KR20230118603A - 종양 세포 치료를 위한 장치 및 항종양 약물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물의 표적 부위에서 종양 세포(neoplastic cell)의 성장을 차단 또는 억제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 항암제에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 종양 세포가 상기 항암제로 치료되는 동안 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가함과 동시에 상기 항암제로 상기 종양 세포를 치료하는 단계를 포함하고, 전류파는 2MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는다.

Description

종양 세포 치료를 위한 장치 및 항종양 약물

본 발명은 생체(living organism)의 표적 부위(target region)에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하도록 구성된 장치에 관한 것으로, 특히 항암제와 함께 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하기 위한 장치의 용도에 관한 것이다.

종양형성(Neoplasms) 또는 종양(tumors)은 규제 메커니즘을 벗어나 몸 전체에서 증식 및 확산되는 세포의 변형에서 비롯된다. 거의 모든 장기(organs)에 영향을 미칠 수 있는 다양한 유형의 종양형성이 있다. 종양 세포가 주변 구조 및 더 멀리 있는 장기를 침범하는 능력에 따라 보통 양성과 악성으로 분류된다. 종양형성이라는 용어는 고형 장기의 종양 외에 림프종, 백혈병 등과 같은 혈액 세포의 종양도 포함한다

표적 예방 조치, 조기 진단 및 치료 덕분에 최근 수십 년 동안 임상 분야에서 큰 성공을 거두었음에도 불구하고 종양형성은 계속해서 주요 사망 원인 및 삶의 질 저하 중 하나이다.

종양 치료는 본질적으로 특히 국소화된 형태로 수술, 방사선 요법 및 약물을 기반으로 한다.

다형 교모세포종(GBM)은 종양 병변(lesion)에 인접한 실질조직에 침투하는 GBM 종양 세포의 능력으로 인해서 인간에게 가장 공격적인 종양 중 하나이다(DeAngelis et al, 2001).

GBM 환자는 일반적으로 수술로 병변을 완전히 절제한 후 방사선 요법과 알킬화 항암제인 테모졸로미드 약물을 사용한 화학 요법을 받는다(Alifieris et al, 2015).

그러나 다각적인 치료적 접근에도 불구하고 GBM은 높은 재발률, 약물 내성 및 파괴적인 신경학적 악화를 특징으로 한다(Wilson et al, 2014).

GBM은 특히 침윤성 종양이며 따라서 병변의 완전한 외과적 절제 수행이 실질적으로 불가능하여 거의 모든 환자들이 재발을 경험하고 생존 기간이 14개월에 불과하다(Becker et al, 2012). 또한 수술 후 5년이 지나면 5% 미만의 환자만이 살아 있다(Ostrom et al, 2014).

따라서 사용 중인 약물의 효능을 개선하고 그에 상응하는 부작용을 줄여 환자의 삶의 질을 향상시키기 위한 새로운 치료 전략을 개발하는 것이 얼마나 필요한지 여부가 분명하다.

이러한 의미에서 가장 유망한 치료법 중 하나는 비이온화 전자기장(EMFs)을 사용하는 것을 포함한다.

상기 요법은 우수한 안전성, 낮은 독성 및 기존 약물 요법과의 병용 가능성을 가지고 있어 특히 유망하다(Mattson et al, 2019).

최근 몇 년 동안 여러 EMF 기술이 테스트되었으며 단독으로 사용하거나 화학 요법과 함께 사용할 때 다양한 유형의 종양에 대해 우수한 수준의 효능을 나타내는 것으로 나타났다(Pasi et al, 2016).

서로 다른 주파수 범위는 종양 세포의 유사분열 방추(mitotic spindle)의 형성과 안정성에 작용하여 종양 세포의 세포 증식을 감소시킬 수 있는 세포에서 서로 다른 반응 메커니즘을 유발하는 것으로 밝혀졌다(Giladi et al, 2015).

2011년 미국 식품의약국(FDA)은 재발성 GBM 환자 치료에 종양 치료 필드(TTFields)의 사용을 승인했다.

예를 들어 문서 US 2020269041 및 EP 3439733과 같은 여러 선행 기술 문서에서 상기 효과가 공개되었다.

본 발명의 목적은 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단하거나 억제하도록 적응된 공지된 유형에 대한 대체 장치 및 방법을 실현하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 그러한 장치 및 방법이 다형 교모세포종과 같은 공격적인 유형의 종양 형성의 치료에 사용될 수 있다는 것이다.

여전히, 본 발명의 목적은 이러한 방법 및 환자에서의 장치의 사용이 또한 비-침습적 유형일 수 있다는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 보다 큰 치료 효능 및 감소된 독성 프로파일을 갖고 환자의 삶의 질을 향상시키는 항암제를 실현하는 것이다.

상기에서 언급된 목적은 주요 청구범위에서 설명된 것과 같은 항암제에 의해 달성된다.

상기 목적은 또한 청구항 제7항에 기재된 바와 같은 장치에 의해 달성된다.

또한, 상기 목적은 후술하는 종양 세포를 치료하는 방법에 의해서도 달성된다.

특히, 본 발명은 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 항암제에 관한 것이고, 상기 방법은 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가(application)하기 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 항암제로 상기 종양 세포를 치료하는 단계를 포함하고, 상기 전류파는 2MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는다.

바람직하게는, 이러한 전류파는 2~64 MHz, 보다 바람직하게는 2~20 MHz, 더욱 바람직하게는 4~20 MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는다.

훨씬 더 바람직하게는, 이러한 전류파는 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는다.

이러한 전류파의 인가는 본 명세서에서 양자 분자 공명 또는 QMR로 또한 언급될 것이다.

또한, 본 발명의 일 측면에 따르면, 이러한 전류파는 사인 파형을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 이 파형은 고조파의 존재에 의해 왜곡(distorted)된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 사인 파형은 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 항암제에 의한 종양 세포의 치료는 상기 전류파의 인가와 동시에 또는 인가 후에 수행된다.

바람직하게는, 본 발명의 일 측면에 따르면, 종양 세포를 항암제로 치료하는 것은 상기 항암제로 종양 세포를 치료하는 동안에, 표적 부위에 전류파를 인가함과 동시에 수행된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 항암제는 테모졸로미드를 포함한다.

본 발명의 일측면에 따르면, 종양 세포는 교모세포종 세포를 포함한다.

특히, 표적 부위는 생체, 바람직하게는 인간 대상체에 속한다.

상기 표적 부위는 중추신경계를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하도록 구성된 장치로서, 상기 장치는 2 MHz 이상, 바람직하게는 2 내지 64 MHz 범위, 더 바람직하게는 2 내지 20 MHz 범위, 보다 더 바람직하게는 4 내지 20MHz 범위, 훨씬 더 바람직하게는 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 구성되고, 상기 파형은 고조파의 존재에 의해 왜곡된 사인 파형이다.

상기 장치는 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 전류파를 이러한 전극의 각각에 공급하도록 적응된 적어도 하나의 무선 주파수 회로에 연결된 하나 이상의 전극을 포함한다.

이러한 하나 이상의 전극은 상기 전류파를 상기 표적 부위로 전달하도록 구성된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 장치의 전극은 전술한 표적 부위에 또는 그 근처에 이식되도록 적응된 이식가능한 유형의 전극이다.

표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단하거나 억제하는 방법도 또한 본 발명의 일부이다.

이 표적 부위는 바람직하게는 생체에 속한다.

본 발명의 방법의 일 측면에 따르면, 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가함으로써 상기 종양 세포를 치료하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 전류파는 2 MHz 이상, 바람직하게는 2 내지 64 MHz 범위, 더 바람직하게는 2 내지 20 MHz 범위, 더욱 더 바람직하게는 4 내지 20 MHz 범위, 훨씬 더 바람직하게는 약 4MHz의 기본 주파수를 가진 파형을 갖는다.

또한, 본 발명의 방법의 일 측면에 따르면, 이러한 파형은 사인 파형이다.

다시, 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 사인 파형은 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

다시, 본 발명의 방법의 다른 측면에 따르면, 사인 파형은 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

또한, 본 발명의 방법의 일 측면에 따르면, 종양 세포는 교모세포종 세포를 포함한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 표적 부위는 중추신경계를 포함한다.

본 발명의 방법의 추가 측면에 따르면, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖고 바람직하게는 고조파의 존재에 의해 왜곡된 사인 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 적응된 장치를 하나 이상의 전극에 연결하는 단계;

- 전술한 종양 세포를 포함하는 표적 부위가 위치하는 생체의 신체 표면에 이들 전극 중 적어도 하나를 적용하는 단계;

- 전류파를 상기 전극으로 전송하는 것과 같이 장치를 활성화하고 미리 정의된 시간 동안 장치를 활성화된 상태로 유지하는 단계.

대안적으로, 본 발명의 방법의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

- 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖고 바람직하게는 고조파의 존재에 의해 왜곡된 사인 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 적응된 장치를 이식가능한 유형의 하나 이상의 전극에 연결하는 단계;

- 전술한 종양 세포를 포함하는 표적 부위에 또는 그 근처에서 이들 전극 중 적어도 하나를 생체에 이식하는 단계;

- 전류파를 상기 전극으로 전송하는 것과 같이 장치를 활성화하고 장치를 미리 정의된 시간 동안 활성화된 상태로 유지하는 단계.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 본 발명의 장치를 사용한다.

본 발명의 약물, 장치 및 방법의 추가 특징 및 장점은 예시로서 제공되는 본 발명의 바람직한 실시예의 하기 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 QMR 자극 종료 후 0, 24, 48시간 후 교모세포종 A172의 세포 배양과 무처리 대조군 세포(대조군)의 도립 광학 현미경(inverted light microscope)으로 획득한 대표적인 이미지를 나타낸다. 이미지는 Axiovert 40 CFL 현미경, 10X 배율을 사용하여 획득되었다.
도 2는 QMR 자극 종료 후 0, 24 및 48시간 후 A172 세포의 세포 생존율을 대조군 세포(대조군)와 비교한 것이다 (4-5회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SEM; ** = p < 0.01, QMR 대 대조군(1-샘플 t-테스트)).
도 3a, 3b 및 3c는 세포 주기의 각 단계(G₀-G₁, S, G₂-M)에 대한 A172 세포의 백분율을 보여준다. 세포 주기의 진행은 QMR 자극 종료 후 0시간 (도 3a), 24시간(도 3b) 및 48시간(도 3c)에서 유동 세포 측정법으로 모니터링되었다 (적어도 4-6회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM; * = p<0.05; QMR 대 대조군(Unpaired t-test)).
도 4a, 4b 및 4c는 QMR 자극 종료 후 0시간(도 4a), 24시간(도 4b) 및 48시간(도 4c) 후에 A172 세포에서 세포사멸의 유도를 보여준다; 히스토그램은 후기 세포사멸 및 괴사로부터 초기 세포사멸을 세분하는, 생존 및 사멸 세포의 백분율을 보여준다(적어도 3-5회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM; ** = p<0.01; QMR 대 대조군(Unpaired t-test)).
도 5a 내지 5f는 간엽 간질 세포(BM-MSC)에 대한 QMR 자극의 효과를 보여준다. 도 5a는 24시간 QMR 자극 종료 후 0시간 및 24시간 후 BM-MSC 세포 배양 및 대조군 세포(대조군)의 Axiovert 40 CFL 도립 광학 현미경, 10X 배율로 획득한 대표 이미지를 보여준다; 도 5b는 24시간 동안 QMR 자극 종료 후 0시간 및 24시간에서 BM-MSC 세포의 생존력을 대조군 세포와 비교하여 트리판 블루(Trypan blue)로 시험한 결과를 나타낸다; 도 5c-5f는 세포 주기의 각 단계(G₀-G₁, S, G₂-M)에 대한 BM-MSC 세포의 백분율 및 QMR 자극 종료 후 0시간 및 24시간에서 유동 세포 측정법에 의한 세포사멸의 유도를 나타낸다 (각각 5c/5e 및 5d/5f); 결과는 적어도 3-4회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p<0.05; QMR 대 대조군.
도 6은 기본 조건(대조군) 및 QMR 자극 후 BM-MSC 세포의 핵형(karyotype)의 대표적인 이미지를 보여준다; 중기의 염색체는 GTG 방법으로 검출되었다; 이미지는 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 7a 및 7b는 QMR 자극 후 A172 세포의 공격성 및 침입성을 보여준다. 도 7a에서 A172 세포 콜로니는 칼세인으로 표지되고 Axiovert CFL 도립 광학 현미경을 사용하여 계수되었다; 도 7b에서 A172 세포는 페트리 접시 내부에 직접 배치된 실리콘 인서트(silicon inserts)에서 성장했으며, QMR 자극 후 자극이 끝난 후 최대 48시간 동안 도립 광학 현미경을 사용하여 이동 속도를 평가하였다; 세포 이동 속도를 나타내는 스크래치 클로저(scratch closure)의 백분율은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다; 결과는 적어도 3-5회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p <0.05; *** = p <0.001; QMR 대(Vs) 대조군.
도 8a 내지 8f는 T98G 교모세포종 세포에 대한 QMR 자극의 효과를 보여준다: 도 8a는 24시간 QMR 자극 종료 후 0시간 및 24시간 후 T98G 세포 및 대조군 세포(대조군)의 배양물을 나타내는, Axiovert 40 CFL 도립 광학현미경, 5X 배율로 획득한 이미지를 보여준다; 도 8b는 대조군 세포와 비교하여 24시간 QMR 자극 종료 후 0, 24 및 48시간에서 T98G 세포의 생존율을 나타낸 것으로, 트리판 블루로 시험한 결과이다; 도 8c는 칼세인으로 표지되고 Axiovert CFL 도립 광학 현미경으로 계수된 T98G 세포의 콜로니를 보여준다; 도 8d 및 8e는 세포주기의 각 단계(G₀-G₁, S, G₂-M)에 대한 T98G 세포의 백분율 및 QMR 자극 종료 후 0, 24 및 48시간에서 유동 세포 측정법에 의해 얻어진 세포사멸의 유도를 나타낸다; 도 8f에서, T98G 세포는 페트리 접시 내부에 직접 배치된 실리콘 인서트에서 성장되었고, QMR 자극 후, 자극 종료 후 72시간까지의 이동 속도를 도립 광학 현미경으로 평가하였다; 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 세포 이동 속도를 나타내는 스크래치 클로저의 백분율을 정량화하였다; 결과는 적어도 3-5회 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현하였다; * = p <0.05; ** = p <0.01; QMR 대 대조군.
도 9a 내지 9e는 U87MG 교모세포종 세포에 대한 QMR 자극의 효과를 보여준다; 도 9a는 24시간 QMR 자극 종료 후 0시간 및 24시간 후의 U87MG 세포 배양물 및 대조군 세포(대조군)를 나타내는 Axiovert 40 CFL 도립 광학 현미경, 5X 배율로 획득한 이미지를 보여준다; 도 9b는 24시간 QMR 자극 종료 후 0, 24 및 48시간에서 U87MG 세포의 생존율을 대조군 세포와 비교한 것으로, 트리판 블루로 시험한 결과이다; 도 9c에서 U87MG 세포의 콜로니를 칼세인으로 표지하고 Axiovert CFL 도립 광학 현미경으로 계수하였다; 도 9d 및 9e는 세포주기의 각 단계(G₀-G₁, S, G₂-M)에 대한 U87MG 세포의 백분율 및 QMR 자극 종료 후 0, 24 및 48시간에서 유동 세포 분석법에 획득한 세포사멸의 유도를 나타낸다; 결과는 적어도 3-5회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p<0.05; ** = p<0.01; QMR 대 대조군.
도 10a 및 10b는 QMR 자극의 24시간 및 48시간 후 A172, T98G 및 U87MG 세포에 대한 세포 생존율 값을 보여준다; 도 10b에서, T98G 세포는 다른 세포주보다 15% 더 높은 전력에서 QMR로 자극되었고 증식률은 QMR 자극의 24-48시간 후에 평가되었다; 결과는 적어도 1-4회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p <0.001; QMR 대 대조군.
도 11은 144시간 동안 약물 테모졸로마이드(TMZ)로 처리된 A172 세포에 대한 세포 생존율 값을 보여준다; 결과는 트리판 블루를 사용한 테스트를 통해 얻었으며 최소 3회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표시된다; * = p <0.05; ** = p <0.01; *** = p <0.001; TMZ 대 대조군 (1-샘플 t-테스트);
도 12a 및 12b는 A172 세포에 대한 TMZ 약물 치료 및 QMR 자극의 조합 효과를 보여준다; TMZ는 24시간 QMR 자극 후 또는 그와 동시에 144시간 동안 투여되었으며, 여기에서 트리판 블루를 사용한 테스트를 통해 세포 생존력을 모니터링했으며 결과는 최소 3-5회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표시된다; * = p <0.05; ** = p <0.01; *** = p <0.001; 처리(치료, treatment) 대 대조군; + = p <0.05; ++ = p <0.01; TMZ 및 QMR의 조합 대 TMZ 단독에 대한 +++ = p <0.001.
도 13a 및 13b는 QMR 자극 후(도 12a) 또는 그와 동시에(도 12b) TMZ(10μM 및 25μM)로 처리된 A172 세포에 대한 세포사멸의 유도 값을 나타내며, 여기서 값은 유동 세포 측정법에 의해 얻어졌다; 결과는 최소 4-6회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p <0.05; ** = p <0.01; 치료(처리) 대 대조군에 대한 *** = p <0.001; + = p <0.05; ++ = p <0.01; TMZ 및 QMR의 조합 대 TMZ 단독에 대한 +++ = p <0.001.
도 14a 및 14b는 세포 주기의 각 단계(G₀-G₁, S, G₂-M)에 대한 A172 세포의 백분율을 보여준다; 세포 주기 진행은 QMR 자극 후(도 14a) 및 QMR 자극과 동시에(도 14b) TMZ 처리된 세포의 유동 세포 측정법에 의해 모니터링되었다; 결과는 적어도 3-5회의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다; * = p<0.05; ** = p<0.01; TMZ 치료(처리) 및 QMR 대 대조군에 대한 *** = p<0.001; + = p<0.05; ++ = p<0.01; TMZ 치료(처리) 및 QMR 대 TMZ 단독에 대한 +++ = p <0.001.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.

종양 세포(neoplastic cells)라는 용어는 본 명세서에서 증식 제어 메커니즘을 피하고 자체적인 자율 재생산 프로그램을 따르는 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 그들은 종양형성(neoplasm), 즉 정상적인 세포에 비해 과도하고 비협조적인 성장을 보이는 비정상적인 세포 덩어리를 형성하며, 이를 유발한 자극이 중단된 후에도 과도하게 진행된다.

전술한 종양형성 및 선택적으로 이 종양 덩어리가 확장되는 생체의 신체 부위는 또한 전술한 표적 부위를 나타낸다.

제한하는 것으로 간주되지 않는 예로서, 이러한 종양형성은 폐, 결장직장, 유방(mammary), 전립선, 췌장, 간 종양형성 또는 골수 세포, 림프계, 면역계 등의 혈액학적 종양형성을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 종양 세포는 교모세포종(GBM) 세포, 악성 성상 세포 종양을 포함하며, 표적 부위는 중추신경계를 포함한다.

본 발명의 방법은 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가함으로써 상기 종양 세포를 치료하기 위해 제공되며, 상기 전류파는 바람직하게는 2MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 사인 파형을 갖는다.

기본 주파수가 2MHz 이상인 사인 파형을 갖는 전류파를 인가하는 것은 이러한 전류파가 적용된 분자에 에너지를 전달하며, 이는 양자 분자 공명(Quantum Molecular Resonance (QMR))이라는 용어로 정의되는 소위 "분자 공명"에 해당한다.

출원인을 대신하여 문서 EP1087691 및 문서 Pozzato G et al, 2003에서, 이 QMR 에너지는 전류의 통과에 의해 충돌하는 분자들 사이의 결합을 끊기에 충분하며, 이는 메스에 적용될 때 특히 유용하다는 것이 알려져 있다. 이 메스는 파열, 찢어짐, 괴사, 관련 조직의 두께 감소 또는 증가, 액체 내용물의 변경, 응고 또는 절단 부위 주변의 기타 퇴행성 효과를 일으키지 않고 실제로 관심 영역을 절단할 수 있다.

그러나, 2MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 전류파가 종양 유형의 세포에 적용될 때 항종양 작용을 수행한다는 것이 놀랍게도 이제 밝혀졌다.

출원인은 QMR 공명 에너지를 종양 세포에 전달하는 것과 같은 전류파의 인가가 전술한 세포의 운동성 및 공격성을 감소시켜 예를 들어, 새로운 종양 병변을 일으키기 위해 매트릭스를 통해 이동하는 능력을 감소시킬 수 있다는 사실을 발견하였다.

BM-MSC 세포에 대한 실험은 또한 그러한 전류파의 인가가 정상의 비-종양 유형 세포에 무해한 것으로 보인다는 것을 강조하였고, 따라서 본 발명의 방법이 표준 유형의 항종양 요법 대신에 경우에 따라 이러한 종양 세포 주변에서 발견되는 지지 세포(supporting cells)의 성장이 아닌 종양 세포만의 성장을 차단하거나 억제하는데 선택적임을 보장한다.

또한, 이러한 전류파를 교모세포종 세포에 인가하면 단백질 구조의 전체적인 변화를 일으켜 궁극적으로 세포 사멸을 초래한다는 사실이 확인되었다.

대신 유리하게는 이 단백질 변형은 건강한 세포에서 신속하게 대응된다.

2 내지 64 MHz 범위, 보다 바람직하게는 2 내지 20 MHz 범위, 보다 더 바람직하게는 4 내지 20 MHz 범위의 기본 주파수 값의 사용은 본 발명의 방법에서 특히 유리한 것으로 입증되었다.

기본 주파수가 약 4 MHz인 파형을 갖는 전류파를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

바람직하게는, 이러한 파형은 사인 유형의 파형이다. 또한, 본 발명의 방법의 일 측면에 따르면, 그러한 사인 파형은 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

다시, 본 발명의 방법의 다른 측면에 따르면, 사인 파형은 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

바람직하게는, 사인 파형은 적어도 1차, 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

하기 실험 결과에서 알 수 있듯이, 종양 세포에 상기 전류파를 인가하면 높은 성공률로 종양 세포의 성장을 차단하거나 억제할 수 있으며, 건강한 세포는 표적 부위에 실질적으로 상하지 않고 남게 된다.

이러한 전류파를 인가하는 것과 알려진 유형의 항암제로 종양 세포를 치료하는 것을 조합한 것의 효과도 테스트되었다.

항암제라는 용어는 종양 형성의 성장 및 확산을 억제하거나 차단하기 위한 약제학적 용도의 임의의 분자 또는 분자의 조합을 의미한다.

항암제 테모졸로마이드(TMZ)의 사용이 특히 바람직하다.

2 MHz 이상, 바람직하게는 2 내지 64 MHz 범위, 더 바람직하게는 2 내지 20 MHz 범위, 더욱 더 바람직하게는 4 및 20 MHz, 훨씬 더 바람직하게는 약 4 MHz의 주파수를 가진 파형을 갖는 상기 전류파를 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위의 종양 세포에 대해 미리, 항암제 치료와 동시에 또는 치료한 후에 인가하는 것은, 항암제 그 자체의 더 큰 항종양 효능을 얻을 수 있게 한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.

특히, QMR과 함께 항암제를 사용하면 종양 세포에 항암제를 단독으로 사용하는 것보다 살아있는 종양 세포의 수를 더 많이 감소시킬 수 있다

따라서 항암제와 전술한 전류파의 인가를 병용하는 것이 이들 종양 세포에 항암제를 단독으로 사용하는 것보다 처리된 종양 세포에서 더 큰 항종양 효과를 발휘하여서, 동등한 항종양 효과와 함께, 항암제의 용량을 감소시킨다.

여전히 유리한 점은 QMR의 사용을 통한 투여량 감소 덕분에 동일한 항종양 효과를 달성하면서 항암제 치료로 인한 부작용을 상당히 줄일 수 있다는 것이다.

이러한 장점은 항암제가 QMR 치료와 동시에 또는 처리 후에 투여될 때 특히 분명하다.

이러한 장점은 약물이 QMR 치료와 동시에 투여될 때 더욱 분명해진다.

유리하게도, 항암제 및 QMR의 치료의 병용은 초기 세포사멸에서 세포 수의 증가를 얻을 수 있게 해준다.

QMR은 상응하는 독성 증가 없이 현재 사용되는 항암제의 효과를 향상시키기 위해 표준 화학 요법에 대한 효과적인 보조 요법으로 사용될 수 있음이 분명하다.

이러한 항암제 외에도, QMR은 다른 유형의 항종양 치료와 함께 적용될 수도 있다.

이러한 항종양 치료의 일부 예는 외과적 치료, 방사선 수술, 이온화 방사선 치료, 알킬화제를 사용한 화학 요법 치료, 항대사제, 항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 항진균 약물, 코르티코스테로이드, 생물학적 약물, 분화제, 호르몬, 면역 체계를 자극하는 약물, 단일클론 항체를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단하거나 억제하는 방법에 사용하기 위한 항암제도 본 발명의 일부를 형성하며, 여기서 상기 방법은 미리 정의된 시간 동안 전술한 표적 부위에 전류파를 인가하는 것과 동시에 또는 인가한 후에 상기 항암제로 종양 세포를 치료하는 것을 포함한다.

위에서 언급한 바와 같이 이러한 전류파는 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 항암제로 종양 세포를 치료하는 것은 전술한 전류파의 인가 전에 일어나는 것을 배제하지 않는다.

바람직하게는, 상기 파형은 2~64 MHz 범위, 바람직하게는 2~20 MHz 범위, 더 바람직하게는 4~20 MHz 범위의 기본 주파수를 갖는다.

보다 바람직하게는, 상기 파형은 약 4 MHz의 기본 주파수를 갖는다.

더욱 바람직하게는, 전술한 파형은 사인 파형이다.

또한 이 사인 파형은 고조파의 존재로 인해 왜곡된다.

바람직하게는, 이러한 사인 파형은 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 종양 세포가 항암제로 치료하는 동안, 생체의 표적 부위에 전술한 전류파를 인가함과 동시에 종양 세포를 항암제로 치료하는 것을 포함하는 방법에 사용하기 위해 항암제가 사용된다.

본 발명의 방법으로 돌아가서, 이 방법은 바람직하게는 다음 단계를 포함한다:

- 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 적응된 장치를 하나 이상의 전극에 연결하는 단계, 여기서 바람직하게는 상기 파형은 고조파의 존재에 의해 왜곡된 사인 파형이다;

- 전술한 종양 세포를 포함하는 표적 부위가 위치한 생체의 신체 표면에 이들 전극 중 적어도 하나를 적용하는 단계, 또는 전술한 종양 세포를 포함하는 표적 부위에 또는 그 근처에 생체에서 이러한 전극의 적어도 하나를 이식하는 단계;

- 현재 파동을 이러한 하나 이상의 전극으로 전송하는 것과 같이 장치를 활성화하고 사전 정의된 시간 동안 장치를 활성화 상태로 유지하는 단계.

바람직하게는 생체는 인간을 대상으로 한다.

이들 전극은 표적 부위로 전술한 전류파를 전달하기에 적합한 형상 및 구성을 갖는다.

제한하는 것으로 간주되지 않는 예로서, 이러한 전극은 이식 불가능한 유형일 수 있고, 예를 들어 핸드피스(handpiece) 형태 또는 흡인 컵 형태일 수 있거나, 다시 본질적으로 층상 형태일 수 있고 피험자(subject)의 피부에 접착하여 적용할 수 있으며, 또는 이러한 전극은 프로브 형태일 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 전극이 층상 형상을 가질 때, 전극은 본질적으로 유연하여 신체 표면의 형상을 어려움 없이 따라갈 수 있고, 또한 선택적으로 장치에서 생성된 파형을 인가하는 동안 신체와 접촉을 유지하기 쉽게 하는 접착 물질이 장착되어 있다.

전술한 전극 중 하나 이상이 이식가능한 유형일 수 있음을 배제하지 않는다.

따라서 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단하거나 억제하기 위한 장치도 본 발명의 일부를 형성한다.

이러한 장치는 본 발명의 방법에 사용가능하다.

특히, 본 발명의 장치는 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 구성된다.

표적 부위는 바람직하게는 상기에서 이미 지적한 바와 같이 생체, 더 바람직하게는 인간 대상체에 속한다.

본 발명의 장치의 바람직한 실시예에 따르면, 하나 이상의 전극에 연결되고 이들 전극 각각에 2 MHz 이상의 기본 주파수를 갖는 전류파를 공급하도록 적응된 무선 고주파 회로를 포함한다.

바람직하게는, 장치는 바람직하게는 연속 전압, 보다 바람직하게는 안정화된 전압을 전술한 무선 주파수 회로에 공급하는 메인 전압에 의해 전력을 공급받는 정류 회로(rectifier circuit)를 더 포함한다.

이러한 무선 주파수 회로는 전압에 의해 전원이 공급되고 구동 회로에 의해 구동되는 적어도 하나의 전자 스위치를 포함하는 것이 바람직하다.

보다 자세하게는 무선 주파수 회로는 2 MHz 이상의 기본 주파수를 가진 전류파를 출력에 제공하고 상기 전류파를 이러한 전극으로 전송하도록 적응된다. 바람직하게는, 이 기본 주파수는 2 내지 64 MHz 범위, 보다 바람직하게는 2 내지 20 MHz 범위, 훨씬 더 바람직하게는 4 내지 20 MHz 범위이다.

보다 바람직하게는 기본 주파수는 약 4 MHz에 해당한다.

상기 전류파는 또한 사인 형태를 갖는다.

상기 전류파는 또한 고조파의 존재에 의해 유리하게 왜곡된다.

이들 고조파는 바람직하게는 적어도 2차 및 3차의 고조파이다.

보다 바람직하게는, 상기 전류파는 적어도 1차, 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 사인 형태를 갖는다.

상기 전류파도 왜곡된 사인 형태의 기본 주파수에서 바람직하게는 광대역 공진 회로(broadband resonant circuit)를 순환한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 장치는 4 내지 64 MHz의 고조파를 갖는 4 MHz의 고주파 사인 교류 전류파를 생성한다.

본 발명의 장치의 일 측면에 따르면, 상기 장치의 전극은 전술한 전류파를 표적 부위로 전달할 수 있는 방식으로 구성된다.

본 발명의 장치의 전극은 본 발명의 방법에 대해 전술한 전극의 형상 및 구성에 대응하는 형상 및 구성을 가질 수 있음이 명시되어 있다.

본 발명의 장치의 일 측면에 따르면, 이러한 전극은 비-이식가능한 유형이고 종양 세포를 포함하는 표적 부위가 위치하는 곳에 또는 그 근처에 있는 유기체의 신체 표면에 적용되도록 구성된다.

장치의 변형 실시예에 따르면, 상기 전극의 하우징을 가능하게 하고 전술한 무선 주파수 회로와의 연결 및 표적 부위에서의 또는 그 근처의 배열을 허용하도록 구성된 헬멧(helmet)을 포함한다.

전술한 헬멧을 포함하는 장치의 특정 변형 실시예에 따르면, 후자는 또한 무선 주파수 회로를 수용하도록 구성된다는 점에 유의해야 한다.

장치의 추가 변형에 따르면, 이는 전술한 전극을 수용하도록 구성된 웨어러블 유형(wearable type)의 캡(cap)을 포함하고 표적 부위에 또는 그 근처에 적용할 수 있게 한다.

장치의 다른 변형 실시예에 따르면, 상기 전극이 제공된 적어도 하나의 밴드(band)를 포함한다. 선택적으로, 상기 밴드는 장치의 무선 주파수 회로를 또한수용하도록 구성된다.

상기 밴드는 또한 피험자의 머리에 대해 측면 및/또는 정면 및/또는 후면에 배치되도록 구성된다.

이러한 밴드는 사람의 허리에 두르고 사람이 벨트로 착용하도록 구성되는 것을 배제하지 않는다.

또한, 상기 밴드는 위에 표시된 것과 다른 방식으로 피험자가 착용할 수 있음을 배제하지 않는다.

본 발명의 장치의 특정한 변형 실시예에 따르면, 본 발명의 장치의 적어도 하나 이상의 전극은 이식가능한 유형의 전극이다.

"이식가능한(implantable)"이라는 용어는 외과적 또는 의학적 개입에 의해 인체로 완전히 또는 부분적으로 이식되도록 의도된 전극을 의미한다.

본 발명의 장치의 다른 변형 실시예에 따르면, 완전히 이식가능하도록 구성된다.

실시예로서, 본 발명의 이식가능한 장치는 이식가능한 심장박동기의 구성과 실질적으로 유사한 구성을 갖는다

본 발명의 다른 측면 및 장점은 예시적이고 비제한적인 것으로 간주되는 하기 실시예를 읽을 때 나타날 것이다.

실시예

실시예 1. 재료 및 방법

1.1 세포 배양 및 세포 성장

교모세포종 세포주 A172, T98G 및 U87MG를 사용하였다. A172 및 T98G 세포(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 10% 태아 소 혈청(FBS)(Qualified Australian, Gibco, Thermo Fisher Scientific) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich)이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's 배지/영양 혼합물 F-12 (DMEM/F12 GlutaMAX, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.

U87MG 세포(courtesy of Prof. Massimo Dominici, Laboratory of Cellular Therapy, University Hospital of Modena and Reggio Emilia Modena, Italy)를 10% FBS(Gibco, Thermo Fisher Scientific) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich)이 첨가된 GlutaMAX(Gibco, Thermo Fisher Scientific)가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 배양하였다.

골수-유래 중간엽 간질 세포(BM-MSC)를 비-종양 유형 대조군 세포로 사용하였다. BM-MSC 세포는 이전에 설명한대로 ULSS8 Berica의 혈액학(Haematology)의 복합 수술 단위(Complex Operative Unit)의 첨단 세포 치료 연구실(Advanced Cellular Therapies Laboratory)에서 생산되었다(Sella et al, 2018). 간단히 말해서, MSC는 폐기된 골수 수집 백(bags)과 건강한 기증자의 필터를 세척하여 얻은 세포에서 분리되었다(Ethics Committee auth. No. 107/18 of 12.02.2019). 세척 후, 세포를 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 10% FBS(Gibco, Thermo Fisher Scientific) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich)이 첨가된 GlutaMAX(Gibco, Thermo Fisher Scientific,)를 가진 DMEM에서 1x10⁵ cells/cm²의 밀도로 시딩(seed)하였다. 세포 배양은 5% CO₂가 있는 습한 대기에서 37℃에서 배양되었다. 부착되지 않은 세포를 시딩 72시간 후에 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. 배지를 3~4일마다 갈아주었다. 80% 컨플루언스(confluence)에서 BM-MSC 세포를 2000 cells/cm²의 밀도로 다시 시딩하였다.

1.2 QMR 자극 프로토콜

세포주를 Telea 사(Telea Electronic Engineering, Sandrigo, VI, Italy)의 프로토타입(prototype) QMR 장치를 사용하여 QMR로 자극하였다. 현재 시험관 내 실험에 적합하게 조정된 장치는 4MHz 내지 64MHz의 고조파로 4MHz의 고주파 사인 교류 전류파를 생성하였으며 하기 데이터를 가졌다: 전원 공급 100÷230 V ~ 50/60 Hz; 최대 출력 전력, 5W/400Ω.

QMR은 100mm 페트리 접시 내부의 가장자리에 배치되고 발전기 장치에 연결된 한 쌍의 전극을 사용하여 세포에 적용되었다.

전기장을 세포 배양 배지로 전달하면 열이 발생한다(줄(Joule) 효과). 자극된 세포 배지에서 평균 온도 증가는 5℃였다. 상기 값은 배양 배지에 배치된 데이터-로거 프로브(data-logger probe)(iLog, Escort Scunthorpe, UK)를 사용하여 세 가지 독립적인 측정을 통해 측정되었다. 자극된 세포의 배지의 온도 증가를 보상하고 자극된 세포에 대해 평균 온도를 37℃로 유지하기 위해서, 자극된 세포에 사용된 배양기는 32℃, 5% CO₂로 설정되었고 실험실의 온도는 20℃ 내지 25℃ 사이로 유지되었다.

1.3 실험 설정

사용된 세포주에 기초하여, 60% 컨플루언스에서 자극을 받기 위해서, 정의된 수의 세포를 100mm 플레이트(Greiner Bio-One,Frickenhausen, DE)에 시딩하였다. 이어서 세포를 24시간 동안 QMR에 노출시키고 자극 종료 후 0-24-48시간 동안 분석하였다.

보다 구체적으로, 세포를 D-PBS(Sigma-Aldrich)로 세척하고, 1X TrypLE Select(Gibco, Thermo Fisher Scientific)로 분리하고 얻어진 분취량을 사용하여 세포 생존력, 세포사멸, 세포 주기, 핵형 및 프로테오믹스(proteomics)를 조사하였다. 반고체 배지(소프트 한천 분석(soft agar assay))에서 세포 성장 능력을 평가하기 위해 세포 분취량을 다시 시딩하고 자극 전후에 QMR-자극 플레이트에서 세포 이동을 직접 모니터링하였다.

QMR 및 약물 TMZ(Sigma-Aldrich)의 병용 사용 효과도 테스트하였다.

이러한 분석을 위해 세포를 QMR 자극과 동시에 또는 그 후에 투여된 10-25 μM의 TMZ로 144시간 동안 처리하였다. TMZ 원액을 10mM의 최종 농도로 DMSO에서 준비하였고 4℃에서 유지하였다. 후속 희석액을 신선한 배양 배지에서 만들고 세포에 투여하였다. 세포 생존력, 세포사멸 및 세포 주기를 144시간 후에 평가하였다.

1.4 세포 생존력: 트리판 블루 배제 분석

자극 후, 세포를 수확하고 배양 배지에서 트리판 블루 용액(Gibco, Thermo Fisher Scientific)과 1:1 비율로 현탁하였다.

Burker's chamber를 사용하여 세포를 계수하였고 다음 공식을 적용하여 살아있는 세포의 수를 얻었다: [(세포 수 x 10,000 x 2 x V)/9], 여기서 V는 수득된 세포 용액의 총 부피이고 2는 염료가 포함된 용액의 희석 계수이다(2X).

1.5 세포사멸: 아넥신(Annexin) V/7-아미노악티나마이신 D(7-AAD)로 라벨링

자극 후, 1.5 x 10⁵ 세포를 수확하고 400g에서 6분 동안 원심분리하였다. 결합 완충액으로 세척한 후, 제조업체의 지침(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 따라 세포를 아넥신 V/7-AAD로 표지하였다. 결합 완충액으로 희석한 후, FC500 유동 세포 분석기(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 2 x 10⁴ 세포/샘플의 형광을 검출하였다. 세포 집단을 4개의 그룹으로 분리하였다: 아넥신 V 및 7-AAD 모두에 대해 음성 형광을 갖는 살아있는 세포; 초기 세포사멸에서 아넥신 V에 대해 양성 및 7-AAD에 대해 음성(아넥신 V+/7-AAD-)인 세포; 후기 세포사멸에서 아넥신 V 및 7-AAD(아넥신 V+/7-AAD+)에 대해 이중 양성을 나타내는 세포, 및 아넥신 V에 대해 음성이고 7-AAD에 대해 양성(아넥신 V-/7-AAD+)인 죽은 세포.

1.6 세포 주기

자극 후, 5 x 10⁵ 세포를 수확하고 400g에서 6분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 세포를 D-PBS로 세척하고 고정하고 아세톤(80% 수용액)으로 침투시켰다. 4℃에서 1시간 후, 원심분리로 아세톤을 제거하고, 세포를 세척하고 실온에서 1시간 동안 7-AAD(Invitrogen)로 1㎍/mL로 표지하였다. FC500 유동 세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 2.5 x 10⁴개 세포/샘플의 형광을 분석하였다. EXPO 32 소프트웨어(Coulter Systems, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 세포 주기의 여러 단계에서 세포의 백분율을 계산하였다. 세포 클러스터에 대해 Diplode 주기를 고려하고 수정하였다.

1.7 핵형 분석

QMR 자극이 안전하고 따라서 염색체 변형을 일으키지 않았는지 여부를 평가하기 위해, BM-MSC 중간엽 간질 세포를 QMR로 24시간 동안 자극하고 350/400 밴드 해상도의 표준 기술에 따라 G-Trypsin-Giemsa 밴딩으로 테스트하였다. 20개의 중기가 분석되었고 3개가 핵형 분석되었다. 자극받지 않은 BM-MSC 세포를 대조군 세포로 사용하였다.

1.8 세포 이동(스크래치 테스트)

스크래치 테스트는 세포 운동성을 반정량적으로 감지하는 2D 세포 이동 접근법을 나타낸다. 스크래치(오프닝(opening))의 목적은 주변 세포가 이동하고 상기 오프닝을 닫도록 유도하기 위해 세포-프리 영역(또는 오프닝)을 만드는 것이다. 세포를 세포 단일층에서 500μm 세포-프리 오프닝을 달성하는 2-웰 실리콘 인서트(IBIDI GmbH, Grafelfing, DE)에 시딩하였다.

60% 세포 컨플루언스에 도달하면 삽입물을 제거하고 세포를 24시간 동안 QMR로 자극하였다. 세포 이동은 자극 전 및 자극 후 0-24-48시간에 이미지 획득에 의해 시간 경과에 따라 모니터링되었다. 이미지 획득은 Axiovert 40 CFL 도립 광학 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, DE)으로 수행되었다. 이미지 J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 오프닝의 폐쇄 비율을 분석하고 이주율 곡선을 사용하여 이주 능력(migratory capacity)을 평가했으며, 이는 다음과 같이 계산되었다: 클로저 % = [(영역(Area) tx - 영역 ty)/영역 tx] x 100, 여기서 tx는 획득 시간을 나타내고 ty는 다음 시점을 나타낸다.

1.9 소프트 한천

반고체 배지(소프트 한천)에서의 콜로니 형성 분석은 기질에 대한 세포 고정과 독립적으로 세포 성장을 모니터링하는데 사용되는 방법이며 광학 콜로니 계수를 통해 반고체 배지에서 세포 증식을 측정한다. 소프트 한천에서 콜로니 형성 속도는 사용하는 세포주에 따라 달라진다. 따라서 각 세포주에 대해 아가로스의 농도, 시딩된 세포의 수 및 실험의 마지막 날을 최적화하였다. 세포 현탁액을 세포 배지 중 0.4% 아가로스 용액으로 제조하고 완전한 배지에서 0.6% 아가로스의 응고된 층에서 시딩하였다. 상온에서 1시간 후, 완전한 배지 160 ㎕를 첨가하고 실험이 끝날 때까지 매주 100 ㎕씩 추가하였다. 플레이트를 30분 동안 100 μM 카세린(Sigma-Aldrich)으로 표지하기 전에 21-24일 동안 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터로 옮겼다. 최소 50개의 세포로 구성된 콜로니를 Axiovert 40 CFL 도립 광학 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 계수하였다.

1.10 프로테오믹스

1 x 10⁶개 세포를 수확하고 400g에서 6분 동안 원심분리하고 D-PBS로 세척하고 프로테아제 억제제 또는 칵테일(Cell Signalling, Danvers, MA, 미국)이 첨가된 얼음에서 용해 완충액(Pierce™ RIPA 완충액, Thermo Fisher Scientific)으로 용해하였다. 얼음에서 30분 후, 세포 용해물을 4℃에서 10분 동안 14000g에서 원심분리하고 단백질 상청액을 BCA 분석(Pierce™ BCA 단백질 분석 키트, Thermo Fisher Scientific)으로 비색적으로(colorimetrically) 결정하였다. 소 혈청 알부민을 표준(Sigma Aldrich)으로 사용하였다.

1.11 액체 크로마토그래피 - 질량분석법

단백질 추출

액체 크로마토그래피 - 질량 분석법(LC/MS-MS)은 액체 크로마토그래피의 분리 능력과 삼중 사중극 질량 분광분석법(triple quadrupole mass spectrometry)의 질량 분석의 높은 민감도 및 선택성을 결합한 분석 기술이다. 샘플 준비를 위해, 50 μg의 단백질 용해물을 아세톤으로 침전시키고 얻어진 단백질 펠릿을 6M 요소 용액 및 100 mM 중탄산암모늄(pH 8)에 용해시켰다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 10mM 디티오트레이톨을 사용하여 환원시켰고 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 20mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 이어서, 단백질을 엔도펩티다아제 효소 Lys-C(Promega)로 효소/단백질 비율 1:100(w/w)으로 실온에서 3시간 동안 분해시켰다. 그런 다음 단백질을 50mM 중탄산암모늄에서 4배 희석하고 실온에서 트립신(Promega) 1:100(w/w)으로 밤새 분해시켰다. 1% 트리플루오로아세트산을 첨가하여 단백질 분해를 중단시켰다. 그런 다음 샘플을 탈염하고 진공 건조하고 LC-MS/MS 분석을 위해 0.1% 포름산에서 재현탁하였다.

특정 데이터베이스 및 상대적 정량화를 통한 단백질 식별

샘플을 Orbitrap Fusion Tribrid 질량 분석기(Thermo Fisher)와 인라인으로 결합된 Easy-nLC 1200 시스템(Thermo Fisher)을 사용하여 분석하였다. 2-성분 이동상이 있는 역상 컬럼(Acclaim PepMap RSLC C18, 2μm 입자 크기, 100Å 기공 크기, id 75μm, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 분해된 펩타이드를 분리하였다: 물에서 0.1% 포름산(완충액 A) 및 아세토니트릴에서 0.1% 포름산(완충액 B). 펩타이드를 52분 동안 5%에서 25%로, 이어서 8분 동안 25%에서 40%로, 마지막으로 400 nL/분의 유속으로 10분 동안 40%에서 98%로 기울기(gradient)를 사용하여 용출시켰다. DDA(Data-dependent Acquisition) 방법은 120000 fwhm(최대값의 반에서의 최대 폭)(200m/z에서)의 분해능 전력, 및 50ms의 최대 주입 시간에서 수행된 전체 스캔을 기반으로 한다. 350-1100m/z의 질량 범위는 전구체에 대해 조사되었으며, 첫 번째 질량은 파편에 대해 140m/z로 설정되었다. 전체 스캔에 이어 30%의 충돌 에너지에서 3초의 사이클 시간 동안 일련의 MS/MS(HCD) 스캔이 수행되었으며 최대 주입 시간 150ms의 이온 트랩에서 검출되었다. 동적 배제 시간은 50초로 설정되었다. 처리되지 않은 데이터는 Proteome Discoverer 2.2 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)에서 검색되었다. 펩타이드 검색은 인간 단백질 FASTA 파일(uniprot)을 사용하여 수행되었다. 단백질은 10ppm의 전구체 질량 허용 오차와 0.6Da의 제품 질량 허용 오차를 사용하여 MASCOT 검색 엔진(Matrix Science inc, Boston, MA, USA)으로 식별되었다.

1.12 생물정보학적 분석

Clustvis 도구(Metsalu T et al, 2015)를 사용하여 계층적 클러스터 분석을 수행하기 위해 서로 다른 실험 그룹(각각 t0 및 t24)에서 발현된 단백질의 서로 다른 양을 사용하였다. 유전자 온톨로지(GO, Gene Ontology) 및 단백질 ID의 경로 주석은 EnrichR 유전자 세트 농축 분석 서버(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)를 사용하여 생물학적 프로세스 및 Reactome 분류를 p <0.05에서 유의한 임계값 세트로 적용하여 수행되었다. 단백질 상호작용 네트워크는 STRING 상호작용 데이터베이스, 버전 11.0(https://string-db.org/)(Mering C et al, 2003)을 사용하여 구성되었다.

1.13 통계 분석

모든 데이터를 GraphPad 프로그램(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 분석하였으며 평균±표준 오차로 나타내었다. 1-샘플 t-테스트는 대조군의 비율/백분율로 표현된 결과의 분석에 사용되었다(예를 들어, 트리판 블루 제외 분석). 독립표본 학생의 t-테스트(unpaired Student’s t-test)는 다른 모든 분석에 사용되었다. p < 0.05인 데이터는 중요한 것으로 간주되었다.

실시예 2. 결과

2.1 QMR 치료는 세포 주기 진행을 수정함으로써 교모세포종 세포의 성장을 감소시킨다

QMR 치료가 A172 교모세포종 세포에 미치는 영향은 치료 종료 직후와 QMR 자극 종료 24시간 및 48시간 후에 세포의 형태, 증식률, 세포사멸 및 세포 주기를 분석함으로써 평가되었다. 이러한 시간 프레임을 준수함으로써 치료로 얻은 효과의 영속성 및 처리된 세포가 세포 기능을 치료-전 수준으로 복원하는 능력에 대한 평가를 얻을 수 있었다.

QMR 처리가 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 처리된 A172 세포의 형태를 변화시킨다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 실제로 QMR-처리된 세포는 대조군 세포보다 더 부풀어 오르고 더 과립화되어 세포 손상이 발생했음을 나타낸다.

상기 손상은 도 1과 같이 시간이 지나도 지속되는 것으로 나타났다.

세포 증식률도 트리판 블루로 테스트하여 추정하였다. 처리 24시간 후, QMR-처리된 세포에서 종양 성장이 약 28% 감소를 보였다.

또한 처리 후 24~48시간이 지나도 살아있는 세포의 수가 감소하는 경향을 보여서, 도 2에서 보는 것과 같이 QMR 처리가 세포 주기 진행에 미치는 영향을 시사한다.

이러한 놀라운 발견을 뒷받침하기 위해 A172 세포의 세포 주기를 또한 유동 세포 분석법 실험을 사용하여 평가하였다. 도 3a 및 도 3c에 표시된 결과는 QMR 처리가 세포 분열 속도(S 단계에 있는 세포의 백분율로 정의됨)를 크게 감소시키는 반면 G₂/M 단계에 있는 세포를 크게 증가시키는 것을 보여준다. 이러한 결과는 처리 종료 후 48시간까지 확인되어서, G₂/M 단계에 세포 주기 정지가 발생했음을 보여주었다.

또한, QMR로 세포를 처리하는 효능은 처리된 세포에서 명확한 세포사멸 활성화에 의해 확인되었다. 도 4b와 도 4c의 결과에서 볼 수 있듯이, QMR 처리 후 살아있는 세포의 수는 QMR을 처리하지 않은 대조군의 살아있는 세포의 수보다 실제로 유의하게 낮았다(p<0.01). 이러한 감소는 또한 초기 세포사멸에서 세포 수의 약 10% 증가 및 후기 세포사멸에서 세포 수의 약간 증가와 상관관계가 있었다.

2.2 QMR 처리는 BM-MSC 세포에 세포 독성 및 유전 독성 효과를 일으키지 않는다

건강한 BM-MSC 세포에 대한 QMR 처리의 효과는 비-종양 유형 세포에 대한 QMR 처리의 안전성을 검증하기 위해 테스트되었다. QMR 자극 종료 시점 및 처리 종료 24시간 후, 처리된 BM-MSC 세포와 처리되지 않은 대조군 세포에서 세포 형태, 증식률, 세포사멸, 세포 주기 및 핵형을 평가하였다. 도 5b와 같이 QMR 처리 종료 시 세포 성장의 약간의 감소가 나타났지만, 이 효과는 도 2에 표시된 처리된 A172 교모세포종 세포에서 얻은 효과와 비교할 수 없는 것으로 간주된다.

또한, QMR로 처리된 BM-MSC 세포는 각각 도 5a, 5c/5d, 5e/5f에서 볼 수 있듯이 세포 형태, 세포 주기 조절 및 세포사멸에서 차이를 보이지 않았다.

또한, 처리 후 0시간 및 24시간에 실질적으로 중첩될 수 있는, 얻어진 결과에 의해 입증된 바와 같이, 시간은 얻어진 최종 효과에 영향을 미치지 않았다.

QMR로 처리한 BM-MSC 세포의 핵형 분석은 또한 도 6에서 볼 수 있듯이 QMR 처리가 염색체의 수나 그의 구조에 변화를 일으키지 않는 장점이 있음을 보여주었다.

2.3 QMR 처리는 A172 교모세포종 세포의 공격성 및 침습성을 감소시킨다

종양 유형 세포가 통제되지 않는 증식과 이동을 특징으로 한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 반-고체 배지에서 세포가 성장하는 능력과 이들의 이동 속도는 종양의 공격성과 침습성의 지표로 간주된다. 따라서 기본 조건과 QMR 처리 후에 소프트 한천에서의 세포 콜로니 형성과 세포 이동을 분석하였다. 도 7a에서 보여주는 결과는 놀랍게도 QMR 처리가 소프트 한천에서 A172 세포의 성장을 상당히 감소시킨다는 것을 보여주었다. 실제로 QMR 처리 후 세포 콜로니의 수는 처리되지 않은 대조군 세포의 콜로니 수보다 약 85% 낮았다. 더욱이 놀랍게도 QMR로 처리한 A172 세포의 세포 이동률은 또한 도 7b에 나타낸 바와 같이 대조군 세포의 그것보다 시간의존적으로 더 낮았다.

2.4 QMR 처리는 A172 교모세포종 세포주의 단백질 지문을 조절한다

QMR로 처리된 A172 및 BM-MSC 세포의 단백질 프로파일도 또한 조사되었다. 분석을 QMR 자극 종료 시점(시간 0)과 처리 종료 24시간 후에 수행하였다. 처리되지 않은 A172 및 BM-MSC 세포를 대조군으로 사용하였다.

A172 세포주에서 총 5104개의 단백질이 확인되었으며, 그 중 QMR 처리 후 0시와 24시간 후에 각각 311개와 308개가 상당히 변화된 것으로 나타났다. 도면에 표시되지 않은 클러스터 분석은 두 테스트 시간 프레임에서 두 개의 분리된 단백질 그룹을 강조하여, QMR 처리가 종양 세포 활동을 방해한다는 것을 보여준다.

단백질은 처리된 세포와 처리되지 않은 세포 사이에서 분화되는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 시간 0에서 111개의 단백질이 상당히 상향 조절된 것으로 밝혀진 반면, 200개의 단백질이 하향 조절된 것으로 밝혀졌다. 대신, 처리 종료 24시간 후 103개의 상향 조절된 단백질과 205개의 하향 조절된 단백질이 발견되었다.

유전자 온톨로지 및 경로 농축에 대한 보다 구체적인 분석 결과는 상향 조절된 단백질이 스트레스 반응 메커니즘, 단백질 폴딩 및 세포외 기질 모델링과 강하게 연관되어 있으며, 이는 QMR 처리가 독성-단백질 자극으로도 작용함을 보여준다.

보다 구체적으로, QMR 처리된 세포는 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하여 단백질 번역, RNA 처리 및 세포 주기 관련 경로와 관련된 핵심 요소의 상당한 하향 조절을 거쳐서, 처리된 세포의 세포 주기 정지 및 사멸을 초래하였다.

유리하게도, BM-MSC 세포에 대한 QMR 자극의 효과는 A172 교모세포종 세포와 비교하여 완전히 다른 결과를 제공하였다. QMR 처리 종료 시, 열 충격 단백질의 활성화는 세포외 기질의 리모델링과 관련이 있었다. 그러나 이러한 변화는 처리 후 24시간이 지나면 완전히 정상화되는 것으로 나타났다. 따라서 QMR 처리는 BM-MSC 세포의 증식률을 방해하지 않으며, 종양 유형 세포에 대한 QMR 처리의 선택성을 뒷받침한다.

2.5 T98G 및 U87MG 세포주에 대한 QMR 처리

위에서 설명한 실험은 A172 세포주 세포보다 더 공격적인 교모세포종 세포주에서도 또한 수행되었다. 이러한 보다 공격적인 세포주는 T98G 및 U87MG 세포를 포함한다. QMR 처리 후 두 세포주에서 증식률이 감소한 것으로 나타났지만, 도 8a 내지 도 8f에 나타낸 바와 같이 세포사멸 활성화, 세포 주기 진행, 클론 생성 능력 및 세포 운동성에는 유의미한 차이가 없었다.

QMR 처리 48시간과 72시간 후에 세포 생존율도 검사하였다. 놀랍게도, A172 및 U87MG 세포 모두에 대한 세포 증식률은 시간이 지남에 따라 상당히 감소된 것으로 밝혀졌다.

치료 능력이 15% 증가해도 세포 증식 속도에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 실제로 QMR 처리된 세포의 세포 생존율은 도면에서 보는 것과 같이 더 높은 출력에서 최대 35%까지 감소하는 것으로 나타났다.

2.6 A172 교모세포종 세포에서 QMR의 인가는 약물 테모졸로마이드(TMZ)의 효과를 높인다

교모세포종을 가진 환자를 위한 표준 요법은 현재까지 병변의 전체 절제, 이어서 방사선 요법 및 약물 TMZ를 사용한 화학 요법을 포함한다.

단점은 약물 자체에 의한 부작용의 정도와 약물 내성 기전의 확립에 의해 약물의 효능이 제한된다는 점이다. 따라서 TMZ의 용량을 낮추고 환자의 삶의 질을 향상시키기 위해 TMZ와 병용할 새로운 치료 전략을 찾는 것이 필수적이다.

따라서 A172 교모세포종 세포에 대한 TMZ와 QMR 처리의 병용 요법의 효능을 테스트하였다. 이 세포들은 QMR 처리와 동시에 또는 그 후에 10-25 μM의 TMZ로 처리되었다. 세포 생존력, 세포사멸 및 세포 주기 값을 분석하였다. TMZ 약물 농도는 IC50을 기준으로 선택되었다(도 14).

얻어진 결과는 놀랍게도 도 12b에서 보는 것과 같이, 10 μM 농도의 TMZ 약물을 QMR 처리와 함께 사용했을 때 세포 생존력이 TMZ 약물 단독으로 처리한 세포에서 얻어진 세포 생존력에서의 감소보다 약 12% 더 감소한 것을 보여준다.,

또한, 이들 데이터는 놀랍게도 세포 사멸에 관한 데이터와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 실제로, TMZ와 QMR의 병용 투여는 도 13a 및 13b의 그래프에 나타난 바와 같이, 살아있는 세포 수의 감소가 초기 세포사멸에서의 세포 수의 증가와 관련이 있음을 보여주었다.

TMZ 25 μM 약물과 QMR에 대한 세포의 동시 노출은 TMZ 약물 단독으로 처리된 세포에 비해 세포 주기 진행에서 더 큰 변형을 활성화한다.

이러한 데이터는 놀랍게도 TMZ와 QMR의 조합된 치료 전략이 도 14b에 표시된 것과 같이 G2-M 단계에서 상당한 세포 주기 정지를 유도하고 G0-G1 단계에서 세포의 비율을 감소시킨다는 것을 보여준다.

참고문헌

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10. S. Sella et al., In-vitro analysis of Quantum Molecular Resonance effects on human mesenchymal stromal cells. PLoS One 13, e0190082 (2018).

Claims (9)

1. 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하는 방법에 사용하기 위한 항암제로서,
   상기 방법은 상기 종양 세포가 상기 항암제로 치료되는 동안 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가(application)함과 동시에 상기 항암제로 상기 종양 세포를 치료하는 것을 포함하고,
   상기 전류파는 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 것인, 항암제.
2. 제1항에 있어서, 상기 파형은 사인 파형(sinusoidal waveform)인 것을 특징으로 하는 항암제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항암제가 테모졸로마이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포는 교모세포종 세포를 포함하고, 상기 표적 부위는 중추신경계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제.
5. 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 항암제로서,
   상기 방법은 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가함과 동시에 상기 항암제로 상기 종양 세포를 치료하는 단계를 포함하고,
   상기 전류파는 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 것인, 항암제.
6. 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하기 위한 방법에서 사용하기 위한 항암제로서,
   상기 방법은 미리 정의된 시간 동안 상기 표적 부위에 전류파를 인가하기 전에 상기 항암제로 상기 종양 세포를 치료하는 단계를 포함하고,
   상기 전류파는 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 것인, 항암제.
7. 생체의 표적 부위에서 종양 세포의 성장을 차단 또는 억제하도록 구성된 장치로서,
   상기 장치는 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 파형을 갖는 전류파를 생성하도록 구성되고,
   상기 장치는 적어도 2차 및 3차 고조파의 존재에 의해 왜곡된 약 4MHz의 기본 주파수를 갖는 전류 파동을 상기 전극의 각각에 공급하도록 적응된 적어도 하나의 무선 주파수 회로에 연결된 하나 이상의 전극을 포함하는 것인, 장치.
8. 제7항에 있어서, 상기 파형은 사인 파형인 것을 특징으로 하는 장치.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 전극은 이식가능한 유형의 전극이고, 상기 하나 이상의 전극은 상기 표적 부위에 또는 그 근처에 이식되도록 적응되는 것을 특징으로 하는 장치.