ES2943672T3 - Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular - Google Patents

Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular Download PDF

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Abstract

Ciertas sustancias (p. ej., moléculas grandes) que normalmente no pueden atravesar la membrana celular de las células pueden introducirse en las células aplicando un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, en el que la frecuencia del campo eléctrico alterno se selecciona de modo que la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular. Una vez aumentada la permeabilidad de la membrana celular, la sustancia es capaz de atravesar la membrana celular. Este enfoque es particularmente útil en el contexto de las células cancerosas (p. ej., glioblastoma). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de campos eléctricos alternos para aumentar la permeabilidad de la membrana celular
ANTECEDENTES
El tratamiento del glioblastoma (GBM) usando campos eléctricos alternos es una terapia novedosa y validada que se ha convertido en una modalidad adicional (después de la cirugía, la quimiorradiación y la quimioterapia) para los tratamientos contra el cáncer. Los campos eléctricos alternos de frecuencia intermedia (100­ 500 kHz) se han estudiado con detalle. Más recientemente, se ha demostrado que los TTFields prolongan la supervivencia mediana (en 5 meses) de los pacientes con glioblastoma que reciben quimioterapia de mantenimiento con temozolomida. En el contexto del tratamiento de tumores, los campos eléctricos alternos a estas frecuencias se denominan a menudo "campos de tratamiento de tumores" o "TTFields".
Existen muchas hipótesis sobre el mecanismo de los TTFields, pero el mecanismo de acción anticancerígena más ampliamente propuesto ("estándar") para los TTFields se centra en la propiedad de que las subunidades de tubulina tienen momentos dipolares intrínsecos. Al obligar a las estructuras de microtúbulos a alinearse a lo largo de líneas de campos eléctricos alternos a través de la imposición exógena de TTFields de 200 kHz, la funcionalidad de las células que se dividen activamente se altera a través de la interferencia con el citoesqueleto que soporta los husos mitóticos. Tal estrés promueve en última instancia la proliferación celular deteriorada. Durante los últimos diez años se han producido experimentos de prueba de concepto y desarrollos tecnológicos relevantes, que culminaron con la aprobación por parte de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de un dispositivo TTFields clínico comercial (Optune®, Novocure Ltd.), para el tratamiento de glioblastoma recurrente y de nuevo diagnóstico.
Durante los últimos años, se ha informado de detalles adicionales sobre los mecanismos de acción. Por ejemplo, se ha demostrado que los TTFields alteran la localización de septinas (proteínas intracelulares responsables de anclar los husos mitóticos durante la división celular) y, por lo tanto, perturban la mitosis. Algunos equipos han informado de la prolongación del daño en el ADN por la quimioterapia o la radioterapia junto con TTFields, mientras que otros han demostrado efectos sobre la función mitocondrial a través de la inflamación de las matrices mitocondriales. Otros equipos exploraron la combinación de quimioterapias (por ejemplo, temozolomida) con TTFields en pacientes con GBM. Dicha investigación sobre intervenciones de combinación ha descubierto otros efectos prometedores contra el glioblastoma.
La WO-A-2015/175570 divulga un sistema para tratar selectivamente células aberrantes, como células cancerígenas, a través de la administración de un tren de pulsos eléctricos, donde se optimiza la longitud del pulso y el retardo entre pulsos sucesivos para producir efector sobre los potenciales de la membrana intracelular. La WO 2005/115535 A2 describe experimentos en los que cada muestra de células se sometió a un campo que tenía uno de varios valores de frecuencia, durante un periodo de 24 horas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto la presente invención proporciona un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de las membranas celulares en el cuerpo del sujeto de acuerdo con la reivindicación 1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es una ilustración esquemática que muestra un efecto alternativo de los TTFields sobre la modulación de la integridad y, por tanto, la permeabilidad de las membranas celulares.
La FIG. 2A representa efectos ejemplares de los TTFields sobre la bioluminiscencia de células U87-MG/eGFP-fLuc a partir de exploraciones de imagenología bioluminiscente en función del tiempo en TTFields frente a condiciones sin TTFields.
La FIG. 2B representa los efectos ejemplares de TTFields sobre la fluorescencia de eGFP para células U87-MG/eGFP-fLuc en función del tiempo en TTFields frente a condiciones sin TTFields.
La FIG. 2C representa el efecto de TTFields sobre la bioluminiscencia fLuc (fLuc-BLI) sobre la relación de fluorescencia eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición a TTFields.
La FIG. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición a TTFields.
La FIG. 3A representa los efectos ejemplares de los TTFields sobre la captación dependiente del tiempo de etidio D en células U87-MG/eGFP-fLuc entre sin TTFields y TTFields (200 kHz).
Las FIGS. 3B-3D representan el impacto ejemplar de las condiciones de TTFields frente a las condiciones sin TTFields en el curso temporal de la captación de dextrano-FITC para dextrano-FITC de 4 kDa, dextrano-FITC de 20 kDa y dextrano-FITC de 50 kDa, respectivamente.
La FIG. 4A representa el efecto ejemplar de los TTFields (200 kHz) sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) como se muestra mediante la fluorescencia representativa de protoporfirina IX (PpIX) para TTFields frente a células U87-MG no expuestas a TTFields a las 6 y 24 horas.
La FIG. 4B representa cómo cambió la fluorescencia de PpIX a lo largo del tiempo en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que se sometieron a TTFields.
La FIG. 5 proporciona la cuantificación del número y el tamaño de los orificios a partir de una comparación SEM de los orificios de la membrana plasmática en células U87-MG/eGFP-fLuc expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.
La FIG. 6 proporciona la cuantificación del número y el tamaño de los orificios a partir de una comparación SEM de los orificios de la membrana plasmática en células PCS-201 humanas normales expuestas y no expuestas a TTFields durante 3 días.
Las FIG. 7A-7C representan los resultados de los experimentos que muestran cómo los campos eléctricos alternos aumentan reversiblemente la captación en las células U87-MG de D-luciferina, 5-ALA y dextrano-FITC (4 kDa), respectivamente.
La FIG. 7D representa los resultados de un experimento que muestra las características de cadencia de la permeabilidad inducida por la aplicación de TTFields a las células U87-MG.
La FIG. 8A representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan a la permeabilidad de las membranas celulares de MDA-MB-435 para 7-AAD.
La FIG. 8B representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan a la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la doxiciclina MDA-MB-435 y MDA-MB-435 para la doxorrubicina.
La FIG. 8C representa los resultados de un experimento que muestra cómo los campos eléctricos alternos afectan a la permeabilidad de las membranas celulares resistentes a la mitoxantrona MCF-7 y MCF-7 para la mitoxantrona.
Las FIGS. 9A-9G representan el efecto de los TTFields sobre la sensibilidad a siete combinaciones diferentes de sustancias y tipos de células correspondientes.
Las FIGS. 10A y 10B representan cada una, una relación temporal adecuada entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en las inmediaciones de la célula cancerosa.
La FIG. 11A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células U-87 MG.
La FIG. 11B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.
La FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MES-SA.
La FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA.
La FIG. 12C representa los resultados de un experimento para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan a la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA para la doxorrubicina. La FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MCF-7.
La FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MCF-7.
La FIG. 14 representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc.
La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato de doble frecuencia que genera una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad.
A continuación se describen con detalle varias realizaciones con referencia a los dibujos acompañantes, en donde números de referencia similares representan elementos similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Como se usa en la presente, el término "reducir la viabilidad" de una célula se refiere a reducir el crecimiento, la proliferación o la supervivencia de la célula, o a aumentar la citotoxicidad de la célula.
Esta solicitud describe un enfoque novedoso para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de las células plasmáticas de las células cancerosas usando campos eléctricos alternos para que las sustancias que normalmente están bloqueadas por la membrana celular sean capaces de cruzar la membrana celular, o para que las sustancias que normalmente se ven obstaculizadas por la membrana celular sean capaces de atravesar la membrana celular más fácilmente. En algunos de los ejemplos descritos en la presente, este enfoque se usa para aumentar temporalmente la permeabilidad de las membranas de células plasmáticas de glioblastoma usando campos eléctricos alternos, de tal manera que las sustancias que normalmente se ven obstaculizadas por la membrana celular de glioblastoma sean capaces de cruzar la membrana celular de glioblastoma más fácilmente.
Los inventores han demostrado que el tratamiento con TTFields, junto con un nuevo compuesto anticancerígeno Witaferina A, inhibía sinérgicamente el crecimiento de células de glioblastoma humano. Los inventores plantearon la hipótesis de que dicho efecto sinérgico se debe a la mayor accesibilidad de Witaferina A a las células de glioblastoma a través de la capacidad de los TTFields para aumentar transitoriamente la permeabilidad de la membrana de la célula tumoral, como se representa esquemáticamente en la FIG. 1. En esta figura 5-ALA = ácido 5-aminolevulínico; etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.
Luego se realizaron estudios que validaron la hipótesis. En particular, se encontraron evidencias que demuestran que la exposición a TTFields indujo una mayor bioluminiscencia en células de glioblastoma humano que han sido modificadas para expresar luciferasa (renilla y luciérnaga), y que esta inducción se debe a una mayor permeación de los sustratos (D-luciferina y coelenterazina, respectivamente), a través de la membrana plasmática. También se demostró una mayor permeabilidad de la membrana provocada por la exposición a TTFields con otros reactivos que penetran en la membrana, como dextrano-FITC y Ethidium D.
También se demostró el uso de TTFields para aumentar la permeabilidad de la membrana en células de glioblastoma usando ácido 5-aminolevulínico (5-ALA). El 5-ALA es un precursor de la hemoglobina que se convierte en protoporfirina IX fluorescente (PpIX) en todas las células de los mamíferos. Sin embargo, muchas células malignas, incluyendo los gliomas de alto grado, tienen una biosíntesis de hemoglobina elevada, lo que se refleja en una mayor acumulación de PpIX dentro de las células y tejidos transformados (en comparación con las células no cancerosas). Esta propiedad ha provocado que muchas investigaciones médicas usen la captación de 5-ALA (y, en consecuencia, su conversión enzimática a PpIX) como biomarcador fluorescente para células tumorales. Sin embargo, con el nivel actual de tecnología, puede ser difícil distinguir el margen celular preciso entre tejido tumoral y no tumoral intraoperativamente. Los experimentos descritos en la presente muestran que TTFields mejora significativamente la relación de células tumorales a normales para la fluorescencia PpIX (provocada por la exposición y captación de 5-ALA) y, de esta manera, puede usarse para delinear mejor los márgenes tumorales en entornos intraoperatorios.
Experimentos adicionales que usan datos de microscopía electrónica de barrido (SEM) demuestran un aumento en la cantidad y el tamaño de los orificios en las membranas celulares de glioblastoma provocados por la exposición a TTFields, y que la morfología de la membrana celular de glioblastoma se altera cuando se aplican TTFields. A través de todas las modalidades estudiadas (bioluminiscencia, fluorescencia y SEM), se descubrió que los efectos de TTFields sobre la permeabilidad de la membrana celular de GBM eran reversibles después del cese de la exposición a TTFields.
RESULTADOS
La inducción de TTFields aumenta la bioluminiscencia (BLI) en los glioblastomas que expresan luciferasa.
Se sembraron células U87-MG/eGFP-fLuc en cubreobjetos de vidrio Thermanox, se dejó que se asentasen y creciesen, y luego se sometieron o a TTFields o a sin TTFields. En este experimento, el uso de TTFields (4 V/cm, 200 kHz, 0,5-24 h de duración) aumentó significativamente la intensidad de bioluminiscencia (BLI) de las células U87-MG/eGFP-fLuc en comparación con las condiciones no expuestas. Este aumento en BLI se produjo tan pronto como 30 minutos después del comienzo de TTFields y continuó hasta las 24 h de la exposición a TTFields. Cuando se realizó la cuantificación del ROI, el curso temporal de la intensidad de BLI para las muestras expuestas a TTFields fue significativamente mayor en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p <0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields). Los datos que representan la cuantificación temporal de los resultados de BLI de estos experimentos se resumen en la FIG. 2A. Sin querer estar limitados a esta teoría, se cree que la elevación de la bioluminiscencia no se debió a un efecto directo de TTFields sobre la actividad de la luciferasa de luciérnaga porque la exposición de la luciferasa de luciérnaga purificada a TTFields de 200 kHz llevó a una pérdida de más de 1000 veces en la actividad enzimática 60 minutos después del inicio de TTFields.
La FIG. 2B representa el efecto de TTFields sobre la fluorescencia de eGFP en células U87-MG/eGFP-fLuc observadas a partir del curso temporal de imágenes representativas (no mostradas) para U87-MG/eGFP-fLuc expuestas a TTFields frente a no expuestas a TTFields. La presencia de TTFields no aumentó significativamente la fluorescencia de eGFP (eGFP-FL) en el transcurso de los experimentos. Cuando se compararon las proporciones de BLI sobre eGFP-FL entre muestras con TTFields y muestras sin TTFields, hubo una proporción significativamente mayor con respecto al tiempo de incubación con TTFields para las muestras con TTFields, como se representa en las FIGS. 2C, 2d (p<0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields). Más específicamente, la FIG. 2C representa el efecto de TTFields en la bioluminiscencia fLuc (fLuc-BLI) sobre la relación de fluorescencia eGFP (eGFP-FL) para células U87-MG/eGFP-fLuc en función de la duración de la exposición a TTFields; y la FIG. 2D representa el efecto de la exposición a TTFields frente a la no exposición en la relación fLuc-BLI/eGFP-FL en función del tiempo de exposición a TTFields (horas). TTFields disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga purificada en comparación con no TTFields (p<0,01, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields).
La aplicación de TTFields a lo largo del tiempo en otra línea celular de glioblastoma derivada de un paciente, GBM2/GFP-fLuc, también indujo un aumento dependiente del tiempo en la bioluminiscencia en células GBM2/GFP-fLuc expuestas a TTFields en comparación con los controles sin TTFields (p<0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields). Este mismo efecto se observó en una línea celular de astrocitoma murino (KR158B) que se modificó genéticamente para expresar la proteína de fusión Renilla luciferasa-proteína fluorescente roja (p<0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields). La actividad de la luciferasa de renilla no depende del ATP y el magnesio (a diferencia de la luciferasa de luciérnaga). Por tanto, se cree que la inducción de bioluminiscencia por parte de TTFields no se debió a alteraciones en las reservas endógenas de ATP.
Efecto de TTFields sobre la captación de reactivos de asociación de membrana.
Para probar si la imposición de TTFields afecta a las propiedades de la membrana celular y, por tanto, a la permeabilidad de la membrana, se determinó el efecto de TTFields sobre el comportamiento de los reactivos marcados con fluorescencia que se unen a la membrana celular. Inicialmente, se midió el impacto de TTFields sobre la unión de Anexina-V-APC a la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc. La unión de Anexina-V-APC es una firma de apoptosis temprana que se caracteriza por el pliegue de la membrana. Se usó un control positivo para la apoptosis (adición de Witaferina A 21 pM a células U87-MG/eGFP-fLuc) para evaluar la visibilidad de la unión de Anexina-V-APC a células U87-MG/eGFP-fLuc y mostró que dicha unión podría visualizarse mediante microscopía de fluorescencia sobre muestras no expuestas a TTFields. Sin embargo, cuando se aplicaron TTFields a células U87-MG/eGFP-fLuc, no se observó unión de anexina-V-APC en ningún momento de la exposición a TTFields. Por lo tanto, parece que TTFields no indujo ningún grado significativo de apoptosis en las células U87-MG.
En particular, la captación de etidio D aumentó significativamente cuando las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a campos TTFields de 200 kHz. como se muestra en la FIG. 3A(p<0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields). El etidio D penetra tanto a través de la membrana plasmática como de la membrana nuclear y se intercala en el ADN genómico. Por tanto, estos descubrimientos sugieren que TTFields puede tener un efecto sobre la permeabilidad de las membranas plasmáticas en las células U87-MG/eGFP-fLuc.
Otra consecuencia de la permeabilidad de membrana mejorada por TTFields son las alteraciones en la unión de dextrano-FITC en la membrana celular. Se sabe que el dextrano-FITC se une e intercala en la membrana plasmática. Cuando se sometieron células U87-MG a 1 h de TTFields de 200 kHz, hubo una captación significativa de dextrano-FITC de pesos moleculares de 4 kDa y 20 kDa, en comparación con la exposición sin TTFields, como se representa en las FIGS. 3B y 3C. Pero no hubo una diferencia significativa en la captación de Dextrano-FITC de 50 kDa, como se muestra en la FIG. 3D. Más específicamente, se examinó la unión de dextrano-FITC en presencia de TTFields durante un período de exposición de 0,5-24 h, se descubrió un aumento significativo en la captación de dextrano-FITC de 4 kDa en comparación con las muestras no expuestas a TTFields (p<0,0001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields), un aumento significativo en la absorción de dextrano-FITC de 20 kDa bajo exposición a TTFields (p<0,01, TTFields frente a no TTFields) y ninguna diferencia significativa en la absorción de dextrano-FITC de 50 kDa bajo exposición a TTFields (p= 0,26, no significativo, TTFields frente a no TTFields). Estos datos sugieren que el tamaño máximo de dextrano-FITC que se unió y entró en la membrana plasmática bajo la exposición a TTFields en este experimento fue de aproximadamente 20 a 50 kDa. En todas las comparaciones estadísticas descritas en este párrafo, cada punto de datos representa n = 3 experimentos. En las FIGS. 3A-3D, APC = aloficocianina; etidio D = bromuro de etidio; y FITC = isotiocianato de fluoresceína.
Efecto de TTFields sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA): cultivo único de U87-MG.
Se realizaron experimentos para determinar los efectos de TTFields sobre la captación de 5-ALA (según se mide por la acumulación de PpIX y su fluorescencia resultante) en células de glioblastoma. Debido a que es difícil distinguir el margen entre las células tumorales y las células normales usando el presente bioensayo de 5-ALA, se usó medición de la fluorescencia de PpIX para solucionar este problema. Se llevaron a cabo investigaciones para determinar si la penetración de 5-ALA a través de la membrana celular y hacia las células de glioblastoma podría aumentarse con la exposición a TTFields. Las células U87-MG se expusieron o no se expusieron a TTFields, cada una durante 6-24 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4A, fueron los siguientes: la exposición a TTFields dio como resultado un aumento significativo de la captación de 5-ALA en células U87-MG/eGFP-fLuc tan pronto como a las 6 h de la exposición a TTFields (p = 0,047, prueba t de Student, TTFields frente a no TTFields) y este aumento se mantuvo con una exposición prolongada a TTFields de 24 h (p = 0,011).
Para generar los datos representados en la FIG. 4A, se obtuvieron paneles de fluorescencia de protoporfirina IX (PpIX) para células U87-MG no expuestas a TTFields frente a expuestas a TTFields después de 6 y 24 h de exposición. La cuantificación de esas imágenes mostró un aumento significativo en las señales de PpIX en las células expuestas a TTFields en comparación con las células sin TTFields, en los puntos temporales tanto de 6 h (p = 0,047) como de 24 h (p = 0,01). Todas las comparaciones estadísticas monovariantes entre muestras TTFields y sin TTFields realizadas mediante la prueba t de Student para n = 3 experimentos por punto temporal.
Efecto de TTFields sobre la captación de ácido 5-aminolevulínico: U87-MG GBM en cocultivos de fibroblastos PCS-201.
Durante la resección de glioblastoma en pacientes, se usa 5-ALA para ayudar a los neurocirujanos a delinear entre los tumores y el tejido cerebral normal circundante. De igual manera, para distinguir las diferencias en la captación de 5-ALA entre las células de glioblastoma y las normales, se desarrolló un cocultivo en el que se sembraron células U87-MG en el centro de un lecho de fibroblastos PCS-201 y se sometieron a TTFields o a no TTFields. Las fotomicrografías fluorescentes y de campo claro confirmaron la presencia de regiones discretas de células de glioblastoma frente a fibroblastos en la configuración de cocultivo. Cuando los cocultivos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), las microfotografías revelaron un número reducido de células GBM que se infiltraban en la periferia de los fibroblastos para las muestras expuestas a TTFields.
En particular, sin exposición a TTFields, las células GBM formaron muchos bolsillos de neuroesferas adherentes como se ha informado con anterioridad. Las imágenes de fluorescencia mostraron un aumento de la fluorescencia de PpIX en células de glioblastoma frente a fibroblastos en las plataformas de cocultivo que se sometieron a TTFields durante 6 h. Los resultados, que se resumen en la FIG. 4B, fueron los siguientes: la fluorescencia de PpIX se acumuló con el tiempo, pero la tasa de aumento de la intensidad de la fluorescencia aumentó significativamente (p<0,001, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields) para cocultivos expuestos a TTFields en comparación con cocultivos no expuestos a TTFields. Para generar los datos representados en la FIG. 4B, se obtuvieron paneles fluorescentes de captación de 5-ALA (y fluorescencia PpIX posterior, Ex = 558 nm, Em = 583 nm) para sin TTFields y TTFields. La duración de las exposiciones es de 2, 6 y 24 h. Cuantificación del curso temporal de la acumulación de PpIX (y, por lo tanto, la acumulación de flujo fluorescente expresado como fotones/s) en la plataforma de cocultivo de glioblastoma-fibroblastos en condiciones de exposición frente a no exposición a TTFields (p<0,001). Los análisis estadísticos consistieron en ANOVA bidireccional para condiciones sin TTFields frente a TTFields, y n = 3 experimentos por punto temporal.
En un conjunto separado de experimentos, a las 24 h de la aplicación de TTFields, la proporción de intensidad de fluorescencia de PpIX en las células de glioblastoma U87-MG sobre las células de fibroblastos PCS-201 circundantes aumentó significativamente en comparación con la proporción de intensidad de fluorescencia para las células cocultivadas bajo condiciones sin TTFields (p=0,043, ANOVA bidireccional, TTFields frente a sin TTFields).
La micrografía electrónica de barrido (SEM) muestra que TTFields altera la morfología de la membrana de las células U87-MG/eGFP-fLuc.
Se obtuvieron imágenes SEM de células U87-MG/eGFP-fLuc de baja densidad (5000 células/cubreobjetos) que no se expusieron a TTFields o se expusieron a TTFields durante 3 días con aumentos de 2000x, 20000x y 60000x. Los datos obtenidos al revisar estas imágenes SEM se resumen en la FIG. 5. Hubo un número significativamente mayor de orificios de más de 51,8 nm2 de tamaño (equivalente a 9 píxeles2 con un aumento de 60000x) dentro del ROI de las células expuestas a TTFields (53,5 ± 19,1) en comparación con las células no expuestas a TTFields (23,9 ± 11,0), (p = 0,0002, prueba univariada de Mann-Whitney). El tamaño medio de los orificios dentro del ROI también fue significativamente mayor en las células expuestas a TTFields (240,6 ± 91,7 nm2) en comparación con las células no expuestas a TTFields (129,8 ± 31,9 nm2), (p = 0,0005 (prueba univariada de Mann-Whitney)). Para obtener los datos representados en la FIG. 5, La cuantificación y la comparación entre las células expuestas y no expuestas a TTFields del número y tamaño de los orificios se realizó dentro de una región circular de interés de 500 nm de radio. El corte del tamaño mínimo del orificio se basó en los radios de Stokes de 3,3 y 5,0 nm de dextrano-FITC de 20 kDa y 50 kDa, respectivamente. Se usaron cubreobjetos de tres experimentos por condición, y para el recuento y el tamaño de los orificios se analizaron por lo menos 5 células por cubreobjetos, de manera doble ciego.
También se observaron visualmente los efectos de una exposición de 24 h a TTFields en las membranas plasmáticas de células U87-MG sembradas a alta densidad. Para las muestras sin TTFields, la superficie celular parecía estar cubierta de extensiones de membrana densamente apelmazadas, alargadas y aplanadas, similares a pliegues de membrana y contiguas a la membrana celular. Por el contrario, después de 24 horas de exposición a TTFields, las estructuras densamente apelmazadas y alargadas fueron reemplazadas por estructuras cortas, bulbosas y similares a vesículas.
A modo de comparación, también se obtuvieron y analizaron imágenes SEM de células PCS-201 humanas normales. Se sembraron células PCS-201 a baja densidad (5000 células por cubreobjetos de vidrio de 13 mm). Las células se cultivaron en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37°C, 95% de O2 , 5% de CO2). Las células no expuestas a TTFields se dejaron en esas condiciones durante la duración del estudio. Otras células se expusieron a TTFields durante 72 h. Después de 72 horas, se obtuvieron imágenes SEM con aumentos de 2000x, 20000x y 60000x. Cuantificación y comparación entre células expuestas y no expuestas de TTFields del número y tamaño de orificios con área >51,8 nm2 (equivalente a un círculo de 4 nm de radio, o 9 píxeles2 en las imágenes de 60000 aumentos) dentro de una región circular de interés de 500 nm de radio. El corte del tamaño mínimo del orificio se basó en los radios de Stokes de 3,3 nm y 5,0 nm de dextrano-FITC de 20 kDa y 50 kDa, respectivamente. Los resultados, que se muestran en la FIG. 6, fueron los siguientes: No hubo diferencia significativa en el número o tamaño de los orificios entre las células PCS-201 humanas normales expuestas y no expuestas de TTFields (análisis de suma de rangos de Wilcoxon). Se usaron cubreobjetos de tres experimentos por condición y se analizaron por lo menos 5 células por cubreobjetos para determinar el número y el tamaño de los orificios, de manera doble ciego.
También se observaron visualmente los efectos de una exposición de 24 h a TTFields en las membranas plasmáticas de células PCS-201. A diferencia de la situación descrita anteriormente para las células U87-MG, TTFields no pareció alterar la morfología de la membrana de las células PCS-201.
El efecto de TTFields sobre la permeabilidad de la membrana es reversible.
Para evaluar la reversibilidad del efecto de TTFields sobre las células cancerosas, las células U87-MG/eGFP-fLuc se sometieron a tres condiciones: (1) Sin exposición a TTFields, condiciones de cultivo celular estándar (37° C, 95% de O2, 5% de CO2), (2) exposición a TTFields durante 24 h y (3) exposición a TTFields durante 24 h seguido de ninguna exposición a TTFields durante 24 h. Se adquirieron las lecturas de BLI, fluorescencia PplX (producto 5-ALA) y fluorescencia Dextrano-FITC (4 kDa). Todas las condiciones experimentales se realizaron por triplicado. La FIG. 7A resume los datos de BLI: La presencia de TTFields durante 24 h (barra central) aumentó significativamente el flujo de BLI en comparación con la ausencia de exposición a TTFields (barra izquierda) (p<0,0005, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields), pero este aumento fue significativamente atenuado cuando las células se volvieron a introducir en la condición sin TTFields durante 24 h (barra derecha) (ANOVA bidireccional, p<0,005, TTFields durante 24 h frente a TTFields durante 24 h seguido de sin TTFields durante 24 h). La FIG. 7B muestra que se produjo un patrón similar de lecturas reversibles con fluorescencia PpIX (p<0,0005, ANOVA bidireccional, TTFields (barra central) frente a sin TTFields (barra izquierda) y p<0,0004, TTFields frente a TTFields seguido de no TTFields (barra derecha) bar)). Y la FIG. 7C muestra que se produjo un patrón similar de lecturas reversibles para la fluorescencia de Dextrano-FITC de 4 kDa (p<0,05, ANOVA bidireccional, TTFields (barra central) frente a no TTFields (barra izquierda); y p<0,05, TTFields frente a TTFields seguido por no TTFields (barra derecha)). Para cada conjunto experimental, la fluorescencia de eGFP no cambió significativamente. Las investigaciones SEM también revelaron que el aumento significativo tanto en el número de orificios (p = 0,007, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields) como en el tamaño de los orificios (p = 0,0007, ANOVA bidireccional, TTFields frente a no TTFields) de TTFields también eran reversibles, después de 24 h sin exposición. Aquí, NS = no significativo; BLI = imágenes bioluminiscentes; eGFP = proteína de fluorescencia verde mejorada; fLuc = luciferasa de luciérnaga; 5-ALA = ácido 5 aminolevulínico; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PpIX = protoporfirina IX; y FL = fluorescencia.
Para resumir, la captación de los compuestos relevantes aumentó cuando se aplicaron campos eléctricos alternos (en comparación con cuando no se aplicaron campos eléctricos alternos). Cada una de estas figuras también muestra que la captación disminuyó sustancialmente después del cese de los campos eléctricos alternos durante 24 horas. De esto, podemos inferir que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares que fue inducido por los campos eléctricos alternos no es un efecto permanente, y que la permeabilidad vuelve a caer después del cese de los campos eléctricos alternos.
La FIG. 7D representa los resultados de un experimento para probar como de rápido vuelve a caer la permeabilidad después del cese de los campos eléctricos alternos. Más específicamente, la 7-aminoactinomicina D (7-AAD) es un compuesto químico fluorescente con una fuerte afinidad por el ADN. La 7-AAD es una molécula relativamente grande (1270,43 g/mol, es decir, 1,27 kDa) que normalmente no atraviesa fácilmente las membranas celulares intactas. La FIG. 7D muestra las características de cadencia de la permeabilidad para 7-AAD que es inducida por la aplicación de TTFields para células U87-MG. En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a 300 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18° C. Se introdujo 7-AAD en las muestras en cinco momentos diferentes.: 15 minutos antes del cese del campo eléctrico alterno; inmediatamente después del cese del campo eléctrico alterno; y 15, 30 y 60 minutos después del cese del campo eléctrico alterno. En cada caso, las células se incubaron con 7-AAD durante 30 minutos después de la introducción de 7-AAD, seguido de un análisis de citometría de flujo del porcentaje de células con acumulación aumentada de 7-AAD fluorescente para cada una de las diferentes cadencias. Como se ve en la FIG. 7D, se observó un aumento significativo en la acumulación de 7-AAD solo en la muestra que se incubó con 7-AAD mientras se sometía a un campo eléctrico alterno.
Resultados adicionales para diferentes fármacos y diferentes tipos de células cancerosas.
Los métodos descritos en la presente no se limitan al contexto del glioblastoma. Por el contrario, son aplicables a otros tipos de células cancerosas. Más específicamente, puede administrarse una sustancia a través de la membrana celular de una célula (a) aplicando un campo eléctrico alterno a la célula durante un período de tiempo, en donde la aplicación del campo eléctrico alterno aumenta la permeabilidad de la membrana celular; y (b) introduciendo la sustancia en las inmediaciones de la célula. La permeabilidad aumentada de la membrana celular permite que la sustancia atraviese la membrana celular. En particular, los métodos descritos en la presente pueden usarse para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de diferentes tipos de células (es decir, células distintas del glioblastoma), incluyendo pero no limitadas a otros tipos de células cancerígenas (por ejemplo, célulasMDA-MB-435 y MCF-7).
La FIG. 8A representa los resultados de un experimento realizado para determinar cómo afectan los campos eléctricos alternos a la permeabilidad de las membranas celulares de las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435. En este experimento, las células MDA-MB-435 se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18° C y una temperatura de plato de 37° C. (La temperatura del plato en este y otros ejemplos es más alta que la temperatura ambiente debido al calentamiento provocado por los campos eléctricos alternos). Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se terminó la aplicación de campo eléctrico alterno y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. El porcentaje de células con acumulación aumentada de 7-AAd fluorescente se determinó usando análisis de citometría de flujo. El ~66% de las células mostraron una acumulación aumentada de 7-AAD (barra 2 en la FIG. 8A), en comparación con menos del 5% de las células en el control (barra 1), que se sometió a las mismas condiciones, excepto que no se aplicaron campos eléctricos alternos. Estos resultados indican que los campos eléctricos alternos provocan un aumento muy significativo de la permeabilidad de las membranas celulares.
En una variación de este experimento, se trataron células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 24 horas, a una temperatura ambiente de 18° C y una temperatura del plato de 37° C. Después de este período de 24 horas, los campos eléctricos alternos se apagaron durante 15 minutos, después de lo cual se añadió el 7-AAD. Después de esperar 15 minutos adicionales, se determinó el porcentaje de células con acumulación aumentada de 7-AAD fluorescente mediante citometría de flujo. Esta vez, solo el ~20% de las células mostraron una acumulación aumentada de 7-AAD (barra 3 en la FIG. 8A). Estos resultados indican que el aumento de la permeabilidad de las membranas celulares que es inducido por campos eléctricos alternos tiene una vida relativamente corta y que la permeabilidad declina rápida y drásticamente después del cese de los campos eléctricos alternos.
La FIG. 8B representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos afectan a la permeabilidad de las membranas celulares de las células de la línea celular de melanoma humano MDA-MB-435 para la doxorrubicina (543,52 g/mol). En este experimento, se trataron variantes de células MDA-MB-435 tanto de tipo salvaje como resistentes a la doxorrubicina con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó tanto para las células de tipo salvaje (comparar la barra 1 con la barra 3) como para las células resistentes a la doxorrubicina (comparar la barra 2 con la barra 4).
La FIG. 8C representa los resultados de un experimento similar usando células de la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 y mitoxantrona (444,481 g/mol). En este experimento, se trataron variantes de células MCF-7 tanto de tipo salvaje como resistentes a la mitoxantrona con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm durante 23 horas. Después de este período de 23 horas, se añadió mitoxantrona a una concentración de 2 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual continuaron los campos eléctricos alternos. Luego se midió la acumulación intracelular de mitoxantrona. La acumulación intracelular de mitoxantrona aumentó tanto para las células de tipo salvaje (compare la barra 1 con la barra 3) como para las células resistentes a la mitoxantrona (compare la barra 2 con la barra 4).
Los resultados descritos anteriormente en relación con las FIGS. 8B y 8C indican que los campos eléctricos alternos mejoran la acumulación intracelular de moléculas de quimioterapia tanto en células de tipo salvaje como resistentes a fármacos, y que los campos eléctricos alternos pueden restaurar ventajosamente la acumulación intracelular de sustancias químicas quimioterapéuticas en las células cancerosas después de que esas células hayan desarrollado resistencia múltifármaco para esos productos químicos
Se realizaron experimentos adicionales para determinar si existe sinergia entre TTFields y varios fármacos para varias líneas de células cancerosas, y las FIGS. 9A-9G representan el resultado de algunos de estos experimentos. Más específicamente, la FIG. 9a muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/GFP-Luc a varias concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9B muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células pcGBM2/GFP-Luc a varias concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9C muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a varias concentraciones de Lomustina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9D muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39 a varias concentraciones de temozolomida (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9E muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células GBM39/Luc a varias concentraciones de irinotecán (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). La FIG. 9F muestra cómo la aplicación de TTFields durante 3 días mejora la sensibilidad de las células MDA-MB-235 a varias concentraciones de doxorrubicina (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields). Y la FIG. 9Gmuestra cómo la aplicación de TTFields durante 4 días mejora la sensibilidad de las células U87-MG/eGFP-Luc a varias concentraciones de manosa (en comparación con un control en el que no se aplicaron TTFields).
Hasta la fecha, se ha descubierto sinergia para la combinación de TTFields más Witaferina A para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se descubrió sinergia para la combinación de TTFields más Lomustina para GBM39/Luc, U87-MG/GFP-Luc y pcGBM2/GFP-Luc; se descubrió sinergia para la combinación de TTFields más Irinotecán para GBM39/Luc; y se descubrió sinergia para la combinación de TTFields más Manosa para U87-MG/GFP-Luc. También se descubrieron evidencias de sinergia para la combinación de TTFields más doxorrubicina para MDA-MB-235.
ANÁLISIS
Estudios anteriores se han centrado en los efectos de los TTFields sobre el núcleo (por ejemplo, microtúbulos), septina, mitocondrias y autofagia. Pero se cree que los experimentos descritos en la presente son los primeros en informar de los efectos de TTFields sobre la integridad de la membrana celular del cáncer y demuestran una permeabilidad aumentada de la membrana celular para las células cancerosas (por ejemplo, múltiples líneas celulares de GBM humana) en presencia de TTFields usando varias técnicas de evaluación (por ejemplo, imagenología por bioluminiscencia, imagenología por fluorescencia y microscopía electrónica de barrido).
Las observaciones revelaron una permeabilidad aumentada de la membrana celular para los glioblastomas en presencia de TTFields en múltiples líneas celulares de GBM humano. Los enfoques empleados para validar la hipótesis incluyeron imagenología por bioluminiscencia, imagenología por fluorescencia y microscopía electrónica de barrido. Las observaciones también revelaron una permeabilidad aumentada de la membrana celular para otros tipos de células cancerosas en presencia de TTFields. Los estudios de TTFields en combinación con quimioterapias han demostrado tanto aditividad terapéutica como sinergia. Para este estudio, postulamos que TTFields media una mejor accesibilidad a las células cancerosas. Varios experimentos mostraron la reversibilidad del efecto de TTFields sobre las membranas, demostrando por tanto una relación causal entre los TTFields y el aumento de la permeabilidad de la membrana. Tales observaciones también sugieren que los TTFields podrían usarse para ajustar la accesibilidad de fármacos a las células cancerosas.
La investigación sobre la hipótesis de la permeabilidad celular de la acción de TTFields se inició en parte debido a las observaciones de aumento de bioluminiscencia en células GBM que expresan luciferasa realizadas por TTFields. Aunque no se desea estar limitado por esta teoría, se cree que TTFields indujo una permeabilidad aumentada en las membranas celulares de las células GBM. Se cree que el aumento de la permeabilidad de las células GBM para la D-luciferina según se mide por BLI no se debió a los efectos de los TTFields en la propia luciferasa, sino a una entrada aumentada de su D-luciferina de sustrato en las células diseñadas para expresar la luciferasa de luciérnaga. Además, este descubrimiento fue válido tanto para la luciferasa dependiente de ATP (FLuc) como para la luciferasa independiente de ATP (RLuc). Por lo tanto, a pesar de un informe preliminar que sugiere que el ATP intracelular aumentó en células de carcinoma colorrectal CT26 expuestas a TTFields, la observación de la permeabilidad aumentada de la membrana celular del glioblastoma en el entorno de la exposición a TTFields sugiere un fenómeno independiente. Una expresión o activación aumentada de luciferasa debidas a la exposición a TTFields no podría haber explicado el aumento de la señal de BLI porque en estas células la enzima luciferasa estaba controlada por el mismo promotor que eGFP, y no se observó un aumento en la señal de fluorescencia en las mismas células. Sin embargo, la exposición a TTFields puede afectar al metabolismo celular que se manifestaría por cambios en los niveles de ATP, alteraciones en la morfología de la membrana y desplazamientos en el consumo de oxígeno.
Algunos descubrimientos clave que respaldan la hipótesis de la permeabilidad provienen de los experimentos de validación de dextrano-FITC descritos anteriormente con respecto a las FIGS. 3B-D. La accesibilidad de la membrana celular a sondas pequeñas en el entorno de TTFields se probó con dextranos marcados con FITC, lo que dio como resultado un aumento en la entrada de 4 kDa (radio de Stokes ~1,4 nm) y 20 kDa (radio de Stokes ~3,3 nm) pero no dextranos de 50 kDa (radio de Stokes ~5 nm). Esto sugiere que los campos TTF hacen que las células GBM se vuelvan más permeables a sustancias de hasta 20 kDa, pero no mayores de 50 kDa. Como referencia, los sustratos de luciferina y coelenterazina tienen un peso molecular lo suficientemente pequeño como para ser accesibles a través de la membrana con exposición a TTFields. La D-luciferina (sustrato para la luciferasa de luciérnaga) tiene un peso molecular de 280,3 g/mol (~280 Da), la coelenterazina H (sustrato para la luciferasa de Renilla) tiene un peso molecular de 407,5 g/mol (~408 Da) y la 5- LA tiene un peso molecular de 167,6 g/mol (169 Da), consistentes con los descubrimientos de dextrano-FITC.
Los descubrimientos de SEM descritos en la presente revelan que a baja densidad de siembra, 3 días de exposición a TTFields provocaron un aumento significativo en el número y tamaño de orificios de más de 51,8 nm2 de área, en comparación con la condición sin TTFields, como se ha descrito anteriormente en relación con la FIG. 5. Este corte del tamaño del orificio representa un círculo de radio de 4,1 nm, que es el radio de Stokes de una molécula de FITC-dextrano con un tamaño de 20-40 kDa. Por tanto, la diferencia en la interrupción de la membrana celular visualizada por SEM confirma las observaciones indirectas de los estudios de FITC-dextrano descritos en la presente.
Curiosamente, la exposición de fibroblastos humanos normales (PCS-201) a TTFields no provocó un aumento significativo en la cantidad o el tamaño de los orificios de la membrana celular, lo que sugiere que el efecto de permeabilidad puede tener cierta especificidad para las células cancerosas. Cualitativamente, para las células U87-MG, hubo una clara aparición de estructuras bulbosas similares a vesículas debido a una exposición de 24 h a TTFields con alta densidad de siembra. La apariencia de estas estructuras es consistente con una permeabilidad aumentada en la membrana externa y la inducción de apoptosis y parece haber poca evidencia de un fenotipo apoptótico con una exposición a TTFields de 24 horas. Además, las células PCS-201 de alta densidad no mostraron tales cambios con la exposición a TTFields (datos no mostrados), lo que sugiere de nuevo la especificidad del efecto TTFields para las células cancerosas.
Aunque para los experimentos no se sincronizó el ciclo celular, el tiempo de duplicación de las células U87-MG es de ~48 h y como los TTFields ejercen su efecto antiproliferativo máximo en las células en división, esto podría explicar la falta de apoptosis abundante observada después de un período de exposición de 24 h a TTFields. Una interpretación alternativa puede residir en los informes de que la formación de vesículas celulares puede conferir resistencia a la lisis celular. Un informe anterior en células de glioblastoma no sincronizadas demostró que 72 h de exposición a TTFields indujeron la muerte celular con una marcada proporción de células positivas para anexina V. Usando microscopía electrónica de transmisión, estos informes describieron signos de autofagia, incluyendo autofagosomas, mitocondrias inflamadas y un retículo endoplasmático dilatado. Por el contrario, los resultados en la presente usan SEM para visualizar mejor los efector de TTFields, específicamente sobre la membrana celular plasmática.
El aumento de la permeabilidad de la membrana por TTFields tiene implicaciones clínicas significativas. Usando la plataforma de cocultivo de células GBM humanas superpuestas sobre la parte superior de células de fibroblastos humanos normales, se estudió el impacto de TTFields sobre la absorción de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) en células GBM. La exposición a TTFields dio como resultado un aumento significativo de la captación de 5-ALA en las células GBM en comparación con las células de fibroblastos. En junio de 2017, la Administración de Alimentos y Fármacos aprobó la 5-ALA para uso clínico en los Estados Unidos para ayudar a los neurocirujanos a delinear el borde cerebral normal del tumor durante la resección del glioma. Por lo tanto, será útil tratar previamente a los pacientes con glioma con TTFields antes de la administración de 5-ALA para mejorar la delimitación del margen del tumor infiltrante durante la resección del tumor.
Con respecto a la detección y medición de los efectos de TTFields sobre las células cancerosas, la mayoría de los estudios basados en cultivos celulares hasta la fecha se han centrado en el recuento/viabilidad celular como lectura principal. Esto se basa en el entendimiento predominante de que TTFields interfiere con la mitosis de las células tumorales que se dividen rápidamente, lo que da como resultado la muerte de las células cancerosas.
Además, los estudios de modelado computacional de TTFields en cultivo celular actualmente se basan en el recuento de células como resultado principal del modelo.
La recurrencia de GBM es inevitable y el tiempo mediano hasta la primera recurrencia a pesar de la terapia estándar es de aproximadamente 7 meses. En aplicaciones clínicas de TTFields a pacientes con GBM, los datos sugieren que un mayor cumplimiento y duración del uso de TTFields se correlaciona con una mejor supervivencia. El cumplimiento de TTFields (>75% frente al <75%) fue un predictor independiente de la supervivencia general en el análisis retrospectivo del conjunto completo de datos del ensayo EF-14 y también se descubrió que la duración del uso de TTFields afecta a la supervivencia general. En conjunto, estos datos pueden servir como correlatos clínicos de los efectos observados en el entorno experimental de TTFields basado en cultivos celulares. Concretamente, se observó una correlación entre la duración de la exposición a TTFields y la duración de su efecto sobre la permeabilidad de la membrana celular después de la suspensión de TTFields. En longitudes de exposición a TTFields de 0,5-3 h, la duración en el aumento de BLI (en comparación con las condiciones sin TTFields) duró aproximadamente 5 min. Sin embargo, en exposiciones a TTFields de 12-25 h, esta diferencia en BLI entre las condiciones con TTFields y sin TTFields duró más de 20 min. De igual manera, un nuevo análisis de los datos informados por Ram et al. muestra que el porcentaje de aumento en la supervivencia general (en pacientes tratados con TTFields más temozolomida frente a temozolomida sola) saltó del 32% después de 1 año de la exposición a TTFields al 551% después de 5 años de la exposición a TTFields, respectivamente.
Los resultados descritos en la presente, es decir, que los campos eléctricos alternos aumentan la permeabilidad de la membrana celular, son distintos de los efectos de los TTFields informados anteriormente. Esto debería tener un impacto significativo en las prácticas clínicas y quirúrgicas actuales en el tratamiento de glioblastomas, así como otros tipos de cáncer.
En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la frecuencia de los campos eléctricos alternos fue de 200 kHz. Pero en realizaciones alternativas, la frecuencia de los campos eléctricos alternos podría ser otra frecuencia, por ejemplo, aproximadamente 200 kHz, entre 50 y 500 kHz, entre 25 kHz y 1 MHz, entre 50 y 190 kHz, entre 25 y 190 kHz, o entre 210 y 400 kHz.
En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la intensidad de campo de los campos eléctricos alternos estaba entre 1 y 4 V/cm RMS. Pero en realizaciones alternativas, pueden usarse diferentes intensidades de campo (por ejemplo, entre 0,1 y 10 V/cm).
En los experimentos in vitro descritos anteriormente, los campos eléctricos alternos se aplicaron durante una variedad de intervalos diferentes que van desde 0,5 horas hasta 72 horas. Pero en realizaciones alternativas, puede usarse una duración diferente (por ejemplo, entre 0,5 horas y 14 días). En algunas realizaciones, la aplicación de campos eléctricos alternos puede repetirse periódicamente. Por ejemplo, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse todos los días durante dos horas.
En los experimentos in vitro que usan el sistema Inovitro™ descrito en la presente, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió a intervalos de un segundo entre dos direcciones perpendiculares. Pero en realizaciones alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse a una velocidad más rápida (por ejemplo, a intervalos entre 1 y 1000 ms) o a una velocidad más lenta (por ejemplo, a intervalos entre 1 y 100 segundos).
En los experimentos in vitro que usan el sistema Inovitro™ descrito en la presente, la dirección de los campos eléctricos alternos se cambió entre dos direcciones perpendiculares aplicando un voltaje de CA a dos pares de electrodos que están dispuestos a 90° uno del otro en un espacio 2D en una secuencia alterna. Pero en realizaciones alternativas, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse entre dos direcciones que no son perpendiculares reposicionando los pares de electrodos, o entre tres o más direcciones (suponiendo que se proporcionen pares de electrodos adicionales). Por ejemplo, la dirección de los campos eléctricos alternos puede cambiarse entre tres direcciones, cada una de las cuales está determinada por la colocación de su propio par de electrodos. Opcionalmente, estos tres pares de electrodos pueden colocarse de tal manera que los campos resultantes estén dispuestos a 90° entre sí en el espacio 3D. En otras realizaciones alternativas, los electrodos no necesitan estar dispuestos en pares. Ver, por ejemplo, la colocación de los electrodos descrita en la Patente de Estados Unidos 7.565.205. En otras realizaciones alternativas, la dirección del campo permanece constante.
En los experimentos in vitro que usan el sistema Inovitro™ descrito en la presente, el campo eléctrico se acopló capacitivamente al cultivo porque el sistema Inovitro™ usa electrodos conductores dispuestos en la superficie exterior de las paredes laterales del plato, y el material cerámico de las paredes laterales actúa como un dieléctrico. Pero en realizaciones alternativas, el campo eléctrico podría aplicarse directamente a las células sin acoplamiento capacitivo (por ejemplo, modificando la configuración del sistema Inovitro™ para que los electrodos conductores estén dispuestos en la superficie interior de la pared lateral en lugar de en la superficie exterior de la pared lateral).
Los métodos descritos en la presente también pueden aplicarse en el contexto in vivo aplicando campos eléctricos alternos a una región objetivo del cuerpo de un sujeto vivo, tanto para células de glioblastoma como para otros tipos de células cancerosas. La imposición del campo eléctrico en la región objetivo aumentará la permeabilidad de las membranas celulares en la región objetivo, lo que permitirá que las moléculas que normalmente están bloqueadas o impedidas por la membrana celular pasen a través de la membrana celular. Esto puede lograrse, por ejemplo, colocando electrodos sobre o debajo de la piel del sujeto de tal manera que la aplicación de un voltaje de CA entre subconjuntos seleccionados de esos electrodos imponga los campos eléctricos alternos en la región objetivo del cuerpo del sujeto.
Por ejemplo, en situaciones donde las células relevantes están localizadas en los pulmones del sujeto, un par de electrodos podría colocarse en la parte delantera y trasera del tórax del sujeto, y un segundo par de electrodos podría colocarse en los lados derecho e izquierdo del tórax del sujeto. En algunas realizaciones, los electrodos se acoplan capacitivamente al cuerpo del sujeto (por ejemplo, usando electrodos que incluyen una placa conductora y también tienen una capa dieléctrica dispuesta entre la placa conductora y el cuerpo del sujeto). Pero en realizaciones alternativas, puede omitirse la capa dieléctrica, en cuyo caso las placas conductoras harían contacto directo con el cuerpo del sujeto. En otra realización, los electrodos podrían insertarse por vía subcutánea por debajo de la piel de un paciente. Un generador de voltaje de CA aplica un voltaje de CA a una frecuencia seleccionada (por ejemplo, entre 100 y 200 kHz) entre los electrodos derecho e izquierdo durante un primer período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelas al eje transversal del cuerpo del sujeto. Luego, el generador de voltaje de CA aplica un voltaje de Ca a la misma frecuencia (o una frecuencia diferente) entre los electrodos delantero y trasero durante un segundo período de tiempo (por ejemplo, 1 segundo), lo que induce campos eléctricos alternos donde los componentes más significativos de las líneas de campo son paralelas al eje sagital del cuerpo del sujeto. Esta secuencia de dos pasos se repite luego durante la duración del tratamiento. Opcionalmente, pueden incluirse sensores térmicos en los electrodos, y el generador de voltaje de CA puede configurarse para disminuir la amplitud de los voltajes de CA que se aplican a los electrodos si la temperatura detectada en los electrodos es demasiado alta. En algunas realizaciones, pueden añadirse e incluirse en la secuencia uno o más pares de electrodos adicionales. En realizaciones alternativas, solo se usa un único par de electrodos, en cuyo caso no se cambia la dirección de las líneas de campo. Tener en cuenta que cualquiera de los parámetros para esta realización in vivo (por ejemplo, frecuencia, intensidad de campo, duración, tasa de cambio de dirección y colocación de los electrodos) puede variarse como se ha descrito anteriormente en relación con las realizaciones in vitro. Pero debe tenerse cuidado en el contexto in vivo para garantizar que el campo eléctrico permanezca seguro para el sujeto en todo momento.
Pueden preverse fácilmente una amplia variedad de aplicaciones para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares en el contexto in vivo. En un ejemplo, puede inducirse un aumento localizado de la absorción del fármaco por parte de las células tumorales aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, la captación del fármaco por células tumorales resistentes a múltiples fármacos puede restaurarse aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de quimioterapias u otros agentes antineoplásicos. En otro ejemplo, puede evitarse el desarrollo de metástasis resistentes a múltiples fármacos aplicando campos eléctricos alternos a regiones que son propensas a metástasis durante un período de tiempo (por ejemplo, 12 o 24 horas) antes y durante la administración de un fármaco apropiado (independientemente de su el sujeto tiene un tumor primario que se está tratando con campos eléctricos alternos).
La FIG. 10A representa una primera relación adecuada en la cadencia entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la introducción de la sustancia en las inmediaciones de la célula cancerosa en el contexto in vitro; o entre la aplicación del campo eléctrico alterno y la administración de la sustancia a un paciente vivo. Basándose en los datos descritos anteriormente en relación con las FIGS. 7A-7D y 8A, y suponiendo que la sustancia se introduce o administra en un momento dado t=0, el campo eléctrico alterno puede comenzar después del tiempo dado y continuar durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 12 horas) mientras la sustancia todavía está disponible en las inmediaciones de la célula. En esta situación, la permeabilidad comenzará a aumentar después de que comience el campo eléctrico alterno, y este aumento de permeabilidad permitirá que la sustancia se introduzca en las células correspondientes. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería a la administración de un agente quimioterapéutico a un paciente, seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, durante 12 horas).
Alternativamente, como se representa en la FIG. 10B, el campo eléctrico alterno puede comenzar antes del momento dado (por ejemplo, 1 hora antes de t=0) y continuar durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, hasta 12 horas después de t=0) mientras la sustancia todavía está disponible en las proximidades de la célula. En esta situación, la permeabilidad de las células relevantes comenzará a aumentar antes de que la sustancia llegue a las proximidades de la célula (o antes de que la sustancia se administre a un paciente vivo). Esto permitirá que la sustancia atraviese la membrana celular inmediatamente después de su llegada a las proximidades de la célula. En el contexto de la quimioterapia, esto correspondería al inicio de la aplicación de los campos eléctricos alternos, seguido de la administración del agente quimioterapéutico mientras se siguen aplicando los campos eléctricos alternos, seguido de la aplicación continuada de los campos eléctricos alternos durante un intervalo de tiempo adicional (por ejemplo, hasta 12 horas después del momento en el que se administró el agente quimioterapéutico).
Tener en cuenta que los intervalos de tiempo analizados anteriormente en relación con las FIGS. 10Ay 10B puede ser ininterrumpido o puede incluir descansos que son preferiblemente cortos. Por ejemplo, suponiendo que el intervalo de tiempo es de 12 horas, podría satisfacerse con un único bloque ininterrumpido de 12 horas. Alternativamente, el intervalo de 12 horas podría cumplirse aplicando campos eléctricos alternos durante 6 horas, seguido de un descanso de 1 hora, seguido de la aplicación de campos eléctricos alternos durante 6 horas adicionales (mientras la sustancia todavía está disponible en las proximidades de la célula). Tener en cuenta también que en el contexto de las FIGS. 10A y 10B, cuando la sustancia se administra a un paciente vivo, la administración de la sustancia puede realizarse usando cualquiera de una variedad de enfoques que incluyen, pero no se limitan a, por vía intravenosa, oral, subcutánea, intratecal, intraventricular e intraperitoneal.
La frecuencia óptima, la intensidad de campo y las características de conmutación pueden determinarse experimentalmente para cada combinación de un tipo dado de célula huésped y un tipo dado de sustancia que se va a administrar a través de la membrana celular. En algunas realizaciones preferidas, la frecuencia es menor de 190 kHz (por ejemplo, entre 50 y 190 kHz o entre 25 y 190 kHz). En otras realizaciones preferidas, la frecuencia está entre 210 y 400 kHz.
Un enfoque existente para tratar tumores (por ejemplo, glioblastoma) consiste en aplicar al tumor campos eléctricos alternos a frecuencias de entre 50 y 500 kHz, preferiblemente entre 100 y 300 kHz. Para el glioblastoma, la frecuencia más preferida es de 200 kHz. Los campos eléctricos alternos a estas frecuencias se conocen como TTFields y se describen en las Patentes de Estados Unidos 6.868.289 y 7,565,205. Brevemente, esas dos solicitudes describen la alteración de células en división durante la mitosis. La eficacia de TTFields mejora cuando la dirección del campo eléctrico se cambia periódicamente, cuando la intensidad del campo en por lo menos una parte del tumor es de por lo menos 1 V/cm y cuando los campos se aplican durante largos períodos de tiempo (por ejemplo, semanas o meses) con la menor cantidad de descansos posible.
Pueden surgir situaciones en las que sea deseable tratar el tumor con TTFields y también administrar una sustancia a través de las membranas celulares de las células tumorales (por ejemplo, para ayudar a que una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco de quimioterapia atraviese las membranas celulares para proporcionar una línea adicional de ataque contra el tumor). En algunas situaciones, puede ser posible usar una única frecuencia de un campo eléctrico alterno para tratar el tumor y aumentar la permeabilidad de las membranas celulares. En otras situaciones, puede ser deseable usar campos eléctricos alternos con diferentes frecuencias: una primera frecuencia que se selecciona para proporcionar resultados mejorados para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, y una segunda frecuencia que se selecciona para proporcionar resultados mejorados para la acción antitumoral de los TTFields.
Las FIGS. 11Ay 11B representan los resultados de dos experimentos in vitro en células de glioblastoma U-87 MG. Más específicamente, la FIG. 11A representa los resultados de un primer experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células U-87 MG; y la FIG. 11B representa los resultados de un segundo experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células U-87 MG.
En el primer experimento, las células U-87 MG se sometieron a campos eléctricos alternos con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS a diferentes frecuencias durante un período de 72 horas a una temperatura ambiente de 18° C. Después de este período de 72 horas, el número de células que estaban presentes en la muestra para cada una de las diferentes frecuencias se midió usando citometría de flujo. Como se ve en la FIG. 11A, se observó el número más bajo de células (lo que indica el nivel más alto de citotoxicidad) para la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz.
En el segundo experimento, se midió la permeabilidad para 7-AAD (una sustancia química fluorescente con un peso molecular de 1270,43 g/mol que normalmente no pasa fácilmente a través de las membranas celulares intactas). En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante un total de 24 horas, a una temperatura ambiente de 18° C y una temperatura de plato de 37° C. Después de las primeras 23,75 horas, se añadió 7-AAD al cultivo y se incubó durante 15 minutos, tiempo durante el cual continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Después de este período de 15 minutos, se terminó la aplicación de campo eléctrico alterno y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos adicionales. seguido de análisis por citometría de flujo del porcentaje de células con acumulación aumentada de 7-AAD fluorescente para cada una de las diferentes frecuencias. Como se ve en la FIG. 11B, se observó el mayor porcentaje de células con acumulación aumentada de 7-AAD (lo que indica el mayor nivel de permeabilidad) para la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 300 kHz.
Las FIGS. 12A y 12B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11A/B, excepto que se usaron células de sarcoma uterino MES-SA. Más específicamente, la FIG. 12A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MES-SA. Se observó el número más bajo de células MES-SA (lo que indica el nivel más alto de citotoxicidad) para la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 100 kHz. La FIG. 12B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA. El mayor porcentaje de células MES-SA con acumulación aumentada de 7-AAD (lo que indica el mayor nivel de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 150 kHz.
La FIG. 12C representa los resultados de otro experimento realizado para determinar cómo los campos eléctricos alternos de 150 kHz afectan a la permeabilidad de las membranas celulares de las células MES-SA para la doxorrubicina (543,52 g/mol). En este experimento, las células MES-SA se trataron con un campo eléctrico alterno a 150 kHz con una intensidad de campo de 1,62 V/cm RMS durante 24 horas. Después de las primeras 23 horas, se añadió doxorrubicina a una concentración de 10 pM y se incubó durante una hora, tiempo durante el cual continuaron los campos eléctricos alternos (para completar el período de 24 horas). Luego se midió la acumulación intracelular de doxorrubicina. La acumulación intracelular de doxorrubicina aumentó más de 2 veces para la muestra que se trató con el campo eléctrico alterno de 150 kHz.
Las FIGS. 13A y 13B representan los resultados de dos experimentos in vitro similares a los descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11A/B, excepto que se usaron células de adenocarcinoma de mama MCF-7. Más específicamente, la FIG. 13A representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el nivel más alto de citotoxicidad a las células MCF-7. El número más bajo de células MCF-7 (que indica el nivel más alto de citotoxicidad) se observó en la muestra que se sometió a campos eléctricos alternos a 200 kHz. La FIG. 13B representa los resultados de un experimento para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células MCF-7. El porcentaje más alto de células MCF-7 con acumulación aumentada de 7-AAD (lo que indica el nivel más alto de permeabilidad) se observó en la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 150 kHz.
Los experimentos descritos anteriormente en relación con las FIGS. 11-13 revelan que la frecuencia óptima para inducir la permeabilidad celular es diferente de la frecuencia óptima para inducir la citotoxicidad. Más específicamente, para el glioblastoma, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 250 kHz y 350 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 150 kHz y 250 kHz. Para el sarcoma uterino, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 125 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 75 kHz y 125 kHz. Y para el adenocarcinoma de mama, la primera frecuencia óptima (para inducir la permeabilidad celular) está entre 75 kHz y 175 kHz; y la segunda frecuencia óptima (para inducir citotoxicidad) está entre 100 kHz y 300 kHz. Los pares de intervalos de frecuencia para otros tipos de cáncer pueden determinarse experimentalmente.
Cuando se usan diferentes frecuencias para inducir la permeabilidad celular e inducir la citotoxicidad, la frecuencia de citotoxicidad se aplica preferiblemente durante la máxima cantidad de tiempo que el paciente pueda tolerar cómodamente. Preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante por lo menos una semana. Más preferiblemente, la frecuencia de citotoxicidad se aplica durante muchos meses. Opcionalmente, el intervalo de tiempo durante el cual se aplica la frecuencia de citotoxicidad puede dividirse en una pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos que están separados por descansos, donde la pluralidad de intervalos de tiempo no contiguos suma colectivamente por lo menos una semana. Por el contrario, la frecuencia para inducir la permeabilidad se aplica preferiblemente de tal manera que la permeabilidad sea alta cuando la sustancia relevante se encuentre en las proximidades de las células objetivo (por ejemplo, FIGS. 10A-10B). La aplicación de estas dos frecuencias diferentes puede lograrse usando un solo generador de voltaje de CA que puede controlarse para generar una primera frecuencia para inducir la permeabilidad celular en ciertos momentos y una segunda frecuencia para inducir la citotoxicidad en otros momentos. Puede usarse el mismo conjunto de matrices de transductores (es decir, electrodos) para aplicar los campos eléctricos alternos a estas dos frecuencias (dependiendo de qué frecuencia aplique el generador de voltaje de CA).
La FIG. 15 es un diagrama de bloques de un aparato que genera una primera frecuencia para inducir permeabilidad celular y una segunda frecuencia para inducir citotoxicidad. El aparato incluye un generador de voltaje CA 44 que es similar a la unidad generadora de campo Optune® convencional, pero tiene la capacidad de operar a dos frecuencias diferentes. Cada una de esas frecuencias está entre 50 y 500 kHz. Esta capacidad puede implementarse, por ejemplo, usando relés para cambiar un primer conjunto de componentes o un segundo conjunto de componentes en el circuito convencional que genera el voltaje de CA y ajustando la frecuencia operativa de un oscilador. El generador de voltaje de CA 44 está configurado para emitir la primera frecuencia o la segunda frecuencia dependiendo del estado de una entrada de control. Cuando la entrada de control está en un primer estado, el generador de voltaje de CA 44 emite la primera frecuencia, y cuando la entrada de control está en un segundo estado, el generador de voltaje de CA 44 emite la segunda frecuencia. Un controlador 42 está programado para colocar la entrada de control en el segundo estado de tal manera que el generador de voltaje de CA 44 emita la segunda frecuencia. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. En la realización representada en la FIG. 15, la solicitud llega a través de una interfaz de usuario 40 que puede implementarse usando cualquiera de una variedad de enfoques convencionales que incluyen, entre otros, un botón pulsador, una pantalla táctil, etc. En realizaciones alternativas, la solicitud puede llegar a través de RF (por ejemplo, Bluetooth, WiFi, etc.) desde una tableta, teléfono inteligente, etc.
Tras recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, por lo menos 1 hora, por lo menos 12 horas o por lo menos 24 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 colocará la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.
Opcionalmente, el generador de voltaje de CA 44 puede configurarse para dar salida a una o más frecuencias adicionales (por ejemplo, una tercera frecuencia, una cuarta frecuencia, etc.), dependiendo del estado de la entrada de control. Preferiblemente, cada una de estas frecuencias adicionales se selecciona para inducir citotoxicidad. En estas realizaciones, el controlador 42 está programado para hacer circular la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales antes de que llegue la solicitud. El controlador 42 también está programado para aceptar una solicitud para cambiar a la primera frecuencia. Tras recibir la solicitud, el controlador 42 colocará la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, por lo menos 1 hora, por lo menos 12 horas, o por lo menos 24 horas). Después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, el controlador 42 volverá a alternar la entrada de control a través de los estados que hacen que el generador de voltaje de CA 44 emita la segunda frecuencia y una o más frecuencias adicionales.
El sistema representado en la FIG. 15 es particularmente útil cuando una persona tiene un tumor que está siendo tratado con una terapia combinada que incluye TTFields y quimioterapia. En esta situación, el sistema funciona la mayor parte del tiempo en la segunda frecuencia para proporcionar el máximo efecto de citotoxicidad. Pero cuando una persona visita una clínica de quimioterapia para recibir una dosis de quimioterapia, el personal sanitario (o el usuario) activa la interfaz de usuario 40 para cambiar el sistema a la primera frecuencia que promueve la permeabilidad. En esta situación, la activación de la interfaz de usuario podría realizarse, por ejemplo, una hora antes del inicio esperado de la quimioterapia, o poco tiempo después del inicio real de la quimioterapia.
Alternativamente, tras recibir la solicitud (por ejemplo, desde la interfaz de usuario 40), el controlador 42 puede controlar la entrada de control para que el generador de voltaje de CA 44 emita la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, 1 hora), luego alternar entre la segunda frecuencia y la primera frecuencia (por ejemplo, alternando cada hora). Eventualmente (por ejemplo, cuando la sustancia relevante se ha agotada del torrente sanguíneo del paciente), el controlador 42 controla la entrada de control para que el generador de voltaje de CA 44 vuelva a emitir la segunda frecuencia.
Un conjunto de electrodos (no mostrados) que son similares a los electrodos convencionales usados con Optune® están conectados a la salida del generador de voltaje de CA 44.
La FIG. 14 representa los resultados de otro experimento más para determinar la frecuencia que proporciona el mayor aumento en la permeabilidad de las membranas celulares de las células GBM39/Luc. En este experimento, las células se trataron con un campo eléctrico alterno a diferentes frecuencias en presencia de dextrano FITC de 4 kDa (que normalmente no pasa fácilmente a través de las membranas celulares intactas) durante 2 días. Como se ve en la FIG. 14, se observó el nivel más alto de fluorescencia de dextrano-FITC (que indica el nivel más alto de permeabilidad) para la muestra que se sometió a un campo eléctrico alterno a 100 kHz.
Los datos experimentales analizados en relación con las FIGS. 11-14 contienen información que es útil para inducir la permeabilidad celular en la mayor medida posible (para permitir que una mayor cantidad de la sustancia relevante atraviese la membrana celular) sin tener en cuenta ninguna citotoxicidad que pueda producirse como efecto secundario. En estas situaciones, el campo eléctrico alterno se aplica preferiblemente a una única frecuencia, seleccionada para inducir el nivel más alto de permeabilidad celular. En algunas situaciones (por ejemplo, GBM39/Luc, sarcoma uterino y adenocarcinoma de mama), esta frecuencia estará entre 50 y 190 kHz; y en otras situaciones (por ejemplo, glioblastoma U-87 MG), esta frecuencia estará entre 210 y 400 kHz.
Para aquellas sustancias que ordinariamente pueden atravesar la membrana celular en una medida significativa, pueden usarse las técnicas descritas en la presente para aumentar la permeabilidad de la membrana celular para aumentar la cantidad de sustancia que se introducirá en la célula. Esto puede mejorar el resultado terapéutico proporcionado por esas sustancias. Los ejemplos de esta clase de sustancias analizadas anteriormente incluyen bromuro de etidio (tamaño = 394 Da), doxorrubicina (tamaño = 544 Da), mitoxantrona (tamaño = 445 Da), etc.
Y, en particular, las técnicas descritas en la presente también pueden usarse para permitir que sustancias que normalmente no podrían atravesar la membrana celular en una medida significativa se introduzcan en la célula. Los ejemplos de esta clase de sustancias analizadas anteriormente incluyen (a) compuestos que tienen por lo menos 1,2 kDa (por ejemplo, 7-AAD, cuyo tamaño es 1,27 kDa), (b) compuestos que tienen por lo menos 4 kDa (por ejemplo, dextrano-FITC de 4kDa, y (c) compuestos de por lo menos 20 kDa (por ejemplo, dextrano-FITC de 20 kDa), (d) material genético que incluye, entre otros, constructos de ADN plasmídico superenrollado, ARNip y ARNhc, (e) sistema de edición del genoma que incluye pero no está restringido a meganucleasas, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de transcripción (TALEN) y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR/Cas9), (f) cualquier forma de un anticuerpo que incluye pero no se limita a IgG, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, sdAb. Dicho anticuerpo puede estar no conjugado o conjugado con un agente citotóxico, toxina, fluoróforo, puntos cuánticos y enzimas, (g) moléculas cargadas y (h) moléculas pequeñas, entidades terapéuticas, péptidos y proteínas que normalmente no atraviesan la membrana celular o se destruyen durante la endocitosis. Proporcionar la capacidad de hacer que estas sustancias atraviesen la membrana celular significa que los compuestos que anteriormente pueden haber sido rechazados como ineficaces en un proceso de selección de compuestos (debido a su incapacidad para atravesar la membrana celular) pueden repentinamente volverse utilizables con propósitos terapéuticos cuando se usan en combinación. con un campo eléctrico alterno que mejora la permeabilidad celular.
Los métodos descritos en la presente también pueden ser útiles más allá del contexto de las células cancerosas. Más específicamente, los métodos descritos en la presente pueden ser útiles para administrar moléculas grandes (que normalmente no pasarían a través de la membrana celular relevante) a través de una membrana celular de ciertas otras células no cancerosas (por ejemplo, células renales, células pulmonares, células hepáticas, células cardíacas, células cerebrales, células musculares, células de la médula ósea, etc.). La administración de tales fármacos puede mejorarse aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo correspondiente durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de tales fármacos. Los candidatos para tales fármacos incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiepilépticos y fármacos psicotrópicos (por ejemplo, olanzapina, 9-OH risperidona y otras variedades de risperidona, etc.).
En otro ejemplo más, puede ser posible lograr una mejora localizada de la captación de fármacos en bacterias aplicando campos eléctricos alternos a la parte del cuerpo relevante durante un período de tiempo (por ejemplo, 24 horas) antes y durante la administración de un antibiótico adecuado. En situaciones en las que una bacteria en particular ha evolucionado para ser resistente a los fármacos o resistente a múltiples fármacos (por ejemplo, sobre la base de un mecanismo de acción que implica la membrana celular), la aplicación de campos eléctricos alternos puede aumentar la permeabilidad de la membrana celular de la bacteria hasta el punto donde puede superarse la resistencia. Se pueden usar enfoques similares para mejorar la captación de fármacos para combatir la meningitis, la neumonía, la endocarditis infecciosa, etc. Tenga en cuenta que en el contexto in vivo, los campos eléctricos alternos se pueden aplicar a una región objetivo (por ejemplo, los pulmones) que no tiene tumores. Alternativamente, los campos eléctricos alternos pueden aplicarse a una región objetivo que contenga un tumor (por ejemplo, un cerebro que incluye un glioblastoma).
Aunque la presente invención se ha divulgado con referencia a ciertas realizaciones, son posibles numerosas modificaciones, alteraciones y cambios a las realizaciones descritas sin apartarse del alcance de la presente invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, se pretende que la presente invención no se limite a las realizaciones descritas, sino que tenga el alcance completo definido por el lenguaje de las reivindicaciones enumeradas a continuación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudios de cultivos celulares: se usaron dos líneas de GBM derivadas de pacientes (GBM2, GBM39), una línea celular de GBM humana disponible comercialmente (U87-MG de ATCC, Manassas, VA, USA), así como una línea celular de astrocitoma murino (KR158B; un obsequio del Dr. Duane Mitchell del Departamento de Neurocirugía de la Facultad de Medicina de la Universidad de Florida). Las líneas celulares de glioblastoma U87-MG humano, PCS-201 humano y KR158B murino se cultivaron en DMEM (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)/FBS al 10%/y 1x de antibiótico-antimicótico (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). GBM2 y GBM39 se cultivaron en un medio definido libre de suero cuya composición se ha descrito anteriormente.
Siembra de células en cubreobjetos de vidrio para experimentos de TTFields: Brevemente, las células en cultivo se tripsinizaron a través de protocolos estándar y se suspendieron de 10000-50000 células individuales en 200 o 75 |jl de DMEM/FBS al 10%/antibiótico-antimicótico 1x y luego se sembraron en el centro de un cubreobjetos de vidrio Thermanox™ de 22 mm o 12 mm de diámetro respectivamente (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Las células se incubaron durante la noche en una incubadora humidificada con aire al 95%/CO2 al 5% a 37° C. Una vez que las células se hubieron adherido al cubreobjetos, se añadieron 2 ml o 1 ml de DMEM/FBS al 10%/antibiótico-antimicótico 1x por pocillo de placas de 6 o 12 pocillos, respectivamente. A menos que se indique lo contrario en la sección Resultados, las células se dejaron crecer en el cubreobjetos durante dos o tres días (para garantizar que las células estuvieran en la fase de crecimiento) antes de transferirlas a platos de cerámica de un aparato de TTFields in vitro inovitro™ (Novocure Inc., Haifa, Israel). Las condiciones de crecimiento (es decir, el tiempo que se permitió que las células crecieran en condiciones expuestas a TTFields frente a las no expuestas) se especifican en la sección Resultados o en las leyendas de las figuras correspondientes.
Aparato de campo para el tratamiento de tumores in vitro: Los cubreobjetos se transfirieron a un plato de cerámica del sistema inovitro™, que a su vez se montó sobre placas base de inovitro™ (Novocure Ltd., Haifa, Israel). Se aplicaron campos de tratamiento de tumores a 200 kHz (1-4 V/cm) a través de un generador de energía inovitro™. La temperatura ambiente de la incubadora osciló entre 20 y 27° C con una temperatura objetivo de 37° C en los platos de cerámica tras la aplicación de TTFields. La duración de la exposición a TTFields duró entre 0,5 y 72 h, después de lo cual se retiraron los cubreobjetos y se procesaron para los bioensayos apropiados (ver a continuación). Para los experimentos de reversibilidad, los cubreobjetos expuestos a TTFields se transfirieron a una incubadora normal sin exposición a TTFields durante 24 h (período fuera de TTFields para evaluar la reversibilidad del efecto del TTFields sobre la permeabilidad de la membrana celular) antes del procesamiento para los bioensayos apropiados. Los medios de cultivo se cambiaron manualmente cada 24 h durante los experimentos para tener en cuenta la evaporación. Los experimentos de control correspondientes (sin TTFields) se realizaron colocando cubreobjetos equivalentes dentro de placas de 6 pocillos o de 12 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada convencional (37° C, 95% de aire/5% de CO2) y células cultivadas en paralelo con los cubreobjetos expuestos a TTFields. A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron en por lo menos muestras por triplicado por condición y por punto temporal.
Ensayo de recuento de células mediante hemocitómetro: La preparación de las células para el recuento se logró mediante protocolos establecidos y se visualizó en un microscopio de sobremesa Zeiss PrimoVert (Dublín, CA, USA). A menos que se indique lo contrario, los recuentos de células se realizaron en suspensiones de células individuales tripsinizadas con un hemocitómetro y se calculó la media de las cuatro mediciones de recuento de células y se redondeó al número entero más próximo.
Imagenología por bioluminiscencia: Para todo el trabajo de bioluminiscencia, usamos GBM2, GBM39 y U87-MG modificados genéticamente, por lo que las células de glioblastoma se transfectaron con vectores lentivirales que expresaban luciferasa de luciérnaga (fLuc para GBM39) o una proteína de fusión de GFP y luciferasa de luciérnaga (GFP/fLuc para GBM2 y eGFP-fLuc para U87-MG) o una fusión de proteína de fluorescencia rojaluciferasa de Renilla (RLuc-RL8 para KR158B). Las células se transdujeron usando sobrenadantes virales y la expresión de luciferasas se confirmó midiendo la actividad de luciferasa celular (IVIS Spectrum; Perkin Elmer, Waltman, MA) en presencia de D-Luciferina (concentración final de 0,3 mg/ml) para fLuc y coelenterazina (1 pg/ml) para rLuc.
Microscopía electrónica de barrido (SEM): Se depositaron células U87-MG/eGFP-fLuc o fibroblastos PCS-201 a 5000 (condiciones de siembra baja) a 50000 (condiciones de siembra alta) en cubreobjetos de vidrio de 13 mm y luego se prepararon para experimentos de TTFields. Las células se cultivaron en condiciones estándar de incubadora de cultivo de tejidos (37° C, 95% de O2 , 5% de C O2). Al final de los experimentos expuestos a TTFields y no expuestos a TTFields (1 día para condiciones de siembra alta y 3 días para condiciones de siembra baja), los cubreobjetos se procesaron para SEM. Todos los análisis de ROI se realizaron de manera ciega en la que ni el individuo responsable de la adquisición de imágenes SEM ni el que realizaba los análisis de datos conocían las condiciones experimentales de las muestras. Un tercer individuo tenía posesión de las identidades de la muestra.
Reactivos químicos: A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos se adquirieron de Selleckchem Inc. (Houston, TX, USA), Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La luciferina de luciérnaga purificada o la luciferasa de luciérnaga (SRE0045-2MG), así como el kit de apoptosis Ethidium D (11835246001) se adquirieron de Sigma Aldrich Inc (St. Louis, MO). El dextrano-FITC de pesos moleculares de 4, 20 y 50 kDa (FD4, FD20 y FD50) también se adquirió de Sigma Aldrich Inc. El ácido 5-aminolevulínico (5-ALA, AAA16942ME) y el kit AnnexinV-APC (50712549) se adquirieron de Thermo-Fisher Scientific Inc (Waltham, MA).
Análisis estadístico: Se usó el software PRISM 7.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) para determinar si los datos tenían una distribución normal. Los datos con distribución normal se analizaron con comparaciones de medias de prueba t de Student bidireccional o análisis de varianza (ANOVA), mientras que los datos con distribución no normal se analizaron con análisis no paramétricos (por ejemplo, comparación de medianas con la prueba U de Mann-Whitney). El nivel de significancia estadística se fijó en alfa = 0,05. Se emplearon correcciones post-hoc de Bonferroni o Dunnet para ajustar alfa para comparaciones múltiples. Todos los datos se presentan como intervalo, media ± desviación estándar, mediana (rango intercuartílico) o porcentaje. En todas las figuras, los niveles de diferencias estadísticamente significativas están representados por: *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.

Claims (1)

REIVINDICACIONES
1. Un aparato para tratar un tumor en el cuerpo de un sujeto y facilitar la administración de una sustancia a través de las membranas celulares en el cuerpo del sujeto, el aparato comprendiendo:
un generador de voltaje de CA (44) capaz de generar un campo eléctrico alterno a una primera frecuencia entre 50 kHz y 500 kHz y una segunda frecuencia entre 50 kHz y 500 kHz, y que tiene una entrada de control, la segunda frecuencia siendo diferente de la primera frecuencia, en donde el generador de voltaje de CA (44) está configurado para emitir el campo eléctrico alterno a la primera frecuencia cuando la entrada de control está en un primer estado y a la segunda frecuencia cuando la entrada de control está en un segundo estado; y
un controlador (42) programado para (a) colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno a la segunda frecuencia, (b) aceptar una solicitud para cambiar el campo eléctrico alterno a la primera frecuencia, (c) tras recibir la solicitud, colocar la entrada de control en el primer estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno a la primera frecuencia durante un intervalo de tiempo, y (d) después de que haya transcurrido el intervalo de tiempo, colocar la entrada de control en el segundo estado para que el generador de voltaje de CA (44) emita el campo eléctrico alterno a la segunda frecuencia;
caracterizado porque el intervalo de tiempo es de por lo menos 12 horas.
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