IT202100000119A1 - Dispositivo e farmaco antitumorale per il trattamento di cellule neoplastiche - Google Patents
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Description
DISPOSITIVO E FARMACO ANTITUMORALE PER IL TRATTAMENTO DI CELLULE NEOPLASTICHE.
DESCRIZIONE
L?invenzione concerne un dispositivo configurato per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio di un organismo vivente, particolarmente l?uso di un dispositivo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in combinazione con un farmaco antitumorale.
Le neoplasie o tumori originano dall'alterazione di cellule che si moltiplicano e diffondono nell?organismo sfuggendo ai meccanismi di regolazione. Esistono numerose tipologie di neoplasie che possono colpire sostanzialmente qualunque organo. Esse vengono solitamente classificate in benigne o maligne a seconda della capacit? delle cellule neoplastiche di invadere le strutture circostanti e gli organi pi? lontani. Il termine neoplasia comprende, oltre ai tumori degli organi solidi, anche i tumori delle cellule del sangue, come ad esempio linfomi e leucemie.
Nonostante i grandi successi in campo clinico ottenuti negli ultimi decenni grazie a mirate misure di prevenzione, diagnostica precoce e terapia, le neoplasie continuano ad essere tra le prime cause di morte e deterioramento della qualit? della vita.
La terapia dei tumori si basa essenzialmente su chirurgia, soprattutto nelle forme localizzate, radioterapia e farmaci.
Il glioblastoma multiforme (GBM) rappresenta uno dei tumori pi? aggressivi per l?uomo a causa dell?abilit? delle cellule neoplastiche di GBM di infiltrarsi nel parenchima adiacente la lesione tumorale I pazienti affetti da GBM sono solitamente sottoposti a resezione, possibilmente completa, della lesione mediante chirurgia, seguita da radioterapia e chemioterapia con il farmaco temozolomide, un farmaco antitumorale alchilante
Tuttavia, nonostante l?approccio terapeutico su pi? fronti, il GBM ? caratterizzato da un elevato tasso di ricorrenza, resistenza farmacologica ed un devastante deterioramento neurologico (Wilson et al, 2014).
Il GBM ? un tumore particolarmente infiltrante, una resezione completa chirurgica della lesione ? quindi sostanzialmente impossibile da realizzare, cosicch? la quasi totalit? dei pazienti sviluppa una recidiva e presenta un tempo di sopravvivenza di soli 14 mesi (Becker et al, 2012). Ulteriormente, a 5 anni dall?intervento, meno del 5% dei pazienti ? ancora vivo
Risulta quindi evidente quanto sia necessario sviluppare nuove strategie terapeutiche per migliorare l?efficacia dei farmaci in uso e diminuire gli effetti avversi corrispondenti, migliorando cos? la qualit? della vita del paziente.
In tal senso, una delle terapie pi? promettenti comprende l?uso di campi elettromagnetici non-ionizzanti (EMFs).
Tale terapia ? particolarmente promettente in quanto sembra possedere un ottimo grado di sicurezza, bassa tossicit? e possibilit? di combinazione con terapie farmacologiche convenzionali
Negli ultimi anni, diverse tecnologie EMFs sono state testate e hanno dimostrato possedere un buon livello di efficacia nei confronti di diverse tipologie di tumori sia quando utilizzate da sole, che in combinazione con la chemioterapia
? stato individuato che range di frequenze differenti innescano nelle cellule meccanismi di risposta differenti che possono portare alla riduzione della proliferazione cellulare delle cellule neoplastiche, agendo sulla formazione e sulla stabilit? del fuso mitotico di tali cellule
Nel 2011 poi, l?American Food and Drug Administration ha approvato l?utilizzo di Tumor Treating Field (TTFields) per il trattamento di pazienti con GBM ricorrente.
Diversi documenti di arte nota sono stati pubblicati in tal senso, come a titolo di esempio i documenti US2020269041 e EP3439733.
Descrizione dell?invenzione
Lo scopo della presente invenzione ? quello di realizzare un dispositivo ed un metodo alternativi a quelli di tipo noto, atti a bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio di un organismo vivente.
In particolare, ? uno scopo della presente invenzione che tali dispositivo e metodo siano utilizzabili nel trattamento di neoplasie anche di tipo aggressivo, come il glioblastoma multiforme.
Ancora, ? uno scopo della presente invenzione, che tali metodo e utilizzo del dispositivo in un paziente possano essere anche di tipo non invasivo.
Ulteriormente, ? scopo della presente invenzione realizzare un farmaco antitumorale che presenti maggiore efficacia terapeutica, ridotto profilo tossicologico, migliorando la qualit? della vita del paziente.
Gli scopi suddetti vengono raggiunti da un farmaco antitumorale come descritto nella rivendicazione principale.
Gli scopi sono inoltre raggiunti da un dispositivo come riportato in rivendicazione 11.
Ulteriormente, gli scopi sono anche raggiunti da un metodo per il trattamento di cellule neoplastiche, secondo quanto verr? descritto in seguito.
In particolare, la presente invenzione riguarda un farmaco antitumorale per l?uso in un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, in cui tale metodo comprende il trattamento delle suddette cellule neoplastiche con il farmaco antitumorale precedentemente, contemporaneamente o successivamente all?applicazione di onde di corrente elettrica alla regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, ed in cui le onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
Preferibilmente, tali onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda con frequenza fondamentale compresa tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz.
Molto pi? preferibilmente, tali onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda con frequenza fondamentale di circa 4 MHz.
Si specifica che l?applicazione di tali onde di corrente elettrica verr? definita nel presente documento anche con il nome di Quantum Molecular Resonance o con la sigla QMR.
Secondo un aspetto della presente invenzione inoltre, tali onde di corrente elettrica presentano una forma d?onda sinusoidale.
Secondo un aspetto dell?invenzione, tale forma d?onda ? distorta per la presenza di armoniche.
Secondo un altro aspetto della presente invenzione, la forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il trattamento delle cellule neoplastiche con il farmaco antitumorale ? realizzato contemporaneamente o successivamente all?applicazione delle suddette onde di corrente elettrica.
Preferibilmente, secondo un aspetto dell?invenzione, il trattamento delle cellule neoplastiche con il farmaco antitumorale ? realizzato contemporaneamente all?applicazione delle onde di corrente elettrica alla regione bersaglio mentre le cellule neoplastiche sono trattate con tale farmaco antitumorale.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il suddetto farmaco antitumorale comprende temozolomide.
Secondo un aspetto della presente invenzione, le cellule neoplastiche comprendono cellule di glioblastoma.
Particolarmente, la regione bersaglio appartiene ad un organismo vivente, preferibilmente un soggetto umano.
La suddetta regione bersaglio comprende preferibilmente il sistema nervoso centrale.
Fa parte della presente invenzione anche un dispositivo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, in cui tale dispositivo ? configurato per generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz, molto pi? preferibilmente di circa 4 MHz, ed in cui tale forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche.
Tale dispositivo comprende uno o pi? elettrodi collegati ad almeno un circuito di radiofrequenza atto a fornire a ciascuno di tali elettrodi un?onda di corrente avente frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
Tali uno o pi? elettrodi sono configurati in modo tale da trasmettere dette onde di corrente elettrica alla suddetta regione bersaglio.
Secondo un aspetto dell?invenzione, gli elettrodi del dispositivo sono elettrodi del tipo impiantabile atti ad essere impiantati in corrispondenza o in prossimit? della suddetta regione bersaglio.
Fa inoltre parte della presente invenzione anche un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio.
Tale regione bersaglio appartiene preferibilmente ad un organismo vivente.
Secondo un aspetto del metodo della presente invenzione, esso comprende il trattamento delle suddette cellule neoplastiche mediante applicazione di onde di corrente elettrica alla regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, in cui tali onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz, molto pi? preferibilmente di circa 4 MHz. Inoltre, secondo un aspetto del metodo dell?invenzione, tale forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale.
Ancora, secondo un aspetto dell?invenzione, tale forma d?onda sinusoidale ? distorta per la presenza di armoniche.
Ancora, secondo un altro aspetto del metodo della presente invenzione, la forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
Ulteriormente, secondo un aspetto del metodo dell?invenzione, le cellule neoplastiche comprendono cellule di glioblastoma.
Secondo un aspetto dell?invenzione, la regione bersaglio comprende il sistema nervoso centrale.
Secondo un ulteriore aspetto del metodo dell?invenzione, tale metodo comprende le seguenti fasi:
- collegare un dispositivo atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz ed aventi preferibilmente una forma d?onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche, ad uno o pi? elettrodi;
- applicare almeno uno di tali elettrodi sulla superficie del corpo dell?organismo vivente in corrispondenza della quale ? localizzata la regione bersaglio comprendente le suddette cellule neoplastiche;
- attivare il dispositivo in modo da trasferire le onde di corrente a tale elettrodo e mantenere attivato il dispositivo per un tempo predefinito. Alternativamente, secondo un altro aspetto del metodo dell?invenzione, tale metodo comprende le seguenti fasi:
- collegare un dispositivo atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz ed aventi preferibilmente una forma d?onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche, ad uno o pi? elettrodi del tipo impiantabile;
- impiantare almeno uno di tali elettrodi nell?organismo vivente in corrispondenza o in prossimit? della regione bersaglio comprendente le suddette cellule neoplastiche;
- attivare il dispositivo in modo da trasferire le onde di corrente a tale elettrodo e mantenere attivato il dispositivo per un tempo predefinito. Preferibilmente, il metodo della presente invenzione fa uso del dispositivo della presente invenzione.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del farmaco, del dispositivo e del metodo dell?invenzione risulteranno evidenti ad un esperto del ramo dalla descrizione seguente di una forma esecutiva preferita dell?invenzione che viene data a titolo indicativo, ma non limitativo. Breve descrizione delle figure
- nella figura 1 sono mostrate delle immagini rappresentative acquisite al microscopio ottico invertito di colture di cellule di glioblastoma A172 a 0, 24 e 48 ore dal termine della stimolazione con QMR e di cellule controllo (Control) non trattate; le immagini sono state acquisite mediante microscopio Axiovert 40 CFL, ingrandimento 10X;
- nella figura 2 ? mostrato il rapporto di vitalit? cellulare di cellule A172 a 0, 24 e 48 ore dal termine della stimolazione con QMR, rispetto alle cellule controllo (Control) (media ? SEM di almeno 4-5 esperimenti indipendenti; ** = p <0,01; QMR Vs Control (One-sample t-test));
- nelle figure 3a, 3b e 3c sono riportate le percentuali di cellule A172 per ciascuna fase del ciclo cellulare (G0-G1, S, G2-M): la progressione del ciclo cellulare ? stata monitorata mediante citometria a flusso a 0 (fig. 3a), 24 (fig. 3b) e 48 ore (fig. 3c) dal termine della stimolazione con QMR (media ? SEM di almeno 4-6 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; QMR Vs Control (Unpaired t-test));
- le figure 4a, 4b e 4c riportano l?induzione dell?apoptosi in cellule A172 a 0 (fig. 4a), 24 (fig. 4b), e 48 ore (fig. 4c) dal termine della stimolazione con QMR; gli istogrammi mostrano la percentuale di cellule vive (viable) e cellule morte, suddividendo l?apoptosi precoce (early apoptosis) dall?apoptosi tardiva (late apoptosis) e dalla necrosi (necrosis) (media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; ** = p <0,01; QMR Vs Control (Unpaired t-test));
- nelle figure da 5a a 5f sono riportati gli effetti della stimolazione QMR su cellule stromali mesenchimali (BM-MSC): in fig. 5a sono riportate delle immagini rappresentative acquisite al microscopio ottico invertito Axiovert 40 CFL, ingrandimento 10X, di colture di cellule BM-MSC a 0 e 24 ore dal termine di una stimolazione di 24 ore con QMR e delle cellule controllo (Control); in fig. 5b ? riportata la vitalit? di cellule BM-MSC a 0 e 24 ore dal termine di una stimolazione con QMR per un tempo di 24 ore rispetto alle cellule controllo, ottenuta mediante test con Trypan blue; le figure 5c-5f riportano la percentuale di cellule BM-MSC per ciascuna fase del ciclo cellulare (G0-G1, S, G2-M) e l?induzione dell?apoptosi mediante citometria a flusso a 0 e 24 ore dal termine della stimolazione con QMR (rispettivamente 5c/5e e 5d/5f); i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 3-4 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; QMR Vs Control;
- nella figura 6 sono mostrate le immagini rappresentative del cariotipo di cellule BM-MSC in condizioni basali (Control) e dopo stimolazione con QMR; i cromosomi in metafase sono stati individuati mediante metodo GTG; le immagini sono rappresentative di 3 esperimenti indipendenti;
- nelle figure 7a e 7b sono riportate l?aggressivit? e l?invasivit? di cellule A172 dopo stimolazione con QMR: in fig. 7a le colonie di cellule A172 sono state marcate con calceina e contate mediante microscopio ottico invertito Axiovert CFL; in fig. 7b cellule A172 sono state fatte crescere in inserti in silicone posizionati direttamente all'interno delle piastre Petri e, dopo stimolazione con QMR, ? stato valutato il tasso di migrazione fino a 48 ore dal termine della stimolazione mediante microscopio ottico invertito, la percentuale di ?scratch closure? indicativa del tasso di migrazione cellulare ? stato quantificato mediante software Image J; i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; *** = p <0,001; QMR Vs Control;
- nelle figure da 8a a 8f sono riportati gli effetti della stimolazione con QMR su cellule di glioblastoma T98G: in fig. 8a sono mostrate delle immagini acquisite al microscopio ottico invertito Axiovert 40 CFL, ingrandimento 5X, rappresentative di colture di cellule T98G a 0 e 24 ore dal termine di una stimolazione di 24 ore con QMR e delle cellule controllo (Control); in fig. 8b ? riportata la vitalit? di cellule T98G a 0, 24 e 48 ore dal termine di una stimolazione di 24 ore con QMR rispetto alle cellule controllo, ottenuta mediante test con Trypan blue; in fig. 8c le colonie di cellule T98G sono state marcate con calceina e contate mediante microscopio ottico invertito Axiovert CFL; nelle figg.
8d e 8e sono riportate le percentuali di cellule T98G per ciascuna fase del ciclo cellulare (G0-G1, S, G2-M) e l?induzione dell?apoptosi ottenute mediante citometria a flusso a 0, 24 e 48 ore dal termine della stimolazione con QMR; in fig. 8f cellule T98G sono state fatte crescere in inserti in silicone posizionati direttamente all?interno delle piastre Petri e, dopo stimolazione con QMR, ? stato valutato mediante microscopio ottico invertito il tasso di migrazione fino a 72 ore dal termine della stimolazione; la percentuale di ?scratch closure? indicativa del tasso di migrazione cellulare ? stata quantificata mediante software Image J; i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; QMR Vs Control;
- nelle figure da 9a a 9e sono riportati gli effetti della stimolazione con QMR su cellule di glioblastoma U87MG: in fig. 9a sono mostrate delle immagini acquisite al microscopio ottico invertito Axiovert 40 CFL, ingrandimento 5X, rappresentative di colture di cellule U87MG a 0 e 24 ore dal termine di una stimolazione di 24 ore con QMR e delle cellule controllo (Control); in fig. 9b ? riportata la vitalit? di cellule U87MG a 0, 24 e 48 ore dal termine di una stimolazione di 24 ore con QMR rispetto alle cellule controllo, ottenuta mediante test con Trypan blue; in fig. 9c le colonie di cellule U87MG sono state marcate con calceina e contate mediante microscopio ottico invertito Axiovert CFL; nelle figg. 9d e 9e sono riportate le percentuali di cellule U87MG per ciascuna fase del ciclo cellulare (G0-G1, S, G2-M) e l?induzione dell?apoptosi ottenute mediante citometria a flusso a 0, 24 e 48 ore dal termine della stimolazione con QMR; i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; QMR Vs Control;
- nelle figure 10a e 10b sono mostrati i valori di vitalit? cellulare per cellule A172, T98G e U87MG dopo 24 e 48 ore di stimolazione con QMR; in fig. 10b le cellule T98G sono state stimolate con QMR ad una potenza maggiore del 15% rispetto alle altre linee cellulari e il tasso di proliferazione ? stato valutato dopo 24-48 ore di stimolazione con QMR; i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 1-4 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001; QMR Vs Control;
- nella figura 11 sono riportati i valori di vitalit? cellulare per cellule A172 trattate con farmaco temozolomide (TMZ) per un tempo di 144 ore; i risultati sono stati ottenuti mediante test con Trypan blue e sono espressi come media ? SEM di almeno 3 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001; TMZ Vs Control (One-sample ttest);
- nelle figure 12a e 12b sono mostrati gli effetti della combinazione di trattamento con farmaco TMZ e stimolazione QMR su cellule A172; TMZ ? stato somministrato per 144 ore, successivamente o contemporaneamente alla stimolazione di 24 ore con QMR, la vitalit? cellulare ? stata monitorata mediante test con Trypan blue e sono espressi come media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001; Trattamento Vs Control; = p <0,05; + = p <0,01; ++ = p <0,001 per combinazione TMZ e QMR Vs solo TMZ;
- nelle figure 13a e 13b sono riportati i valori di induzione dell?apoptosi su cellule A172 trattate con TMZ (10?M e 25?M) successivamente (fig. 12a) o contemporaneamente (fig. 12b) alla stimolazione con QMR, i valori sono stati ottenuti mediante citometria a flusso; i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 4-6 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001 per Trattamento Vs Control; = p <0,05; + = p <0,01; ++ = p <0,001 per combinazione TMZ e QMR Vs solo TMZ;
- nelle figure 14a e 14b sono riportate le percentuali di cellule A172 per ciascuna fase del ciclo cellulare (G0-G1, S, G2-M): la progressione del ciclo cellulare ? stata monitorata mediante citometria a flusso di cellule trattate con TMZ successivamente alla stimolazione con QMR (fig. 14a), e contemporaneamente alla stimolazione con QMR (fig.
14b); i risultati sono espressi come media ? SEM di almeno 3-5 esperimenti indipendenti; * = p <0,05; ** = p <0,01; *** = p <0,001 per Trattamento TMZ e QMR Vs Control; = p <0,05; + = p <0,01; ++ = p <0,001 per trattamento TMZ e QMR Vs solo TMZ.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Come indicato precedentemente, la presente invenzione concerne un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio.
Con il termine cellule neoplastiche si intendono nel presente documento quelle cellule che sfuggono ai meccanismi di controllo della proliferazione e seguono un loro programma autonomo di riproduzione. Esse compongono una neoplasia ossia una massa abnorme di cellule il cui accrescimento ? eccessivo e scoordinato rispetto a quello delle cellule normali e progredisce in modo eccessivo anche dopo la cessazione degli stimoli che lo hanno evocato.
La suddetta neoplasia, e opzionalmente la regione del corpo dell?organismo vivente dove tale massa tumorale si espande rappresenta anche la regione bersaglio citata poc?anzi.
A titolo di esempio da non considerarsi limitativo, tale neoplasia pu? comprendere neoplasia polmonare, del colon-retto, mammaria, della prostata, del pancreas, del fegato, oppure neoplasie ematologiche delle cellule del midollo osseo, del sistema linfatico, del sistema immunitario, ecc.
In particolare, le cellule neoplastiche della presente invenzione comprendono cellule di glioblastoma (GBM), un tumore maligno astrocitario e la regione bersaglio comprende il sistema nervoso centrale.
Il metodo dell?invenzione prevede di trattare le suddette cellule neoplastiche mediante applicazione di onde di corrente elettrica alla regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, in cui tali onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda preferibilmente sinusoidale con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz. L?applicazione di onde di corrente aventi una forma d?onda sinusoidale con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz trasmette un?energia alle molecole su cui tali onde di corrente sono applicate che corrisponde alla cosiddetta ?risonanza molecolare?, definita con il termine Quantum Molecular Resonance (QMR).
? noto dal documento EP1087691 e dal documento Pozzato G et al, 2003, a nome del richiedente, che tale energia QMR ? appena sufficiente a rompere i legami tra le molecole interessate dal passaggio di corrente, risultando particolarmente utile quando applicata ad un bisturi. Tale bisturi risulta infatti in grado di tagliare le regioni di interesse, senza produrre alcun effetto n? di rottura, n? di strappo, n? di necrosi, n? di diminuzione o aumento dello spessore, alterazione del contenuto in liquidi, coagulazione o altro effetto degenerativo, nell?intorno del taglio.
? stato ora invece sorprendentemente scoperto che le onde di corrente aventi forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz realizzano un?azione antitumorale quando vengono applicate a cellule di tipo neoplastico.
I richiedenti hanno infatti scoperto che l?applicazione di onde di corrente elettrica tali da trasmettere alle cellule neoplastiche l?energia di risonanza QMR consente di ottenere la riduzione della motilit? e aggressivit? delle suddette cellule, diminuendo la loro capacit? di migrare attraverso le matrici per, ad esempio, dare vita a nuove lesioni tumorali.
Esperimenti eseguiti su cellule BM-MSC hanno inoltre evidenziato che l?applicazione di tali onde di corrente sembra essere innocua nei confronti di cellule normali di tipo non neoplastico, garantendo cos? la selettivit? del metodo dell?invenzione nel bloccare o inibire la crescita delle sole cellule neoplastiche e non la crescita delle cellule di supporto che si trovano nell?intorno di tali cellule neoplastiche, come avviene invece con le terapie antitumorali di tipo standard.
Ulteriormente, ? stato inoltre identificato che l?applicazione di tali onde di corrente su cellule di glioblastoma causa un?alterazione globale del loro assetto proteico che porta infine alla morte delle cellule.
Vantaggiosamente, tale alterazione proteica risulta invece velocemente contrastata nelle cellule sane.
? risultato particolarmente vantaggioso, nel metodo dell?invenzione, l?utilizzo di valori di frequenza fondamentale compresi tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresi tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresi tra 4 e 20 MHz.
Particolarmente preferito ? l?utilizzo di onde di corrente elettrica a forma d?onda con frequenza fondamentale di circa 4 MHz.
Preferibilmente, tale forma d?onda ? una forma d?onda di tipo sinusoidale. Inoltre, secondo un aspetto del metodo dell?invenzione, tale forma d?onda sinusoidale ? distorta per la presenza di armoniche. Ancora, secondo un altro aspetto del metodo della presente invenzione, la forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
Preferibilmente, la forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del primo, del secondo e del terzo ordine.
Come mostrato dai risultati degli esperimenti descritti successivamente, l?applicazione delle suddette onde di corrente elettrica a cellule neoplastiche consente di bloccare o inibire in tasso elevato la crescita di cellule neoplastiche, lasciando sostanzialmente illese le cellule sane presenti nella regione bersaglio.
? stato anche testato l?effetto della combinazione dell?applicazione di tali onde di corrente elettrica con il trattamento delle cellule neoplastiche con farmaci antitumorali di tipo noto.
Con il termine farmaco antitumorale si intende una qualsiasi molecola o combinazione di molecole, per l?uso farmaceutico, destinata ad inibire o bloccare la crescita e la diffusione di formazioni tumorali. Particolarmente preferito ? l?utilizzo del farmaco antitumorale temozolomide (TMZ).
? stato sorprendentemente scoperto che la combinazione dell?applicazione di tali onde di corrente elettrica aventi forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz, molto pi? preferibilmente di circa 4 MHz, alle cellule neoplastiche della suddetta regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, precedentemente, contemporaneamente o successivamente al trattamento con un farmaco antitumorale, consente di ottenere una maggior efficacia antitumorale del farmaco antitumorale stesso.
In particolare, l?uso del farmaco antitumorale in combinazione a QMR consente di ottenere una maggiore riduzione del numero di cellule neoplastiche vive rispetto all?uso del solo farmaco antitumorale sulle cellule neoplastiche.
Si evidenzia dunque che la combinazione del trattamento con un farmaco antitumorale con l?applicazione delle suddette onde di corrente elettrica esercita un effetto antitumorale maggiore nelle cellule neoplastiche trattate rispetto all?uso del solo farmaco antitumorale su tali cellule neoplastiche, permettendo dunque, a parit? di effetto antitumorale, di diminuire il dosaggio del farmaco antitumorale.
Ancora vantaggiosamente, grazie a tale diminuzione di dosaggio ottenuta mediante l?uso di QMR ? possibile ottenere una sostanziale riduzione degli effetti collaterali causati dal trattamento con il farmaco antitumorale, a parit? di effetto antitumorale ottenuto.
Tale vantaggio ? particolarmente evidente quando il farmaco antitumorale ? somministrato contemporaneamente o successivamente al trattamento con QMR.
Tale vantaggio ? ancora pi? evidente quando il farmaco ? somministrato contemporaneamente al trattamento con QMR.
Ancora vantaggiosamente, la combinazione di trattamento con farmaco antitumorale e QMR permette di ottenere un incremento del numero di cellule in apoptosi precoce.
Risulta evidente che QMR pu? essere usata come efficace complemento alle terapie chemioterapiche standard per aumentare gli effetti dei farmaci antitumorali attualmente utilizzati, senza un corrispondente aumento della tossicit?.
Oltre a tali farmaci antitumorali, QMR pu? essere applicata in combinazione anche con altre tipologie di trattamenti antitumorali. Alcuni esempi da non considerarsi limitativi di tali trattamenti antitumorali comprendono trattamenti chirurgici, radiochirurgici, trattamenti con radiazioni ionizzanti, trattamenti chemioterapici con agenti alchilanti, antimetaboliti, antibiotici antitumorali, inibitori della topoisomerasi, farmaci antimicotici, corticosteroidi, farmaci biologici, agenti differenzianti, ormoni, farmaci che stimolano il sistema immunitario, anticorpi monoclonali.
Fa dunque parte della presente invenzione anche un farmaco antitumorale per l?uso in un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, in cui il metodo comprende il trattamento delle cellule neoplastiche con tale farmaco antitumorale contemporaneamente o successivamente all?applicazione di onde di corrente elettrica alla suddetta regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito. Come indicato precedentemente, tali onde di corrente elettrica hanno una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
Non si esclude che, secondo un aspetto dell?invenzione, il trattamento delle cellule neoplastiche con il farmaco antitumorale avvenga precedentemente all?applicazione delle suddette onde di corrente elettrica.
Preferibilmente, tale forma d?onda presenta frequenza fondamentale compresa tra 2 e 64 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz.
Pi? preferibilmente, tale forma d?onda presenta frequenza fondamentale di circa 4 MHz.
Ancora preferibilmente, la suddetta forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale.
Ulteriormente, tale forma d?onda sinusoidale ? distorta per la presenza di armoniche.
Preferibilmente, tale forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il farmaco antitumorale ? utilizzato per l?uso in un metodo che comprende il trattamento delle cellule neoplastiche con il farmaco antitumorale contemporaneamente all?applicazione delle suddette onde di corrente elettrica alla regione bersaglio mentre le cellule neoplastiche sono trattate con il farmaco antitumorale.
Ritornando al metodo della presente invenzione, tale metodo comprende preferibilmente le seguenti fasi:
- collegare un dispositivo atto a generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz ed in cui, preferibilmente, tale forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale distorta per la presenza di armoniche, ad uno o pi? elettrodi;
- applicare almeno uno di tali elettrodi sulla superficie del corpo dell?organismo vivente in corrispondenza della quale ? localizzata la regione bersaglio comprendente le suddette cellule neoplastiche oppure impiantare almeno uno di tali elettrodi nell?organismo vivente in corrispondenza o in prossimit? della regione bersaglio comprendente le suddette cellule neoplastiche;
- attivare il dispositivo in modo da trasferire le onde di corrente a tali uno o pi? elettrodi e mantenere attivato il dispositivo per un tempo predefinito.
Preferibilmente con organismo vivente si intende un soggetto umano. Tali elettrodi presentano forma e configurazione idonea per trasmettere le suddette onde di corrente elettrica alla regione bersaglio.
A titolo di esempio da non considerarsi limitativo, tali elettrodi possono essere di tipo non impiantabile e, ad esempio, possono presentare forma di manipolo oppure forma di ventosa, o ancora presentare forma essenzialmente laminare ed essere applicabili per adesione alla pelle del soggetto, oppure tali elettrodi possono presentare forma di sonda.
Quando gli elettrodi utilizzati nel metodo dell?invenzione hanno forma laminare, essi sono essenzialmente flessibili in modo da seguire senza difficolt? la forma della superficie del corpo e, inoltre, sono opzionalmente dotati anche di una sostanza adesiva che facilita il mantenimento del contatto sul corpo durante l?applicazione della forma d?onda generata dal dispositivo.
Non si esclude che uno o pi? dei suddetti elettrodi sia del tipo impiantabile.
Fa dunque parte della presente invenzione anche un dispositivo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio.
Tale dispositivo ? utilizzabile nel metodo dell?invenzione.
In particolare, il dispositivo dell?invenzione ? configurato per generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
La regione bersaglio appartiene preferibilmente ad un organismo vivente, pi? preferibilmente un soggetto umano, come gi? indicato poc?anzi.
Secondo una forma esecutiva preferita del dispositivo dell?invenzione, esso comprende un circuito di radiofrequenza collegato ad uno o pi? elettrodi e atto a fornire a ciascuno di tali elettrodi un?onda di corrente avente frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
Preferibilmente, il dispositivo comprende inoltre un circuito raddrizzatore alimentato dalla tensione di rete che fornisce tensione preferibilmente continua, pi? preferibilmente stabilizzata, al suddetto circuito di radiofrequenza.
Tale circuito di radiofrequenza comprende preferibilmente almeno un interruttore elettronico alimentato dalla tensione e pilotato da un circuito di pilotaggio.
Pi? nel dettaglio, il circuito di radiofrequenza presenta in uscita un?onda di corrente avente frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz ed ? atto a trasmettere tale onda di corrente a tali elettrodi. Preferibilmente tale frequenza fondamentale ? compresa tra 2 e 64 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz.
Pi? preferibilmente, la frequenza fondamentale corrisponde a circa 4 MHz.
Tale onda di corrente inoltre presenta forma sinusoidale.
La suddetta onda di corrente ? inoltre vantaggiosamente distorta per la presenza di armoniche.
Tali armoniche sono preferibilmente armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
Pi? preferibilmente, l?onda di corrente presenta forma sinusoidale distorta per la presenza di armoniche almeno del primo, del secondo e del terzo ordine.
Tale onda di corrente inoltre circola in un circuito preferibilmente risonante, a banda larga sulla frequenza dell?onda fondamentale della forma sinusoidale distorta.
Secondo la forma esecutiva preferita dell?invenzione, il dispositivo genera onde di corrente elettrica alternata sinusoidali ad alta frequenza di 4 MHz con armoniche da 4 a 64 MHz.
Secondo un aspetto del dispositivo dell?invenzione, gli elettrodi di tale dispositivo sono configurati in modo tale da poter trasmettere la suddetta onda di corrente alla regione bersaglio.
Si specifica che gli elettrodi del dispositivo dell?invenzione possono presentare forma e configurazione corrispondente alla forma e configurazione degli elettrodi descritta poc?anzi per il metodo dell?invenzione.
Secondo un aspetto del dispositivo dell?invenzione, tali elettrodi sono del tipo non impiantabile e sono atti ad essere applicati sulla superficie del corpo dell?organismo in corrispondenza o in prossimit? della quale ? localizzata la regione bersaglio comprendente le cellule neoplastiche.
Secondo una variante realizzativa del dispositivo, esso comprende un casco configurato per permettere l?alloggiamento dei suddetti elettrodi e permetterne sia il collegamento con il suddetto circuito di radiofrequenza che la loro disposizione in corrispondenza o in prossimit? della regione bersaglio.
Si specifica che, secondo una particolare variante realizzativa del dispositivo comprendente il suddetto casco, quest?ultimo ? configurato per alloggiare anche il circuito di radiofrequenza.
Secondo un?ulteriore variante del dispositivo, esso comprende una cuffia del tipo indossabile configurata per alloggiare i suddetti elettrodi e permetterne l?applicazione in corrispondenza o in prossimit? della regione bersaglio.
Secondo un?altra variante realizzativa del dispositivo, esso comprende almeno una fascia provvista dei suddetti elettrodi. Opzionalmente, tale fascia ? configurata per alloggiare anche almeno il circuito di radiofrequenza del dispositivo.
Tale fascia ? inoltre configurata per essere disposta lateralmente e/o frontalmente e/o posteriormente alla testa del soggetto.
Non si esclude che tale fascia sia configurata per essere disposta in corrispondenza della vita del soggetto ed essere indossata da quest?ultimo come una cintura.
Non si esclude inoltre che, tale fascia possa essere indossata dal soggetto in modo diverso da quanto indicato poc?anzi.
Secondo una particolare variante realizzativa del dispositivo dell?invenzione, almeno uno o pi? degli elettrodi del dispositivo dell?invenzione sono elettrodi del tipo impiantabile.
Con il termine ?impiantabile? si intende un elettrodo destinato ad essere impiantato interamente o parzialmente, mediante intervento chirurgico o medico, nel corpo umano.
Secondo un?altra variante realizzativa del dispositivo dell?invenzione, esso ? configurato in modo tale da risultare completamente impiantabile.
A titolo di esempio, il presente dispositivo impiantabile presenta configurazione sostanzialmente simile alla configurazione di un pacemaker impiantabile.
Altri aspetti e vantaggi della presente invenzione appariranno alla lettura degli esempi che seguono, che devono essere considerati come illustrativi e non limitativi.
Esempi
Esempio 1. Materiali e metodi
1.1 Colture cellulari e crescita cellulare
Sono state utilizzate le linee cellulari di glioblastoma A172, T98G e U87MG. Le cellule A172 e T98G (
sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 GlutaMAX, Gibco, Thermo Fisher Scientific,
, Gibco, Thermo Fisher Scientific) e 1% penicillina/streptomicina .
Le cellule U87MG (concessione del Prof. Massimo Dominici, Laboratory of Cellular Therapy, University Hospital of Modena and Reggio Emilia Modena, Italy) sono state coltivate in Dulbecco?s modified Eagle?s medium (DMEM) con GlutaMAX (Gibco, Thermo Fisher Scientific) aggiunto di 10% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) e 1% penicillina/streptomicina .
Sono state inoltre utilizzate cellule stromali mesenchimali derivate da midollo osseo (BM-MSC) come cellule controllo di tipo non tumorale. Le cellule BM-MSC sono state prodotte nel Laboratorio Terapie Cellulari Avanzate dell'Unit? Operativa Complessa di Ematologia dell?ULSS8 Berica secondo quanto descritto precedentemente
. Brevemente, MSC sono state isolate da cellule ottenute dal lavaggio di sacche e filtri di raccolta di midollo osseo scartati, provenienti da donatori sani (Comitato etico aut. N. 107/18 del 12.02.2019). Successivamente al lavaggio, le cellule sono state centrifugate a 2000 rpm per 10 min e seminate ad una densit? di 1x10<5 >cell/cm<2 >in DMEM con GlutaMAX (Gibco, Thermo Fisher Scientific,) aggiunto di 10% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific) e 1% penicillina/streptomicina . Le colture cellulari sono state incubate a 37?C in atmosfera umida con 5% CO2. Le cellule che non hanno aderito sono state rimosse dopo 72 ore dalla semina e nuovo medium ? stato aggiunto. Il medium ? stato cambiato ogni 3?4 giorni. Ad una confluenza dell?80%, le cellule BM-MSC sono state nuovamente seminate ad una densit? di 2000 cell/cm<2>.
1.2 Protocollo di stimolazione con QMR
Le linee cellulari sono state stimolate con QMR mediante un dispositivo prototipale QMR della ditta
. Il dispositivo, adattato opportunamente per le presenti sperimentazioni in vitro, genera onde di corrente elettrica alternata sinusoidali ad alta frequenza di 4 MHz con armoniche da 4 a 64 MHz e presenta i seguenti dati di targa: alimentazione 100?230 V ~ 50/60 Hz; potenza in uscita massima, 5 W/400 ?.
La QMR ? stata applicata alle cellule utilizzando un paio di elettrodi che sono stati posizionati all?interno di una piastra Petri da 100 mm, in corrispondenza del bordo, e collegati al dispositivo generatore. La trasmissione di campi elettrici al medium delle colture cellulari genera calore (effetto Joule). L?incremento medio di temperatura nel medium delle cellule stimolate ? stato di 5?C. Tale valore ? stato rilevato mediante tre misurazioni indipendenti con sonda data-logger (iLog, Escort Scunthorpe, UK) disposta nel medium di cultura. Per ovviare all?aumento di temperatura del medium delle cellule stimolate e garantire anche per le cellule stimolate una temperatura media di 37?C, l?incubatore utilizzato per le cellule stimolate ? stato impostato a 32?C al 5% di CO2 e la temperatura del laboratorio ? stata mantenuta tra 20?C e 25?C.
1.3 Setup sperimentale
Sulla base della linea cellulare utilizzata, un numero definito di cellule sono state seminate in piastre da 100mm (Greiner Bio-One, Frickenhausen, DE) per poter essere stimolate ad una confluenza del 60%. Le cellule sono state poi esposte a QMR per 24 ore e analizzate dopo 0-24-48 ore dal termine della stimolazione.
Pi? nel dettaglio, le cellule sono state lavate con D-PBS
, staccate con 1X TrypLE Select (Gibco, Thermo Fisher Scientific) e le aliquote ottenute sono state utilizzate per investigare la vitalit? cellulare, l?apoptosi, il ciclo cellulare, il cariotipo e la proteomica. Un?aliquota cellulare ? stata riseminata per la valutazione della capacit? di crescita delle cellule in medium semi-solido (soft agar assay) mentre la migrazione cellulare ? stata monitorata direttamente sulle piastre stimolate con QMR prima e dopo la stimolazione.
? stato testato anche l?effetto dell?uso combinato QMR e farmaco TMZ .
Per tale analisi, le cellule sono state trattate per 144 ore con 10-25 ?M TMZ somministrato contemporaneamente o successivamente alla stimolazione con QMR. La soluzione stock di TMZ ? stata preparata in DMSO ad una concentrazione finale di 10 mM e mantenuta a 4?C. Successive diluizioni sono state fatte in medium di cultura fresco e somministrate alle cellule. La vitalit? cellulare, l?apoptosi e il ciclo cellulare sono stati valutati dopo 144 ore.
1.4 Vitalit? cellulare: trypan blue exclusion assay
Dopo la stimolazione, le cellule sono state raccolte e sospese in rapporto 1:1 con una soluzione di trypan blue (Gibco, Thermo Fisher Scientific) in medium di coltura. Le cellule sono state contate mediante camera di Burker e il numero di cellule vive ? stato ricavato applicando la seguente formula: [(numero cellule x 10.000 x 2 x V)/9]. In cui V ? il volume totale della soluzione cellulare ottenuta e 2 ? il fattore di diluizione della soluzione con il colorante (2X).
1.5 Apoptosi: Marcatura con Annessina V/7-amminoactinamicina D (7-AAD)
Dopo stimolazione, 1,5 x 10<5 >cellule sono state raccolte e centrifugate a 400g per sei minuti. Dopo lavaggio con binding buffer, le cellule sono state marcate con Annessina V/7-AAD secondo le indicazioni del produttore Dopo diluizione con binding buffer, ? stata rilevata la fluorescenza di 2 x 10<4 >cellule/campione mediante citometro a flusso FC500
. La popolazione cellulare si ? separata in quattro gruppi: cellule vive con fluorescenza negativa sia per Annessina V che per 7-AAD; cellule in apoptosi precoce positive ad annessina V e negative per 7-AAD (Annessina V+/7-AAD?); cellule in apoptosi tardiva con doppia positivit? ad annessina V e 7-AAD (Annessina V+/7-AAD+) e cellule morte negative per annessina V e positive per 7-AAD (Annexin V-/7-AAD+).
1.6 Ciclo cellulare
Dopo stimolazione, 5 x 10<5 >cellule sono state raccolte e centrifugate a 400g per sei minuti. Le cellule sono state poi lavate con D-PBS e fissate e permeabilizzate con acetone (soluzione all?80% in acqua). Dopo un?ora a 4?C, l?acetone ? stato rimosso per centrifugazione, le cellule sono state lavate e marcate con 1 ?g/mL con 7-AAD (Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente. La fluorescenza di 2,5 x 10<4 >cellule/campione ? stata analizzata usando un citometro a flusso FC500 . Per calcolare la percentuale di cellule nelle differenti fasi del ciclo cellulare, ? stato utilizzato il software EXPO 32 . I cicli diplodi sono stati considerati e corretti per cluster di cellule.
1.7 Analisi del cariotipo
Per valutare se la stimolazione con QMR fosse sicura e quindi non provocasse alterazioni del cromosoma, cellule stromali mesenchimali BM-MSC sono state stimolate per 24 ore con QMR e testate mediante bandeggio G-Trypsin-Giemsa seguendo tecniche standard con risoluzione 350/400 bande. Sono state analizzate 20 metafasi e 3 sono state cariotipizzate. Cellule BM-MSC non stimolate sono state utilizzate come cellule controllo.
1.8 Migrazione cellulare (scratch test)
Lo scratch test rappresenta un approccio di migrazione cellulare 2D per rilevare semiquantitativamente la motilit? cellulare. Lo scopo dello scratch (apertura) ? la realizzazione di un?area priva di cellule, per indurre le cellule circostanti a migrare e chiudere l?apertura. Le cellule sono state seminate in inserti in silicone a due pozzetti
che realizzano un?apertura priva di cellule di 500 ?m sul monostrato cellulare.
Al raggiungimento del 60% di confluenza cellulare, l?inserto ? stato rimosso e le cellule sono state stimolate per 24 ore con QMR. La migrazione cellulare ? stata monitorata nel tempo mediante acquisizione delle immagini prima della stimolazione e dopo 0-24-48 ore dalla stimolazione. L?acquisizione delle immagini ? stata eseguita con un microscopio ottico invertito Axiovert 40 CFL
. La percentuale di chiusura dell?apertura ? stata analizzata con software ImageJ (National Institutes of Health,
) e la capacit? migratoria ? stata valutata mediante curva del tasso di migrazione che ? stata calcolata come indicato di seguito: Chiusura % = [(Area tx ? Area ty)/ Area tx] x 100; in cui tx rappresenta il tempo di acquisizione e ty il successivo punto temporale.
1.9 Soft Agar
Il saggio di formazione delle colonie in terreno semi-solido (soft agar) ? un metodo utilizzato per monitorare la crescita cellulare indipendentemente dall?ancoraggio delle cellule al substrato e che misura la proliferazione cellulare in terreno semi-solido mediante conteggio ottico delle colonie. Il tasso di formazione delle colonie in soft agar cambia a seconda della linea cellulare utilizzata. Pertanto, la concentrazione di agarosio, il numero di cellule seminate e il giorno finale della sperimentazione sono stati ottimizzati per ciascuna linea cellulare. La sospensione cellulare ? stata preparata in una soluzione di agarosio 0,4% in medium cellulare e seminata su uno strato solidificato di agarosio 0,6% in medium completo. Dopo 1 ora a temperatura ambiente, 160 ?l di medium completo ? stato aggiunto e altri 100 ?l sono stati aggiunti ogni settimana fino a termine dell?esperimento. Le piastre sono state trasferite in un incubatore a 37?C a 5% CO2 per 21-24 giorni prima di essere marcate con 100 ?M di calceina per 30 minuti. Le colonie costituite da almeno 50 cellule sono state contate utilizzando un microscopio ottico invertito Axiovert 40 CFL .
1.10 Proteomica
1 x 10<6 >cellule sono state raccolte e centrifugate a 400g per 6 minuti, lavate con D-PBS e lisate con lysis buffer in ghiaccio (Pierce? RIPA buffer, Thermo Fisher Scientific) aggiunto di protease inhibitor cocktail . Dopo 30 minuti in ghiaccio, i lisati cellulari sono stati centrifugati a 14000g per 10 minuti a 4?C e il supernatante proteico ? stato determinato colorimetricamente mediante BCA assay (Pierce? BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific). L?albumina sierica bovina ? stata utilizzata come standard (Sigma Aldrich).
1.11 Cromatografia liquida - spettrometria di massa
Estrazione proteica
La cromatografia liquida - spettrometria di massa (LC/MS-MS) ? una tecnica analitica che combina la capacit? separatoria della cromatografia liquida con l?elevata sensibilit? e selettivit? dell?analisi di massa della spettrometria di massa a triplo quadrupolo. Per la preparazione dei campioni, 50 ?g di lisato proteico ? stato precipitato con acetone e il pellet proteico ottenuto ? stato disciolto in una soluzione 6M di urea e 100 mM di bicarbonato d?ammonio (pH 8). I campioni sono stati ridotti utilizzando 10 mM di ditiotreitolo per 1 ora a temperatura ambiente e alchilati con 20 mM di iodoacetamide al buio per 30 minuti, a temperatura ambiente. Successivamente, le proteine sono state sottoposte a digestione con enzima endopeptidase Lys-C (Promega) con un rapporto enzima/proteine di 1:100 (w/w) per 3 ore a temperatura ambiente. Le proteine sono state poi diluite 4 volte in 50 mM bicarbonato d?ammonio e digerite overnight con tripsina (Promega) 1:100 (w/w) a temperatura ambiente. La proteolisi ? stata interrotta mediante aggiunta dell?1% di acido trifluoroacetico. I campioni sono stati poi dissalati, essiccati sottovuoto e risospesi in 0,1% acido formico per l?analisi LC-MS/MS. Identificazione proteica mediante appositi database e relativa quantificazione
I campioni sono stati analizzati mediante il sistema Easy-nLC 1200 (Thermo Fisher), accoppiato in linea con uno spettrometro di massa Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Fisher). Per la separazione dei peptidi digeriti ? stata utilizzata una colonna a fase inversa (Acclaim PepMap RSLC C18, 2?m dimensione particelle, 100? dimensione pori, id 75 ?m, Thermo Fisher Scientific) con una fase mobile a due componenti: 0,1% acido formico in acqua (buffer A) e 0,1% acido formico in acetonitrile (buffer B). I peptidi sono stati eluiti utilizzando un gradiente da 5% a 25% per 52 minuti, seguito da 25% a 40% per 8 minuti e d 40% a 98% per 10 minuti ad una portata di 400 nL/min. Il metodo di acquisizione dipendente dai dati (DDA) si basa su scansioni complete eseguite a una potenza di risoluzione di 120000 fwhm (full width at half maximum) (a 200 m/z), e un tempo di iniezione massima di 50 ms. Il range di masse di 350-1100 m/z ? stato esaminato per i precursori, con la prima massa impostata a 140 m/z per i frammenti. Le scansioni complete sono state seguite da una serie di scansioni MS/MS (HCD) per un tempo di ciclo di 3 secondi, ad un'energia di collisione del 30% e rilevate nella trappola ionica con un tempo di iniezione massimo di 150 ms. Il tempo di esclusione dinamica ? stato fissato a 50 sec. I dati non elaborati sono stati cercati nel software Proteome Discoverer 2.2 (Thermo Fisher Scientific). Le ricerche dei peptidi sono state effettuate utilizzando il file Human protein FASTA file (uniprot). Le proteine sono state identificate con il motore di ricerca MASCOT
utilizzando una tolleranza di massa del precursore di 10 ppm e una tolleranza di massa del prodotto di 0,6 Da.
1.12 Analisi bioinformatica
Le differenti abbondanze delle proteine espresse nei diversi gruppi sperimentali (a t0 e t24, rispettivamente) sono state usate per realizzare un?analisi gerarchica dei cluster mediante lo strumento Clustvis ). Il Gene Ontology (GO) e Pathway annotation of protein IDs ? stato realizzato usando il server EnrichR gene set enrichment analysis (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/), applicando i processi biologici e la categorizzazione Reactome con la soglia di significativit? impostata a p <0,05. La rete di interazioni di proteiche ? stata costruita utilizzando il database di interazioni STRING, versione 11.0 (https://string-db.org/)
1.13 Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati mediante programma GraphPad e sono stati espressi come media ? errore standard. Per l?analisi dei risultati espressi come rapporto/percentuale del controllo (es. trypan blu exclusion assay), ? stato usato l?One-sample t-test. Per tutte le altre analisi ? stato utilizzato l?unpaired Student?s t-test. Sono stati considerati significativi i dati con p < 0,05.
Esempio 2. Risultati
2.1 Il trattamento con QMR riduce la crescita di cellule di glioblastoma modificando la progressione del ciclo cellulare
Gli effetti del trattamento con QMR su cellule di glioblastoma A172 ? stata valutata analizzando la morfologia cellulare, il tasso di proliferazione, l?apoptosi e il ciclo cellulare delle cellule immediatamente al termine del trattamento e dopo 24 e 48 ore dal termine della stimolazione con QMR. Il rispetto di queste tempistiche ha consentito di ottenere una valutazione sulla permanenza degli effetti ottenuti con il trattamento e l?abilit? delle cellule trattate di riportare a livelli pre-trattamento le loro funzioni cellulari.
? stato sorprendentemente scoperto che il trattamento con QMR modifica la morfologia delle cellule A172 trattate rispetto alle cellule controllo, non trattate. Le cellule trattate con QMR sono apparse infatti pi? gonfie e maggiormente granulose rispetto alle cellule controllo, indicando che era avvenuto un danno cellulare.
Tale danno ? risultato inoltre essere persistente nel tempo, come mostrato in figura 1.
Il tasso di proliferazione cellulare ? stato inoltre stimato mediante test con Trypan Blu. Dopo 24 ore dal trattamento, le cellule trattate con QMR hanno mostrato una riduzione della crescita tumorale di circa il 28%. Inoltre, il numero di cellule vive tendeva a diminuire anche nelle 24-48 ore successive al trattamento, suggerendo un effetto del trattamento con QMR sulla progressione del ciclo cellulare, come visibile in figura 2.
A sostegno di tale sorprendente scoperta ? stato inoltre valutato il ciclo cellulare di cellule A172 mediante esperimenti di citometria a flusso. I risultati, mostrati nelle figure 3a e 3c, hanno evidenziato che il trattamento con QMR riduce significativamente il tasso di cellule che si dividono (definito come la percentuale di cellule in fase S) mentre aumenta significativamente le cellule in fase G2/M. Questi risultati inoltre sono stati confermati fino alle 48 ore successive al termine del trattamento, mostrando che era avvenuto un arresto del ciclo cellulare nella fase G2/M.
Ulteriormente, l?efficacia del trattamento delle cellule con QMR ? stata confermata dall?evidente attivazione apoptotica nelle cellule trattate. Il numero di cellule vive dopo trattamento con QMR ? risultato infatti significativamente inferiore (p<0,01) rispetto al numero di cellule vive di controllo non trattate con QMR, come mostrato dai risultati delle figure 4b e 4c. Tale riduzione era correlata inoltre ad un aumento di circa il 10% del numero di cellule in apoptosi precoce e un leggero aumento del numero di cellule in apoptosi tardiva.
2.2 Il trattamento con QMR non causa effetti citotossici e genotossici su cellule BM-MSC.
Sono stati testati gli effetti del trattamento con QMR su cellule sane BM-MSC al fine di verificare la sicurezza del trattamento con QMR su cellule di tipo non neoplastico. Al termine della stimolazione con QMR e dopo 24 ore dal termine del trattamento sono stati valutati nelle cellule BM-MSC trattate, e in cellule controllo non trattate, la morfologia cellulare, il tasso di proliferazione, l?apoptosi, il ciclo cellulare ed il cariotipo. Anche se al termine del trattamento con QMR era stato visualizzato un leggero decremento nella crescita cellulare, come mostrato in figura 5b, tale effetto non ? da considerarsi comparabile a quello ottenuto nelle cellule di glioblastoma A172 trattate, mostrato in figura 2.
Inoltre, le cellule BM-MSC trattate con QMR non mostravano differenze di morfologia cellulare, di modulazione del ciclo cellulare e dell?apoptosi, come visibile rispettivamente nelle figure 5a, 5c/5d, 5e/5f.
Il tempo inoltre non ha influenzato l'effetto finale ottenuto, come dimostrato dai risultati ottenuti che sono sostanzialmente sovrapponibili a 0 e 24 ore dal trattamento.
Anche l?analisi del cariotipo delle cellule BM-MSC trattate con QMR ha dimostrato che il trattamento con QMR, vantaggiosamente, non causa modificazioni nel numero di cromosomi o nella loro struttura, come visibile in figura 6.
2.3 Il trattamento con QMR riduce l?aggressivit? e l?invasivit? di cellule di glioblastoma A172.
? noto che le cellule di tipo neoplastico sono caratterizzate da una proliferazione e migrazione incontrollata. La capacit? delle cellule di crescere in medium semi-solido e il loro tasso di mobilit? sono dunque considerati marker di aggressivit? e invasivit? tumorale. La formazione di colonie cellulari in soft agar e la migrazione cellulare ? stata dunque analizzata in condizioni basali e dopo trattamento con QMR. I risultati, mostrati in figura 7a, hanno sorprendentemente mostrato come il trattamento con QMR riduce significativamente la crescita delle cellule A172 in soft agar. Infatti, il numero di colonie cellulari dopo trattamento con QMR ? stato circa l?85% in meno rispetto al numero di colonie delle cellule controllo, non trattate. Sorprendentemente inoltre, anche il tasso di migrazione cellulare delle cellule A172 trattate con QMR ? risultato essere inferiore, in modo tempo-dipendente, rispetto alle cellule controllo, come mostrato in figura 7b.
2.4 Il trattamento con QMR modula l'impronta proteomica della linea cellulare di glioblastoma A172.
Anche il profilo proteomico di cellule A172 e BM-MSC trattate con QMR ? stato investigato. L?analisi ? stata condotta al termine della stimolazione con QMR (tempo 0) e dopo 24 ore dal termine del trattamento. Cellule A172 e BM-MSC non trattate sono state utilizzate come gruppi di controllo.
Sono state identificate 5104 proteine nella linea cellulare A172, e di queste, 311 e 308 sono risultate essere significativamente alterate dopo trattamento con QMR rispettivamente al tempo zero e dopo 24 ore dal termine del trattamento. L?analisi dei cluster, non mostrata nelle figure, ha evidenziato due gruppi di proteine separate ad entrambe le tempistiche di analisi, dimostrando che il trattamento con QMR interferisce con l?attivit? delle cellule neoplastiche.
Le proteine sono risultate essere differenziate tra cellule trattate e cellule non trattate. In particolare, al tempo zero, 111 proteine sono risultate essere significativamente sovra-regolate mentre 200 proteine sono risultate essere sotto-regolate. Dopo 24 ore dal termine del trattamento, sono state invece riscontrate 103 proteine sovra-regolate e 205 proteine sotto-regolate.
Analisi pi? specifiche circa l?ontologia genica e l?arricchimento dei pathway hanno mostrato che le proteine sovra-regolate erano fortemente associate con i meccanismi di risposta allo stress, con il folding proteico e con la modellazione della matrice extracellulare, suggerendo che il trattamento con QMR agisce anche da stimolo tossico proteico.
Pi? nel dettaglio, le cellule trattate con QMR, rispetto alle cellule controllo non trattate, avevano subito una notevole sotto-regolazione dei fattori chiave coinvolti nella traduzione delle proteine, nell'elaborazione dell'RNA e nei pathways coinvolti nel ciclo cellulare, comportando l?arresto del ciclo cellulare e la morte delle cellule trattate.
Vantaggiosamente, gli effetti della stimolazione con QMR sulle cellule BM-MSC ha fornito risultati completamente differenti rispetto alle cellule di glioblastoma A172. Al termine del trattamento con QMR, l?attivazione delle heat shock protein ? stata associata ad una rimodellazione della matrice extracellulare. Tale alterazione ? tuttavia risultata essere totalmente normalizzata dopo 24 ore dal trattamento. Pertanto, il trattamento con QMR non interferisce con il tasso di proliferazione di cellule BM-MSC, a favore della selettivit? del trattamento con QMR nei confronti di cellule di tipo neoplastico.
2.5 Il trattamento con QMR sulle linee cellulari T98G e U87MG.
Gli esperimenti descritti precedentemente sono stati eseguiti anche su linee cellulari di glioblastoma maggiormente aggressive rispetto alle cellule di linea cellulare A172. Tali linee cellulari maggiormente aggressive comprendono le cellule T98G e U87MG. Nonostante il tasso di proliferazione ? risultato essere ridotto in entrambe le linee cellulari, a seguito del trattamento con QMR, non sono state evidenziate differenze significative di attivazione dell?apoptosi, progressione del ciclo cellulare, capacit? clonogenica e motilit? cellulare, come mostrato nelle figure da 8a a 8f.
La vitalit? cellulare ? stata inoltre testata dopo 48 e 72 ore di trattamento con QMR. Sorprendentemente, il tasso di proliferazione cellulare per entrambe le cellule A172 e U87MG ? risultato essere ridotto significativamente con il passare del tempo.
Anche un aumento del 15% della potenza del trattamento ha dimostrato essere influente sul tasso di proliferazione cellulare. La vitalit? cellulare delle cellule trattate con QMR ad una potenza maggiore ? risultato essere infatti diminuito fino al 35%, come mostrato nelle figure.
2.6 L?applicazione di QMR aumenta gli effetti del farmaco Temozolomide (TMZ) nelle cellule di glioblastoma A172.
Le terapie standard per pazienti con glioblastoma includono, ad oggi, la totale resezione della lesione, seguita da radioterapia e chemioterapia con il farmaco TMZ.
Svantaggiosamente, l?efficacia del farmaco ? limitata dalla gravit? degli effetti collaterali causati dallo stesso farmaco e dall?instaurarsi di meccanismi di resistenza al farmaco. Risulta quindi fondamentale individuare nuove strategie terapeutiche da usare in combinazione con TMZ al fine di diminuirne il dosaggio e migliorare la qualit? della vita del paziente.
? stata dunque testata l?efficacia della terapia combinata di TMZ e trattamento con QMR su cellule di glioblastoma A172. Tali cellule sono state trattate con 10-25 ?M di TMZ contemporaneamente o successivamente al trattamento con QMR. Sono stati analizzati i valori di vitalit? cellulare, apoptosi e ciclo cellulare. La concentrazione di farmaco TMZ ? stata selezionata sulla base della sua IC50 (figura 14).
I risultati ottenuti hanno dimostrato sorprendentemente che, quando il farmaco TMZ in concentrazione 10 ?M ? stato utilizzato in combinazione con trattamento con QMR, la vitalit? cellulare ? risultata ridotta di circa il 12% in pi? rispetto alla riduzione di vitalit? cellulare ottenuta nelle cellule trattate con il solo farmaco TMZ, come mostrato in figura 12b.
Questi dati inoltre, sono risultati essere sorprendentemente correlati con i dati sull?apoptosi cellulare. Infatti, la somministrazione combinata di TMZ e QMR ha mostrato che la riduzione del numero di cellule vive ? associato ad un incremento del numero di cellule in apoptosi precoce, come visibile dai grafici delle figure 13a e 13b.
La contemporanea esposizione delle cellule al farmaco TMZ 25 ?M e alla QMR attiva una maggiore alterazione nella progressione del ciclo cellulare, rispetto alle cellule trattate con il solo farmaco TMZ.
Questi dati dimostrano sorprendentemente che la strategia terapeutica combinata di TMZ con QMR induce un significativo arresto del ciclo cellulare nella fase G2-M e riduce la percentuale di cellule nella fase G0-G1, come mostrato in figura 14b.
Claims (14)
1) Farmaco antitumorale per l?uso in un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, detto metodo comprendendo il trattamento di dette cellule neoplastiche con detto farmaco antitumorale contemporaneamente all?applicazione di onde di corrente elettrica a detta regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito mentre dette cellule neoplastiche sono trattate con detto farmaco antitumorale, dette onde di corrente elettrica avendo una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
2) Farmaco antitumorale secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda presenta frequenza fondamentale compresa tra 2 e 64 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz.
3) Farmaco antitumorale secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda presenta frequenza fondamentale di circa 4 MHz.
4) Farmaco antitumorale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale.
5) Farmaco antitumorale secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda sinusoidale ? distorta per la presenza di armoniche.
6) Farmaco antitumorale secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda sinusoidale risulta distorta per la presenza di armoniche almeno del secondo e del terzo ordine.
7) Farmaco antitumorale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto farmaco antitumorale comprende temozolomide.
8) Farmaco antitumorale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette cellule neoplastiche comprendono cellule di glioblastoma e detta regione bersaglio comprende il sistema nervoso centrale.
9) Farmaco antitumorale per l?uso in un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, detto metodo comprendendo il trattamento di dette cellule neoplastiche con detto farmaco antitumorale successivamente all?applicazione di onde di corrente elettrica a detta regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, dette onde di corrente elettrica avendo una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 64 MHz.
10) Farmaco antitumorale per l?uso in un metodo per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, detto metodo comprendendo il trattamento di dette cellule neoplastiche con detto farmaco antitumorale precedentemente all?applicazione di onde di corrente elettrica a detta regione bersaglio per un periodo di tempo predefinito, dette onde di corrente elettrica avendo una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 64 MHz.
11) Dispositivo configurato per bloccare o inibire la crescita di cellule neoplastiche in una regione bersaglio, detto dispositivo essendo configurato per generare onde di corrente elettrica aventi una forma d?onda con frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz; detto dispositivo comprendendo uno o pi? elettrodi collegati ad almeno un circuito di radiofrequenza atto a fornire a ciascuno di detti elettrodi un?onda di corrente avente frequenza fondamentale superiore o uguale a 2 MHz.
12) Dispositivo secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda presenta frequenza fondamentale compresa tra 2 e 64 MHz, preferibilmente compresa tra 2 e 20 MHz, pi? preferibilmente compresa tra 4 e 20 MHz, ancor pi? preferibilmente di circa 4 MHz.
13) Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 11 o 12, caratterizzato dal fatto che detta forma d?onda ? una forma d?onda sinusoidale, preferibilmente detta forma d?onda sinusoidale essendo distorta per la presenza di armoniche.
14) Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 11 a 13, caratterizzato dal fatto che detti uno o pi? elettrodi sono elettrodi del tipo impiantabile, detti uno o pi? elettrodi essendo atti ad essere impiantati in corrispondenza o in prossimit? di detta regione bersaglio.
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| K. P. BECKERJ. YU: "Status quo--standard-of-care medical and radiation therapy for glioblastoma", CANCERJOURNAL (SUDBURY, MASS., vol. 18, 2012, pages 12 - 19 |
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| M. GILADI: "Mitotic spindle Disruption by alternating Electric Fields leads to Impro Chromosome Segregationand mitotic Catastrophe in Cancer cells", SCIENTIFICREPORTS, vol. 5, 2015, pages 18046 |
| Q. T. OSTROM: "the epidemiology of glioma in adults: A ''State of the science''re view", NEURO-ONCOLOGY, vol. 16, 2014, pages 896 - 913 |
| S.. SADDLE: "in-vitro analysis of Quantum molecular Resonance effects on human mesenchymal stromal cells", PLOS ONE, vol. 13, 2018, pages e0190082 |
| T. A. WILSONM. A. KARAJANNISD. H. HARTER: "glioblastoma multiforme: State of the art and future therapeutics", SURG NEUROL INT, vol. 5, 2014, pages 64 - 64 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230118603A (ko) | 2023-08-11 |
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