JP2024515405A - 腫瘍性細胞の治療のための装置及び抗腫瘍薬 - Google Patents
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Abstract
生体の標的領域における腫瘍細胞の増殖を阻止又は阻害する方法において使用される抗腫瘍薬を提供する。該方法は、新生物細胞が抗腫瘍薬により治療されている所定の期間において、標的領域への電流波の印加を同時に行いながら、新生物細胞を抗腫瘍薬で治療する工程を含み、電流波は、２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する波形を有する。【選択図】図１
Description
本発明は、生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害するように構成されたデバイスに関し、特に、抗腫瘍薬と組み合わせて新生物細胞の増殖を阻止又は阻害するための装置の使用に関する。
新生物又は腫瘍は、規制メカニズムから逸脱して、増殖し、体全体に広がる細胞の変化に由来するものである。実質的にあらゆる臓器に影響を与える可能性のある新生物には、多くの種類が存在する。それらは通常、腫瘍細胞が周囲の構造及びより遠位の器官に侵入する能力に応じて、良性又は悪性に分類される。固形臓器の腫瘍に加えて、新生物という用語は、リンパ腫及び白血病などの血球の腫瘍も含む。
臨床分野において、ターゲット型予防措置、早期診断及び治療により、ここ数十年で大きく進歩があったにも関わらず、新生物は、死因及び生活の質低下の主要な原因であり続けている。
腫瘍治療は基本的に手術、特に、局所的な手術、放射線療法、薬剤療法に基づくものである。
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）は、ＧＢＭ腫瘍細胞の、腫瘍病変に隣接する実質組織への浸潤能力の高さゆえ、ヒトにとって最も侵略的な腫瘍の１つである（非特許文献１）。
ＧＢＭ患者は通常、手術によって病変の切除、可能であれば、完全切除を受け、その後、放射線療法と、アルキル化抗腫瘍薬であるテモゾロミドによる化学療法を受ける（非特許文献２）。
しかし、多面的な治療アプローチにもかかわらず、ＧＢＭは高い再発率、薬剤耐性、及び壊滅的な神経学的悪化を特徴とする（非特許文献３）。
ＧＢＭは特に浸潤性腫瘍であり、したがって病変の完全な外科的切除の実施は事実上不可能であるため、ほとんどすべての患者が再発を経験し、生存期間はわずか１４か月である（非特許文献４）。さらに、手術後５年での患者の生存率は、わずか５％未満である（非特許文献５）。
したがって、新しい治療戦略を開発し、使用する薬の有効性を改善し、それに伴う副作用を軽減することで、患者の生活の質を向上させることが急務であることは、明らかである。
この意味で、最も有望な治療法の１つは、非電離電磁界（ＥＭＦ）の活用である。
この治療法は、優れた安全性、低毒性、及び従来の薬剤療法との併用の可能性があるとされ、特に有望である（非特許文献６）。
近年、いくつかのＥＭＦ技術が試験されており、単独でも化学療法と組み合わせて使用した場合でも、さまざまな種類の腫瘍に対して良、好なレベルの有効性があることが示されている（非特許文献７）。
異なる周波数範囲が細胞内の異なる応答メカニズムを引き起こし、これらの細胞の有糸分裂紡錘体の形成及び安定性に作用することによって、腫瘍細胞の細胞増殖の抑制をもたらし得ることが見出されている（非特許文献８）。
２０１１年、米国食品医薬品局により、再発性多形性神経膠芽腫患者の治療に腫瘍治療フィールド（ＴＴフィールド）の使用が認可された。
例として、特許文献１及び特許文献２など、この趣旨の先行技術文献が数件公開されている。
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M. O. Mattsson, M. Simko "Emerging medical applications based on non-ionizing electromagnetic fields from 0 Hz to 10 THz" Medical devices（ニュージーランド、オークランド）, 2019年, 第12巻, pp. 347-368
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本発明の課題は、生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害する、公知の種類のものに代わる装置及び方法を実現することである。
特に、このような装置及び方法が、多形性膠芽腫などの侵略型の新生物の治療においても使用され得ることが本発明の目的である。
さらに、このような装置及び方法が、非侵略型の新生物を患う患者に対して使用され得ることが本発明の目的である。
さらに、本発明の目的は、より大きな治療効果及び低減された毒物学的プロファイルを有し、患者の生活の質を改善する抗腫瘍薬を実現することである。
上記の目的は、主たる請求項に記載されるような抗腫瘍薬によって達成される。
上記の目的は、請求項７に記載されるような装置によっても達成される。
さらに、これらの目的は、以下に記載される腫瘍性細胞の治療方法によっても達成される。
特に、本発明は、生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害する方法に使用するための抗腫瘍薬に関し、該方法は、所定の期間、標的領域への電流波の印加の前、同時、又は後に、新生物細胞を抗腫瘍薬で治療することを含み、電流波は、基本周波数が２ＭＨｚ以上の波形を有することを特徴とする。
好ましくは、このような電流波は、２～６４ＭＨｚの範囲の基本周波数、より好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲、さらにより好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲の波形を有する。
またさらに好ましくは、そのような電流波は、約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有する。
このような電流波の印加は、本明細書では、量子分子共鳴又はＱＭＲとも称される。
さらに、本発明の態様によれば、このような電流波は正弦波波形を有する。
本発明の一態様によれば、この波形は、高調波の存在によって変形する。
本発明の別の態様によれば、正弦波波形は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形する。
本発明の一態様によれば、抗腫瘍薬による腫瘍細胞の治療は、前述の電流波の適用と同時に、又はその後に行われる。
好ましくは、本発明の一態様によれば、抗腫瘍薬による新生物細胞の治療は、標的領域への電流波の印加と同時に行われ、新生物細胞は、この抗腫瘍薬で治療される。
本発明の一態様によれば、前述の抗腫瘍薬はテモゾロミドを含む。
本発明の一態様によれば、腫瘍細胞は膠芽腫細胞を含む。
特に、標的領域は生物に属し、好ましくはヒトである。
標的領域は、中枢神経系を含むことが好ましい。
生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害するための装置も本発明の一部であり、装置は、２ＭＨｚ以上、好ましくは２～６４ＭＨｚの範囲、より好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲、さらにより好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲、またさらにより好ましくは約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有する電流波を生成するように構成され、波形は、高調波の存在によって変形した正弦波波形である。
この装置は、少なくとも１つの無線周波回路に接続された１つ以上の電極を備え、少なくとも１つの無線周波回路は、２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する電流波を、これらの電極の各々に供給する。
このような１つ以上の電極は、電流波を標的領域に伝送するように構成される。
本発明の一態様によれば、本装置の電極は、埋め込み型の電極であり、前述の標的領域又はその近傍に移植される。
標的領域における腫瘍細胞の増殖を阻止又は阻害する方法もまた、本発明の一部である。
この標的領域は、好ましくは生物に属する。
本発明の方法の１つの態様によれば、前述の標的領域に電流波を所定の期間印加することによって腫瘍細胞を治療することを含み、電流波は、２ＭＨｚ以上、好ましくは２～６４ＭＨｚの範囲、より好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲、さらにより好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲、またさらにより好ましくは約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有する。
さらに、本発明の方法の一態様によれば、このような波形は正弦波波形である。
ここでも、本発明の一態様によれば、この正弦波波形は、高調波の存在によって変形する。
ここでも、本発明の方法の別の態様によれば、正弦波波形は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形する。
さらに、本発明の方法の１つの態様によれば、腫瘍細胞は膠芽腫細胞を含む。
本発明の一態様によれば、標的領域は中枢神経系を含む。
本発明の方法のさらなる態様によれば、この方法は以下の工程を含む。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の電極に接続する工程。
・腫瘍細胞を含む標的領域が位置する生体の体表面に、これらの電極の少なくとも一方を取り付ける工程。
・電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の電極に接続する工程。
・腫瘍細胞を含む標的領域が位置する生体の体表面に、これらの電極の少なくとも一方を取り付ける工程。
・電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
あるいは、本発明の方法の別の態様によれば、この方法は以下の工程を含む。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の埋め込み型の電極に接続する工程。
・生体内の、腫瘍細胞を含む標的領域、又はその近傍に、これらの電極の少なくとも一方を埋め込む工程。
・電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の埋め込み型の電極に接続する工程。
・生体内の、腫瘍細胞を含む標的領域、又はその近傍に、これらの電極の少なくとも一方を埋め込む工程。
・電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
好ましくは、本発明の方法は、本発明の装置を利用する。
本発明の薬剤、装置及び方法のさらなる特徴及び利点は、例示として非限定的に示す本発明の好ましい実施形態に関する以下の説明から、当業者にとって明らかとなるであろう。
上記に示したように、本発明は、生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害する方法に関する。
腫瘍細胞という用語は、本明細書では、増殖制御メカニズムを回避し、独自の自律的生殖プログラムに従う細胞を指す際に使用される。これらの細胞は、正常な細胞と比べて増殖が過剰で不調和な異常な細胞の集合であり、それを誘発した刺激が停止した後も、過度に進行する。
前述の新生物、及び、場合によっては、この腫瘍塊が拡大する生体の身体領域はまた、上述の標的領域を示す。
例えば、これらに限定はされないが、こうした新生物は、肺、結腸直腸、乳腺、前立腺、膵臓、肝臓新生物、又は骨髄細胞の血液学的新生物、リンパ系、免疫系などを含み得る。
特に、本発明の腫瘍性細胞は、膠芽腫（ＧＢＭ）細胞、悪性星状細胞性腫瘍を含み、標的領域は中枢神経系を含む。
本発明の方法は、前述の標的領域に電流波を所定の期間印加することによって新生物細胞を治療することを提供し、ここで、電流波は、好ましくは２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する正弦波波形を有する。
基本周波数が２ＭＨｚ以上の正弦波波形を有する電流波の適用は、これらの電流波が印加される分子にエネルギーを伝達し、これは量子分子共鳴（ＱＭＲ）という用語で定義される、いわゆる「分子共鳴」に対応する。
出願人に代わって、特許文献３及び非特許文献９から、このＱＭＲエネルギーは、電流が流れた分子間の結合を切断するのに十分であることが知られており、メスに適用すると特に有効である。メスにより、破裂、裂け、壊死、関与する組織の厚さの減少又は増加、液体含有量の変化、凝固又は切断周囲の他の変性効果の影響を生じさせることなく、実際に、標的領域の切断が可能となる。
しかし、驚くべきことに基本周波数が２ＭＨｚ以上の波形の電流波が腫瘍性の細胞に印加されると、抗腫瘍作用が発揮されるということが発見された。
本出願人は、実際に電流波を応用して、ＱＭＲ共鳴エネルギーを新生物細胞に伝達することで、これらの細胞の運動性と侵略性を減少させることが可能であることを発見した。これにより、これらの細胞がマトリックスを通して移動し、新しい腫瘍病変を引き起こす能力が低下する。
ＢＭ－ＭＳＣ細胞における実験でも、このような電流波の適用は、正常な非新生物型細胞に対して無害であることが明らかになった。これにより、この発明の方法が選択的であり、新生物細胞の増殖を阻害するか抑制するだけであり、これらの新生物細胞の周囲に存在する支持細胞の増殖には影響を及ぼさないことが保証されている。これは、従来の標準的な抗腫瘍療法とは異なる点である。
さらに、このような電流波を膠芽腫細胞に適用すると、それらのタンパク質構造の全体的な変化を引き起こし、最終的に細胞死につながることが確認されている。
さらに、健康な細胞ではこのタンパク質の変化は迅速に対処されるという利点がある。
本発明の方法において、２～６４ＭＨｚの範囲、より好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲、さらにより好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲の基本周波数値を利用することが特に有利であることが証明されている。
特に好ましいのは、基本周波数約４ＭＨｚの波形を有する電流波の使用である。
好ましくは、このような波形は正弦波型の波形である。さらに、本発明の方法の一態様によれば、このような正弦波波形は、高調波の存在によって変形する。
ここでも、本発明の方法の別の態様によれば、正弦波波形は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形する。
好ましくは、正弦波波形は、少なくとも１次、２次及び３次の高調波の存在によって変形する。
後述する実験の結果が示すように、前述の電流波を新生物細胞に印加することで、新生物細胞の増殖を高い成功率で阻止又は阻害することが可能となり、標的領域に存在する健康な細胞に対しては、実質的に無害とすることができる。
このような電流波の適用と、既知のタイプの抗腫瘍薬による新生物細胞の治療を組み合わせる効果も試験された。
抗腫瘍薬という用語は、任意の分子又は分子の組み合わせを指し、医薬用途のために、腫瘍形成の増殖及び拡大を阻害又は阻止することを意図する。
抗腫瘍薬テモゾロミド（ＴＭＺ）の使用が特に好ましい。
驚くべきことに、前述の標的領域の新生物細胞に対して、基本周波数が２ＭＨｚ以上の波形を持つ電流波を、事前、同時、又は抗腫瘍薬の治療の前後に所定の期間適用することで、抗腫瘍薬のより高い抗腫瘍効果を得ることが可能であることが明らかとなった。特に、基本周波数が２～６４ＭＨｚの範囲、より好ましい範囲では２～２０ＭＨｚの範囲、さらには４～２０ＭＨｚの範囲、より一層好ましくは約４ＭＨｚの周波数が効果的である。
特に、ＱＭＲと組み合わせた抗腫瘍薬の使用により、腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬単独の使用よりも、生腫瘍細胞の数のより大きな減少を得ることができる。
したがって、抗腫瘍薬の治療と前述の電流波の応用を組み合わせることにより、治療された新生物細胞に対して、単独で抗腫瘍薬を使用するよりもより強力な抗腫瘍効果が得られることが強調される。これにより、同じ抗腫瘍効果を持ちながら、抗腫瘍薬の投与量を減少させることが可能となる。
さらに利点として、ＱＭＲの使用による投与量の減少により、同様の抗腫瘍効果を得ることができる一方で、抗腫瘍薬の治療によって引き起こされる副作用を大幅に減少させることが可能となる。これにより、抗腫瘍療法に伴う副作用の負担を軽減することができる。
こうした利点は、抗腫瘍薬がＱＭＲによる治療と同時に又は治療後に投与される場合に、特に顕著である。
この利点は、薬剤がＱＭＲ治療と同時に投与される場合にさらに顕著である。
さらに利点として、抗腫瘍薬とＱＭＲの併用治療により、早期アポトーシスを遂げる細胞の数を増加させることができる。
ＱＭＲは、現在使用されている抗腫瘍薬の効果を高めるために、従来の化学療法に効果的な補完として利用できることが明らかであると同時に、毒性の増加を伴わずに効果を向上させることができる。
これらの抗腫瘍薬に加えて、ＱＭＲは他の種類の抗腫瘍治療とも組み合わせて適用できまる。
抗腫瘍治療の例として、外科的処置、放射線外科手術、電離放射線治療、アルキル化剤による化学療法処置、代謝阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗真菌薬、コルチコステロイド、生物学的薬剤、分化促進剤、ホルモン、免疫系を刺激する薬剤、モノクローナル抗体が含まれるが、これらには限定されない。
したがって、生体内の標的領域に存在する新生物細胞の増殖を阻害するための方法に使用される抗腫瘍薬も、本発明の一部となる。該方法では、前述の標的領域に対して所定の時間にわたり電流波を適用した後、又は同時に、新生物細胞にこのような抗腫瘍薬を投与することが含まれる。前述のように、これらの電流波は、２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する波形を有する。
本発明の一態様によれば、抗腫瘍薬による腫瘍細胞の治療が、前述の電流波の適用に先立って行われることは、排除されない。
好ましくは、この波形は、２～６４ＭＨｚの範囲の基本周波数、好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲、より好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲を有する。
より好ましくは、この波形は約４ＭＨｚの基本周波数を有する。
さらに好ましくは、前述の波形は正弦波波形である。
さらに、この正弦波波形は高調波の存在によって変形する。
好ましくは、このような正弦波波形は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形する。
本発明の一態様によれば、抗腫瘍薬は、新生物細胞に対して前述の電流波を生体内の標的領域に適用する際に、同時に新生物細胞に対しても抗腫瘍薬を投与する方法に使用される。該方法においては、新生物細胞が抗腫瘍薬で治療されると同時に、同じタイミングで電流波が標的領域に適用される。
本発明の方法の説明に戻ると、該方法は、好ましくは以下の工程を含む。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の電極に接続する工程。
・腫瘍細胞を含む標的領域が位置する生体の体表面に、これらの電極の少なくとも一方を取り付ける、又は、生体内の、腫瘍細胞を含む標的領域、又はその近傍に、これらの電極の少なくとも一方を埋め込む工程。
・これら１つ以上の電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
・電流波を生成するように構成され、基本周波数が２ＭＨｚ以上、好ましくは、高調波の存在によって変形した正弦波波形を有する装置を、１つ以上の電極に接続する工程。
・腫瘍細胞を含む標的領域が位置する生体の体表面に、これらの電極の少なくとも一方を取り付ける、又は、生体内の、腫瘍細胞を含む標的領域、又はその近傍に、これらの電極の少なくとも一方を埋め込む工程。
・これら１つ以上の電極に電流波を転送するよう装置を作動させ、所定の期間、装置を作動させたままにする工程。
好ましくは、生体は、ヒトを対象としている。
これらの電極は、前述の電流波を標的領域に伝送するのに好適な形状及び構成を備える。
例として、このような電極は、非埋め込み型のものであってもよく、例えば、ハンドピースの形態又は吸盤の形態であってもよく、又は、再び本質的に層状の形状であり、被験体の皮膚への接着によって適用可能であり、そのような電極は、プローブの形態であってもよいが、これらには限定されない。
本発明の方法で使用される電極が層流形状を有する場合、それらは本質的に身体の表面の形状に容易に追従するよう、柔軟性を有し、さらに、装置によって生成された波形の印加中に、身体に接触させ続けることを容易にする接着性物質も任意に備える。
前述の電極のうちの１つ以上が埋め込み型であり得る可能性は、排除されない。
したがって、生物の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害するための装置もまた、本発明の一部を形成する。
このような装置は、本発明の方法において使用可能である。
特に、本発明の装置は、２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する波形を有する電流波を発生させる構成である。
標的領域は、好ましくは、既に上記に示したように、生物に属し、より好ましくはヒトに属する。
本発明の好ましい実施形態によれば、本装置は、１つ以上の電極に接続された無線周波回路を備え、これらの電極のそれぞれに２ＭＨｚ以上の基本周波数を有する電流波を供給する。
好ましくは、本装置は、主電圧によって給電される整流回路をさらに備える。整流回路は、好ましくは連続電圧、より好ましくは安定化された電圧を、前述の無線周波回路に供給する。
このような無線周波回路は、電圧によって給電され、駆動回路によって駆動される、少なくとも１つの電子スイッチを備えることが好ましい。
より詳細には、無線周波回路は出力側に、基本周波数が２ＭＨｚ以上の電流波を持ち、これらの電極に電流波を伝達する。好ましい基本周波数は、２～６４ＭＨｚの範囲にあり、より好ましくは２～２０ＭＨｚの範囲にあり、さらにより一層好ましくは４～２０ＭＨｚの範囲にある。
より好ましくは、基本周波数は約４ＭＨｚに相当する。
この電流波も正弦波の形状を有する。
この電流波は、高調波の存在によっても有利に変形する。
これらの高調波は、少なくとも２次及び３次の高調波であることが好ましい。
より好ましくは、電流波は、少なくとも１次、２次及び３次の高調波の存在によって変形した正弦波形状を有する。
この電流波はまた、変形した正弦波形状の基本波の周波数で、好ましくは広帯域共振回路内を循環する。
本発明の好ましい実施形態によれば、本装置は、４～６４ＭＨｚの高調波を有する、４ＭＨｚの高周波正弦波交流電流波を生成する。
本発明の装置の一態様によれば、本装置の電極は、前述の電流波を標的領域に送信できるように構成されている。
本発明の装置の電極は、本発明の方法に関する上述した電極の形状及び構成に対応する形状及び構成を有し得ることが明記される。
本発明の装置の一態様によれば、このような電極は、非移植型であり、腫瘍性細胞を含む標的領域が位置する、又は、その近傍の生物の体の表面に適用される。
装置の変形実施形態によれば、ヘルメットが設けられる。該ヘルメットは、前述の電極が収容でき、前述の無線周波回路との接続と、標的領域又はその近傍での配置の両方を可能にするように構成されている。
なお、前述のヘルメットを備える装置の特定の変形実施形態によれば、ヘルメットは無線周波回路も収容するように構成される。
さらなる変形例によれば、該装置は、前述の電極を収容し、標的領域又はその近傍で適用されることを可能にするように構成されたウェアラブルタイプのキャップを備える。
別の変形例によれば、該装置は、前述の電極を備えた少なくとも１つのバンドを備える。任意ではあるが、このバンドは、装置の無線周波回路も収容するように構成される。
このバンドはまた、被験者の頭部に対して横方向及び／又は正面及び／又は後方に配置されるように構成される。
そのようなバンドが人の腰に配置され、ベルトとして、人が着用するように構成される可能性を排除するものではない。
さらに、このバンドが上記とは異なる方法で被験者によって着用され得ることを排除するものではない。
本発明の装置の特定の変形例によれば、本発明の装置の電極の少なくとも１つ以上は、埋め込み型の電極である。
「埋め込み型」という用語は、外科的又は医学的介入によって人体に全体的又は部分的に移植されることを意図した電極を意味する。
本発明の別の変形実施形態によれば、本装置は、完全に移植可能になるように構成される。
例として、本埋め込み型装置は、埋め込み型ペースメーカの構成と実質的に類似した構成を有する。
本発明の他の態様及び利点は、例示的であり非限定的な、以下の実施例によっても、明らかになる。
実施例１． 材料と方法
１．１ 細胞培養と細胞増殖
膠芽腫細胞株Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧを使用した。Ａ１７２及びＴ９８Ｇ細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）をダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）で培養し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（品質が保証されたオーストラリア産のもの、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した。
１．１ 細胞培養と細胞増殖
膠芽腫細胞株Ａ１７２、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧを使用した。Ａ１７２及びＴ９８Ｇ細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）をダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）で培養し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（品質が保証されたオーストラリア産のもの、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した。
Ｕ８７ＭＧ細胞（提供：マッシモ・ドミニチ教授、モデナ・レッジョ・エミリア大学病院細胞療法研究所、イタリア国モデナ）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した。
骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）もまた、非腫瘍型対照細胞として使用された。ＢＭ－ＭＳＣ細胞は、前述のように、ＵＬＳＳ８ Ｂｅｒｉｃａ社における、血液学複合運用ユニットの先端細胞治療研究室（Ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＬＴＣＡ））で産生された（非特許文献１０）。簡単に説明すると、ＭＳＣは、健康なドナーから廃棄された骨髄収集バッグ及びフィルターを洗浄することによって得られた細胞から単離された（倫理委員会認証第１０７／１８号、２０１９年１２月２日）。洗浄後、細胞を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むＤＭＥＭに１ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。細胞培養物を、５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気下で３７°Ｃでインキュベートした。播種後７２時間で接着しなかった細胞を除去し、新しい培地を添加した。培地は３～４日ごとに交換した。８０％コンフルエントで、ＢＭ－ＭＳＣ細胞を２，０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。
１．２ ＱＭＲ刺激プロトコル
細胞株は、Ｔｅｌｅａ社（Ｔｅｌｅａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、イタリア国ヴェネト州サンドリゴ）のプロトタイプＱＭＲ装置を使用してＱＭＲ刺激が加えられた。本装置は、本インビトロ実験に適切に適合したもので、４ＭＨｚの高周波正弦波交流電流波を生成し、４～６４ＭＨｚの高調波を有する。本装置の仕様としては、電源供給１００÷２３０Ｖ～５０／６０Ｈｚ、最大出力電力５Ｗ／４００Ωである。
細胞株は、Ｔｅｌｅａ社（Ｔｅｌｅａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、イタリア国ヴェネト州サンドリゴ）のプロトタイプＱＭＲ装置を使用してＱＭＲ刺激が加えられた。本装置は、本インビトロ実験に適切に適合したもので、４ＭＨｚの高周波正弦波交流電流波を生成し、４～６４ＭＨｚの高調波を有する。本装置の仕様としては、電源供給１００÷２３０Ｖ～５０／６０Ｈｚ、最大出力電力５Ｗ／４００Ωである。
ＱＭＲは、１００ｍｍのペトリ皿の内側の端に配置され、発電機装置に接続された一対の電極を使用して細胞に印加された。細胞培養の培地への電界の伝達は熱を発生する（ジュール効果）。刺激細胞の培地の平均温度上昇は５°Ｃであった。この値は、培養培地に入れたデータロガープローブ（ｉＬｏｇ、エスコートスカンソープ、英国）による３回の独立した測定によって測定された。刺激細胞の培地の温度上昇を補い、刺激細胞の平均温度を３７°Ｃにするために、刺激細胞に使用するインキュベーターを５％ＣＯ２で３２°Ｃに設定し、実験室の温度を２０°Ｃ～２５°Ｃに維持した。
１．３ 実験のセットアップ
使用した細胞株に基づいて、６０％コンフルエントで刺激されるように、規定数の細胞を１００ｍｍプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、ドイツ国フリッケンハウゼン）に播種した。次に、細胞をＱＭＲに２４時間曝露し、刺激終了後０～２４～４８時間で分析した。
使用した細胞株に基づいて、６０％コンフルエントで刺激されるように、規定数の細胞を１００ｍｍプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、ドイツ国フリッケンハウゼン）に播種した。次に、細胞をＱＭＲに２４時間曝露し、刺激終了後０～２４～４８時間で分析した。
より具体的には、細胞をＤ－ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で洗浄し、１Ｘ ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で剥離し、得られたアリコートを使用して、細胞生存率、アポトーシス、細胞周期、核型、プロテオミクスを調べた。半固体培地での細胞増殖能の評価（軟寒天アッセイ）のために細胞アリコートを再播種し、刺激前後のＱＭＲ刺激プレート上で細胞遊走を直接モニタリングした。
ＱＭＲと薬剤ＴＭＺ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の併用の効果も試験した。
これらの分析のために、細胞をＱＭＲ刺激と同時に、又は、ＱＭＲ刺激後に投与された１０～２５μＭのＴＭＺで１４４時間治療した。ＴＭＺストック溶液は、ＤＭＳＯ中で終濃度１０ｍＭで調製し、４°Ｃに維持した。その後の希釈を新鮮な培養培地で行い、細胞に投与した。細胞生存率、アポトーシス及び細胞周期を１４４時間後に評価した。
１．４ 細胞生存率：トリパンブルー排除アッセイ
刺激後、細胞は収穫され、培養液中にトリパンブルー溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と１：１の比率で懸濁した。細胞はＢｕｒｋｅｒ社のカウンターを用いて数えられ、生細胞数は以下の式を用いて計算された：［（細胞の数×１０，０００×２×Ｖ）／９］。ここで、Ｖは得られた細胞溶液の総容量を表し、２は染料（２倍希釈）との溶液の希釈倍率を表す。
刺激後、細胞は収穫され、培養液中にトリパンブルー溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と１：１の比率で懸濁した。細胞はＢｕｒｋｅｒ社のカウンターを用いて数えられ、生細胞数は以下の式を用いて計算された：［（細胞の数×１０，０００×２×Ｖ）／９］。ここで、Ｖは得られた細胞溶液の総容量を表し、２は染料（２倍希釈）との溶液の希釈倍率を表す。
１．５ アポトーシス：アネキシンＶ／７－アミノアクチナマイシンＤ（７－ＡＡＤ）によるラベリング
刺激後、１．５×１０５細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離した。結合バッファーで洗浄した後、細胞を製造元の指示に従ってアネキシンＶ／７－ＡＡＤでラベリングした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッド）。結合バッファーで希釈した後、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ブレア）を使用して２×１０４細胞／サンプルの蛍光を検出した。細胞集団を、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤの両方について負の蛍光を有する生細胞、アネキシンＶが陽性で７－ＡＡＤに対して陰性である初期アポトーシス（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）の細胞、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤ（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）が二重陽性の後期アポトーシスの細胞、及び、アネキシンＶが陰性で７－ＡＡＤ陽性の死細胞（アネキシンＶ－／７－ＡＡＤ＋）を有する細胞、の４グループに分けた。
刺激後、１．５×１０５細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離した。結合バッファーで洗浄した後、細胞を製造元の指示に従ってアネキシンＶ／７－ＡＡＤでラベリングした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッド）。結合バッファーで希釈した後、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ブレア）を使用して２×１０４細胞／サンプルの蛍光を検出した。細胞集団を、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤの両方について負の蛍光を有する生細胞、アネキシンＶが陽性で７－ＡＡＤに対して陰性である初期アポトーシス（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ－）の細胞、アネキシンＶ及び７－ＡＡＤ（アネキシンＶ＋／７－ＡＡＤ＋）が二重陽性の後期アポトーシスの細胞、及び、アネキシンＶが陰性で７－ＡＡＤ陽性の死細胞（アネキシンＶ－／７－ＡＡＤ＋）を有する細胞、の４グループに分けた。
１．６ 細胞周期
刺激後、５×１０５細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離した。次いで、細胞をＤ－ＰＢＳで洗浄し、固定し、アセトン（水中の８０％溶液）で透過治療した。４°Ｃで１時間後、アセトンを遠心分離により除去し、細胞を洗浄し、７－ＡＡＤ（インビトロジェン社）で室温で１時間１μｇ／ｍＬでラベリングした。２．５×１０４細胞／サンプルの蛍光は、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して分析された。ＥＸＰＯ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フラートン）を使用して、細胞周期のさまざまな段階にある細胞の割合を計算した。二倍体サイクルを考慮し、細胞クラスターについては修正した。
刺激後、５×１０５細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離した。次いで、細胞をＤ－ＰＢＳで洗浄し、固定し、アセトン（水中の８０％溶液）で透過治療した。４°Ｃで１時間後、アセトンを遠心分離により除去し、細胞を洗浄し、７－ＡＡＤ（インビトロジェン社）で室温で１時間１μｇ／ｍＬでラベリングした。２．５×１０４細胞／サンプルの蛍光は、ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用して分析された。ＥＸＰＯ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フラートン）を使用して、細胞周期のさまざまな段階にある細胞の割合を計算した。二倍体サイクルを考慮し、細胞クラスターについては修正した。
１．７ 核型解析
ＱＭＲ刺激が安全であり、したがって染色体変化を引き起こさないかどうかを評価するために、ＢＭ－ＭＳＣ間葉系間質細胞をＱＭＲで２４時間刺激し、３５０／４００バンド分解能の標準技術に従って、Ｇ－トリプシン－ギムザバンディングによって試験した。２０の中期が分析され、３が核型化された。非刺激ＢＭ－ＭＳＣ細胞をコントロール細胞として用いた。
ＱＭＲ刺激が安全であり、したがって染色体変化を引き起こさないかどうかを評価するために、ＢＭ－ＭＳＣ間葉系間質細胞をＱＭＲで２４時間刺激し、３５０／４００バンド分解能の標準技術に従って、Ｇ－トリプシン－ギムザバンディングによって試験した。２０の中期が分析され、３が核型化された。非刺激ＢＭ－ＭＳＣ細胞をコントロール細胞として用いた。
１．８ 細胞遊走（スクラッチテスト）
スクラッチテストは、細胞の運動性を半定量的に検出するための２Ｄ細胞移動アプローチを表している。スクラッチ（開口）の目的は、周囲の細胞を遊走させてこの開口部を閉じるように誘導するために、無細胞領域（又は開口部）を作成することである。細胞を２ウェルシリコーンインサート（ＩＢＩＤＩ社、ドイツ国グレーフェルフィング）に播種し、細胞単層上に５００μｍの無細胞開口部を得た。
スクラッチテストは、細胞の運動性を半定量的に検出するための２Ｄ細胞移動アプローチを表している。スクラッチ（開口）の目的は、周囲の細胞を遊走させてこの開口部を閉じるように誘導するために、無細胞領域（又は開口部）を作成することである。細胞を２ウェルシリコーンインサート（ＩＢＩＤＩ社、ドイツ国グレーフェルフィング）に播種し、細胞単層上に５００μｍの無細胞開口部を得た。
６０％の細胞コンフルエントに達したら、インサートを除去し、細胞をＱＭＲで２４時間刺激した。細胞遊走は、刺激前及び刺激後０～２４～４８時間の画像取得によって経時的にモニタリングした。画像取得は、Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０ＣＦＬ倒立光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ国オーバーコッヘン）で行った。開口部の閉鎖率はＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、アメリカ合衆国メリーランド州ベセスダ）で分析され、移動能力は、以下に示すように計算された移動率曲線によって、評価された：閉鎖％＝［（面積ｔｘ－面積ｔｙ）／面積ｔｘ］×１００。ここでｔｘは取得時間を表し、ｔｙは次の時点を表する。
１．９ 軟寒天
半固体培地（軟寒天培地）でのコロニー形成アッセイは、基質への細胞固定とは無関係に細胞増殖をモニタリングするために使用される方法であり、光学コロニーカウントによって半固体培地での細胞増殖を測定する。軟寒天でのコロニー形成速度は、使用する細胞株によって異なる。したがって、アガロースの濃度、播種された細胞数及び実験の最終日は、各細胞株に対して最適化した。細胞懸濁液を細胞培地中の０．４％アガロース溶液中で調製し、完全培地中の０．６％アガロースの固化層上に播種した。室温で１時間後、１６０μｌの完全培地を添加し、さらに１００μｌを実験終了まで毎週添加した。プレートを３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターに２１～２４日間移した後、１００μＭのカルセイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で３０分間ラベリングした。少なくとも５０個の細胞からなるコロニーを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０ＣＦＬ倒立光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて計数した。
半固体培地（軟寒天培地）でのコロニー形成アッセイは、基質への細胞固定とは無関係に細胞増殖をモニタリングするために使用される方法であり、光学コロニーカウントによって半固体培地での細胞増殖を測定する。軟寒天でのコロニー形成速度は、使用する細胞株によって異なる。したがって、アガロースの濃度、播種された細胞数及び実験の最終日は、各細胞株に対して最適化した。細胞懸濁液を細胞培地中の０．４％アガロース溶液中で調製し、完全培地中の０．６％アガロースの固化層上に播種した。室温で１時間後、１６０μｌの完全培地を添加し、さらに１００μｌを実験終了まで毎週添加した。プレートを３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターに２１～２４日間移した後、１００μＭのカルセイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で３０分間ラベリングした。少なくとも５０個の細胞からなるコロニーを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０ＣＦＬ倒立光学顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）を用いて計数した。
１．１０ プロテオミクス
１×１０６細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離し、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、氷上でリシスバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＲＩＰＡバッファー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ダンバース）を加えて溶解した。氷上で３０分間放置した後、細胞のリシェートを１４，０００ｇで４°Ｃで１０分間遠心分離し、タンパク質上清液をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって比色定量した。標準として、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。
１×１０６細胞を回収し、４００ｇで６分間遠心分離し、Ｄ－ＰＢＳで洗浄し、氷上でリシスバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＲＩＰＡバッファー、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ダンバース）を加えて溶解した。氷上で３０分間放置した後、細胞のリシェートを１４，０００ｇで４°Ｃで１０分間遠心分離し、タンパク質上清液をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって比色定量した。標準として、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。
１．１１ 液体クロマトグラフィー － 質量分析
タンパク質抽出
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）は、液体クロマトグラフィーの分離能力とトリプル四重極質量分析の質量分析の高感度及び選択性を組み合わせた分析技術である。サンプル調製のために、５０μｇのタンパク質溶解物をアセトンで沈殿させ、得られたタンパク質ペレットを尿素及び１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）の６Ｍ溶液に溶解した。サンプルを１０ｍＭジチオスレイトールを用いて室温で１時間還元し、暗所で２０ｍＭヨードアセトアミドで室温で３０分間アルキル化した。続いて、エンドペプチダーゼ酵素Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて酵素／タンパク質比１：１００（ｗ／ｗ）で室温で３時間消化した。次に、タンパク質を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで４倍に希釈し、室温でトリプシン（プロメガ）１：１００（ｗ／ｗ）で一晩消化した。タンパク質分解は、１％トリフルオロ酢酸の添加によって中断された。その後、サンプルを脱塩し、真空乾燥し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために０．１％ギ酸に再懸濁した。
タンパク質抽出
液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）は、液体クロマトグラフィーの分離能力とトリプル四重極質量分析の質量分析の高感度及び選択性を組み合わせた分析技術である。サンプル調製のために、５０μｇのタンパク質溶解物をアセトンで沈殿させ、得られたタンパク質ペレットを尿素及び１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）の６Ｍ溶液に溶解した。サンプルを１０ｍＭジチオスレイトールを用いて室温で１時間還元し、暗所で２０ｍＭヨードアセトアミドで室温で３０分間アルキル化した。続いて、エンドペプチダーゼ酵素Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて酵素／タンパク質比１：１００（ｗ／ｗ）で室温で３時間消化した。次に、タンパク質を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで４倍に希釈し、室温でトリプシン（プロメガ）１：１００（ｗ／ｗ）で一晩消化した。タンパク質分解は、１％トリフルオロ酢酸の添加によって中断された。その後、サンプルを脱塩し、真空乾燥し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために０．１％ギ酸に再懸濁した。
特定のデータベースと相対定量によるタンパク質同定
サンプルはＥａｓｙ－ｎＬＣ１２００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して分析され、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）とインラインで連結された。逆相カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８、粒子サイズ２μｍ、孔径サイズ１００Å、直径７５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して消化されたペプチドを分離するため、水中の０．１％ホルム酸（バッファーＡ）及びアセトニトリル中の０．１％ホルム酸（バッファーＢ）の、二成分のモバイルフェーズが使用された。ペプチドは、流速４００ｎＬ／ｍｉｎで５％から２５％へのグラデーションで５２分間、２５％から４０％への８分間、最後に４０％から９８％への１０分間で洗出された。データ依存取得（ＤＤＡ）メソッドは、解像度パワー１２０，０００ｆｗｈｍ（２００ｍ／ｚでのハーフマックス全幅）の完全スキャンに基づいており、最大注入時間は５０ｍｓであった。前駆物質の範囲は３５０～１，１００ｍ／ｚで検査され、最初の質量はフラグメントのために１４０ｍ／ｚで設定された。完全スキャンの後に、サイクル時間が３秒でＭＳ／ＭＳ（ＨＣＤ）スキャンの一連のスキャンが行われ、衝突エネルギーは３０％で、最大注入時間は１５０ｍｓで検出された。ダイナミックエクスクルージョン時間は５０秒に設定された。未治療のデータはＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２．２ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で検索された。ペプチド検索はヒト蛋白質ＦＡＳＴＡファイル（ＵｎｉＰｒｏｔ）を使用して行われ、タンパク質はＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストン）を使用して同定された。前駆物質の質量許容誤差は１０ｐｐｍ、生成物質の質量許容誤差は０．６Ｄａで設定された。
サンプルはＥａｓｙ－ｎＬＣ１２００システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して分析され、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）とインラインで連結された。逆相カラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８、粒子サイズ２μｍ、孔径サイズ１００Å、直径７５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して消化されたペプチドを分離するため、水中の０．１％ホルム酸（バッファーＡ）及びアセトニトリル中の０．１％ホルム酸（バッファーＢ）の、二成分のモバイルフェーズが使用された。ペプチドは、流速４００ｎＬ／ｍｉｎで５％から２５％へのグラデーションで５２分間、２５％から４０％への８分間、最後に４０％から９８％への１０分間で洗出された。データ依存取得（ＤＤＡ）メソッドは、解像度パワー１２０，０００ｆｗｈｍ（２００ｍ／ｚでのハーフマックス全幅）の完全スキャンに基づいており、最大注入時間は５０ｍｓであった。前駆物質の範囲は３５０～１，１００ｍ／ｚで検査され、最初の質量はフラグメントのために１４０ｍ／ｚで設定された。完全スキャンの後に、サイクル時間が３秒でＭＳ／ＭＳ（ＨＣＤ）スキャンの一連のスキャンが行われ、衝突エネルギーは３０％で、最大注入時間は１５０ｍｓで検出された。ダイナミックエクスクルージョン時間は５０秒に設定された。未治療のデータはＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２．２ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で検索された。ペプチド検索はヒト蛋白質ＦＡＳＴＡファイル（ＵｎｉＰｒｏｔ）を使用して行われ、タンパク質はＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストン）を使用して同定された。前駆物質の質量許容誤差は１０ｐｐｍ、生成物質の質量許容誤差は０．６Ｄａで設定された。
１．１２ バイオインフォマティクス解析
異なる実験グループ（それぞれｔ０及びｔ２４）で発現されたタンパク質の異なる存在量を、Ｃｌｕｓｔｖｉｓツール（Ｍｅｔｓａｌｕ．Ｔ外、２０１５年）を使用した階層クラスター分析を実行するために使用した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）及びタンパク質ＩＤのパスウェイアノテーションは、生物学的プロセスを適用し、有意閾値をｐ＜０．０５に設定したリアクトーム分類を適用することにより、ＥｎｒｉｃｈＲ遺伝子セット濃縮分析サーバー（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）を使用して実行した。タンパク質相互作用のネットワークは、ＳＴＲＩＮＧ相互作用データベース、バージョン１１．０（https://string-db.org/）（Ｍｅｒｉｎｇ．Ｃ外、２００３年）を用いて構築した。
異なる実験グループ（それぞれｔ０及びｔ２４）で発現されたタンパク質の異なる存在量を、Ｃｌｕｓｔｖｉｓツール（Ｍｅｔｓａｌｕ．Ｔ外、２０１５年）を使用した階層クラスター分析を実行するために使用した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）及びタンパク質ＩＤのパスウェイアノテーションは、生物学的プロセスを適用し、有意閾値をｐ＜０．０５に設定したリアクトーム分類を適用することにより、ＥｎｒｉｃｈＲ遺伝子セット濃縮分析サーバー（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）を使用して実行した。タンパク質相互作用のネットワークは、ＳＴＲＩＮＧ相互作用データベース、バージョン１１．０（https://string-db.org/）（Ｍｅｒｉｎｇ．Ｃ外、２００３年）を用いて構築した。
１．１３ 統計解析
すべてのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分析され、平均±標準誤差として表された。１サンプルｔ検定は、対照の比率／パーセンテージとして表される結果の分析に使用された（例：トリパンブルー排除アッセイ）。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定は、他のすべての分析に使用された。ｐ＜０．０５のデータは有意であると考えられた。
すべてのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して分析され、平均±標準誤差として表された。１サンプルｔ検定は、対照の比率／パーセンテージとして表される結果の分析に使用された（例：トリパンブルー排除アッセイ）。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定は、他のすべての分析に使用された。ｐ＜０．０５のデータは有意であると考えられた。
実施例２．結果
２．１ ＱＭＲ治療は、細胞周期の進行を改変することにより、膠芽腫細胞の増殖を減少させる
Ａ１７２膠芽腫細胞に対するＱＭＲ治療の効果は、治療終了直後及びＱＭＲ刺激終了後２４時間及び４８時間後の細胞の細胞形態、増殖速度、アポトーシス及び細胞周期を分析することによって評価された。これらの時間枠を遵守することにより、治療で得られた効果の永続性、及び治療された細胞がその細胞機能を治療前のレベルに回復する能力について、評価することが可能となった。
２．１ ＱＭＲ治療は、細胞周期の進行を改変することにより、膠芽腫細胞の増殖を減少させる
Ａ１７２膠芽腫細胞に対するＱＭＲ治療の効果は、治療終了直後及びＱＭＲ刺激終了後２４時間及び４８時間後の細胞の細胞形態、増殖速度、アポトーシス及び細胞周期を分析することによって評価された。これらの時間枠を遵守することにより、治療で得られた効果の永続性、及び治療された細胞がその細胞機能を治療前のレベルに回復する能力について、評価することが可能となった。
驚くべきことに、ＱＭＲ治療は治療されたＡ１７２細胞の形態を未治療のコントロール細胞と比較して変化させることが明らかとなった。実際に、ＱＭＲ治療された細胞はコントロール細胞よりも腫脹しており、顆粒状と視認された。これは細胞の損傷が発生したことを示す。
この損傷は、図１に示すように、時間が経過しても持続することも明らかとなった。
細胞増殖速度もトリパンブルーによる試験によって推定した。処置後２４時間で、ＱＭＲ治療細胞は腫瘍増殖の約２８％の減少を示した。さらに、生細胞数は治療後２４～４８時間でも減少する傾向があり、図２に示すように、ＱＭＲ治療が細胞周期の進行に及ぼす影響を示唆している。
この驚くべき発見を支持するために、Ａ１７２細胞の細胞周期もフローサイトメトリー実験を用いて評価された。図３ａ及び図３ｃに示す結果は、ＱＭＲ治療が細胞の分裂速度（Ｓ期の細胞の割合として定義）を有意に減少させ、Ｇ２／Ｍ期の細胞が有意に増加することを示した。これらの結果は、治療終了後４８時間まで確認され、Ｇ２／Ｍ期に細胞周期停止が起こったことを示している。
また、ＱＭＲで細胞を治療することの有効性は、治療された細胞における明確なアポトーシス活性化によって確認された。図４ｂ及び図４ｃの結果によって示されるように、ＱＭＲ治療後の生細胞の数は、ＱＭＲで治療されていない対照生細胞の数よりも実際には有意に低かった（ｐ＜０．０１）。この減少はまた、初期アポトーシスにおける細胞数の約１０％の増加及び後期アポトーシスにおける細胞数のわずかな増加と相関していた。
２．２ ＱＭＲ治療はＢＭ－ＭＳＣ細胞に細胞毒性及び遺伝毒性の影響を引き起こさない
非腫瘍性細胞に対するＱＭＲ治療の安全性を検証するために、健康なＢＭ－ＭＳＣ細胞に対するＱＭＲ治療の効果を試験した。ＱＭＲ刺激の終了時及び治療終了後２４時間で、治療されたＢＭ－ＭＳＣ細胞及び未治療の対照細胞において、細胞形態、増殖速度、アポトーシス、細胞周期及び核型を評価した。図５ｂに示すように、ＱＭＲ治療の終了時に細胞増殖のわずかな減少が示されたが、この効果は、図２に示される治療されたＡ１７２膠芽腫細胞で得られたものに匹敵すると考えられるべきではない。
非腫瘍性細胞に対するＱＭＲ治療の安全性を検証するために、健康なＢＭ－ＭＳＣ細胞に対するＱＭＲ治療の効果を試験した。ＱＭＲ刺激の終了時及び治療終了後２４時間で、治療されたＢＭ－ＭＳＣ細胞及び未治療の対照細胞において、細胞形態、増殖速度、アポトーシス、細胞周期及び核型を評価した。図５ｂに示すように、ＱＭＲ治療の終了時に細胞増殖のわずかな減少が示されたが、この効果は、図２に示される治療されたＡ１７２膠芽腫細胞で得られたものに匹敵すると考えられるべきではない。
さらに、ＱＭＲで治療したＢＭ－ＭＳＣ細胞は、図５ａ、図５ｃ／図５ｄ、図５ｅ／図５ｆにそれぞれ示すように、細胞形態、細胞周期調節及びアポトーシスに差を示さなかった。
さらに、時間は最終的な効果に影響を与えなかったことが、処理後の０時間と２４時間の結果が実質的に重なっていることによって示された。
ＱＭＲで治療したＢＭ－ＭＳＣ細胞の核型の分析はまた、図６に見られるように、ＱＭＲ治療が染色体数又はそれらの構造に変化を引き起こさないことを有利に示した。
２．３ ＱＭＲ治療は、Ａ１７２膠芽腫細胞の侵略性と浸潤性を軽減する
腫瘍性細胞は、制御されない増殖及び遊走を特徴とすることはよく知られている。したがって、半固体培地中で増殖する細胞の能力及びそれらの移動速度は、腫瘍の侵略性及び浸潤性のマーカーと考えられる。したがって、軟寒天における細胞コロニー形成と細胞移動を基礎条件下及びＱＭＲ治療後に分析した。図７ａに示される結果は、驚くべきことに、ＱＭＲ治療が軟寒天中でのＡ１７２細胞の増殖を有意に減少させることを示した。実際、ＱＭＲ治療後の細胞コロニー数は、未治療のコントロール細胞のコロニー数よりも約８５％少なかった。驚くべきことに、さらに、ＱＭＲで治療されたＡ１７２細胞の細胞遊走速度も、図７ｂに示すように、対照細胞の細胞よりも時間依存的に低かった。
腫瘍性細胞は、制御されない増殖及び遊走を特徴とすることはよく知られている。したがって、半固体培地中で増殖する細胞の能力及びそれらの移動速度は、腫瘍の侵略性及び浸潤性のマーカーと考えられる。したがって、軟寒天における細胞コロニー形成と細胞移動を基礎条件下及びＱＭＲ治療後に分析した。図７ａに示される結果は、驚くべきことに、ＱＭＲ治療が軟寒天中でのＡ１７２細胞の増殖を有意に減少させることを示した。実際、ＱＭＲ治療後の細胞コロニー数は、未治療のコントロール細胞のコロニー数よりも約８５％少なかった。驚くべきことに、さらに、ＱＭＲで治療されたＡ１７２細胞の細胞遊走速度も、図７ｂに示すように、対照細胞の細胞よりも時間依存的に低かった。
２．４ ＱＭＲ治療はＡ１７２膠芽腫細胞株のプロテオミクスフィンガープリントを調節する
ＱＭＲで治療したＡ１７２及びＢＭ－ＭＳＣ細胞のプロテオミクスプロファイルも調査した。分析は、ＱＭＲ刺激の終了時（時間０）及び治療終了後２４時間で実施した。未治療のＡ１７２及びＢＭ－ＭＳＣ細胞を対照群として使用した。
ＱＭＲで治療したＡ１７２及びＢＭ－ＭＳＣ細胞のプロテオミクスプロファイルも調査した。分析は、ＱＭＲ刺激の終了時（時間０）及び治療終了後２４時間で実施した。未治療のＡ１７２及びＢＭ－ＭＳＣ細胞を対照群として使用した。
Ａ１７２細胞株では合計５１０４個のタンパク質が同定され、そのうち３１１個及び３０８個は、ＱＭＲ治療後にそれぞれ治療終了後０時間及び２４時間後に有意に変化することが見出された。図には示されていないクラスター分析では、両方の試験時間枠で２つの別々のタンパク質グループが強調され、ＱＭＲ治療が腫瘍性細胞の活性を妨げることが実証された。
タンパク質は、治療された細胞と未治療の細胞の間で分化することが見出された。具体的には、時間ゼロでは、１１１個のタンパク質が有意にアップレギュレーションされ、２００個のタンパク質がダウンレギュレーションされていることが判明した。その代わりに、治療終了後２４時間で、１０３個のアップレギュレーションされたタンパク質と２０５個のダウンレギュレーションされたタンパク質が見出された。
遺伝子オントロジーとパスウェイエンリッチメントのより具体的な分析により、アップレギュレーションされたタンパク質はストレス応答メカニズム、タンパク質フォールディング、細胞外マトリックスモデリングと強く関連していることが示され、ＱＭＲ治療が毒性タンパク質刺激としても作用することが示唆された。
より具体的には、ＱＭＲ治療細胞は、未治療の対照細胞と比較して、タンパク質翻訳、ＲＮＡプロセシング、及び細胞周期に関与する経路に関与する重要な因子の有意なダウンレギュレーションを受けており、細胞周期の停止と治療された細胞の死滅を引き起こしていた。
有利には、ＢＭ－ＭＳＣ細胞に対するＱＭＲ刺激の効果は、Ａ１７２膠芽腫細胞と比較して全く異なる結果をもたらした。ＱＭＲ治療終了時、熱ショックタンパク質の活性化は細胞外マトリックスのリモデリングと関連していた。しかし、この変化は治療後２４時間で完全に正常化することが明らかとなった。したがって、ＱＭＲ治療はＢＭ－ＭＳＣ細胞の増殖速度を妨げず、腫瘍性細胞に対するＱＭＲ治療の選択性を助ける。
２．５ Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧ細胞株におけるＱＭＲ治療
上記の実験は、Ａ１７２細胞株細胞よりも侵略的であった膠芽腫細胞株についても実施した。これらのより侵略的な細胞株は、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧ細胞を含む。ＱＭＲ治療後の増殖速度は両方の細胞株で低下することが明らかとなったが、図８ａ乃至図８ｆに示すように、アポトーシス活性化、細胞周期の進行、クローン形成能力及び細胞運動性に有意差はなかった。
上記の実験は、Ａ１７２細胞株細胞よりも侵略的であった膠芽腫細胞株についても実施した。これらのより侵略的な細胞株は、Ｔ９８Ｇ及びＵ８７ＭＧ細胞を含む。ＱＭＲ治療後の増殖速度は両方の細胞株で低下することが明らかとなったが、図８ａ乃至図８ｆに示すように、アポトーシス活性化、細胞周期の進行、クローン形成能力及び細胞運動性に有意差はなかった。
細胞生存率は、ＱＭＲ治療の４８時間及び７２時間後にも試験した。驚くべきことに、Ａ１７２細胞及びＵ８７ＭＧ細胞の両方の細胞増殖率は、時間の経過とともに有意に低下することが明らかとなった。
治療出力において１５％増加した場合であっても、細胞増殖速度に影響を与えることが示されている。実際、図に示すように、高出力でのＱＭＲ治療細胞の細胞生存率は、最大３５％減少することが明らかとなった。
２．６ ＱＭＲの適用は、Ａ１７２膠芽腫細胞における薬剤テモゾロミド（ＴＭＺ）の効果を高める
これまでの膠芽腫患者に対する標準療法には、病変の全切除、それに続く放射線療法及び薬剤ＴＭＺによる化学療法が含まれていた。
これまでの膠芽腫患者に対する標準療法には、病変の全切除、それに続く放射線療法及び薬剤ＴＭＺによる化学療法が含まれていた。
不都合なことに、薬剤の有効性は、薬剤自体によって引き起こされる副作用の重症度及び薬剤耐性メカニズムの構築によって、制限されてしまう。したがって、ＴＭＺの投与量を減らし、患者の生活の質を改善するために、ＴＭＺと組み合わせて使用される新しい治療戦略を見つけることが不可欠であった。
したがって、Ａ１７２膠芽腫細胞に対するＴＭＺとＱＭＲ治療の併用療法の有効性が試験された。これらの細胞は、ＱＭＲ治療と同時に、又は治療後に１０～２５μＭのＴＭＺを用いて治療された。細胞生存率、アポトーシス及び細胞周期値を解析した。ＴＭＺ薬剤濃度は、そのＩＣ５０に基づいて選択された（図１４）。
得られた結果は、驚くべきことに、１０μＭの濃度のＴＭＺ薬剤をＱＭＲ治療と組み合わせて使用した場合、図１２ｂに示すように、ＴＭＺ薬剤のみで治療した細胞で得られた細胞生存率の低下よりも、細胞生存率が約１２％低下したことを示している。
さらに、これらのデータは、細胞アポトーシスに関するデータと驚くほど相関していることが判明した。実際、ＴＭＺとＱＭＲの併用投与は、図１３ａ及び１３ｂのグラフに示すように、生細胞数の減少が初期アポトーシスにおける細胞数の増加と関連していることを示した。
２５μＭの薬剤ＴＭＺ及びＱＭＲへの細胞曝露を同時に行うことで、ＴＭＺ薬剤のみで治療された細胞と比較して、細胞周期進行のより大きな変化が活性化された。
これらのデータは、驚くべきことに、図１４ｂに示すように、ＴＭＺとＱＭＲの併用治療戦略がＧ２－Ｍ期に有意な細胞周期停止を誘導し、Ｇ０－Ｇ１期の細胞の割合を減少させることを実証している。
Claims (9)
- 生体の標的領域における腫瘍細胞の増殖を阻止又は阻害する方法において使用される抗腫瘍薬であって、該方法は、新生物細胞が前記抗腫瘍薬により治療されている所定の期間において、前記標的領域への電流波の印加を同時に行いながら、前記新生物細胞を前記抗腫瘍薬で治療する工程を含み、前記電流波は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形した約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有することを特徴とする、抗腫瘍薬。
- 前記波形が正弦波波形であることを特徴とする、請求項１に記載の抗腫瘍薬。
- 前記抗腫瘍薬がテモゾロミドを含む、
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の抗腫瘍薬。 - 前記腫瘍細胞が膠芽腫細胞を含み、前記標的領域が中枢神経系を含む、
ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗腫瘍薬。 - 生体の標的領域における腫瘍細胞の増殖を阻止又は阻害する方法において使用される抗腫瘍薬であって、該方法は、所定の期間において、前記標的領域への電流波の印加を同時に行いながら、前記新生物細胞を前記抗腫瘍薬で治療する工程を含み、前記電流波は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形した約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有することを特徴とする、抗腫瘍薬。
- 生体の標的領域における腫瘍細胞の増殖を阻止又は阻害する方法において使用される抗腫瘍薬であって、該方法は、所定の期間において、前記標的領域への電流波の印加を行う前に、前記新生物細胞を前記抗腫瘍薬で治療する工程を含み、前記電流波は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形した約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有することを特徴とする、抗腫瘍薬。
- 生体の標的領域における新生物細胞の増殖を阻止又は阻害するよう構成され、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形した約４ＭＨｚの基本周波数を有する波形を有する電流波を生成するよう構成された装置であって、
少なくとも１つの無線周波回路に接続された１つ以上の電極を備え、
該少なくとも１つの無線周波回路は、少なくとも２次及び３次の高調波の存在によって変形した約４ＭＨｚの基本周波数を有する電流波を前記電極の各々に供給することを特徴とする、装置。 - 前記波形が正弦波波形であることを特徴とする、請求項７に記載の装置。
- 前記１つ以上の電極が埋め込み型の電極であり、前記１つ以上の電極が前記標的領域又はその近傍に移植されることを特徴とする、請求項７または８に記載の装置。
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