ou uma proteína de fusão da GFP e luciferase de vagalume (GFP/fLuc para a GBM2 e eGFP-fLuc para a U87-MG) ou uma proteína de fusão luciferase da Renilla luciferase-Proteína fluorescente vermelha (RLuc-RL8 para a KR158B). As células foram transdutadas usando sobrenadantes virais, e a expressão das luciferases foi confirmada medindo a atividade da luciferase celular (Espectro de IVIS; Perkin Elmer, Waltman, MA) na presença da D-Luciferina (0,3 mg/mL de concentração final) para a fLuc e coelenterazina (1 (μg/mL) para a rLuc.

[0131]Microscópio eletrônico de varredura (SEM): De 5.000 (condição de baixa semeadura) a 50.000 (condição de alta semeadura) células U87-MG/eGFP- fLuc ou células de fibroblasto PCS-201 foram depositadas sobre lamínulas de vidro de 13 mm e então preparadas para os experimentos com TTFields. As células foram cultivadas em condições de incubadora de culturas de tecido padrão (37° C, 95% de O2, 5% de CO2). Ao fim dos experimentos com exposição a TTFields e sem exposição a TTFields (1 dia para condições de alta semeadura e 3 dias para condições de baixa semeadura), as lamínulas foram processadas para a SEM. Todas as análises ROI foram realizadas de maneira cega, onde nem o indivíduo responsável pela obtenção das imagens SEM nem o indivíduo fazendo a análise dos dados tinham conhecimento das condições experimentais para as amostras. Um terceiro indivíduo manteve as identidades das amostras.

[0132]Reagentes químicos: Salvo menção em contrário, todos os agentes químicos foram obtidos junto à Selleckchem Inc. (Houston, TX, EUA), Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA) ou Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). A luciferina de vagalume purificada ou luciferase de vagalume (SRE0045-2MG) bem como o kit de apoptose Etídio D (11835246001) foram adquiridos junto à Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO). Os Dextranos-FITC com pesos moleculares de 4, 20 e 50 kDa (FD4, FD20 e FD50) foram adquiridos junto à Sigma Aldrich Inc., e o ácido 5- aminolevulínico (5-ALA, AAA16942ME) e o kit de AnexinaV-APC (50712549) foram adquiridos junto à Thermo-Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA).

[0133]Análise Estatística: O software PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA) foi usado para determinar se os dados foram distribuídos normalmente. Os dados distribuídos normalmente foram analisados por comparação das médias pelo teste t de Student bidirecional ou análise de variância (ANOVA), ao passo que os dados não distribuídos normalmente foram analisados por análises não paramétricas (por exemplo, comparação das medianas pelo teste U de Mann- Whitney). O nível de significância estatística foi definido em alfa = 0,05. As correções post-hoc de Bonferroni ou Dunnett foram empregadas para ajustar alfa para várias comparações. Todos os dados são representados por faixa, média ± desvio padrão, mediana (faixa interquartil) ou porcentagem. Em todas as figuras, os níveis de diferenças estatisticamente significativas são dados por: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para distribuir uma substância através da membrana celular de uma célula, o método sendo CARACTERIZADO por compreender: aplicar um campo elétrico alternado à célula por um período de tempo, sendo que a aplicação do campo elétrico alternado aumenta a permeabilidade da membrana celular; e introduzir a substância nos arredores da célula, sendo que o aumento na permeabilidade da membrana celular permite que a substância cruze-a.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula cancerosa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula de glioblastoma.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência de cerca de 200 kHz.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência entre 50 e 190 kHz.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado é aplicado a uma frequência entre 210 e 400 kHz.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula encontra-se no corpo de um paciente vivo, o campo elétrico alternado é aplicado à célula aplicando-se um campo elétrico ao corpo do paciente, e introduzir compreende administrar a substância ao paciente.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula cancerosa.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula de glioblastoma.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado possui uma frequência entre 50 e 190 kHz.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado possui uma frequência entre 210 e 400 kHz.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm RMS.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo entre 1 e 4 V/cm RMS.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de introduzir a substância começa em dado momento, e pelo fato de que a etapa de aplicar o campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de aplicar o campo elétrico alternado começa ao menos uma hora antes do dado momento.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 1,2 kDa.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 4 kDa.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 20 kDa.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui ao menos uma característica que, em circunstâncias normais, dificulta-lhe cruzar a membrana celular.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula é uma célula cancerosa que é inatamente resistente ao tratamento usando a substância.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula compreende uma bactéria e a substância compreende um antibiótico.

23. Método para atacar células cancerosas, o método sendo CARACTERIZADO por compreender: aplicar um primeiro campo elétrico alternado a uma primeira frequência às células cancerosas por um primeiro período de tempo, sendo que a aplicação do primeiro campo elétrico alternado à primeira frequência às células cancerosas pelo primeiro período de tempo aumenta a permeabilidade das membranas celulares das células cancerosas; introduzir uma substância nas células cancerosas, sendo que o aumento da permeabilidade das membranas celulares permite que a substância cruze-as; e aplicar um segundo campo elétrico alternado a uma segunda frequência às células cancerosas por um segundo período de tempo, sendo que a segunda frequência difere da primeira e sendo que o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência reduz a viabilidade das células cancerosas.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de glioblastoma, a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de sarcoma uterino, a primeira frequência é de entre 125 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 75 kHz e 125 kHz.

26. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células cancerosas compreendem células de adenocarcinoma de mama, a primeira frequência é de entre 75 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 100 kHz e 300 kHz.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de introduzir a substância começa em dado momento, e pelo fato de que a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado começa ao menos uma hora antes do dado momento.

29. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo compreende vários intervalos de tempo não contíguos durante os quais o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência é aplicado às células cancerosas, sendo que os vários intervalos de tempo não contíguos somam coletivamente ao menos uma semana.

30. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células cancerosas encontram-se no corpo de um paciente vivo, o primeiro campo elétrico alternado é aplicado às células cancerosas aplicando-se um primeiro campo elétrico alternado ao corpo do paciente, o segundo campo elétrico alternado é aplicado às células cancerosas aplicando-se um segundo campo elétrico alternado ao corpo do paciente, e introduzir compreende administrar a substância ao paciente.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro campo elétrico alternado possui uma intensidade de campo de ao menos 1 V/cm RMS.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 1,2 kDa.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 4 kDa.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 20 kDa.

35. Método para tratar um tumor no corpo de um paciente e distribuir uma substância através das membranas celulares no corpo do paciente, o método sendo CARACTERIZADO por compreender: aplicar um primeiro campo elétrico alternado a uma primeira frequência ao corpo do paciente durante um primeiro período de tempo, sendo que a aplicação do primeiro campo elétrico alternado à primeira frequência ao corpo do paciente durante o primeiro período de tempo aumenta a permeabilidade das membranas celulares no corpo do paciente; administrar a substância ao paciente, sendo que o aumento da permeabilidade das membranas celulares permite que a substância cruze-as; e aplicar um segundo campo elétrico alternado a uma segunda frequência ao corpo do paciente durante um segundo período de tempo de ao menos uma semana, sendo que a segunda frequência difere da primeira e sendo que o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência inibe o crescimento do tumor.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor compreende um glioblastoma no cérebro do paciente, a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo período de tempo compreende vários intervalos de tempo não contíguos durante os quais o segundo campo elétrico alternado à segunda frequência é aplicado ao corpo do paciente, sendo que os vários intervalos de tempo não contíguos somam coletivamente ao menos uma semana.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de administrar a substância começa em dado momento, e pelo fato de que a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado termina ao menos 12 horas após o dado momento.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de aplicar o primeiro campo elétrico alternado começa ao menos uma hora antes do dado momento.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 1,2 kDa.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 4 kDa.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 35 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a substância possui um peso molecular de ao menos 20 kDa.

43. Aparelho para tratar um tumor no corpo de um paciente e facilitar a distribuição de uma substância através das membranas celulares no corpo do paciente, o aparelho sendo CARACTERIZADO por compreender: um gerador de tensão elétrica de CA capaz de operar a uma primeira frequência entre 50 e 500 kHz e a uma segunda frequência entre 50 e 500 kHz, sendo que a segunda frequência difere da primeira, o gerador de tensão elétrica de CA tendo uma entrada de controle, sendo que o gerador de tensão elétrica de CA é configurado para emitir a primeira frequência quando a entrada de controle está em um primeiro estado e para emitir a segunda frequência quando a entrada de controle está em um segundo estado; e um controlador programado para (a) posicionar a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA emita a segunda frequência, (b) aceitar um pedido para cambiar para a primeira frequência, (c) quando do recebimento do pedido, posicionar a entrada de controle no primeiro estado para que o gerador de tensão elétrico de CA emita a primeira frequência durante um intervalo de tempo, e, (d) após o fim do intervalo de tempo, posicionar a entrada de controle no segundo estado para que o gerador de tensão elétrica de CA emita a segunda frequência.

44. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO por compreender ainda: um conjunto de elétrodos configurado para afixação junto ao corpo do paciente; e a fiação que conecta uma saída do gerador de tensão elétrica de CA ao conjunto de elétrodos.

45. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira frequência é de entre 250 kHz e 350 kHz, e a segunda frequência é de entre 150 kHz e 250 kHz.

46. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira frequência é de entre 125 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 75 kHz e 125 kHz.

47. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira frequência é de entre 75 kHz e 175 kHz, e a segunda frequência é de entre 100 kHz e 300 kHz.

48. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o intervalo de tempo é de ao menos 12 horas.

49. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o intervalo de tempo é de entre 12 e 72 horas.

50. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o controlador é adicionalmente programado para, subsequentemente ao recebimento do pedido, cambiar a entrada de controle para trás e para frente entre o primeiro estado e o segundo estado.

51. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o gerador de tensão elétrica de CA é capaz de operar a ao menos uma frequência adicional entre 50 e 500 kHz e pelo fato de que o gerador de tensão elétrica de CA é configurado para emitir a ao menos uma frequência adicional quando a entrada de controle estiver em ao menos um estado adicional; e pelo fato de que o controlador é programado para alternar a entrada de controle entre o segundo estado e o ao menos um estado adicional antes do recebimento do pedido, e para alternar a entrada de controle entre o segundo estado e o ao menos um estado adicional após o fim do intervalo de tempo.

52. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO por compreender ainda uma interface do usuário através da qual o pedido é aceito.

53. Aparelho, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o pedido é aceito via RF.